poligrafo de aula prática microbiologia

NORMAS DE SEGURANÇA PARA O TRABALHO NO LABORATÓRIO DE

MICROBIOLOGIA GERAL

1. No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente com a

desinfecção e esterilização. O mesmo procedimento deverá ser repetido se ocorrer

ferimentos ou cortes.

2. Considerar todos os micro-organismos como patogênicos em potencial;

3. Cuidados com fogo (checar torneiras de gás);

4. Evitar respingos, geração de aerossóis e derramamentos (= trabalhar com calma);

5. Tomar cuidado ao transportar vidrarias; produtos químicos; inóculos microbianos;

6. Uso de equipamento de proteção (luva, óculos, máscara), e locais de segurança (fluxo,

capela);

7. Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a análise.

8. Utilizar exclusivamente material estéril para a análise.

9. Não utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho.

10. Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais os deixando sobre a

bancada.

11. Flambar as alças, agulhas e pinças antes e após o uso.

12. Os cultivos após a leitura devem ser esterilizados, portanto não os colocar na estufa ou

despeja-los na pia.

13. Trabalhar sempre próximo ao fogo.

14. Manter a calma durante uma situação de risco;

15. Não atender telefones ou abrir portas com luvas descartáveis, tampouco se coçar;

16. Não cheirar ou “provar” qualquer produto químico etiquetagem/rotulação;

17. Não sobrecarregar a capacidade de uma tomada;

18. Evitar longos períodos com a chama acesa;

19. Ter noção de suas limitações (peso que consegue carregar, carga de trabalho semanal,

evitar “malabarismos circenses”);

20. Cuidar dos colegas de trabalho;

21. Assumir os erros e alertar sobre consequências.

NORMAS PARA A PREPARAÇÃO DOS RELATÓRIOS DAS AULAS PRÁTICAS

O relatório deve ser composto da seguinte forma:

1. Capa (dados de identificação, título da prática e data de realização).

2. Introdução (referencial bibliográfico sobre o assunto abordado durante a aula).

3. Objetivos

4. Metodologia (descrição dos procedimentos realizados na aula prática).

5. Resultados e Discussão (Apresentação dos resultados obtidos na prática e discussão destes

pelo aluno, tendo como base o referencial bibliográfico).

6. Questões

7. Conclusão

8. Referências bibliográficas.

As margens adotadas devem ser de 2,5 cm e o espaçamento de 1,5 cm para todo relatório exceto

as referências bibliográfica (item 8) com espaçamento simples. As fontes devem ser Arial

(tamanho 11) ou Times New Roman (tamanho 12).

Lembrando que na introdução todas as citações devem ser explicitadas no texto e todos os

autores citados devem constar nas referências.

Exemplos de citações

SOBRENOME, Nome (s) do (s) autor (es). Título do livro. Local de publicação: editora, ano.

Páginas utilizadas.

SOBRENOME, Nome (s) do (s) autor (es). Título. Ano. Disponível em: < link do site >. Acesso em:

(dia mês ano).

Em obras com mais de três autores, cita-se apenas o sobrenome do primeiro autor que aparece

na obra, seguido da expressão et al.

01 Micro-organismos no Meio Ambiente INTRODUÇÃO Os micro-organismos podem ser encontrados tanto no meio ambiente como na superfície

da pele e de algumas mucosas do homem e dos animais. A grande maioria deles exerce um

papel importante na manutenção de ecossistemas da natureza ou são utilizados em processos

industriais. Alguns deles, localizados na pele e mucosas, exercem papel importante impedindo a

colonização de bactérias patogênicas.

Uma pequena parcela deste mundo microbiano, entretanto, é responsável por importantes

enfermidades no homem e nos animais.

As bactérias são visualizadas apenas com o uso do microscópio. Entretanto, quando

semeadas em meios sólidos, cada bactéria, multiplicando-se sucessivamente, formará colônias.

Estas são populações de centenas a milhares de bactérias provenientes do mesmo indivíduo,

sendo geneticamente idênticas.

As características morfológicas das colônias são importantes para a identificação das

bactérias

Objetivo

Após o término desta unidade o aluno deverá estar apto a:

a) Ter conhecimento das normas adotadas no laboratório de Microbiologia;

b) Reconhecer a presença de micro-organismos no meio-ambiente.

Atividade

a) Dividir a placa no verso em 2 partes;

b) Tocar diferentes superfícies com o "swab" e semear no ágar;

c) Colocar a placa na estufa ( 37°C) para crescer, com a tampa para baixo.

02 Estudo Macroscópio de Colônias (Morfologia de Colônias) INTRODUÇÃO Colônias são o resultado da reprodução de bactérias e/ou outros micro-organismos na

superfície de um dado meio de cultura (ex.: ágar + nutrientes).

O desenvolvimento de colônias é útil porque o tamanho e a aparência das colônias

costumam estar fortemente associados à espécie de bactéria que as compõe. Quando uma

população mista é cultivada adequadamente, pelo isolamento das colônias é possível identificar a

colônia desejada, baseando-se nas suas características macroscópicas.

Em uma dada colônia, as diferenças de crescimento bacteriano parecem estar ligadas ao

gradiente de O2, nutrientes e produtos tóxicos no seu interior. Na borda da colônia a

disponibilidade de O2 e nutrientes é plena, o que está associado à multiplicação mais rápida das

bactérias nesta região. À medida que se aproxima do centro da colônia, tem-se um crescimento

mais lento das bactérias. O centro da colônia é naturalmente mais espesso que a borda. Como

resultado, nesta região o O2 e os nutrientes são mais vagarosamente difundidos e há menor

eliminação dos metabólitos tóxicos, ocorrendo redução do crescimento da colônia (em algumas

porções mais antigas da colônia pode até estar ocorrendo autólise celular).

MORFOLOGIA COLONIAL

a) Forma: puntiforme; circular; irregular; filamentosa

b) Elevação: elevada; convexa; bosselada; papilada

c) Bordos: ondulado; fimbriado; inteiro; denticulado

d) Transparência: transparente; opaco;translúcido

e) Brilho: fosco; brilhante

f) Pigmentação: ausente; presente

g) Superfície: rugosa; lisa

h) Consistência: mucóide; quebradiça

Objetivos


a) Reconhecer a diversidade da população microbiana no meio ambiente.

b) Reconhecer que esta diversidade se reflete nas diferentes colônias formadas pelas bactérias

no meio de cultura.

c) Observar e descrever a morfologia colonial das bactérias.

Atividade

Observe a morfologia de quatro colônias diferentes que cresceram na sua placa e

classifique as quanto à sua morfologia.

Questões

a) Discuta o porquê da existência de colônias diferentes na amostra proveniente de um mesmo

local e de locais distintos.

03 Estudo Macroscópio das Bactérias Colorações: simples e diferencial __________________________________________________________________________________________ INTRODUÇÃO Os micróbios não são facilmente visíveis em seu estado natural, mas possuem uma

acentuada afinidade por substâncias corantes e, uma vez submetidos a métodos de coloração,

são facilmente identificáveis ao microscópio.

Corantes são compostos orgânicos de estrutura complexa, capazes de transmitir ao objeto

de estudo a sua própria cor. Existem corantes naturais (origem animal ou vegetal) e corantes

artificiais ou sintéticos, derivados de benzeno.

Os corantes são classificados em ácidos ou plasmáticos (eosina, vermelho congo, fucsina

ácida) e básicos ou nucleares (cristal de violeta, azul de metileno, fucsina básica). Quando sais

corantes são formados pela união de grupos ácidos e básicos, ambos dotados de propriedades

corantes, resulta um composto classificado como corante neutro (ou salino), reunindo a

característica plasmática e nuclear (eosinato de azul de metileno).

Preparação do esfregaço utilizando cultura de bactérias em ágar inclinado:

a) Flambar a alça de platina ao rubro até incandescência e, a seguir, deixá-la esfriar conservando-

a próxima à chama;

b) Depositar uma gota de água no centro da lâmina ( pegar com a alça de platina uma gota de

água na torneira );

c) Segurar o tubo de cultura contendo meio sólido com a mão esquerda e, com o dedo mingo,

remover o tampão de algodão da boca do tubo;

d) Flambar a boca do tubo de cultura e com a alça de platina esterilizada retirar uma pequena

porção da cultura de bactéria e depositá-la sobre a gota de água na lâmina;

e) Fazendo movimento circulares com a alça de platina, espalhar o material sobre a lâmina;

f) Deixar evaporar o excesso de água, segurando e movimentando a lâmina sobre a chama, sem

encostar;

g) Fixar o esfregaço movimentando a lâmina sobre a chama por algumas vezes, a fim de que o

material fique bem aderido à lâmina;

h) Deixar a preparação esfriar ao ar.

Preparação do esfregaço utilizando uma cultura líquida de bactérias

a) Segurar o tubo de cultura (caldo), remover o tampão de algodão da boca do tubo;

b) Flambar a boca do tubo de cultura e com a alça de platina previamente esterilizada, retirar 3

a 4 gotas de cultura de bactéria depositando-as sobre a lâmina;

c) Flambar novamente a boca do tubo e fechá-lo;

d) Com movimentos de rotação da alça de platina (que vai se ampliando do centro para a

periferia), o material deve ser espalhado a fim de se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e

uniforme;

e) A fixação do material é semelhante à do esfregaço de cultura em ágar inclinado

COLORAÇÃO SIMPLES

a) Fazer um esfregaço bem espalhado de uma suspenção bacteriana;

b) Fixar o material ao calor (sobre a chama três vezes);

c) Cobrir o esfregaço com algumas gotas de corante: solução de azul de metileno, violeta de

genciana ou fucsina básica;

d) Deixar o corante agir durante um minuto;

e) Escorrer e lavar em água corrente;

g) Enxugar a preparação com papel filtro dobrado, apertando-o cuidadosamente para não

remover a preparação. Deixar a lâmina secar ao ar completamente;

h) Colocar uma gota de óleo de cedro sobre a preparação e examina-lá com objetiva de

imersão.

RECOMENDAÇÕES ÚTEIS

a) O aquecimento da lâmina deve ser feito com o esfregaço voltado para cima (não deve ter

contato com a chama). Observar com muita atenção a marca feita inicialmente com o lápis;

b) Verificar sempre que o esfregaço esteja seco antes de ser fixado pelo calor para não haver

o risco de ferver com projeção de partículas, os aerossóis, que são partículas em suspensão no

ar, que podem conter micro-organismos patogênicos.

Objetivo


a) Realizar esfregaços a partir de diferentes materiais.

b) Fixar os esfregaços de maneira correta.

c) Identificar os esfregaços de maneira correta.

d) Realizar uma coloração simples.

e) Diferenciar os tipos morfológicas das bactérias.

Atividade

Fazer uma coloração simples de uma cultura em ágar inclinado e de uma cultura em

caldo e observar as diferentes formas e arranjos bacterianos.

COLORAÇÃO DIFERENCIAL

MÉTODO DE GRAM

Incluem-se, na teoria das colorações, outras noções de interesse prático, tais como:

Mordente: qualquer substância que forme compostos insolúveis com os corantes, determinando

sua fixação às bactérias. O mordente participa intimamente na reação de coloração, sendo

exemplos a solução de iodo – iodetada (LUGOL), o ácido tânico, os sais de alumínio, de ferro, de

zinco ou de cobre.

Acentuador: substâncias que contribuem para intensificar a coloração de uma estrutura biológica

não sendo, como os mordentes, indispensáveis ao processo de coloração. (ex. ácido fênico).

Agentes descorantes: descoram, seletivamente, estruturas previamente coradas. São

amplamente empregados nos processos diferenciais de coloração.

Ex: álcool, acetona, álcool-acetona, ácido clorídrico, álcool-ácido clorídrico.

O método de coloração de GRAM baseia-se no fato da retenção do cristal de violeta após o

tratamento pela mistura de álcool-acetona dividindo, desta maneira, as bactérias em duas

categorias:

gram-positivas e gram-negativas.

Várias alterações do método original de GRAM já foram feitas. Entretanto, em todas elas quatro

reagentes básicos são usados:

a) corante básico(violeta de genciana)

b) mordente (solução de iodo-iodetada de LUGOL)

c) agente descorante (álcool etílico, acetona ou álcool-acetona 1/3)

d) corante básico de fundo: (fucsina básica diluída ou safranina).

Objetivo

Após o término desta unidade o aluno deverá ser capaz de:

a) Executar a técnica de coloração de Gram a partir de culturas em meio sólido e líquido.

b) Relacionar a composição química da parede celular da bactéria com o seu comportamento na

coloração de Gram.

c) Classificar as bactérias de acordo com a coloração de Gram.

d) Classificar as bactérias de acordo com a sua forma e arranjo.

Atividade

a) Fazer o esfregaço utilizando cultura sólida ou líquida.

b) Cobrir o esfregaço com violeta de genciana, aguardar um minuto e desprezar o corante na pia,

lavando rapidamente a lâmina para tirar o excesso de Violeta de Genciana.

c) Cobrir a lâmina com Lugol, aguardar um minuto e desprezar o corante na pia.

d) Inclinar a lâmina e gotejar a solução de álcool-acetona até que não haja mais desprendimento

de corante. Lavar a lâmina rapidamente em água corrente.

e) Cobrir a lâmina com Fucsina Básica e aguardar 30 segundos. Lavar a lâmina e secar em papel

filtro sem esfregar.

f) Observar no microscópio com objetiva de imersão.

Questões

a) Qual a razão das bactérias Gram positivas manterem a coloração violeta e as Gram negativas

a coloração rosa?

b) Cite exemplos de micro-organismos Gram positivos (cocos e bacilos) e Gram negativos (cocos

e bacilos)

c) Em uma coloração de Gram o técnico de laboratório esquece de colocar Lugol, o que

acontecerá?

COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN

A parede bacteriana das micobactérias caracterizam-se por conter um alto teor de lipídeos,

principalmente ácido micólico, que tornam as mesmas difíceis de serem coradas por métodos

convencionais. Uma vez sendo coradas, entretanto, estas bactérias resistem ao descoramento

até mesmo por solventes orgânicos fortes como o álcool ácido. Por esta razão estas bactérias são

chamadas bacilos álcool-ácido resistente (BAAR). Para a coloração inicial com a FUCSINA de

ZIEHL (carbolfucsina) é necessário um tratamento com calor para que o corante penetre através

da parede bacteriana.

Procedimento

a) Colocar a lâmina na cuba contendo FUCSINA DE ZIEHL e deixar por 15 min.

b) Passar a lâmina no frasco LAVAGEM 1 para retirar o excesso de corante.

c) Lavar em água corrente.

d) Inserir e retirar a lâmina, umas duas vezes, no álcool ácido, para a retirada da fucsina.

e) Lavar em água corrente.

f) Colocar a lâmina na cuba contendo AZUL DE METILENO e deixar por 1 min.

g) Passar a lâmina no frasco LAVAGEM 2 para retirar o excesso de corante.

h) Secar a lâmina, colocar o óleo de imersão e observar com objetiva X100.

Resultado

Bacilos ácido-resistentes vermelhos; outras bactérias e núcleos celulares azuis.

COLORAÇÃO DE ENDÓSPORO

Endosporos são corpos ovais altamente resistentes, produzidos tipicamente por bactérias

Gram positivas dos gêneros Bacillus e Clostridium.

Representam um período latente (repouso) da célula bacteriana. As bactérias capazes de

esporular podem crescer e se multiplicar por muitas gerações como células vegetativas.

As bactérias dos gêneros Bacillus e Clostridium produzem um esporo por célula

vegetativa; a esporulação, portanto, não é um processo de multiplicação embora haja outras

bactérias que formem mais de um esporo por célula.

O tamanho bem como a localização dos esporos dentro das células, varia de espécie para

espécie. Os esporos, em relação às formas vegetativas, são muito mais resistentes aos agentes

químicos e físicos adversos, o que é usualmente atribuído à parede de complexo ácido

dipicolínico-Ca2+.

Objetivo


a) Executar a técnica de coloração de Bartolomeu, para a evidenciação dos endosporos.

b) Reconhecer, na coloração, os endósporos e as formas bacterianas.

Atividade

Técnica de coloração de endosporos

(Método de Bartolomeu Mittwer’s):

a) Fazer um esfregaço de uma cultura de Bacillus.

b) Cobrir a lâmina com solução saturada de Verde Malaquita, aquecer durante cinco minutos,

contados após o desprendimento de vapores. Não deixar ferver ou secar, se necessário, adicionar

mais corante.

c) Lavar com água abundante, até retirar bem o corante Verde Malaquita.

d) Corar por 30 segundos com solução aquosa de safranina a 0,25%;

e) Lavar, escorrer e secar;

f) Examinar em objetiva de imersão.

Questões

a) Qual a coloração que os esporos adquirem?

b) Se você fizer uma coloração de Gram neste material, o que poderia observar ? Justifique

sua resposta.

04 Meios de Cultura para Bactérias INTRODUÇÃO

Na natureza muitas espécies de micro-organismos são encontrados juntos crescendo

em diferentes ambientes como: solo, água, matéria orgânica viva ou morta. Estes materiais

(ambientes) podem ser considerados meios de cultura naturais desses micro-organismos.

Os meios de cultivo, também chamados de meios de cultura, são complexos que se

destinam ao cultivo de micro-organismos no laboratório. Para se cultivar bactérias ou qualquer

outro micro-organismo no laboratório é necessário conhecer as necessidades nutricionais destes

Os meios de cultivo devem conter as substâncias exigidas pelos micro-organismos para o

seu crescimento e multiplicação. Para que possam realizar a síntese de seus próprios

constituintes devem dispor de fontes de carbono (proteínas e açúcares), fontes de nitrogênio (

peptonas) e fontes de energia. São também necessários alguns sais minerais, vitaminas e outras

substâncias que favorecem o seu crescimento.

Alguns micro-organismos, como as bactérias causadoras de lepra, sífilis, não são capazes

de

crescer em meios de cultura de laboratório. Elas somente crescem em culturas que contenham

células vivas oriundas de seres humanos ou outros animais.

Ainda, para que os micro-organismos sejam capazes de crescer e se multiplicar em meios

de

cultivo é necessário que as condições de pressão osmótica, pressão atmosférica, pH, grau de

umidade, temperatura de incubação sejão adequadas.

CLASSIFICAÇÃO DOS MEIO DE CULTIVO

Quanto a consistência:

a) Meio Líquido: é aquele em que os nutrientes estão dissolvidos em uma solução

aquosa. O crescimento microbiano nesse meio de cultura muda o seu aspecto causando a

turvação do mesmo.

b) Meio semi-sólido: é aquele que possui na sua composição, além dos nutrientes, uma pequena

porção (0,5%) de um polissacarídeo proveniente de algas marinhas chamado ágar . Estes meio

normalmente são preparados em tubos de ensaio e a partir desse tipo de meio de cultivo é capaz

de se observar a motilidade bacteriana.

c) Meio sólido: é aquele que possui os nutriente e uma porção maior de ágar em torno de

1,5% (cerca de 15g/litro água destilada). Podem ser dispostos em tubos de ensaio ou em placas

de Petri, dependendo da finalidade.

Quanto a função:

a) Meio sintético: são meios preparados em laboratório a partir de materiais de composição

precisa ou razoavelmente bem definida.

b) Meio sintético definido: é aquele que contém tipos e quantidade de substâncias químicas

conhecidas e específicas ex: meio sintético definido para o cultivo de Pseudomonas aeruginosa.

c) Meio complexo ou quimicamente não definido: é aquele que contém materiais

razoavelmente conhecidos porém a composição química de alguns ingredientes pode variar de

partida para partida. Fazem parte da composição desses meios: extratos de carne, soja, peptonas

etc..

d) Meio Simples: possui os nutrientes essenciais para o crescimento dos micro-organismos

pouco exigentes. Ex: caldo simples

e) Meio Enriquecido:. Neste meio, além das fontes nutricionais usuais são adicionados sangue,

soro, ovo extrato de levedura , extratos teciduais etc... Este meio de cultura permite o crescimento

de micro-organismos exigentes que necessitam de fatores de crescimento, mas não inibem o

crescimento de outros. ex. Ágar sangue

f) Meio Seletivo: é meio que favorece o crescimento de determinados micro-organismos em

detrimento de outros, geralmente devido a adição de substâncias. Ex. ágar Mac Conkey: possui

sais biliares que inibem o crescimento de Gram positivos; ágar Salmonella Shigella.; ágar

Sabouraud

g) Meio Diferencial: este meio possui substâncias que evidenciam uma característica que

permite separar um grupo ou uma espécie de microrganimos.

Ex: ágar Mac Conkey diferencia bactérias Gram negativas em lactose positiva ou lactose

negativa; ágar sangue diferencia estafilococos e estreptococos alfa hemolíticos e beta hemolíticos

através do padrão de hemólise das hemácias do meio.

h) Meios de manutenção: são aqueles destinados manter a viabilidade da cultura.

Os meios de cultura são preparados e armazenados seguindo um rígido controle de

qualidade pois devem ser mantidas as suas propriedades nutricionais e garantida a esterelidade

dos mesmos até o momento do uso

Objetivo


a) Conhecer os diferentes meios de cultura e algumas de suas propriedades.

Questões

Qual seria a sequência de meios a serem utilizados para:

b) Diagnosticar bactérias Gram negativas de uma amostra de urina ?

b) Bactérias causadoras de uma infecção ocular?

c) Diagnosticar enterobactérias de uma amostra de fezes?

d) Caracterizar bactérias de uma amostra de água?

05

Técnicas de Semeadura

INTRODUÇÃO

As técnicas de cultivo de micro-organismos variam de acordo com o meio e a finalidade do

cultivo. No entanto, algumas regras devem sempre ser seguidas:

a) A agulha e alça de níquel-cromo ( alça ou agulha de platina) devem ser esterilizadas por

flambagem antes e após qualquer cultivo. Cuidar para sempre esfria-las antes de usar.

b) Os recepientes devem sempre ser abertos perto do bico de Bunsen.

c) A boca dos tubos de ensaio deve ser aquecida após a retirada e antes da colocação da

tampa. A tampa nunca deve ser colocada sobre o balcão, sendo retirada e mantida segura pelo

dedo mínimo durante a inoculação.

Objetivo


a) Realizar a inoculação em meio de cultura líquido, sólido e semi-sólido.

b) Verificar a presença ou ausência de crescimento bacteriano nos meios inoculados.

c) Observar os tipos de crescimento em meio sólido, líquido e semi-sólido das diferentes espécies

bacterianas.

d) Obter colônias isoladas em meio sólido em placa.

Atividade

Realizar os diferentes tipos de semeadura a partir de uma cultura de bactérias em ágar

inclinado.

Incubar a 37ºC.

Quando num determinado meio encontramos apenas um tipo de micro-organismo temos a

chamada cultura pura, caso contrário tem uma cultura mista.

Para realizar a identificação de um micro-organismo precisamos sempre trabalhar com

culturas puras. O método de esgotamento em meio sólido em placa é o mais utilizado para

obtermos esta cultura pura.

Por este método as bactérias vão sendo espalhadas na superfície do meio até que esteja

separada o bastante para, durante o crescimento, dar origem a uma colônia isolada da bactéria

de origem.

Procediemento

Técnica I: semeadura em meio líquido

Com a alça de platina coletar um pouco do crescimento bacteriano do ágar inclinado e

suspender no meio líquido em tubo.

Técnica II: semeadura em meio semissólido

Com a agulha de platina coletar um pouco do crescimento bacteriano do ágar inclinado e

introduzir (injeção) a mesma no ágar em coluna reta até a profundidade de 2/3 do meio. A

inoculação deve ser única.

Técnica III: semeadura em meio sólido inclinado

Com a alça de platina coletar um pouco do crescimento bacteriano do ágar inclinado e fazer

estrias na superfície do ágar-inclinado novo recebido.

Técnica IV. Semeadura em meio sólido em placa (técnica do esgotamento)

A técnica consiste em depor sobre um ponto da superfície do meio uma alíquota do material e

depois espalhá-lo em dois ou três setores, com o auxílio da alça de platina, flambando-a antes de

mudar de setor e sem recarregá-la, de maneira a obter quantidades progressivamente menores

do material. O sucesso da semeadura por esta técnica está em:

a) grande número de estrias;

b) não perfurar o meio;

c) não voltar a tocar à alça sobre a estria e

d) pegar pequena quantidade de material para semear.

São componentes importantes para o crescimento in vitro das bactérias: a temperatura, a

tensão de oxigênio e os nutrientes do meio de cultura.

REGRA GERAL PARA AS TÉCNICAS DE SEMEADURA

a) Flambar o fio e a alça de platina, resfriando-os antes da coleta

b) Recipientes com meio de cultura abertos e próximos ao bico de Bunsen

c) Aquecer a boca do tubo de ensaio antes e depois da colocação do tampão de algodão

d) Técnica de Semeadura em Meio Sólido Inclinado - Semeadura em Estria

e) Técnica de semeadura em Meio Semisólido em Tubo (Semeadura em Picada):

f) Técnica deSemeadura por Esgotamento (técnica de isolamento bacteriano em Placa de

Petri):

- Depositar num ponto da superfície de ágar da placa, a amostra a ser cultivada.

- Espalhar, sem “recarregar”, o material sobre a superfície do ágar, em pelo menos três setores,

com angulações sucessivas de 90ºC. A cada mudança de setor flambar a alça de platina.

Questões

Uma vez feita a semeadura, verificar o crescimento das bactérias nos diferentes tipos de

meio e classificá-las como descrito abaixo:

a) A quantidade de crescimento:

- Escassa

- Média

- Abundante

b) A distribuição de crescimento:

- Uniformemente distribuído

- Em “película”

- Crescimento “acumulado”

c) Isolamento de colônia:

- Colônia única

- Colônias agrupadas

- Massa de células bacterianas

- Sem diferenciação.

06 Provas Metabólicas na Identificação de Bactérias Objetivo


a) Ter conhecimento das diversas provas metabólicas utilizadas na identificação de

micro-organismos, bem como a interpretação de seus resultados.

b) Analisar os testes capazes de classificar os micro-organismos quanto à sua capacidade de

utilização de substratos como fonte doadora de energia, bem como quanto ao tipo de mecanismo

utilizado para a sua obtenção

MEIOS CARBONADOS

Entre os produtos formados da quebra de carboidratos pelos micro-organismos estão os

ácidos orgânicos (ácido acético, ácido lático, etc.) e gases (dióxido de carbono e hidrogênio). Os

tipos e proporções dos produtos formados depende da espécie do micro-organismo, portanto, da

habilidade (ou falta de habilidade) de um organismo quebrar uma simples molécula de açúcar,

combinar diferentes moléculas de açúcar ou várias outras moléculas de carboidratos em um meio,

provendo informação necessária para a classificação das espécies de bactérias. A fácil detecção

de ácidos e gases produzidos pelas espécies de bactérias é de importância prática.

Utilização da glicose

A glicose é utilizada por uma série grande de micro-organismos, que produzem

quantidades

variadas de substâncias orgânicas, dentre as quais se destacam ácidos (que alteram o pH do

meio de cultura), e gases como o CO2, H2 e CH4.

Meio de cultura:

Água peptonada como indicador

Peptona...............................................10,0 g

Cloreto de sódio......................................5,0 g

Glicose.................................................10,0 g

Indicador de andrade..........................10,0 ml

Água destilada................................1000,0 ml

pH entre 7,2 e 7,4

Semeadura: A semeadura é realizada com alça de platina.

Incubação: 18 à 24 horas à 37 oC.

Leitura:

a) Meio de cultura inalterado com crescimento = glicose negativa.

b) Meio de cultura vermelho, com bolhas no tubo coletor (tubo de Durham) = glicose positiva com

gases.

c) Meio de cultura vermelho, sem bolhas no tubo coletor = glicose positiva sem gases.

Nota: A glicose pode ser substituída por outro carboidrato, como a lactose, o manitol, a sacarose,

etc., para a realização de testes semelhantes a este.

Prova do vermelho de metila (VM)

A utilização da glicose por certas bactérias leva à formação de substâncias ácidas,

algumas das quais, como por exemplo, a Escherichia coli, produz maior quantidade de ácidos do

que outras (Ex.: Klebsiella pneumoniae). Essa diferença quantitativa pode ser evidenciada quando

o teste é realizado em meios de cultura que contenham tampões de pH, de tal maneira ajustados,

que pequenas quantidades de ácidos formados, não alteram a concentração hidrogeniônica do

meio.

Meio de cultura: Meio de Clark-Lubs

Proteose-peptona..................................5,0 g

Glicose...................................................5,0 g

Fosfato dipotássico................................5,0 g


pH entre 6,8 e 7,0

Semeadura: A semeadura é realizada com alça de platina.

Incubação: A incubação é de 48 horas, no mínimo, podendo a leitura ser realizada dentro do

período de até uma semana.

Reativo de VM: Vermelho de metila..0,1 ml

Álcool etílico...........300,0 ml

Água destilada.......500,0 ml

Leitura: Após a incubação, adicionam-se algumas gotas (3 a 5) do Reativo de VM em cada

tubo. A leitura é feita imediatamente, anotando-se os resultados conforme descrição abaixo:

a) Coloração vermelha = positivo

b) Coloração amarela = negativo

c) Coloração intermediária = duvidoso

Nota: Após a leitura guardar o tubo para a prova de Voges-Proskauer

Prova de Voges-Proskauer (VP)

Vimos, anteriormente, que a Escherichia coli e a Klebsiella pneumoniae têm

comportamentos diferentes quando cultivadas em meio glicosado tamponado. A diferença entre

as duas é de ordem não só quantitativa, mas também qualitativa, pois a Klebsiella pneumoniae

produz, além de ácidos, dois produtos - o acetilmetilcarbinol (acetoína) e o 2-3 butilenoglicol - que

não são elaborados pela Escherichia coli.

O acetilmetilcarbinol em presença de hidróxido de potássio e do oxigênio atmosférico é

oxidado formando diacetil que, com as peptonas ricas em arginina, desenvolve uma reação

avermelhada. Sabe-se que o constituinte responsável pela reação corada é o núcleo guanidina da

arginina, presente em grande número de peptonas.

Meio de cultura: igual ao da prova do Vermelho de Metila.

Semeadura: Idêntica à prova do Vermelho de Metila.

Reativo de Barritt

Solução I: Alfa-naftol........................6,0 ml

Álcool etílico 95%...... 100,0 ml

Solução II: Hidróxido de potássio...16,0 ml

Água destilada...........100,0 ml

Leitura: Após a incubação adicionar a cada tubo a solução I do Reativo de Barritt em quantidade

correspondente à metade do volume do meio de cultura. Agitar e acrescentar a solução II do

Reativo de Barritt em quantidade igual à da solução I. Agitar vigorosamente e deixar em repouso

à temperatura ambiente (mais ou menos 15 minutos).

a) Coloração vermelha (anel vermelho na superfície) = positivo.

b) Ausência de cor vermelha = negativo.

Oxidação X fermentação

Fundamento: Algumas bactérias utilizam a glicose somente por via oxidativa (em presença

de oxigênio atmosférico), outras o fazem somente por via fermentativa (na ausência total de

oxigênio) e um terceiro grupo usa a glicose tanto por uma via quanto por outra via.

Meio de cultura: Meio de Mossel e Martin

Peptona................................................10,0 g

Extrato de levedo...................................1,5 g


Glicose..................................................10,0 g

Ágar......................................................15,0 g

Púrpura de bromocresol.....................0,015 g


Semeadura: Semeia-se a bactéria em picada, procurando alcançar a parte inferior do meio de

cultura.

Incubação: Incuba-se durante 24 horas, no mínimo, à temperatura adequada ao desenvolvimento

da bactéria testada.

Leitura:

a) Cor amarela na porção superior do meio = oxidação.

b) Cor amarela na porção inferior do meio = fermentação.

c) Cor amarela em todo o meio = oxidação e fermentação.

d) Cor inalterada do meio = não utilização da glicose.

Utilização do citrato de sódio

Algumas bactérias têm a capacidade de sintetizar compostos orgânicos complexos

(proteínas) utilizando como única fonte de carbono o citrato de sódio e como fonte de nitrogênio

um sal inorgânico.

Meio de cultura: (Simmons, 1926)


Sulfato de magnésio...............................0,2 g

Fosfato diácido de amônio......................1,0 g

Fosfato monoácido de potássio..............1,0 g

Citrato de sódio.......................................2,0 g

Azul de bromotimol (solução a 0,2%)...40,0 ml

Ágar .....................................................20,0 g

Água destilada..................................1000,0 ml

pH igual a 6

Semeadura: Inocula-se com agulha de platina fazendo uma estria central sobre o bisel. A

agulha que leva o inóculo (não usar alça) deve ter apenas tocado o material a ser semeado,

evitando-se inóculos abundantes.

Incubação: Incubar a 37 oC e fazer a leitura de 24 em 24 horas até 4 dias.

Leitura:

a) Meio de cultura inalterado, sem crescimento = citrato negativo.

b) Meio de cultura azul, com crescimento =citrato positivo.

MEIOS NITROGENADOS

Produção de indol

O indol é um composto volátil produzido pela ação de algumas bactérias sobre o triptofano,

razão porque os meios de cultura utilizados nesta prova devem conter tal aminoácido.

Meio de cultura: S.I.M.

Extrato de carne......................................3,0 g

Peptona.................................................10,0 g

Tripticase ou proteose-peptona............10,0 g

Sulfato ferroso amoniacal.......................0,2 g

Tiossulfato de sódio................................0,2 g


Ágar........................................................4,0 g


pH entre 7,2 e 7,4

Semeadura: Inocula-se com agulha de platina em picada, de modo a não ultrapassar 2/3 da

altura da coluna. Colocar tiras de papel impregnadas com o reativo de Braun-Silverstein,

prendendo-as entre o tampão de algodão e a parede do tubo.

Reativo: Braun-Silverstein (1940)

Para-dimetilaminobenzaldeído....................5,0

Álcool metílico......................................50,0 ml

Ácido orto-fosfórico...............................10,0 ml

Cortar tiras de papel filtro do tamanho aproximado de 5 X 80 mm e umedecer com o

reativo acima, deixando secar por 2 ou 3 dias ao abrigo da poeira, na estufa ou no ambiente.

Incubação: Incuba-se a 37oC durante 24 horas.

Leitura:

a) Extremidade distal do papel-reativo inalterado = indol negativo.

b) Extremidade distal do papel-reativo de cor vermelha = indol positivo.

Nota: Outro teste para a Produção do Indol O indol é resultante da degradação do aminoácido

triptofano pela enzima triptofanase. A prova é realizada inoculando-se o meio de cultura SIM

contendo excesso de triptofano. Após a incubação colocar 0,5 ml do reagente de Kovacs ou o

reativo de Ehrlich (solução aquosa ou alcoólica de p-dimetil aminobenzaldeído, respectivamente)

através da parede interna do tubo. A prova é positiva quando na porção superior, isto é, na

interface da cultura e o reagente, desenvolve-se um anel de cor rósea dentro de no máximo 5

minutos. Este resultado é devido à complexação do indol com o aldeído, em meio ácido, formando

o composto colorido. A prova é negativa com qualquer outra tonalidade de cor (original do meio

ou marrom)

Reação: triptofanase Triptofano 6 Indol + piruvato e amônia

Leitura: O indol reage com o reagente, formando um composto colorido róseo.

A cistina e a metionina são dois aminoácidos que contém enxofre e são encontrados nas

proteínas e nas peptonas usadas nos meios de cultura. Existem bactérias capazes de produzir

gás sulfídrico (H2S) a partir da cistina, reduzindo uma molécula de cistina a duas de cisteína e

depois a H2S, que é evidenciado, nas culturas bacterianas, pela propriedade de reagir com metais

pesados (Fe, Bi, Co, Ni, Pb), formando sulfetos (de coloração negra).

Meio de cultura: S.I.M. (ver prova anterior)

Semeadura: (ver prova anterior)

Incubação: (ver prova anterior)

Leitura:

a) Meio de cultura enegrecido = H2S positivo.

b) Meio de cultura inalterado = H2S negativo.

Nota: A produção de H2S também pode ser revelada, com maior sensibilidade, pelo uso de

papel embebido em solução de acetato de chumbo e colocado entre a parede do tubo e o tampão

de algodão.

Prova da motilidade

A prova da motilidade indica indiretamente a produção de flagelos. Não é uma prova

bioquímica e sim fisiológica, mas auxilia a identificar bactérias. A prova é efetuada inoculando-se

em linha reta o meio de cultura semi-sólido com auxílio de uma agulha de platina até 2/3 de

profundidade. A prova indica motilidade positiva quando os micro-organismos crescem

deslocando-se da linha de inoculação, turvando o meio. A prova é negativa quando os micro-

organismos ficam restritos ao local da inoculação sem, contudo, turvar o meio.

Meio de cultura: S.I.M. (ver prova anterior)

Semeadura: (ver prova anterior)

Incubação: (ver prova anterior)

Leitura:

a) Crescimento deslocado da linha de inoculação e turvação do meio = motilidade positiva.

b) Crescimento restrito a linha de inoculação sem turvação do meio = motilidade negativa.

Prova da fenilanina desaminase

As bactérias produtoras de fenilalaninadesaminase são capazes de agir sobre a

fenilalanina, transformando-a em ácido fenilpirúvico.

Este, em presença de cloreto férrico, desenvolve uma coloração verde (garrafa) intensa

e fugaz.

Meio de cultura: Ágar Fenilalanina (Ewing et al., 1957)

Extrato de levedo....................................3,0 g

DL-fenilalanina........................................2,0 g

ou L-fenilalanina......................................1,0 g

Fosfato dissódico....................................1,0 g


Ágar......................................................12,0 g

Água destilada..................................1000,0 g

pH igual a 7,3

Semeadura: a partir de uma cultura recente da bactéria em estudo, fazer a semeadura em

estria, no bisel.

Incubação: Incubar a 37 oC durante 18 a 24 horas. Reativo: Solução aquosa de cloreto férrico a

10%.

Leitura: Após a incubação, gotejar sobre o crescimento bacteriano 4 a 5 gotas do reativo.

a) Cor verde intensa = fenilalaninadesaminase positiva.

b) Cor inalterada = fenilalaninadesaminase negativa.

Produção de uréase

A uréia é um composto nitrogenado que libera amônia, quando hidrolisada pela ação da

enzima urease bacteriana. A amônia liberada alcaliniza o meio de cultura, fato que é demonstrado

por um indicador de pH presente no meio.

Meio de cultura: (Christensen, 1946):

Peptona.................................................1,0 g


Glicose....................................................1,0 g

KH2PO4....................................................2,0 g

Vermelho de fenol...............................0,012 g

Uréia......................................................20,0 g


Semeadura: Usar inóculo grande, com alça

de platina.

Incubação: Incuba-se à 37°C NCE\d3C, durante 4 dias.

Leitura: A leitura deve ser feita em intervalos de 24 horas, durante os 4 dias de incubação.

a) Meio vermelho = urease positiva.

b) Meio inalterado = urease negativa.

OUTROS TESTES

Catalase

A catalase é capaz de decompor o peróxido de hidrogênio com formação de água e oxigênio

molecular. Ela atua sobre a água oxigenada (peróxido de hidrogênio 3 a 5%) desdobrando-a em

oxigênio e água. A prova é feita colocando uma gota de solução aquosa de peróxido de

hidrogênio a 3- 5% numa lâmina e, em seguida, com uma alça de platina, coloca-se uma porção

do crescimento bacteriano sobre a gota. Ou de outra forma, adicionando-se 0,5 ml da mesma

solução a uma cultura em meio líquido ou em ágar inclinado. A prova é considerada positiva

quando há borbulhamento ou efervescência devido à liberação do oxigênio. A catalase é

produzida por muitos micro-organismos e é usualmente empregada para diferenciar

Staphylococcus, que são catalase positivos de Streptococcus, catalase negativos, ou os b acilos

Gram-positivos catalase negativos, Lactobacillus e Erysipelothrix de Listeria e a maioriados

Corynebacterium catalase positivos.

Catalase

2H202 6 2H20 + ½O2

Peróxido de Água Oxigênio Livre

Hidrogênio

Meio de cultura: Qualquer meio de cultura capaz de propiciar o crescimento da bactéria em

estudo. Não utilizar o agar sangue (falso positivo).

Semeadura: Semear em superfície ou em profundidade, de acordo com a consistência sólida

ou líquida do meio de cultura.

Incubação: Incuba-se à temperatura adequada à bactéria, durante o tempo necessário

ao seu crescimento.

Leitura: Colocar algumas gotas de água oxigenada (10 a 20 vol.) sobre o crescimento

bacteriano.

a) Desprendimento de bolhas gasosas (O2) = catalase positiva.

b) Ausência de bolhas = catalase negativa.

Coagulase

As coagulases possuem a capacidade de coagular o plasma sanguíneo através de um

mecanismo similar ao da coagulação normal. A atividade da coagulase é utilizada para distinguir

espécies patogênicas de Staphylococcus de espécies não patogênicas, sendo um bom indicador

da patogenicidade do Staphylococcus aureus. Esta prova pode ser realizada de duas formas.

Pesquisa da coagulase ligada, realizada em lâmina e a prova da coagulase livre realizada em

tubo de ensaio. Nas aulas práticas será realizada a prova da coagulase em lâmina.

Procedimento:

Coagulase em Lâmina (Coagulase ligada)

Realizando-se a prova em lâmina (coagulase ligada) pega-se uma lâmina de vidro limpa.

Coloca-se uma gota de água e em seguida, inocula-se a colônia a ser testada, usando para isso a

alça de platina (inoculada como explicado em experimento anterior). Se não ocorrer aglutinação,

significa que não há resultado falso positivo, podendo-secontinuar para o teste com o plasma. Se

aparecerem grânulos o controle demonstrou falha. Não é esperada a formação de aglutinação no

teste com água.

Segue-se colocando na lâmina uma gota deplasma de coelho inoculando-se a mesma

bactéria sobre a gota de plasma. Homogeneizar e/ou realizar

movimentos circulares com auxílio da alça de platina e observar, ao fim de uns minutos, se ocorre

a formação de aglutinação. E em aparecendo grânulos (aglutinação +), constatamos que a

bactéria é coagulase (+). Se ocorrer formação de pequenos agregados resultantes do fato das

bactérias ficarem aprisionadas na rede de fibrina então formada, a prova é positiva.

Se por algum acaso o teste de coagulase ligada, acima descrito, der negativo, deve-se

partir então para o teste de coagulase livre que é feito em tubo.

Coagulase em Tubo (Coagulase livre)

A prova da coagulase em tubo (coagulase livre) consiste em juntar num tubo de ensaio

contendo plasma (obtido de sangue a que se juntou um anticoagulante, por exemplo, oxalato,

citrato, heparina) uma suspensão do micro-organismo a ser testado (caldo de cultura) ou colônias

provenientes de um meio sólido e incubar a 37º C. A formação de coágulos às 2 h, às 6 h ou às

24 h de incubação é interpretada como uma prova positiva. A ausência de coagulação após 24

horas de incubação é uma prova negativa.

Leitura:

O que ficou evidenciado nos resultados obtidos para a coagulase é:

07

Identificação de Bactérias Gram Negativas e Gram

Positivas

Objetivo


a) Ter conhecimento dos procedimentos de recebimento de amostras com culturas de bactérias

a serem identificadas pelos métodos bioquímicos clássicos da microbiologia.

b) Conhecer as etapas requeridas na identificação de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas

e a importância dos micro-organismos identificados, para a sua área de atuação.

IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS

A família Enterobacteriaceae é a maior e mais heterogênea família de bactérias Gram-

negativas de importância médica. Esta família é formada por bacilos entéricos de importância no

controle das infecções intestinais pela prevenção da contaminação de água e alimentos.

Família Enterobacteriaceae: grupo de bactérias que pode ser encontrado no trato intestinal

de humanos e alguns mamíferos.

Representantes: forma de bastonetes, gram-negativos e não formadores de esporos.

Patogênicos: Salmonella e Shigella

Patógenos Ocasionais: Proteus e Klebsiella

Flora intestinal normal: Escherichia e Enterobacter

Caracterização da família Enterobacteriaceae

São bacilos gram-negativos, não esporulados, com motilidade variável, oxidase negativa e que

crescem em meios básicos (caldo peptona), meios ricos (ágar sangue, ágar chocolate), meios

seletivos (ágar mac conkey, EMB). São anaeróbios facultativos (crescem em aerobiose e

anaerobiose), fermentam a glicose com ou sem a produção de gás, são catalase positivos e

reduzem nitrato a nitrito.

São divididos através de diferentes provas em 11 principais gêneros, tendo sido descritos

nos últimos anos outros 16 gêneros e algumas espécies, mas ainda considerados de pouca ou

nenhuma importância clínica.

Importância clínica

A maioria das enterobactérias é encontrada no trato gastrointestinal de humanos, no reino

animal, na água, solo e vegetais. Alguns também são considerados enteropatógenos por

causarem preferencialmente infecções gastrointestinais como Salmonella, Shigella, Yersinia e

vários sorotipos de Escherichia coli, embora possam também causar infecções em outros locais.

As enterobactérias representam 80% ou mais de todos os Gram-negativos de importância

clínica isolados na rotina microbiológica. São responsáveis por cerca de 70% das infecções

urinárias e 50% das septicemias.

Para a diferenciação dos principais grupos de Enterobacteriaceae são estudadas as

propriedades bioquímicas e as reações enzimáticas na presença de substratos específicos.

Procedimento I:

a) Recebimento de bactérias codificadas.

b) Realizar uma semeadura por esgotamento de uma amostra de material biológico (das culturas

codificadas) em uma placa de ágar MacConkey.

- Isolamento em Ágar Mac-Conkey

- Presença de cristal violeta (inibe Gram +)

- Presença de lactose (verificação da fermentação)

c) Isolar uma colônia bacteriana em ágar inclinado.

d) Fazer uma coloração Gram desta cultura após 24 horas de crescimento para classificação da

bactéria quanto a esta coloração e sua morfologia.

e) Semear os tubos com os diversos testes bioquímicos (prestar atenção quanto à maneira de

semeadura de cada teste bioquímico) também com material desta cultura.

Inoculação nos meios carbonados: Glicose, lactose, Citrato, VM-VP

Inoculação em meios nitrogenados: Fenilalanina, Caldo Uréia, Meio SIM

f) Após o período de incubação, fazer a leitura conforme explicado em cada teste e anotar no

quadro abaixo. Comparar os resultados com os da tabela para Identificação de Bactérias Gram-

negativas, identificando então, o micro-organismo estudado.

Devido a importância da Família Enterobacteriacea, ocorre a sua pesquisa e estudo em

alimentos, uma vez que podem estar envolvidos em diversos casos de toxi-infecções

alimentares. Alguns gêneros pertencentes nesta família são utilizados como indicadores

das condições higiênico-sanitárias empregadas no processo de manufatura de alimentos.

Procedimento II:

a) Recebimento de amostra de alimentos (verduras, legumes e outros alimentos) já preparados

em água peptonada 0,1%, diluídos adequadamente.

b) Realizar uma semeadura por esgotamento da amostra do alimento já diluído em placas de ágar

MacConkey.

- Isolamento em Ágar MacConkey:

- Presença de cristal violeta (inibe gram +)

- Presença de lactose (verificação da fermentação)

c) Interpretação do crescimento e análise macroscópica da colônia. Isolar uma colônia bacteriana

em ágar inclinado.

d) Fazer uma coloração Gram desta cultura após 24 horas de crescimento para classificação da

bactéria quanto a esta coloração e sua morfologia.

e) Semear os tubos com os diversos testes bioquímicos (prestar atenção quanto à maneira de

semeadura de cada teste bioquímico) também com material desta cultura.

Inoculação nos meios carbonados: Glicose, lactose, Citrato, VM-VP

Inoculação em meios nitrogenados: Fenilalanina, Caldo Uréia, Meio SIM

f) Após o período de incubação, fazer a leitura conforme explicado em cada teste e anotar no

quadro abaixo. Comparar os resultados com os da tabela para Identificação de Bactérias Gram-

negativas, identificando então, o micro-organismo estudado.

OBS: Comparando seus resultados com os da tabela para Identificação de Bactérias Gram-

negativas, você terá condições de identificar as bactérias. Você deve ter em mente que

trabalhamos com seres vivos, portanto, capazes de uma certa variação nos resultados.

IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS

Identificação de bactérias do gênero Staphylococcus

As espécies pertencentes a este gênero são flora normal de animais e humanos, sendo

nestes a espécie Staphylococcus aureus a mais importante no aspecto clínico. Nos humanos,

30% da população são considerados portadores de S.aureus nasal. Os estafilococos se

caracterizam por serem cocos Gram-positivos arranjados em grupos (cachos de uvas). São

bactérias não esporuladas que resistem bem no meio ambiente. Podem sobreviver por meses em

amostras clínicas secas, são relativamente resistentes ao calor e podem tolerar uma

concentração aumentada de sal, o que as caracteriza como bactérias halófilas ou halofílicas.

No entanto, apesar dos antimicrobianos existentes, da melhora das condições sanitárias e

das medidas de controle de infecção hospitalar, este micro-organismo continua a ser um dos mais

importantes patógenos para o homem. Indivíduos sadios são colonizados intermitentemente por

S.aureus desde a amamentação, e podem albergar o micro-organismo na nasofaringe,

ocasionalmente na pele e raramente na vagina. A partir deste sítios, o S.aureus pode contaminar

peles e membranas mucosas do paciente, objetos inanimados ou outros pacientes por contato

direto ou por aerossol, ocasionando infecções letais por conta dos fatores de virulência ou através

da resistência aos antimicrobianos atualmente utilizados. Assim, há necessidade de uma

identificação rápida e eficiente de todos os casos em que estes micro-organismos se apresentam.

A mastite bovina é a principal doença do gado leiteiro em todo o mundo devido aos

prejuízos econômicos que acarreta ao produtor e à perda da qualidade do leite. Dentre os agentes

da mastite, Staphylococcus aureus é o mais frequentemente isolado em diversos países. No

Brasil, relatos de isolamento de S. aureus de mastite subclínica são conhecidos desde o início da

década de 50. Além de participar como patógeno primário da mastite bovina, S. aureus pode estar

presente como agente de diversas condições patológicas e como parte da flora endógena de

diferentes espécies animais, incluindo o homem. Logo, o estudo e a identificação deste patógeno

em amostras clínicas tornam-se importantes, a partir das quais medidas de prevenção e controle

poderão ser estabelecidas.

Procedimento I:

O estudo das bactérias Gram-Positivas será realizado simulando-se o recebimento de uma

amostra clínica em um laboratório de Microbiologia.

Objetivos

a) Isolamento de culturas para verificação de pureza

b) Preparo de material para identificação de bactérias

c) Importância do isolamento de micro-organismos do ponto de vista clínico.

Material Necessário

a) Tubos com caldo simples inoculados com bactérias gram-positivas.

b) 1 placa de ágar sangue por aluno

OBS: Paralelamente será feito o estudo e identificação de bactérias gram-negativas. Para isso,

o aluno deve buscar na apostila a parte referente à identificação deste grupo, fazendo o uso do

meio de cultura adequado para esta identificação (ágar macconkey).

Atividade

a) Recebimento das amostras com as culturas, com as bactérias gram-positivas.

b) Identificação da amostra recebida.

c) Isolamento do micro-organismo em ágar sangue empregando a técnica da semeadura por

esgotamento.

d) Incubação da placa na estufa à 37/C.

e) Leitura e interpretação do crescimento das colônias.

f) Re-isolamento em ágar simples inclinado ou placa de agar simples.

g) Avaliação da morfologia colonial, realização da coloração de Gram, prova da catalase.

h) Semeadura das provas bioquímicas: meios carbonados e meios nitrogenados.

i) Leitura e interpretação dos resultados. Identificação da bactéria.

j) Realização do antibiograma.

Procedimento II:

A pesquisa de Staphylococcus (S.aureus) pode se dar de diferentes formas. A coleta

poderá ser feita a partir da realização de um swab nasal e/ou swab subungueal.

Objetivo

a) Coleta de material para isolamento de Staphylococcus.

b)Ter noção de coleta de material clínico.


a) Meio de Chapman-Stone (Agar Sal-Manitol)

b) 1 placa de Agar sal manitol por aluno e 1 para o professor

c) 1 swab pequeno estéril por aluno

Agar Sal Manitol: meio de cultivo caracterizado como seletivo e diferencial para

estafilococos. Ele é recomendado para isolamento de estafilococos patogênicos a partir de

amostras clínicas, alimentos, produtos cosméticos e outros materiais. Trata-se de um meio

seletivo pela alta concentração de sal (7,5%) o que seleciona as bactérias que toleram meios com

alta concentração de NaCl (halófilas). Ainda, a presença do manitol mostra as bactérias que

fermentam este açúcar, sendo que dos estafilococos, o S.aureus é o único com esta capacidade o

que torna este meio diferencial. A evidenciação da fermentação do manitol dá-se pelo

aparecimento da uma coloração amarelado no meio, ao redor da colônia do micro-organismo que

o fermenta.

Atividade

a) Os alunos deverão coletar material da própria cavidade nasal ou realizar um swab

subungueal, com auxílio de swab estéril, e inoculá-lo na placa de Agar Sal Manitol. Identificar o

material e incubá-lo na estufa.

b) Avaliação do crescimento em meio Agar Sal-Manitol. Observar o crescimento das colônias e

suas caracteristicas, assim como, as reações de fermentação ou não do manitol.

c) Selecionar uma colônia e avaliar a morfologia colonial.

d) Realizar uma coloração de Gram para confirmação.

e) Realizar testes de catalase e coagulase e a prova bioquímica em Agar Mossel.

f) Incubar os testes a 37/C.

g) Leitura dos resultados e identificação da bactéria isolada de acordo com a tabela.

Identificação de bactérias do gênero Streptococcus

Os estreptococos foram os maiores causadores de infecção hospitalar na era

préantibiótica, causando surtos de infecção e mortes.

Apesar de não serem atualmente uma importante causa de infecção hospitalar, provocam,

no entanto, doenças muito graves e muitas vezes letais, mesmo em pacientes imunocompetentes,

sendo importante o rápido diagnóstico deste agente. Os estreptococcus são encontrados em

animais e humanos na microbiota normal da cavidade orofaríngea. Os estreptococos são muito

exigentes. Para um bom desenvolvimento dos mesmos, são necessários meios enriquecidos e,

por serem em sua maioria anaeróbios aerotolerantes, seu crescimneto ótimo ocorre me

microaerofilia. Eles podem ser diferenciados de acordo com a sua aparência em placas de agar

sangue após incubação a 35°C em presença de 5% de CO2, podendo apresentar hemólise total

(beta), hemólise parcial (alfa, de cor esverdeada) ou ausência de hemólise (gama). A identificação

de espécie de estreptococos beta hemolíticos é feita através da aglutinação com soros

específicos contra os antígenos de Lancefield (A, B, C, D, F e G), que constitui uma prova rápida,

porém não acessível a todos os laboratórios em virtude do elevado custo.

Objetivo

a) Coletar material para isolamento de Streptococcus.

b) Ter noção de coleta de material clínico


a) 1 tubo de caldo azida por aluno

b) 1 swab de garganta estéril

c) 1 placa de agar sangue (Sangue de Carneiro 5%).

Atividade

a) Os alunos deverão realizar swabs de garganta e inocular em tubos com caldo azida. Este

procedimento é empregado para pesquisa de bactérias pertencentes ao gênero Streptococcus.

Incubação dos tubos com o swab junto, à 37°C.

b) Observar uma certa turvação no meio de cultura caldo azida,

c) Retirar o swab e depositar o meio de cultura líquido em um quadrante de uma placa de meio de

cultura àgar sangue. Fechar a placa e proceder uma semeadura por esgotamento, espalhando o

material depositado com o swab, utilizando a alça de platina.

d) Incubação das placas em uma condição de microaerofilia, que será criada em aula (em uma

jarra específica), para promover o crescimeto das bactérias do gênero Strepetococcus, as quais

são consideradas fastidiosas (necessitando de meio rico e condições de microaerofilia).

e) Incubação da jarra na estufa a 37°C.

f) Leitura e interpretação do crescimento.

g) Avaliação dos perfis de hemólise observados.

h) Seleção de uma colônia em agar simples inclinado para posterior identificação.

i) Semadura em provas bioquímicas: meios com diferentes substratos a serem testados. Incução

na estufa a 37°C.

j) Leitura e interpretação dos resultados.

08

Métodos para testar a Sensibilidade das Bactérias

aos Antibióticos (antibiograma)

INTRODUÇÃO

Os antibióticos são produtos naturais de fungos e bactérias do grupo Actinomyces, capazes

de impedir o crescimento ou destruir os micro-organismos. Alguns antibióticos são bactericidas

(matam as bactérias) enquanto outros apenas bacteriostáticos (inibem o crescimento das

bactérias). Na prática se define como resistente aquele organismo que não é inibido ou destruído

por um agente antibacteriano que, em concentrações padronizadas, é eficaz para controlar

micro-organismos. Antibiograma é um bioensaio aplicado para verificar a sensibilidade dos micro-

organismos a vários antibióticos, a fim de avaliar sua sensibilidade ou resistência a um

determinado antibiótico. Sua aplicação básica está em avaliar a provável eficácia de uma

variedade de antibiótico sobre uma determinada bactéria.

MÉTODO DE DIFUSÃO COM

DISCOS DE KIRBY-BAUER

Neste método, discos de papel impregnados com antibiótico são colocados sobre a

superfície do àgar previamente semeado uniformemente com o micro-organismo a ser avaliado.

Após a difusão do antibiótico no meio de cultura ocorre a formação de um gradiente de

concentração ao redor do disco.

Depois da incubação da placa, a presença do antibiótico no meio pode ou não inibir o

crescimento bacteriano que é observado como a formação ou não de um halo de inibição. A

correlação do halo de inibição com a sensibilidade ou resistência do micro-organismo em questão

categorizando é determinada a partir de uma tabela. Então (a partir de respectivas escalas

padronizadas), o micro-organismo poderá ser definido como sensível, intermediário ou resistente

àquele antimicrobiano (Tabela 7).

Objetivo


a) Realizar e interpretar corretamente um antibiograma.

Atividade

a) Saturar um “swab” de algodão com a suspensão bacteriana.

b) Semear a suspensão bacteriana uniformemente sobre a superfície estéril do meio de ágar

Muller-Hinton com o “swab” de algodão, em 3 direções, a fim de obter um inóculo uniforme.

c) Deixar a superfície das placas secar por 15segundos.

d) Colocar os discos de antibióticos sobre a superfície do ágar inoculado, com auxílio de uma

pinça estéril, pressionar levemente cada disco para baixo para assegurar um contato uniforme.

Nota: os discos não devem ficar mais próximos do que 1-1,5 cm da borda da placa de Petri, bem

como devem estar suficientemente separados para evitar superposição de seus halos

de inibição.

e) Deixar a placa em incubação à 37º C.

Leitura da placa

a) Medir e anotar o diâmetro de cada halo (incluindo o diâmetro do disco).

b) Caso haja o crescimento de colônias satélites (adjacentes), medir o halo de inibição a

partir destas colônias.

c) Colocar abaixo o resultado conforme a bactéria escolhida.

Bactéria utilizada:__________________________

Questões

a) O que deve ser observado na leitura de um antibiograma?

b) Explique o resultado do seu antibiograma.

c) Qual o principio do teste de sensibilidade realizado nesta aula?

d) Houve diferenças quando o mesmo antibiótico era utilizado contra diferentes

bactérias? Justifique sua resposta.

09

Controle da População Bacteriana por Métodos

Físicos

CONCEITOS IMPORTANTES

Esterilização: Processo que visa à destruição total de todas as formas de vida de um material ou

ambiente, através de métodos físicos ou químicos.

Desinfecção: É eliminação parcial ou redução do número de micro-organismos presentes num

material inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto, superfície ou local. A

desinfecção pode ser realizada de forma física (pasteurização) ou química (agentes químicos,

denominados desinfetantes).

Anti-sepsia: Semelhante à desinfecção,porém este processo está relacionado com tecidos

vivos, como pele e mucosas.

Sanitização: É o tratamento empregado para diminuir a população microbiana nos utensílios

alimentares e equipamentos de manipulação de alimentos até níveis seguros a saúde pública.

Limpeza: Remoção mecânica da sujeira ou sujidade retidas dos componentes. Este processo é

indispensável e antecede os procedimentos de desinfecção ou esterilização.

Métodos Físicos:

a) Calor Seco: incineração, flambagem, ar quente;

b) Calor úmido: água em ebulição, vapor d'água sob pressão (autoclave), pasteurização,

Tyndalização;

c) Radiações: radiação não-ionizante e ionizante.

DEFINIÇÃO

Calor úmido

O calor úmido é um agente esterilizante eficaz pelo seu alto poder de penetração. Seu

mecanismo de ação ocorre termocoagulação das proteínas bacterianas.

a) Água fervente e vapor efluente: a exposição de micro-organismos por 10 minutos a 1000C é

suficiente para destruir células vegetativas, porém é ineficiente na destruição de esporos.

b) Autoclave: a esterilização pelo vapor d'água é processada na autoclave. Nesse aparelho

a pressão faz aumentar a temperatura e a autoclavação se dá à 1200C, por 15 a 20 minutos,

juntamente com o vapor em estado de saturação. Portanto, calor e umidade constituem

elementos indispensáveis para a destruição dos micro-organismos. A penetração do vapor no

material garante maior nível de destruição dos micro-organismos, e por este motivo é mais rápido.

c) Pasteurização: processo que consiste em aquecer o material a uma temperatura relativamente

baixa (63°C) durante 30 min ou um aquecimento rápido (72°C) por 15 seg e seguido de um

resfriamento rápido (10°C).

d) Tyndallização: também denominada de esterilização fracionada, é um processo no qual o

material a ser esterilizado é aquecido a 100°C por 30 minutos em 3 dias consecutivos, sendo

incubado a 37°C nos intervalos de aquecimento. O primeiro aquecimento irá destruir os micro-

organismos presentes, com exceção dos esporos. Estes germinarão nos períodos de incubação a

37°C e serão destruídos nos aquecimentos posteriores.

Calor seco

O processo de destruição da vida bacteriana pelo calor seco é diferente do que ocorre pelo

calor úmido. No calor seco as bactérias expostas ao ar quente carbonizam antes que a

temperatura seja suficiente para destruí-las. Todavia o calor seco tem menos poder de

penetração que o calor úmido, sendo que necessita de temperaturas muito elevadas e maior

tempo de exposição. Como métodos de esterilização por calor seco podemos citar:

a) Incineração: método onde os micro-organismos são destruídos juntamente com o material que

se leva ao fogo. Em hospitais é utilizado para destruir o material infectado, como por exemplo:

material proveniente de curativos, seringas, agulhas, "swabs".

b) Flambagem: método eficiente somente quando o material se torna incandescente. Em

laboratórios de análise é usado para esterilizar alça de platina, no preparo de lâminas e na

inoculação dos micro-organismos no meio de cultura.

c) Ar Quente: Forno de Pasteur (estufa de esterilização) Este tipo de esterilização é realizado a

temperaturas de 160ºC a 180ºC, com tempo de exposição de 120 a 60 min. em estufas elétricas

equipadas com termostatos, respectivamente. O calor seco ou ar quente em temperatura

suficientemente alta levam a desnaturação e oxidação das proteínas, que resultam na morte dos

micro-organismos. Podem ser esterilizados na estufa: vidros em geral, instrumentos metálicos,

talco, vaselina e óleos em geral.

Radiações

As radiações consistem num método eficaz para reduzir ou eliminar os micro-organismos.

Como métodos de esterilização por radiação podemos citar:

a) Radiação não-ionizante: A radiação não ionizante tem sua atividade microbicida na faixa de

comprimento de onda de 240-280 nm, sendo o comprimento de 260 nm o mais eficaz para

eliminar os micro-organismos. Bactérias ou fungos contidos no ar são facilmente atingidos pelos

raios e conseqüentemente destruídos. Os raios ultravioletas (UV) são os componentes da luz

solar que exercem ação bactericida, a luz UV é absorvida por muitos componentes intracelulares,

mas o DNA é que sofre o mais dano. Após o DNA ter sido exposto a luz UV, ocorre a formação de

dímeros de timina, que impede a ação da DNA polimerase. Para exercer sua função letal sobre

qualquer micro-organismo devem atingi-los diretamente, pois possuem baixo poder de

penetração. Se os micro-organismos estiverem complexados com matéria orgânica, isto é, fora de

alcance direto dos raios (atrás de uma partícula de poeira, superfície com reentrâncias e dobras),

estes permanecem vivos. Por não terem alto poder de penetração, as vestimentas e alimentos só

estarão esterilizados, na superfície expostas à radiação. A água perfeitamente límpida é

permeável aos raios e o vidro comum é impenetrável aos raios.

O grau de exposição aos raios ultravioletas, necessários para exercer ação microbicida,

depende dos fatores tempo e intensidade, que variam para os diferentes micro-organismos.

b) Radiação inonizante: as radiações são denominadas de ionizantes quando produzem íons,

radicais e elétrons livres na matéria que sofreu a interação. A ionização se deve ao fato das

radiações possuírem energia alta, o suficiente para rompem as estruturas celulares. É um

excelente agente de esterilização, porque possui um alto poder de penetração. As radiações

eletromagnéticas do tipo X e gama são as mais penetrantes é utilizada para esterilizar

antibióticos, hormônios e plásticos descartáveis.

Objetivos


a) Ter conhecimento do controle de populações bacterianas através do uso de agentes físicos.

Atividade

Calor úmido

a) Com a caneta de retroprojetor, fazer 4 divisões iguais na parte de inferior da placa, seguindo o

esquema abaixo.

b) A partir de uma cultura em ágar inclinado, será feita uma suspensão da bactéria em água

destilada estéril. Esta suspensão será fervida em banho-maria. Após 5, 10 e 15 minutos uma

alíquota da suspensão será semeada na placa de Petri demarcada. Colocar a placa semeada na

estufa 37ºC (Figura XX)

Radiação não-ionizante

a) Com a caneta de retroprojetor, fazer 2 divisões iguais na parte de inferior da placa, seguindo o

esquema abaixo.

b) Com auxílio da alça de platina ou cotonete de algodão, semear a cultura bacteriana de forma

estufa à 37ºC.

Questões

a) O que pode ser observado com a utilização do calor úmido? Interprete os resultados.

b) Interprete o resultado observado na placa que foi colocada sob raios UV.

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Controle da População Bacteriana por Métodos

Químicos

INTRODUÇÃO

Os desinfetantes e anti-sépticos são agentes químicos utilizados na desinfecção e anti-

sepsia de superfícies inanimadas e tecidos vivos, respectivamente. A eficácia destes agentes

dependente de vários fatores, como: tipos de micro-organismos potencialmente presentes,

concentração e procedência do desinfetante a ser usado, e tempo de permanência de efeito.

Superfícies sujas devem estar limpas antes do uso do desinfetante ou anti-séptico. O uso

adequado de agentes químicos é essencial à segurança laboratorial. Além do uso como

desinfetantes ou antisépticos, os agentes químicos podem ser usados para evitar crescimento

bacteriano em alimentos (ex: nitritos em salsichas e outros tipos de carne).

TIPOS DE DESINFETANTES E ANTISÉPTICOS

Agentes alquilantes: glutaraldeído, formaldeído, óxido de etileno.

Fenóis: fenóis

Álcoois: etílicos e isopropílicos

Biguanidas: clorexidina

Halogênios: compostos clorados e iodo

Compostos de Amônio Quaternário: cloreto de benzalcônico

Peroxigênios: peróxido de hidrogênio, ácido peracético, ozônio

Corantes: violeta de genciana

Objetivos


a) Ter conhecimento dos agentes químicos utilizados para o controle de populações bacterianas.

Atividade

O experimento que será realizado tem por objetivo verificar a ação de anti-sépticos sobre a

microbiota das mãos, para tanto devem ser seguidas as seguintes etapas:

a) Com a caneta de retroprojetor, fazer 4 divisões iguais na parte de inferior da placa,

seguindo o esquema abaixo.

b) Identificar cada quadrante com os respectivos títulos: Controle (C), Mão Suja (MS),

anti-séptico 1 (AS1), anti-séptico 2 (AS2).

c) No quadrante identificado como MS o aluno deve encostar o dedo (sem lavar) no ágar

por 1 minuto.

d) A seguir o aluno deve lavar as mãos com um anti-séptico, secá-las levemente e encostar o

mesmo dedo no quadrante do ágar identificado como AS1 por 1 minuto.

e) O aluno então deve lavar as mãos com um outro anti-séptico, secá-las e encostar o mesmo

dedo no quadrante do ágar identificado como AS2 por 1 minuto.

f) A placa deve ser levada para incubação.

OBS: Cuidado para não encostar no quadrante identificado como “Controle”.

Questões

a) Foi observada alguma diferença quanto à sensibilidade das bactérias Gram positivas e Gram

negativas aos anti-séptico? Discuta seus resultados.

b) Por que o álcool 70% é mais eficaz que o álcool a 100%?

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Enzimas Extracelulares produzidas por Bactérias

INTRODUÇÃO

A habilidade dos micro-organismos em produzir e secretar uma variedade de enzimas é de

grande importância para a adaptabilidade do micro-organismo ao ambiente no qual ele sobrevive.

Esta característica contribui também na produção de novas enzimas que possam auxiliar

na indústria, possam ser utilizadas no controle biológico e na degradação de compostos poluentes

no meio ambiente. Nesta aula prática as bactérias serão testadas quanto à produção das enzimas

abaixo relacionadas.

GELATINASE

A proteína gelatina é obtida pela hidrólise do colágeno e é um bom substrato para testar

bactérias produtoras de enzimas proteolíticas (proteinases).

Estas enzimas proteolíticas são importantes fatores de virulência de alguns micro-

organismos. Ao ser hidrolisada pela gelatinase, a gelatina perde suas características de

gelificação, tornando o meio de cultura líquido.

Meio de cultura: tubos ágar em coluna de gelatina nutriente

Extrato de carne ..........................3,0 g

Peptona bacteriológica ................5,0 g

Gelatina (12%)...........................120,0 g

Água destilada ........................1000 mL

Semeadura : Semear os tubos por picada até metade do tubo, pelo menos 3 vezes

Incubação : à 37°C por aproximadamente 24 horas

Leitura : Após incubação, colocar em um banho de gelo por 30 minutos. Não agitar os tubos

enquanto seu conteúdo for líquido. Se o meio ficar sólido será gelatinase negativo, se ficar líquido

será gelatinase positivo.

A hidrólise de proteínas é bem mais lenta quando comparada a quebra dos carboidratos,

portanto a detecção visual deve ser feita cuidadosamente e se necessário com incubações mais

longas.

AMILASE

Como a molécula do amido é muito complexa, sua assimilação pelas bactérias deve ser

precedida por uma decomposição, que é efetuada pelas amilases bacterianas. O amido, assim,

pode ser hidrolisado totalmente até glicose ou, parcialmente, com a formação de dextrinas.

Meio de cultura: Ágar simples adicionado de 0,2% de amido, distribuído em placas de Petri.

Semeadura: semear a bactéria em pontos eqüidistantes ou em pequenas estrias.

Incubação: incubar à temperatura de 37°C, durante 24 a 48 horas.

Leitura: após a incubação cobre-se a superfície do meio com solução diluída de Lugol.

a) Coloração azul do ágar (amido não hidrolisado) = amilase negativa.

b) Zona clara ao redor do crescimento (hidrólise total do amido) = amilase positiva.

c) Zona vermelha ao redor do crescimento (hidrólise parcial do amido) = amilase positiva.

CASEINASE

A caseína é a principal proteína do leite e é responsável pela sua brancura opaca. Muitas

bactérias produzem enzimas que hidrolisam a caseína em derivados mais solúveis e

transparentes.

Meio de cultura: Placas de ágar caseína

Triptona............................ 5,0 g

Extrato de levedura........... 2,5 g

Glucose.............................1,0 g

Leite desnatado................. 20 mL

Ágar................................... 15,0 g

Água destilada................... 980 mL

Semeadura: semear a bactéria em pontos eqüidistantes ou em pequenas estrias.

Incubação: incubar à temperatura de 37 °C, durante 24 a 48 horas.

Leitura:

a) coloração opaca do ágar ao redor do crescimento bacteriano - sem produção da enzima

b) zonas claras ao redor do crescimento bacteriano – produção da enzima

Atividade

a) Preencha o quadro abaixo, em relação a produção ou não das enzimas extracelulares,

utilizando também os dados de seus colegas.

b) Se você tiver bactérias Gram positivas e Gram negativas, discuta seus dados.

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Cultivo e Identificação de Fungos Filamentosos

INTRODUÇÃO

Os meios de cultura mais comuns utilizados no cultivo de fungos são o agar batata

dextrose (BDA ou PDA) e o agar Sabouraud, ambos ricos em açúcares e ligeiramente ácidos.

Caso seja necessária a preparação de um meio de cultura mais seletivo para fungos, deve-

se adicionar um antibiótico de amplo espectro de ação, como o cloranfenicol, e acidificar ainda

mais o meio de cultura (pH 4,0), já que a maioria das bactérias não cresce bem em pH ácido. A

temperatura ótima de crescimento dos fungos varia entre 22 e 28°C, dependendo da espécie.

Outra característica importante no cultivo de fungos filamentosos é a necessidade de

umidade elevada, o que pode ser obtido através da incubação das placas de Petri com as tampas

voltadas para cima.

A identificação dos fungos filamentosos é feita após a observação de características

morfológicas coloniais e da micromorfologia, principalmente através da observação das estruturas

reprodutivas.

Em relação à colônia, são observadas a cor (frente e reverso), aspecto (cotonoso /

algodonoso ou feltroso), produção de pigmentos difusíveis e de exsudatos, entre outras. Para a

observação correta da micromorfologia, é realizada a técnica de microcultivo (cultivo em lâmina).

As principais características micromorfológicas a serem observadas são: tipo de hifa

(cenocítica ou septada), cor da hifa (hialina ou escura), tipo de estrutura reprodutiva (sexuada

e/ou assexuada; esporângios / conidióforos), tamanho e forma dos esporos.

Objetivos

Ao término desta unidade, o aluno deverá ser capaz de:

a) Reconhecer uma colônia de fungo filamentoso e saber diferenciá-la de colônias de

microorganismos unicelulares (bactérias e leveduras).

b) Diferenciar as condições apropriadas para cultivo de fungos das utilizadas para cultivo de

bactérias.

c) Saber as características morfológicas coloniais utilizadas na identificação de fungos

filamentosos.

d) Saber as características micromorfológicas utilizadas na identificação de fungos filamentosos.

e) Realizar a técnica de microcultivo (cultivo em lâmina) para a identificação de fungos

filamentosos.

Atividade

a) Inocular com a alça bacteriólogica uma suspensão de esporos de um fungo filamentoso no

centro de uma placa de Petri contendo BDA ou Ágar Sabouraud. Incubar a 25 – 28o C por 1

semana, mantendo a tampa da placa de Petri voltada para cima.

b) Após a incubação, observar as características morfológicas da colônia e a micromorfologia.

c) Realizar o microcultivo do fungo e incubá-lo nas mesmas condições mencionadas

anteriormente.

d) Após a incubação, retirar a lamínula do microcultivo e montar em uma nova lâmina, usando

lugol como líquido de montagem. Observar a micromorfologia ao microscópio.

e) Comparar a micromorfologia do fungo estudado com lâminas prontas de fungos comuns na

natureza (Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, etc).

Morfologia da colônia de um fungo filamentoso

Aspecto da colônia: cotonosos (algodão); velutina ou aveludada; membranosa ou coriácea;

lanosa

Presença de pigmento: verso ou reverso

Contorno: circular; oval; eliptico; irregular; amebóide;

Bordos: ondulados; inteiros; denteados; ciliados; lobulares

Topografia: dobras; sulcos;elevações; franjas; pregas

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Cultivo e Identificação de Leveduras

INTRODUÇÃO

As leveduras são fungos predominantemente unicelulares, que se reproduzem

assexuadamente por brotamento (gemulação) ou fissão. As condições para cultivo de leveduras

são as mesmas mencionadas para fungos filamentosos, com exceção de que elas não requerem

tanta umidade para o crescimento, portanto, as placas de Petri são incubadas com a tampa

voltada para baixo. Como as leveduras são unicelulares, a identificação é feita através de

características morfológicas (coloniais e celulares) e testes fisiológicos / bioquímicos. Todas

as leveduras se coram como Gram positivas pela coloração de Gram.

Características coloniais: cor da colônia; consistência (cremosa, mucóide, seca), superfície

(lisa ou rugosa), bordas (regulares ou irregulares), brilho (brilhosa ou opaca), elevação (plana,

convexa, umbonada, forma de vulcão).

Características celulares: tamanho e forma das células, tipo de reprodução assexuada

(brotamento ou fissão), reprodução sexuada (principalmente presença de ascosporos), presença

de pseudomicélio.

Testes fisiológicos / bioquímicos: fermentação de açúcares, assimilação de diferentes

fontes de carbono e de nitrogênio, crescimento em diferentes temperaturas e diferentes

concentrações de NaCl, etc.

Objetivos

Ao término desta unidade, o aluno deverá ser capaz de:

a) Diferenciar colônias de bactérias, leveduras e fungos filamentosos.

b) Diferenciar as células de bactérias das de leveduras (forma, tamanho, etc).

c) Saber as características morfológicas coloniais utilizadas na identificaç o de leveduras.

d) Interpretar os testes fisiológicos / bioquímicos utilizados na identificaç o de leveduras.

Atividade

a) Escolher uma levedura a ser identificada e trazer para a bancada de trabalho todas as placas

de Petri e tubos inoculados com a levedura escolhida.

b) Observar a morfologia colonial da levedura escolhida.

c) Fazer coloração simples da levedura (cristal de violeta) e observar a morfologia celular ao

microscópio.

d) Observar a morfologia de todas as leveduras a serem identificadas pela turma.

e) Interpretar os testes fisiológicos / bioquímicos da levedura escolhida.

FERMENTAÇÃO: Nem toda levedura é fermentadora. As capazes de fermentar açúcares

produzem gás dentro dos tubos de Durham.

ASSIMILAÇÃO: A assimilação de fontes de carbono e de nitrogênio é interpretada através da

turvação do meio de cultura, causada pelo crescimento da levedura. Para evitar resultados

falso-positivos, a levedura deve ser previamente inoculada em água destilada estéril (esgotar

reservas nutritivas endógenas) antes da inoculação nos meios de cultura respectivos. O grau de

turvação é visto com auxílio do cartão de Wickerham. Turvações de grau 2 ou 3 são interpretadas

como assimilação positiva.

f) Identificar a levedura escolhida utilizando uma chave de identificação.

poligrafo de aula prática microbiologia

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