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P03928PT_04/SK00621-2/2016.11 p. 1/16

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx SK006 50 testes para utilizao no Autostainer Link 48 Finalidade Para utilizao em diagnstico in vitro. O PD-L1 IHC 22C3 pharmDx um ensaio de imuno-histoqumica qualitativa que utiliza o anticorpo Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 para a deteo da protena PD-L1 em tecido de cancro do pulmo de clulas no pequenas (NSCLC) fixado em formol e impregnado em parafina (FFPE) atravs do sistema de visualizao EnVision FLEX no Autostainer Link 48. A expresso da protena PD-L1 determinada utilizando a classificao da proporo tumoral (TPS), que a percentagem de clulas tumorais viveis que apresentam uma colorao parcial ou completa da membrana a qualquer intensidade. O PD-L1 IHC 22C3 pharmDx est indicado como auxiliar na identificao de doentes com NSCLC para tratamento com KEYTRUDA (pembrolizumab). Consulte no rtulo do produto KEYTRUDA os valores de corte de expresso que orientam a terapia em circunstncias clnicas especficas. Resumo e explicao A ligao dos ligandos da PD-1, PD-L1 e PD-L2 ao recetor da PD-1 encontrado nas clulas T inibe a proliferao de clulas T e a produo de citoquina. A regulao superior dos ligandos da PD-1 ocorre em alguns tumores e a sinalizao atravs desta via pode contribuir para a inibio da vigilncia a clulas T imunes ativas dos tumores. O KEYTRUDA um anticorpo monoclonal humanizado que se liga ao recetor da PD-1 e bloqueia a interao deste com a PD-L1 e a PD-L2, libertando a inibio mediada pela via da PD-1 da resposta imune, incluindo a resposta imune antitumoral. Em modelos tumorais de ratinhos singeneicos, o bloqueio da atividade da PD-1 resultou num menor crescimento do tumor (1). Princpio do procedimento O PD-L1 IHC 22C3 pharmDx contm os reagentes e o protocolo otimizados necessrios para concluir um procedimento de colorao IHC de amostras FFPE no Autostainer Link 48. Aps a incubao com o anticorpo monoclonal primrio PD-L1 ou com o Negative Control Reagent (NCR), as amostras so incubadas com um anticorpo de ligao especfico s espcies hospedeiras do anticorpo primrio, sendo depois incubadas com um reagente de visualizao pronto a usar, que consiste em molculas do anticorpo secundrio e em molculas de peroxidase de rbano associadas a uma estrutura base de polmero dextrano. A converso enzimtica do cromognio posteriormente adicionado resulta na precipitao de um produto de reao visvel no local do antignio. A cor da reao cromognica modificada por um reagente de intensificao do cromognio. Em seguida, possvel aplicar um contraste e uma lamela na amostra. Os resultados so interpretados utilizando um microscpio tico. Materiais fornecidos Cada kit inclui 19,5 mL de anticorpo primrio da PD-L1 (aproximadamente 3 g/mL de concentrao de protenas) e contm os reagentes necessrios realizao de 50 testes num mximo de 15 processamentos individuais. Os materiais apresentados abaixo so suficientes para 50 testes (50 lminas incubadas com anticorpo primrio contra a protena PD-L1 e 50 lminas incubadas com o reagente de controlo negativo correspondente, 100 lminas no total). O nmero de testes baseia-se na utilizao de 2 x 150 L de cada reagente por lmina, exceto para DAB+ e para a Target Retrieval Solution. O kit fornece materiais suficientes para, no mximo, 15 processos de colorao individuais. Quantidade Descrio 1 x 34,5 mL Peroxidase-Blocking Reagent

PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT

Soluo tamponada que contm perxido de hidrognio, detergente e 0,015 mol/L de azida de sdio.

1 x 19,5 mL

Primary Antibody: Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3

Anticorpo monoclonal de ratinho (IgG1) anti PD-L1 numa soluo tamponada, que contm protena estabilizadora e 0,015 mol/L de azida de sdio.

1 x 15 mL

Negative Control Reagent NEGATIVE CONTROL REAGENT

Anticorpo monoclonal de ratinho contra a IgG de controlo numa soluo tamponada, que contm protena estabilizadora e 0,015 mol/L de azida de sdio.

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1 x 34,5 mL Mouse LINKER LINKER, ANTI-MOUSE

Anticorpo monoclonal de coelho contra imunoglobulinas de ratinho numa soluo tamponada, que contm protena estabilizadora e 0,015 mol/L de azida de sdio.

1 x 34,5 mL Visualization Reagent-HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP

Dextrano associado a molculas de peroxidase e molculas de anticorpo secundrio de caprino contra imunoglobulinas de coelho e ratinho numa soluo tamponada, que contm protena estabilizadora e um agente antimicrobiano.

15 x 7,2 mL DAB+ Substrate Buffer DAB+ SUBSTRATE BUFFER

Soluo tamponada, que contm perxido de hidrognio e um agente antimicrobiano.

1 x 5 mL DAB+ Chromogen DAB+ CHROMOGEN

3,3'-diaminobenzidina tetrahidrocloreto em solvente orgnico.

1 x 34,5 mL DAB Enhancer DAB ENHANCER

Sulfato cprico em gua.

6 x 30 mL EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x) EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW pH (50X)

Soluo tamponada, pH 6,1, que contm detergente e um agente antimicrobiano.

15 lminas PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Control Slides CONTROL SLIDES

Cada lmina contm cortes de duas linhas celulares aglomeradas, fixados em formol e impregnados em parafina: NCI-H226* com expresso da protena PD-L1 moderada e MCF-7 com expresso da protena PD-L1 negativa.

PD-L

1 IH

C 2

2C3

phar

mD

x XX

XXX

* reconhecido o contributo do Dr. AF Gazdar e do Dr. JD Minna nos Institutos Nacionais de Sade (NIH) para o desenvolvimento da NCI-H226 (nmero ATCC: CRL-5826) (2). Nota: Todos os reagentes includos so especialmente formulados para a utilizao com este kit. Para que o teste tenha o desempenho especificado, no podem ser feitas substituies, exceo da EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x (Referncia K8005). O PD-L1 IHC 22C3 pharmDx foi concebido para ser usado com o Autostainer Link 48. Consulte os manuais de utilizador do Autostainer Link 48 e do PT Link para obter mais informao. Materiais necessrios, mas no fornecidos PT Link Pre-treatment Module (Referncias PT100/PT101/PT200) Autostainer Link 48 (Referncia AS480) EnVision FLEX Wash Buffer, 20x (Referncia K8007) Hematoxylin (Referncia K8008) gua destilada ou desionizada (gua de qualidade reagente) Cronmetro Tecidos positivos e negativos para utilizar como controlos do processo (consultar a seco Controlo de qualidade) Lminas de microscpio: Dako FLEX IHC Microscope Slides (Referncia K8020) ou lminas carregadas com Fisherbrand Superfrost Plus Lamelas Meio de montagem permanente e reagentes acessrios necessrios para a montagem de lamelas Microscpio tico (ampliao de objetiva de 4x-40x)

MCF-7: negativo PD-L1

NCI-H226: positivo PD-L1

MCF-7: negativo PD-L1

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Precaues 1. Para utilizao em diagnstico in vitro. 2. Para utilizadores profissionais. 3. Este produto contm azida de sdio (NaN3), uma substncia qumica altamente txica na forma pura. Em situaes de

concentraes do produto, embora no sendo classificada como perigosa, a NaN3 pode reagir com as canalizaes de chumbo e de cobre, formando acumulaes de azidas metlicas altamente explosivas. Ao eliminar o produto, adicionar gua abundante para evitar a acumulao de azida metlica na canalizao (3).

4. O Primary Antibody, o Negative Control Reagent, o Linker e o Visualization Reagent contm material de origem animal. 5. As amostras, antes e depois da fixao, assim como todos os materiais expostos s amostras, devero ser manuseados como

sendo potencialmente infeciosos e eliminados com as precaues adequadas (4). 6. Os tempos e as temperaturas de incubao ou mtodos diferentes dos especificados podem originar resultados errneos. 7. Os reagentes apresentam uma diluio ideal. A diluio subsequente pode originar a perda de colorao do antignio. 8. Caso sejam expostos a nveis de luz excessivos, o Visualization Reagent, o Liquid DAB+ Chromogen e a soluo DAB+

Substrate-Chromogen preparada podem ser afetados de forma adversa. No conservar os componentes do sistema nem efetuar a colorao sob luz intensa como, por exemplo, luz solar direta.

9. Os resduos de parafina podem dar origem a resultados falsos negativos. 10. Utilizar volumes de reagentes diferentes dos recomendados pode resultar na perda da imunorreatividade visvel da PD-L1. 11. Resultados de um pequeno estudo mostraram um intervalo dinmico semelhante da expresso da PD-L1 em pares de amostras

NSCLC primrias e metastticas. possvel que haja diferenas na expresso da PD-L1 entre tumores primrios e locais metastticos de um mesmo doente.

12. Cortes de tecido de grandes dimenses podem necessitar de 3 x 150 l de reagente. 13. Geralmente, pessoas com idade inferior a 18 anos no esto autorizadas a trabalhar com este produto. Os utilizadores devem ser

cuidadosamente instrudos sobre os procedimentos de trabalho adequado, as propriedades perigosas do produto e as instrues de segurana necessrias. Consultar a Ficha de dados de segurana (FDS) para obter informaes adicionais.

14. Usar equipamento de proteo pessoal adequado para evitar o contacto com a pele e os olhos. 15. A soluo no utilizada dever ser eliminada em conformidade com as regulamentaes locais, nacionais e comunitrias. 16. A ficha de dados de segurana encontra-se disponvel para utilizadores profissionais mediante pedido.

Perigo DAB+ Chromogen: Bifenil-3,3,4,4-tetrailtetraamnio tetracloreto a 1-5% H350 Pode provocar cancro. H341 Suspeito de provocar anomalias genticas. P201 Pedir instrues especficas antes da utilizao. P202 No manuseie o produto antes de ter lido e percebido todas as precaues de segurana. P280 Usar luvas de proteo. Usar proteo ocular ou facial. Usar vestur