plantas aromáticas da amazonia

iUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUMICA

DISSERTAO DE MESTRADO

ESTUDO DA COMPOSIO QUMICA DE LEOS ESSENCIAIS DE

PLANTAS AROMTICAS DA AMAZNIA

ALUNA: FERNANDA AVILA LUPE ORIENTADOR: PROF. DR. LAURO E. S. BARATA

CAMPINAS

2007

vAos meus pais Maria de Ftima e Luprcio Aos meus irmos Tania e Ricardo

Ao meu sobrinho Arthur Ao Nelson e Emerval

Dedico

vii

AGRADECIMENTOS

A Deus por me dar fora para concluir mais uma etapa.

Ao Instituto de Qumica da UNICAMP pela oportunidade de

aperfeioamento dos meus conhecimentos em Qumica.

Secretaria de Educao do Estado de So Paulo pelo apoio

financeiro.

Ao professor Dr. Lauro E. S. Barata pelo apoio e orientao.

Ao Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Qumicas, Biolgicas e

Agrcolas (CPQBA), Sra. Maria Emlia Andrade, ao Sr. Raul Alencar e ao

Dr. Nilson Maia pela doao das amostras deste trabalho.

Aos professores Dr. Fbio Augusto e Dr Anglica Zaninelli Schreiber

pelas anlises feitas em colaborao.

Rita pela ajuda tcnica, dedicao e amizade.

Aos amigos do laboratrio de Qumica de Produtos Naturais, em

especial Adriana, pelo aprendizado e descontrao.

Aos amigos Ilton e Antonio por serem to prestativos.

Ana Cladia e ao Mrcio por ensinar a tcnica de SPME.

s minhas queridas amigas Mnica e Carla pelo incentivo e

pacincia.

Aos meus alunos pelo carinho.

A todos que de alguma forma contriburam para o desenvolvimento

desse trabalho.

ix

CURRICULUM VITAE

FORMAO ACADMICAUniversidade de So Paulo USP Ribeiro Preto.

Bacharelado em Qumica, concludo em dezembro de 2000. Licenciatura em Qumica, concludo em dezembro de 2000. Atribuies Tecnolgicas em Qumica, concludo em julho de 2001.

Escola Tcnica Estadual Conselheiro Antnio Prado ETECAP Curso tcnico em Qumica, concludo em dezembro de 1996.

EXPERINCIASENAI Paulnia

Professora do curso Tcnico em Qumica das disciplinas: Anlise Qualitativa, Anlise Instrumental, Corroso e Tecnologia Ambiental. Desde novembro de 2005 at os dias atuais.

Escolas Estaduais de Ensino Mdio. Professora Efetiva de Qumica do Ensino Mdio. Desde maro de 2001 at os dias atuais.

Oficina Pedaggica - Diretoria de Ensino Regio de Sumar. Bolsista do Programa Bolsa Mestrado. Incio em novembro de 2004 at fevereiro de 2007.

Colgio Alternativa Sumar Professora de Qumica do curso pr-vestibular e pr-vestibulinho. Incio em maro de 2005 at os dias atuais.

Curso Pr-Col. Tec Campinas. Professora Plantonista de Qumica. Incio em fevereiro de 2004 at dezembro de 2004.

Colgio Nova Veneza Unidade II Hortolndia. Professora de Qumica do Ensino Mdio. Incio em fevereiro de 2004 at julho de 2004.

xAPRESENTAES

Reviso de estudos fitoqumico e farmacolgico de Aniba canelilla e anlise do leo da madeira e folhas pster. VI Jornada Paulista de Plantas Medicinais. 26 a 29 de outubro de 2003.

Massoia lactona constituinte principal do resduo de Aeollanthussuaveolens por HS-SPME pster. III Simpsio Brasileiro de leos Essenciais. 8 a 10 de novembro de 2005.

PUBLICAES

LUPE, F. A.; LEMES, A. C.; AUGUSTO, F.; BARATA, L. E. S. Fragrant Lactones in the steam distillation residue of Aeollanthus suaveolensMart. ex Spreng and analysis by HS-SPME. Journal of Essential Oil Research, v 19 (3), 201-202, 2007

LUPE, F. A.; SOUZA, R. C. Z; BARATA, L. E. S. Linalool enantiomers from Aniba rosaeodora (rosewood), Lippia alba (erva cidreira nacional) and Ocimum basilicum (basil) oils. (Perfumer Flavorist,submetido).

xi

RESUMOESTUDO DA COMPOSIO QUMICA DE LEOS

ESSENCIAIS DE PLANTAS AROMTICAS DA AMAZNIA

O presente trabalho envolveu o estudo da composio qumica dos

leos essenciais de cinco plantas aromticas Aeollanthus suaveolens, Aniba

canelilla, Aniba rosaeodora, Lippia alba e Ocimum basilicum por

Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (CG-EM).

Amostras destas plantas - leo essencial, planta fresca, seca e resduo da

extrao do leo essencial - foram extradas por Microextrao em Fase

Slida em Espao confinado (HS-SPME) e analisadas por CG-EM. Os leos

foram extrados por arraste a vapor. Os leos essenciais ricos em linalol de

A. rosaeodora (madeira e folhas), L. alba e O. basilicum foram avaliados

por CG-EM com coluna HP-5 e a composio dos enantimeros de linalol

determinada usando coluna quiral. Com o resultado dessa comparao, foi

avaliada a substituio do leo essencial da madeira de A. rosaeodora pelos

leos essenciais estudados. Um estudo sazonal de L. alba para definir as

concentraes e quiralidade do linalol encontrado foi feito com seis coletas.

As principais molculas dos leos essenciais e/ou extratos de A. canelilla (1-

nitro-2-feniletano e metileugenol) e A. suaveolens (massoia lactona) foram

isoladas utilizando tcnicas de fracionamento como: destilao,

hidrodestilao, extrao cido-base, cromatografia em coluna e

cromatografia em camada delgada preparativa, e identificadas por RMN de 1H e 13C. A semi-sntese da massoia lactona foi feita a partir de uma

molcula comercial (-decalactona). Ensaios biolgicos - antifngico e anti

bacteriano foram realizados pela tcnica de difuso com discos com

amostras de A. canelilla e A. suaveolens.

xiii

ABSTRACTCHEMICAL COMPOSITION OF THE ESSENTIAL

OILS FROM AMAZONIAN AROMATIC PLANTS

This work involved the chemical composition study of the following

five aromatics plants Aeollanthus suaveolens, Aniba canelilla, Aniba

rosaeodora, Lippia alba and Ocimum basilicum using Gas Chromatography

/ Mass Spectrometry (GC-MS). Samples of these plants essential oils,

fresh and dried plants as well as extraction residues were extracted using

Headspace Solid Phase Microextraction (HS-SPME) and analyzed with GC-

MS. The oils were extracted by steam distillation. The essential oils of A.

rosaeodora (wood and leaves), L. alba and O. basilicum rich in linalool

were evaluated by GC-MS using HP-5 column, while the linalool

enantiomer composition using a chiral column. From the results of this

comparison the replacement of A. rosaeodora essential oil from its wood by

the plants listed above was evaluated. A seasonal study of L. alba to define

linalool concentrations and chirality was made using six different samples.

The main molecules of the essential oils and/or extracts of A. canelilla (1-

nitro-2-phenyethane and methyl eugenol) and A. suaveolens (massoia

lactone) were isolated using separation techniques as distillation, hydro-

distillation, acid-base extraction, column chromatography and preparative

thin layer chromatography, and identified by NMR 1H and 13C. The semi-

synthesis of the massoia lactone was obtained from a commercial molecule

(-decalactone). Biological assays anti-fungal and antibacterial with

samples of A. canelilla and A. suaveolens were conducted using the

diffusion technique in discs.

xv

LISTA DE ABREVIAES

CCD: Cromatografia em camada delgada

CCDP: Cromatografia em camada delgada preparativa

CG-EM: Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas

d: Dubleto

dd: Duplo dubleto

dt: Duplo tripleto

HS SPME: Microextrao em fase slida no headspace da amostra

M: Multipleto

o.e.: leo essencial

PDMS: Polidimetilsiloxano

RMN de 13C: Ressonncia magntica nuclear de carbono 13

RMN de 1H: Ressonncia magntica nuclear de hidrognio

SPME: Microextrao em fase slida (Solid phase micro-extraction)

t: Tripleto

xvii

LISTA DE FIGURAS Figura 1. Evoluo do faturamento lquido do setor de higiene

pessoal, perfumaria e cosmticos no Brasil........................................... 3

Figura 2. Origem dos terpenides e fenilpropanides............................ 6

Figura 3. Ciclo biossinttico geral dos metablitos secundrios3........... 7

Figura 4. Foto de A. suaveolens............................................................. 12

Figura 5. Foto de A. canelilla................................................................. 14

Figura 6. Foto de A. rosaeodora............................................................ 16

Figura 7. Foto de L. alba........................................................................ 19

Figura 8. Foto de O. basilicum............................................................... 22

Figura 9. Espectro de RMN de 1H da massoia lactona isolada de A.

suaveolens............................................................................................... 34

Figura 10. Espectro de RMN de 13C da massoia lactona isolada A.

suaveolens............................................................................................... 35

Figura 11. Espectro de RMN de 1H da massoia lactona sintetizada....... 37

Figura 12. Espectro de RMN de 13C da massoia lactona sintetizada...... 38

Figura 13. Espectro de RMN de 1H da -decalactona............................ 39

Figura 14. Espectro de RMN de 13C da -decalactona........................... 39

Figura 15. Fluxograma de extrao cido-base do leo essencial bruto

da madeira de A. canelilla...................................................................... 41

Figura 16. Espectro de RMN de 1H do 1-nitro-2-feniletano................... 44

Figura 17. Espectro de RMN de 13C do 1-nitro-2-feniletano.................. 44

Figura 18. Espectro de RMN de 1H do metileugenol............................. 45

Figura 19. Espectro de RMN de 13C do metileugenol............................ 46

Figura 20. Cromatograma do o.e. de A. suaveolens................................ 56

Figura 21. Principais constituintes do o.e. essencial de A. suaveolens. 57

xviii

Figura 22. Obteno da massoia lactona................................................ 62

Figura 23.Cromatograma do o.e. bruto da madeira de A. canelilla (A) 64

Figura 24. Cromatograma da frao obtida por destilao fracionada

do o.e. bruto da madeira de A. canelilla (B).......................................... 64

Figura 25. Cromatograma da alquota obtida por destilao fracionada

da frao B da madeira de A. canelilla (C)............................................. 65

Figura 26. Cromatograma da frao obtida por hidrodestilao do o.e.

bruto da madeira de A. canelilla (D)...................................................... 65

Figura 27. Cromatograma do o.e. das folhas de A. canelilla (E)........... 65

Figura 28. Principais constituintes do o.e. da madeira de A. canelilla... 66

Figura 29. Variao percentual dos principais componentes do leo

essencial de A. canelilla em fraes hidrodestiladas............................. 70

Figura 30. Cromatograma do o. e. das folhas de A. rosaeodora............ 74

Figura 31. Cromatograma do o. e. da madeira de A. rosaeodora.......... 75

Figura 32. Principais constituintes do leo essencial de A. rosaeodora 76

Figura 33. Cromatograma do o. e. de L. alba........................................ 78

Figura 34. Principais constituintes do leo essencial de L. alba........... 79

Figura 35. Cromatograma do o. e. de O. basilicum................................ 81

Figura 36. Principais constituintes do leo essencial de O. basilicum... 82

Figura 37. Enantimeros do linalol 88

xix

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Eluentes, volumes usados e fraes da coluna

cromatogrfica para isolamento da massoia lactona............................. 33

Tabela 2. Eluentes, volumes usados e fraes da coluna

cromatogrfica para isolamento de 1-nitro-2-feniletano e

metileugenol.......................................................................................... 42

Tabela 3. Fraes da hidrodestilao do o.e. de A. canelilla................. 48

Tabela 4. Datas, observaes das coletas e rendimentos das extraes

de L. alba................................................................................................ 53

Tabela 5 Constituintes do o.e. de A. suaveolens e rea percentual

relativa dos picos no cromatograma....................................................... 57

Tabela 6. Constituintes volteis de A. suaveolens fresca (1), seca (2),

leo essencial (3) e resduo da extrao do o.e. (4) extrados por HS-

SPME e rea percentual relativa dos picos no cromatograma............... 60

Tabela 7. Amostras de A. canelilla analisada por CG-EM..................... 64

Tabela 8. Constituintes do leo essencial de A. canelilla da madeira

bruto (A) e fraes B, C, D e das folhas (E), e rea percentual

relativa dos picos nos cromatogramas (Figura 22, 23, 24, 25, 26)........ 66

Tabela 9. Concentrao (%) de 1-nitro-2-feniletano (m/m) nos leos

essenciais de A. canelilla....................................................................... 68

Tabela 10. Constituintes do leo essencial hidrodestilado da madeira

de A. canelilla e rea percentual relativa dos picos no cromatograma . 69

Tabela 11. leo essencial e extratos testados no ensaio biolgico........ 72

Tabela 12. Teste preliminar de atividade do o.e. e dos extratos

realizado pela tcnica de difuso com discos........................................ 73

Tabela 13. Constituintes do leo essencial da madeira e folhas de A.

xx

rosaeodora e rea percentual relativa dos picos no cromatograma....... 75

Tabela 14. Constituintes do leo essencial da madeira e folhas de A.

rosaeodora e rea percentual relativa dos picos no cromatograma33.... 76

Tabela 15. Constituintes do leo essencial de L. alba e rea percentual

relativa dos picos no cromatograma....................................................... 78

Tabela 16. Anlise comparativa de linalol em diferentes amostras de

L. alba....................................................................................................

80

Tabela 17. Constituintes do leo essencial de O. basilicum e rea

percentual relativa dos picos no cromatograma..................................... 82

Tabela 18. Constituintes volteis de amostras de A. rosaeodora, L.

alba e O. basilicum analisados por HS-SPME-CG-EM e rea

percentual relativa dos picos no cromatograma...................................... 85

Tabela. 19. Comparao dos constituintes do o.e. de O. basilicum por

injeo do o.e. e por HS-SPME.............................................................. 86

Tabela 20. Enantimeros do linalol nos o.e. de A. rosaeodora, L. alba

e O. basilicum...................................................................................... 87

xxi

SUMRIO

1. INTRODUO................................................................................. 1

1.1. leo essencial.......................................................................... 4

1.2. Mercado de leos essenciais..................................................... 9

2. REVISO BIBLIOGRFICA.......................................................... 12

2.1 Aeollanthus suaveolens Mart. ex-Spreng................................. 12

2.2 Aniba canelilla (H.B.K.) Mez.................................................. 14

2.3. Aniba rosaeodora Ducke......................................................... 16

2.4. Lippia alba Mill. N. E. Br....................................................... 19

2.5. Ocimum basilicum L. .............................................................. 22

3. OBJETIVOS...................................................................................... 27

3.1. Objetivo Geral......................................................................... 27

3.2. Objetivos Especficos.............................................................. 27

4. EXPERIMENTAL............................................................................. 29

4.1. Material botnico..................................................................... 30

4.2. Extrao do leo essencial de Aeollanthus suaveolens........... 31

4.3. Extrao a frio do resduo de A. suaveolens............................ 31

4.4. Extrao das partes areas de A. suaveolens com solvente..... 32

4.5. Isolamento da massoia lactona do extrato hexnico de A.

suaveolens....................................................................................... 32

4.5.1. Eliminao de clorofila.................................................... 32

4.5.2. Coluna cromatogrfica.................................................... 33

4.5.3. Cromatografia em camada delgada preparativa.............. 34

xxii

4.6. Constituintes volteis de Aeollanthus suaveolens extrados

por Micro-extrao em fase slida (SPME)................................... 35

4.7. Obteno da massoia lactona................................................... 36

4.8. Fracionamento do leo essencial da madeira de A. canelilla

por extrao cido-base, cromatografia em coluna e

cromatografia em camada delgada preparativa.............................. 40

4.9. Destilao do leo essencial bruto da madeira de A. canelilla 46

4.10. Redestilao do leo essencial da madeira de A. canelilla.... 47

4.11. Hidrodestilao do leo essencial bruto da madeira de A.

canelilla.......................................................................................... 47

4.12. Extrao e anlise do leo essencial das folhas de A.

canelilla.......................................................................................... 48

4.13. Quantificao de 1-nitro-2-feniletano no leo essencial da

madeira e folhas de A. canelilla e fraes...................................... 48

4.14. Extrao das folhas de A. canelilla com diclorometano........ 49

4.15. Ensaios biolgicos................................................................. 49

4.15.1. Amostras e microorganismos avaliados........................ 49

4.15.2. Preparao do inculo................................................... 50

4.15.3. Preparao dos discos.................................................... 50

4.15.4. Meio de cultura.............................................................. 51

4.15.5. Inoculao das placas de teste....................................... 51

4.15.6. Aplicao de discos a placas de gar inoculadas........... 52

4.15.7. Leitura das placas e interpretao dos resultados.......... 52

4.16. Extrao do leo essencial de Lippia alba............................ 53

xxiii

4.17. Microextrao em Fase Slida de A. rosaeodora, L. alba e

O basilicum......................................................................................

54

4.18. Avaliao dos enantimeros de linalol nos leos essenciais

de A. rosaeodora, L. alba e O. basilicum....................................... 54

5. RESULTADOS E DISCUSSO....................................................... 56

5.1. Constituintes volteis do leo essencial de A. suaveolens....... 56

5.1.1. Isolamento da massoia lactona........................................ 58

5.1.2. Constituintes de A. suaveolens extrados por HS-SPME 59

5.1.3. Obteno da massoia lactona........................................... 61

5.2. Constituintes volteis do leo essencial de Aniba canelilla.... 63

5.2.1. Quantificao de 1-nitro-2-feniletano no leo essencial

de A. canelilla............................................................................ 68

5.2.2. Variao dos constituintes volteis do leo essencial da

madeira de A. canelilla no processo de hidrodestilao............ 69

5.2.3. Isolamento de 1-nitro-2-feniletano e de metileugenol..... 70

5.3. Ensaios biolgicos com amostras de Aeollanthus suaveolens

e Aniba canelilla............................................................................. 72

5.4. Constituintes volteis do leo essencial de Aniba rosaeodora

das folhas e da madeira................................................................... 74

5.5. Constituintes volteis do leo essencial de Lippia alba.......... 77

5.5.1. Variao sazonal de linalol no leo essencial de Lippia

alba............................................................................................. 80

5.6. Constituintes volteis do leo essencial de Ocimum basilicum 81

5.7. Anlise comparativa de A. rosaeodora, L. alba e O.

xxiv

basilicum......................................................................................... 83

5.7.1 Constituintes volteis de A. rosaeodora, L. alba e O.

basilicum extrados por Microextrao em Fase Slida............ 83

5.7.2. Avaliao dos enantimeros de linalol nos leos

essenciais de A. rosaeodora, L. alba e O. basilicum................. 87

5.7.3. Anlise dos leos essenciais de L. alba, O. basilicum e

das folhas de A. rosaeodora comparando com o leo essencial

da madeira de A. rosaeodora...................................................... 89

6. CONCLUSES................................................................................. 91

7. REFERNCIAS................................................................................ 93

8. ANEXOS............................................................................................ 101

INTRODUO

1

1. INTRODUO

Estima-se que o Brasil possua 50.000 espcies de plantas superiores,

produtoras de madeiras, celulose, fibras, alimentos, leos vegetais e leos

essenciais entre outros produtos naturais. A floresta Amaznica com 4

milhes km2, teria 30.000 espcies de plantas, cerca de um tero medicinais

e/ou aromticas e talvez 70 % destas usadas como medicamentos pela

populao local, alm de outros usos. Porm, acredita-se que apenas 8 %

das espcies vegetais da flora brasileira foram estudadas em busca de

compostos bioativos e apenas 1.100 espcies vegetais da flora brasileira

foram avaliadas em suas propriedades medicinais.1

Plantas tm sido tradicionalmente usadas por populaes de todos os

continentes no controle de diversas doenas e pragas, alm de representar

uma fonte importante de produtos naturais biologicamente ativos, muitos

dos quais se constituem modelos para sntese de um grande nmero de

frmacos. O fato que gera interesse nos produtos encontrados na natureza

que esses apresentam enorme diversidade em termos de estrutura e de

propriedades fsico-qumicas e biolgicas. A diversidade molecular dos

produtos naturais muito superior quela derivada dos processos de sntese,

que, apesar dos avanos considerveis, ainda limitada. Alm disso, como

produtos de organismos que possuem muitas similaridades com o

metabolismo dos mamferos, os produtos naturais muitas vezes exibem

propriedades adicionais s antimicrobianas a eles associados.2

Estudos apontam que a maior parte da populao nacional usa a

medicina alternativa como fonte de recursos teraputicos.

Com o aumento da demanda pela utilizao de plantas medicinais na

cura ou preveno de doenas, o cultivo e/ou o extrativismo dessas plantas

INTRODUO

2

torna-se uma alternativa cada vez mais importante na agricultura nacional.

No entanto, o intenso extrativismo coloca em risco de extino inmeras

espcies nativas, causando distrbios ecolgicos. Considerando-se o valor

das plantas medicinais no apenas como recurso teraputico, mas tambm

como fonte de recurso econmico, torna-se importante estabelecer linhas de

ao voltadas para o desenvolvimento de tcnicas de manejo ou cultivo,

tendo em vista a utilizao dessas espcies vegetais pelo homem aliada

manuteno do equilbrio dos ecossistemas tropicais.3

O mercado de produtos farmacuticos derivados de plantas um

segmento promissor, j que o crescimento do mercado de medicamentos

fitoterpicos da ordem de 15 % ao ano, enquanto o crescimento anual do

mercado de medicamentos sintticos gira em torno de 3 a 4 %, alm de

constituir-se em uma opo teraputica eficaz e culturalmente apropriada.3

O ltimo diagnstico do mercado de cosmticos feito pela ABIHPEC

(Associao Brasileira da Indstria de Higiene Pessoal, Perfumaria e

Cosmticos), disponvel para consulta, mostra que o Brasil conta com 1.367

empresas atuando no setor, sendo que as 16 de grande porte so

responsveis por 72,4 % de faturamento total. As vendas de cosmticos em

2005 atingiram o valor de R$ 15,4 bilhes e o crescimento do setor de

cosmticos, higiene pessoal e perfumaria em 2005 foi de 14,5 %,

apresentando nos ltimos 10 anos um crescimento mdio de 10,7 %.

Adicionalmente, o setor de cosmticos tem alta demanda por novos

produtos. Essa dissertao visa a inovao em novos produtos para

perfumaria e cosmticos. A Figura 1 apresenta a evoluo do faturamento

desse setor.4

INTRODUO

3

Fig. 1. Evoluo do faturamento lquido do setor de higiene pessoal,

perfumaria e cosmticos no Brasil

A Amaznia tem papel de grande importncia, nacional e

internacional. Sua flora e fauna so extremamente ricas, e centenas de

espcies de animais e plantas so encontradas exclusivamente na regio.

urgente a necessidade de preservar sua biodiversidade, pois a floresta

Amaznica sofre grande devastao, tanto pela explorao madeireira como

pela prtica agrcola. Estima-se que o desmatamento j destruiu cerca de

625.000 km2 de floresta, no poupando nem mesmo plantas teis para a

rea Farmacutica ou Cosmtica. O custo ecolgico destas derrubadas

altssimo, e o ambiente afetado de forma irreparvel.

Apesar da indstria de Perfumaria e Cosmticos exigir produtos

novos com freqncia, e esta ser uma boa rea de investimento por

consumir baixos volumes de materiais a altos preos, apenas trs espcies

aromticas oriundas da Biodiversidade fazem parte da pauta de exportao

e comrcio na Amaznia: as favas de cumar (Coumarona odorata), o leo

3,6 3,3 3,84,6

6,48,3

9,711,5

13,515,4

2001 2002 2003 2004 2005

Bilhes - US$ Bilhes - R$

INTRODUO

4

de copaba (Copaifera spp.) e o leo de pau-rosa (Aniba rosaeodora). 5

Recentemente, o Estado do Acre iniciou a extrao do leo essencial de

pimenta longa (Piper hispidinervium) originado de cultivos, como produtor

de safrol, e o Par extrao do leo essencial de priprioca (Cyperus

articulatus) para perfumes finos. No Sul do Brasil a espcie Ocotea

sassafraz est em perigo de extino e a erva baleeira (Cordia verbenaceae)

a nica que se tornou comercial, em bases sustentveis como medicamento

Acheflan desenvolvido pela Ach em colaborao com o CPQBA -

UNICAMP.

1.1. LEO ESSENCIAL

As substncias odorferas em plantas possuem funes ecolgicas,

especialmente como inibidores da germinao, na proteo contra

predadores, na atrao de polinizadores, na proteo contra a perda de gua

e aumento da temperatura, entre outras.6,7

leos essenciais tambm chamados de leos volteis so produtos

obtidos de partes de plantas atravs, sobretudo, de destilao por arraste

com vapor dgua, bem como os produtos obtidos por expresso dos

pericarpos de frutos ctricos. De forma geral, so misturas complexas de

substncias volteis lipoflicas geralmente odorferas e lquidas. Sua

principal caracterstica a volatilidade, diferindo-se, assim, dos leos fixos,

mistura de substncias lipdicas, obtidos geralmente de sementes.

Apresentando tambm outras caractersticas:

x aparncia oleosa temperatura ambiente;

x aroma agradvel e intenso da maioria dos leos;

INTRODUO

5

x solubilidade em solventes orgnicos apolares. Em gua apresentam

solubilidade limitada, mas suficiente para aromatizar as solues

aquosas, que so denominadas hidrolatos;

x sabor: geralmente acre (cido) e picante;

x cor: quando recentemente extrados so geralmente incolores ou

ligeiramente amarelados; so poucos os leos que apresentam cor,

como o leo voltil de camomila de colorao azulada pelo seu alto

teor de azuleno;

x estabilidade: em geral no so muito estveis, principalmente na

presena de ar, calor, luz, umidade e metais;

x a maioria possui ndice de refrao e so opticamente ativos;

x seus constituintes variam desde hidrocarbonetos terpnicos, lcoois

simples e terpnicos, aldedos, cetonas, fenis, steres, teres, xidos,

perxidos, furanos, cidos orgnicos, lactonas, cumarinas, e at

compostos com enxofre. Na mistura, tais compostos apresentam-se

em diferentes concentraes, normalmente, um deles o composto

majoritrio, existindo outros em menores teores e alguns em

baixssimas quantidades ou traos.3

A grande maioria dos leos essenciais constituda de derivados de

terpenides ou de fenilpropanides, sendo que os primeiros preponderam.

Os terpenides so derivados de unidades do isopreno e os fenilpropanides

se formam a partir do cido chiqumico, que forma as unidades bsicas dos

cidos cinmico e p-cumrico. A Figura 2 mostra a origem dos terpenides

e fenilpropanides.

INTRODUO

6

isopreno terpenide

OHO

OHHO OH

cido chiqumico fenilpropanide

Fig. 2. Origem dos terpenides e fenilpropanides

Tais compostos so metablitos secundrios que tm a sua origem

explicada a partir do metabolismo da glicose. Esse ciclo biossinttico pode

ser observado na Figura 3.

INTRODUO

7

alcalideindlicos

quinolnico

protoalcalidealcalide

isoquinolnicos benzilisoquinolnicos

polissacardeos heterosdeos

cido chiquimco

GLICOSEE

acetil-CoA

triptofano fenilalanintirosina

cido glico

Ciclo do cido ctrico

via mevalonato

condensao

taninoshidrolisveis

antraquinonaflavonide

taninos

ornitinalisina

isoprenide

cidos graxosacetogeninas

terpenides esteris

alcalidepirrolidnicos

tropnicos,pirrolizidnicopiperidnicos

quinolizidnico

cido cinmico

fenilpropanide

lignanas e cumarinas

Fig. 3. Ciclo biossinttico geral dos metablitos secundrios 3

Os leos essenciais podem estar estocados em certos rgos, tais

como nas flores, folhas ou ainda nas cascas dos caules, madeira, razes,

rizomas, frutos ou sementes. Embora todos os rgos de uma planta possam

INTRODUO

8

acumular leos essenciais, sua composio pode variar segundo a

localizao.3

A composio qumica dos leos essenciais pode ser afetada pelas

condies ambientais. Por exemplo: um indivduo cultivado numa regio

chuvosa pode apresentar composio qumica diferente de outro indivduo

da mesma espcie cultivado em uma regio seca.

Os mtodos de extrao variam conforme a localizao do leo

essencial na planta e com a proposta de utilizao do mesmo, os mais

comuns so:

1. enfleurage: empregado para extrair leo essencial de ptalas de

flores,. As ptalas so depositadas, a temperatura ambiente, sobre

uma camada de gordura, durante certo perodo de tempo. Em seguida

essas ptalas esgotadas so substitudas por novas at a saturao

total, quando a gordura tratada com lcool. Para se obter o leo

essencial, o lcool destilado a baixa temperatura, o produto assim

possui alto valor comercial.

2. arraste por vapor dgua: os constituintes do material vegetal

possuem presso de vapor mais elevada que a da gua, sendo por

isso, arrastados pelo vapor dgua. Em pequena escala, emprega-se o

aparelho de Clevenger. O leo essencial obtido, aps separar-se da

gua, deve ser seco com Na2SO4 anidro. Esse procedimento, embora

clssico, pode levar formao de artefatos em funo da alta

temperatura empregada. Preferencialmente, esse mtodo utilizado

para extrair leos de plantas frescas.

3. extrao com solventes orgnicos: os leos essenciais so extrados,

preferencialmente, com solventes apolares que, entretanto, extraem

INTRODUO

9

outros compostos lipoflicos, alm dos leos essenciais. Por isso, os

produtos assim obtidos raramente possuem valor comercial.

4. prensagem (ou expresso): empregado para extrao de leos

essenciais de frutos ctricos. Os pericarpos desses frutos so

prensados e a camada que contm o leo essencial , ento, separada.

Posteriormente, o leo separado da emulso formada com gua

atravs de decantao, centrifugao ou destilao fracionada.

5. extrao por CO2 super crtico: esse mtodo permite recuperar os

aromas naturais de vrios tipos e no somente leo essencial, de um

modo bastante eficiente. o mtodo ideal para extrao industrial de

leos essenciais. Nenhum trao de solvente permanece no produto

obtido, tornando-o mais puro do que aqueles obtidos por outros

mtodos. Para tal extrao, o CO2 primeiramente liquefeito atravs

de compresso e, em seguida, aquecido a uma temperatura superior a

31 C. Nessa temperatura, o CO2 atinge um quarto estado, no qual

sua viscosidade anloga de um gs, mas sua capacidade de

dissoluo elevada como a de um lquido. Uma vez efetuada a

extrao, faz-se o CO2 retornar ao estado gasoso, resultando na sua

total eliminao.

1.2. MERCADO DE LEOS ESSENCIAIS

O uso de extratos e leos essenciais na indstria de cosmticos e, em

particular, no ramo de perfumes remonta Antigidade. Na China, na ndia

e no Oriente Mdio, as plantas aromticas, os leos, as guas perfumadas e

preparaes cosmticas eram utilizadas na cozinha, em cosmticos, na

medicina e nas prticas religiosas. A indstria de cosmticos moderna foi

INTRODUO

10

buscar na sabedoria milenar da fitoterapia as receitas para hidratao e

relaxamento da pele e do cabelo.8

Alm dos leos essenciais obtidos de plantas, produtos sintticos so

encontrados no mercado. Esses leos sintticos podem ser imitaes dos

naturais ou composies de fantasia. Para o uso farmacutico, somente os

naturais so permitidos pelas farmacopias. Excees so aqueles leos que

contm somente uma substncia, como o leo de baunilha, que contm

vanilina. Nesses casos, algumas farmacopias permitem tambm os

equivalentes sintticos.3

No mercado internacional o Brasil o dcimo maior importador de

leos essenciais e o quarto maior exportador somando US$ 98 bilhes em

2004. Existem hoje aproximadamente 3.000 leos conhecidos e 300

comercializados, sendo os seis principais produzidos e exportados os leos

de laranja, limo taiti, eucalipto, pau-rosa, lima e capim-limo.5

Empresas multinacionais, sobretudo comeam a instalar-se na

Amaznia a partir do ano 2001. Assim a Crodamazon, a Cognis alm da

Beraca (Brazmazon) produzem diferentes leos e extratos para importantes

indstrias de cosmticos.

O mercado mundial de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosmtico

chegou a US$ 240 bilhes em 2004,9 sendo provavelmente 10 % desde

valor o consumo de matrias primas. O valor deste mercado mostra

claramente que os produtos naturais da Amaznia tm uma oportunidade

nica neste contexto, visto que a demanda de novos leos essenciais para o

mercado de perfumaria crescente, principalmente aqueles oriundos da

Amaznia e da Mata Atlntica. Infelizmente, a baixa qualidade das matrias

primas originadas na regio aliada a fatores como suprimento inadequado,

INTRODUO

11

prazos, e falta de controle de qualidade, liquidam a competitividade da

regio na busca de novos mercados.

Baseado na importncia do estudo de novas fontes sustentveis, leos

essenciais de cinco plantas aromticas (Aeollanthuns suaveolens, Aniba

canelilla, Aniba rosaeodora, Lippia alba e Ocimum basilicum) foram

escolhidos para esse trabalho. Aeollanthuns suaveolens pelo seu aroma

marcante de cco, tornando seu leo uma possvel fragrncia para

perfumaria, Aniba canelilla por seu aroma de canela, podendo ser usado nas

indstrias alimentcia e de cosmticos, Aniba rosaeodora dado ao

esgotamento de suas fontes naturais e por sua importncia no mercado

internacional de leos essenciais, Lippia alba e Ocimum basilicum por

serem citados na literatura como possveis fontes de linalol para substituir o

leo essencial de A. rosaeodora . A reviso bibliogrfica de cada planta est

a seguir.

REVISO BIBLIOGRFICA

12

2. REVISO BIBLIOGRFICA

2.1. Aeollanthus suaveolens Mart. ex- Spreng

Fig. 4. Foto de A. suaveolens

Aeollanthus suaveolens, conhecida popularmente como catinga de

mulata, pertence famlia Lamiaceae e uma erva anual nativa da

Amaznia. O leo essencial dessa planta foi recentemente apresentado, pelo

nosso grupo de pesquisa, no Congress on Perfumery and Natural raw

material 5, na Frana, e na empresa Quest, em Paris, onde recebeu grande

ateno.

A planta usada pela populao em banhos de cheiro feito pela

infuso de plantas aromticas, em motivos religiosos ou folclricos, e em

perfumes caseiros. No folclore usado para quebranto. Na etnomedicina

usado no combate febre, dor de cabea, incio de derrame, sendo a folha a

parte mais utilizada como ch e sumo.10 Devido a importncia desta planta

como medicinal e como fragrncia, vrios autores a estudaram.

Edua

rdo

Mat

toso

REVISO BIBLIOGRFICA

13

Estudos anteriores mostraram que os leos essenciais das folhas e

flores obtidos por hidrodestilao apresentaram como principais

componentes o (-) linalol, farneseno e (-) massoia lactona.10 Por esses

autores, o maior rendimento de linalol ocorre na folha (31,50 %), para o

farneseno observa-se maior concentrao na flor (55,32 %), seguida do

caule (42,17 %) e folha (21,90 %).10 Com relao a massoia lactona, o

percentual de maior significado ocorreu na folha (25,15 %), nas demais

partes do vegetal, as porcentagens foram insignificantes.10 Um outro estudo

mostra que o rendimento da destilao do leo essencial maior no perodo

de florescncia (0,11 %) do que no perodo sem flores (0,07 %).11 No caso

da hidrodestilao, amostras frescas apresentam menor rendimento (0,1 %)

que amostras secas (0,5 %).12

A atividade antimicrobiana do leo essencial foi comprovada, sendo a

massoia lactona fortemente ativa contra os microorganismos S. setubal e

Bacillus subtilis.13 A CIM (Concentrao Inibitria Mnima) do leo voltil

mostra atividade mais acentuada contra a bactria Escherichia coli e o

fungo Cryptococcus neoformans.13

Estudos fitoqumicos monitorados farmacologicamente evidenciaram

que o leo essencial o responsvel pelo bloqueio de convulses induzidas

por Metrazol (PTZ) em camundongos.14 A atividade anticonvulsivante das

lactonas detectadas nesta planta, (G - decalactona, G - decen-2-lactona e J -

decalactona) foram avaliadas em camundongos, sendo que as duas

primeiras no apresentaram resultados significativos, mas a J - decalactona

apresentou atividade sedativa.15 O extrato hidroalcoolico de A. suaveolens

mostrou forte atividade analgsica e antiinflamatria em camundongos.16

REVISO BIBLIOGRFICA

14

Dado a importncia etnomdica, farmacolgica e a possibilidade de

ser utilizada em perfumaria, decidimos estudar mais profundamente essa

planta.

2.2. Aniba canelilla (H. B. K.) Mez

Fig. 5. Foto de A. canelilla

A Aniba canelilla pertence famlia Lauraceae e nativa da regio

Amaznica, distribuindo-se amplamente nas matas pluviais do interior da

Guiana Francesa no leste, ao longo do escudo das Guianas, atravessando

Suriname, Venezuela e Colmbia at Amaznia peruana. No Brasil,

ocorre nos estados do Par e Amazonas. Apresenta os nomes vulgares de

preciosa17, folha-preciosa, pau-precioso18, casca-preciosa17, casca-do-

maranho17, falsa-canela18, amapaiama18, pereior18. Esta rvore fornece

madeira de tima qualidade, apropriada para mobilirio e construo civil.

A planta enormemente utilizada na medicina popular. O ch das

cascas e folhas empregada contra o artritismo, esgotamento nervoso como

redutora da albumina do sangue19, para hidropsia, catarro crnico, sfilis,

leucorria, aerofagia, males do corao e para amenizar a dor aps a

extrao de dentes17, sendo ainda considerado anti-anmico, anti-

desentrico, anti-espasmdico, digestivo, eupptico, peitoral e

ww

w.tr

eem

ail.n

l

REVISO BIBLIOGRFICA

15

estimulante18. Tambm usado para resfriados, tosses, dor-de-cabea e

nuseas.20 Possveis aplicaes em cosmticos so sugeridas pelo seu uso

etnobotnico. O leo essencial usado contra acnes, dermatites, febre,

infeces diversas e ferimentos.20

Devido ao aroma de canela usado como condimento.21 O odor do leo

essencial da preciosa, semelhante ao da canela, fez com expedies

portuguesas e espanholas, aps o descobrimento do Brasil, penetrassem na

regio amaznica em busca dessa especiaria.22

Os tecidos indicam a composio: eugenol, linalol, metileugenol,

anabasina, anibina e tanino.23 O principal componente do leo essencial,

tanto do tronco quanto das folhas de A. canelilla, o 1-nitro-2-feniletano,

uma molcula rara em produtos naturais, derivada da fenilalanina. O leo

da madeira apresenta rendimento de 0,7-1,0 % e consiste de eugenol (1 %),

metil eugenol (15 %) e 1-nitro-2-feniletano (80 %).24 A anlise de CG-EM

do leo essencial das folhas apresentou a seguinte composio qumica: D-

pineno, E-pineno, E-felandreno, E-cariofileno, E-sesquifelandreno, p-

cimeno, linalol, 1-nitro-2-feniletano, D-copaeno e espatulenol.18 Em outro

estudo22 foram identificados sesquiterpenos no leo essencial das folhas,

bem como a presena de molculas precursoras da biossntese de 1-nitro-2-

feniletano como benzonitrila, benzoacetaldedo e benzoacetonitrila. O leo

essencial das cascas apresentou os alcalides benziltetrahidroisoquinolina23,

tetrahidroprotoberberina25, (R)(+)noranicanina26, anicanina26, canelila27,

norcanelilena27, (-) norcanelilina28, (+) canelilina28, canelilinixina.28

A atividade anti-espasmdica do leo das cascas de A. canelilla foi

comprovada in vivo.29

REVISO BIBLIOGRFICA

16

O componente majoritrio do leo essencial 1-nitro-2-feniletano,

possui alta toxicidade contra Candida albicans. A DL50 do extrato de ter de

petrleo da planta maior que 800 mg/Kg por rato BALB/c.30

Nosso interesse nessa planta deriva do seu aroma especial, do uso

etnobotnico e da sua ao sobre a pele como mostrado por Maia e col.18

Adicionalmente, nosso estudo voltado para as folhas dessa planta, que

mostram os trabalhos de Maia e col.18,22 possui enorme concentrao de 1-

nitro-2-feniletano.

2.3. Aniba rosaeodora Ducke

Fig. 6. Foto de A. rosaeodora

A Aniba rosaeodora uma rvore da famlia Lauraceae, conhecida

como pau-rosa, que no Brasil ocorre desde o Amap at a fronteira com o

Peru ao longo de ambas as margens do rio Amazonas.

A planta usada em cosmticos, perfumes caseiros e sprays para

aromatizar ambientes e em loes com leo de Andiroba (Carapa

guianensis) para reumatismo. O leo essencial puro usado na odontologia

Edua

rdo

Mat

toso

REVISO BIBLIOGRFICA

17

e alergias. O hidrolato (gua aromtica subproduto da destilao) usado

para a desinfeco de banheiros e ralos com grande eficincia. As folhas de

A. rosaeodora so utilizadas pelas lavadeiras beira dos rios da Amaznia,

para a ltima gua de enxge das roupas, o que lhe confere um aroma

especial de limpeza.

No folclore amaznico os homens passam gotas do leo atrs dos

lbulos da orelha, acreditando que isto lhes confere atrativo sexual. So os

perfumes atrativos encontrados na feira Ver-o-Pso preparados com lcool

desodorizado 70 %, casca e folhas do pau-rosa e outras plantas aromticas.

Defumaes de limpeza do ambiente so feitas com raspas de casca e

folhas de A. rosaeodora aspergidas sobre braseiros toda 1a sexta-feira do

ms, e no folclore isto afasta os maus espritos.

Na Aromaterapia, o leo essencial de A. rosaeodora aconselhado

como estimulante celular, regenerador de tecidos, antidepressivo, tnico

dos nervos, calmante e utilizado para dores de cabea e nuseas.

Na Cosmetologia indicado para os cuidados com a pele sensvel,

pele envelhecida, rugas e cuidados em geral e tambm para cicatrizes e

leses, acne e dermatite. indicado para qualquer tipo de preparado para o

corpo ou para a pele (leos de banho, loes, mscaras e massagens

faciais).

A. rosaeodora, espcie cujo aroma da madeira lembra a rosa, produz

leo essencial constitudo na maior parte por linalol (70-90 %). Linalol e

seus steres, como o acetato de linalila, so matrias odorferas de cheiro

intenso e agradvel. Esse lcool um importante intermedirio na produo

de vitamina E, e embora de origem sinttica seja bastante usado em

perfumaria para produtos de fragrncias florais, pode ser aplicado em

detergentes e sabes. Desde o incio do sculo a indstria de Perfumaria e

REVISO BIBLIOGRFICA

18

Cosmticos vem utilizando este leo, que hoje vendido por US$80/kg

(FOB Manaus). O preo tem aumentado com a escassez do produto, j que

as ltimas fontes naturais esto esgotando-se. Os principais compradores do

leo so os Estados Unidos e Europa, podemos citar empresas sofisticadas

como a francesa Chanel, que utiliza o leo na produo dos seus perfumes.

Para produzir anualmente cerca de 40 toneladas de leo essencial da

madeira de A. rosaeodora, necessrio que sejam derrubadas cerca de 4 mil

rvores. De acordo com o Ibama, para cada tambor de 180 litros de leo

produzido, 80 mudas de A. rosaeodora deveriam ser plantadas. Existe,

entretanto, a escassez de mudas, o que as torna caras. O principal problema

que para a extrao do leo essencial de A. rosaeodora ocorre a destruio

da rvore, pois, para obteno desse leo, o tronco cortado transformado

em serragem, outros problemas so a falta de tcnicas de plantio e o longo

perodo de maturao dessas plantas na floresta para corte da madeira -

mais de 25 anos.

Nos ltimos tempos, a indstria de Perfumaria tem reduzido o

consumo do leo de A. rosaeodora, tanto pelo preo quanto pela questo

ambiental, tendo em vista que a espcie corre perigo de extino, as grandes

empresas, em geral, preferem no correr o risco de ter seu nome associado

devastao do meio ambiente.

Cientistas brasileiros preocupados com o esgotamento das reservas

naturais de A. rosaeodora tm pesquisado fontes alternativas de leos

essenciais ricos em linalol. Alguns estudos mostram que o leo de O.

basilicum por apresentar considervel concentrao de linalol (31 %) e

grande facilidade de cultivo seria uma possvel alternativa ao uso do leo de

A. rosaeodora.31 Outros estudos apontam o leo da L. alba como

REVISO BIBLIOGRFICA

19

alternativa, devido a sua alta concentrao de linalol (60 %) nas partes

areas.32

Anlises do leo essencial das folhas de A. rosaeodora feitas pelo

nosso grupo de pesquisa mostraram que este a melhor alternativa de fonte

sustentvel do leo da sua madeira, por possuir perfil cromatogrfico e

qualidade olfativa aps destilao, similar ao linalol da madeira. O linalol

apresenta-se em alta concentrao no leo essencial da madeira (85 %) e

nas folhas (81 %).33

O estudo dos leos essenciais da madeira e das folhas de A.

rosaeodora foi introduzido nessa dissertao para comparar a quiralidade

dos compostos desses leos com as dos leos essenciais de Lippia alba e

Ocimum basilicum.

2.4. Lippia alba Mill. N. E. Br.

Fig. 7. Foto de L. alba

Tambm conhecida como erva cidreira nacional, erva cidreira de

arbusto, erva cidreira do campo, alecrim do campo, alecrim selvagem,

carmelitana, cidreira brava, falsa melissa, lpia (Brasil); white ou bush

Adr

iana

Lope

sSch

ioze

r

REVISO BIBLIOGRFICA

20

Lippia, wild sage (ingls); pampa organo (Amaznia peruana); toronjil

mulato, organo de burrro, cidrona (Venezuela); paralisado, salvia

(Argentina); salvia betonica (Mxico).34 Ocorre nas Amricas Central e do

Sul, habitando praticamente todas as regies do Brasil, onde empregada

como medicinal, pelas suas propriedades sedativa, carminativa, analgsica,

espasmoltica e emengoga.

L. alba um arbusto perene de at 3 m de altura, muito ramificado e

de galhos finos. As folhas so curto-pecioladas, opostas, ovadas, ovado-

oblongas ou oblongas, agudas ou obtusas no pice, estreitas na base. As

flores so pequenas, normalmente rseo-violceas, mas s vezes vermelhas

ou brancas, em espigas densas. Planta de fcil propagao, no tolerando

excesso de temperatura. Cresce em vrios tipos de solo, preferindo os

levemente arenosos.34

A composio do leo essencial apresenta variao qualitativa e

quantitativa, levando a separao em quimiotipos denominados Lippia alba

1, 2, 3, os quais produzem como componente majoritrio no leo essencial

o citral, a carvona e o linalol, respectivamente,35 mesmo que cultivadas em

condies semelhantes. O leo essencial do quimiotipo 3 obtido por

hidrodestilao das folhas das plantas foi analisado por CG, sendo

identificados oito compostos (aproximadamente 93,6 % do leo): linalol

(69,3 %), 1,8 cineol + limoneno (4,6 %), germacreno D (4,2 %), SS-

cariofileno (3,6 %) e germacreno D-4-ol (2,7 %).36 Em outra anlise, o leo

essencial das folhas apresentou a composio: linalol (78,9 %), 1,8 cineol

(6,5 %), germacreno D (3,5 %), E- cariofileno (2,7 %) e D- terpineol (2

%).37 A anlise do linalol com coluna quiral mostrou que a L. alba apresenta

exclusivamente o ismero S-linalol.38 Humberto, Lage e Leito39 afirmam

que L. alba uma fonte em potencial de linalol 3S-(+)-linalol, que requer

REVISO BIBLIOGRFICA

21

pequenas reas para o cultivo a apresenta crescimento rpido, alm disso

uma fonte sustentvel porque o melhor leo obtido dessa planta o da sua

folha. Kleber, Bem e Jannuzzi40, agrnomos da Universidade de Braslia

(UNB), estudaram diferentes quimiotipos de L. alba determinando a

composio de linalol com at 60 % nas partes areas. Os autores sugerem

que o leo essencial dessa planta poderia vir a substituir o leo essencial da

madeira de A. rosaeodora.

O leo essencial de L. alba mostra efeito fungisttico contra

Colletotrichum falcatum and C. pallescens a 700 ppm ou menos e efeito

fungicida em concentraes maiores para Fusarium moniliforme,

Ceratocystis paradoxa, Rhizoctonia solani, Curvularia lunata, Periconia

atropurpuria e Epicoccum nigrum.41 Tambm apresenta atividade

antibacteriana, sendo maior, sobre os germes grampositivos.42 e mostra um

promissor potencial txico contra insetos de gros.43

Avaliando a atividade inseticida de compostos de origem vegetal para

obter inseticidas com baixa toxicidade para mamferos, testou-se extrato de

Lippia alba contra a praga Tribolium castaneum e como se observou um

efeito letal sobre T. castaneum concluiu-se que esse extrato poderia servir

como base para a obteno de novos agroqumicos.44 O extrato tambm

apresentou efeito aleloptico e citotxico sobre sementes de alface45 e

atividade anti-candida.46

O extrato de acetato de etila de L. alba mostra atividades anti-

poliovrus.43 Administrao oral de infuso de L. alba previne leses

gstricas induzidas por indometacina (anti-inflamatrio).48 Uma frao no-

voltil de L. alba extrada em etanol 80 % (v/v) apresentou efeitos sedativo

e miorelaxante em camundongos.49

REVISO BIBLIOGRFICA

22

O leo essencial anti-oxidante natural apropriado para produtos

farmacuticos e alimentcios, por exemplo: loes, cremes, xampus e

doces.50

O uso etnomdico de L. alba e suas propriedades bactericidas,

fungicidas e anti-oxidante conduziram nosso interesse para o estudo dessa

planta. Adicionalmente, a sugesto de autores (Maia e col.32, Humberto,

Lage, Leito39 e Kleber, Bem e Jannuzzi40) de que o leo essencial de L.

alba poderia substituir o leo da madeira de A. rosaeodora, provocou a

anlise comparativa desses leos.

2.5. Ocimum basilicum L.

Fig. 8. Foto de O. basilicum

Entre as ervas aromticas, O. basilicum, conhecido popularmente

como manjerico, possui importncia econmica no Brasil, podendo ser

utilizado in natura ou como leo essencial.51 Este leo produzido em larga

escala mundialmente: ndia, Bulgria, Egito, Paquisto, Israel, Iugoslvia,

Estados Unidos, Madagascar, Albnia e Hungria. O Brasil exporta esse leo

por 50 US$/Kg, a ndia e o Egito por 12 15 US$/Kg.52 O tipo europeu

Nils

onM

aia

Bor

lina

REVISO BIBLIOGRFICA

23

considerado de altssima qualidade, produzindo um delicado aroma devido

mistura de linalol e estragol em sua composio qumica, sendo

extensivamente utilizado como aromatizante de licores e perfumes finos.53

Na Etnomedicina essa planta utilizada contra vrias doenas como:

estimulante, estomacal, bronquite, reumatismo e antiespasmdico. Na

Aromaterapia cabocla da Amaznia a planta usada em banhos de cheiro,

mas cuidados devem ser tomados quando se utiliza o leo essencial de O.

basilicum em banhos, pois ele pode causar irritaes na pele de pessoas

sensveis.54,55,56

So identificados sete quimiotipos de Ocimum basilicum: (1) linalol,

(2) metil cinamato, (3) metil cinamato/ linalol, (4) metil eugenol, (5) citral,

(6) metil chavicol, e (7) metil chavicol/ citral.57

A anlise qumica do O. basilicum mostra a presena de taninos,

flavonides, saponinas, cnfora e no leo essencial: timol, metil-chavicol,

linalol, eugenol, cineol e pineno.51

Diversos autores avaliaram a produtividade de O. basilicum em

ambiente protegido: 1) hidroponia (floating); 2) substrato preparado e 3)

substrato comercial. O sistema hidropnico apresentou a maior

produtividade de massa verde, aproximadamente 44 % superior aos outros

dois tipos de cultivo. No houve diferena significativa entre as formas de

cultivo quanto ao rendimento e composio qumica dos leos essenciais.51

Um estudo sobre o efeito da temperatura na composio do leo

essencial foi realizado, sendo que na temperatura de 25 C houve aumento

de eugenol e cis-ocimeno, enquanto em 15 C o acrscimo se deu nos

compostos cnfora e trans farneseno. Os compostos linalol e 1,8

cineol no sofreram efeito da temperatura.58

REVISO BIBLIOGRFICA

24

A anlise do leo essencial de O. basilicum leva a resultados

diferentes dependendo do mtodo de extrao. Enquanto a composio dos

leos obtidos com arraste convencional, usando-se microondas como fonte

de aquecimento e com CO2 pressurizado forneceu estragol como principal

constituinte, o leo extrado com solvente a partir da gua codestilada

apresenta linalol em maior teor.59

Um estudo do armazenamento e conservao do O. basilicum, em

diferentes pocas e horrios de colheita, mostrou o decrscimo linear dos

teores de leo essencial, de clorofila e do nmero de colnias de fungos e

bactrias ao longo do armazenamento. No houve efeito da poca ou do

horrio de colheita sobre a composio do leo essencial, mas os teores de

eugenol e linalol aumentaram durante o armazenamento.60 O nmero de

coliformes ficou abaixo de 0,3 NMPg-1 e o nmero de Staphylococcus

aureus, abaixo de 1,0x 102 UFC g1-.60

O leo essencial das folhas extrado tanto por hidrodestilao quanto

por arraste vapor ou de toda planta usado em aroma alimentcio,

produtos de higiene bucal, em fragrncias, em rituais, aromaterapia e como

medicinal.

O leo essencial apresenta propriedades inseticidas, nematicida,

fungisttico, antimicrobiano61 e antifngico.62 Diferentes mtodos utilizados

para testar a atividade antibacteriana mostraram que o leo essencial obtido

de partes areas de O. basilicum possui forte efeito inibitrio sobre

Staphylococcus, Enterococcus e Pseudomonas.63

O crescimento micelial do fungo patognico (Botrytis fabae) de

planta foi reduzido significativamente nos quimiotipos metil chavicol e

linalol. Todos os componentes individuais de maior concentrao nos leos

REVISO BIBLIOGRFICA

25

metil chavicol, linalol, eugenol e eucaliptol - diminuem o crescimento do

fungo.64

O leo essencial a uma dose de 1,5 mL/L inibe completamente o

crescimento micelial de 22 espcies de fungos e tambm repelente ao

inseto Allacophora foveicollis. A dose txica muito menor que de alguns

fungicidas comerciais.65

Nos testes antifngicos, os melhores resultados foram obtidos com o

extrato das folhas frescas a 20 %, que ocasionou inibio de 100 %, 91 % e

84 % sobre o crescimento micelial de C. gloeosporioides, L. theobromae e

M. phaseolina respectivamente e com o leo essencial a 0,2 % que

promoveu uma inibio de 91 %, 100 % e 43 % frente a C. gloeosporioides,

L. theobromae e M. phaseolina respectivamente. Os extratos das folhas

secas foram completamente inativos nas mesmas condies.59

O eugenol encontrado no leo essencial mostra atividade

antioxidante,66 alm dos 2 compostos fenlicos cido rosmarnico (RA) e

cido cafeico (CA) - que apresentam essa propriedade fortemente

pronunciada.67

As substncias apigenina, linalol e cido ursolico foram isoladas dos

extratos aquoso e etanlico e apresentaram amplo espectro de atividade

antiviral, como atividade contra vrus da Herpes e hepatite B.68

O extrato aquoso, metanlico e hidro-metanlico e os flavonides

glicosilados de O. basilicum diminuem o ndice de lcera, inibe o cido

gstrico e secrees da pepsina e aumenta hexosaminas em ratos em

tratamento com aspirina.69

A atividade antimicrobiana do leo essencial de O. basilicum contra

microorganismos tem sido amplamente relatada. Prasad et al. (1986) e

Farag et al. (1989) ressaltam ainda que o leo essencial obtido de O.

REVISO BIBLIOGRFICA

26

basilicum e outras espcies de Ocimum so mais eficientes contra bactrias

Gram-positivas (Bacilus sp., Staphylococcus sp., Micrococcus sp.,

Lactobacillus sp.) que contra bactrias Gram-negativas (Enterobacter sp.,

Pseudomonas sp., Salmonela sp.).70

O. basilicum tolerante a cobre e zinco em altas concentraes e

sensvel a Co e Ni. Estudos da distribuio subcelular das folhas e raiz

revelam a seletiva diviso de altas concentraes de Cu e Zn nas paredes da

clula, e Co e Ni na frao do citoplasma.71

O leo essencial de O. basilicum um aromatizante utilizado em

indstrias Alimentcia e de Perfumaria, possui atividades antimicrobiana e

antifngica. Somando-se a isso citado na literatura31 como uma possvel

fonte sustentvel de linalol, pois sua concentrao de 31 % e apresenta

grande facilidade de cultivo, por isso sugerido como um substituinte do

leo essencial da madeira de A. rosaeodora. Tornando-se assim, um objeto

interessante para nosso estudo.

OBJETIVOS

27

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Estudar a composio qumica de leos essenciais de plantas

aromticas de valor comercial por CG-EM.

3.2. Objetivos Especficos

1. Extrair o leo essencial das folhas de Aniba canelilla e Lippia alba e

partes areas de Aeollanthus suaveolens.

2. Caracterizar quimicamente por CG-EM os leos essenciais das

espcies Aeollanthus suaveolens, Aniba canelilla, Aniba rosaeodora,

Lippia alba e Ocimum basilicum.

3. Extrair por Microextrao em Fase Slida e analisar por CG-EM os

compostos volteis de amostras de A. suaveolens, A. rosaeodora, L.

alba e O. basilicum.

4. Comparar por CG-EM em coluna quiral a composio dos

enantimeros de linalol nos leos essenciais de A. rosaeodora, L.

alba e O. basilicum e avaliar a substituio do leo essencial da

madeira de A. rosaeodora pelos leos essenciais das folhas de A.

rosaeodora, de L. alba e/ou de O. basilicum.

5. Isolar e identificar fitoquimicamente as principais molculas dos

leos essenciais e/ou extratos de A. canelilla e A. suaveolens.

6. Transformar a -decalactona comercial na lactona majoritria de A.

suaveolens: massoia lactona, por uma rota deferente da literatura.

OBJETIVOS

28

7. Concentrar a massoia lactona no resduo da extrao do leo

essencial por arraste a vapor.

8. Realizar (em colaborao) ensaios biolgicos preliminares

antifngico e antibacteriano - pela tcnica de difuso com discos com

amostras de Aniba canelilla e Aeollanthus suaveolens.

9. Estudo sazonal de L. alba por CG-EM para definir as variaes de

rendimento do leo essencial e concentrao de linalol.

EXPERIMENTAL

29

4. EXPERIMENTAL

Para anlises de Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de

Massas (CG-EM) foi utilizado um cromatgrafo a gs HP 5890 com

detector seletivo de massas HP 5870 B, com exceo da quantificao de

1-nitro-2-feniletano no leo essencial da madeira e das folhas de A.

canelilla e em suas fraes, realizada no cromatgrafo a gs com detector

de ionizao de chama modelo HP 5890, integrador 3396. A coluna usada

foi HP-5 (5 % fenil 95 % metilpolisiloxano) com comprimento de 30 m,

dimetro interno de 0,25 mm e filme com espessura de 0,25 m. As

condies foram:

Temperatura inicial: 60 C

Temperatura final: 240 C

Rampa: 3 C/ min.

Injetor: 240 C

Detector: 260 C

Gs de arraste: Hlio, fluxo: 1,0 mL/min

Nas anlises usando HS-SPME (do ingls Head Space - Solid Phase

Micro Extraction), o equipamento utilizado foi o primeiro citado. Foi usado

o modo de injeo splitless com fibra PDMS-100 (polidimetilsiloxano).

As anlises de Ressonncia Magntica Nuclear foram feitas no

espectrmetro Varian INOVA500 operando a 499,88 MHz para 1H e 75,45

MHz para 13C e no espectrmetro Gemini operando a 75 MHz para a

anlise de 13C da amostra de 1-nitro-2-feniletano. As amostras foram

solubilizadas em CDCl3.

EXPERIMENTAL

30

As extraes por arraste a vapor foram realizadas num extrator

Marconi 20 L ao inox 306.

As placas para cromatografia em camada delgada preparativa

(CCDP) foram preparadas no prprio laboratrio com espessura de 1 mm de

slica de placa da marca Merck sobre lmina de vidro.

A slica gel usada nas colunas cromatogrficas da marca Merck e

possuem tamanho de partcula 0,063 0,200 mm e 70 230 mesh ASTM.

As placas para cromatografia em camada delgada (CCD) utilizadas

foram da marca Merck, com refletncia para luz ultravioleta 254 nm com

diferentes combinaes dos solventes: acetato de etila, clorofrmio,

diclorometano, hexano, metanol e tolueno. A visualizao dos compostos

foi verificada pela irradiao da luz ultravioleta no comprimento onda 254

nm, seguida da pulverizao com vanilina e cido sulfrico 5 % em etanol

(revelador de terpenides, fenis, etc.)72 seguida de aquecimento em placa

eltrica.

A avaliao dos cromatogramas foi feita atravs da comparao dos

espectros de massas apresentados pela biblioteca Wiley do equipamento e

dos ndices de reteno calculados com os dados da literatura73. Para a

determinao do ndice de reteno de cada substncia foi usada uma srie

homloga de hidrocarbonetos (C9- C20).

4.1. Material botnico

O leo essencial bruto da madeira da A. canelilla e o leo essencial

da madeira de A. rosaeodora foram doados pelo produtor Sr. Raul Alencar

de Manaus, Amazonas.

EXPERIMENTAL

31

O leo essencial das folhas de A. rosaeodora foi obtido num

experimento piloto realizado na regio de Presidente Figueiredo,

Amazonas, pela Sra. Maria Emlia Andrade, tambm produtora de leo

essencial.

As amostras de A. suaveolens e as folhas A. canelilla foram obtidas

no mercado municipal Ver-o-Pso em Belm, Par.

As folhas de L. alba foram colhidas no campo do Centro

Pluridisciplinar de Pesquisas Qumicas, Biolgicas e Agrcolas (CPQBA) e

no jardim da residncia do Professor Lauro E. S. Barata em Campinas, So

Paulo.

O leo essencial de Ocimun basilicum foi doado pelo Dr. Nilson

Maia do Instituto Agronmico de Campinas (IAC), So Paulo e representa

uma amostra da empresa Linax.

4.2. Extrao do leo essencial de Aeollanthus suaveolens

O leo essencial de A. suaveolens obtido por arraste a vapor de

1386,5 g de partes areas frescas, durante 2 h e 30 min, apresentou a massa

de 0,306 g, que corresponde a 0,022 % de rendimento e foi analisado por

CG-EM.

4.3. Extrao do resduo de A. suaveolens

16,3 g do resduo seco da extrao de A. suaveolens por arraste a

vapor foi submetido extrao temperatura ambiente com diclorometano

por 24 h, resultando em 0,74 g de extrato (4,5 % da massa inicial).

EXPERIMENTAL

32

4.4. Extrao das partes areas de A. suaveolens com solvente

Para extrao das partes areas de A. suaveolens utilizou-se um

equipamento de Soxhlet, que utiliza refluxo de solvente o que torna a

tcnica econmica e ambientalmente correta.

33,6 g de partes areas secas ao ar foram extradas com

diclorometano por 24 h, num equipamento de Soxhlet. Aps esse perodo o

solvente foi evaporado em evaporador rotatrio e o extrato foi obtido com

7,6 % de rendimento (2,55 g).

Esse procedimento foi repetido para outra amostra (78,3 g) mudando

o solvente para hexano, apresentando agora o rendimento de 2,8 % (2,17 g).

4.5. Isolamento da massoia lactona do extrato hexnico de A.

suaveolens

Para o isolamento da massoia lactona, o extrato hexnico seco (sem

solvente 4.4) passou por trs processos:

4.5.1. Eliminao de clorofila

1 g do extrato hexnico seco de cor verde, obtido no item 4.4 foi

adicionado 30 mL de metanol. Depois de agitada, essa mistura, filtrada em

papel de filtro. O resduo da filtrao foi abandonado e ao filtrado foi

adicionado gua destilada at turvar (a relao metanol:gua ficou prxima

de 7:3), posteriormente foi realizada uma filtrao em celite de

granulometria 0,01 0,04 mm da marca Merck. Novamente o resduo foi

EXPERIMENTAL

33

descartado e o filtrado extrado com diclorometano (3 x 30 mL). O solvente

foi evaporado em rota-evaporador, o extrato hexnico sem clorofila, de

colorao amarelada, foi pesado, apresentando a massa de 0,23 g que

corresponde a 23 % da massa inicial e analisado em CG-EM.

4.5.2. Coluna cromatogrfica

O extrato obtido no item 4.5.1 foi submetido coluna de filtrao,

utilizando 10 g slica gel, 0,20 g de amostra e os eluentes hexano e acetato

de etila. Foram retiradas alquotas de 20 mL e seis novas fraes foram

agrupadas de acordo com as semelhanas de RF observadas por CCD

(Tabela 1).

Tab. 1. Eluentes, volumes usados e fraes da coluna cromatogrfica para

isolamento da massoia lactona

Eluentes (proporo) Volume

(mL)

Fraes

ReunidasMassa (mg) Massa %

Hexano 80 1 7,8 3,9

20 2 5,8 2,9

20 3 130,2 65,1 Hexano: AcOEt (7:3)

40 4 29,8 14,9

40 5 16,5 8,3 Hexano: AcOEt(4:6)

40

AcOE 90 6 8,8 4,4

As seis fraes foram analisadas por CG-EM.

EXPERIMENTAL

34

4.5.3. Cromatografia em camada delgada preparativa

A frao 3 (Tab. 1) que continha a massoia lactona foi submetida a

cromatografia em camada delgada preparativa com 5 % de nitrato de prata,

mantida no escuro, com eluente hexano:acetato de etila 8:2. A frao

apresentou quatro faixas, que foram coletadas da placa e extradas com

clorofrmio: metanol 95:5. Essa mistura foi filtrada, o solvente evaporado

em rota-evaporador A anlise de CG-EM indicou que na segunda frao, a

massoia lactona foi isolada. A anlise por RMN de 1H e 13C (Figuras 8 e 9)

confirmou que se trata da massoia lactona.

ppm1234567

Fernanda lactona-1 cdcl3/tri-res mar31falHPulse Sequence: s2pul

Fig. 9. Espectro de RMN de 1H da massoia lactona isolada de A. suaveolens

RMN de 1H (500 MHz): G 0,92 (3H, t, 3J= 6,6Hz, H-10); 1,24 1,83

(8H, m, H-6, 7, 8, 9); 2,27 2,37 (2H, m, H-4); 4,39 4,45 (1H, m, H-5);

6,01 (1H, dt, 3J=9,9Hz, 4J=1,5Hz, H-2); 6,86 6,90 (1H, m, H-3).

OO1

2

34

56

7

8

9

10

EXPERIMENTAL

35

ppm20406080100120140160

Fernanda lactona-1 cdcl3/tri-res mar31falCPulse Sequence: s2pul

Fig. 10. Espectro de RMN de 13C da massoia lactona isolada de A.

suaveolens

RMN de 13C (125 MHz): G 13,9 (CH3, C-10); 22,4 (CH2, C-9); 24,4

(CH2, C-7); 29,3 (CH2, C-8); 31,5 (CH2, C-6); 34,8 (CH2, C-4); 80,0 (CH,

C-5); 121,3 (CH, C-2); 145,0 (CH, C-3); 164,5 (C0, C-3).

4.6. Constituintes volteis de Aeollanthus suaveolens extrados

por Microextrao em Fase Slida (SPME)

As anlises dos constituintes volteis extrados por Microextrao em

Fase Slida foram feitas no modo headspace (HS-SPME) para quatro

amostras de A. suaveolens: partes areas frescas, secas, leo essencial e

resduo da extrao do leo essencial. 200 mg de cada amostra e 15 mL de

soluo aquosa saturada de cloreto de sdio foram acondicionadas em

frascos de 25 mL lacrados com septo de teflon/silicone e magneticamente

EXPERIMENTAL

36

agitados a 1.200 rpm por 15 minutos a 55 C para o pr-equilbrio

amostra/headspace. Aps esse perodo, a fibra foi exposta por 20 minutos,

os analitos extrados foram imediatamente dessorvidos e analisados por CG-

EM. Estas foram realizadas em colaborao com o laboratrio do Prof. Dr.

Fbio Augusto do Instituto de Qumica UNICAMP.

4.7. Obteno da massoia lactona

A massoia lactona, alm de ter sido isolada do extrato hexnico da

planta (descrito em 4.5) tambm foi obtida por uma reao de eliminao

, a carbonila da G-decalactona comercial. uma soluo de

diisopropilamina (0,36 mL, 2,36 mmol) em THF anidro (10,0 mL) foi

adicionado a - 78 C e sob uma atmosfera de argnio, 1,20 mL (2,36 mmol)

de uma soluo de n-butil-ltio (2,35 M em n-hexano). esta soluo de

LDA formada (2,36 mmol), foi adicionada uma soluo da G-decalactona

(0,200 g, 1,18 mmol) em THF anidro (1,2 mL). A mistura foi mantida sob

agitao por 0,5h a -78 C, quando ento adicionou-se uma soluo de

PhSeCl (0,452 g, 2,36 mmol) em THF (1,2 mL). A reao foi mantida sob

agitao a -78 C por 4 h (a cada 1 h a reao foi monitorada por CG-EM).

Aps este perodo, adicionou-se 10 mL de uma soluo aquosa saturada de

NH4Cl. A fase aquosa foi extrada com acetato de etila (3 x 10 mL) e as

fases orgnicas combinadas foram secas com MgSO4 anidro, filtradas e

concentradas em evaporador rotatrio. O resduo obtido foi dissolvido em

diclorometano (30 mL) e esta soluo adicionou-se, 0 C, piridina (2

mL) e H2O2 (soluo 30 % aquosa, 8mL). Esta mistura bifsica foi agitada

por 1,5 h a 0 C quando ento adicionou-se uma soluo aquosa de Na2CO3

EXPERIMENTAL

37

(10 %, 20 mL). As fases orgnicas combinadas foram lavadas com gua (10

mL) e soluo aquosa saturada de NaCl (10 mL), seca com MgSO4 anidro,

filtradas, concentradas em evaporador rotatrio e avaliadas por CG-EM.

O leo resultante foi purificado por coluna cromatogrfica com slica

gel, usando o eluente hexano:acetato de etila 8:2. Foram retiradas trs

alquotas de 50 mL que foram analisadas por CG-EM, sendo que apenas a

primeira frao continha a massoia lactona e para seu isolamento, essa

frao foi submetida a CCDP em placa preparada como descrito no item

4.5.3. As subfraes foram analisadas por CG-EM. Anlises de RMN 1H e 13C foram realizadas com a subfrao que apresentava a massoia lactona

isolada e com a G-decalactona, material de partida, (Figuras 11 e 12; 13 e

14, respectivamente), para confirmao do isolamento da massoia lactona e

da reao.

ppm1234567

Fernanda F3.2P44-2 cdcl3 ago24falHPulse Sequence: s2pul

0.040.04

0.050.12

0.550.19

Fig. 11. Espectro de RMN de 1H da massoia lactona sintetizada

OO1

2

34

56

7

8

9

10

EXPERIMENTAL

38


(9H, m, H-6, 7, 8, 9); 2,25 2,39 (2H, m, H-4); 4,37 4,44 (1H, m H-5);

6,01 (1H, d, 3J= 9,9Hz, H-2), 6,85 6,89 (1H, m, H-3).

ppm20406080100120140160

Fernanda "F3.2P44-2" cdcl3/bb5old ago29falCPulse Sequence: s2pul

Fig. 12. Espectro de RMN de 13C da massoia lactona sintetizada

RMN de 13C (500 MHz): G 13,9 (CH3, C-10), 22,4 (CH2, C-9), 24,4

(CH2, C-7), 29,3 (CH2, C-8), 31,5 (CH2, C-6), 34,8 (CH2, C-4), 77,9 (CH,

C-5), 121,4 (CH, C-2), 145,0 (CH, C-3), 164,5 (C0, C-1).

EXPERIMENTAL

39

ppm1234567

Fernanda d-decalactona cdcl3/tri-res abr26falHPulse Sequence: s2pul

0.040.12

0.380.30

0.16

Fig. 13. Espectro de RMN de 1H da -decalactona


(8H, m H-6, 7, 8, 9); 1,86 -1,92 (2H, m, H-4); 2,38 2,45 (2H, m, H-3);

2,53 -2,59 (2H, m, H-2); 4,23 4,29 (1H, m, H-5).

ppm20406080100120140160180

Fernanda d-decalactona cdcl3/tri-res abr26falCPulse Sequence: s2pul

Fig. 14. Espectro de RMN de 13C da -decalactona

OO1

2

34

56

7

8

9

10

EXPERIMENTAL

40


(CH2, C-9); 24,5 (CH2, C-7); 27,7 (CH2, C-4); 29,4 (CH2, C-8); 31,5 (CH2,

C-6); 35,7 (CH2, C-2); 80,6 (CH, C-5); 172,0 (C0, C-1).

4.8. Fracionamento do leo essencial da madeira de A.

canelilla por extrao cido-base, cromatografia em coluna e

cromatografia em camada delgada preparativa

As condies utilizadas para o fracionamento do leo por extrao

cido-base esto na Figura 15.

EXPERIMENTAL

41

Fig. 15. Fluxograma de extrao cido-base do leo essencial bruto da

madeira de A. canelilla.

A secagem de cada frao foi feita com MgSO4 anidro, a filtrao

com papel de filtro e a evaporao do solvente em rota-evaporador. As trs

fraes (cidos, bases e neutros) foram submetidas CG-EM.

xtrao com HCl 1 % (3x30 mL)

cidosm = 46 mg

Adio de NaOH 1N at pH >7 Extrao com CH2Cl2(3x30 mL)

Secagem FiltraoEvaporao do solvente


Fase Aquosa

Adio de HClconc. at pH < 7 Extrao com CH2Cl2 (3x30 mL)

Massa do leo = 1,1210 g

Fase Orgnica

Fase Orgnica

Fase Orgnica

Fase Aquosa

Adio de 50mL de CH2Cl2Extrao com KOH 1 % (3x 30mL)

Fase Aquosa Fase Aquosa Fase Orgnica

Abandonada

Abandonada


Basesm = 3,9mg

Neutrosm = 986,7 mg

EXPERIMENTAL

42

Para purificao de 1-nitro-2-feniletano, uma coluna cromatogrfica

foi feita com 30 g slica gel e 0,98 g dos compostos neutros (relao slica:

amostra = aproximadamente 30:1). Foram usados os eluentes: hexano,

acetato de etila e metanol em gradiente de polaridade. Retiraram-se

alquotas de 10 mL e com o auxlio de CCD, de acordo com a semelhana

de RF, foram agrupadas em seis fraes (Tabela 2)

Tab. 2. Eluentes, volumes usados e fraes da coluna cromatogrfica para

isolamento de 1-nitro-2-feniletano e metileugenol.

As seis fraes foram analisadas por CCD e por CG-EM, onde 70 %

dos componentes foram coletados nas fraes 3 e 4, que concentraram as

substncias 1-nitro-2-feniletano e metileugenol, por isso foram submetidas a

cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP). O eluente usado foi

tolueno: acetato de etila 9:1. A visualizao foi feita atravs da irradiao da

Eluentes (proporo) Volume

(mL)

Fraes

reunidas

Massa

(mg)massa %

Hexano: AcOEt (99:1) 30

Hexano: AcOEt (98:2) 301 0,8 0,1

Hexano: AcOEt (95:5) 30 2 1,1 0,1

Hexano: AcOEt (85:15) 30

Hexano: AcOEt (7:3) 30 0 0

Hexano: AcOEt (3:7) 30 3 463,0 47

AcOEt 60 4 236,6 24

AcOEt: metanol (97:3) 30 5 4,8 0,5

AcOEt: metanol (95:5) 60 6 5,3 0,5

EXPERIMENTAL

43

luz ultravioleta no comprimento de onda 254 nm. As regies de slica

contendo as subfraes foram retiradas das placas e as amostras

solubilizadas com clorofrmio: metanol 95:5. Cada mistura foi filtrada, o

solvente evaporado em rota-evaporador.

Aps esta separao, as subfraes foram analisadas por CG-EM. Os

cromatogramas indicaram duas substncias isoladas: 1-nitro-2-feniletano

nas subfraes 1 das placas 1 e 2, metileugenol nas subfraes 2 das duas

placas. O isolamento das mesmas foi confirmado por RMN de 1H e 13C

(Figuras 16, 17, 18,19).

Para o isolamento do 1-nitro-2-feniletano das folhas de A. canelilla,

seu leo essencial foi submetido CCDP nas mesmas condies usadas

para o isolamento do 1-nitro-2-feniletano do o.e. da madeira, descritas a

cima. As fraes da CCDP foram avaliadas por CCD e para facilitar a

identificao do composto de interesses utilizou-se o padro isolado do o.e.

da madeira, que indicou que o 1-nitro-2-feniletano foi realmente isolado. A

frao correspondente ao composto isolado foi analisada por CG-EM, RMN

de 1H e 13C e IV (Anexo A).

EXPERIMENTAL

44

ppm12345678

Fernanda F2,1P4 cdcl3 out16lsbH2Pulse Sequence: s2pul

0.550.22

0.23

Fig. 16. Espectro de RMN de 1H do 1-nitro-2-feniletano

RMN de 1H (500 MHz): G 3,35 (2H, t, 3J=6,9 Hz, H-2); 4,63 (2H, t, 3J=6,9 Hz, H-1); 7,23 (2H, dd, 3J=7,4 Hz, 3J=2,7 Hz, H-5 e H-5); 7,30 (1H,

tt, 3J=7,4Hz, 3J =2,6 Hz, H-6); 7,35 (2H, t, J=7,4 Hz, H-4 e H-4).

Fig. 17. Espectro de 13C do 1-nitro-2-feniletano

ppm2030405060708090100110120130140

Fernanda f1,1p4 cdcl3 jan05falCPulse Sequence: s2pul

NO21

23

4

4'

5

5'

6

EXPERIMENTAL

45


(CH, C-6); 127,4 (CH, C-4, C-8); 127,8 (CH, C-5, C-7); 134,5 (C0, C-3).

ppm1234567

Fernanda F1,2P4 cdcl3 out16lsbH1Pulse Sequence: s2pul

0.210.07

0.140.43

0.15

Fig. 18. Espectro de RMN de 1H do metileugenol

RMN de 1H (500 MHz): G 3,34 (2H, d, 3J=6,1Hz, H-3); 3,85 (3H, s,

H-11); 3,87 (3H, s, H-10); 5,02 5,11 (2H, m, H-1); 5,95 6,02 (1H, m, H-

2); 6,68 6,71 (1H, m, H-9); 6,72 (1H, s, H-5); 6,80 (1H, d, 3J=6, 80Hz, H-

8).

1

2

349

8

7 65

10

11OCH3

CH3O

EXPERIMENTAL

46

ppm2030405060708090100110120130140150

Fernanda f1,2P4 cdcl3/bbsw out17lsbCPulse Sequence: s2pul

Fig. 19. Espectro de RMN de 13C do metileugenol

RMN de 13C (125 MHz): G 40,1 (CH2, C-3); 56,1 (CH3, C-10, C-11);

111,2 (CH, C-8); 111,8 (CH, C-9); 115,6 (CH2, C-1); 120,3 (CH, C-2);

132,6 (C0, C-4); 137,7 (CH, C-5); 147,3 (C0, C-7); 148,8 (C0, C-6).

4.9. Destilao do leo essencial bruto da madeira de A.

canelilla

A destilao de 31,0 g do leo essencial bruto foi realizada sob vcuo

de 3,3 mmHg com coluna de fracionamento de 13,5 cm. Foi usado um

banho de silicone e o intervalo da temperatura de destilao foi 110-112 C.

O leo foi fracionado em duas amostras e a frao no destilada foi

denominada resduo. A primeira chamada cabea de destilao com

massa de 0,43 g corresponde a 1,4 % da massa inicial do leo e a segunda,

EXPERIMENTAL

47

leo destilado com 29,3 g referentes a 94,6 %. O leo bruto e as duas

amostras foram analisados por CCD e por CG-EM.

4.10. Redestilao do leo essencial da madeira de A. canelilla

Para redestilao do leo destilado, descrito no item 4.9., utilizou-se

26,0 g do leo destilado, vcuo de 3 mmHg e coluna de fracionamento de

13,5 cm. O mesmo foi fracionado em duas alquotas e resduo. A primeira,

cabea de destilao, foi retirada na faixa de temperatura de 68 70 C,

massa = 1,27 g (4,9 %) e a segunda, leo redestilado foi retirada na faixa de

temperatura de 72 74 C, massa = 23,6 g (90,7 %). O leo redestilado foi

analisado por CCD e por CG-EM.

4.11. Hidrodestilao do leo essencial bruto da madeira de A.

canelilla

Foi realizado a hidrodestilao de 33 g de leo essencial bruto da

madeira por 19 h e 30 min. A primeira alquota foi retirada aps 6 h e as

demais, a cada 1 h e 30 min, totalizando 10 fraes hidrodestilada e um

resduo (frao no hidrodestilada). O leo foi extrado de cada poro com

diclorometano (3 x 30 mL), seco com MgSO4 anidro e o solvente evaporado

em rota-evaporador. As fraes foram pesadas (Tabela 3) e analisadas por

CCD, utilizando como eluente hexano: acetato de etila 8:2, e por CG-EM.

EXPERIMENTAL

48

Tab. 3. Fraes da hidrodestilao do o.e. de A. canelilla

N da frao Massa (g)

1 14,7928

2 4,6161

3 2,7768

4 3,8547

5 3,3783

6 1,7647

7 0,7153

8 0,1935

9 0,1722

10 0,042

Resduo 0,4121

4.12. Extrao e anlise do leo essencial das folhas de A.

canelilla

A extrao de 900 g de folhas de A. canelilla foi realizada por arraste

a vapor durante 2 h e 30 min, obtendo 1,35 g de leo (1,7 % de

rendimento). O leo essencial foi submetido CG-EM.

4.13. Quantificao de 1-nitro-2-feniletano no leo essencial da

madeira e folhas de A. canelilla e fraes

A quantificao de 1-nitro-2-feniletano foi feita em cinco amostras:

A- leo essencial bruto da madeira

EXPERIMENTAL

49

B- frao obtida por destilao fracionada do o. e. bruto da madeira

C- amostra obtido atravs redestilao: destilao fracionada de leo

destilado(B) - madeira

D- frao obtido por hidrodestilao do o. e. bruto da madeira

E- leo essencial obtido por arraste vapor folhas

4.14. Extrao das folhas de A. canelilla com diclorometano

56,1 g de folhas de A. canelilla foram submetidas extrao com

diclorometano num equipamento de Soxhlet por 18 h. Aps esse perodo, o

extrato foi obtido com 1,4 % de rendimento (0,77 g).

4.15. Ensaios biolgicos

Os ensaios foram realizados pela Prof Dr Anglica Zaninelli

Schreiber da Faculdade de Cincias Mdicas UNICAMP.

Foi utilizada a tcnica de difuso com discos utilizando como base a

norma do NCCLS (Performance Standards for Antimicrobial Disk

Susceptibility Tests; Approved StandardEighth Edition. NCCLS document

M2-A8 [ISBN 1-56238-485-6]) que permite a determinao do halo de

inibio de crescimento para as substncias em estudo.

4.15.1. Amostras e microorganismos avaliados

As amostras foram dissolvidas em DMSO e esto descrita abaixo :

O.e. hidrodestilado de A. canelilla madeira

Extrato CH2Cl2 de A. canelilla folhas

EXPERIMENTAL

50

Extrato CH2Cl2 de A. suaveolens partes areas

Extrato CH2Cl2 do resduo da extrao com arraste a vapor de A.

suaveolens

Os microorganismos avaliados foram:

Candida albicans

Candida krusei

Candida parapsilosis

Staphylococcus aureus (S)

Staphylococcus aureus (R)

Staphylococcus hominis

4.15.2. Preparao do inculo

Pelo menos de trs a cinco colnias, bem isoladas, do mesmo tipo

morfolgico foram selecionadas da placa de gar. A superfcie de cada

colnia foi tocada com uma ala, e os microorganismos foram transferidos

para um tubo contendo 4-5 mL de salina 0,8 %. Ajustou-se a turbidez da

cultura em crescimento com soluo salina estril ou caldo, de modo a obter

uma turbidez ptica comparvel da soluo padro de McFarland a 0,5.

Isso resulta numa suspenso contendo aproximadamente de 1 a 2 x 108

UFC/mL.

4.15.3. Preparao dos discos

Foram utilizados discos de papel de filtro estreis (CEFAR),

comercialmente disponveis com peso de 30 r 4 mg/cm2, com capacidade

EXPERIMENTAL

51

para absorver de 2 a 3 vezes o seu peso em gua e dimetro de 6,35mm. A

cada disco foram adicionados 20 Pl de extrato. Acondicionados em placas

de Petri estreis foram incubados em estufa at completa secagem, depois

mantidos entre 2-8 C at o momento do teste.

4.15.4. Meio de cultura

O gar Meller-Hinton foi preparado a partir de uma base desidratada

(Oxoid) conforme as instrues do fabricante. O meio recm preparado e

resfriado foi depositado em placas de Petri estreis descartveis de fundo

chato, numa superfcie horizontal, para garantir uma profundidade uniforme

de aproximadamente 4 mm. O que corresponde a 25-30 mL de meio para

placas com dimetro de 100 mm. O meio gar foi esfriar a temperatura

ambiente e armazenadas em geladeira (de 2 a 8 C), por at 7 dias.

4.15.5. Inoculao das placas de teste

Em condies ideais, mergulhou-se um swab de algodo estril na

suspenso ajustada, at 15 minutos aps ajuste da turbidez da suspenso de

inculo. O swab foi girado vrias vezes e apertado firmemente contra a

parede interna do tubo, cima do nvel do lquido para retirada de qualquer

excesso de inculo no swab. A superfcie seca da placa de gar Meller-

Hinton foi inoculada passando-se o swab em toda a superfcie estril do

gar. Repetiu-se o procedimento esfregan

plantas aromáticas da amazonia

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