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  • A 5' VP90 NH2

    ORF2 Gene S - 4328-6691nt 3' 3COOH

    (11) (21) PI 0504441-3 A (22) Data de Depsito: 20/10/2005 (43) Data de Publicao: 26/06/2007

    Repblica Federativa do Brasil (RPI 1903) Ministrio do Desenvolvimento, Indstria

    e do Comrcio Exterior Instituto Nacional da Propriedade Industrial

    (51) Int. CL: GO1N 33/53 (2007.01) C12N 15/63 (2007.01) C12N 15/70 (2007.01) CO7H 21/04 (2007.01) CO7K 14/01 (2007.01) A61K 39/00 (2007.01)

    (54) Ttulo: VETORES DE EXPRESSO PLASMIDIAL CONTENDO REGIES ESPECFICAS PARA A EXPRESSO DE PROTENAS OU EPTOPOS RECOMBINANTES DE ROTAVRUS E ASTROVRUS, PROCESSO DE PRODUO DOS INSUMOS PARA GERAO DE IMUNOBIOLGICOS PARA DIAGNSTICO

    (71) Depositante(s): Fundao Oswaldo Cruz - FIOCRUZ (BR/RJ)

    (72) Inventor(es): Ana Carolina Magalhes Andrade Ges, Jos Paulo Gagliardi Leite, Mrcia Terezinha Baroni de Moraes e Souza, Irene Trigueiros Araujo, Jean Claude D'Halluin, Jos Godinho da Silva Junior

    (74) Procurador: Bhering, Almeida & Associados

    (57) Resumo: vetores de expresso plasmidial contendo regies especficas para expresso de proteinas ou eptopos recombinantes de rotavirus e astrovirus, Processo de produo dos insumos para gerao de imunobiolgicos para diagnsticos. A presente inveno se refere produo de protenas virais especficas recombinantes, para aplicao na construo de um Kit de diagnstico para deteco simultnea das duas principais virose gastroentricas. Mais particularmente, as viroses detectadas pelo dito Kit so as causadas por retavrus e astrovrus.

    B

    VP9Orec

    Gene S- 4139-5315nt

    5' [Segmento 6 1-1321 nt

    757 nt

    NH2

    VP6

    NH2 VP6rec

    COOH

    3' COOH

  • 1 . 11 (-

    . -

    '' , c: ****** e

    .

    "Vetores de expresso plasmidial contendo regies

    especficas para a expresso de protenas ou eptopos

    recombinantes de rotavrus e astrovrus, processo de

    produo dos insumos para gerao de imunobiolgicos para

    5 diagnstico".

    CAMPO DA INVENO:

    A presente inveno se refere produo de protenas

    virais especificas recombinantes para construo de kits

    para o diagnstico das duas principais viroses

    10 gastroentricas. Mais particularmente, as viroses so as

    causadas por rotavrus e astrovrus.

    TCNICAS RELACIONADAS:

    A gastroenterite virai hoje um dos maiores problemas

    de sade publica no mundo inteiro, devido aos altos ndices

    1 5 de morbidade e mortalidade, especificamente, entre crianas

    menores de 5 anos. Apesar do ndice de mortalidade ter

    diminudo, o ndice de morbidade permaneceu estvel durante

    as ultimas 4 dcadas. O nmero de patgenos causadores da

    gastroenterite viral vem aumentando nos ltimos anos,

    20 devido s espcies virais distintas causadoras da

    gastroenterite e devido aos diversos outros agentes

    causadores da gastroenterite que esto sendo descobertos.

    Apenas nas ltimas dcadas os vrus foram descritos

    como agentes envolvidos na etiologia das gastroenterites

    25 infantis, passando estes, junto com as bactrias e

    parasitas, a serem patgenos reconhecidamente envolvidos

    com doenas diarricas de importncia mdica. Os principais

    agentes virais causadores da gastroenterite so os

    rotavrus, os calicivirus, os astrovrus e os adenovrus.

  • 2

    Estudos tm demonstrado, por exemplo, que a infeco

    causada por rotavrus a mais comum causa de diarria em

    crianas. O ndice de pacientes hospitalizado por essa

    patologia de cerca de 35%. O rotavrus vem sendo

    5 considerado, em todo o mundo, o principal responsvel por

    diarria em crianas menores de 5 anos.

    A infeco causada pelo rotavrus varia de um quadro

    leve, com diarria lquida e durao limitada a quadros

    graves com desidratao, febre e vmitos. Entretanto, uma

    10 parte das infeces causadas por este vrus pode ser

    assintomtica.

    Sabe-se que a doena por rotavrus " de distribuio

    universal, embora apresente caractersticas epidemiolgicas

    distintas em reas de clima temperado e nas reas

    15 tropicais.

    Os rotavrus eliminados em alta quantidade nas fezes

    de crianas infectadas, so transmitidos pela via fecal-

    oral, por gua, alimentos ou objetos contaminados, por

    conta o pessoa-a-pessoa, provavelmente, tambm por

    20. secrees respiratrias, mecanismos que permitem uma alta

    capacidade de disseminao dessa doena.

    Estudos demonstram que a partir da descoberta dos

    astrovrus em 1975, estes tm sido considerados a terceira

    maior causa das gastroenterites virais, depois dos

    25 calicivrus. O percentual de deteco deste vrus pode

    variar. Os astrovrus podem ocorrer principalmente como

    resultado de infeces nasocomiais, e diferente dos

    rotavrus tambm ocorrem em jovens e adultos. Estudos tm

    demonstrado que um percentual de 2,4% a 17% encontrado

  • 3

    entre indivduos assintomticos. Muitos casos de deteco

    de astrovrus em amostras clnicas aparecem associados a

    amostras rotavrus positivas.

    A diarria causada pelos astrovrus e de curta durao

    5 e de menor severidade. Outros sintomas como febre e vmito

    ocorrem menos frequentemente. Sintomas mais graves ocorrem

    em crianas ou adultos imunodeficientes.

    As prticas higinicas tradicionais e universais como

    lavagem de mos, controle da qualidade da gua e dos

    10 alimentos, destino adequado dos dejetos e do esgoto,

    imprescindveis para a preveno de quaisquer surtos de

    diarria, no tm sido suficientes para reduo da

    incidncia da infeco causada principalmente pelos

    rotavrus. Evidncias nesse sentido so as extensas

    15 epidemias cclicas da doena em pases desenvolvidos, o que

    mostra que a perspectiva de preveno dessa doena est no

    desenvolvimento de uma vacina que seja capaz de prevenir as

    infeces graves e, conseqentemente as hospitalizaes.

    Contudo, no existe ainda, no mundo, nenhuma vacina

    20 disponvel para isso.

    No Brasil so comercializados kits para pesquisa de

    alguns agentes etiolgicos da gastroenterite,

    particularmente o rotavrus. Entretanto, para a produo de

    insumos dos kits, necessrio o cultivo de partculas

    25 virais em culturas celulares especificas, necessitando de

    mo de obra especializada e otimizao de processos.

    A ttulo ilustrativo, no documento de patente

    US5.298.244, encontra-se descrito um processo para

    construo de um kit de deteco dos agentes etiolgicos de

  • infeces causadas por alguns tipos de vrus. Mais

    particularmente, o rotavrus. O kit descrito no documento

    de patente US5.298.244 consiste na construo de partculas

    virais derivadas de protenas do rotavrus. As partculas

    5 construdas incluem uma protena interna ao capsdeo, a VP6

    em combinao com uma outra protena ou ambas protenas em

    combinao com outras protenas do capsdeo, como por

    exemplo, as protenas VP4 e VP7. Essa construo pode ainda

    ser utilizada como uma composio vacinal para o tratamento

    10 e preveno de infeces causadas pelo rotavrus. A tcnica

    utilizada na patente US5.298.244 compreende na expresso

    eucaritica recombinante utilizando culturas celulares do

    tipo Autographa califrnia e sistema de expresso gnica em

    baculovrus o qual necessita de infra-estrutura especfica

    15 razoavelmente mais cara que aquela utilizada para expresso

    de protenas recombinantes em sistema bacteriano do tipo

    E.coli, para produo e manuteno em mdia escala, o qual

    j bem estabelecido e utilizado para a maioria das

    protenas recombinantes de uso comercial. A patente

    20 US5.298.244 no apresenta qualquer mtodo purificativo a

    ser utilizado empregando as partculas completas formadas

    no sistema acima mencionado, e que seja capaz de gerar

    partculas purificadas para utilizao na induo e

    formao de anticorpos especficos em modelos animais e

    25 posterior utilizao em diagnstico.

    As recentes descobertas dos diversos agentes

    etiolgicos causadores das gastroenterites, apontam o

    astrovrus como um significativo patgeno. Com isso, existe

    uma necessidade no estado da arte para o desenvolvimento de

  • 5

    novos produtos para o diagnstico dos principais agentes

    etiolgicos causadores da gastroenterite.

    SUMARIO DA INVENO:

    A presente inveno se refere produo de protenas

    5 virais especficas recombinantes, para aplicao na

    construo de um kit de diagnstico para deteco

    simultnea das duas principais viroses gastroentricas.

    Mais particularmente, as viroses detectadas pelo dito kit

    so as causadas por rotavrus e astrovrus.

    10 Assim, um primeiro objetivo da presente inveno

    caracterizar por meio de metodologias de biologia

    molecular, tais como o seqnciamento nucleotdico e

    anlise pelo perfil de restrio, vetores plasmidiais de

    expresso de protenas em sistema E.coli, a qual contm

    15 regies especficas codificadoras de eptopos das protenas

    VP6 de rotavrus e VP90 de astrovrus.

    Um outro objetivo da presente inveno refere-se a

    avaliao do perfil protico e a avaliao do rendimento

    obtido em um cultivo bacteriano em baixa escala de clones

    20 transformados com os vetores plasmidiais de expresso, por

    meio de metodologias bioqumicas tais como eletroforese em

    gel de SDS-PAGE.

    Um outro objetivo da presente inveno refere-se a

    avaliao da antigenicidade dos eptopos expressos, por

    25 meio das metodologias imunolgicas tais com