perfil de resistÊncia de staphylococcus coagulase … · resistência de staphylococcus coagulase...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
CAMPUS PROFESSOR ANTÔNIO GARCIA FILHO
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA DE LAGARTO
RAQUEL DE OLIVEIRA SANTOS
PERFIL DE RESISTÊNCIA de Staphylococcus COAGULASE
NEGATIVA ISOLADAS DE QUEIJOS COALHO
COMERCIALIZADOS NO MUNICÍPIO DE LAGARTO-SE
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
Lagarto
Maio, 2018
RAQUEL DE OLIVEIRA SANTOS
PERFIL DE RESISTÊNCIA DE Staphylococcus COAGULASE NEGATIVA
ISOLADAS DE QUEIJOS COALHO COMERCIALIZADOS NO MUNICÍPIO DE
LAGARTO-SE.
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Universidade Federal de Sergipe, Campus Professor Antônio Garcia Filho, como exigência para a obtenção do Diploma de Graduação em Farmácia.
Orientador: Prof. Dr. Rafael Ciro Marques Cavalcante
Lagarto
Maio, 2018
RAQUEL DE OLIVEIRA SANTOS
PERFIL DE RESISTÊNCIA DE Staphylococcus COAGULASE NEGATIVA
ISOLADAS DE QUEIJOS COALHO COMERCIALIZADOS NO MUNICÍPIO DE
LAGARTO-SE
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Universidade Federal de Sergipe, Campus Professor Antônio Garcia Filho, como exigência para a obtenção do Diploma de Graduação em Farmácia.
Orientador: Prof. Dr. Rafael Ciro Marques Cavalcante
Dedicatória
Dedico este trabalho a toda minha
família, principalmente aos meus pais Telma
e José Raimundo, meus irmãos Eduardo e
Ricardo e meu namorado Natanael que
sempre estiveram ao meu lado, nos
momentos difíceis e de glória dessa jornada.
“E guardemos a certeza pelas próprias
dificuldades já superadas que não há mal que
dure para sempre.”
Chico Xavier
RESUMO
PERFIL DE RESISTÊNCIA DE Staphylococcus COAGULASE
NEGATIVA ISOLADAS DE QUEIJOS COALHO COMERCIALIZADOS NO
MUNICIPIO DE LAGARTO-SE
Raquel de Oliveira Santos. Lagarto, 2018.
Introdução: O queijo coalho é consumido e produzido tipicamente nos estados da
região Nordeste. A utilização do leite cru e a falta de padronização de técnicas de
preparo levam à contaminação do produto final, fazendo do queijo coalho um veículo
de transmissão de doenças. Outro ponto menos estudado, trata-se da possibilidade
de bactérias presentes no alimento, patogênicas ou não, possuírem genes de
resistência a antimicrobianos. De fato, vários estudos vêm sendo conduzidos visando
a detecção de Staphylococcus aureus multirresistentes. Entretanto, poucos trabalhos
dedicam-se ao estudo de cepas de Staphylococcus coagulase negativas (SCN),
focando no potencial em transmitir esses genes para outras espécies que, embora
não sejam patogênicas, podem disseminar genes de resistência para outros
microrganismos e produzir enterotoxinas que, depois de ingeridas, causam
intoxicação alimentar nos consumidores. Objetivos: Isolar e traçar o perfil de
resistência de Staphylococcus coagulase negativa em queijos tipo coalho
comercializados em Lagarto-SE. Metodologia: Coletaram 35 amostras de queijos
coalho de diferentes pontos comerciais de Lagarto. As análises microbiológicas foram
conduzidas, de acordo com a metodologia descrita na Instrução Normativa (IN) 62 de
2003. As SCN foram isoladas em ágar Baird Parker e submetidas aos testes de
confirmação, coloração de Gram, fermentação de manitol, DNAse, catalase e
coagulase. O perfil de resistência das cepas foi determinado de acordo com a
metodologia de disco difusão em ágar. Resultados: Das 45 cepas isoladas de SCN,
53,33% (24/45) apresentaram resistência a, pelo menos, um fármaco. Além disso,
13% (6/45) apresentaram resistência a 2 ou mais antibióticos. Conclusão: Os dados
encontrados destacam o potencial do SCN como reservatório de genes de resistência
e podem funcionar como veículo da resistência bacteriana para outras espécies.
Palavras-chave: Intoxicação; Multirresistência; Antibióticos; Segurança dos
alimentos.
ABSTRACT
PROFILE OF RESISTANCE OF COAGULASE NEGATIVE
Staphylococcus ISOLATED FROM RENNET CHEESES
MARKETED IN THE MUNICIPALITY OF LAGARTO-SE
Raquel de Oliveira Santos. Lagarto, 2018.
Introduction: Rennet cheese is typically consumed and produced in the Northeastern
states. The use of raw milk and the lack of standardization of preparation techniques
lead to the contamination of the final product, making rennet cheese a vehicle for the
transmission of diseases. Another point less studied, it is the possibility of bacteria
present in the food, pathogenic or not, to possess antimicrobial resistance genes. In
fact, several studies have been conducted aiming at the detection of multiresistant
Staphylococcus aureus. However, few studies are devoted to the study of strains of
Staphylococcus coagulase negative (SCN), focusing on the potential to transmit these
genes to other species that, although not pathogenic, can disseminate resistance
genes to other microorganisms and produce enterotoxins that later ingested, cause
food poisoning in consumers. Objectives: Isolate and trace the resistance profile of
coagulase negative Staphylococcus in rennet-type cheeses commercialized in Lizard-
SE. Methodology: 35 samples of rennet cheeses from different commercial points of
Lagarto were collected. The microbiological analyzes were conducted according to the
methodology described in Normative Instruction (NI) 62 of 2003. The SCN were
isolated in Baird Parker agar and submitted to the tests of confirmation, Gram staining,
mannitol fermentation, DNAse, catalase and coagulase. The resistance profile of the
strains was determined according to the agar diffusion methodology. Results: Of the
45 strains isolated from SCN, 53.33% (24/45) presented resistance to at least one
drug. In addition, 13% (6/45) had resistance to 2 or more antibiotics. Conclusion: The
data found highlight the potential of SCN as reservoir of resistance genes and can act
as a vehicle of bacterial resistance to other species.
Keywords: Intoxication; multiresistance; antibiotics; Food safety.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Imagem ilustrativa do queijo coalho. ......................................................... 14
Figura 2: Fluxograma com as etapas do processo de produção de queijo coalho. .. 15
Figura 3: Imagem ilustrativa do processo de transdução, etapas da transferência de
genes entre bactérias mediada por bacteriófago. ..................................................... 20
Figura 4: Imagem ilustrativa das etapas de transferência de genes pelo mecanismo
de transformação. ..................................................................................................... 21
Figura 5: Imagem ilustrativa das etapas de transferência de genes entre bactérias
pelo mecanismo de conjugação. ............................................................................... 21
Figura 6: Imagem ilustrativa de uma placa de ágar Baird Parker com colônias típicas
e atípicas de Staphylococcus.. .................................................................................. 25
Figura 7: Imagem ilustrativa de placas de ágar sal manitol cultivadas com cepas
presuntivamente pertencentes ao gênero Staphylococcus. ...................................... 26
Figura 8: Imagem microscópica ilustrativa de cocos gram positivos arranjados em
cachos.. ..................................................................................................................... 27
Figura 9: Imagem ilustrativa da prova catalase. ....................................................... 27
Figura 10: Imagem ilustrativa da prova da coagulase em tubos.. ............................ 28
Figura 11: Imagem ilustrativa da prova da DNAse realizada em placas. ................. 29
Figura 12: Imagem ilustrativa de uma placa de antibiograma com oito discos de
antimicrobianos.. ....................................................................................................... 30
Figura 13: Distribuição das amostras de queijo pela origem de fabricação.. ............ 31
Figura 14: Perfil de resistência a antimicrobianos das cepas isoladas.. ................... 32
Figura 15: Percentual das cepas de SCN quanto à multirresistência a fármacos.. .. 34
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Agentes antimicrobianos e os valores dos halos para cada classificação
(CSLI, 2012). ............................................................................................................. 30
Tabela 2: Local de coleta das amostras ..................................................................... 31
LISTA DE SIGLAS
ABP Agar Baird Parker AMO ASB
Amoxicilina Ampicilina+sulbactam
ANVISA ATCC BHI
Agência Nacional de Vigilância Sanitária American Type Culture Collection Brain Heart Infusion
BPF Boas Práticas de Fabricação CDCP CFE CFZ
Center for Disease Control and Prevention Cefalexina Cefazolina
CSLI Clinical and Laboratory Standards Institute DNA Deoxyribonucleic Acid DTA Doença Transmitida por Alimento EE Enterotoxina Estafilocócica ERI Eritromicina HCl Ácido Clorídrico IN Instrução Normativa KOH NaCl NEO LPS
Hidróxido de Potássio Cloreto de sódio Neomicina Lipopolissacarídeos
OMS Organização Mundial da Saúde OPAS Organização Panamericana de Saúde PEN Penicilina G pH Potencial Hidrogeniônico RDC Resolução da Diretoria Colegiada Rpm SCN
Rotações por Minuto Staphylococcus coagulase negativa
TET Tetraciclina UFC/g Unidades Formadoras de Colônia por grama
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 12
2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 14
2.1 Queijo coalho .................................................................................................. 14
2.2 Doenças transmitidas por alimentos (DTA) ..................................................... 16
2.3 Staphylococcus sp. ......................................................................................... 18
2.4 Staphylococcus coagulase negativa (SCN) .................................................... 18
2.5 Mecanismos de transmissão de resistência .................................................... 19
3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 23
3.1 Objetivo ........................................................................................................ 23
3.2 Objetivos Específicos ...................................................................................... 23
4 METODOLOGIA .................................................................................................... 24
4.1 Coletas das amostras de queijo ...................................................................... 24
4.2 Preparo das amostras de queijo coalho .......................................................... 24
4.3 Isolamento de Staphylococcus sp. .................................................................. 24
4.4 Provas Confirmatórias ..................................................................................... 25
4.4.1 Fermentação de manitol ......................................................................................... 25
4.4.2 Coloração de Gram ................................................................................................ 26
4.4.3 Prova da catalase ................................................................................................... 27
4.4.4 Prova da coagulase ................................................................................................ 28
4.4.5 Prova da DNAse ..................................................................................................... 28
4.5 Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos ..................................................... 29
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 31
6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 36
7 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 37
12
1 INTRODUÇÃO
O queijo coalho é produzido a partir do leite cru ou pasteurizado e é um produto
de alto consumo na região Nordeste. Está sempre presente à mesa, apresentando
grande importância cultural e econômica para região. A fabricação é, muitas vezes,
artesanal, passada de pai para filho, mantendo-se uma tradição. Sendo assim, a forma
de produção varia de acordo com as habilidades e a estrutura física de cada produtor,
que, geralmente, faz adaptações e pode não atentar às boas práticas de fabricação
(BPF) (DANTAS, 2012). Devido a essas adaptações nos padrões de fabricação, a
qualidade do produto final pode ser afetada.
O sertão sergipano atualmente é grande produtor de laticínios e um deles é o
queijo coalho. Esse produto é distribuído e comercializado em todo estado. Os
padrões de produção e cuidados com a higiene não são diferentes das outras regiões,
mas a maioria acontece em pequenas fazendas e queijarias, sem o devido cuidado
de seguir as BPF. São, muitas vezes, transportados sem refrigeração e, ao chegar no
local de comercialização, são armazenados a temperatura ambiente (SILVA et al.,
2012).
O queijo coalho é um produto de média a alta umidade, onde a proliferação de
microrganismos patogênicos pode ocorrer, expondo os consumidores às doenças
transmitidas por alimentos (DTAs). Geralmente, chegam aos pontos de vendas pelos
produtores sem nenhuma fiscalização e controle de qualidade prévia, e desta forma
os consumidores acabam adquirindo um alimento de baixa qualidade higiênico-
sanitária (SOUSA et al., 2014).
As DTAs são de natureza infecciosa ou tóxica, devido à ingestão de alimento
ou água contaminados. Representam uma grande preocupação para a saúde pública
e sua gravidade depende do microrganismo, da sua quantidade e de metabólitos por
eles produzidos. As infecções podem ser de leves a muito graves, de uma simples
diarreia até ao óbito. As populações mais suscetíveis a essas infecções são crianças
menores de 5 anos, idosos, gestantes e imunodeprimidos (ALVES, 2012).
A contaminação dos alimentos pode acontecer durante o cultivo, produção,
conservação e comercialização. Interfere diretamente na economia e na saúde da
população, atingindo um indivíduo ou um grupo de pessoas. Não é possível perceber
a presença de microrganismos nos alimentos a olho nu, mas quando muito
13
contaminados são evidentes as alterações na cor, textura e sabor, que podem ser
detectados previamente (OPAS, 2009).
A contaminação dos alimentos pode ocorrer por fungos, vírus, bactérias ou
toxinas produzidas por eles, sendo as bactérias os principais agentes etiológicos dos
surtos de DTAs. Entre eles, destacam-se: Salmonella sp., Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Shigella sp., Bacillus cereus e Clostridium perfringes. Com
relação aos queijos não pasteurizados, os contaminantes mais comuns são
Salmonella sp, Staphylococcus sp, Campylobacter sp, Listeria monocytogenes,
Yersinia enterocolitica e E. coli (DANTAS, 2012).
A maioria dos trabalhos realizados nos últimos anos, aborda principalmente, as
S. aureus, por sua patogenicidade e maior prevalência nesse tipo de alimento. Porém,
a contaminação do queijo coalho pode ocorrer também por Staphylococcus
coagulase-negativa capazes de produzir enterotoxinas. Essas bactérias, quando
presentes em números elevados e, sob condições adequadas de temperatura, pH,
atividade de água e O2, produzem uma ou mais enterotoxinas estafilocócicas nos
alimentos, as quais, depois de ingeridas, causam intoxicação (BORGES et al., 2008).
Além disso, assim como a S. aureus, as Staphylococcus coagulase negativa
podem possuir genes de resistência a antimicrobianos e transmiti-los a outras
espécies presentes na microbiota, inclusive para cepas do mesmo gênero (GOMES,
2013). De fato, espécies desse gênero possuem capacidade de destaque para
transmitir e assimilar genes, principalmente pelos mecanismos de conjugação,
transformação, transdução e mediada por transposons (SOUZA et al., 2016).
Diante desse risco iminente da disseminação de genes de resistência por meio
dos alimentos, propõe-se averiguar o perfil de resistência das cepas de estafilococos
coagulase negativa presentes em queijos tipo coalho comercializados em Lagarto –
SE.
14
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Queijo coalho
O queijo coalho é um produto tipicamente nordestino, bastante consumido pela
população. É muito utilizado em preparações culinárias, assim como de forma natural.
A produção rural de queijo coalho é relevante para formação de renda dos produtores
de leite estabelecidos nessa região, representando uma importante atividade
econômica e social (BRASIL, 2006).
Em Sergipe, ele é bastante produzido e consumido. Sua produção concentra-
se no Sertão Sergipano, onde se localiza a principal bacia leiteira do estado,
destacando-se, dentre os demais, o município de Nossa Senhora da Glória. O queijo
produzido nessa microrregião é comercializado em todo o estado e, inclusive, é
exportado para fora de Sergipe (MENEZES; ALMEIDA, 2008; SILVA et al., 2012).
O queijo coalho é obtido da coagulação do leite por meio do coalho ou outras
enzimas coagulantes, complementada ou não pela ação de bactérias lácteas. O queijo
coalho (Figura 1) possui de média a alta umidade, é de massa semicozida ou cozida
e apresenta um teor de gordura nos sólidos totais variável entre 35,0% e 60,0%
(BRASIL, 2001b).
Figura 1: Imagem ilustrativa do queijo coalho. Fonte:http://www.sebraemercados.com.br/estrutura-para-producao-de-queijo-coalho/
A sua fabricação não exige equipamentos sofisticados e a diversificação da
metodologia para a produção do queijo coalho pode ser constatada na produção de
vários fabricantes. Não existem critérios de qualidade para a matéria-prima e para as
técnicas de processamento, permitindo que produtos com baixa qualidade, tanto do
15
ponto de vista higiênico-sanitário, quanto em relação aos padrões do produto, atinjam
o mercado, dificultando sua comercialização (BRASIL, 2006; DANTAS, 2012).
A legislação exige a pasteurização do leite antes da fabricação do queijo
coalho, como pode ser observado no fluxograma da produção (Figura 2) (BRASIL,
2006). A não realização dessa etapa, aumenta as chances de contaminação do
produto final. Isso traz riscos à saúde dos consumidores, devido à proliferação de
microrganismos patogênicos, como a Salmonella sp. e o S. aureus. Outro fator
associado a esse risco, é que se trata também de um produto que pode ser consumido
cru e, normalmente, não passa por nenhum tratamento térmico ou químico (SOUSA
et al., 2014).
Figura 2: Fluxograma com as etapas do processo de produção de queijo coalho. Fonte: www.infoteca.cnptia.embrapa.br/infoteca/bitstream/doc/1080129/1/FFC17002.pdf
16
Muitos dos microrganismos presentes no queijo possuem como habitat natural
o trato intestinal do homem e de outros animais, esses pertencem à família
Enterobacteriaceae. Nesse grupo estão inclusos os gêneros, Escherichia,
Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Providencia, Citrobacter. São divididos em
coliformes totais e fecais, dependendo do habitat do microrganismo. Além deles,
temos as S. aureus, Staphylococcus coagulase-negativa, Listeria sp., Salmonella sp.
e Shigella sp. (OPAS, 2009; ALVES, 2012).
As principais vias de contaminação dos queijos são o leite, o manipulador, o
ambiente de processamento, o transporte e a comercialização. No leite cru, a principal
fonte de contaminação provém da mastite bovina, onde os principais agentes
etiológicos pertencem ao gênero Staphylococcus. Esses agentes são considerados
patógenos secundários, apresentam baixa patogenicidade e estão associados à forma
subclínica da doença. Porém, essa forma da doença é considerada mais prevalente e
de difícil diagnóstico, uma vez que não apresenta os sinais clínicos aparentes. Assim,
ocorre alteração na qualidade microbiológica do leite e diminuição da produção
(SCHUKKEN et al., 2009).
O manipulador acaba contaminando o alimento por não utilizar os
equipamentos de proteção individual exigidos. No ambiente de processamento, a
contaminação ocorre devido à utilização de utensílios, bancadas e pisos não
higienizados. No transporte, ocorre quando não é feito em carros higienizados com
refrigeração e controle de temperatura. A comercialização muitas vezes ocorre sem
refrigeração e os utensílios como faca e balança são utilizados para diversos produtos,
sem higienização entre eles, levando à contaminação cruzada (SOUSA et al., 2014).
2.2 Doenças transmitidas por alimentos (DTA)
DTA é um termo genérico aplicado a uma síndrome que geralmente apresenta
anorexia, náuseas, vômitos e/ou diarreia, acompanhada ou não de febre. São
identificadas quando uma ou mais pessoas apresentam sintomas similares, após a
ingestão de alimentos contaminados. Os sintomas digestivos não são as únicas
manifestações dessas doenças, podendo, ainda, acometer outros órgãos,
dependendo do agente etiológico envolvido (OLIVEIRA et al., 2010).
17
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), uma doença de origem
alimentar é geralmente de natureza infeciosa ou tóxica e provocada por agentes que
entram em contato com o organismo humano através da ingestão de alimentos ou de
água contaminados. Os microrganismos são encontrados em quase todos os
alimentos, mas a sua transmissão ocorre devido à utilização de metodologias
inadequadas no processo de produção e/ou distribuição. É preciso levar em
consideração as propriedades físicas e químicas dos alimentos que facilitam ou não
o desenvolvimento de microrganismos. Para o queijo coalho, é interessante utilizar
uma matéria prima de qualidade, um leite oriundo de vacas sadias, realizar a
pasteurização e depois de prontos armazená-los sob refrigeração (ALVES, 2012).
A incidência das doenças transmitidas por alimentos vem aumentando
mundialmente. Os fatores que contribuem para a emergência são o crescente
aumento das populações e a desigualdade, gerando grupos vulneráveis; o processo
de urbanização caótico e a necessidade de produção de alimentos em maior
quantidade; falta de fiscalização dos órgãos públicos e privados no tocante à
qualidade dos alimentos ofertados às populações; o aumento do consumo de comidas
prontas (fast-foods); as mudanças de hábitos alimentares, ambientais, a globalização
e as facilidades atuais de deslocamento da população (BRASIL, 2010).
Os dados epidemiológicos das DTAs no Brasil ainda são pouco conhecidos.
Apenas alguns estados e/ou municípios possuem estatísticas e dados sobre os
principais agentes etiológicos, alimentos mais relacionados e população mais
vulnerável. Esse problema de saúde pode ser causado por toxinas, produzidas pelas
bactérias, como, S. aureus, Clostridium sp., Bacillus cereus, Escherichia coli, Vibrio
sp., entre outras. Outros causadores são os vírus, os parasitas Entamoeba histolytica,
Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, e também algumas substâncias tóxicas,
como metais pesados e agrotóxicos (BRASIL 2010; ALVES, 2012).
A contaminação pode ocorrer em toda a cadeia produtiva, da produção primária
até o consumo (plantio, manuseio, transporte, cozimento, acondicionamento). Os
alimentos de origem animal e os preparados para consumo coletivo são os maiores
responsáveis por surtos (SCHUKKEN et al., 2009).
Geralmente os surtos estão relacionados à ingestão de alimentos com boa
aparência e sem alteração organoléptica. Isso acontece porque a dose infectante de
patógenos alimentares, capaz de causar danos à saúde de quem os ingere,
18
geralmente é menor que a quantidade de microrganismos necessária para degradar
os alimentos. Isso dificulta a rastreabilidade dos alimentos causadores de surto, pois
os consumidores afetados raramente conseguem perceber visualmente e
sensorialmente os alimentos fonte da DTA (OLIVEIRA et al., 2010).
2.3 Staphylococcus sp.
O gênero Staphylococcus pertence à família Micrococcaceae, possui 33
espécies e 17 delas podem ser isoladas de amostras biológicas humanas. São cocos
gram-positivos, com o comprimento de 0,5 a 1,5 μm, arranjados em cachos, não
formadores de esporos, aeróbicos facultativos, catalase positivos, imóveis e se
multiplicam facilmente em uma faixa de pH entre 4,2 e 9,3 e em 7,5% de cloreto de
sódio (NaCl). Para coagulase existe dois grupos, os positivos, como S. aureus e várias
outras espécies que não produzem a enzina, portanto são consideradas coagulase
negativa. É um patógeno associado a altas taxas de mortalidade e morbidade,
habitante natural da pele e mucosas. A depender da quantidade de microrganismo e
a susceptibilidade do hospedeiro, essas bactérias são capazes de produzir infecções
em diversos tecidos, como endocardite, furúnculos, espinhas, bacteremia, pneumonia,
sepse e intoxicação alimentar (SANTOS et al., 2007; GOMES, 2013).
No Brasil, a legislação preconiza a contagem de S. aureus, levando em
consideração a produção da enzima coagulase e o risco de síntese de enterotoxinas
estafilocócicas (EE). No entanto, algumas cepas de Staphylococcus sp. coagulase
negativas (SCN) são também produtoras de enterotoxinas e potencialmente podem
causar intoxicações (MOTA et al., 2012). Inclusive há registros de surtos de
intoxicação alimentar no Brasil, associados a espécies coagulase negativa. A
presença de Staphylococcus, tanto coagulase positiva quanto negativa em alimentos
representa um risco potencial à saúde pública, uma vez que essas espécies, quando
presentes, podem produzir uma ou mais enterotoxinas (LEITE, 2008; BRASIL, 2011).
2.4 Staphylococcus coagulase negativa (SCN)
Os Staphylococcus coagulase-negativa são habitantes normais da pele,
cabeça, membros superiores e inferiores, ouvido e axilas humanas. Atualmente são
19
conhecidas onze espécies comensais. Dentre essas, há produção de enterotoxinas
pelas espécies S. capitis, S. conhnii, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S.
saprophyticus, S. schleiferi, S. warneri, S. xylosus e S. chromogenes, que foi
observada sob condições de laboratório, em vários estudos. Esses estudos sugerem
que SCN podem ser causadores de intoxicação alimentar em potencial (BORGES et
al., 2008; MOTA et al., 2012; NUNES et al., 2015; BERTELLONI et al., 2015;
KÜREKCI, 2016).
AS SCN são frequentemente encontradas em alimentos, incluindo carne,
embutidos, leite e seus derivados, sendo também bastante usados em preparações
de alimentos fermentados como cultura inicial (KÜREKCI, 2016).
Os Staphylococcus coagulase negativa tornam-se patógenos importantes ao
ganhar acesso à corrente sanguínea, através do uso de cateteres intravenosos,
próteses valvulares e também com o aumento de pacientes imunodeprimidos, em
Unidades de Tratamento Intensivo (GEORGIEVA, 2012). As SCN estão
frequentemente associadas a casos sérios de infecções (sepse, endocardites,
pneumonia, infecção urinária, espinhas e furúnculos), bem como a intoxicações
alimentares, causadas pelas enterotoxinas estafilocócicas. Isso acarreta no aumento
da mortalidade e do tempo de hospitalização, assim, bactérias conhecidas como
simples contaminantes começam a ganhar importância clínica (GOMES, 2013).
Além do potencial patogênico, as cepas de SCN podem conter genes que
codificam resistência a antimicrobianos. Esses genes podem ser transferidos a outras
espécies patogênicas, contribuindo para disseminação da resistência microbiana. A
resistência à meticilina em S. aureus, por exemplo, foi adquirida a partir de um
mecanismo de transferência gênica conhecido como conjugação (GAYOSO et al,
2007). Alguns estudos, sobretudo em hospitais, também vêm isolando cepas de SCN
resistentes a vários fármacos, inclusive à oxacilina (SALABERRY et al., 2016).
2.5 Mecanismos de transmissão de resistência
Resistência adquirida a antimicrobianos tornou-se um grande problema em
bactérias patogênicas. O uso indiscriminado desses fármacos resulta na seleção de
bactérias resistentes, tornando-as predominantes em uma população, com a
capacidade de transferir material genético para bactérias susceptíveis, que então
20
adquirem resistência. Esta resistência aos antibióticos pode ser codificada pelo
cromossomo bacteriano ou em plasmídeos, o que facilita a difusão destes genes. Os
plasmídeos e os transposons são mediadores de múltipla resistência, nas quais os
microrganismos se tornam resistentes a drogas de diferentes classes. Esse tipo de
transferência também pode afetar diferentes gêneros e espécies de bactérias (VAZ,
2009; SOUZA et al., 2016). A resistência a antimicrobianos pode ocorrer por mutação
e pela transferência horizontal de genes, que inclui a transformação, transdução e
conjugação (SALABERRY et al., 2016).
A transferência horizontal de genes depende dos elementos genéticos móveis.
Esses elementos incluem os plasmídeos e os fagos transdutores. Outros elementos
são os transferíveis, íntegrons e cassetes de genes, que também participam do
processo. Os elementos transferíveis pertencem a três grupos gerais: sequências de
inserção, transposons e fagos transferíveis (SOUZA et al., 2016).
Na transdução ocorre a obtenção de DNA bacteriano de um fago, esse
incorpora ao seu revestimento proteico externo o DNA de um hospedeiro bacteriano.
Caso o material genético obtido tenha um gene que confere resistência
antimicrobiana, a bactéria recém-infectada pode adquirir resistência. Ocorre entre
bactéria da mesma espécie, e é um meio relativamente ineficaz de transferência de
material genético, porém, é importante na transferência entre cepas de
Staphylococcus e Streptococcus (Figura 3) (SFACIOTTE, 2014).
Figura 3: Imagem ilustrativa do processo de transdução, etapas da transferência de genes entre bactérias mediada por bacteriófago. A) O DNA do vírus bacteriófago é injetado para iniciar um ciclo lítico; B) o ciclo é iniciado e o DNA se mistura à célula bacteriana; C) durante o ciclo fragmentos do DNA bacteriano é empacotado em capsídio do fago; D) em uma infecção subsequente o DNA é incorporado a uma nova célula. Fonte: SADAVA et al., 2009
A transformação é um mecanismo de transferência gênica presente em poucos
gêneros bacterianos em condições naturais. Esse fenômeno ocorre a partir da
captação do DNA livre liberado no ambiente por outras células bacterianas e a
A B C D
21
posterior incorporação ao genoma por recombinação homóloga. A transformação é a
base molecular da resistência à penicilina dos Pneumococos e da Neisseria (Figura
4) (SOUZA et al., 2016).
Figura 4: Imagem ilustrativa das etapas de transferência de genes pelo mecanismo de transformação. A) Uma bactéria morta libera fragmentos de DNA; B) Alguns fragmentos são captados por uma célula bacteriana viva; C) A recombinação acontece entre o fragmento do DNA e o cromossomo do hospedeiro. Fonte: SADAVA et al., 2009
A conjugação envolve o contato direto entre as células bacterianas, por meio de
uma ponte ou pelo sexual. Neste mecanismo, vários genes de resistência podem ser
transferidos de uma vez. A capacidade de se conjugar está codificada nos plasmídeos
de conjugação, podem estar no mesmo plasmídeo ou em dois diferentes, onde um
codifica a resistência a antimicrobianos e o segundo codifica os genes necessários ao
processo de conjugação bacteriana. Esse mecanismo é mais significativo em locais
com grandes concentrações bacterianas, como no intestino, por exemplo (Figura 5)
(MOREIRA et al., 2013).
Figura 5: Imagem ilustrativa das etapas de transferência de genes entre bactérias pelo mecanismo de conjugação. A) quando as bactérias conjugam, os plasmídeos podem passar pelo tubo de conjugação para a bactéria receptora; B) plasmídeos transferidos; C) os plasmídeos tornam-se partes do genoma das células receptoras. Fonte: SADAVA et al., 2009.
Além dos mecanismos de transferência de resistência entre as bactérias, esses
microrganismos possuem mecanismos de resistência próprios, como as mutações,
que podem ocorrer no gene que codifica: 1) a proteína alvo, alterando sua estrutura
A
B
C
A B
1
C
1
22
de forma que não possa mais se ligar ao antimicrobiano; 2) uma proteína envolvida
no transporte do fármaco; 3) uma proteína importante para a ativação ou inativação
do fármaco; ou 4) um gene regular ou promotor que afeta a expressão do alvo, de
uma proteína de transporte ou de uma enzima inativadora (VAZ, 2009). Existem
também os mecanismos bioquímicos, que envolvem a produção de enzimas que
inativam os fármacos. O principal exemplo é a produção de β-lactamases,
responsáveis por inativar os antibióticos β-lactâmicos, devido a clivagem do anel β-
lactâmico. Espécies do gênero Staphylococcus são as principais produtoras dessa
enzima, e os genes que codificam a enzima estão em plasmídeos que podem ser
transferidos por transdução (MOREIRA et al., 2013).
A resistência adquirida a antimicrobianos é preocupante, como exemplo na
produção animal, são utilizadas muitas drogas antimicrobianas e isso exerce pressão
de seleção sobre os microrganismos. Ao consumir alimentos de origem animal ou
vegetal, a população pode contrair estas cepas resistentes dificultando o tratamento
das infecções. Assim, a segurança dos alimentos representa uma preocupação para
os consumidores e para órgãos de fiscalização responsáveis pela saúde pública,
sendo que produtos disponíveis para comercialização podem representar um risco à
saúde, devendo ser seguidos, com rigor, todos os cuidados higiênicos sanitários
durante todo o processo de produção (GUIMARÃES et al., 2012a; SOUZA et al.,
2016).
23
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo
Conhecer perfil de resistência de cepas de Staphylococcus coagulase negativa
isoladas de queijos coalho comercializados no município de Lagarto-SE
3.2 Objetivos Específicos
Isolar cepas de Staphylococcus coagulase negativa em cultura pura;
Determinar o perfil de resistência das cepas de Staphylococcus coagulase
negativa isoladas;
24
4 METODOLOGIA
4.1 Coletas das amostras de queijo
Coletaram 35 amostras de 100g de queijos coalho em diferentes pontos
comerciais da cidade de Lagarto. Entre eles, panificações, supermercados, casa de
frios e feiras livres, entre outubro de 2017 e janeiro de 2018. No momento da coleta
era questionado aos vendedores qual o local de produção daquele queijo. Depois
disso as amostras foram transportadas isotermicamente, mantendo-se a temperatura
ambiente, em torno de 25 ºC ± 2 ºC para o laboratório de Microbiologia do Curso de
Farmácia. As análises tiveram início em um prazo máximo de duas horas após a
coleta.
4.2 Preparo das amostras de queijo coalho
Ao chegar no laboratório, preparou-se as amostras em condições assépticas.
Inicialmente, pesou-se 25 g de queijo coalho, sendo pedaços do meio e das laterais.
Em seguida, triturou-se a amostra em um liquidificador, previamente higienizado com
solução de hipoclorito de sódio a 2,5 % v/v, juntamente com 225 mL de água
peptonada, preparada conforme instruções do fornecedor e esterilizada na autoclave.
Essa suspensão representa uma diluição de 1:10 (m/v) e foi utilizada para as próximas
análises (BRASIL, 2003).
4.3 Isolamento de Staphylococcus sp.
Para isolamento de Staphylococcus sp, foi utilizado o meio de cultura Ágar
Baird Parker (ABP). Esse meio é composto basicamente por caseína enzimática
hidrolisada 10 g/L, extrato de carne bovina 5 g/L, cloreto de lítio 5 g/L, glicina 12 g/L,
extrato de levedura 1 g/L, piruvato de sódio 10 g/L e Ágar 20 g/L, enriquecido com
gema de ovo 5% v/v e telurito de potássio a 1% m/v. Essa análise foi conduzida de
acordo com a Instrução Normativa N° 62 de 2003 (BRASIL, 2003).
25
Inicialmente, foram preparadas diluições 10-2 e 10-3 a partir da suspensão de
queijo e água peptonada preparada, conforme descrito no item anterior. De cada
diluição, plaqueou-se em duplicada 50 µL em ABP com o auxílio de uma alça de
Drigalski. As placas foram, em seguida, incubadas a 37 °C durante 24h em estufa
bacteriológica.
O ágar BP possui alto grau de seletividade. Os agentes seletivos telurito de
potássio e o cloreto de lítio atuam inibindo o crescimento da microbiota acompanhante.
O piruvato e a glicina atuam estimulando o crescimento de Staphylococcus e a gema
de ovo e o piruvato são responsáveis pela regeneração de células injuriadas. Ocorre
a redução do telurito a telurato, conferindo aos Staphylococcus coagulase negativa,
colônias cinzentas a pretas, sem zonas transparentes ou opacas (Figura 6 A). Já os
Staphylococcus coagulase positiva apresenta colônias negras, brilhantes, rodeada
por uma zona clara, devido a produção de lipase, enzima responsável por hidrolisar
da lipovitelina, principal constituinte lipídico da gema do ovo. (Figura 6 B) (SANTOS,
2008).
Figura 6: Imagem ilustrativa de uma placa de ágar Baird Parker. (A) Colônias atípicas e (B)
colônias típicas de Staphylococcus sp. Fonte: Arquivo pessoal.
4.4 Provas Confirmatórias
4.4.1 Fermentação de manitol
Foram selecionadas quatro colônias não típicas do ABP de cada amostra das
35, sendo elas de cor cinzentas a pretas, sem zonas transparentes. Estas foram
semeadas em Agar sal manitol, pela técnica de esgotamento, utilizando uma alça de
A
B
26
platina, e posteriormente incubadas a 37 °C durante 24h em estufa bacteriológica
(Figura 7).
O sal manitol permite diferenciar os microrganismos que fermentam o manitol,
pois quando o utilizam como fonte de carbono, modificam a coloração do meio de
vermelho para amarelo. A viragem do meio é ocasionada pela diminuição do pH,
oriunda da produção de ácidos e revelada pelo indicador de pH vermelho de fenol. Os
microrganismos que não utilizam o manitol crescem utilizando peptonas presentes no
meio e o tornam rosa devido à alcalinização provocada pela liberação de grupamentos
amino (BRASIL, 2013) (Figura 7).
O ágar sal manitol é um meio bastante seletivo, isso se dá por sua alta
concentração de sal (7,5%), que inibe o crescimento de grande parte dos
microrganismos, permitindo o crescimento principalmente de cocos Gram positivos. É
composto basicamente por peptona de caseína 5,0 g/L, peptona de carne 5,0 g/L,
extrato de carne 1,0 g/L, D-manitol 10,0 g/L, cloreto de sódio 75,0 g/L vermelho de
fenol 0,025 g/L, Ágar 15,0 g/L.
Figura 7: Imagem ilustrativa de placas de ágar sal manitol cultivadas com cepas presuntivamente pertencentes ao gênero Staphylococcus. A) microrganismos fermentadores de manitol. O meio vira para amarelo, devido a fermentação do manitol e a consequente produção de ácidos B) microrganismos não fermentadores, o meio mantém a coloração rosa original. Fonte: Arquivo pessoal.
4.4.2 Coloração de Gram
Este teste foi realizado retirando uma alíquota das placas de manitol negativo.
Inicialmente, preparou-se o esfregaço em lâmina de vidro para microscopia, por meio
da fixação em chama de bico de Bunsen. Os próximos passos foram o tratamento de
A B
27
esfregaço com os reagentes, cristal-violeta, lugol, álcool/acetona e fucsina. Para o
cristal-violeta e lugol, o esfregaço ficou submetido aos corantes respectivamente por
dois minutos e um minuto e meio. A solução descorante foi aplicada à lamina na
posição vertical até a observação de gotas incolores na extremidade inferior da lâmina.
Finalmente a lâmina foi coberta com o contra corante fucsina durante 30 segundos,
seguida da lavagem com água e secagem à temperatura ambiente. Após secas, as
lâminas foram observadas em microscópio óptico no aumento de 1000x. A morfologia
compatível com isolados do gênero Staphylococcus corresponde a cocos gram-
positivos agrupados em cachos (BRASIL, 2013) (Figura 8).
Figura 8: Imagem microscópica ilustrativa de cocos gram positivos arranjados em cachos. A) foto da lâmina ao microscópio, aumento de 1000x. B) Ampliação da imagem com destaque para as bactérias gram-positivas em forma de cocos e arranjados em cachos, características de bactérias do gênero Staphylococcus. Fonte: Arquivo pessoal.
4.4.3 Prova da catalase
A prova da catalase avalia se o microrganismo produz essa enzima que é capaz
de decompor o peróxido de hidrogênio em oxigênio e água. A reação pode ser
observada pela formação de bolhas oriundas da liberação de oxigênio gasoso. Essa
prova permite diferenciar dois grandes gêneros de bactérias gram positivas, os
Streptococcus, catalase negativo e Staphylococcus catalase positivo (BRASIL, 2013).
Figura 9: Imagem ilustrativa da prova catalase. A) catalase positivo, ocorre a formação de bolhas e produção de gás. B) Catalase negativo por não haver produção gás, isso se dá devido a decomposição o peróxido de hidrogênio em oxigênio e água pela enzima. Fonte: Arquivo pessoal.
B
A + B --
A
28
Para realização do teste, retirou-se uma alíquota do cultivo de ágar sal manitol
negativo e transferiu para uma lâmina contendo uma gota de peróxido de hidrogênio
a 10%, ao misturar-se ao inóculo, observa-se a reação. A formação de bolhas indica
prova positiva para catalase. A não formação de bolhas indica prova negativa para
catalase (Figura 9). Como controle positivo, utilizou-se cepa padrão de S. aureus
(ATCC 25293) e como controle negativo, a cepa padrão de Streptococcus pyogenes
(ATCC 19615).
4.4.4 Prova da coagulase
Nesta prova, foi possível verificar se o microrganismo produziu a enzima
coagulase, capaz de coagular o plasma sanguíneo convertendo, fibrinogênio em
fibrina. Para esse teste, utilizou tubos estéreis, onde foi adicionado,3 mL de cultivo em
caldo BHI e 0,3 mL de plasma de coelho (GOMES, 2013; SANTOS, 2008). Os tubos
foram incubados a 36 ºC por até 6 h. Após esse período, observou-se a formação do
coágulo, de acordo com os critérios presentes na Instrução Normativa Nº 62 do
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 2003) (Figura 10).
Quando a reação de coagulação formou coágulos firmes e organizados, a prova
foi considerada positiva e quando o meio permaneceu fluido, a prova é considerada
negativa. Como controle positivo, utilizou-se a cepa padrão de S. aureus ATCC 25293
e como controle negativo a cepa padrão de Staphycococcus epidermidis ATCC 12228.
Figura 10: Imagem ilustrativa da prova da coagulase em tubos. A) Microrganismo produtor da enzima coagulase, há formação do coágulo no plasma. B) microrganismo não produtor de coagulase, o plasma permanece inalterado. Fonte: Hardy Diagnostics CoaguStaph.
4.4.5 Prova da DNAse
Para esse teste, utilizou-se o meio ágar DNAse. Nele foi possível detectar se o
microrganismo produz a enzima DNAse, capaz de degradar o DNA em
B
A
29
oligonucleotídeos. Após preparar o meio ágar DNAse e adicioná-lo nas placas de Petri
previamente esterilizadas, foi feito um inóculo pontual em cada quadrante. Como
controle positivo, utilizou-se a cepa padrão de S. aureus (ATCC 25293) e como
controle negativo, a cepa padrão de S. epidermidis (ATCC 12228). As placas foram
incubadas a 37º C por 24 horas. Depois deste período, foi adicionado 10 mL de HCl a
0,5 M em cada placa. A reação é evidenciada pelo aparecimento de halos de
clarificação no meio de cultura. A bactéria considerada DNAse positiva quando surgir
um halo superior a 1 mm (Figura 11) (BRASIL, 2003).
Figura 11: Imagem ilustrativa da prova da DNAse realizada em placas. C- Controle negativo, sem produção a enzima DNAse, portanto não há o halo transparente ao redor da colônia; C+ Controle positivo, houve produção a enzima DNAse formação do halo transparente ao redor da colônia. 1.1 E 1.2 Colônias de bactérias DNAse positivo. Fonte: Arquivo pessoal.
4.5 Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos
Esse teste traçou o perfil de resistência das cepas de Staphylococcus
coagulase negativa isoladas, tendo como base a metodologia de difusão em ágar
descrita por de Kirby e Bauer em 1966 para antibiograma. Essa técnica é mais
utilizada devido à sua praticidade de execução, baixo custo e confiabilidade de seus
resultados (BRASIL, 2006).
Inicialmente, as cepas estocadas foram inoculadas em ágar sal manitol, após
o crescimento em 24 horas, realizou-se o inóculo em caldo BHI. Os tubos com os
inóculos foram incubados a 37 C sob agitação constante (200 rpm) até que o
crescimento microbiano correspondesse à absorbância a 600nm de 0,1 ± 0,05
(aproximadamente 106 UFC/mL). Os inóculos padronizados foram, em seguida,
utilizados para semear placas de Petri com ágar Müeller-Hinton, com o auxílio de um
swab estéril. O semeio foi realizado em todas as direções, no intuito de promover um
30
crescimento homogêneo e profuso. Em seguida, os discos de antimicrobiano foram
adicionados à superfície do ágar (Figura 12) (BRASIL, 2006; CSLI, 2012).
Figura 12: Imagem ilustrativa de uma placa de antibiograma com oito discos de antimicrobianos. Os halos de inibição do crescimento bacteriano podem ser observados ao redor dos discos. Fonte: Arquivo pessoal.
Para realização deste teste escolheu-se oito discos de antimicrobianos ativos
contra cocos Gram positivos, entre eles, Amoxicilina (AMO), Ampicilina+sulbactam
(ASB), Cefalexina (CFE), Cefazolina (CFZ), Eritromicina (ERI), Neomicina (NEO),
Penicilina G (PEN) e Tetraciclina (TET). Os discos foram distribuídos igualmente pela
placa com a distância mínima entre eles de 24 mm. As placas, em seguida, foram
incubadas a 37 ºC por 18h. Decorrido esse período, os diâmetros dos halos de inibição
de cada antimicrobiano foram medidos com o auxílio de um paquímetro digital. Os
valores obtidos foram comparados com os tamanhos dos halos estabelecidos,
classificando os microrganismos como resistentes (R), sensíveis (S) e intermediários
(I) ao antimicrobiano Tabela 1 (CSLI, 2012).
Tabela 1: Agentes antimicrobianos e os valores dos halos para cada classificação (CSLI,
2012). HALOS DE INIBIÇÃO (mm)
ANTIMICROBIANO CÓDIGO Resistente Intermediário Sensível
Amoxicilina AMO <28 --- >29
Ampicilina + sulbactam
ASB <11 12 - 14 >15
Cefalexina CFE <29 --- >37
Cefazolina CFZ <14 15 - 17 >18
Eritromicina ERI <13 14 - 23 >23
Neomicina NEO <18 --- >26
Penicilina G PEN <28 --- >29
Tetraciclina TET <14 15 - 18 >19
31
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram isoladas 45 cepas de Staphylococcus coagulase negativa a partir de 35
amostras de queijo coalho, oriundas de diferentes estabelecimentos. Entre esses
locais destacaram-se, panificações, queijarias, supermercados e feiras livres. Essa
diversidade colaborou com uma representatividade fidedigna dos produtos
comercializados. Foram coletadas aproximadamente as mesmas quantidades nos
diversos locais, como pode ser observado na tabela 2.
Tabela 2: Local de coleta das amostras
LOCAIS QUANTIDADE DE AMOSTRAS (%)
Panificações 22,9
Queijarias 20
Supermercados 31,4
Feiras livres 25,7
Outro ponto observado foi o local de fabricação do queijo. No momento da
coleta, era questionado aos vendedores sobre a origem do produto. Com isso, alguns
respondiam sobre o desconhecimento do fabricante, mas a grande maioria das
respostas foi que a produção era realizada em Nossa Senhora da Glória, a cidade do
Sertão Sergipano bastante conhecida pela pecuária e a produção de laticínios. Dentre
os lugares que produzem e fornecem o queijo coalho para serem comercializados no
município de Lagarto, além da cidade de Nossa Senhora da Glória, estão a cidade de
Itabaiana e o próprio munícipio de Lagarto (SILVA et al., 2012) (Figura 13).
Figura 13: Distribuição das amostras de queijo pela origem de fabricação. Abreviações: NSG (Nossa Senhora da Glória), Ita (Itabaiana), Lag (Lagarto) e Desc (desconhecida).
51%
23%17%
9%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
NSG ITA LAG DESC.
Percentual de amostras por município (%)
32
O antibiograma foi realizado com as 45 cepas isoladas a fim de avaliar a
resistência aos antimicrobianos. Destas, 53,3% (24/45) das cepas apresentaram
resistência a pelo menos um antimicrobiano. Além disso, 13% (6/45) dos isolados
apresentaram multirresistência (duas ou mais classes de antimicrobianos).
O perfil de resistência em ordem crescente foi o seguinte: Amoxicilina (0%);
Penicilina G (0%), Ampicilina + Sulbactram (2,2%), Cefazolina (4,4%), Eritromicina
(6,6%), Tetraciclina (6,6%), Cefalexicina (11%) e Neomicina (46,6%) (Figura 14).
Figura 14: Perfil de resistência a antimicrobianos das cepas isoladas. No eixo das abscissas está disposto os antimicrobianos que foram utilizados, e no eixo das ordenadas o percentual de amostras que apresentam resistência. Abreviações: AMO: Amoxiciica; ASB: Ampicilina + Sulbactram; CFE: Cefalexicina; CFZ: Cefazolina; ERI: eritromicina; NEO: Neomicina; PEN: penicilina G; TET: tetraciclina.
Esses resultados diferem dos encontrados por Schoenfelder e colaboradores
(2017), onde foram isoladas 344 cepas de diferentes espécies de Staphylococcus
coagulase-negativa em ambientes pecuários na Alemanha. Neste trabalho eles
também analisaram o potencial dessas cepas serem reservatório de genes de
resistência antimicrobiana. Nos testes realizados, 65% das cepas apresentaram
resistência a Penicilina, 38% a Eritromicina e 71% a Tetraciclina. No estudo realizado
por Kürekci (2016), na província de Hatay, no Sul da Turquia, com 17 cepas de SCN
isoladas pelo pesquisador, os resultados encontrados foram 76,5% resistente à
penicilina, 35,3% à eritromicina e 29,4% à tetraciclina.
0% 0%2,2%
4,4%6,6% 6,6%
11%
46,6%
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
45%
50%
Pe
rce
ntu
al d
e c
ep
as
(%
)
AMO PEN ASB CFZ ERI TET CFE NEO
33
A diferença entre esses perfis de resistência pode advir de vários fatores,
dentre eles: o número e tipo de amostras; local de coleta e quantidade de cepas
isoladas. Schoenfelder e colaboradores (2017) não precisam a quantidade de
amostras, apenas o tipo, sendo poeira e esterco bovino, em um estudo com 344 cepas
isoladas. Por sua vez, Kürekci (2016) utilizou 72 amostras de diferentes tipos de queijo
e isolou 17 cepas de SCN. Já em Lagarto, foram utilizadas 35 amostras de queijo
coalho e obtiveram-se 45 cepas de SCN. Apesar do número superior de cepas
isoladas, estas são oriundas de apenas 35 amostras de queijo em oposição às 72
amostras coletadas pelo último pesquisador.
As cepas isoladas nesse trabalho apresentaram resistência a poucos fármacos
quando comparadas a outros estudos. Tais diferenças podem ser resultado do
tamanho e industrialização da cidade de Lagarto e do Estado de Sergipe, quando
comparados a outros locais pesquisados, tais como cidades da Turquia e da
Alemanha. De fato, nos grandes centros, há uma maior concentração de pessoas e,
consequentemente, o acesso aos antimicrobianos é maior pela população. Além
disso, grandes produtores utilizam bastante promotores de crescimento, constituídos,
na maioria das vezes, por antibióticos, aumentando, dessa forma, a seleção de
bactérias resistentes nos grandes centros (NASCIMENTO, 2016; MOTA, et al., 2005).
Medeiros e colaboradores (2009), isolaram 291 cepas de Staphylococcus spp.
de leite bovino em diferentes lugares de Pernambuco: 62 cepas na Região
Metropolitana de Recife (A), 151 no Agreste (B) e 78 na Zona da Mata (C). Destas
291, apenas 170 eram Staphylococcus coagulase negativa. Na referida pesquisa, os
resultados do perfil de resistência foram dados por região, conforme a seguir: Região
A - 11,3%, 11,3%, 12,9%, 1,6%; Região B - 27,8%, 53,6%, 36,4%, 0,7% e Região C -
37,2%, 5,9%, 46,2%, 10,3%, respectivamente para os antimicrobianos: Amoxicilina,
Penicilina+Novobiocina, Eritromicina, Neomicina+Bacitracina+Tetraciclina.
Os antibióticos utilizados nestes estudos são rotineiramente administrados nos
bovinos, para o tratamento da mastite. A associação Penicilina/Novobiocina
apresentou baixo número de cepas resistente nas regiões A e C. Tal resultado,
assemelha-se ao obtido na cidade de Lagarto-SE (0%) e, diferencia-se dos demais,
já que a penicilina, na maioria dos estudos, mostrou-se com altos índices de
resistência. Esse fato pode ser decorrente da associação dos dois fármacos, que
aumenta o espectro de ação e potencializa o efeito (MEDEIROS et al., 2009). Por sua
34
vez, a associação Neomicina/Bacitracina/Tetraciclina apresentou-se bastante ativa
neste estudo, principalmente nas regiões A e B. Porém, em Lagarto-SE, a Neomicina
apresentou um índice de 46,6% de resistência e a Tetraciclina 6,6%. Dessa forma a
provável diferença entre os estudos pode ser explicada pelo uso combinado de
fármacos no estudo de Medeiros e colaboradores (2009), em oposição ao presente
que testou as drogas de forma isolada.
Quanto a resistência à Amoxicilina e a Eritromicina, observou-se maiores
valores quando comparados ao presente estudo. Isso pode ser explicado devido ao
tipo de amostra, já que Medeiros e colaboradores (2009), utilizaram o leite direto da
vaca, sem passar por nenhum tratamento, diferentemente do estudo realizado em
Lagarto-SE, cuja amostra foi o queijo coalho, o qual, muitas vezes, passa por
tratamentos térmicos, fato que pode afetar o desenvolvimento e proliferação de
bactérias presentes na amostra (SANTOS et al., 2007; NUNES et al., 2015).
Diante dos resultados encontrados das cepas resistentes aos antimicrobianos
nestes estudos, outro ponto a ser elencado é as cepas multirresistentes e os riscos
que estas apresentam para seres humanos e animais que usam esses medicamentos.
A crescente presença de cepas com essas características representa um risco para a
saúde pública e pode dificultar o tratamento de doenças, agravando quadros clínicos
facilmente tratáveis (RAPINI et al., 2004).
Das 45 cepas isoladas do queijo coalho, 6 (13,3%) eram multirresistentes; 3
(6,6%) foram resistentes a dois antimicrobiano; 2 (4,4%) apresentaram resistência a
três fármacos, e apenas 1 cepa (2,2%) foi resistente a quatro antibióticos (Figura 15).
Figura 15: Percentual das cepas de SCN quanto à multirresistência a fármacos. No eixo das abscissas estão o número de fármacos cujo microrganismo apresentou resistência, enquanto que no das ordenadas estão dispostas as porcentagens de cepas multirresistentes.
6,6%
4,4%
2,2%
0,0%
1,0%
2,0%
3,0%
4,0%
5,0%
6,0%
7,0%
Pe
rce
ntu
al d
e c
ep
as
(%
)
Dois Três Quatro
35
No estudo realizado por Kürekci (2016), cinco das 17 cepas de SCN
apresentaram resistência a 3 ou mais drogas, número elevado, apesar da pequena
quantidade de cepas analisadas. Medeiros e colaboradores (2009) relataram que 54
(32%) das 170 cepas de SCN apresentaram resistência entre 2 e 4 antibióticos.
A maior preocupação com essas cepas multirresistentes é a dificuldade de
encontrar um tratamento com antimicrobiano rápido e eficaz, para infecções causadas
por bactérias consideradas simples, mas que podem levar a óbito por sepse, se não
tratadas corretamente (NASCIMENTO, 2016). Outra possibilidade é a disseminação
dos genes que conferem resistência, podendo ser transferidos para bactérias da
própria espécie ou de espécies diferentes, patogênicas ou não (SFACIOTTE, 2014).
36
6 CONCLUSÃO
Foram isoladas um total de 45 cepas a partir das 35 amostras de queijos coalho.
Das 45 cepas de Staphylococcus coagulase negativa mais da metade foram
resistentes a pelo menos um fármaco. Esses dados confirmam o papel dos SCN como
reservatório de genes de resistência e seu potencial para disseminação da resistência
microbiana. Fica também evidente a necessidade de estudos posteriores, com o leite,
matéria prima do queijo coalho, nos locais de produção e de comercialização, bem
como em outros alimentos.
O perfil de resistência encontrado, embora menos expressivo do que em
grandes centros produtores, serve de alerta às autoridades sanitárias no sentido de
intensificar o controle do uso de antimicrobianos pela população e nos animais
destinados à produção de leite.
37
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38
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