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1. INTRODUÇÃO
Os caprinos são considerados animais economicamente atrativos por serem
importantes fontes de carne, leite e pele. Além de estarem presentes em todos os continentes,
no Brasil, eles desempenham importantes papéis econômico e social, especialmente na região
nordeste do país. Nas últimas décadas, uma quantidade significativa de pesquisas tem sido
realizada na área de reprodução animal, visando aumentar o potencial reprodutivo de caprinos
de alto valor zootécnico ou em via de extinção. O grande desafio destes estudos é aumentar o
número de descendentes de fêmeas de alto valor genético, pois até o momento, um número
relativamente pequeno tem sido obtido.
Ao nascimento, o ovário dos mamíferos contém milhares de folículos primordiais, os
quais são considerados o pool de estoque de folículos ovarianos. No entanto, poucos folículos
primordiais desenvolvem-se até o estádio de folículo pré-ovulatório, pois a grande maioria
morre por atresia após iniciar o crescimento in vivo (Figueiredo et al., 2002). Neste contexto,
torna-se prioritário o desenvolvimento de pesquisas que contribuam para uma melhor
compreensão dos processos relacionados com a formação, crescimento e maturação dos
oócitos inclusos em folículos ovarianos caprinos. A biotécnica de MOIFOPA (Manipulação
de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais) surge então como uma importante
ferramenta para esse estudo, dando suporte necessário para a elucidação dos mecanismos que
envolvem a foliculogênese inicial. Até o momento, sabe-se que durante os estádios iniciais da
foliculogênese, os fatores de crescimento localmente produzidos exercem um papel
determinante na manutenção da viabilidade e do crescimento folicular (Fortune, 2003). No
entanto, o ambiente ovariano que propicia o desenvolvimento folicular é regulado pelos
hormônios folículos estimulante (FSH) e luteinizante (LH), também conhecidos como
gonadotrofinas. As gonadotrofinas são indispensáveis para o desenvolvimento de folículos
antrais, e seu papel sobre a foliculogênese inicial ainda não está claro (Fortune, 2003). Desta
forma, a realização de estudos in vitro para avaliar o efeito destes hormônios poderá
contribuir para uma melhor compreensão dos diversos componentes implicados na
foliculogênese e no processo de atresia folicular nesta espécie.
Para um maior esclarecimento da importância deste trabalho, a revisão de literatura a
seguir aborda aspectos relacionados ao ovário mamífero, foliculogênese e características dos
folículos ovarianos, importância das gonadotrofinas para o crescimento folicular, população e
atresia folicular, bem como aos modelos utilizados para estudo da foliculogênese in vitro. Os
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benefícios oriundos de uma melhor compreensão do desenvolvimento folicular para a
melhoria da eficiência reprodutiva dos caprinos também são enfatizados.
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2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Ovário mamífero
Como na maioria das espécies mamíferas, o ovário caprino é composto de uma medula
e um córtex circundado pelo epitélio germinal. A medula ovariana consiste de um arranjo
irregular de tecido conjuntivo fibroelástico e um extensivo tecido nervoso e vascular que
chega ao ovário através do hilo. O córtex contém folículos ovarianos e corpos lúteos em
vários estádios de desenvolvimento ou regressão. O tecido conectivo do córtex consiste de
fibroblastos, colágeno e fibras reticulares (Silva, 2005).
Os eventos que marcam a formação do ovário fetal incluem a sua colonização por
células germinativas primordiais (CGP) e associação das células germinativas com células
somáticas, formando assim os folículos primordiais. Além disso, observa-se o
desenvolvimento de uma complexa rede vascular intra-ovariana em ovinos (Juengel et al.,
2002). Entre os dias 18 e 28 do desenvolvimento embrionário, as células germinativas
primordiais migram para a base do mesentério dorsal e a gônada indiferenciada surge entre os
dias 23-24 de vida embrionária, sendo evidenciada como um espessamento do epitélio
celômico na porção medial do mesonéfron. Simultaneamente com a sua formação, a gônoda
começa a sofrer mudanças estruturais associadas com o processo de diferenciação sexual (dias
32-35 da vida embrionária), observando-se atividade esteroidogênica neste estádio em ovinos
(Lun et al., 1998; Quirk et al., 2001).
Após chegarem ao ovário, as CGP sofrem sucessivas mitoses e após uma
reorganização das organelas e crescimento celular as CGP transformam-se em oogônias
(Russe, 1983). Embora as oogônias continuem proliferando até o dia 100, o número máximo
de células germinativas é alcançado aos 75 dias de desenvolvimento embrionário. A partir do
75º dia inicia-se uma redução da população de oogônias, sendo que no dia 90, mais de 75%
das células germinativas são perdidas por apoptose (Smith et al., 1993). Quando as oogônias
iniciam a primeira divisão meiótica, ocorre a transformação destas células em oócitos. Em
seguida, uma camada de células somáticas planas, conhecidas também como células da pré-
granulosa, originárias do epitélio celômico, circundam os oócitos formando assim os folículos
primordiais, iniciando a foliculogênese. Após a formação dos folículos primordiais, as células
da pré-granulosa param de se multiplicar e entram num período de quiescência. Os oócitos
primários inclusos nesses folículos encontram-se na fase de prófase I da meiose. A progressão
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da divisão meiótica ocorre somente na puberdade, com a liberação do pico pré-ovulatório de
FSH e LH (Erickson, 1986).
2.2 Foliculogênese e características dos folículos ovarianos
A foliculogênese, evento iniciado na vida pré-natal na maioria das espécies, pode ser
definida como o processo de formação, crescimento e maturação folicular, iniciando-se com a
formação do folículo primordial e culminando com o estádio de folículo pré-ovulatório (Van
Den Hurk & Zhao, 2005).
O folículo ovariano é formado por vários tipos celulares, sendo composto por um
oócito circundado por células da granulosa. Durante a foliculogênese, a morfologia folicular é
alterada, uma vez que o oócito cresce e as células circundantes se diferenciam (Bristol-Gould
& Woodruff, 2006). O folículo é considerado uma unidade morfológica e funcional do ovário
mamífero, cuja função é proporcionar um ambiente ideal para o crescimento e maturação do
oócito (Cortvrindt & Smitz, 2001), bem como produzir hormônios como o estrógeno, e
peptídeos como inibina A e B, ativina e folistatina (Adashi, 1994). De acordo com o grau de
evolução, os folículos podem ser classificados em primordiais, primários, secundários e
antrais.
2.2.1. Folículos primordiais
Os gametas femininos são estocados no ovário principalmente na forma de folículos
primordiais. Tais folículos são constituídos de um oócito imaturo, circundado por uma
simples camada de células da pré-granulosa de formato pavimentoso (Hutt et al., 2006). Em
caprinos, os folículos primordiais são constituídos por um oócito quiescente, esférico ou oval,
circundado por 1 a 14 células da granulosa. O núcleo do oócito é relativamente grande e
ocupa uma posição central a excêntrica mostrando seu nucléolo evidente. As organelas são
uniformemente distribuídas no citoplasma ou, às vezes, mais próximas ao núcleo. As
mitocôndrias são as organelas mais evidentes e são predominantemente arredondadas,
normalmente apresentando poucas cristas, organizadas paralelamente à superfície externa da
membrana mitocondrial. No entanto, um pequeno número de mitocôndrias alongadas pode ser
observado. Alguns retículos endoplasmáticos lisos e complexos de Golgi são observados
associados a um número variável de vesículas distribuídas pelo citoplasma. A zona pelúcida
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nesse estádio ainda não é observada, sendo observado apenas uma justaposição do oócito e
células da granulosa, sem nenhuma junção específica (Lucci et al., 2001).
Os folículos primordiais permanecem quiescentes até seu recrutamento para o grupo
de folículos em crescimento (Van Den Hurk & Zhao, 2005 ). Durante toda a vida da fêmea,
um pequeno grupo de folículos são gradualmente estimulados à crescer, constituindo a etapa
de ativação folicular (Fair, 2003). O primeiro sinal de ativação dos folículos primordiais é a
retomada da proliferação das células da granulosa, o que pode acontecer dias, meses ou anos
após a sua formação (Hirshfield, 1991). Uma vez ativados, os folículos entram em um curso
pré-programado de desenvolvimento e maturação que são necessários para o sucesso da
ovulação e fertilização, ou alternativamente são perdidos por atresia (Fair, 2003).
2.2.2 Folículos primários
Os folículos primários são assim chamados quando uma camada simples de células da
granulosa circundando o oócito torna-se cubóide. Tais folículos são circundados por 5 a 26
células da granulosa de formato cubóide dispostas em uma única camada, com as quais o
oócito mantém um estreito contato. A comunicação entre o oócito e células da granulosa é
mediada por endocitose. A membrana plasmática do oócito apresenta projeções que penetram
entre as células da granulosa adjacentes, e algumas microvilosidades aparecem na superfície
oocitária. Da mesma forma que observado em folículos primordiais, é possível observar
mitocôndrias arredondadas e, com o desenvolvimento folicular, estas se tornam alongadas
(Lucci et al., 2001). Na espécie caprina, os folículos primários possuem diâmetro médio de
34,7 µm e sua formação ocorre ao redor do 71° dia de gestação (Bezerra et al., 1998).
À medida que os folículos iniciam o crescimento, as proteínas que irão formar a zona
pelúcida começam a ser sintetizadas (Lee, 2000). A multiplicação das células da granulosa
dos folículos primários leva à formação de várias camadas destas células ao redor do oócito,
formando os folículos secundários.
2.2.3. Folículos secundários
Nesses folículos, os oócitos são circundados por 13 a 114 células da granulosa de
formato cubóide, formando duas ou mais camadas de células da granulosa com as quais o
oócito mantém íntimo contato. O núcleo do oócito assume uma posição excêntrica e as
organelas começam a mover-se para a periferia. O número de retículos endoplasmáticos lisos
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aumenta e a grande maioria das mitocôndrias apresenta-se alongada. Com o desenvolvimento
dos folículos, também aumenta o número de microvilos e inicia-se a formação da zona
pelúcida (Lucci et al., 2001). Neste estádio, a zona pelúcida é claramente identificada ao redor
do oócito (Parrot & Skinner, 1999). Os folículos secundários são observados em ovários de
fetos caprinos, ovinos e bovinos aos 80, 120 e 210 dias de gestação, respectivamente (Rüsse,
1983; Bezerra et al., 1998; McNatty et al., 1999). Nessa fase, inicia-se a formação das células
da teca externa a partir do estroma intersticial (Van Den Hurk & Zhao, 2005). As células da
teca interna são definidas quando os folículos apresentam 4 ou mais camadas de células da
granulosa (Lucci et al., 2001). Os folículos secundários não são bem vascularizados, o que
indica que fatores endócrinos têm pouca importância no seu desenvolvimento. Vários
experimentos in vivo e in vitro têm mostrado, no entanto, que um grande número de folículos
secundários em desenvolvimento, e as taxas de atresia são influenciados por gonadotrofinas.
O FSH é um fator predominante de sobrevivência folicular e tem mostrado estimular a
formação das junções GAP nas células da granulosa (Van den Hurk et al., 1997, 2000).
Apesar de serem responsivos às gonadotrofinas, os folículos secundários podem desenvolver-
se até o estádio antral com uma quantidade mínima de FSH circulante (Van den Hurk et al.,
2000; McGee & Hsueh, 2000). O LH parece ter uma maior importância para o
desenvolvimento de folículos secundários que o FSH. Os receptores de LH são demonstrados
nas células da teca de folículos secundários iniciais e a ligação do LH ao seu receptor é
responsável pela biossíntese de andrógenos pela teca, que por sua vez estimula a formação de
receptores de FSH nas células da granulosa, amplificando o efeito do FSH sobre os folículos
secundários (Van den Hurk et al., 2000).
2.2.4. Folículos antrais
Com o crescimento dos folículos secundários e organização das células da granulosa
em várias camadas, ocorre a formação de uma cavidade repleta de líquido denominada antro.
A partir deste estádio, os folículos passam a ser denominados terciários ou antrais. A
formação dos folículos antrais em caprinos, ovinos e bovinos é observada aos 110, 135 e 230
dias, respectivamente (Rüsse, 1983; Bezerra et al., 1998; McNatty et al., 1999). Em caprinos,
o menor diâmetro observado em folículo terciário de fetos foi de 130 µm (Bezerra et al.,
1998). A partir deste estádio de desenvolvimento folicular, o diâmetro dos folículos aumenta
acentuadamente devido ao crescimento do oócito, multiplicação das células da granulosa, da
teca e aumento do fluido antral (Driancourt, 2001). Tal fluido pode servir como uma
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importante fonte de substâncias reguladoras derivadas do sangue ou secreções das células
foliculares, i.e., gonadotrofinas, esteróides, fatores de crescimento, enzimas, proteoglicanas e
lipoproteínas. Durante o desenvolvimento folicular, a produção de fluido antral é intensificada
pelo aumento da vascularização folicular e permeabilidade dos vasos sangüíneos, os quais
estão fortemente relacionados com o aumento do folículo antral (Van Den Hurk & Zhao,
2005). O estímulo inicial para a formação do antro não é bem compreendido. Estudos in vitro
mostram que o LH (Cortvrindt et al., 1998 a, b) é um dos responsáveis pela formação do
antro.
Pequenos folículos antrais podem ser similares aos folículos secundários quanto ao
diâmetro (~200 µm), mas eles aumentam rapidamente em tamanho com o contínuo acúmulo
de fluido folicular (Bristol-Gould & Woodruff, 2006). Os grandes folículos antrais geralmente
possuem diâmetro acima de 3mm e contêm células da granulosa diferenciadas em células do
cumulus e células murais, muitas camadas de células tecais, um grande espaço contendo
líquido folicular e um oócito. O desenvolvimento dos folículos antrais é caracterizado por
uma fase de crescimento, recrutamento, seleção e dominância (Van Den Hurk & Zhao, 2005)
sendo a formação de folículos pré-ovulatórios um pré-requisito para a ovulação e formação do
corpo lúteo, bem como manutenção da fertilidade (Drummond, 2006).
No último estádio do desenvolvimento folicular, o folículo pré-ovulatório é
caracterizado por um oócito circundado por células da granulosa especializadas que são
denominadas de células do cúmulus. As células da granulosa de folículos pré-ovulatórios
param de se multiplicar em resposta ao hormônio luteinizante e iniciam o programa final de
diferenciação. A ovulação do oócito e células do cúmulus ocorre em resposta ao pico de LH.
Em todas as espécies, a formação de folículos pré-ovulatórios ocorre geralmente a partir da
puberdade (Driancourt, 2001).
2.3 Importância do FSH e LH no controle da foliculogênese em ruminantes
A regulação da proliferação celular, diferenciação e atresia, relacionadas com a
foliculogênese, é resultado de uma complexa interação entre fatores locais e endócrinos (Silva
et al., 2006). Nesse contexto, observa-se uma grande importância das gonadotrofinas no que
se refere tanto ao desenvolvimento folicular normal, como a esteroidogênese (Levi-Setti et al.,
2004). As gonadotrofinas apresentam uma maior importância nos estádios mais avançados do
desenvolvimento folicular. Entretanto, uma grande quantidade de mudanças foram observadas
na população de folículos pré-antrais de camundongas hipofisectomizadas (Edward et al.,
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1977) e ovelhas (Dufour et al., 1979) evidenciando que as gonadotrofinas afetam os estádios
de desenvolvimento pré-antral. Mais recentemente novos modelos de estudo da
foliculogênese inicial em camundongas transgênicas demonstraram que a mutação de genes
que controlam a expressão das gonadotrofinas, bem como de seus receptores, afeta
diretamente não só a ovulação e formação de corpo lúteo, mas também o processo de
formação de folículos primordiais, crescimento folicular e atresia (Barnett et al., 2006).
2.3.1 Hormônio Folículo Estimulante (FSH)
O hormônio gonadotrófico FSH é crítico regulador da função ovariana. A ligação do
FSH é restrita às células da granulosa e resulta em uma variedade de reações, tais como a
estimulação da proliferação celular, síntese de esteróides e expressão de receptores para Fator
de Crescimento Epidermal (EGF) e LH. Entretanto, estudos mais recentes têm demonstrado a
presença de receptores de FSH também em oócitos, sugerindo um efeito adicional do
hormônio no ovário (Méduri et al., 2002). Sabe-se que as gonadotrofinas são necessárias para
o desenvolvimento de folículos antrais, mas ainda não está claro se o FSH afeta o
desenvolvimento de pequenos folículos pré-antrais.
A expressão de receptores de FSH nas células da granulosa de folículos primários,
secundários e antrais bovinos, bem como em oócitos de folículos primordiais de animais de
laboratório, reforçam a idéia da ação do FSH sobre o crescimento dos folículos pré-antrais
(Wandji et al., 1992; Roy, 1993). Durante o cultivo de pequenos folículos pré-antrais (30-70
µm) bovinos, o FSH promoveu um aumento do diâmetro folicular (Hulshof et al., 1995).
Após seis dias de cultivo na presença de FSH, folículos primários e secundários (60-179 µm),
isolados enzimaticamente de ovários de fetos bovinos, aumentaram o diâmetro, a
sobrevivência folicular, bem como a secreção de progesterona e estradiol, (Wandji et al.,
1996). Gutierrez et al. (2000) isolaram folículos secundários bovinos e, após cultivo de 28
dias, observaram que o FSH promoveu o crescimento folicular e aumentou as taxas de
formação de antro. Por outro lado, o FSH não afetou o diâmetro folicular e oocitário, bem
como, o número de células da granulosa durante cultivo de fragmentos ovarianos bovinos
(Braw-Tal & Yossefi, 1997). Além disso, a adição de 5 ng/ml de FSH (Derrar et al., 2000),
bem como de outras concentrações de FSH (1, 10 ou 100 ng/ml) não teve efeito sobre os
folículos pré-antrais bovinos cultivados por 7-14 dias (Fortune et al., 1998). Nuttinck et al.
(1996) cultivaram pequenos folículos pré-antrais bovinos (30-70 µm) por 7 dias e observaram
que o FSH aumentou a degeneração oocitária. Em suínos, o FSH está envolvido na
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proliferação e diferenciação de células da granulosa de folículos pré-antrais (Hirao et al.,
1994). Em caprinos, a adição de 50 ng/mL de FSH ao meio de cultivo de folículos pré-antrais
inclusos em tecido ovariano foi responsável pela preservação da viabilidade folicular,
aumento dos diâmetros folicular e oocitário bem como pela manutenção da integridade ultra-
estrutural dos folículos (Matos et al., 2007).
Vários estudos também mostraram que o FSH pode promover o desenvolvimento de
folículos pré-antrais de animais de laboratório. Em hamsters, pequenos folículos pré-antrais
mostraram ser dependentes de FSH, pois esse hormônio reduziu significativamente a
percentagem de folículos atrésicos (Roy & Greenwald, 1989). Qvist et al. (1990) mostraram
que o crescimento de folículos primários é criticamente dependente, ou exige uma adequada
concentração de FSH. Liu et al. (1999) observaram que o FSH promoveu o crescimento de
folículos pré-antrais (95–120 µm) isolados de ovários de camundongas adultas. Nesta mesma
espécie, o FSH aumentou a sobrevivência e proliferação das células da granulosa, a formação
do antro e a secreção de estradiol e inibina em folículos isolados (95-142 µm) (Cortvrindt et
al., 1997). Por outro lado, Hartshorne et al. (1994) observaram que, em camundongos, após
cultivo por quatro dias, o FSH promoveu um aumento do crescimento folicular e da formação
do antro em folículos maiores de 200 µm, mas não naqueles menores de 200 µm de diâmetro.
Folículos (160-200 µm) isolados de ratas pré-púberes também não cresceram com a adição de
FSH ao meio de cultivo (McGEE et al., 1997). Outros estudos realizados com camundongos
mostraram que o FSH é indispensável somente para a formação do antro (Nayudu & Osborn,
1992).
O FSH pode ainda desempenhar um efeito indireto no desenvolvimento de folículos
iniciais através da indução da liberação de fatores de crescimento pelos grandes folículos
antrais e células do estroma. Por exemplo, o FSH promove a proliferação de células da
granulosa através de fatores parácrinos como o IGF-1 (Fator de Crescimento Semelhante à
Insulina-1) e ativina (Van Den Hurk & Zhao, 2005). Adicionalmente, o FSH regula a
expressão do Kit Ligand (KL), Fator de Crescimento e Diferenciação-9 (GDF-9) e Proteína
Morfogenética do Osso-15 (BMP-15) em folículos murinos (Joyce et al., 1999, Thomas et al.,
2005). Esses fatores têm sido implicados na ativação de folículos primordiais (Van Den Hurk
& Zhao, 2005).
2.3.2 Hormônio Luteinizante (LH)
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O hormônio luteinizante (LH) é uma glicoproteína secretada pela hipófise anterior,
junto com o FSH, sendo um regulador primário da função ovariana. O LH pode apresentar
múltiplos papéis sobre o desenvolvimento folicular, porém grande parte dos estudos têm
focado sua ação em folículos em estádios mais avançados de desenvolvimento, durante a fase
pré-ovulatória (Wu et al., 2000). O LH tem um papel bem estabelecido e essencial na síntese
de esteróides e na ovulação. Enquanto a ocorrência da ovulação normal é impossível na
ausência do LH (Weiss et al., 1992; Toledo et al., 1996) o papel específico deste hormônio na
foliculogênese inicial, bem como na maturação oocitária ainda é pouco conhecido. Sabe-se
que as células da teca expressam receptores para LH (LHR), e a ligação hormônio/receptor
estimula a síntese de substratos androgênicos desde a vida fetal até o final da vida reprodutiva
de fêmeas mamíferas (Adashi, 1994; Gougeon, 1996). As células da granulosa adquirem seus
próprios receptores para LH em meados da fase final de desenvolvimento folicular sob
influência do FSH (Erickson et al. 1979). Nesse estádio o FSH e o LH agem sinergicamente
para promover o desenvolvimento folicular, aumentando a atividade da aromatase, a produção
de inibina, bem como preparando o folículo pré-ovulatório para o pico de LH (Levy et al.,
2000).
Embora receptores não-funcionais de LH tenham sido detectadas em gônadas de
roedores mesmo antes da formação folicular, o primeiro receptor funcional para LH foi
demonstrado em ovários de camundongas 5 dias após o nascimento (O’Shaughnessy et al.,
1997). Isto coincide com o período de diferenciação morfológica das células intersticiais da
teca de folículos primários em crescimento e com a capacidade de expressão da
esteroidogênese basal. O FSH e LH utilizados isoladamente têm demonstrado suportar o
crescimento folicular in vitro (Nayudu & Osborn, 1992; Cortvrindt et al., 1998a). Wu et al.,
2000), realizando experimentos com camundongas, mostraram que o LH é necessário para o
desenvolvimento in vitro de pequenos folículos pré-antrais. Além disso observaram que os
folículos isolados com diâmetro entre 150-160 µm cresceram até o estádio antral na presença
de soro e FSH, mas os folículos isolados com 85-100 µm, desenvolveram o antro somente na
presença de soro, FSH e LH (10 UI/mL). Outro estudo relatou que 70% dos folículos pré-
antrais alcançaram o estádio de metáfase II quando o cultivo foi realizado por 13 dias em
meio contendo FSH e LH juntos (Cortvrindt et al., 1998b). Anteriormente, o LH introduzido
ao meio no sexto dia de cultivo, induziu a ovulação in vitro de folículos pré-antrais de
camundongas cultivados por 5 dias em FSH (Boland et al., 1993). Apesar da ação do LH ser
direcionada para o estádio final da foliculogênese, sua ação conjunta com o FSH auxilia na
proliferação celular, diferenciação, produção de estrógeno e posterior maturação (Qvist et al.,
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1990). Recentemente, Braw-Tal & Roth (2005), demonstraram a presença de receptores para
LH na teca interna de folículos pré-antrais em estádios mais avançados e tais receptores estão
diretamente relacionados à viabilidade folicular, sendo sua presença progressivamente
reduzida com a atresia. Além da necessidade da obtenção de conhecimentos acerca da
importância do LH sobre folículos pré-antrais, torna-se necessário conhecer as concentrações
ideais no cultivo “in vitro” de tais folículos.
2.4 População e atresia folicular
Conforme observado, a foliculogênese é um processo complexo que envolve a
interação de diferentes hormônios e fatores de crescimento. Como conseqüência, a maioria
dos milhares de folículos presentes nos ovários mamíferos ao nascimento não ovula, mas
morrem por um processo conhecido por atresia.
A população folicular é estabelecida ainda na vida fetal (primatas e ruminantes –
Betteridge et al., 1989) ou em um curto período de tempo após o nascimento (roedores –
Hirshfield, 1991). Entretanto, recentemente trabalhos têm demonstrado mecanismos
envolvidos na formação, após o nascimento, de novas células germinativas e folículos na
mulher (Bukovski et al., 2004) e camundonga adultas (Johnson et al., 2004). Os folículos pré-
antrais representam 90% do total de folículos e constituem o estoque de gametas femininos
durante a vida reprodutiva do animal (Liu et al., 2001). O número de folículos pré-antrais por
ovário varia entre espécies, sendo de aproximadamente 1.500 na camundonga (Shaw et al.,
2000); 33.000 na ovelha (Amorim et al., 2000); 35.000 na cabra (Lucci et al., 1999) e
aproximadamente 2.000.000 na mulher (Erickson, 1986).
Durante a vida reprodutiva da fêmea, ocorre uma redução ordenada, geralmente
exponencial, no número de folículos pré-antrais (Shaw et al., 2000). Essa redução é devida a
dois fenômenos que ocorrem naturalmente no ovário: (i) a ovulação e (ii) a atresia ou morte
folicular. A atresia pode ocorrer por via degenerativa (Saumande, 1981) e/ou apoptótica
(Figueiredo et al., 1995). A degeneração pode ser observada após os procedimentos de
preservação in vitro, quando ocorrem alterações no fornecimento de oxigênio e nutrientes
para o ovário. Nesta situação, a isquemia pode ser uma das principais causas do
desencadeamento da morte folicular (Farber, 1982), resultando em alterações na
permeabilidade da membrana celular. Essas alterações podem levar ao aumento de água
intracelular e do volume celular, vacuolização citoplasmática e, conseqüentemente,
degeneração (Barros et al., 2001). Análises histológicas e ultra-estruturais de folículos
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primordiais e primários degenerados, mostraram oócito retraído com núcleo picnótico e
numerosos vacúolos no ooplasma, sendo estes os principais sinais de degeneração Tipo 1,
(degeneração ocorrida apenas no oócito). Já em folículos secundários, alterações tanto no
oócito quanto nas células da granulosa são mais freqüentes, sendo observada uma baixa
densidade de células e aumento de volume, caracterizando assim uma degeneração do Tipo 2
(Silva et al., 2001).
Já a apoptose é um processo de morte celular individual e ativo, caracterizado pela
fragmentação nuclear e pela formação de corpos apoptóticos (Rachid et al., 2000). O processo
de apoptose é altamente dependente da expressão de genes (Barnett et al., 2006). O balanço
estabelecido entre o produto dos genes pró-apoptóticos e anti-apoptóticos pode determinar a
morte celular (Hurwitz & Adashi, 1992). A progressão da apoptose pode ser dividida nas
fases de iniciação, execução e terminação. A fase de iniciação pode ser promovida por fatores
qua ativam a via extrínseca (receptores de morte localizados na membrana celular), tais como
citocinas (ex. Fator de Necrose tumoral-α, Fas ligand) e proteínas virais ou pela remoção de
fatores de crescimento. A morte celular também pode ser induzida por fatores que ativam a
via intrínseca (mitocondrial), tais como o estresse oxidativo ou irradiação. Independentemente
dos tipos de fatores envolvidos, ocorre o envolvimento de uma ou mais caspases de iniciação
(caspase 8, caspase 9) (Morita & Tilly, 1999; Johnson & Bridgham, 2002). A fase de
execução é caracterizada por mudanças na membrana celular, fragmentação nuclear,
condensação da cromatina e degradação do DNA. Esta fase é considerada irreversível e
ocorre devido à ativação das caspases efetoras (caspases 3, 6 e 7). Finalmente, a fase de
terminação consiste na fagocitose de corpos apoptóticos fragmentados através de um processo
não inflamatório. No sentido de evitar a morte celular por apoptose, existem processos de
sobrevivência celular que promovem a transcrição de várias proteínas anti-apoptóticas, tais
como os membros da família Bcl-2, que bloqueiam a progressão da apoptose em diferentes
etapas ao longo deste processo (Johnson et al., 2003).
2.5 Sistema de cultivo in vitro de folículos pré-antrais
Para evitar a enorme perda folicular que ocorre naturalmente “in vivo”, vem sendo
desenvolvida a biotécnica MOIFOPA que é constituída pelas fases de isolamento,
conservação e cultivo folicular “in vitro”. No tocante ao cultivo “in vitro”, vários sistemas
têm sido desenvolvidos e os resultados são dependentes do tipo de meio utilizado e da espécie
animal (Eppig e Schoeder, 1989, Boland et al., 1994, Fortune, 2003).
29
Para o cultivo “in vitro” de folículos pré-anrais, especialmente nos estádios de
folículos primordiais e primários, existem dois sistema bem definidos (Van den Hurk et al.,
2000). O mais utilizado envolve o cultivo de pequenos fragmentos de tecido ovariano, cultivo
“in situ”, no qual a integridade estrutural folicular é mantida e as interações entre as células
foliculares e células do estroma são permitidas. Através desse método, folículos primordiais
de caprinos, bovinos (Braw-tal e Yossefi, 1997) e humanos (Hovatta et al., 1997; Wright et
al., 1999; Louhio et al., 2000; Scott et al., 2004 e Zhang et al., 2004) cresceram até folículos
secundários. Folículos humanos permaneceram viáveis por quatro semanas quando cultivados
em sistema “in situ” (Hovatta et al., 1997).
Já o segundo sistema de cultivo folicular envolve o isolamento, mecânico ou
enzimático dos folículos ovarianos pré-antrais (Abir et al., 1999, 2001b). As técnicas de
isolamento desenvolvidas possibilitam a recuperação de milhares de folículos pré-antrais a
partir de um único ovário (Figueiredo et al., 2002). Além disso, o cultivo de folículos isolados
permite o monitoramento diário do crescimento folicular in vitro (Abir et al., 2001a).
Os maiores avanços do cultivo folicular foram obtidos em roedores, tendo sido obtido
o nascimento de crias viáveis a partir do cultivo de oócitos provenientes de folículos pré-
antrais de camundongas, nos quaia o oócito adquiriu competência para maturação, fertilização
e desenvolvimento embrionário (O’ Brien et al., 2003). Tal crescimento foi obtido através de
dois sistemas de cultivo. O primeiro consistiu no cultivo de ovários inteiros para obtenção da
transição de primordial para primário. O segundo consistiu no isolamento e cultivo de
folículos primários e secundários. Provavelmente essa estratégia é necessária para promover o
crescimento de folículos primordiais de espécies domésticas e primatas (Silva et al., 2006).
No entanto, o tamanho dos ovários dos animais domésticos impede seu cultivo inteiro, sendo
necessária a fragmentação do córtex ovariano. Embora a utilização de fragmentos ovarianos
no cultivo, permita a ativação folicular (Hovatta et al., 1999), a variedade de células presentes
no cultivo in situ torna o sistema pouco definido e impede estudos mais detalhados sobre a
biologia dos oócitos e da foliculogênese nos estádios iniciais de desenvolvimento (Muruvi et
al., 2005). O presente desafio é determinar condições de cultivo apropriadas para dar suporte
à transição de folículos primários para secundários “in vitro”.
30
3. JUSTIFICATIVA
Os folículos primordiais constituem o pool de reserva de folículos quiescentes e
compreendem cerca de 90 a 95% de toda população folicular presente no ovário mamífero.
No entanto, para que estes folículos possam entrar em fase de crescimento (intermediário,
primário, secundário, terciário e/ou pré-ovulatório), é preciso que sejam ativados, ou seja,
retomem a proliferação das células da granulosa, bem como aumentem os volumes
citoplasmático e nuclear do oócito. Neste contexto, sabendo-se do grande valor econômico
que a espécie caprina representa para o Nordeste brasileiro, é de extrema importância o
desenvolvimento de um sistema de cultivo in vitro capaz de ativar esses folículos e assegurar
seu posterior crescimento e maturação in vitro, otimizando o aproveitamento do potencial
oocitário desses animais e incrementando a eficiência da reprodução animal. Além disso, o
desenvolvimento de um sistema de cultivo eficiente poderá fornecer subsídios para uma
melhor compreensão acerca dos fatores que regulam a foliculogênese na fase pré-antral,
fatores esses necessários para a sobrevivência, a ativação e o início do crescimento folicular.
Estudos referentes aos fatores e mecanismos envolvidos na regulação e ativação dos
folículos primordiais são escassos, especialmente em animais de produção, como os caprinos.
Desse modo, diversos autores têm investigado o efeito de vários componentes no cultivo de
folículos pré-antrais tanto de animais de laboratório como de animais domésticos como vaca,
cabra e ovelha. Substâncias como soro fetal, FSH, estradiol, EGF são largamente utilizadas.
Entretanto, os efeitos de diferentes concentrações de LH, bem como sua interação com o FSH
não tinham sido testadas no cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos. Além disso, não
eram conhecidos os efeitos deste cultivo sobre as características estruturais e ultra-estruturais
de folículos pré-antrais caprinos. Assim, a utilização da microscopia eletrônica de transmissão
para determinar a qualidade de folículos pré-antrais caprinos cultivados in vitro pode fornecer
dados precisos sobre a qualidade folicular.
Desta forma, a realização deste trabalho contribuirá para a compreensão da
foliculogênese caprina, o que poderá no futuro, trazer benefícios para otimização da produção
de embriões caprinos em larga escala.
31
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA
O FSH e o LH podem influenciar positivamente na ativação e crescimento in vitro de
folículos pré-antrais caprinos.
EXPERIMENTOS
O presente trabalho foi dividido em dois experimentos, a saber:
EXPERIMENTO I: Cultivo in vitro de oócitos inclusos em folículos pré-antrais caprinos
utilizando diferentes concentrações de LH.
EXPERIMENTO II: Avaliação da interação do LH e do FSH no cultivo in vitro de oócitos
inclusos em folículos pré-antrais caprinos.
32
5. OBJETIVOS
EXPERIMENTO I: Cultivo in vitro de oócitos inclusos em folículos pré-antrais caprinos
utilizando diferentes concentrações de LH.
Objetivo Geral
- Estudar o efeito do LH sobre o cultivo de folículos pré-antrais caprinos in vitro.
Objetivos Específicos
- Estabelecer a melhor concentração de LH para o cultivo de folículos pré-antrais
caprinos, tendo como parâmetros a viabilidade, a ativação e o crescimento de folículos pré-
antrais;
- Analisar morfológica e ultra-estruturalmente os folículos pré-antrais caprinos
cultivados in vitro com LH.
EXPERIMENTO II: Avaliação da interação FSH e LH no cultivo in vitro de oócitos
inclusos em folículos pré-antrais caprinos.
Objetivo Geral
- Cultivar in vitro folículos pré-antrais caprinos utilizando o FSH sozinho ou em
associação ao LH em diferentes concentrações.
Objetivos Específicos
- Verificar o efeito do FSH isoladamente ou em associação ao LH sobre a viabilidade,
ativação e crescimento in vitro de folículos primordiais caprinos;
- Analisar morfológica e ultra-estruturalmente os folículos pré-antrais caprinos
cultivados in vitro com LH e FSH.
33
6. Capítulo 1
Influence of different concentrations of Luteinizing Hormone (LH) and Follicle Stimulating
Hormone (FSH) on caprine preantral follicle development
O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito do LH, FSH e a interação de ambos sobre o crescimento de folículos pré-antrais caprinos cultivados in vitro. Para realização do experimento oito pares de ovários provenientes de cabras adultas sem raça definida foram coletados de abatedouros locais e transportados até o laboratório. Cada par de ovário foi dividido em 11 fragmentos e, um deles foi imediatamente fixado, para constituir o grupo controle, e os demais foram cultivados em meio essencial mínimo MEM+ na ausência ou presença de LH nas concentrações 1, 5 ,10, 50 ou 100 ng/ml (Experimento 1), ou nas mesmas concentrações associadas ao FSH 50 ng/mL (Experimento 2). O cultivo foi realizado por 1 e 7 dias à 39 °C em atmosfera de 5% CO2. Ao término desse período, proporções relativas de folículos primordiais, primários e secundários foram calculadas e comparadas com aquelas em tecido não cultivado. A morfologia folicular foi analisada por histologia clássica e microscopia eletrônica e os folículos foram classificados em degenerados, de acordo com o grau de comprometimento do oócito e células da granulosa. Os resultados mostram que após 7 dias de cultivo a presença de LH (10, 50 ou 100 ng/mL) no meio de cultivo aumentou significativamente a percentagem de folículos em desenvolvimento. Em adição, os fragmentos cultivados em meio suplementado com FSH sozinho ou associado ao LH aumentaram as taxas de folículos em desenvolvimento após um dia de cultivo (P<0,05), mas no dia sete não foram verificadas diferenças significativas (P>0,05). Ao final do período de cultivo, o LH 1, 5 e 10 ng/mL aumentaram o diâmetro oocitário em relação ao controle, mas apenas o LH 1 e 5 ng/mL aumentaram o diâmetro folicular em relação ao MEM (P<0,05). Em associação ao FSH, estas mesmas concentrações de LH (1 e 5 ng/mL) aumentaram o diâmetro folicular no dia 7 em relação ao MEM. Referente à sobrevivência folicular, a concentração mais baixa de LH (1 ng/mL) manteve a viabilidade semelhante ao grupo controle e ao MEM (P>0,05) após 7 dias de cultivo. Contudo, as concentrações mais altas de LH (5, 10, 50 e 100 ng/mL) induziram atresia dos folículos caprinos cultivados. Após 7 dias, os folículos cultivados em meio suplementado com FSH sozinho ou associado ao LH 1 ng/mL mantiveram as características ultra-estruturais similar ao dia 0. Em conclusão, a adição de baixas concentrações de LH (1 ng/mL) associado ou não ao FSH, mantiveram a integridade ultra-estrutural de folículos pré-antrais caprinos, mas o LH em concentrações superiores a 5 ng/mL induziu a atresia destes folículos.
PALAVRAS-CHAVE: Folículo, pré-antral, caprino, cultivo in vitro, LH, FSH.
34
Influence of different concentrations of Luteinizing Hormone (LH) and Follicle Stimulating
Hormone (FSH) on caprine primordial follicle development
M.V.A. Saraivaa, J.J.H. Celestinoa, R.N. Chavesa , F.S. Martinsa, J.B. Bruno, I.B. Lima
Verdea, M.H.T. Matosa, G.M. Silvaa; E. P. Porfiriob, S.N. Báob, C.C. Campelloa, J.R.V. Silvaa,
J.R. Figueiredoa
aFaculty of Veterinary Medicine, LAMOFOPA, PPGCV, State University of Ceara, Fortaleza,
CE, Brazil
bLaboratory of Electron Microscopy, Department of Cell Biology, University of Brasilia,
Brasilia, DF, Brazil
*Corresponding address:
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV)
Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA)
Universidade Estadual do Ceará (UECE)
Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi.
Fortaleza – CE – Brasil. CEP: 60740-000
Tel.: +55.85.3101.9852; Fax: +55.85.3101.9840
E-mail address: [email protected] (M.V.A. Saraiva)
35
Abstract
The roles of gonadotropins in the regulation of primordial follicle development remain poorly
understood. The aims of the present study were to investigate the effects of Luteinizing
Hormone (LH) alone or in association with Follicle Stimulating Hormone (FSH) on survival,
activation and growth of caprine primordial follicles using histological and ultrastructural
studies. To this end, pieces of caprine ovarian cortex were cultured for 1 or 7 days, at 39oC in
an atmosphere containing 5% CO2, in Minimum Essential Medium (MEM - control medium)
supplemented with different concentrations of LH (0, 1, 5, 10, 50 or 100 ng/mL – experiment
1). In experiment 2, control medium was supplemented with FSH (50 ng/mL) and different
concentrations of LH (0, 1, 5, 10 or 50 ng/mL). Small fragments from non-cultured ovarian
tissue as well as from those cultured for 1 or 7 days in a specific medium were processed for
classical histology and transmission electron microscopy (TEM) to evaluate follicular
integrity and to calculate the percentages of normal follicles. Additionally, effects of FSH on
oocyte and follicle diameter of cultured follicles were evaluated. The results showed that after
7 days of culture, the presence of LH (10, 50 or 100 ng/mL) in culture media significantly
increased the percentages of developing follicles (P<0,05). In addition, fragments cultured in
media supplemented with FSH alone or FSH plus LH had higher percentage of developing
follicles after one and seven days culture compared with control (P<0,05). At the end of
culture period, 1 and 5 ng/mL LH increased follicular diameter, while addition of 1, 5 or 10
ng/mL LH increased oocyte diameter (P<0,05). In association with FSH, LH (1 and 5 ng/mL)
increased follicular diameter (P<0,05). With regard to follicle survival, low doses of LH (1
ng/mL) kept follicle viability similar to control medium after 7 days culture. However, higher
concentrations of LH (5, 10, 50 and 100 ng/mL) induced atresia in goat follicles. Culture of
ovarian cortex for 7 days in medium supplemented with FSH or LH 1 ng/mL alone or FSH
36
plus 1ng/mL LH kept ultrastructural characteristics of follicles similar to day 0. In conclusion,
addition of low concentrations of LH (1 ng/mL) associated or not with FSH maintain goat
follicles ultrastructural integrity, but LH in doses higher than 5 ng/mL induces atresia in goat
preantral follicles.
Keywords: Caprine, Primordial Follicles, Culture, LH, FSH.
1. Introduction
It is well established that gonadotropins are required for antral follicle development,
but not for the development of preantral follicles (primordial, primary and secondary
follicles). However, large quantitative changes in the population of preantral follicles after
hypophysectomy of mice (Edwards et al., 1977) and ewes (Dufour et al., 1979) provide
evidence that gonadotropins do affect the development of follicles at preantral stages. Effects
of FSH on preantral follicles from humans and domestic species were also observed. When
Wright et al. (1999) added FSH to cortical pieces from human ovaries the percentage of
atretic follicles was decreased and follicle diameter increased during a 15-day culture period.
In contrast, the addition of FSH at 5 ng/ml (Derrar et al., 2000) or graded doses of FSH
(Fortune et al., 1998) had no effect on follicular populations during longer cultures (7-14
days) of bovine cortical pieces. However, a recent study with caprine follicles showed that, at
a concentration of 50 ng/mL FSH is able to promote the activation of primordial follicles and
further growth of activated follicles (Matos et al., 2007). Receptors of FSH are expressed in
granulosa cells (Ulloa-Aguirre et al., 1995; O’Shaughnessy et al., 1997) from primary
follicles and more recent reports indicate its presence in oocytes (Méduri et al., 2002).
37
Regarding to LH, much less is known about its potential effects on growth of preantral
follicles. Experiments accomplished by Wu et al. (2000) indicated that in mice LH is need for
in vitro development of preantral follicles to antral stages. Large preantral follicles (150-160
µm) developed to antral follicles in presence of FSH and serum, but addition of LH, together
with serum and FSH, was important to promote the development of small preantral follicles
(85-110 µm) to the antral stage. Liu et al. (2002) developed a culture system that allows the
maturation of preantral follicles in vitro with recombinant gonadotropins. Receptors of LH
have a more widespread distribution and are also found in non gonadal tissues (Reshef et al.,
1990; Reiter et al., 1995). In the ovary, LH receptors are found primarily in the interstitial
(McFarland et al., 1989) and thecal cells, and only in the mid-follicular phase, granulosa cells
acquire LH receptors (Zeleznick and Hillier, 1984; Yamoto et al., 1992) as well as in the
preovulatory follicle and the corpus luteum (Zeleznick et al., 1974; McFarland et al., 1989).
The acquisition of LH receptors by granulosa cells depends upon the actions of FSH and
estradiol together. FSH induces the expression of LH receptors in granulosa cells by
increasing transcription of the LH receptor gene (Segaloff, 1996).
Although the importance of FSH and LH for antral follicle development in vivo is well
know, the effects of both hormones on primordial follicle growth during culture of caprine
ovarian cortex was not yet evaluated. Thus, the goal of the present study was to investigate
whether LH alone or in combination with FSH, have a beneficial role in the survival,
activation and further growth of in vitro cultured goat primordial follicles enclosed in ovarian
cortex. To this aim, both histological and ultrastructural studies were performed to investigate
and compare the morphology of follicles before and after culture for 1 or 7 days in the
absence or presence of LH at different concentrations (1, 5, 10, 50 or 100 ng/ml) alone, or
associated with FSH (50 ng/mL).
38
2. Material and Methods
2.1. Source of ovaries
Ovaries (n = 8 for experiment 1, n = 8 for experiment 2) from eight adult non-pregnant
mixed-breed goats were collected at a local slaughterhouse. The animals were cyclic and in
good body condition. Then, the ovaries were washed and transported in MEM (Minimum
Essential Medium) to the laboratory in thermo flasks with water at 33oC within 30 minutes.
2.2. Culture medium
The control medium was Minimum Essential Medium (Cultilab, Rio de Janeiro, Brazil)
supplemented with ITS (insulin 6.25 µg/mL, transferrin 6.25 µg/mL, and selenium 6.25
ng/mL), 0.23 mM pyruvate; 2 mM glutamine; 2 mM hypoxanthine; 1.25 mg/mL BSA, 100
µg/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin (Vetec, Rio de Janeiro, Brazil) (MEM+). This
control medium (MEM) was supplemented with porcine FSH (50 ng/mL) and/or porcine LH
(1, 5, 10, 50 or 100 ng/mL) (both provided by Dr. J.F. Beckers, Liège, Belgium). All chemicals
used in the present study were purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)
unless otherwise indicated.
2.3. Experimental protocol
In experiment one, goat ovaries (n = 8) were collected and stripped of surrounded fat
tissue and ligaments, and cut in half, after the medulla, large antral follicles and corpora lutea
were removed. Following this, the ovarian cortex was divided into 11 fragments of
39
approximately 3 x 3 mm (1 mm thick). One fragment was immediately fixed for classic
histological studies (non-cultured controls) while a smaller fragment (1 mm3) was randomly
collected and subsequently fixed for ultrastructural examination. The other fragments of
ovarian cortex were individually cultured in vitro in 1 mL of culture medium supplemented
with different concentrations of porcine LH (1, 5, 10, 50 or 100 ng/mL). To evaluate the
interaction between FSH and LH (experiment 2), 8 ovaries were collected and the fragments
obtained of ovarian cortex were individually cultured in vitro in 1 mL of culture medium
supplemented with porcine FSH (50 ng/mL) alone or associated to LH (1, 5, 10 or 50 ng/mL).
The culture was performed for 1 or 7 days at 39°C with 5% CO2 in air using a 24-well culture
dish. Every two days, the culture medium was replaced by fresh medium. Each treatment was
repeated four times using the ovaries of four different animals for each experiment.
2.2. Histological analysis and assessment of in vitro follicle growth
For both experiments, to evaluate the morphology of caprine follicles after 1 or 7 days
of culture, a small part (1 mm3) from each fragment was randomly removed for TEM studies,
while the remainder was fixed in Carnoy for 12 h for histological studies. After fixation, the
tissue fragments were dehydrated in graded series of ethanol, clarified with xylene and
embedded in paraffin wax. For each piece of ovarian cortex, 7µm sections were mounted on
slides, stained with periodic acid Schiff and hematoxylin (PAS staining system, Sigma, Inc.,
St. Louis, MO, USA), and examined by light microscopy (Zeiss, Germany) at 100X and 400X
magnification.
The follicles were classified as primordial (one layer of flattened granulosa cells
around the oocyte), or developing follicles i.e., intermediate (one layer of flattened to cuboidal
granulosa cells around the oocyte), primary (a single layer of cuboidal granulosa cells around
40
the oocyte), or secondary (oocyte surrounded by two or more layers of cuboidal granulosa
cells). These follicles were classified individually as histologically normal (1) when an intact
oocyte was present, i.e. an oocyte without a pyknotic nucleus, surrounded by granulosa cells
which are well organized in one or more layers and that have no pyknotic nucleus or (2).
degenerated follicles were defined as those with a retracted oocyte, which have a pyknotic
nucleus, and/or are surrounded by disorganized granulosa cells, which are detached from the
basement membrane. From each medium and culture period, approximately 120 follicles were
randomly evaluated.
To evaluate follicular activation and growth, only intact follicles with a visible oocyte
nucleus were recorded, and the proportion of primordial and growing follicles were calculated
at day 0 (controls) and after 1 or 7 days of culture in the various media tested. Major and
minor axes of each oocyte and follicle were measured with the aid of an ocular micrometer.
The averages of the minor and major axes were reported as oocyte and follicle diameters,
respectively. These values were used to assess the effect of the hormonal treatment on
follicular growth.
2.3. Ultrastructural analysis
For ultrastructural analysis, small pieces of ovarian cortex were fixed in 2%
paraformaldehyde, 2.5% glutaraldehyde, and 0.1 M sodium cacodylate buffer, pH 7.2. After
washing the ovarian pieces with sodium cacodylate buffer, they were post-fixed in 1%
osmium tetroxide, 0.8% potassium ferricyanide and 5 mM CaCl2 in 0.1 M sodium cacodylate
buffer. Subsequently, samples were dehydrated in graded series of acetone and embedded in
Spurr´s epoxy resin. Firstly, semi-thin sections (3 µm) were cut on an ultramicrotome
(Reichert Supernova, German) for light microscopy studies and stained with toluidine blue.
41
Subsequently, follicles classified as histologically normal in semi-thin toluidin blue stained
sections were submitted to ultrastructural analysis. For that purpose, thin sections (70 nm)
were cut and then contrasted with uranyl acetate and lead citrate, and examined using a Jeol
1011 (Jeol, Tokyo, Japan) transmission electron microscope.
2.4. Statistical analysis
Data for follicles and oocytes diameters were analyzed statistically as follows.
Kolmogorov-Smirnov and Bartlett’s tests were applied to confirm normal distribution and
homogeneity of variance, respectively. Analysis of variance was then made using GLM
procedure of SAS (1999) and Dunnett’s test was applied for comparison of control groups
against each treatment tested (Steel et al., 1997), whilst Student’s t-test was used to compare
means between one and seven days of cultivation. Differences among groups were considered
significant when P<0.05 and results were expressed as means ± standard deviation. Chi-
square test was used to compare percentages of viable follicles among the days.
3. Results
3.1. Effects of FSH and LH on primordial follicle activation
The percentage of primordial and developing follicles in goat ovarian tissue before and
after culture in media supplemented with LH is shown in Table 1. Growth was evaluated only
for follicles considered morphologially normal during culture (Figure 1A). After one day
culture in medium containing 10 ng/mL LH, a significant reduction of primordial follicles and
concomitant increase of developing follicles was observed when compared to day 0 (non-
42
cultured control). However, no significant differences were observed among treatmens. At
day 7 of culture, the presence of 10, 50 or 100 ng/mL of LH in culture media significantly
increased the percentages of developing follicles in relation to day 0, and follicles cultured in
MEM (P<0,05). Cultured ovarian tissue in MEM or MEM plus 1 or 5 ng/mL LH had similar
percentages of developing follicles when compared to day 0. Increasing the culture period
from 1 to 7 days, higher percentages of developing follicles was observed in ovarian tissue
cultured in media supplemed with 50 or 100 ng/mL LH (P<0,05).
The effects of both FSH and LH on primordial follicle development are shown in
Table 2. After one and seven days culture, all treatments showed a significant reduction in the
percentage of primordial follicles that was followed by a significant increase of developing
follicles when compared to day 0, except for tissue cultured in FSH plus and 10 ng/mL LH for
one day. Cortical tissue cultured in media supplemented with FSH alone or FSH plus LH (all
concentrations) had higher percentage of developing follicles, as well as lower percentage
primordial follicles than MEM after one day culture. After 7 days culture, significant
differences were observed among the treatments compared to day 0. When the culture period
was increased from 1 to 7 days, ovarian tissue cultured in FSH plus LH 10 ng/mL had higher
percentage of developing follicles, as well as lower percentage of primordial follicles (Table
2).
3.2. Effects of FSH and LH on oocyte and follicle diameters
After one day culture in all media, oocyte and follicle diameters were similar to day 0,
and no differences were observed among treatmens and MEM (Table 3). After 7 days culture
of ovarian tissue in medium supplemented with LH (1, 5, 10, 50, 100) ng/mL a significant
increase in oocyte and follicle diameters was observed when compared to day 0, except for
43
oocyte diameter in tissue cultured in MEM plus 50 and 100 ng/mL LH. When follicles were
cultured for 7 days in MEM plus 1 or 5 ng/mL LH that had higher diameter when compared
to MEM. When the culture period was increased from 1 to 7 days, a significant increase in
follicle and oocyte diameter was observed after culture in MEM or MEM plus 1, 5 and 10
ng/mL LH, except for oocyte diameter in tissue cultured in MEM alone (Table 3).
Table 4 shows the effects of FSH alone or the interaction between FSH and LH on
oocyte and follicle diameters. After one day, ovarian tissue cultured in all media had similar
oocyte and follicle diameters when compared to day 0. Similar results were observed for
oocyte diameter at day 7 of culture. In contrast, a significant increase in follicle diameter was
observed after 7 days culture in medium supplemented with FSH or FSH plus LH, when
compared to day 0. In addition, cortical tissue cultured for 7 days in FSH plus and 1 or 5
ng/mL LH had significantly higher diameter than MEM and FSH (P<0,05 – Table 4).
3.3. Effects of FSH and LH on follicle survival
Cortical tissue cultured for one day in MEM or MEM plus 1 ng/mL LH kept the
percentages of normal follicles (Figure 1A) similar to day 0. Degenerated follicle is shown in
Figure 1B. After 7 days, tissues cultured in all tested media had significantly lower
percentages of normal follicles when compared to day 0 (non-cultured control). After 1 or 7
days culture, addition of 5, 10, 50 or 100 ng/mL LH to culture medium promoted a significant
reduction of normal follicles was observed when compared to day 0, MEM or MEM plus 1
ng/mL LH (Table 5). When the culture period was increased from 1 to 7 days, a significant
reduction of normal follicles in tissues cultured in MEM plus LH at 5, 10 and 50 ng/mL. With
regard to the effect of the interaction between FSH and LH, cortical tissue cultured for one
day in MEM or MEM plus FSH kept the percentages of normal follicles similar to day 0.
44
After 7 days, tissues cultured in all tested media had significantly lower percentages of normal
follicles when compared to day 0. After 1 day culture, addition FSH + LH (1, 5, 10 or 50
ng/mL) together significantly reduced the percentage of normal follicles when compared to
MEM or MEM plus FSH alone. Similar results were observed after 7 days, except for FSH
plus 1 or 5 ng/mL LH (Table 6). With the increased of culture period from 1 to 7 days, a
significant reduction of normal follicles was observed in tissues cultured in all media, except
for FSH + LH 50 ng/mL.
3.4. Ultrastructural characteristics of cultured follicles
Based on histological results, ultrastructural evaluation was performed in non-cultured
tissue and in tissue cultured for 7 days in MEM supplemented or not with 1 ng/mL LH, as
well as in FSH plus and LH (1 or 5 ng/mL). Follicles cultured for 7 days in MEM plus 1
ng/mL LH and in MEM plus FSH and LH (1 ng/mL) had ultrastructural characteristics similar
to day 0 (non-cultured control). In contrast, follicles cultured in MEM alone or MEM plus
FSH and LH (5 ng/mL) had signs of degeneration. Normal follicles had intact oocyte showing
nuclear membranes, unpacked nuclear chromatin and cytoplasm rich in organelles
(Figure 2A). The cytoplasm contained numerous rounded mitochondria with peripheral cristae
and continuous mitochondrial membranes (Figures 2A, B and C). In all the oocytes, a large
number of vesicles spread throughout the cytoplasm were observed, but Golgi complexes
were rarely seen. Both smooth and rough endoplasmic reticulum was present, either as
isolated aggregations or as complex associations with mitochondria. Granulosa cells had
irregularly-shaped nuclei, and the cytoplasm contained a great number of elongated
mitochondria with lamellar cristae and well-developed rough endoplasmic reticulum (Figure
2C). Degenerated follicles had low cytoplasm density in oocyte and granulosa cells, as well as
45
broken oocyte and nuclear membranes (follicles cultured for 7 days in MEM plus FSH and
LH (5 ng/mL) - Figure 2D).
4. Discussion
This study showed for the first time the effect of different concentration of LH, alone
or in association with FSH, on primordial follicle development and viability after culture of
goat ovarian cortical tissue in vitro.
Higher percentages of primordial follicle activation were observed in ovarian cortex
cultured for 7 days in medium supplemented with high concentration of LH (10, 50 or 100
ng/mL). Flaws et al. (1997) demonstrated that high levels of LH can stimulate growth of
primordial follicle and their transition to primary and secondary stages. In our study, when
associated to FSH, LH (1, 5, 10 or 50 ng/mL) did not increase primordial follicle activation.
According to Médure et al. (2002), transition from primordial to primary follicle stage is not
directly dependent of FSH. In addition, Silva et al. (2004) did not observe effect of FSH
(100ng/mL) on goat primordial follicle activation in vitro. On the other hand, addition of
50ng/mL FSH increased goat primordial follicle activation and growth after 1 day culture
(Matos et al., 2007). FSH can act indirectly, since it regulates the production of prarcrine
factors, such as kit ligand, BMP-15 and GDF 9, which promote oocyte development (Thomas
et al., 2005) and primordial follicle activation (Elvin et al., 1999; Vitt et al., 2000; Kingler
and Felici, 2002). Additionally, during follicle development, gonadotropins promote growth
and differentiation of granulosa cells, as well as oocyte growth and maturation (Cortvrindt et
al., 1998a,b).
After 7 days culture, 1, 5 and 10 ng/mL LH increased oocyte diameter, while addition
only of LH 1 or 5 ng/mL increased follicular diameter. Furthermore, in association with FSH,
46
LH (1 and 5 ng/mL) increased follicular diameter. In mice, addition of both FSH and LH to
culture medium also increased follicular growth (Cortvrindt et al., 1997, 1998a,b; Liu et al.,
2002). In the ovary, LH receptors are expressed in interstitial cells (McFarland et al., 1989),
as well as theca and granulosa cells (McFarland et al., 1989). Probably, these cells are
stimulated by LH and then secrete factors that promote preantral follicle growth. To support
this hypothesis, Liu et al. (2002) showed that in absence of LH no proliferation of granulosa
cells is observed in vitro. With regard to FSH, its receptor is expressed in oocyte (Méduri et
al., 2002) and granulosa cells (Xu et al., 1995) of preantral follicles. Studies in vitro showed
that FSH stimulates oocyte growth in preantral follicles (caprine: Matos et al., 2207; bovine:
Itoh et al., 2002; murine: Cortvrindt et al., 1998a). In addition, FSH, together with estradiol,
activates granulosa cell proliferation, increase aromatase activity and promote expression of
LH receptors in granulosa cells (Zeleznik et al., 1974; Carson and Smith, 1986; Xu et al.,
1995).
With regard to follicular survival, low doses of LH (1 ng/mL) kept follicle viability
similar to control medium after 7 days culture. However, higher concentrations of LH (5, 10,
50 and 100 ng/mL) induced atresia in up to 85% (LH 100 ng/mL) of follicles. The presence of
both FSH and LH (1 and 5 ng/mL) kept follicle survival similar to control. Flaws et al. (1997)
demonstrated that high levels of LH promote depletion of primordial follicle population.
According to this author, elimination of primordial follicles in mice can be due to the fact that
(1) LH, in high levels, stimulates primordial follicle growth and transition to primary and
secondary stages (2) or induces apoptosis of primordial follicles. In addition, Simplício (1985)
showed that plasmatic level of LH in goats ranges from 0,41 to 4 ng/mL during anestrous and
from 6,1 to 28,0 ng/mL during estrus. In human, during the period of perimenopause, the loss
of primordial follicles accelerates at a rate twice that seen previously (Richardson et al.,
1987). If not for this acceleration, women would remain fertile well into their eighties (Faddy
47
et al., 1992). During perimenopause, women experience transient elevations in the levels of
both LH and FSH (Sherman et al., 1976; Marcus et al., 1993). This altered endocrine milieu
exerts a toxic effect on the primordial follicle pool, accelerating its depletion (Richardson et
al., 1987). Studies with transgenic mice also demonstrated that high levels of LH rapidly
reduces the pool of primordial follicles (Barnett et al., 2006). The effects of FSH and LH on
follicle viability can be via glucose metabolism, since gonadotropins significantly influence
several regulators enzymes of glicolysis and Krebs cycle may be influenced differently by
FSH and LH, and the influence varies with the maturation status of the follicles (Roy and
Terada, 1999).
In this study, medium supplemented with FSH alone or FSH plus 1ng/mL LH kept
ultrastructural characteristics of 7-day cultured follicles. Recently, Matos et al. (2007) showed
similar results after culturing ovarian tissue in medium containing FSH alone. In contrast,
follicles cultured with FSH and 5 ng/mL LH had various signs of degeneration, such as
numerous vacuoles in the ooplasm. These vacuoles are the first signs of degeneration
observed in atretic follicles and may represent endoplasmic reticulum swelling or altered
mitochondria (caprine: Silva et al., 2002; ovine: Jorio et al., 1991). Normal follicles had their
ultrastructure similar to that previously described for goat (Lucci et al., 2001) and other
species (bovine: Van Wezel and Rodgers, 1996; swine: Greenwald and Moor, 1989, human:
Oktay et al., 1997). Round or elongated mitochondria were abundant in the ooplasm of goat
follicle. The round shape of the mitochondria, indicate immaturity (Perkins and Frey, 2000),
in accordance with the quiescent stage of primordial follicle oocytes. In these follicles the
round mitochondria were the vast majority in the oocyte cytoplasm, being gradually replaced
by elongated mitochondria in the oocytes of primary and secondary follicles (Lucci et al.,
2001).
48
In conclusion, addition of FSH (50 ng/mL) associated or not with low concentrations
of LH (1 ng/mL) maintain goat primordial follicles ultrastructural integrity after cultured
follicles. However, LH in doses higher than 5 ng/mL induces atresia and reduces primordial
follicle population in cultured goat cortical tissue. Further studies on the effects of LH in the
modulation of paracrine growths factors are still needed to understand the effects of LH on
early folliculogenesis in goats.
Acknowledgements
This work was supported by CAPES. Márcia Viviane Alves Saraiva is a recipient of a grant
from CAPES (Brazil). We would like to acknowledge the generous donation of FSH and LH
by Dr. Jean-François Beckers of the University of Liège, Belgium.
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Table 1. Percentages of primordial or developing follicles in non-cultured tissue (day 0) and
in tissues cultured in MEM alone or supplemented with diffferent concentrations of LH (1, 5,
10, 50 or 100 ng/mL) for 1 and 7 days.
% Primordial follicles % Growing follicles
Treatments Day 1 Day 7 Day 1 Day 7
Control -day 0 44,21 55,26
MEM 34,21 Aa 30,91 Aa 65,79 Aa 69,09 Aa
LH 1 34,42 Aa 43,64 Aa 65,57 Aa 56,369 Aa
LH 5 38,30 Aa 28,57 Aa 61,70 Aa 71,43 Aa
LH 10 25,49 Aa* 17,39 Ba* 74,51 Aa* 82,61 Ba*
LH 50 37,04 Aa 11,76 Bb* 62,96 Ab 88,24 Ba*
LH 100 30,56 Aa 5,00 Bb* 69,44 Ab 95,00 Ba* * Differs significantly from control A, B Different letters denote significant differences from MEM (Test of X2 P<0,05) a, b Different letters denote significant differences between culture periods (Test of X2 P<0,05)
55
Table 2. Percentages of primordial or developing follicles in non-cultured tissue (day 0) and
in tissues cultured in MEM alone or supplemented with FSH or FSH associated with
diffferent concentrations of LH (1, 5, 10 or 50 ng/mL) for 1 and 7 days.
% Primordial follicles % Growing follicles
Treatments Day 1 Day 7 Day 1 Day 7
Control -day 0 55,70 44,33
MEM 83,46Aa* 31,42Ab* 16,54 Ab* 68,57 Aa*
FSH 36,14Ba* 32,31Aa* 63,86 Ba* 67,69 Aa*
FSH + LH 1 32,88Ba* 21,21Aa* 67,12 Ba* 78,79 Aa*
FSH + LH 5 32,91Ba* 20,00Aa* 67,09 Ba* 80,00 Aa*
FSH + LH 10 50,00Ba 26,00Ab* 50,00 Bb 74,00 Aa*
FSH + LH 50 30,23Ba* 26,08Aa* 69,76 Ba* 73,91 Aa* * Differs significantly from control A, B Different letters denote significant differences from MEM (Test of Dunnett; P<0,05) a, b Different letters denote significant differences between culture periods (Test t of Student; P<0,05)
Table 3. Follicle and oocyte diameters in non-cultured tissue (day 0) and in tissues cultured in
MEM alone or supplemented with diffferent concentrations of LH (1, 5, 10, 50 or 100 ng/mL)
for 1 and 7 days.
Oocyte diameter (µm) Follicle diameter (µm)
Treatments Day 1 Day 7 Day 1 Day 7 Control -day 0 38,01 ± 6,02 50,98 ± 8,56
MEM 39,09 ± 5,33 Aa 42,80 ± 6,97 Aa 49,11 ± 4,93 Ab 57,83 ± 6,23 Aa
LH 1 38,47 ± 6,14 Ab 46,04 ± 6,48 Aa* 54,48 ± 7,30 Ab 71,69 ± 7,47 Ba*
LH 5 40,48 ± 5,39 Ab 48,41 ± 7,11 Aa* 54,89 ± 5,83 Ab 68,91 ± 9,98 Ba*
LH 10 42,18 ± 6,67 Ab 47,43 ± 8,16 Aa* 54,69 ± 8,69 Ab 63,50 ± 7,26 Aa*
LH 50 42,45 ± 6,74 Aa 41,87 ± 6,61 Aa 55,23 ± 7,30 Aa 62,42 ± 8,12 Aa*
LH 100 38,78 ± 5,62 Aa 42,33 ± 5,85 Aa 53,61 ± 7,72 Aa 58,25 ± 7,91 Aa* * Differs significantly from control A, B Different letters denote significant differences from MEM (Test of Dunnett; P<0,05) a, b Different letters denote significant differences between culture periods (Test t of Student; P<0,05)
56
Table 4. Follicle and oocyte diameters in non-cultured tissue (day 0) and in tissues cultured in
MEM alone or supplemented with FSH and FSH with diffferent concentrations of LH (1, 5,
10 or 50 ng/mL) for 1 and 7 days.
Oocyte diameter (µm) Follicle diameter (µm)
Treatments Day 1 Day 7 Day 1 Day 7 Control - day 0 40,63 ±6,97 53,46 ± 9,30
MEM 41,25 ± 6,04 Aa 44,03 ± 7,22 Aa 55,46 ± 6,83 Aa 59,64 ± 7,84 Aa
FSH 40,48 ± 5,29 Aa 43,10 ± 6,38 Aa 56,55 ± 7,30 Aa 61,34 ± 10,09 Aaβ* FSH + LH 1 39,40 ± 6,64 Ab 45,89 ± 6,82 Aa 56,39 ± 8,26 Ab 70,45 ± 7,67 Baα*
FSH + LH5 42,02 ± 5,88 Ab 46,35 ± 4,69 Aa 56,70 ± 7,04 Ab 69,37 ± 9,64 Baα*
FSH + LH 10 42,18 ± 6,67 Ab 45,66 ± 5,86 Aa 54,69 ± 8,69 Ab 64,58 ± 7,89 Aaβ*
FSH + LH 50 43,26 ± 7,50 Aa 42,18 ± 6,36 Aa 58,40 ± 9,18 Aa 62,57 ± 8,20 Aaβ* * Differs significantly from control A,B Different letters denote significant differences from MEM (Test of Dunnett; P<0,05) a, b Different letters denote significant differences between culture periods (Teste t of Student; P<0,05) α, β Different letters denote significant differences from MEM (Test of Dunnett; P<0,05)
Table 5. Percentages of morphologically normal follicles in non-cultured tissue (day 0) and in
tissues cultured in MEM alone or supplemented with diffferent concentrations of LH (1, 5,
10, 50 or 100 ng/mL) for 1 and 7 days.
% Normal follicles Treatments Day 1 Day 7
Control -day 0 65,90 ± 4,22 MEM 59,95 ± 6,70 Aa 33,32 ± 6,55 Ab* LH1 56,63 ± 5,77 Aa 30,60 ± 9,88 Aa* LH5 39,97 ± 8,18 Ba* 14,00 ± 6,52 Bb* LH10 38,87 ± 5,09 Ba* 17,02 ± 5,48 Bb* LH50 37,77 ± 6,92 Ba* 12,80 ± 7,39 Bb* LH100 29,37 ± 10,87 Ba* 15,36 ± 6,82 Ba* * Differs significantly from control A,B Different letters denote significant differences from MEM (Test of Dunnett; P<0,05) a, b Different letters denote significant differences between culture periods (Teste tof Student; P<0,05)
57
Table 6. Percentages of morphologically normal follicles in non-cultured tissue (day 0) and in
tissues cultured in MEM alone or supplemented with FSH and diffferent concentration of LH
(1, 5, 10 or 50 ng/mL) for 1 and 7 days.
% Normal follicles Treatments Day 1 Day 7
Control -day 0 77,6
MEM 78,39 Aa 57,85 Ab*
FSH 68,60 Aa 54,17 Ab* FSH + LH1 59,84 Ba* 54,10 Ab*
FSH + LH5 64,23 Ba* 50,00 Ab* FSH + LH10 56,20 Ba* 40,98 Bb*
FSH + LH50 37,39 Ba* 40,00 Ba* * Differs significantly from control A,B Different letters denote significant differences from MEM (Test of Dunnett; (Test of Dunnett; P<0,05) a, b Different letters denote significant differences between culture periods (Test t of Student; P<0,05)
Figure 1. Histologically normal (A) and (B) degenerated follicles after in vitro culture (400x).
O: oocyte; Nu: nucleus; GC: granulosa cell;
A B
GC
GC
O O
Nu Nu
58
Figure 2: Electron micrography of follicles before and after 7 days culture (A) Normal follicle
from day 0 (non-cultured control) (10000x); (B) normal follicle after culture in medium
containing 1 ng/mL LH (8000x); (C) or FSH plus 1 ng/mL LH (15000x) and (D) degenerated
follicles after 7 days culture in medium supplemented with FSH and 5 ng/mL LH (5000x). O:
oocyte; Nu: nucleu; GC: granulosa cell; M: mitochondria; ER: endoplasmic reticulum.
A B
D
A
C D C D
Nu GC
M
O
Nu
GC
GC
O
ER
D
O
GC
59
7. CONCLUSÕES
• O LH em baixa concentração (1 ng/mL) associado ou não ao FSH promove a
manutenção da morfologia folicular garantindo também a integridade ultra-estrutural
dos folículos pré-antrais caprinos cultivados in situ por 7 dias, além de influenciar
positivamente o crescimento folicular;
• Em todas as concentrações testadas o LH associado ao FSH aumenta as taxas de
ativação folicular;
• Quando adicionado em concentrações acima de 5 ng/mL, o LH promove altos níveis
de atresia folicular contribuindo desta forma para uma drástica redução da população
de folículos primordiais caprinos cultivados in vitro, sendo este um importante dado
para o estudo da foliculogênese inicial.
60
8. PERSPECTIVAS
• O estudo dos folículos pré-antrais isolados em diferentes estádios de desenvolvimento
em meio contendo LH e FSH deverá ser realizado com o objetivo de estabelecer as
necessidades das gonadotrofinas nos diferentes estádios da foliculogênese inicial;
• Além disso, estudos adicionais sobre a influência do LH na modulação de substâncias
(hormônios e fatores de crescimento) que interferem no desenvolvimento folicular e
atresia ainda são necessários para a compreensão da foliculogênese em caprinos.
61
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGÁFICAS
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