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    PD-L1 IHC 22C3 pharmDx SK006 Cinquenta testes para uso com Autostainer Link 48 Uso pretendido Para uso com diagnóstico in vitro. O PD-L1 IHC 22C3 pharmDx é um ensaio imuno-histoquímico qualitativo que utiliza anticorpo monoclonal de camundongos anti-PD-L1, Clone 22C3 para uso na detecção da proteína PD-L1 em tecidos com câncer de pulmão de células não pequenas não escamosas (NSCLC) embebidas em parafina e fixadas em formalina (FFPE) utilizando o sistema de visualização EnVision FLEX no Autostainer Link 48. A expressão da proteína PD-L1 é determinada pelo índice de proporção do tumor (TPS), que representa a porcentagem de células tumorais viáveis que apresentam coloração parcial ou completa da membrana em qualquer intensidade. A espécie terá a expressão de PD-L1 se TPS ≥1% e expressão elevada de PD-L1 se TPS ≥50%. O PD-L1 IHC 22C3 pharmDx é indicado como auxílio na identificação de pacientes com NSCLC para tratamento com KEYTRUDA® (pembrolizumabe). Consulte o rótulo do produto KEYTRUDA® para conhecer os valores de corte da expressão que orientam a terapia em circunstâncias clínicas específicas. Resumo e explicação A ligação dos ligantes PD-1, do PD-L1 e do PD-L2 com o receptor PD-L1 encontrados em células T inibe a proliferação de células T e a produção de citocinas. A regulação ascendente dos ligantes PD-1 ocorre em alguns tumores, e a sinalização por meio dessa via pode contribuir para a inibição da vigilância de tumores imune a células T ativas. KEYTRUDA é um anticorpo monoclonal humana que se liga ao receptor de PD-1 e bloqueia a interação com PD-L1 e PD-L2, liberando a inibição mediada via PD-1 da resposta imunológica, incluindo a resposta imunológica antitumor. Nos modelos de tumores de camundongos singênicos, o bloqueio da atividade do PD-1 resultou em diminuição do crescimento do tumor (1). Princípio do procedimento O PD-L1 IHC 22C3 pharmDx contém reagentes otimizados e o protocolo necessário para executar procedimentos de marcação de IHC de amostras de FFPE usando Autostainer Link 48. Após a incubação com o anticorpo monoclonal primário PD-L1 ou o reagente de controle negativo (NCR), as amostras são incubadas utilizando um anticorpo de vinculação específico às espécies hospedeiras do anticorpo primário e, em seguida, incubadas com reagente de visualização pronto para uso composto por moléculas de anticorpo secundário e moléculas de perioxidase de raiz-forte ligadas à espinha dorsal de um polímero dextrano. A conversão enzimática do cromogênio adicionado posteriormente resulta na precipitação de um produto de reação visível no local do antígeno. A cor da reação cromogênica é modificada por um reagente cromogênico de realce. A amostra pode, então, ser contrastada e recoberta com vidro. Os resultados são interpretados utilizando um microscópio de luz. Materiais fornecidos Cada kit inclui 19,5 mL de anticorpo primário PD-L1 (aproximadamente 3 µg/mL de proteína concentrada) e contém os reagentes necessários para realizar 50 testes em até 15 rodadas individuais. Os materiais listados abaixo são suficientes para 50 testes (50 lâminas incubadas com anticorpo primário para PD-L1 e 50 lâminas incubadas com o reagente de controle negativo correspondente; 100 lâminas ao todo). O número de testes se baseia no uso de 2 x 150 µL por lâmina de cada reagente, exceto DAB+ e solução de recuperação do alvo. O kit fornece materiais suficientes para, no máximo, 15 séries individuais de marcação. Quantidade Descrição 1 x 34,5 mL Reagente bloqueador da peroxidase

    PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT

    Solução tamponada contendo peróxido de hidrogênio, detergente e 0,015 mol/L de azido de sódio.

    1 x 19,5 mL

    Anticorpo primário: Anticorpo monoclonal de camundongos anti-PD-L1, Clone 22C3 MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3

    Anticorpo monoclonal de camundongos (IgG1) anti-PD-L1 em uma solução tamponada contendo proteína de estabilização e 0,015 mol/L de azido de sódio.

    1 x 15 mL

    Reagente de controle negativo NEGATIVE CONTROL REAGENT

    Anticorpo IgG de controle monoclonal de camundongos em uma solução tamponada contendo proteína de estabilização e 0,015 mol/L de azido de sódio.

    1 x 34,5 mL VINCULADOR, Camundongo LINKER, ANTI-MOUSE

    Anticorpo secundário de camundongos contra imoglobinas de coelhos em uma solução tamponada contendo proteína de estabilização e 0,015 mol/L de azido de sódio.

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    1 x 34,5 mL Reagente de visualização - HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP

    Dextrano ligado a moléculas de peroxidase e moléculas de anticorpos secundários de cabras contra imunoglobulinas de coelho e camundongo em uma solução tamponada contendo proteína de estabilização e um agente antimicrobiano.

    15 x 7,2 mL Tampão de substrato DAB+ DAB+ SUBSTRATE BUFFER

    Solução tamponada contendo peróxido de hidrogênio e um agente antimicrobiano.

    1 x 5 mL Cromogênio DAB+ DAB+ CHROMOGEN

    3,3’- tetracloridrato de diaminobenzidina em solvente orgânico.

    1 x 34,5 mL Realçador DAB DAB ENHANCER

    Sulfato cúprico em água.

    6 x 30 mL Solução de recuperação do alvo EnVision FLEX, baixo pH (50x) EnVision™ FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW pH (50X)

    Solução tamponada, pH 6.1, contendo detergente e um agente antimicrobiano.

    15 lâminas Lâminas de controle PD-L1 IHC 22C3 pharmDx CONTROL SLIDES

    Cada lâmina contém seções de duas linhagens celulares granulares, embebidas em parafina e fixadas em formalina: NCI-H226* com expressão de proteína PD-L1 moderada e MCF-7 com expressão de proteína PD-L1 negativa.

    PD -L

    1 IH

    C 2

    2C 3

    ph ar

    m D

    x XX

    XX X

    *Dr. AF Gazdar e Dr. JD Minna da NIH são reconhecidos por sua contribuição no desenvolvimento do NCI-H226 (Número ATCC: CRL-5826™)(2). Observação: todos os reagentes incluídos são formulados especificamente para uso com este kit. De modo que a execução do teste ocorra de acordo com as especificações, nenhuma substituição, a não ser a solução de recuperação do alvo EnVision FLEX, baixo pH (50x) (Código K8005), poderá ser feita. PD-L1IHC 22C3 pharmDx foi especialmente criado para uso com o Autostainer Link 48. Consulte os Guias do Usuário do Autostainer Link 48 e do PT Link para obter informações adicionais. Materiais necessários, mas não fornecidos Módulo de pré-tratamento PT Link (Código PT100/PT101) Autostainer Link 48 (Código AS480) Tampão de lavagem EnVision FLEX (20x) (Código K8007) Hematoxilina (Código K8008) Água destilada ou deionizada (água reagente) Temporizador Tecidos positivos e negativos para uso como controles de processo (consulte a seção Controle de qualidade) Lâminas microscópicas: Lâminas microscópicas Dako FLEX IHC (Código K8020) ou lâminas Fisherbrand Superfrost Plus carregadas Coberturas de vidro Reagentes médios e subordinados de montagem permanente necessários à montagem de coberturas de vidro Microscópio de luz (ampliação objetiva de 4x a 40x) Precauções 1. Para uso com diagnóstico in vitro. 2. Para usuários profissionais. 3. Este produto contém azido de sódio (NaN3), um produto químico altamente tóxico em forma pura. Nas concentrações do produto,

    embora não classificadas como perigosas, o NaN3 pode reagir com tubulações de chumbo e cobre para formar acúmulos altamente explosivos de azidos de metal. No descarte, lave com bastante água a fim de impedir o acúmulo de azido de metal na tubulação (3).

    4. O anticorpo primário, o reagente de controle negativo, o vinculador e o reagente de visualização contêm material de origem animal.

    5. As amostras, antes e após a fixação, e todos os materiais a elas expostos, devem ser tratados como capazes de transmitir infecções e descartados observando-se as devidas precauções (4).

    6. Os tempos, temperaturas ou métodos de incubação que não sejam os especificados poderão gerar resultados errôneos. 7. Os reagentes foram perfeitamente diluídos. Outras diluições poderão resultar em perda de marcação do antígeno.

    MCF-7: Negativo para PD-L1

    NCI-H226: Positivo para PD-L1

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    8. O reagente de visualização, o cromogênio DAB+ líquido e a solução cromogênea com substrato DAB+ preparado podem sofrer efeitos adversos se expostos a níveis excessivos de luz. Não armazene componentes do sistema nem execute a marcação em luz forte, como a luz direta do sol.

    9. Resíduos de parafina poderão levar a falsos negativos. 10. O uso de volumes de reagentes que não sejam os recomendados poderá resultar na perda de imunorreatividade visível do PD-L1. 11. Os resultados de um pequeno estudo apresentaram uma faixa dinâmica semelhante na expressão de PD-L1 em pares primários e

    metastáticos de espécies de NSCLC. É possível que existam diferenças na expressão de PD-L1 em tumores primários versus locais metastáticos no mesmo paciente.

    12. Grandes seções de tecido poderão requerer 3x150 µl de reagente. 13. Como regra geral, pessoas com menos de 18 anos de idade não podem trabalhar com este produto. Os usuários devem ser

    cuidadosamente orientados sobre os procedimentos de trabalho adequados, as propriedades perigosas do produto e as instruções de segurança necessárias. Consu