padronização de técnicas e análises de biomarcadores em ... · v.3 – quantificaÇÃo de...

Padronização de Técnicas e Análises de

Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes

Marinhos da Costa Brasileira provenientes do

PMP-BS e PMC-BS

Relatório Técnico Anual

Versão 01

Junho / 2018 Período de Referência: Dezembro / 2016 a Dezembro / 2017

E&P

Pág. 3 / 203 Controle de Revisões

Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes

Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS

______________________

Coordenador da Equipe ______________________

Técnico Responsável

1º Relatório Técnico Anual

Revisão 01 06/2018

CONTROLE DE REVISÕES

REV. DESCRIÇÃO DATA

00 Versão inicial 17/04/2018

01 Primeira revisão 20/06/2018

Original Rev. 01 Rev. 02 Rev. 03 Rev. 04 Rev. 05 Rev. 06 Rev. 07 Rev. 08

Data 17/04/18 20/06/18

Elaboração LABCAI LABCAI

Verificação A. Bainy A. Bainy

Aprovação A. Bainy A. Bainy

Serviço de Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes

Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS Índice Geral

Pág. 4203

______________________




Revisão 01 06/2018

ÍNDICE GERAL

ÍNDICE GERAL ..................................................................................................... 4

TABELAS E QUADROS ........................................................................................ 7

FIGURAS ............................................................................................................. 10

GLOSSÁRIO ........................................................................................................ 14

RESUMO ............................................................................................................. 16

I – INTRODUÇÃO ................................................................................................ 18

II – RECEBIMENTO E GUARDA DE AMOSTRAS .............................................. 20

III – PADRONIZAÇÃO DE TÉCNICAS PARA ANÁLISE DE BIOMARCADORES

BIOQUÍMICOS EM ESPÉCIES DE CETÁCEOS ................................................. 75

III.1 – OBTENÇÃO DE AMOSTRAS .............................................................. 75

III.2 – HOMOGENEIZAÇÃO DAS AMOSTRAS ............................................. 76

III.3 – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS DAS AMOSTRAS ......... 77

III.4 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA ATIVIDADE

GLUTATIONA S-TRANSFERASE (GST) ......................................................... 77

III.4.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS ...................................................... 78

III.4.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................ 81

III.5 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA ATIVIDADE

ETOXIRESORUFINA-O-DEETILASE (EROD) ................................................. 90

III.5.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS ...................................................... 90

III.5.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................ 93

III.6 – RESUMO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO PARA ANÁLISE DE

BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS PARA CETÁCEOS .................................. 99

III.7 – BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM CETÁCEOS: COMPARAÇÃO

COM OS DADOS DA LITERATURA .............................................................. 100

IV – PADRONIZAÇÃO DE TÉCNICAS PARA ANÁLISE DE BIOMARCADORES

BIOQUÍMICOS EM AVES MARINHAS .............................................................. 109

IV.1 – OBTENÇÃO DE AMOSTRAS ........................................................... 109

IV.2 – HOMOGENEIZAÇÃO DAS AMOSTRAS ........................................... 110

IV.3 – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS DAS AMOSTRAS ....... 110

IV.4 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA ATIVIDADE

GLUTATIONA S-TRANSFERASE (GST) ....................................................... 111

IV.4.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS ................................................... 111

Pág. 5 / 203 Índice Geral



______________________




Revisão 01 06/2018

IV.4.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................... 113

IV.5 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA ATIVIDADE

ETOXIRESORUFINA-O-DEETILASE (EROD) ............................................... 117



IV.6 – DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE TEMPORAL DAS AMOSTRAS

PARA O ENSAIO DE GST ............................................................................. 124



IV.7 – DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE TEMPORAL DAS AMOSTRAS

PARA O ENSAIO DE EROD .......................................................................... 128



IV.8 – RESUMO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO PARA ANÁLISE DE

BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS PARA AVES .......................................... 132

IV.9 – BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM AVES: COMPARAÇÃO COM

OS DADOS DA LITERATURA ........................................................................ 133

V – PADRONIZAÇÃO DE TÉCNICAS PARA ANÁLISE DE

BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM QUELÔNIOS ................................... 139

V.1 – OBTENÇÃO DE AMOSTRAS ............................................................ 139

V.2 – HOMOGENEIZAÇÃO DAS AMOSTRAS ............................................ 139

V.3 – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS DAS AMOSTRAS ........ 140

V.4 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA ATIVIDADE

GLUTATIONA S-TRANSFERASE (GST) ...................................................... 141

V.4.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS .................................................... 141

V.4.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................... 142

V.5 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA ATIVIDADE

ETOXIRESORUFINA-O-DEETILASE (EROD) ............................................... 145

V.5.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS .................................................... 145

V.5.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................... 147

V.6 – RESUMO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO PARA ANÁLISE DE

BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS PARA QUELÔNIOS .............................. 150

V.7 – BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM QUELÔNIOS: COMPARAÇÃO

COM OS DADOS DA LITERATURA .............................................................. 151

VI – PADRONIZAÇÃO DE TÉCNICAS PARA ANÁLISE DE BIOMARCADORES

MOLECULARES ................................................................................................ 156


Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS Índice Geral

Pág. 6203

______________________




Revisão 01 06/2018

VI.1 – DEFINIÇÃO DE ESPÉCIES-ALVO: AVES MARINHAS .................... 156

VI.2 – DEFINIÇÃO DE ESPÉCIES-ALVO: TARTARUGAS MARINHAS ...... 160

VI.3 – DEFINIÇÃO DE ESPÉCIES-ALVO: CETÁCEOS MARINHOS .......... 162

VI.4 – PADRONIZAÇÃO DE BIOMARCADORES MOLECULARES ............ 168

VI.4.1 – EXTRAÇÃO DE RNA E AVALIAÇÕES DE CONCENTRAÇÃO E

INTEGRIDADE 169

VI.4.2 – DESENHO DE INICIADORES e qPCR .......................................... 173

VII – CONCLUSÕES ......................................................................................... 183

VIII – PRÓXIMAS ETAPAS ................................................................................ 187

IX - BIBLIOGRAFIA .......................................................................................... 188

X – EQUIPE TÉCNICA ...................................................................................... 202

Pág. 7 / 203

Lista de Tabelas e Quadros



______________________




Revisão 01 06/2018

TABELAS E QUADROS

TABELA OU QUADRO PÁG.

Tabela II-1 - Amostras provenientes do Projeto de Monitoramento de Praias da Bacia de

Santos (PMP-BS) destinadas à análise de biomarcadores. 20/203

Tabela II-2 - Amostras provenientes do Projeto de Monitoramento de Cetáceos da Bacia

de Santos (PMC-BS) destinadas à análise de biomarcadores. 21/203

Tabela II-3 - Caracterização das amostras do PMP-BS recebidas pelo LABCAI para

análise de biomarcadores: Código da amostra (SIMBA), espécies, matriz tecidual da

amostra, código de decomposição, método de preservação no local de coleta, método de

preservação no LABCAI, condição da amostra e observações.

23/203

Tabela II-4 - Caracterização das amostras do PMC-BS recebidas pelo LABCAI para

análise de biomarcadores: número da biópsia, espécies, matriz tecidual da amostra,

método de preservação no LABCAI, condição da amostra e observações.

63/203

Tabela III-1 - Identificação dos espécimes de cetáceos provenientes do PMP-BS e PMC-

BS cujas amostras hepáticas e tegumentares foram utilizadas para padronização da

atividade glutationa S-transferase (GST) e da atividade etoxiresorufina-O-deetilase

(EROD).

75/203

Tabela III-2 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade glutationa S-

transferase (GST) com amostras de cetáceos. 100/203

Tabela III-3 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade etoxiresorufina-

O-deetilase (EROD) com amostras de cetáceos. 100/200

Tabela III-4 - Comparação de dados de atividade glutationa S-transferase (GST) oriundos

da padronização do presente projeto com aqueles reportados em outros estudos

realizados em mamíferos marinhos.

102/203

Tabela III-5 - Comparação de dados de atividade etoxiresorufina-O-deetilase (EROD)

oriundos da padronização do presente projeto com aqueles reportados em outros estudos

realizados com mamíferos marinhos.

104/203

Tabela IV-1 - Identificação dos espécimes de aves marinhas provenientes do PMP-BS

cujas amostras hepáticas foram utilizadas para padronização da atividade glutationa S-

transferase (GST) e da atividade etoxiresorufina-O-deetilase (EROD).

109/203

Tabela IV-2 - Identificação e sumário de informações médicas e de admissão referentes

às aves amostradas para verificação de estabilidade de biomarcadores bioquímicos e

moleculares post mortem.

125/203

Tabela IV-3 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade glutationa S-

transferase (GST) com amostras de aves. 132/203

Tabela IV-4 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade etoxiresorufina-

O-deetilase (EROD) com amostras de aves. 132/203

Tabela IV-5 - Comparação de dados de atividade glutationa S-transferase (GST) oriundos

da padronização do presente projeto com aqueles reportados na literatura para aves. 134/203


Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS Lista de Tabelas e Quadros

Pág. 8/203

______________________




Revisão 01 06/2018

Tabela IV-6 - Comparação de dados de atividade etoxiresorufina-O-deetilase (EROD)

oriundos da padronização do presente projeto com aqueles reportados na literatura para

aves.

136/203

Tabela V-1 - Identificação dos espécimes de quelônios provenientes do PMP-BS cujas

amostras hepáticas foram utilizadas para padronização da atividade glutationa S-


139/203

Tabela V-2 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade glutationa S-

transferase (GST) com amostras de quelônios. 150/203

Tabela V-3 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade etoxiresorufina-

O-deetilase (EROD) com amostras de quelônios. 150/203

Tabela V-4 - Comparação de dados de atividade glutationa S-transferase (GST) oriundos

da padronização do presente projeto com aqueles reportados na literatura para quelônios. 152/203

Tabela V-5 - Comparação de dados de atividade etoxiresorufina-O-deetilase (EROD)

oriundos da padronização do presente projeto com aqueles reportados na literatura para

quelônios.

153/203

Tabela VI-1 - Espécies de aves marinhas, respectivos números de espécimes coletados

junto ao PMP-BS até o momento e dados de presença de transcriptoma público. As

espécies com número amostral satisfatório para o desenvolvimento do transcriptoma

estão destacadas em azul.

157/203

Tabela VI-2 - Espécies de tartarugas marinhas, respectivos números de espécimes

coletados junto ao PMP-BS até o momento e dados de presença de transcriptoma

público. A espécie com número amostral satisfatório para a análise de biomarcadores

moleculares está destacada em azul.

160/203

Tabela VI-3 - Relação dos genes potencialmente biomarcadores de exposição em

Chelonia mydas e seus respectivos números de acesso no GenBank/NCBI. 161/203

Tabela VI-4 - Espécies de cetáceos, respectivos números de espécimes coletados junto

ao PMC-BS até o momento e dados de presença de transcriptoma público. As espécies

com número amostral satisfatório para o desenvolvimento do transcriptoma estão

destacadas em azul.

162/203


ao PMP-BS até o momento e dados de presença de transcriptoma público. As espécies


destacadas em azul.

163/203


Tursiops truncatus e seus respectivos números de acesso no GenBank/NCBI. 165/203

Tabela VI-7 - Espécies e correspondente número de sequências gênicas (DNA e RNA) e

de proteínas, obtidas no banco de dados do NCBI. 166/203

Tabela VI-8 - Lista de espécies coletadas pelo PMP-BS e PMC-BS, e sua relação com

existência de dados gênicos públicos para a espécie. 168/203

Tabela VI-9 - Subamostras de Chelonia mydas com suas respectivas concentrações

(ng/µL) e purezas nas razões de 260/280 e 260/230. 171/203

Pág. 9 / 203

Lista de Tabelas e Quadros



______________________




Revisão 01 06/2018

Tabela VI-10 - Concentração (ng/µL) e pureza e razões de 260/280 e 260/230 do RNA

extraído de tecidos de Tursiops truncatus. 171/203

Tabela VI-11 - Lista de iniciadores de Chelonia mydas para os genes de interesse do

PMP-BS e PMC-BS. 174/203

Tabela VI-12 - Lista de iniciadores de Tursiops truncatus para os genes de interesse do

PMP-BS e PMC-BS. 174/203

Tabela VI-13 - Eficiência de amplificação dos genes de interesse em fígado de Chelonia

mydas. Não foi possível amplificar HSP1A e AHR. E: eficiência. A eficiência de 1,00

significa que os amplicons duplicam a cada ciclo e, portanto, a reação é 100% eficiente.

178/203

Tabela VI-14 - Eficiência de amplificação dos genes de interesse em tecidos de Tursiops

truncatus. E: eficiência. A eficiência de 1,00 significa que os amplicons duplicam a cada

ciclo e, portanto, a reação é 100% eficiente.

180/203

Tabela VI-15 - Subamostras de tecidos de cetáceos com suas respectivas concentrações

de RNA (ng/µL) e purezas nas razões de 260/280 e 260/230. 181/203

Tabela VII-1 - Resumo das condições dos ensaios GST e EROD em tetrápodes marinhos. 184/203


Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS Figuras

Pág. 10/203

______________________




Revisão 01 06/2018

FIGURAS

FIGURAS PÁG.

Figura III.4-1 - Reação de formação do conjugado GS-DNB a partir da reação entre 1-

cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) e glutationa reduzida (GSH), catalisada por glutationa

S-transferase (GST) (Adaptado de Habig, 1981).

78/203

Figura III.4-2 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Sotalia

guianensis construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-

cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (A) e glutationa reduzida (GSH) (B). Condições do

ensaio: Tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por

meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. As

linhas tracejadas indicam o intervalo de confiança de 95%.

83/203

Figura III.4-3 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido tegumentar de Sotalia

guianensis construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-


ensaio: Tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por



84/203

Figura III.4-4 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Stenella

frontalis construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-cloro-

2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (A) e glutationa reduzida (GSH) (B). Condições do ensaio:

Tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por meio de

regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. As linhas

tracejadas indicam o intervalo de confiança de 95%.

85/203

Figura III.4-5 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido tegumentar de Stenella



tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por meio de



86/203

Figura III.4-6 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido tegumentar de Tursiops

truncatus construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos

glutationa reduzida (GSH) (A) e 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (B). Condições do

ensaio: tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por



87/203

Pág. 11 / 203 Figuras



______________________




Revisão 01 06/2018

Figura III.4-7 - Curvas cinéticas de atividade GST em epiderme de Balaenoptera

borealis construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos

glutationa reduzida (GSH) (A) e 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (B). Condições do




88/203

Figura III.5-1 - A. Atividade EROD em tecido hepático de tainha (Mugil lisa) exposta a

dispersantes de petróleo, conforme observada no software SpectraMax® M5 (Molecular

Devices®), para fins de comparação com B. Atividade EROD em tecido tegumentar de

golfinho pintado do atlântico (Stenella frontalis), em duplicata, conforme observada no

software SpectraMax® M5 (Molecular Devices®). Linhas em duplicata mais abaixo em

‘B’ representam o Branco, sem adição de amostra.

94/203

Figura III.5-2 - A. Efeito de diferentes concentrações de NADPH na atividade EROD. B.

Curva cinética de atividade EROD em tecido hepático de Sotalia guianensis construída

com concentrações crescentes do substrato enzimático 7-etoxiresorufina (7-ER), sendo

Kmapp e Vmax obtidos por meio de regressão não linear dos dados ajustados ao

modelo de Inibição por substrato, linhas hachuradas indicam o intervalo de confiança de

95%. Média±DP com base em réplicas técnicas. ‘Inset’ – Gráfico de Eadie-Hofstee da

curva cinética. A Vmax calculada pelo programa é a Vmax prevista na ausência de

inibição por substrato.

96/203

Figura III.5-3 - A. Efeito de diferentes concentrações de NADPH na atividade EROD. B.

Curva cinética de atividade EROD em tecido hepático de Stenella frontalis construída

com concentrações crescentes do substrato enzimático 7-etoxiresorufina (7-ER), sendo


modelo de Inibição por substrato, linhas pontilhadas indicam o intervalo de confiança de

95%. Média±DP com base em réplicas técnicas. ‘Inset’ – Gráfico de Eadie-Hofstee da

curva cinética. A Vmax calculada pelo programa é a Vmax estimado na ausência de

inibição por substrato.

98/203

Figura IV.4-1 - Atividade GST, representada pelo aumento de absorbância por minuto

(Abs Min), em concentrações crescentes de etanol. Barras representam média ± DP,

calculados a partir de quadruplicatas técnicas* para cada condição de ensaio.*Réplicas

técnicas são repetições de análises de um mesmo organismo (amostra biológica)

realizadas durante um ensaio. As réplicas técnicas podem ser usadas para avaliar a

repetibilidade do método.

113/203

Figura IV.4-2 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Larus

dominicanus, construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos

glutationa reduzida (GSH) (A) e 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (B).

115/203

Figura IV.4-3 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Spheniscus

magellanicus construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-



meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten.

116/203


Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS Figuras

Pág. 12/203

______________________




Revisão 01 06/2018

Figura IV.5-1 - Curva cinética de atividade EROD em tecido hepático de Larus

dominicanus construídas com concentrações crescentes do substrato enzimático 7-

etoxiresorufina (7-ER) (A), sendo Kmapp e Vmax obtidos por meio de regressão não

linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. Inibição da deetilação de 7-

ER em concentrações crescentes de NADPH (B).

121/203

Figura IV.5-2 - A. Efeito de diferentes concentrações de NADPH na atividade EROD,

dados relativizados pela atividade média da concentração de 2 mM. B. Curva cinética de

atividade EROD em tecido hepático de Spheniscus magellanicus construída com

concentrações crescentes do substrato enzimático 7-etoxiresorufina (7-ER), sendo


modelo de Inibição por substrato, linhas hachuradas indicam o intervalo de confiança de

95%. ‘Inset’ – Gráfico de Eadie-Hofstee da curva cinética. O Vmax calculado pelo

programa é o Vmax estimado na ausência de inibição por substrato.

123/203

Figura IV.6-1 - Atividade GST (mU*mgprt-1) post mortem em tecido hepático de Larus

dominicanus em diferentes tempos de decomposição. Pontosrepresentammédias de

duplicatas técnicas*. * Réplicas técnicas são repetições de análises de um mesmo

organismo (amostra biológica) realizadas durante um ensaio. As réplicas técnicas

podem ser usadas para avaliar a repetibilidade do método.

127/203

Figura IV.7-1 - Estabilidade da atividade EROD em tecido hepático de aves Larus

dominicanus: indivíduos 1 e 2. A atividade foi apresentada como porcentagem em

relação ao T0 (momento da morte do animal). *Atividade não detectada em L.

dominicanus 2 após 24 horas. O ajuste dos dados de ambos os espécimes à equação

exponencial de decaimento apresentou r2 = 0,98. O tempo de meia vida de L.

dominicanus 1 e L. dominicanus 2 foi de 2,8 e 5,2 horas, respectivamente.

130/203

Figura V.4-1 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Chelonia mydas

construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos glutationa

reduzida (GSH) (A) e 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (B). Condições do ensaio:

tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 30°C. Km aparente e Vmax obtidos por meio

de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten.

144/203

Figura V.5-1 - A. Efeito de diferentes concentrações de NADPH na atividade EROD,

normalizada pela atividade média da concentração 1 mM. B. Curva cinética de atividade

EROD em tecido hepático de Chelonia mydas construída com concentrações crescentes

do substrato enzimático 7-etoxiresorufina (7-ER), sendo Kmapp e Vmax obtidos por

meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Inibição por substrato,

linhas hachuradas indicam o intervalo de confiança de 95%. ‘Inset’ – Gráfico de Eadie-

Hofstee da curva cinética. O Vmax calculado pelo programa é o Vmax estimado na

ausência de inibição por substrato.

149/203

Pág. 13 / 203 Figuras



______________________




Revisão 01 06/2018

Figura VI.4-1 - Resultado da avaliação da qualidade do RNA das quatro subamostras do

mesmo fígado de Chelonia mydas. Eletroforese em gel de agarose 1,2% desnaturante

(Formaldeído) e corado com GelRed (Biotium). Foi aplicado 1 µg de RNA total. Presença

das bandas de RNA ribossomal 28S e 18S e ausência de DNA genômico e

contaminação por proteínas.

172/203

Figura VI.4-2 - Resultado da avaliação da qualidade do RNA das amostras de diferentes

tecidos de Turiops truncatus. Tecidos correspondentes aos números apresentados na

figura: 1) cérebro; 2) fígado; 3) gordura; 4) músculo; 5) pele; e 6) pulmão. *As amostras

de rim e baço não aparecem na figura porque o fotodocumentador foi incapaz de

registrar a fraca intensidade do rastro. O pulmão não apresentou bandas de RNA

ribossomal.

173/203

Figura VI.4-3 - Curva de dissociação dos genes CYP1A1 (vermelho), E2F1 (roxo), EEF2

(laranja), ESR1 (ciano) em fígado de Chelonia mydas. AHR apresentou múltiplos

produtos e não foi mostrado por prejudicar a visualização dos demais picos; HSP não

amplificou. Eixo X (temperatura); Eixo Y (derivada negativa da fluorescência em função

da temperatura, -dF/dT). O ponto máximo de cada linha representa a temperatura de

dissociação do produto. A presença de mais de um pico sugere a presença de mais de

um produto.

176/203

Figura VI.4-4 - Curva de dissociação dos genes UGT1 (vermelho) em fígado de

Chelonia mydas. Eixo X (temperatura); Eixo Y (derivada negativa da fluorescência em

função da temperatura, -dF/dT). O ponto máximo de cada linha representa a

temperatura de dissociação do produto. A presença de mais de um pico sugere a

presença de mais de um produto.

176/203

Figura VI.4-5 - Gel de agarose 1,2%, nativo, mostrando produtos de qPCR formados

para os genes UGT1A, CYP1A1, E2F, EEF2 e ESR1 de Chelonia mydas em duplicata.

M representa o marcador de peso molecular. Presença de outros produtos em E2F.

177/203

Figura VI.4-6 - Curva de dissociação dos genes CYP1A1 (vermelho), AHR primer A

(azul escuro), E2F1 (roxo), ESR1 (rosa), HSP (laranja) e UGT1 (ciano) em mix de

tecidos de Tursiops truncatus. Eixo X (temperatura); Eixo Y (derivada negativa da

fluorescência em função da temperatura, -dF/dT). O ponto máximo de cada linha

representa a temperatura de dissociação do produto. A presença de mais de um pico

sugere a presença de mais de um produto.

179/203

Figura VI.4-7 - Gel de agarose 1,2%, nativo, evidenciando produtos de qPCR formados

para os genes CYP1A, E2F, ESR1, HSPA, UGT1A e AHR primer B em mix de tecidos

de Tursiops truncatus.

179/203

Figura VI.4-8 - Gel de RNA 1,2%, desnaturante, mostrando resultado da avaliação da

qualidade do RNA para as subamostras de pele de cetáceos (amostra BM66) com

massas de 25, 50, 75 e 100 mg. Foi aplicado 1 µg de RNA total em cada poço e as

amostras foram coradas com GelRed® (Biotium).

182/203


Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS Glossário

Pág. 14/203

______________________




Revisão 01 06/2018

GLOSSÁRIO

7-ER: 7-etoxiresorufina

ε: Coeficiente de extinção molar

µg: Micrograma

µL: Microlitro

µM: Micromolar

1/V: Inverso da velocidade máxima

BSA: Albumina sérica bovina

cDNA: DNA complementar

CDNB: 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno

CYP1A: Citocromo P450 família 1 subfamília A

DEPC: Dietilpirocarbonato

DNA: Ácido desoxirribonucléico

DTT: Ditiotreitol

EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético

EROD: Etoxiresorufina-O-deetilase

fmol.min-1.mgprt-1: Fentomol de produto por minuto por miligrama de proteína

GSH: Glutationa reduzida

GST: Glutationa S-transferase

IUCN: União Internacional para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais

KCl: Cloreto de potássio

Ki: Constante de inibição

Km: Constante de Michaelis-Menten

Kmapp: Km aparente

M: Molar

mg: Miligrama

mg.mL-1: Miligrama por mililitro

milliabs.min: Taxa de formação de GS-DNB (ε = 9,6 mM.cm-1)

min: Minuto

mM: Milimolar

MOPS: 3-[N-morfolino]propano-ácido sulfônico

mU.min.mg proteína-1: Nanomol de substrato por minuto por miligrama de proteína

Pág. 15 / 203 Glossário



______________________




Revisão 01 06/2018

NADPH: Fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina

NCBI: National Center for Biotechnology Information

ng/µL: Nanograma por microlitro

nm: Nanômetro

PCR: Reação em cadeia da polimerase

pH: Potencial hidrogeniônico

pmol.min-1.mgprt-1: Picomol de produto por minuto por miligrama de proteína

PMSF: Fluoreto de fenilmetilsulfonil

Pool: Soma de volumes iguais de amostras de diferentes espécimes

qPCR: Reação em cadeia da polimerase quatitativa

RFU.min-1: Unidade relativa de fluorescência por minuto

RNA: Ácido ribonucléico

S9: Fração citosólica, pós mitocondrial, após centrifugação de 9000 xg

DP: Desvio padrão

Spp: Espécies

Tris-HCl: Cloridrato de 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol

V: Velocidade

Vmax: Velocidade máxima


Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS Resumo

Pág. 16/203

______________________




Revisão 01 06/2018

RESUMO

O presente documento descreve as metodologias empregadas e os

resultados obtidos no primeiro ano de padronização de técnicas e análises de

biomarcadores em espécies de tetrápodes marinhos provenientes do PMP-BS e

PMC-BS, compreendendo o período entre dezembro de 2016 e dezembro de

2017.

Foram realizadas as atividades de padronização das atividades das enzimas

glutationa S-transferase (GST) e etoxiresorufina-O-deetilase (EROD) nos

cetáceos Sotalia guianensis, Stenella frontalis, Tursiops truncatus e Balaenoptera

borealis, na tartaruga marinha Chelonia mydas e nas aves marinhas Spheniscus

magellanicus e Larus dominicanus; o ínicio das padronizações moleculares para

Chelonia mydas e Tursiops truncatus; e os testes de estabilidade temporal para

as atividade GST e EROD padronizadas em tecido hepático de Larus

dominicanus.

Os ensaios de padronização permitiram otimizar a concentração de

substratos utilizada nas metodologias de mensuração de atividade GST e EROD

para cada espécie. Ensaios enzimáticos deverão ser realizados a 37ºC para aves

e cetáceos e 30ºC para C. mydas. O ensaio enzimático para medir atividade GST

em S. magellanicus, L. dominicanus, e C. mydas, deverá utilizar CDNB e GSH em

concentrações de 2,5 mM e, em cetáceos, GSH deverá ser utilizada em

concentrações de 5 mM e CDNB em concentrações de 2,5 mM.

Para a análise da atividade EROD, ensaios com C. mydas e S. magellanicus

deverão utilizar o substrato 7-etoxiresorufina (7-ER) em concentrações de 4 M e

NADPH a 1 mM. Ensaios de atividade EROD com L. dominicanus deverão utilizar

7-ER em concentrações de 2 M e NADPH a 1 mM. Em tecido hepático de S.

frontalis, 7-ER deverá ser utilizada em concentrações de 0,5 M e NADPH a 1

mM, para tecido hepático de S. guianensis deverá ser utilizada concentração de

7-ER a 1 M e NADPH a 0,5 mM. Nossos resultados mostram também que não

foi possível detectar a atividade EROD em tecido tegumentar de cetáceos.

Para os tecidos das espécies avaliadas foi observado um modelo cinético

para a atividade EROD de inibição por substrato.

Testes de estabilidade temporal realizados com espécimes de Larus

dominicanus evidenciaram um decaimento da atividade EROD a partir da

Pág. 17 / 203 Resumo



______________________




Revisão 01 06/2018

segunda hora após a morte. Este padrão, no entanto, não foi observado para

atividade GST, que manteve-se constante ao longo do tempo post mortem. Estes

resultados suportam a possibilidade de análise de atividade GST em L.

dominicanus coletados em código 2 pelo PMP-BS e reforçam a realização de

análises de atividade EROD apenas em L. dominicanus amostrados

imediatamente após a morte.

Além da padronização de ensaios enzimáticos, no período abrangido pelo

presente documento também foram elaborados critérios para a determinação das

espécies nas quais serão sequenciados os seus transcriptomas. Para as espécies

C. mydas e T. truncatus informações genéticas já estão mapeadas e

disponibilizadas publicamente, portanto as análises serão realizadas, inicialmente,

em seis espécies, sendo, além das duas recém citadas, duas espécies de

cetáceos: Stenella longirostris, Balaenoptera brydei, e duas de aves: Puffinus

puffinus e L. dominicanus, para as quais será necessário realizar o

sequenciamento e a identificação dos genes. Destaca-se que na revisão 00 do

presente Relatório Técnico Anual protocolado em abril de 2018 pela Petrobras, o

principal critério de determinação de espécies-alvo foi a quantidade de amostras

coletadas e entregues pelo PMP-BS e PMC-BS ao LABCAI/UFSC até dezembro

de 2017. Assim, as espécies S. frontalis, B. borealis e T. truncatus foram

recomendadas como espécies-alvo de cetáceos para o monitoramento dos

biomarcadores moleculares. Entretanto, após a atualização da quantidade de

amostras disponível para cada espécie em maio de 2018 e consulta à equipe

técnica do PMC-BS, decidiu-se pela revisão da proposta das espécies

prioriatárias, fazendo a substituição de S. frontalis por S. longirostris e de B.

borealis por B. brydei, conforme acordado com o IBAMA em 07/05/2018 em

reunião registrada na Ata de Reunião COPROD nº 2421956 (SEI

02001.114275/2017-00).

O início das padronizações moleculares para as duas espécies que possuem

dados genômicos de acesso público (C. mydas e T. truncatus) confirma a

especificidade e eficiência da maioria dos iniciadores desenhados. Aqueles que

foram considerados inadequados serão redesenhados nos próximos meses.

Os resultados da padronização molecular também reforçam a possibilidade

de extração de RNA de amostras diminutas, de até 25 mg, de tecido tegumentar

de cetáceos, quadro similar aquele observado para o material de biópsia oriundo

do PMC-BS.


Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS I. Introdução Pág.

18 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

I – INTRODUÇÃO

O ambiente natural está constantemente sujeito a alterações de origem

natural e/ou antrópica. Potenciais impactos oriundos de alterações antrópicas

reforçam a necessidade de monitoramento das condições ambientais a fim de

desenvolver e adequar estratégias de gerenciamento para mitigação dos danos.

Diversas ferramentas podem ser utilizadas para o monitoramento de

condições ambientais. O uso de biomarcadores é uma das ferramentas mais

utilizadas para avaliação de exposição e efeito a xenobióticos de origem antrópica

(HUGGETT et al., 2002). Biomarcadores são compreendidos como alterações

celulares, bioquímicas ou moleculares decorrentes de exposição à determinada

condição ambiental. São, por definição, responsivos e facilmente mensuráveis,

fornecendo indícios precoces de exposição e resposta biológica a condições

ambientais adversas (HUGGETT et al., 2002; WALKER, 1995).

Embora sejam ferramentas promissoras, Den Besten (1998) reforça que o

uso de biomarcadores como indicativo de alterações na homeostase do

organismo depende diretamente da determinação de parâmetros considerados

‘normais’. Tal determinação só é possível a partir da continuidade de análises de

biomarcadores em organismos saudáveis, bem como em indivíduos

potencialmente impactados. Ademais, particularidades bioquímicas de cada

espécie tornam necessária a adequação de ensaios utilizados para a análise de

biomarcadores, a fim de garantir que as técnicas utilizadas retratem de forma

fidedigna os processos bioquímicos e/ou moleculares nos organismos (BEGER et

al., 2017).

O presente documento apresenta o 1º Relatório Técnico Anual das atividades

desenvolvidas durante os primeiros 12 meses (dez/2016 – dez/2017) do projeto

intitulado “Padronização de técnicas e análise de biomarcadores em espécies de

tetrápodes marinhos da costa brasileira”. O projeto está previsto no contexto do

licenciamento ambiental do Polo Pré-Sal da Bacia de Santos - ETAPA 2.

O projeto visa, primeiramente, desenvolver, adaptar e padronizar técnicas

para a análise de biomarcadores bioquímicos e moleculares de contaminação

ambiental em tetrápodes marinhos. Os biomarcadores padronizados serão

subsequentemente analisados em amostras de tecidos tegumentar e hepático de

Pág. 19 / 203 I. Introdução



______________________




Revisão 01 06/2018

cetáceos e de tecido hepático de aves e tartarugas marinhas provenientes do

Projeto de Monitoramento de Praias da Bacia de Santos (PMP-BS) e do Projeto

de Monitoramento de Cetáceos da Bacia de Santos (PMC-BS).

No presente relatório são descritas as atividades finalizadas até dezembro de

2017, conforme segue: a padronização das atividades das enzimas glutationa S-

transferase (GST) e etoxiresorufina-O-deetilase (EROD) nos cetáceos Sotalia

guianensis, Stenella frontalis, Tursiops truncatus e Balaenoptera borealis, na

tartaruga marinha Chelonia mydas e nas aves marinhas Spheniscus magellanicus

e Larus dominicanus; o ínicio das padronizações das técnicas de quantificação

dos biomarcadores moleculares para Chelonia mydas e Tursiops truncatus; e os

testes de estabilidade temporal para as atividades das enzimas GST e EROD

padronizadas em tecido hepático de Larus dominicanus.

Também são apontados no presente documento os critérios que estão sendo

utilizados para determinação das espécies para as quais serão realizados o

sequenciamento de seu transcriptoma para identificação dos genes de interesse.



II. Recebimento e guarda de

amostras Pág.

20 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

II – RECEBIMENTO E GUARDA DE AMOSTRAS

Até a conclusão deste Relatório Técnico Anual, encontravam-se destinadas à

análise de biomarcadores bioquímicos e moleculares amostras de 517 espécimes

provenientes do PMP-BS e PMC-BS. Amostras coletadas no âmbito do PMP-BS

totalizam 380 espécimes pertencentes a 26 espécies (Tabela II-1). Amostras

coletadas no âmbito do PMC-BS totalizam 145 espécimes pertencentes a 17

espécies (Tabela II-2). O sumário das amostras destinadas à análise de

biomarcadores é proveniente dos dados disponíveis no SIMBA em 03/05/2018

(PMP-BS) ou de tabelas disponibilizadas pela equipe da Socioambiental

Consultores Associados (PMC-BS). Os dados do PMC-BS são referentes aos

ciclos I, II, III, IV, V e VI das campanhas de telemetria.

Tabela II-1 - Amostras provenientes do Projeto de Monitoramento de Praias da Bacia de

Santos (PMP-BS) destinadas à análise de biomarcadores. Espécies alvo para emissão

de laudos de biomarcadores bioquímicos sinalizadas em azul.

PMP-BS – SIMBA (03/05/2018)

Classe Reptilia

Grupo Taxonômico Espécie Número de espécimes

Ordem Testudinata Chelonia mydas 265

Caretta caretta 02

Eretmochelys imbricata 01

Classe Aves


Ordem Sphenisciformes Spheniscus magellanicus 64

Ordem Charadriiformes Larus dominicanus 39

Sterna hirundo 02

Charadrius semipalmatus 01

Thalasseus acuflavidus 01

Ordem Procellariiformes Puffinus puffinus 28

Ordem Procellariiformes Calonectris diomedea 03

Procellaria aequinoctialis 03

Puffinus gravis 02

Thalassarche melanophris 02

Macronectes giganteus 01

Oceanites oceanicus 01

Pág. 21 / 203

II. Recebimento e Guarda de

amostras Padronização de Técnicas e Análises de

Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS

______________________




Revisão 01 06/2018

Ordem Suliformes Sula leucogaster 10

Phalacrocorax brasilianus 06

Fregata magnificens 06

Classe Mammalia


Ordem Cetacea Subordem Odontoceti

Pontoporia blainvillei 28

Sotalia guianensis 35

Tursiops truncatus 04

Stenella frontalis 03

Phocoena dioptrica 01

Stenella longirostris 01

Ordem Cetacea Subordem Mysticeti

Balaenoptera acutorostrata 01

Ordem Carnivora Arctocephalus australis 07

TOTAL: 26 espécies TOTAL: 517 espécimes disponibilizados no SIMBA em 03/05/2018

Tabela II-2 - Amostras provenientes do Projeto de Monitoramento de Cetáceos da Bacia

de Santos (PMC-BS) destinadas à análise de biomarcadores. Espécies alvo para

emissão de laudos de biomarcadores bioquímicos sinalizadas em azul.

PMC-BS – Lista Geral (Ciclos I a IV) (03/05/2018)

Classe Mammalia


Ordem Cetacea Subordem Odontoceti


Tursiops truncatus 38

Stenella longirostris 47

Stenella clymene 7

Stenella attenuata 12

Delphinus capensis 04

Delphinus sp. 04

Steno bredanensis 07

Physeter macrocephalus 05

Peponocephala electra 05

Orcinus orca 01


Delphinus delphis 01

Ordem Cetacea Subordem Mysticeti

Balaenoptera borealis 14

Megaptera novaeangliae 14

Balaenoptera brydei 08




amostras Pág.

22 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Balaenoptera physalus 06

Balaenoptera bonaerensis 03

Balaenoptera musculus 01

Eubalaena australis 01

Globicephala sp. 01

TOTAL: 21 espécies TOTAL: 244 espécimes disponibilizados em email - Lista Geral (Ciclos I a IV) (03/05/2018)

Dentre as amostras disponibilizadas nos bancos de dados, 617 foram

coletadas pelo PMP-BS e 265 pelo PMC-BS e encontram-se armazenadas em

freezer -80 ºC (Tabela II-3) pelo LABCAI/UFSC.

Pág. 23 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018

Tabela II-3 - Caracterização das amostras do PMP-BS recebidas pelo LABCAI para análise de biomarcadores: Código da amostra (SIMBA), espécie, matriz

tecidual da amostra, código de decomposição, método de preservação no local de coleta, método de preservação no LABCAI, condição da amostra e

observações.

# Código da amostra

Espécie Matriz Código de

decomposição Método de

preservação Preservação no LABCAI

Condição da

amostra Observações

1 87614 Larus dominicanus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A

2 49341 Larus dominicanus Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A

3 60659 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A



ambiente -80 °C A

8 79775 Sula leucogaster Fígado 2 Refrigerado -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A




amostras Pág.

24 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

19 64858 Thalassarche

chlororhynchos Fígado 2

Temperatura ambiente -80 °C

A


ambiente -80 °C A

21 60209 Sotalia guianensis Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

29 30084 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura -80 °C A

Pág. 25 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018

ambiente


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

37 39031 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A

38 37266 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A



ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A




amostras Pág.

26 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018




ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A



ambiente -80 °C A




ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A



ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


Pág. 27 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018

ambiente


66 34617 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Refrigerado -80 °C A



ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A





ambiente -80 °C A




ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A







amostras Pág.

28 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

85 55625 Puffinus puffinus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A






91 61639 Tursiops truncatus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A


93 40803 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Refrigerado -80 °C A

94 48105 Calonectris diomedea Fígado 2 Refrigerado -80 °C A





99 41942 Puffinus gravis Fígado 2 Refrigerado -80 °C A

100 29428 Arctocephalus australis Fígado 2 Refrigerado -80 °C

I Espécie não contemplada

pelo Projeto




ambiente -80 °C A

104 64113 Puffinus puffinus Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A




ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

Pág. 29 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A



ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A




ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A




ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A



ambiente -80 °C A

127 36388 Pontoporia blainvillei Fígado 2 Temperatura -80 °C A




amostras Pág.

30 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

ambiente


ambiente -80 °C A




ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A




ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

Pág. 31 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018





ambiente -80 °C A


150 50720 Thalassarche

chlororhynchos Fígado 2

Temperatura ambiente -80 °C

A

151 49368 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C A Tubo identificado 49369


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A



ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A





amostras Pág.

32 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

ambiente


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


170 34033 Caretta caretta Fígado 2 Refrigerado -80 °C A

171 59369 Fregata magnificens Fígado 2 Refrigerado -80 °C A


ambiente -80 °C A



ambiente -80 °C A



ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A



ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

Pág. 33 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

189 63808 Caretta caretta Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A





amostras Pág.

34 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

ambiente


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

tubos com identificação a lápis.

211 49052 Balaenoptera acutorostrata Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A


212 33850 Sterna hirundo Fígado 2 Refrigerado -80 °C A

213 32479 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura -80 °C A tubos com identificação a

Pág. 35 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018

ambiente lápis.

214 34148 Sotalia guianensis Fígado 2 Refrigerado -80 °C A


216 34163 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A



ambiente -80 °C A



ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

224 56265 Chelonia mydas Fígado 2 Refrigerado -80 °C

A tubos com identificação a

lápis.


ambiente -80 °C A



ambiente -80 °C A



A tubos com identificação a

lápis.


ambiente -80 °C A



ambiente -80 °C A





amostras Pág.

36 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018


ambiente -80 °C A



ambiente -80 °C A



ambiente -80 °C A





236 31977 Fregata magnificens Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A



ambiente -80 °C A



ambiente -80 °C A

239 60113 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura

ambiente -80 °C I

Amostra não foi enviada para análise


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C I



ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C I



ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C I


246 57200 Stenella frontalis Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A

Pág. 37 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018

247 57200 Stenella frontalis Pele 2 Temperatura

ambiente -80 °C I



249 43806 Pontoporia blainvillei Pele 2 Refrigerado -80 °C

I Amostra não foi enviada para

análise


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C I



ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C I



ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C I



ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C I



ambiente -80 °C A


259 56121 Fregata magnificens Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A



261 36799 Chelonia mydas Pele 2 Refrigerado -80 °C

I Amostra não foi enviada para

análise


263 33537 Chelonia mydas Pele 2 Refrigerado -80 °C A

264 42683 Thalassarche melanophris Fígado 2 Temperatura -80 °C A




amostras Pág.

38 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

ambiente

265 34365 Fregata magnificens Fígado 2 Refrigerado -80 °C A


ambiente

-80 °C

A

Identificação no tubo (FAI) em desacordo à identificação da ficha de custódia (SIMBA). Armazenada em eppendorf

NÃO livre de RNases.


ambiente

-80 °C

A




ambiente -80 °C A

269 37000 Phalacrocorax brasilianus Fígado 2 Temperatura

ambiente

-80 °C

A



270 37000 Phalacrocorax brasilianus Pele 2 Temperatura

ambiente -80 °C I Amostra não enviada.


ambiente -80 °C A

272 44136 Phalacrocorax brasilianus Pele 2 Temperatura



ambiente -80 °C

A Identificação no tubo (FAI)

em desacordo à identificação da ficha de custódia (SIMBA).

274 32282 Larus dominicanus Pele 2 Temperatura


275 39335 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura -80 °C A Acondicionada em tubo de 5

Pág. 39 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018

ambiente mL, em desacordo ao protocolo.


ambiente -80 °C

A Acondicionada em tubo de 5

mL, em desacordo ao protocolo.


ambiente -80 °C




ambiente -80 °C




ambiente -80 °C




ambiente -80 °C




ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C

A

Armazenada em RNA later, adequada apenas para

análise de biomarcadores moleculares.


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C

A

Armazenada em RNA later, adequada apenas para





amostras Pág.

40 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018


ambiente -80 °C

A Acondicionada em tubos de 5

mL, em desacordo ao Protocolo.


ambiente -80 °C




ambiente -80 °C




ambiente -80 °C




ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C




ambiente -80 °C



296 48749 Phalacrocorax brasilianus Fígado 2 Congelado -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C I


Pág. 41 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018

299 31231 Arctocephalus australis Fígado 2 Congelado -80 °C

A Espécie não contemplada

pelo projeto.

300 31231 Arctocephalus australis Pele 2 Congelado -80 °C


pelo projeto.


ambiente -80 °C A








ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C




ambiente -80 °C





ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C I



ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A




amostras Pág.

42 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018


ambiente -80 °C A

314 56561 Procellaria aequinoctialis Fígado 2 Refrigerado -80 °C A


ambiente -80 °C

A Identificação do tubo (FAI) em discordância a ficha de

custódia (SIMBA)


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA)


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA)


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA)


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA)


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA)


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C



325 56140 Chelonia mydas Pele 2 Temperatura -80 °C A Acondicionada em tubo de 5

Pág. 43 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018



ambiente -80 °C




ambiente -80 °C




ambiente -80 °C




ambiente -80 °C




ambiente -80 °C


mL, em desacordo ao protocolo

331 39330 Pontoporia blainvillei Pele 2 Temperatura

ambiente -80 °C


mL, em desacordo ao protocolo


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C




ambiente -80 °C







amostras Pág.

44 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

ambiente


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C




ambiente -80 °C




ambiente -80 °C




ambiente -80 °C




ambiente -80 °C




ambiente -80 °C



344 48455 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Congelado -80 °C A

345 47027 Procellaria aequinoctialis Fígado 2 Congelado -80 °C A

346 47907 Phocoena dioptrica Fígado 2 Congelado -80 °C A

347 47907 Phocoena dioptrica Pele 2 Congelado -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

Pág. 45 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018


ambiente -80 °C

A

Amostra armazenada apenas em RNA later, adequada apenas para análise de

biomarcadores moleculares.


I Data de necrópsia não condiz

com data de ocorrência do animal.


I Data de necrópsia não condiz



ambiente -80 °C




ambiente -80 °C




ambiente -80 °C A

357 32379 Sotalia guianensis Pele 2 Temperatura

ambiente -80 °C A

358 31955 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Refrigerado -80 °C

A Data de necrópsia não condiz


359 31955 Spheniscus magellanicus Pele 2 Refrigerado -80 °C I Amostra não enviada.


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


363 48014 Sula leucogaster Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A




amostras Pág.

46 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

364 48014 Sula leucogaster Pele 2 Temperatura

ambiente -80 °C I Amostra não enviada


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

379 54246 Chelonia mydas Fígado 2 Temperatura -80 °C A Acondicionada em tubo de 5

Pág. 47 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018



ambiente -80 °C




ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A




amostras Pág.

48 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C

A

Armazenada apenas em RNA later, adequada apenas para



ambiente -80 °C


custódia (SIMBA)


ambiente -80 °C A

Pág. 49 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA)


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA)


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA)


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA)


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA)


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA)


ambiente -80 °C A

419 29812 Oceanites oceanicus Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A

420 31115 Macronectes giganteus Fígado 2 Temperatura -80 °C A




amostras Pág.

50 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

ambiente


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA)


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA)

426 29740 Puffinus gravis Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A

427 29739 Thalassarche melanophris Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A

428 47668 Calonectris diomedea Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C


custódia (SIMBA)


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA)


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA)

431 46114 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Congelado -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

Pág. 51 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A




ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A










452 47893 Sotalia guianensis Pele 2 Refrigerado -80 °C A






amostras Pág.

52 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018


456 36781 Pontoporia blainvillei Pele 2 Refrigerado -80 °C A










ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A






ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

473 31915 Tursiops truncatus Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C

A

Amostra armazenada apenas em RNA later, adequada

apenas para biomarcadores moleculares.

474 31915 Tursiops truncatus Pele 2 Temperatura

ambiente -80 °C

A



Pág. 53 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018

475 31914 Tursiops truncatus Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C

A



476 31914 Tursiops truncatus Pele 2 Temperatura

ambiente -80 °C

A




ambiente -80 °C A





ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

483 47357 Procellaria aequinoctialis Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A

484 31550 Arctocephalus australis Fígado 2 Congelado -80 °C


pelo projeto.

485 31550 Arctocephalus australis Pele 2 Congelado -80 °C


pelo projeto.

486 30797 Larus dominicanus Fígado 2 Congelado -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

490 32795 Sula leucogaster Fígado 2 Temperatura -80 °C A




amostras Pág.

54 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

ambiente


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

Coletada com material não estéril.


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

504 36346 Calonectris diomedea Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

Identificação do tubo (FAI) em discordância à ficha de

Pág. 55 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018

custódia (SIMBA).


ambiente -80 °C

A Identificação do tubo (FAI) em discordância à ficha de

custódia (SIMBA).


ambiente

-80 °C

A

Identificação no tubo (FAI) em desacordo à identificação na ficha de custódia (SIMBA). Armazenada em microtubo





ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C I

Amostra acondicionada em líquido não identificado




ambiente -80 °C I

Amostra acondicionada em líquido não identificado


ambiente -80 °C I Amostra não foi enviada.

515 29236 Charadrius semipalmatus Fígado 2 Temperatura

ambiente

-80 °C

A




ambiente -80 °C


em desacordo à identificação na ficha de custódia (SIMBA).




amostras Pág.

56 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Armazenada em microtubo NÃO livre de RNases.


ambiente

-80 °C

A




ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

520 46389 Thalasseus acuflavidus Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A



ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

527 30983 0 Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A

528 40299 Larus dominicanus Fígado 2 Congelado -80 °C

I Amostra em código 3 de

decomposição



531 43813 Stenella longirostris Fígado 2 Congelado -80 °C A

Pág. 57 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018

532 43813 Stenella longirostris Pele 2 Congelado -80 °C A

533 30382 Chelonia mydas Fígado 2 Congelado -80 °C A

534 30382 Chelonia mydas Pele 2 Congelado -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA).


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA).

542 34303 Stenella frontalis Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C


custódia (SIMBA).


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA).


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA).


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA).




amostras Pág.

58 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA).


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA).


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA).


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA).


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA).


ambiente -80 °C


custódia (SIMBA).


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


Pág. 59 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018

ambiente


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


A Data de necrópsia difere da data de coleta do animal na

praia.


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A



ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

572 25470 Sterna hirundinacea Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A




amostras Pág.

60 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


578 17222 Sotalia guianensis Pele 2 Refrigerado -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A

590 17601 Spheniscus magellanicus Fígado 2 Temperatura -80 °C A

Pág. 61 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018

ambiente


ambiente -80 °C A

592 21581 Arctocephalus australis Fígado 2 Temperatura

ambiente -80 °C I

Espécie não contemplada pelo projeto

593 21581 Arctocephalus australis Pele 2 Temperatura

ambiente -80 °C I

Espécie não contemplada pelo projeto


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A




ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A




amostras Pág.

62 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018


ambiente -80 °C A

608 18465 Eretmochelys imbricata Fígado 2 Refrigerado -80 °C A

609 18465 Eretmochelys imbricata Pele 2 Refrigerado -80 °C A

610 18466 Arctocephalus australis Fígado 2 Refrigerado -80 °C


pelo projeto

611 18466 Arctocephalus australis Pele 2 Refrigerado -80 °C


pelo projeto


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A


ambiente -80 °C A Espécie não identificada.


ambiente -80 °C A

*A: Adequada para análise de biomarcadores; I: Inadequada para análise de biomarcadores.

Pág. 63 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018

Das 617 amostras coletadas pelas equipes do PMP-BS, 582 estavam

adequadas para análise de biomarcadores, enquanto 35 foram consideradas

inadequadas.

Em relação às amostras coletadas pelo PMC-BS (Tabela II-4), nove foram

consideradas inadequadas para a emissão de laudos. Destas, oito amostras

estavam mal armazenadas nos criotubos e foram encontradas soltas no container

de nitrogênio líquido. Decidiu-se colocá-las agrupadas em um único tubo e utilizá-

las em algumas etapas de padronização.

Tabela II-4 - Caracterização das amostras do PMC-BS recebidas pelo LABCAI para

análise de biomarcadores: número da biópsia, espécie, matriz tecidual da amostra,

método de preservação no LABCAI, condição da amostra e observações.

# Nº da

Biópsia Espécie Matriz

Preservação LABCAI

Cond. amostra

Observações

1 BB 129 Balaenoptera physalus Pele -80 ºC A

2 BM 129 Balaenoptera physalus Pele -80 ºC A



5 BB 131 Stenella clymene Pele -80 ºC A

6 BM 131 Stenella clymene Pele -80 ºC A







13 BB 135 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A

14 BM 135 Megaptera novaeangliae Pele -80 ºC A

15 BB 137 Balaenoptera edeni Pele -80 ºC A

16 BM 137 Balaenoptera edeni Pele -80 ºC A



19 BB 139 Balaenoptera musculus Pele -80 ºC A

20 BM 139 Balaenoptera musculus Pele -80 ºC A

21 BB 140 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A

22 BM 140 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC A





27 BB 143 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A

28 BM 143 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A




amostras Pág.

64 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018










38 BB 152 Balaenoptera bonaerensis

Pele -80 ºC A

39 BM 152 Balaenoptera bonaerensis

Pele -80 ºC A

40 BB 153 Balaenoptera bonaerensis

Pele -80 ºC A

41 BM 153 Balaenoptera bonaerensis

Pele -80 ºC A

42 BB 154 Stenella frontalis Pele -80 ºC A

43 BM 154 Stenella frontalis Pele -80 ºC A





48 BB 165 Pele -80 ºC A Amostra não identificada

49 BM 165 Pele -80 ºC A Amostra não identificada









58 BB 170 Eubalaena australis Pele -80 ºC A

59 BM 170 Eubalaena australis Pele -80 ºC A









68 BB 175 Stenella longirostris Pele -80 ºC A

69 BM 175 Stenella longirostris Pele -80 ºC A

Pág. 65 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018













































114 BB 110 Steno bredanensis Pele -80 ºC A

115 BM 110 Steno bredanensis Pele -80 ºC A




amostras Pág.

66 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018



































150 B 1 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A


152 B 4 Sotalia guianensis Pele -80 ºC I Amostra solta, fora do criotubo





157 B 8D Tursiops truncatus Pele -80 ºC A

Amostra coletada com ponteira reutilizada após ser limpa em álcool e

Pág. 67 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018

fervida em água

158 B 9 Stenella frontalis Pele -80 ºC A

159 B 10 Delphinus capensis Pele -80 ºC A

160 B 11 Delphinus capensis Pele -80 ºC A

Amostra coletada com ponteira reutilizada após ser limpa em álcool e fervida em água











167 B 19 Steno bredanensis Pele -80 ºC A

168 B 20 Stenella longirostris Pele -80 ºC A





171 B 23 Stenella attenuata Pele -80 ºC A


172 B 24 Balaenoptera edeni Pele -80 ºC A





amostras Pág.

68 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

174 B 26 Stenella frontalis Pele -80 ºC I Amostra solta, fora do criotubo

175 B 27 Stenella frontalis Pele -80 ºC I Amostra solta, fora do criotubo



178 B 35 Stenella attenuata Pele -80 ºC A





183 B 39D Stenella frontalis Pele -80 ºC A



186 B 42 Balaenoptera bonaerensis

Pele -80 ºC A


188 B 44 Stenella clymene Pele -80 ºC A

189 B 45 Balaenoptera physalus Pele -80 ºC A


191 B 47 Tursiops truncatus Pele -80 ºC I















205 BB 56 Stenella frontalis Pele -80 ºC I Amostra solta, fora do criotubo



208 BM 58 Tursiops truncatus Pele -80 ºC I Amostra solta, fora do criotubo

209 BB 58 Tursiops truncatus Pele -80 ºC I Amostra solta, fora do criotubo

210 BM 59 Delphinus capensis Pele -80 ºC A

Pág. 69 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018

211 BB 59 Delphinus capensis Pele -80 ºC A

212 BM 60 Delphinus capensis Pele -80 ºC A

213 BB 60 Delphinus capensis Pele -80 ºC A






219 BB 63 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC I Amostra solta, fora do criotubo





224 BM 66 Balaenoptera borealis Pele -80 ºC I Amostra solta, fora do criotubo

























249 BM 80 Globicephala sp. Pele -80 ºC A

250 BB 80 Globicephala sp. Pele -80 ºC A

251 BM 81 Delphinus sp. Pele -80 ºC A

252 BB 81 Delphinus sp. Pele -80 ºC A

253 BM 82 Stenella frontalis Pele -80 ºC A Amostra coletada com ponteira reutilizada após ser




amostras Pág.

70 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

limpa em álcool e fervida em água






























283 BB 191 Physeter macrocephalus Pele -80 ºC A

284 BM 191 Physeter macrocephalus Pele -80 ºC A





289 BB 194 Stenella attenuata Pele -80 ºC A

290 BM 194 Stenella attenuata Pele -80 ºC A






Pág. 71 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018


















































amostras Pág.

72 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018




































377 BB 237 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A Dois tubos



380 BM 238 Tursiops truncatus Pele -80 ºC A Dois tubos








Pág. 73 / 203




______________________




Revisão 01 06/2018




















407 BB 252 Peponocephala electra Pele -80 ºC A

408 BM 252 Peponocephala electra Pele -80 ºC A





























amostras Pág.

74 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018










*A: Adequada para análise de biomarcadores; I: Inadequada para análise de biomarcadores.

Pág. 75 / 203

III. Padronização de Técnicas

de Biomarcadores para

Cetáceos



______________________




Revisão 01 06/2018

III – PADRONIZAÇÃO DE TÉCNICAS PARA ANÁLISE DE

BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM ESPÉCIES DE CETÁCEOS

III.1 – OBTENÇÃO DE AMOSTRAS

Para a padronização de técnicas para análise de biomarcadores bioquímicos

em cetáceos foram utilizadas amostras de fígado e de pele de dois espécimes de

Sotalia guianensis, três espécimes de Stenella frontalis, dez espécimes de

Tursiops truncatus e de dez espécimes de Balaenoptera borealis. As amostras de

S. guianensis e S. frontalis foram coletadas por equipes constituintes de bases

integrantes do PMP-BS, sendo que todas as amostras foram coletadas de

carcaças em estágio de decomposição código 2. Amostras de pele de T.

truncatus e B. borealis foram coletadas pela equipe do PMC-BS. Informações

sobre as amostras utilizadas estão apresentadas na Tabela III-1.

Tabela III-1 - Identificação dos espécimes de cetáceos provenientes do PMP-BS

(necrópsia) e PMC-BS (biópsia) cujas amostras hepáticas e tegumentares foram

utilizadas para padronização das atividades das enzimas glutationa S-transferase (GST)

e etoxiresorufina-O-deetilase (EROD).

Espécie

Identificação no

SIMBA ou código

do PMC-BS

Tecido biológico Origem do material

biológico

Sotalia guianensis 47084 Hepático Necrópsia

Sotalia guianensis 47893 Hepático e Tegumentar Necrópsia

Stenella frontalis 34303 Hepático e Tegumentar Necrópsia

Stenella frontalis 43813 Hepático e Tegumentar Necrópsia

Stenella frontalis 30983 Hepático Necrópsia

Tursiops truncatus B1 Tegumentar Biópsia




Tursiops truncatus BB122 Tegumentar Biópsia






Balaenoptera borealis BB66 Tegumentar Biópsia








Cetáceos

Pág. 76 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018







III.2 – HOMOGENEIZAÇÃO DAS AMOSTRAS

Para a homogeneização das amostras de tecidos hepático e tegumentar de

cetáceos, aproximadamente 150 mg de cada amostra foram homogeneizados em

cinco vezes o volume de tampão de homogeneização Tris-HCl (50 mM Tris-HCl

pH 7,4), contendo 150 mM KCl, 1 mM DTT e 0,5 mM do inibidor de proteases

PMSF. Para amostras provenientes de biópsia, foram utilizados 50 mg de tecido,

em função do pequeno tamanho amostral proveniente de biópsias remotas. Os

tecidos foram homogeneizados com o homogeneizador TissueTearorTM

(BiospecTM). Durante todo o procedimento, as amostras foram mantidas sobre o

gelo.

O homogeneizado foi centrifugado a 9.000 xg por 30 minutos a 4°C, obtendo-

se, assim, a fração citosólica, denominada fração S9. Para a obtenção da fração

microssomal, que corresponde à membrana do retículo endoplasmático, foi

realizada uma segunda centrifugação da fração S9 a 100.000 xg por 60 minutos a

4°C com a ultracentrífuga Hitachi CP100WX. A fração sobrenadante resultante foi

acondicionada em novo microtubo e armazenada em freezer -80°C e a fração

microssomal foi ressuspendida em tampão Tris-HCl (0,1 M, pH 7,4), contendo

1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 M KCl e glicerol 20%. A fração microssomal foi

armazenada em freezer -80°C.

A fração sobrenadante foi utilizada para as etapas subsequentes de

quantificação de proteínas totais citosólicas e padronização da atividade GST,

enquanto a fração microssomal foi utilizada para as etapas subsequentes de

determinação de proteínas totais microssomais e padronização da atividade

EROD.

Pág. 77 / 203



Cetáceos



______________________




Revisão 01 06/2018

III.3 – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS DAS AMOSTRAS

A determinação de proteínas citosólicas e microssomais das amostras foi

realizada por meio do método de Bradford (BRADFORD, 1976). O método utiliza

o corante Coomassie Brilliant Blue (G-250), que reage com os aminoácidos das

proteínas, mostrando uma coloração que varia do tom marrom para o azulado. A

coloração da amostra varia de acordo com a massa de proteínas.

A determinação de proteínas totais foi realizada com o kit Bio-Rad Protein

Assay® (Bio-Rad®) de acordo com instruções do fabricante. Em uma microplaca

com 96 poços foram adicionados, em duplicata, 2,5 ou 5 µL de cada amostra,

diluída em tampão de homogeneização quando necessário,e 200 µL do reagente

de Bradford filtrado. Após incubação de cinco minutos, foi realizada uma leitura

simples das amostras a 595 nm utilizando o espectrofotômetro de placas

SpectraMax® M5 (Molecular Devices®). As absorbâncias das amostras foram

comparadas a uma curva padrão de albumina sérica bovina (BSA) produzida no

mesmo ensaio das amostras. A concentração de proteínas totais nas amostras foi

expressa em mg.mL-1.

III.4 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA

ATIVIDADE GLUTATIONA S-TRANSFERASE (GST)

O princípio do método da atividade GST, descrito por Habig e Jakoby (1976),

está baseado na reação de conjugação do tripeptídeo γ-glutamil-cisteinil-glicina

(GSH) com o substrato hidrofóbico 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB). Essa

reação é catalisada pelas enzimas glutationas S-transferases (GSTs) (Figura

III.4-1). Após a reação, o conjugado GS-DNB é detectado no comprimento de

onda de 340 nm em espectrofotômetro.

A condição de saturação é necessária para a otimização de ensaios

enzimáticos para que não haja uma subestimação da atividade da enzima de

interesse (WILKINSON, 1971).





Cetáceos

Pág. 78 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Figura III.4-1 - Reação de formação do conjugado GS-DNB a partir da reação entre 1-

cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) e glutationa reduzida (GSH), catalisada por glutationa S-

transferase (GST) (Adaptado de Habig; Jakoby, 1981).

Vale ressaltar que o CDNB é um reagente hidrofóbico e precisa ser

previamente solubilizado em etanol para ser adicionado ao meio de reação.

Concentrações crescentes de CDNB requerem, portanto, concentrações também

crescentes de etanol no meio de reação. Ensaios prévios mostraram que, para

atingir a concentração de 5 mM de CDNB, foi necessária a utilização de meio com

aproximadamente 12% etanol.

A utilização de elevadas concentrações de etanol seria muito discrepante dos

5% de etanol utilizado nos ensaios dos idealizadores do método de quantificação

de GST, Keen, Habig e Jakoby (1976) e Habig e Jakoby (1981), e dos ensaios

realizados em diversos outros estudos que fazem referência a esses métodos.

Ainda, Habig e Jakoby (1981) recomendam o uso da menor quantidade possível

de etanol para solubilizar o substrato, pois o etanol pode inibir as reações

enzimáticas.

Além disso, estudos realizados em nosso laboratório mostraram que o uso de

10% de etanol e 2,5 mM de CDNB causam turbidez no meio de reação do ensaio.

Esta turbidez interfere na leitura da absorbância do produto da reação enzimática

(GS-DNB), diminuindo a precisão e repetibilidade das análises. Tais ressalvas

foram consideradas para a realização dos ensaios subsequentes, sendo a

concentração máxima de etanol fixada em 7,5% após ensaios realizados com

tecido hepático de aves marinhas (descrito na seção IV.4).

III.4.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS

A fim de determinar as condições do ensaio GST para tecidos hepático e

tegumentar de cetáceos, foram construídas duas curvas de cinética enzimática

Pág. 79 / 203



Cetáceos



______________________




Revisão 01 06/2018

para GST para cada espécie. As curvas cinéticas foram utilizadas para determinar

os parâmetros cinéticos de velocidade máxima (Vmax) e a constante de

Michaelis-Menten aparente (Kmapp) para os substratos CDNB e GSH.

Vmax é compreendida como a velocidade máxima da enzima nas condições

de total saturação da enzima pelo substrato (> 100 vezes o Km). Já Kmapp, a

constante de Michaelis-Menten, expressa a concentração de substrato na qual a

velocidade da reação corresponde à metade da velocidade máxima. Esses

parâmetros são importantes para a padronização do ensaio GST em cada

espécie de tetrápode.

As curvas de cinética enzimática foram ajustadas ao modelo hiperbólico de

Michaelis-Menten (equação abaixo), utlizando o software Graphpad Prism 5.0®:

Equação: 𝑣𝑜 =(𝑉𝑚𝑎𝑥×[𝑆])

(𝐾𝑚+[𝑆])

Onde,

Vmax = velocidade máxima

Km = Km

[S] = concentração do substrato

vo = velocidade inicial

Os ensaios diferiram entre si quanto à diluição da amostra e concentrações

escolhidas para a composição da curva, conforme apresentado abaixo para as

espécies separadamente. A atividade GST foi calculada por meio da fórmula:

𝑚𝑈.𝑚𝑔𝑝𝑟𝑡−1 = (milli𝐴𝑏𝑠.𝑚𝑖𝑛) × (𝑉𝑜𝑙. 𝑡𝑜𝑡𝑎l)/(𝑉𝑜𝑙. 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎) × (𝑚𝑔. 𝑝𝑟𝑡) × 𝜀

Onde,

mU.mgprt-1 = atividade GST

milliAbs.min = taxa de formação de GS-DNB (ε = 9,6 mM.cm-1) em 340nm

Vol.total = volume total da reação

Vol.amostra = volume da amostra

mg.prt = concentração de proteína em mg.mL-1

ε = coeficiente de extinção molar

Condições de ensaios da atividade GST em tecido hepático de Sotalia

guianensis e Stenella frontalis

Para os ensaios de determinação das condições de ensaio da atividade GST

para tecido hepático de boto cinza, Sotalia guianensis, e de Stenella frontalis,





Cetáceos

Pág. 80 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

foram utilizados ‘pools’ formados a partir de volumes similares de frações

sobrenadantes das amostras homogeneizadas para cada espécie e diluídos 1:5

(v/v) em tampão de homogeneização. A determinação das condições de ensaio

da atividade GST para tecido tegumentar de S. frontalis também foi realizada com

um ‘pool’ das duas amostras homogeneizadas, não diluídas. A determinação das

condições de ensaio da atividade GST para tecido tegumentar de S. guianensis

foi realizada com apenas uma amostra não diluída, representando a totalidade de

amostras desse tecido de S. guianensis provenientes do PMP-BS no momento da

padronização.

Para os tecidos de ambas as espécies, foram realizados dois ensaios para a

determinação das curvas de cinética enzimática de GST: (i) com concentração

fixa de GSH no meio de reação, e (ii) com concentração fixa de CDNB. Para a

primeira situação, foi utilizado 2,5 mM de GSH e concentrações crescentes de

CDNB: 0,0049; 0,0098; 0,0195; 0,0390; 0,0781; 0,156; 0,312; 0,625; 1,25 e 2,5

mM. Na segunda curva de cinética enzimática foi utilizada a concentração 2,5 mM

de CDNB e concentrações crescentes de GSH: 0,009; 0,019; 0,039; 0,078; 0,156;

0,3125; 0,625; 1,25; 2,5; 5 e 10 mM.

Os ensaios de atividade GST foram realizados com concentração final de

etanol de 7,5% para solubilizar o CDNB. Para obtenção do Kmapp e Vmax em

todos os ensaios, as curvas de cinética enzimática com base nas concentrações

de GSH e CDNB foram submetidas à regressão não linear com a equação

hiperbólica de Michaelis-Menten por meio do programa Graphpad Prism 5®.

Condições de ensaios da atividade GST em tecido hepático de Tursiops

truncatus e Balaenoptera borealis

Para os ensaios de determinação das condições de ensaio da atividade GST

para tecido tegumentar de boto-da-tainha, Tursiops truncatus, e de baleia-sei,

Balaenoptera borealis, foram utilizados ‘pools’ de cada espécie, formados a partir

de volumes similares de frações sobrenadantes das dez amostras

homogeneizadas (Tabela III-1). Foram realizados ensaios de atividade GST com

concentração fixa de GSH (2,5 mM) no meio de reação e concentrações

crescentes de CDNB: 0,0024; 0,0049; 0,0098; 0,0195; 0,0390; 0,0781; 0,156;

0,312; 0,625; 1,25 e 2,5 mM. Adicionalmente, uma segunda curva de cinética

enzimática foi construída, utilizando uma concentração fixa de CDNB (2,5 mM) e

Pág. 81 / 203



Cetáceos



______________________




Revisão 01 06/2018

concentrações crescentes de GSH: 0,002; 0,004; 0,009; 0,019; 0,039; 0,078;

0,156; 0,3125; 0,625; 1,25; 2,5 e 5 mM.

Os ensaios de atividade GST foram realizados com concentração final de

etanol de 7,5% para solubilizar o CDNB. Para obtenção do Kmapp e Vmax em

todos os ensaios, as curvas de cinética enzimática com base nas concentrações

de GSH e CDNB foram submetidas à regressão não linear com a equação

hiperbólica de Michaelis-Menten por meio do programa Graphpad Prism 5®.

III.4.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

Concentrações ótimas para o ensaio enzimático podem ser estimadas a partir

dos Km aparentes obtidos para ambas as curvas cinéticas. Wilkinson (1971)

recomenda que para o estabelecimento de condições de ensaio enzimático, o

substrato seja utilizado em concentrações de cinco a 10 vezes o Km.

Vale lembrar que o CDNB é um reagente hidrofóbico e precisa ser

previamente solubilizado em etanol para ser adicionado ao meio de reação.

Concentrações crescentes de CDNB requerem, portanto, concentrações também

crescentes de etanol no meio de reação. Ensaios prévios mostraram que, para

atingir a concentração de 5 mM de CDNB, foi necessária a utilização de meio com

aproximadamente 12% etanol. O resultado dos ensaios de padronização aqui

apresentados indicam como ideal a utilização de CDNB em concentrações de até

33,8 mM, o que exigiria a utilização de quantidades muito elevadas de etanol no

meio de reação.

A utilização dessas concentrações elevadas de etanol seria muito discrepante

dos 5% de etanol utilizado nos ensaios dos idealizadores do método de

quantificação de GST, Keen, Habig e Jakoby (1976) e Habig e Jakoby (1981), e

dos ensaios realizados em diversos outros estudos que fazem referência a esse

método. Ainda, Habig e Jakoby (1981) recomendam o uso da menor quantidade

possível de etanol para solubilizar o substrato, pois o etanol pode inibir as reações

enzimáticas.

Em estudos realizados em nosso laboratório, foi verificado que o uso de

etanol em concentração de 10% causa turbidez no meio de reação do ensaio.

Esta turbidez interfere na leitura da absorbância do produto da reação enzimática

(GS-DNB), diminuindo a precisão e repetibilidade das análises.





Cetáceos

Pág. 82 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Tendo em vista a turbidez no meio de reação com concentrações elevadas de

etanol, a necessidade de comparação dos dados obtidos neste projeto com

àqueles reportados na literatura e o potencial inibitório do etanol, a equipe do

LABCAI não julga pertinente o uso de etanol em ensaios de GST em

concentrações acima de 7,5%. Sendo assim, foram estabelecidas as maiores

concentrações de CDNB possíveis, utilizando 7,5% de etanol.

Com base nas diretrizes supracitadas e nos maiores valores de Km obtidos,

sugere-se, para amostras hepáticas de S. guianensis, a utilização do substrato

CDNB em concentrações de 4,45 a 8,9 mM, enquanto GSH deverá ser utilizada

em concentrações de 2,78 a 5,56 mM.

Para tecido tegumentar de S. guianensis, CDNB deverá ser utilizado em

concentrações de 3,45 a 6,9 mM, e GSH deverá ser utilizado em concentrações

de 5,32 a 10,64 mM (Figuras III.4-2 e III.4-3).

Pág. 83 / 203



Cetáceos



______________________




Revisão 01 06/2018

Figura III.4-2 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Sotalia guianensis construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (A) e glutationa reduzida (GSH) (B). Condições do ensaio: tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. As linhas tracejadas indicam o intervalo de confiança de 95%.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

50

100

150

200

250

Curva cinética de atividade GST hepática de Sotalia guianensis



Vmáx1 = 142,0

Kmapp1= 0,7202

Vmáx2 = 297,8

Kmapp2= 0,8945

A

[CDNB] (mM)

mU

. m

g p

rote

ína

-1

0.0 2.5 5.0 7.5 10.00

100

200

300

400

Curva cinética de atividade GST hepática de Sotalia guianensis



Vmáx1 = 196,4

Kmapp1= 0,4681

Vmáx2 = 333,7

Kmapp2= 0,5562

B

[GSH] (mM)

mU

. m

g p

rote

ína

-1





Cetáceos

Pág. 84 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Figura III.4-3 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido tegumentar de Sotalia guianensis construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (A) e glutationa reduzida (GSH) (B). Condições do ensaio: tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 37°C. Kmapp e Vmax obtidos por meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. As linhas tracejadas indicam o intervalo de confiança de 95%.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

50

100

150

200

250

Curva cinética de atividade GST em pele de Sotalia guianensis

Vmáx1 = 254,7

Kmapp1= 0,6777Sotalia guianensis 2

A

[CDNB] (mM)

mU

. m

g p

rote

ína

-1

0 2 4 6 8 100

100

200

300

Curva cinética de atividade GST em pele de Sotalia guianensis

Vmáx1 = 278,2

Kmapp1= 1,064Sotalia guianensis 2

B

[GSH] (mM)

mU

. m

g p

rote

ína

-1

Pág. 85 / 203



Cetáceos



______________________




Revisão 01 06/2018

Para amostras hepáticas de S. frontalis, o substrato CDNB deverá ser

utilizado em concentrações entre 5,65 e 11,3 mM, e GSH deverá ser utilizado em

concentrações de 3,4 a 6,8 mM (Figuras III.4-4 e III.4-5). Para amostras

tegumentares da mesma espécie, sugere-se a utilização de CDNB em

concentrações de 3,3 a 6,6 mM, e de GSH em concentrações entre 4,8 e 9,6 mM.

Figura III.4-4 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Stenella frontalis

construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-cloro-2,4-

dinitrobenzeno (CDNB) (A) e glutationa reduzida (GSH) (B). Condições do ensaio:




0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

200

400

600

Vmáx1 = 115,4

Kmapp1= 1,108

Curva cinética de atividade GST hepática de Stenella frontalis



Stenella frontalis 1Vmáx2 = 758,9

Kmapp2= 0,9661

Vmáx3 = 826,7

Kmapp3= 1,131

A

[CDNB] (mM)

mU

. m

g p

rote

ína

-1

0 2 4 6 8 100

200

400

600

800

1000

Vmáx1 = 115,4

Kmapp1= 0,428

Curva cinética de atividade GST hepática de Stenella frontalis




Kmapp2= 0,6338

Vmáx3 = 954,9

Kmapp3= 0,6804

B

[GSH] (mM)

mU

. m

g p

rote

ína

-1





Cetáceos

Pág. 86 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Figura III.4-5 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido tegumentar de Stenella






Para T. truncatus foram realizados ensaios de padronização apenas em

tecido tegumentar. Os resultados obtidos indicam que o substrato CDNB deverá

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

20

40

60

80

100

Curva cinética de atividade GST na pele de Stenella frontalis



Kmapp1= 0,6639

Vmáx2 = 109,9

Kmapp2= 0,5805

A

[CDNB] (mM)

mU

. m

g p

rote

ína

-1

0 2 4 6 8 100

50

100

150

200

Curva cinética de atividade GST na pele de Stenella frontalis



Kmapp1= 0,3952

Vmáx2 = 188,4

Kmapp2= 0,9692

B

[GSH] (mM)

mU

. m

g p

rote

ína

-1

Pág. 87 / 203



Cetáceos



______________________




Revisão 01 06/2018

ser utilizado em concentrações entre 12,45 e 24,9 mM, enquanto o substrato

GSH deverá ser utilizado em concentrações de 3,48 a 6,97 mM (Figura III.4-6).

Figura III.4-6 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido tegumentar de Tursiops

truncatus construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos (A) 1-

cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) e glutationa reduzida (GSH) (B). Condições do ensaio:




0 1 2 3 4 50

100

200

300

400

Curva cinética de atividade GST na pelede Tursiops truncatus

Vmáx1 = 222,4

Kmapp1= 0,6978

[GSH] (mM)

mU

. m

g p

rote

ína

-1

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

50

100

150

200

250

Curva cinética de atividade GST na pelede Tursiops truncatus

Vmáx1 = 407,0

Kmapp1= 2,49

[CDNB] (mM)

mU

. m

g p

rote

ína

-1A

B





Cetáceos

Pág. 88 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Para B. borealis foram realizados ensaios de padronização apenas em tecido

tegumentar. Os resultados indicam a utilização de CDNB em concentrações de

16,9 a 33,8 mM e GSH em concentrações de 2,8 a 5,6 mM (Figura III.4-7).

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

50

100

150

200

Curva cinética de atividade GST em pelede Balaenoptera borealis

Vmáx1 = 407

Kmapp1= 3,38

[CDNB] (mM)

mU

. m

g p

rote

ína

-1

0 1 2 3 4 50

50

100

150

200

Curva cinética de atividade GST em pelede Balaenoptera borealis

Vmáx1 = 191,1

Kmapp1= 0,56

[GSH] (mM)

mU

. m

g p

rote

ína

-1

A

B

Figura III.4-7 - Curvas cinéticas de atividade GST em epiderme de Balaenoptera borealis

construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-cloro-2,4-

dinitrobenzeno (CDNB) (A) e glutationa reduzida (GSH) (B). Condições do ensaio:




Pág. 89 / 203



Cetáceos



______________________




Revisão 01 06/2018

De acordo com os resultados obtidos para atividade GST em cetáceos e

considerando a limitação da solubilidade de CDNB no meio de reação, foi

estabelecida a concentração de 5 mM para GSH e 2,5 mM para CDNB.

Portanto, para os ensaios futuros visando a determinação da atividade GST

em cetáceos das espécies S. guianensis, S. frontalis, T. truncatus e B. borealis,

serão utilizadas as seguintes condições metodológicas:

Tampão fosfato de potássio: 0,1 M, pH 7,0

GSH: 5 mM

CDNB: 2,5 mM

Etanol: 7,5%

Temperatura: 37°C

Além da determinação de condições ideais para futuros ensaios com

amostras de cetáceos, a padronização aqui apresentada também permitiu

observar que a Vmax de GST no tecido hepático de ambos os espécimes de S.

guianensis e dos três espécimes de S. frontalis são maiores do que aqueles

observados em tecido hepático de outros cetáceos odontocetos, como Kogia spp.

e T. truncatus (CANTÚ-MEDELLIN et al., 2011) (Tabela III-4). Similarmente, a

Vmax de GST em tecido tegumentar de ambos os indivíduos de T. truncatus e B.

borealis foi maior que o encontrado para outros mamíferos. Esta diferença pode

estar relacionada à otimização dos ensaios realizados neste estudo,

principalmente em relação às concentrações dos substratos, permitindo, portanto,

uma análise mais robusta da atividade GST nas espécies de cetáceos testadas

(Tabela III-4). Ainda, tais diferenças também podem ser atribuídas a variações

entre espécies, ou em decorrência de características individuais, tais como idade,

sexo, exposição aos xenobióticos, patologias, grau de decomposição, dentre

outros fatores.

Vale ressaltar que as diferenças na Vmax serão, ao longo do projeto,

correlacionadas com os níveis de contaminantes orgânicos quantificados no

tecido de cada indivíduo analisado, mas a presença de correlação não significa

que os xenobióticos sejam o único fator influenciando a atividade GST. Além

disso, a presença de correlação estatística não indica necessariamente a

presença de relação causal direta (causation) entre os fatores (i.e. contaminantes

e atividade GST) em nível biológico.





Cetáceos

Pág. 90 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Dados da literatura apontam que concentrações elevadas de hidrocarbonetos

policíclicos aromáticos e contaminantes organoclorados afetam a atividade GST

em invertebrados marinhos (LÜCHMANN et al., 2011). Outros fatores, como sexo,

idade e condições ambientais, como temperatura, também podem influenciar a

atividade enzimática em fígado de peixes (BASTOS et al., 2013) e ratos

(GUSTAFSSON et al., 1983). Em cetáceos, Nash et al. (2014) verificaram

variações da atividade GST na pele de baleias jubarte em decorrência do estágio

reprodutivo, no qual animais em jejum nas áreas reprodutivas apresentaram

atividade mais baixa da enzima. Entretanto, a influência destas variáveis sobre a

atividade de GST ainda é pouco explorada em tetrápodes marinhos.

III.5 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA

ATIVIDADE ETOXIRESORUFINA-O-DEETILASE (EROD)

III.5.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS

A determinação de atividade EROD foi realizada no espectrofluorímetro

SpectraMax® M5 (Molecular Devices®), utilizando microplacas pretas (Perkin

Elmer). Resumidamente, as amostras foram adicionadas nos poços, ajustando-se

o volume final com tampão de microssoma, se necessário. As amostras foram

incubadas com 70 µL de 7-etoxiresorufina (7-ER) por 10 minutos a 37ºC (WHITE

et al., 1994; CHANG, WAXMAN, 2006; WANWIMOLRUK, WANWIMOLRUK,

2006). Após a incubação, NADPH foi adicionado em cada poço para iniciar a

reação. O protocolo foi adaptado de Burke e Mayer (1974). O par de excitação e

emissão (ex/em) foi ajustado para 530nm/585nm com filtro (cutoff) em 550 nm e

fotomultiplicador ligado no máximo (high) para otimizar a detecção de resorufina.

Foram realizadas 20 leituras por poço em cada intervalo de tempo de 30 s. A

reação foi monitorada por 600 s e o coeficiente angular da reta RFU.min-1 foi

utilizado para o cálculo da atividade enzimática.

Uma curva padrão com resorufina foi utilizada para converter a fluorescência

(RFU) em picomoles de resorufina. A atividade foi expressa em picomoles de

resorufina formada por minuto por massa de proteína (pmol.min-1.mgprt-1), usando

a seguinte fórmula:

Pág. 91 / 203



Cetáceos



______________________




Revisão 01 06/2018

Atividade EROD = (𝑹𝑭𝑼×𝒎𝒊𝒏−𝟏)×(𝒄𝒐𝒆𝒇.𝒓𝒆𝒔𝒐𝒓𝒖𝒇𝒊𝒏𝒂)

𝒎𝒈𝒑𝒓𝒐𝒕𝒆í𝒏𝒂

Apesar de seguirem o mesmo procedimento analítico, as padronizações para

amostras hepáticas e tegumentares de Sotalia guianensis e Stenella frontalis

foram distintas das realizadas para Balaenoptera borealis e Tursiops truncatus,

conforme segue.

Condições de ensaios da atividade EROD em tecidos hepático e

tegumentar de Sotalia guianensis e Stenella frontalis

Devido à restrição de quantidade de amostra, as determinações das

condições do ensaio EROD para tecidos hepático e tegumentar de Stenella

frontalis e Sotalia guianensis foram realizadas com ‘pool’ das amostras

homogeneizadas para cada espécie.

Primeiramente, a fim de avaliar o efeito da coenzima NADPH, foram

realizadas análises utilizando uma concentração fixa de 7-etoxiresorufina (7-ER)

(2 µM) e concentrações crescentes de NADPH: 0,25; 0,5; 1 e 2 mM. Esse teste

apenas foi realizado para o ‘pool’ de amostras hepáticas devido à restrição de

volume de microssoma tegumentar. Nas situações em que houve restrição da

quantidade de amostra, foi priorizada a curva cinética do substrato 7-

etoxiresorufina (7-ER).

Para a determinação dos parâmetros Vmax e Kmapp para o substrato 7-ER

foram realizados ensaios de atividade EROD para todos os ‘pools’ de ambas as

espécies com concentração fixa de NADPH (1 mM) e concentrações crescentes

de 7-ER: 0,0078; 0,0156; 0,0312; 0,0625; 0,125; 0,25; 0,5; 1; 2; 4 e 8 µM. A curva

de cinética enzimática foi avaliada por meio de regressão não linear com as

equações de Michaelis-Menten e do modelo de inibição por substrato (equações

abaixo), usando o programa Graphpad Prism 5®.

Equação de Michaelis-Menten: 𝑣𝑜 =(𝑉𝑚𝑎𝑥×[𝑆])

(𝐾𝑚+[𝑆])

Onde,






Cetáceos

Pág. 92 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Km = Km



Equação de inibição por substrato: 𝑣𝑜 =(𝑉𝑚𝑎𝑥×[𝑆])

𝐾𝑚+([𝑆]×(1+[𝑆]

𝐾𝑖))

Onde,


Km = Km


Ki = constante de inibição


No caso de inibição de uma enzima pelo substrato, a padronização do

método com concentrações do substrato iguais a 100, 50, 10 ou 5 vezes o Km da

enzima deve ser aplicada com cautela, pois, dependendo da concentração do

substrato, o método será padronizado em uma concentração inibitória para a

enzima (BISSWANGER, 2011; 2014).

Não foi detectada atividade EROD nas amostras de pele de S. frontalis e S.

guianensis. Portanto, não foram realizadas curvas cinéticas para 7-ER nem

ensaios com diferentes concentrações de NADPH em pele destas espécies de

cetáceos.

Condições de ensaios da atividade EROD em tecido tegumentar de

Tursiops truncatus e Balaenoptera borealis

Devido à restrição de quantidade de amostra, a determinação das condições

do ensaio EROD em microssoma de tecido tegumentar de Tursiops truncatus e

Balaenoptera borealis foi realizada em um ‘pool’ das 10 amostras

homogeneizadas para cada espécie. O ‘pool’ era formado por volumes

equivalentes de cada amostra homogeneizada.

Primeiramente foi realizado um teste a fim de identificar a ocorrência de

atividade EROD em tecido tegumentar destas espécies. Nesse teste foram

utilizadas as seguintes condições para a análise EROD: 2 µM do substrato 7-

etoxiresorufina (7-ER) e 1 mM de NADPH, pH 7,4, a 37ºC.

Pág. 93 / 203



Cetáceos



______________________




Revisão 01 06/2018



Elmer) similarmente ao processo descrito para amostras de Sotalia guianensis e

Stenella frontalis. Entretanto, foram utilizados 60 µg de proteína microssomal do

‘pool’ de amostras.

Não foi detectada atividade EROD nas amostras de pele de B. borealis e

de T. truncatus. Portanto, não foram realizadas curvas cinéticas para 7-ER

nem ensaios com diferentes concentrações de NADPH em tecido

tegumentar destas espécies.

III.5.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

Não foi detectada atividade EROD em tecido tegumentar de Sotalia

guianensis, Stenella frontalis, Balaenoptera borealis e Tursiops truncatus (Figura

III.5-1). Logo, os resultados e recomendações de ensaio abaixo descritas

referem-se apenas ao tecido hepático de S. guianenis e S. frontalis.





Cetáceos

Pág. 94 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Figura III.5-1 - A. Atividade EROD em tecido hepático de tainha (Mugil liza) exposta a

dispersantes de petróleo, conforme observada no software SpectraMax® M5 (Molecular

Devices®), para fins de comparação com B. Atividade EROD em tecido tegumentar de

golfinho pintado do Atlântico (Stenella frontalis), em duplicata, conforme observada no

software SpectraMax® M5 (Molecular Devices®). Linhas em duplicata mais abaixo em ‘B’

representam o “Branco”, sem adição de amostra.

Para a curva cinética de 7-ER de S. guinaneis e S. frontalis foi possível

identificar uma diminuição da atividade da enzima a partir de determinadas

concentrações de substrato (Figuras III.5-2A e III.5-3A). Embora usualmente

ajustados para modelos clássicos de Michaelis-Menten, a atividade EROD em

tecido hepático de cetáceos adequou-se melhor a um modelo de inibição por

substrato. Modelos de inibição por substrato já foram aplicados a diversos

membros da família de citocromos P450, tais como reportado por Lin et al. (2001),

Pág. 95 / 203



Cetáceos



______________________




Revisão 01 06/2018

que identificaram inibição da atividade EROD de CYP1A2 humano quando em

concentrações do substrato 7-ER acima de 8 µM.

Para determinar o Kmapp em casos de inibição por substrato, Stromme e

Theodorsen (1976) propuseram a utilização de gráficos duplo-recíprocos de

Lineweaver-Burk. Tais gráficos linearizam dados enzimáticos, facilitando a

identificação do ponto no eixo X, referente à concentração do 1/[substrato], em

que a relação 1/[substrato] versus 1/V inverte-se, ou seja, referente ao momento

no qual o incremento de substrato reflete em um decréscimo da atividade

enzimática. Este ponto refere-se à determinada concentração do substrato em

questão, sendo que as condições ideais do ensaio devem utilizar concentrações

abaixo desta. O modelo matemático foi escolhido para evitar o uso de

concentrações inibitórias do substrato.

Concernente ao ensaio com concentrações crescentes de NADPH, os

resultados mostraram que não há diferença aparente de atividade EROD hepática

entre os ensaios realizados com concentrações de 0,25, 0,5, 1 e 2 mM de NADPH

(Figura III.5-2B) em amostras hepáticas de S. guianensis. Dessa forma, a

concentração final de 0,5 mM de NADPH será adotada em futuros ensaios

visando minimizar a utilização de NADPH, mas mantendo a linearidade da

reação.

Para a curva cinética de EROD hepática de S. guianensis em função de 7-ER,

a inversão na relação V versus V/[7-ER] ocorre quando a concentração V/[7-ER] é

próxima a 619, referente ao ponto de 2 µM de 7-ER (Figura III.5-2A - ‘inset’).

Tendo em vista o exposto, sugere-se o uso de concentrações de 7-ER abaixo de

2 µM para o ensaio EROD em tecido hepático de boto cinza S. guianensis.





Cetáceos

Pág. 96 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Figura III.5-2 - A. Curva cinética de atividade EROD em tecido hepático de Sotalia

guianensis construída com concentrações crescentes do substrato enzimático 7-

etoxiresorufina (7-ER), sendo Kmapp e Vmax obtidas por meio de regressão não linear

dos dados ajustados ao modelo de Inibição por substrato. Linhas hachuradas indicam o

intervalo de confiança de 95%. Média±DP com base em réplicas técnicas. ‘Inset’ –

Gráfico de Eadie-Hofstee da curva cinética. A Vmax calculada pelo programa é a Vmax

prevista na ausência de inibição por substrato. B. Efeito de diferentes concentrações de

NADPH na atividade EROD.

0 2 4 6 8 100

500

1000

1500

Vmáx = 3718,0 1018,0

Kmapp= 2,133 0,79

Ki = 2,39 0,96

Atividade EROD em diferentes concentrações de 7-ER

[7-ER] (M)

fmo

l.m

in-1

. m

g p

rote

ina

-1

0 500 1000 1500 2000 25000

500

1000

1500

[V/Substrate]

V

Atividade EROD - S. guianensis

0,25

mM

0,5

mM

1 m

M

2 m

M

0.0

0.5

1.0

1.5

[NADPH] (mM)

pm

ol.

min

-1.

mg

pro

tein

a-1

B

A

Pág. 97 / 203



Cetáceos



______________________




Revisão 01 06/2018

Para amostras hepáticas de S. frontalis, os resultados do ensaio com NADPH

mostraram menor atividade EROD quando utilizado NADPH na concentração de

0,25 mM. Por outro lado, a atividade se manteve estável entre os ensaios que

utilizaram de 0,5 a 1 mM de NADPH (Figura III.5-3B). Dessa forma, a

concentração final de 1 mM de NADPH será adotada em futuros ensaios para

manter a linearidade da reação por um período mais longo, garantindo a

qualidade analítica quando for necessário avaliar um grande número de amostras

simultaneamente.

Paralelamente, o gráfico linearizado de Eadie-Hofstee construído para curva

cinética de EROD no golfinho pintado do Atlântico, S. frontalis (Figura III.5-3A -

‘inset’) permitiu identificar que a inversão na relação V versus V/[7-ER] ocorre

quando concentração V/[7-ER] é próxima a 2138, referente ao ponto de 2 µM de

7-ER. Considerando o exposto, sugere-se o uso de concentrações de 7-ER

abaixo de 2 µM para o ensaio EROD em tecido hepático de S. frontalis.

Por fim, com base nos resultados obtidos, as condições de ensaio da enzima

EROD em fígado de S. guianensis e S. frontalis em estudos futuros serão:

S. guianensis:

* 20 µg de proteína microssomal em tampão Tris/NaCl (50 mM/0,1M, pH 7,4)

* 1 µM de 7-ER

* 0,5 mM de NADPH

* Temperatura de 37ºC

S. frontalis:


* 1 µM de 7-ER

* 1 mM de NADPH






Cetáceos

Pág. 98 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Figura III.5-3 - A. Curva cinética de atividade EROD em tecido hepático de Stenella

frontalis construída com concentrações crescentes do substrato enzimático 7-

etoxiresorufina (7-ER), sendo Kmapp e Vmax obtidas por meio de regressão não linear

dos dados ajustados ao modelo de Inibição por substrato, linhas pontilhadas indicam o

intervalo de confiança de 95%. Média±DP com base em réplicas técnicas. ‘Inset’ –

Gráfico de Eadie-Hofstee da curva cinética. A Vmax calculada pelo programa é a Vmax

estimado na ausência de inibição por substrato. B. Efeito de diferentes concentrações de

NADPH na atividade EROD.

0 2 4 6 8 100

1000

2000

3000

4000

5000

Vmáx = 8020,0 1221,0

Kmapp= 0,548 0,14

Ki = 2,6 0,72


[7-ER] (M)

fmo

l.m

in-1

. m

g p

rote

ina

-1

0 10000 20000 30000 400000

1000

2000

3000

4000

5000

[V/Substrate]

V m

ax

Atividade EROD - S. frontalis

0,25

mM

0,5

mM

1 m

M

2 m

M

0

1

2

3

4

5

[NADPH] (mM)

pm

ol.

min

-1.

mg

pro

tein

a-1

B

A

Pág. 99 / 203



Cetáceos



______________________




Revisão 01 06/2018

Nestes testes foi possível identificar os valores de Vmax para atividade EROD

em tecido hepático de S. guinanesis (3,72 pmol.min-1.mgprt-1) e S. frontalis (8,02

pmol.min-1.mgprt-1). Os valores de Vmax para ambas as espécies são, em geral,

menores que aqueles descritos para outras espécies de odontocetos e misticetos

(vide Tabela III-5). No entanto, apesar de alguns trabalhos indicarem atividade

EROD mais alta que as amostras do PMP-BS em amostras de cetáceos (WHITE

et al., 2000; BOON, LEWIS, GOKSOYR, 2001; MCKINNEY et al., 2004), a

ausência de detecção da atividade EROD em amostra tegumentar já foi descrita

para misticetos (NASH et al., 2014), enquanto outros trabalhos mostraram uma

baixa atividade EROD mesmo em tecido hepático (BOON, LEWIS, GOKSOYR,

2001; GARRICK et al., 2006).

É possível que a reduzida atividade hepática observada tanto para S.

guianensis quanto para S. frontalis seja consequência do tempo decorrido após a

morte do animal de até 24 horas. Alguns estudos citados no presente relatório

utilizaram amostras coletadas imediatamente após a morte, como é o caso de

amostras provenientes de animais abatidos para subsistência pela população

Inuit, localizada na região ártica do Canadá (WHITE et al., 1994), ou, mais

frequentemente, de amostras teciduais de animais encalhados vivos (Tabela III-

5).

No entanto, é possível que a atividade EROD seja constitutivamente baixa em

cetáceos, especialmente na pele, visto que as amostras desse tecido de T.

truncatus e B. borealis foram coletadas por meio de biópsia remota de animais

vivos.

III.6 – RESUMO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO PARA ANÁLISE DE

BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS PARA CETÁCEOS

As condições ótimas para realização de futuros ensaios com tecido de

cetáceos encontram-se sumarizadas nas tabelas abaixo. Todas as condições

apresentadas foram determinadas com base nos ensaios realizados durante a

etapa de padronização do presente projeto. A atividade EROD em cetáceos foi

determinada apenas no fígado de animais provenientes do PMP-BS (animais

mortos). Como não foi possível padronizar a técnica de quantificação da atividade

EROD na pele dos cetáceos, serão realizadas análises desta atividade neste

tecido adotando-se a técnica padronizada para o fígado.





Cetáceos

Pág. 100 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Tabela III-2 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade glutationa S-

transferase (GST) em amostras de cetáceos.

Espécie Atividade GST

Tampão [GSH]

mM [CDNB]

mM Temperatura Tecido

Condições de preservação

Stenella frontalis

Fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0)

5 2,5 37 °C Pele e Fígado Freezer -80 °C

Sotalia guianensis


5 2,5 37 °C Pele e Fígado Freezer -80 °C

Tursiops truncatus


5 2,5 37 °C Pele Freezer -80 °C

Balaenoptera borealis


5 2,5 37 °C Pele Freezer -80 °C

Tabela III-3 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade etoxiresorufina-

O-deetilase (EROD) em amostras de cetáceos.

Espécie Atividade EROD

Tampão [7-ER]

µM [NADPH]



Stenella frontalis

TRIS/NaCl (50 mM/0,1 M, pH

7,4) 1 1 37 °C Fígado Freezer -80 °C

Sotalia guianensis


7,4) 1 0,5 37 °C Fígado Freezer -80 °C

Tursiops truncatus

ND Pele Freezer -80 °C


ND Pele Freezer -80 °C

ND: Não detectada.

III.7 – BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM CETÁCEOS:

COMPARAÇÃO COM OS DADOS DA LITERATURA

A tabela comparativa (Tabela III-4) mostra que as atividades GST de

cetáceos odontocetos analisados neste estudo são maiores que aquelas

observadas em outros odontocetos. Os resultados de atividade GST de

Pág. 101 / 203



Cetáceos



______________________




Revisão 01 06/2018

Balaenoptera borealis obtidos neste estudo são similares aos valores observados

em fígado para outros balaenopterídeos (Tabela III-4).





Cetáceos

Pág. 102 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Tabela III-4 - Comparação de dados de atividade glutationa S-transferase (GST) obtidos durante a padronização deste projeto com aqueles reportados em

outros estudos realizados em mamíferos marinhos.

ESPÉCIE TECIDO ORIGEM DA AMOSTRA

CONDIÇÃO DA AMOSTRA

[GSH] [CDNB] TEMPERATURA DO ENSAIO

Km (mM) VMAX

(mU*.mgprt-1) REFERÊNCIA

Tursiops truncatus

Pele Biópsia Fresca 0,002 – 5 mM

0,002 – 2,5 mM

37 °C

GSH: 0,69 GSH: 222,4

Este trabalho

CDNB: 2,49 CDNB: 407

Fígado Necrópsia

< 2 h post mortem

1 mM 0,2 mM 25 °C - 21,57*10³± 8,7*10³ Cantú-medellín et al., 2011

Stenella frontalis

Pele Necrópsia Código 2 0,009 – 10 mM

0,004 – 2,5 mM

37 °C

GSH: 0,96 GSH: 137±71

Este trabalho

CDNB: 0,66 CDNB: 106±4

Fígado Necrópsia Código 2

0,009 – 10 mM

0,004 – 2,5 mM

37 °C

GSH: 0,68 GSH: 669±480

Este trabalho

CDNB: 1,13 CDNB: 567±392

Sotalia guianensis

Pele Necrópsia Código 2 0,009 – 10 mM

0,004 – 2,5 mM

37 °C

GSH: 1,06 GSH: 278

Este trabalho


Fígado Necrópsia Código 2

0,009 – 10 mM

0,004 – 2,5 mM

37 °C

GSH: 0,55 GSH: 265±97

Este trabalho

CDNB: 0,89 CDNB: 219±110

Pág. 103 / 203



Cetáceos



______________________




Revisão 02 06/2018

Kogia sp. Fígado Necrópsia < 2 h post mortem

1 mM 0,2 mM 25 °C - 19,98*10³±

7,86*10³ Cantú-medellín et al., 2011


Pele Biópsia Fresca 0,002 – 5 mM

0,002 – 2,5 mM

37 °C

GSH: 0,56 GSH: 191,1

Este trabalho


Balaenoptera acutorostrata

Fígado Necrópsia Coletada

imediatamente após a morte

- - - - Feto: 102±24

Adulto: 985±287 Goksoyr et al., 1988

Megaptera noveangliae

Pele Biópsia Fresca 1 mM 1 mM 25 °C - 31,35*10³ Nash et al., 2014

Phoca hispida

Fígado Necrópsia < 5 min post

mortem 1 mM 1 mM 25 °C -

Machos: 395±40

Wolkers et al., 1998

Fêmeas: 332±77

Fígado Necrópsia

Coletada imediatamente após a morte

25 μM 2,5 mM 25 °C - 45*10³ Routti et al., 2008

Phoca vitulina

Fígado Necrópsia Coletada


1 mM 1 mM 25 °C - 323,4±51,7 Ruus et al., 2002

* Nenhuma amostra foi submetida a tratamento químico ou farmacológico.





Cetáceos

Pág. 104 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Tabela III-5 - Comparação de dados de atividade etoxiresorufina-O-deetilase (EROD) oriundos da padronização do presente projeto com aqueles reportados em

outros estudos realizados com mamíferos marinhos.


CONDIÇÃO DA

AMOSTRA TRATAMENTO [7-ER] [NADPH]

TEMPERATURA DO ENSAIO

Km (μM) VMAX

(pmol.mgprt-1. min-1)

REFERÊNCIA

Tursiops truncatus

Cultura celular

Biópsia Cultura celular

BNF A 0,01 - 10 μM E TCDD A 0,01 – 30 nM

2,67 μM - - - 3,6 – 15,1 Garrick et al.,

2006

Pele Biópsia Fresca NÃO 2 μM 1 mM 37 °C - ND Este trabalho

Sotalia guianensis

Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 0 - 8 μM 1 mM 37 °C 2,1 μM 3,72 Este trabalho

Stenella frontalis

Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 0 - 8 μM 1 mM 37 °C 0,548 μM 8,02 Este trabalho

Pele Necrópsia Código 2 NÃO 2 μM 1 mM 37 °C - ND Este trabalho

Delphinapterus leucas

Fígado Necrópsia

Coletada imediatament

e após a morte

NÃO 2 μM 0,5 mM 37 °C -

Fêmeas: 97±84:

White et al., 1994

Machos: 413±263

Fígado Necrópsia


e após a morte

NÃO 2 μM 0,5 mM 37 °C - Machos: 563 White et al., 2000

Pág. 105 / 203



Cetáceos



______________________




Revisão 02 06/2018

Fígado Necrópsia


e após a morte

NÃO 2 μM 0,5 mM 37 °C - ND-260 McKinney et al.,

2004

Globicephala melas

Fígado Necrópsia


e após a morte

NÃO 2 μM 0,5 mM 37 °C - 67 White et al., 2000

Physeter macrocephalus

Fígado Necrópsia Até 18 h post

mortem NÃO 0,88 μM 2 mM 20 °C - 20±7 Boon et al., 2001

Lagenorhyncus albirostris


mortem NÃO 0,88 μM 2 mM 20 °C - 9 Boon et al., 2001

Lagenorhyncus acutus


mortem NÃO 5 μM 1,67 mM 25 °C -

Machos: 65±34 Wilson et al.,

2010 Fêmeas: 102±116

Phocoena phocoena


mortem NÃO 0,88 μM 2 mM 37 °C - 417 Boon et al., 2001


Fígado Necrópsia


e após a morte

NÃO 2 μM 0,5 mM 37 °C - 2180 Goksoyr et al.,

1986

Pele Biópsia Fresca NÃO 2 μM 1 mM 37 °C - ND Este trabalho





Cetáceos

Pág. 106 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Megaptera noveangliae

Pele Biópsia Fresca NÃO 200 μM

37 °C - ND - 73 Nash et al., 2014

Phoca vitulina Fígado Necrópsia Até 2 h post

mortem NÃO 1 μM 5 mM 37 °C - 2460 Boon et al., 1994

Fígado Necrópsia - NÃO 1 μM - -

Baltic Sea: 0,12

Baltic Sea: 1191 Nyman et al.,

2000 Canada: 0,16

Canada: 95


mortem NÃO 0,5 μM 0,2 mM - 9600

Troisi e Mason, 1997

Fígado Necrópsia


e após a morte

NÃO 2,5 μM - 33 °C 0,72 37±24 Addison et al.,

1986

Fígado Necrópsia


e após a morte

NÃO 1,6 μM 0,06 mM 25 °C - 323,4 Ruus et al., 2002

Pusa hispida Fígado Necrópsia


e após a morte

NÃO 2,08 μM

Sistema de

regeneração de NADPH

37 °C -

Machos: 172

Wolkers et al., 1998

Fêmeas: 154

Juvenis: 65

Fígado Biópsia Fresca BNF A 50

mg.quilo-1.dia-1 2,08 μM 2 mM 37 °C -

Controle: 30,8±2,4

Miller et al., 2005

Pág. 107 / 203



Cetáceos



______________________




Revisão 02 06/2018

Tratado: 37,2±6,6

Pele Biópsia Fresca

BNF A 50 mg.quilo-1.dia-1

2,08 μM 2 mM 37 °C -

Controle: 2,1±0,1

Miller et al., 2005

Tratado: 1,8




de Biomarcadores

bioquímicos em Cetáceos

Pág. 108 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

A otimização dos ensaios realizados neste estudo, referente às

concentrações de substrato e temperatura, permitiu uma análise mais robusta da

atividade GST em amostras de cetáceos, o que pode explicar a diferença em

relação aos dados da literatura. No entanto, é possível também que as diferenças

observadas sejam relacionadas à variação interindividual decorrente de

características intrínsecas ao organismo, como sexo, idade, ou, ainda, devidas à

exposição a determinadas condições ambientais ou alterações em função do

tempo post-mortem, como no caso de animais provenientes do PMP-BS.

A atividade EROD observada nos cetáceos analisados na presente

padronização foram menores que aquelas descritas para outras espécies de

odontocetos e misticetos. Em biópsias do tecido tegumentar de cetáceos

coletados no PMC, não foi detectada atividade. Os resultados obtidos podem

estar associados a características espécie-específicas e/ou tecido-específicas. A

padronização em tecido hepático de necrópsias do PMP-BS permitiu obter dados

essenciais relacionadas às concentrações potencialmente inibitórias do substrato

7-ER, que variam entre as espécies de tetrápodes. Este é um dado de alta

relevância, visto que concentrações mais elevadas de substrato podem inibir a

atividade EROD em cetáceos, gerando valores inferiores à real estimativa de

atividade do espécime. A técnica padronizada em tecido hepático poderá ser

utilizada para quantificar a atividade EROD em pele de espécimes coletados no

PMC.

É importante ressaltar, ainda, que o esforço de padronização neste estudo

representa, per se, um importante incremento aos dados disponíveis na literatura

mundial para parâmetros enzimáticos de GST e EROD em cetáceos. Os dados

inéditos gerados para os odontocetos T. truncatus, S. frontalis, S. guianensis e o

misticeto B. borealis são, portanto, ferramentas de grande valia para programas

de biomonitoramento ambiental em regiões com ocorrência das espécies

supracitadas. Deve-se ter cautela ao avaliar animais provenientes do PMP-BS,

pois o estágio de decomposição do animal pode afetar os resultados dos

biomarcadores. Os biomarcadores avaliados neste estudo são enzimas

(proteínas) e, portanto, suscetíveis à degradação microbiológica e por proteases

endógenas liberadas no processo de decomposição do animal. A causa mortis

também é um importante fator, pois doenças que afetam o metabolismo hepático

ou infecções sistêmicas também podem afetar a resposta dos biomarcadores.

Pág. 109 / 203

IV. Padronização de

Técnicas de Biomarcadores

para Aves



______________________




Revisão 02 06/2018

IV – PADRONIZAÇÃO DE TÉCNICAS PARA ANÁLISE DE

BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM AVES MARINHAS

IV.1 – OBTENÇÃO DE AMOSTRAS


em aves marinhas foram utilizadas duas amostras de fígado de Larus

dominicanus e dez amostras de fígado de Spheniscus magellanicus. As amostras

de ambas as espécies foram coletadas pelas equipes das bases integrantes do

PMP-BS.

A amostra de L. dominicanus 026450 foi utilizada para padronização da

atividade de GST nesta espécie, bem como para o teste de inbição por etanol. A

amostra R3A002635 foi utilizada para padronização de atividade EROD.

Dentre as amostras de S. magellanicus, 017599, 017600 e 017533 foram

utilizadas para padronização de GST. As demais foram utilizadas para a

padronização de atividade EROD.

Informações sobre as amostras estão apresentadas na Tabela IV-1.

Tabela IV-1 - Identificação dos espécimes de aves marinhas provenientes do PMP-BS

cujas amostras hepáticas foram utilizadas para padronização da atividade glutationa S-


Espécie Identificação

no SIMBA

Tecido

biológico Situação da carcaça

Larus dominicanus 026450 Hepático Código 2 de decomposição

Larus dominicanus R3A002635 Hepático Fresca - eutanasiado

Spheniscus magellanicus 017599 Hepático Código 2 de decomposição















bioquímicos para Aves

Pág. 110 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

IV.2 – HOMOGENEIZAÇÃO DAS AMOSTRAS

Para obtenção das frações citosólica e microssomal, o tecido hepático dos

espécimes de Larus dominicanus e Spheniscus magellanicus foi descongelado

sobre o gelo e pesado individualmente. Aproximadamente 150 mg de tecido foram

homogeneizados com o equipamento TissueTearorTM (BiospecTM) em cinco vezes

o volume de tampão de homogeneização Tris-HCl (50 mM Tris-HCl, pH 7,4)

contendo 150 mM KCl, 1 mM DTT e 0,5 mM do inibidor de proteases fluoreto de

fenilmetilsulfonil (PMSF). Durante todo o procedimento, as amostras foram

mantidas em frascos sobre o gelo.



microssomal, foi realizada uma segunda centrifugação da fração S9 a 100.000 xg

por 60 minutos a 4°C com a ultracentrífuga Hitachi CP100WX. A fração

sobrenadante resultante foi acondicionada em novo microtubo e armazenada em

freezer -80°C, e a fração microssomal foi ressuspendida em tampão Tris-HCl (0,1

M, pH 7,4), contendo 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 M KCl e glicerol 20%, e

armazenada em freezer -80°C até o momento de seu processamento.

A fração citosólica foi utilizada para padronização das técnicas de análise da

atividade GST, enquanto a fração microssomal foi utilizada para padronização da

técnica de atividade EROD.

IV.3 – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS DAS

AMOSTRAS

A determinação da concentração de proteínas totais das frações citosólica e

microssomal das amostras homogeneizadas foi realizada por meio do método de

Bradford (BRADFORD, 1976). O método de Bradford utiliza o corante Coomassie

Brilliant Blue (G-250), que reage com os aminoácidos das proteínas, formando

uma coloração que varia do tom marrom para o azulado.


Assay® (Bio-Rad) de acordo com instruções do fabricante. Em uma microplaca

com 96 poços foram adicionados, em duplicata, 5 µL de cada amostra e 200 µL

Pág. 111 / 203



para Aves



______________________




Revisão 02 06/2018

de Reagente de Bradford filtrado, totalizando um volume final de 205 µL. Após

incubação de 5 minutos, foi realizada uma leitura simples das amostras a 595 nm

utilizando o espectrofotômetro de placas SpectraMax® M5 (Molecular Devices®).

As absorbâncias das amostras foram comparadas a uma curva padrão de

albumina sérica bovina produzida no mesmo ensaio das amostras. A quantidade

de proteínas totais nas amostras foi expressa em mg.mL-1.

IV.4 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA


IV.4.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS

Com o intuito de garantir que a utilização de níveis mais elevados de etanol

não represente inibição da atividade enzimática ou problemas de turbidez em

futuros ensaios, primeiramente foi avaliada a atividade GST em uma mesma

amostra de fígado de L. dominicanus em meios de reação com concentrações

crescentes de etanol (5,5; 7,5 e 10% de etanol no ensaio final) e concentração

fixa dos substratos (GSH a 1 mM e CDNB a 1 mM).

A determinação da atividade GST seguiu o método descrito por Keen, Habig e

Jakoby (1976), com modificações para microplaca. A atividade GST foi calculada

com a fórmula:


Onde,


milliAbs.min = taxa de formação de GS-DNB (ε = 9,6 mM.cm-1)





A determinação das condições do ensaio GST propriamente dita, para tecidos

hepáticos de Larus dominicanus e Spheniscus magellanicus, foi realizada com a

construção de duas curvas de cinética enzimática para GST para cada espécie.






Pág. 112 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

As curvas cinéticas são utilizadas para determinar os parâmetros cinéticos de

velocidade máxima (Vmax) e a constante de Michaelis-Menten aparente (Kmapp)

para os substratos CDNB e GSH.

Para ambas as espécies a curva de cinética enzimática para CDNB foi

construída com concentração fixa de GSH (2,5 mM) e concentrações crescentes

de CDNB: 0,125; 0,156; 0,25; 0,312; 0,500; 0,625; 1; 1,25; 2 e 2,5 mM. Uma

segunda curva de cinética enzimática de GST foi construída, com uma

concentração fixa de CDNB (2,5 mM) e concentrações crescentes de GSH: 0,011;

0,023; 0,046; 0,093; 0,187; 0,375; 0,75; 1,5; 3 e 6 mM. A concentração final de

etanol no ensaio foi de 7,5%.

Ambas as curvas de cinética enzimática foram submetidas à regressão não

linear, com a equação de Michaelis-Menten, para obtenção do Kmapp e Vmax,

usando o programa Graphpad Prism 5.

Vmáx é compreendida como a velocidade máxima da enzima nas condições




parâmetros são importantes para padronização do ensaio GST em cada espécie

de tetrápode.




(𝐾𝑚+[𝑆])

Onde,


Km = Km



Pág. 113 / 203



para Aves



______________________




Revisão 02 06/2018

IV.4.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

IV.4.2.1 – AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO POR ETANOL

No teste de inibição por etanol não foi observada uma redução na atividade

da enzimas GST para as concentrações crescentes de etanol utilizadas (Figura

IV.4-1). A ausência de inibição na atividade enzimática em decorrência do

aumento da concentração final de etanol no ensaio possibilita que haja um

aumento na concentração deste solvente e, consequentemente, de CDNB no

ensaio de GST. Embora este procedimento permita a utilização de maiores

concentrações de CDNB, ressalta-se que não é recomendada a utilização de

concentrações elevadas de etanol no ensaio, tendo em vista seu potencial

inibitório na atividade enzimática em concentrações acima daquelas testadas no

presente trabalho. Além disso, modificações muito significativas podem impedir a

comparação dos resultados obtidos com aqueles existentes na literatura científica.

Para futuros ensaios, portanto, foi determinada a utilização de concentrações

finais máximas de etanol de 7,5%. Nessas condições não há turbidez do meio

nem inibição enzimática.

Figura IV.4-1 - Atividade GST em concentrações crescentes de etanol e concentração

fixa de CDNB (1mM). Barras representam média±DP, calculados a partir de

quadruplicatas técnicas* para cada condição de ensaio.*Réplicas técnicas são repetições

de análises de um mesmo organismo (amostra biológica) realizadas durante um ensaio.

As réplicas técnicas podem ser usadas para avaliar a repetibilidade do método.

ATIVIDADE GST

5,5

%

7,5

%10

%

0

100

200

300

[ETANOL]

mU

. m

g p

rote

ína

-1






Pág. 114 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

IV.4.2.2 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES ÓTIMAS PARA O

ENSAIO


dos Km aparentes (Kmapp) obtidos para ambas as curvas cinéticas. Wilkinson

(1971) recomenda que para o estabelecimento de condições de ensaio

enzimático, o substrato seja utilizado em concentrações de cinco a dez vezes o

Kmapp. Com base nestas diretrizes, para Larus dominicanus, o substrato GSH

deveria ser utilizado em concentrações de 2,9 a 5,8 mM, enquanto CDNB deveria

ser utilizado em concentrações de 5,5 a 11 mM (Figura IV.4-2). Para Spheniscus

magellanicus, o substrato GSH deveria ser utilizado em concentrações de 1,5 a 6

mM, enquanto CDNB deveria ser utilizado em concentrações entre 3 e 9 mM

(Figura IV.4-3).

Em estudos preliminares realizados no laboratório, a elevação da

concentração relativa de CDNB no meio de reação, mantendo-se a

porcentagem de etanol em 5%, resultou em um aumento significativo da

turbidez do meio de reação durante a leitura, acarretando em interferência na

leitura da absorbância do método.

Alternativamente, a concentração de CDNB poderia ser aumentada elevando-

se também a porcentagem de etanol no meio. No entanto, para atingir a

concentração de 5 mM de CDNB foi necessária a utilização de meio com

aproximadamente 12% etanol. Para atingir concentrações ainda mais elevadas de

CDNB seria necessário ampliar ainda mais a porcentagem de etanol na reação

inviabilizando a comparação direta com a literatura científica.

A equipe do LABCAI não julga pertinente o uso de concentrações mais altas

de etanol em decorrência das razões já explicitadas na seção anterior (Seção

IV.4.2.1 deste documento). Dessa forma, a escolha das concentrações de GSH e

CDNB, 2,5 mM e 2,5 mM, respectivamente, foi realizada com o intuito de otimizar

as condições do ensaio, maximizando a atividade GST, em concentrações de

etanol que permitissem a solubilização do CDNB (sem turbidez ou precipitação),

não inibissem as reações enzimáticas e ainda possibilitassem a comparação de

Pág. 115 / 203



para Aves



______________________




Revisão 02 06/2018

resultados com os dados de literatura, cujos ensaios foram realizados em sua

maioria com até 7,5% de etanol e concentração dos substratos de 1 mM.

Figura IV.4-2 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Larus

dominicanus, construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos

glutationa reduzida (GSH) (A) e 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (B).

0 2 4 60

200

400

600

800

1000

Vmáx = 774,1

Kmapp= 0,58

Atividade GST em diferentes concentrações de GSH

A)

[GSH] (mM)

mU

. m

g p

rote

ína

-1

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

200

400

600

800

Vmáx = 829,5

Kmapp= 1,109

Atividade GST em diferentes concentrações de CDNB

B)

[CDNB] (mM)

mU

. m

g p

rote

ína

-1






Pág. 116 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Figura IV.4-3 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Spheniscus

magellanicus construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos 1-



meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten.

Cinética enzimática de Spheniscus magellanicus

0 1 2 30

200

400

600

S. magellanicus 1

S. magellanicus 2

S. magellanicus 3

Km= 0,6063

Vmáx= 626,9

Km= 0,9206

Vmáx= 256,6

Km= 0,5933

Vmáx= 294,5

[CDNB]

mU

/mgprt

Cinética enzimática de Spheniscus magellanicus

0 2 4 6 80

200

400

600

800

1000

S. magellanicus 1

S. magellanicus 2

S. magellanicus 3

Km = 0,6542

Vmáx= 918,5

Km= 0,3636

Vmáx= 428,8

Km= 0,5213

Vmáx= 310,6

[GSH]

mU

/mgprt

A

B

Pág. 117 / 203



para Aves



______________________




Revisão 02 06/2018

Além da determinação das condições ideais de ensaios futuros, a presente

padronização permitiu observar que o Vmax das espécies L. dominicanus e S.

magellanicus são similares aos valores de atividade GST quantificados em outras

espécies de aves, marinhas ou não (Tabela IV-5). Tais resultados respaldam a

eficiência das condições padronizadas.

IV.5 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA



Os ensaios de atividade EROD para padronização em tecido hepático de

Larus dominicanus e Spheniscus magellanicus foram realizados no

espectrofluorímetro SpectraMax® M5 (Molecular Devices®), utilizando microplacas

pretas (Perkin Elmer). Resumidamente, 20 µg de proteína microssomal de cada

amostra foram adicionados por poço, ajustando o volume final para 20 µL com

tampão de microssoma quando necessário, e incubadas com 140 µL de 7-

etoxiresorufina (7-ER) por 10 minutos a 37ºC (WHITE et al., 1994; CHANG,

WAXMAN, 2006; WANWIMOLRUK, WANWIMOLRUK, 2006). Após a incubação,

40 µL de NADPH foram adicionados em cada poço para iniciar a reação. A

determinação da atividade EROD seguiu o método de Burke e Mayer (1994)

adaptado para microplaca.

O par de excitação e emissão (ex/em) foi ajustado para 530nm/585nm com

filtro (cutoff) em 550 nm e fotomultiplicador ligado no máximo (high) para otimizar

a detecção de resorufina. Foram realizadas 20 leituras por poço em cada intervalo

de tempo de 30 s. A reação foi monitorada por 600 s e o coeficiente angular da

reta RFU.min-1 foi utilizado para o cálculo da atividade enzimática.


(RFU) em picomoles de resorufina. A atividade foi expressa em picomoles de

resorufina formada por minuto por massa de proteína (pmol.min-1.mgprt-1), usando

a seguinte fórmula:






Pág. 118 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018


𝒎𝒈𝒑𝒓𝒐𝒕𝒆í𝒏𝒂

Na padronização, os parâmetros Vmax (velocidade máxima) e Kmapp

(constante de Michaelis-Menten aparente) para o substrato 7-etoxiresorufina (7-

ER) foram determinados usando uma curva de cinética com concentrações

crescentes de 7-ER. A curva de cinética enzimática foi avaliada por meio de

regressão não linear com as equações de Michaelis-Menten e do modelo de

inibição por substrato (equações abaixo), usando o programa Graphpad Prism 5.


(𝐾𝑚+[𝑆])

Onde,


Km = Km




𝐾𝑚+([𝑆]×(1+[𝑆]

𝐾𝑖))

Onde,


Km = Km




No caso de inibição de uma enzima pelo substrato, a padronização do

método com concentrações do substrato iguais a 100, 50, 10 ou 5 vezes o Km da

enzima deve ser aplicada com cautela, pois dependendo da concentração do

substrato, o método será padronizado em uma concentração inibitória para a

enzima (BISSWANGER, 2011; 2014).

Um segundo ensaio foi realizado para avaliar os efeitos da concentração da

coenzima NADPH no ensaio. Apesar da similaridade entre os procedimentos, a

padronização para L. dominicanus e S. magellanicus diferiram entre si em alguns

aspectos, conforme explicitado a seguir.

Pág. 119 / 203



para Aves



______________________




Revisão 02 06/2018

Condições de Ensaios da Atividade EROD para Tecido Hepático de

Larus dominicanus

Foram realizados ensaios de atividade EROD com concentração fixa de

NADPH (2 mM) e concentrações crescentes de 7-ER: 0,0039; 0,0078; 0,0156;

0,0312; 0,0625; 0,125; 0,25; 0,5; 1; 2 e 4 µM.

A fim de avaliar o efeito da coenzima NADPH, foram realizadas análises

utilizando uma concentração fixa de 7-ER (2 µM) e concentrações crescentes de

NADPH (1, 2, 4 e 8 mM).

Todos os ensaios foram realizados com a fração microssomal obtida de

apenas uma amostra (R3A002635), coletada pela equipe do LABCAI

imediatamente após a eutanásia do animal.

Condições de ensaios da atividade EROD para tecido hepático de

Spheniscus magellanicus

Os ensaios foram realizados com um ‘pool’ formado por volumes iguais dos

microssomas obtidos das oito amostras homogeneizadas.



NADPH (0,25; 0,5; 1; 2 e 4 mM).

Para a determinação dos parâmetros Vmax e Kmapp para 7-ER foram

realizados ensaios de atividade EROD com concentração fixa de NADPH (1 mM)

e concentrações crescentes de 7-ER: 0,0097; 0,0195; 0,039; 0,078; 0,15; 0,312;

0,625; 1,25; 2,5; 5 e 10 µM.


Para Larus dominicanus, a curva cinética de EROD em função de 7-ER

(Figura IV.5-1) apresentou um Km aparente (Kmapp) de 108,4 nM e Vmax de

30,31 pmol.min-1.mgprt-1. O Kmapp de L. dominicanus está dentro da variação

encontrada para o pinguim Pygoscelis adeliae, de 51 a 109 nM

(WANWIMOLRUK, WANWIMOLRUK, 2006), e para o cormorão Phalacrocorax

carbo, que variou de 82 até 240 nM (KUBOTA, KIM, IWATA, 2009) (Tabela IV-3).






Pág. 120 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Wilkinson (1971) recomenda a utilização do substrato em concentrações de

cinco a 10 vezes o Km. Portanto, recomenda-se a utilização de concentrações

mínimas entre 0,5 a 1 µM de 7-ER em futuros ensaios com L. dominicanus. No

entanto, considerando que alguns ensaios EROD utilizam 2 µM de 7-ER (KLOTZ,

STEGEMAN, WALSH, 1984; YAWETZ, WOODIN, STEGEMAN, 1998), optou-se

por usar esta concentração em estudos futuros com L. dominicanus para permitir

comparações com dados da literatura. Esta escolha não causa prejuízo à

determinação do Vmax do ensaio, pois não há diferença na atividade quando

utilizadas concentrações entre 1 µM e 2 µM de 7-ER (Figura IV.5-1A).

Para o ensaio com NADPH, os resultados dos testes evidenciaram uma

inibição da deetilação da 7-ER proporcional à concentração utilizada da coenzima

(Figura IV.5-1B). Logo, o ensaio deverá ser realizado em baixas concentrações

de NADPH, apenas para garantir que haverá equivalentes redutores suficientes

para a redução do citocromo P450 (HANNEMANN et al., 2007).

Portanto, para futuros ensaios com L. dominicanus, serão adotadas as

seguintes condições:


* 2 µM de 7-ER

* 1 mM de NADPH


Para Spheniscus magellanicus, os resultados mostraram uma menor

atividade EROD nas concentrações de 0,25 mM, 0,5 mM e 4 mM de NADPH

(Figura IV.5-2A). Dessa forma, concentrações entre 1 e 2 mM de NADPH

mostraram-se mais adequadas para este ensaio, garantindo que haja

equivalentes redutores suficientes para redução do citocromo P450

(HANNEMANN et al., 2007).

Pág. 121 / 203



para Aves



______________________




Revisão 02 06/2018

Figura IV.5-1 - Curva cinética de atividade EROD em tecido hepático de Larus

dominicanus construídas com concentrações crescentes do substrato enzimático 7-

etoxiresorufina (7-ER) (A), sendo Kmapp e Vmax obtidos por meio de regressão não

linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten. Inibição da deetilação de 7-

ER em concentrações crescentes de NADPH (B).

A curva cinética de EROD em função de 7-ER (Figura IV.5-2 B) foi ajustada

ao modelo de inibição por substrato e apresentou um Km aparente (Kmapp) de

1,3 µM e Vmax de 7,4 pmol.min-1.mgprt-1. O Kmapp de S. magellanicus também

está acima da faixa encontrada para os pinguins P. adeliae e P. carbo

(WANWIMOLRUK, WANWIMOLRUK, 2006; KUBOTA, KIM, IWATA, 2009).

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.00

10

20

30

Vmáx = 30,31

Kmapp= 0,1084

Curva cinética ERODA

[ER] (M)

pm

ol.

min

-1.

mg

pro

tein

a-1

Atividade EROD - L. dominicanus

1mM

2mM

4mM

8mM

0

5

10

15

201mM

2mM

4mM

8mM

B

[NADPH] (mM)

pm

ol.

min

-1.

mg

pro

tein

a-1






Pág. 122 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

É importante ressaltar que os Kms dos artigos supracitados foram ajustados

com base no modelo clássico de Michaelis-Menten, diferentemente do Km de S.

magellanicus,que se ajustou melhor a um perfil cinético de inibição por substrato

(p<0,0001) (Figura IV.5-2).

Embora o modelo de Michaelis-Menten seja amplamente utilizado, modelos

de inibição por substrato já foram aplicados a diversos membros da família dos

citocromos P450 e foram, inclusive, encontrados na padronização de atividade

EROD em tecido hepático de cetáceos (vide seção III.5 deste relatório).

Para enzimas ajustadas ao modelo de Michaelis-Menten, a concentração de

substrato sugerida é de cinco a 10 vezes o Km (WILKINSON, 1971). No entanto,

esta extrapolação não é aplicável a modelos de inibição pelo substrato.

Pág. 123 / 203



para Aves



______________________




Revisão 02 06/2018

Figura IV.5-2 - A. Efeito de diferentes concentrações de NADPH na atividade EROD,

dados relativizados pela atividade média da concentração de 2 mM. B. Curva cinética de

atividade EROD em tecido hepático de Spheniscus magellanicus construída com

concentrações crescentes do substrato enzimático 7-etoxiresorufina (7-ER), sendo

Kmapp e Vmax obtidos por meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo

de Inibição por substrato, linhas hachuradas indicam o intervalo de confiança de 95%.

‘Inset’ – Gráfico de Eadie-Hofstee da curva cinética. O Vmax calculado pelo programa é o

Vmax estimado na ausência de inibição por substrato.

0 2 4 6 8 100

2

4

6

Vmáx = 7,4 0,47

Kmapp= 1,3 0,14

Ki = 13,54 2,40


[7-ER] (M)

pm

ol.

min

-1.

mg

pro

tein

a-1

0 5 10 15 20 25 30 350

1

2

3

4

5

[V/Substrato]

V

Atividade EROD - S. magellanicus

0,25

mM

0,5

mM

1 m

M

2 m

M

4 m

M

0

50

100

150

[NADPH] (mM)

% d

e a

tiv

ida

de

em

re

laç

ão

à m

éd

ia d

e 2

mM

A

B






Pág. 124 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Stromme e Theodorsen (1976) propuseram a utilização de gráficos duplo-

recíprocos de Lineweaver-Burk para linearização dos dados enzimáticos de γ-

glutamil transferase, facilitando a identificação do ponto no eixo X, referente à

concentração do 1/[substrato], em que a relação 1/[substrato] versus1/V inverte-

se, ou seja, o momento no qual o incremento de substrato reflete em um

decréscimo da atividade enzimática.

Assim como gráficos duplo-recíprocos, o gráfico linearizado de Eadie-Hofstee

construído para curva cinética de EROD na ave S. magellanicus (Figura IV.5-2 -

‘inset’) permitiu identificar que a inversão na relação V versus V/[7-ER] ocorre

quando concentração V/[7-ER] é próxima de 0,92, referente ao ponto de 5 µM de

7-ER. Tendo em vista o exposto, sugere-se o uso de concentrações de 7-ER

abaixo de 5 µM para o ensaio EROD em tecido hepático de ave S. magellanicus.

Com base nos resultados obtidos, as condições para o ensaio EROD em

fígado de S. magellanicus são:


* 4 µM de 7-ER

* 1 mM de NADPH


A Vmax de L. dominicanus e S. magellanicus encontrou-se abaixo dos valores

observados para outras espécies de aves marinhas, embora similares ao Vmax

observado para espécies próximas evolutivamente, como Larus argentatus e P.

adeliae (Tabela IV-6, apresentada na seção IV-9).

IV.6 – DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE TEMPORAL DAS

AMOSTRAS PARA O ENSAIO DE GST


Para avaliar a estabilidade temporal da atividade GST foram utilizadas aves

que seriam mortas por eutanásia. Assim, foram realizados ensaios com amostras

de tecido hepático obtidas no momento da eutanásia (tempo 0) e 1, 2, 3, 6, 12, 18

e 24 horas após a morte de dois indivíduos de Larus dominicanus.

Pág. 125 / 203



para Aves



______________________




Revisão 02 06/2018

As amostras utilizadas foram coletadas pela equipe do LABCAI juntamente

com a equipe da R3 Animal, integrante do PMP-BS. Os espécimes amostrados

foram submetidos à reabilitação no Centro de Reabilitação e Despetrolização de

Florianópolis e, posteriormente, foram eutanasiados. Tendo em vista que estes

ensaios visam apenas avaliar a degradação enzimática ao longo do tempo, e não

necessariamente o valor per se da atividade quando comparada a outros animais,

foi possível utilizar animais submetidos à reabilitação. Estes organismos, no

entanto, não devem ser utilizados para fins de emissão de laudos, uma vez que

os medicamentos utilizados durante a reabilitação podem alterar o valor de

atividades enzimáticas, transcrição de genes e expressão proteica. As

informações sobre os dois espécimes seguem abaixo:

Tabela IV - 2 - Identificação e sumário de informações médicas e de admissão referentes

às aves amostradas para verificação de estabilidade de biomarcadores bioquímicos e

moleculares post mortem.

ID1 ID2

Espécie Larus dominicanus Larus dominicanus

Número SIMBA 2752 3018

Número FAI R3A002635 R3A002712

Data de admissão 22-12-2016 10-02-2017

Data de eutanásia 24-02-2017 24-02-2017

Sexo Indeterminado Indeterminado

Medicamentos administrados

Mercepton; Glicopan; Metronidazol; Drontal; Baytril; Eutanásia: Quetamina + Xilazina + Acepram + MPA + KCl

Glicopan; Clindamicina; Tronadol; Meloxicam; Euntanásia: Quetamina + Xilazina + Acepram + MPA + KCl

A homogeneização e quantificação de proteínas seguiu os métodos relatados

nas seções IV.2 e IV.3.

Os ensaios foram realizados em duplicata e em condições ótimas conforme

descrito na seção IV.4. Brevemente, o substrato GSH a 2,5 mM foi incubado com

a fração citosólica das amostras por 5 minutos a 37ºC. Após a incubação, foi

adicionado CDNB na concentração de 2,5 mM, e a formação do produto GS-DNB

foi acompanhada durante 5 minutos em 340 nm no espectrofotômetro

(SpectraMax® M5, Molecular Devices®). Os dados de atividade GST em relação

ao tempo post mortem foram analisados por meio de regressão linear, usando o

programa Graphpad Prism 5.






Pág. 126 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018


Ao realizar o teste da estabilidade temporal de GST, a hipótese inicial é que

existiria uma diminuição na atividade GST dependente do tempo post mortem das

aves. Essa hipótese está fundamentada no processo de decomposição natural do

animal, que promove a degradação das proteínas dos tecidos biológicos,

destruindo sua atividade enzimática e função biológica (BENJAKUL et al., 1997;

KEMP, KÜLTZ, 2012; POLOZ, O’DAY, 2009). No entanto, não foi observado um

padrão consistente de diminuição de atividade GST ao longo do tempo post

mortem para os dois espécimes de L. dominicanus (Indivíduo 1: r²=0,012;

Indivíduo 2: r²=0,051).

A atividade GST se manteve estável ao longo do tempo para o espécime 1

(código R3A002635), ou seja, não houve padrão de diminuição ao longo do

tempo. A atividade GST no espécime 2 (código R3A002712) após 1 e 2 horas

post mortem foi menor que a atividade GST nos demais tempos de coleta, mas

não houve padrão de diminuição da atividade GST ao longo do tempo de

teste (Figura IV.6-1). É importante mencionar que estes dados se referem a

apenas dois indivíduos. Até o momento, não foram possíveis análises em mais

indivíduos desta espécie. No entanto, este padrão foi observado em espécimens

de tartaruga C. mydas, reforçando a estabilidade de GST post mortem. Análises

com mais indivíduos podem ser feitas ao longo do trabalho.

Pág. 127 / 203



para Aves



______________________




Revisão 02 06/2018

Figura IV.6-1 - Atividade GST (mU*mgprt-1) post mortem em tecido hepático de Larus

dominicanus em diferentes tempos de decomposição. Pontos representam médias de

duplicatas técnicas*.

* Réplicas técnicas são repetições de análises de um mesmo organismo (amostra

biológica) realizadas durante um ensaio. As réplicas técnicas podem ser usadas para

avaliar a repetibilidade do método.

O presente resultado suporta a realização do ensaio de atividade GST em

tecido hepático de L. dominicanus em código 2 de decomposição. No entanto,

vale ressaltar que o presente ensaio foi realizado com amostras em

decomposição em condições de laboratório. Possivelmente em condições de

campo, variáveis como temperatura, incidência solar, umidade, salinidade, dentre

outras, podem influenciar na qualidade da amostra e acelerar o processo de

decomposição tecidual, e consequentemente, de degradação proteica. Tendo em

vista estas limitações, serão priorizados dentre os organismos coletados, os mais

frescos possíveis, para a emissão de laudos, conforme informações

disponibilizadas no SIMBA.






Pág. 128 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

IV.7 – DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE TEMPORAL DAS

AMOSTRAS PARA O ENSAIO DE EROD


Além da determinação da estabilidade temporal para ensaio GST, as

amostras de L. dominicanus coletadas também foram utilizadas para determinar a

estabilidade temporal da atividade EROD.

Para tal foi realizado o ensaio de atividade EROD com amostras de tecido

hepático obtidas no momento da eutanásia (tempo 0) e 1, 2, 3, 6, 12, 18 e 24

horas após a morte.

O ensaio EROD foi realizado no espectrofluorímetro SpectraMax® M5

(Molecular Devices®) utilizando microplacas pretas (Perkin Elmer®), conforme

condições ótimas já estabelecidas para a espécie. Resumidamente, o ensaio foi

realizado em tampão TRIS/NaCl 50 mM/0,1 M (pH 7,4), a 37ºC, com

concentrações finais de 2 μM de 7-ER e 1 mM de NADPH. O par de excitação e

emissão (ex/em) foi ajustado para 530nm/585nm com filtro (cutoff) em 550 nm e

fotomultiplicador ligado no máximo (high) para otimizar a detecção de resorufina,

produto da reação. Foram realizadas 20 leituras por poço em cada intervalo

temporal de 30 segundos. A reação foi monitorada por 600 segundos e o

coeficiente angular da reta RFU/min foi utilizado para o cálculo da atividade

enzimática.


(RFU) em picomoles de resorufina. A atividade foi expressa em fentomoles de

resorufina formada por minuto por mg de proteína (fmol.min-1.mgprt-1), utilizando-

se a seguinte fórmula:


𝒎𝒈𝒑𝒓𝒐𝒕𝒆í𝒏𝒂 *1000

Pág. 129 / 203



para Aves



______________________




Revisão 02 06/2018


Após a morte, as células dos organismos aeróbios consomem todo o oxigênio

molecular e iniciam o metabolismo fermentativo, que é insuficiente para manter a

concentração de ATP (trifosfato de adenosina) em níveis normais. A baixa

quantidade de energia química, na forma de ATP, é insuficiente para manter o

funcionamento das bombas de membranas. Concomitantemente, a fermentação

láctica provoca a queda do pH intracelular. Esses fenômenos provocam a

desestabilização das membranas dos lisossomos, seguido de extravasamento

das enzimas lisossomais, resultando na ativação de enzimas proteolíticas que

degradam os componentes intracelulares, como as enzimas microssomais

(BUTZBACH, 2010). Portanto, a determinação da estabilidade temporal de uma

enzima microssomal é de suma importância para garantir a interpretação dos

resultados obtidos.

Liukkonen-Anttila e colaboradores (2003) observaram uma diminuição de

34% na atividade EROD em fígado de perdiz-cinzenta (Perdix perdix) após 30

minutos post-mortem, e recomendam a padronização do tempo de coleta do

tecido para avaliação da atividade EROD. Similarmente, em fígado de ratos, a

quantidade de citocromo P450 diminuiu 90% e a atividade de algumas isoformas

do citocromo P450 diminuiu entre 75 e 98% após 48 horas post-mortem

(YAMAZAKI; WAKASUGI, 1994). Estes resultados mostram que a diminuição da

atividade enzimática do citocromo P450 post-mortem é comum nos organismos

aeróbios.

Neste estudo, a atividade EROD (Figura IV.7-1) diminuiu ao longo do tempo

no fígado da ave L. dominicanus. O padrão de diminuição da atividade se ajustou

a uma curva de decaimento exponencial com tempo de meia vida de 2,8 e 5,2

horas para os espécimes L. dominicanus 1 e 2, respectivamente. Portanto, o

tempo post-mortem é uma variável importante a ser considerada nas análises de

atividade EROD de animais coletados no PMP-BS. De acordo com estes

resultados, é importante considerar a possibilidade de que futuras análises de

algumas amostras do PMP apresentem pouca ou nenhuma atividade EROD

devido ao estágio de decomposição (tempo post mortem).






Pág. 130 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Figura IV.7-1 - Estabilidade da atividade EROD em tecido hepático de aves Larus

dominicanus: indivíduos 1 e 2. A atividade foi apresentada como porcentagem em relação

ao T0 (momento da morte do animal). *Atividade não detectada em L. dominicanus 2

após 24 horas. O ajuste dos dados de ambos os espécimes à equação exponencial de

decaimento apresentou r2 = 0,98. O tempo de meia vida de L. dominicanus 1 e L.

dominicanus 2 foi de 2,8 e 5,2 horas, respectivamente.

Os dados apresentados na Figura IV.7-1 demonstram, ainda, uma

variabilidade interindividual para a estabilidade da enzima post mortem. Estes

resultados podem ser decorrentes de variações biológicas existentes entre L.

dominicanus 1 e 2. Adicionalmente, os animais analisados não foram submetidos

ao mesmo tratamento veterinário. De acordo com os dados apresentados na

Tabela IV-2, tanto os medicamentos administrados como a duração dos

tratamentos diferiram entre os espécimes. A consequência desta variação de

protocolos de tratamento veterinários nas atividades enzimáticas obtidas neste

trabalho permanece desconhecida. Por fim, deve-se considerar que, em trabalhos

de campo similares ao PMP-BS, fatores como causa mortis (predação, patógenos

e/ou contaminação) e condições ambientais (temperatura, umidade, presença de

perfurações na pele ou carcaça, dentre outros) durante a decomposição da

carcaça do animal também podem exercer alguma influência sobre a atividade

enzimática nos tecidos dos animais analisados.

Corroborando os resultados apresentados neste relatório, Espín et al. (2016)

concluíram em sua revisão que amostras de tecido hepático devem ser coletadas

imediatamente após a morte do animal:

EROD de L. dominicanus post mortem

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 240

20

40

60

80

100

120Larus dominicanus 1

Larus dominicanus 2

*

Larus dominicanus 1

r2 = 0,98

Meia vida = 2,8 horas

Larus dominicanus 2

r2 = 0,98

Meia vida = 5,2 horas

Tempo (h)

Po

rce

nta

ge

m e

m r

ela

çã

o a

o T

0

Pág. 131 / 203



para Aves



______________________




Revisão 02 06/2018

“Em nossa revisão de 249 estudos europeus, 111 analisaram tecidos

internos e o fígado foi de longe o órgão mais comumente analisado (98 estudos,

Tabela 2). Em alguns casos, tecidos internos são coletados especificamente

para a determinação de biomarcadores de efeito (Mateo et al., 2003; Rainio et

al., 2012) mas estes são instáveis, devem ser medidos ou conservados

imediatamente após a biópsia ou morte (Mateo et al., 2003; Rainio et al., 2012) e

não podem ser medidos em tecidos de carcaças encontradas no campo algum

tempo após a morte” (transcrito do original com tradução livre e negrito pela equipe

do LABCAI).

Portanto, é necessária uma padronização eficaz, tanto do ensaio EROD,

quanto do procedimento de coleta e armazenamento da amostra. Se esta etapa

não for adequadamente realizada, haverá comprometimento das análises

estatísticas subsequentes e das possíveis conclusões do estudo. A partir dos

dados gerados nessa etapa de padronização da determinação da atividade EROD

em amostras hepáticas de aves, recomenda-se que as mesmas sejam coletadas

em até 30 minutos post mortem para viabilizar as análises bioquímicas e

estatísticas de atividade EROD. É importante ressaltar que a escolha desse

tempo de coleta post mortem é relativa, variando conforme a espécie,

biomarcador/enzima alvo, causa mortis e condições de decomposição. O ideal é

coletar amostras frescas, obtidas imediatamente após a morte do animal.

Qualquer tempo de coleta superior à coleta imediata implicará em: um grande

risco de perda de qualidade da amostra e possível enviesamento dos resultados

nas análises estatísticas. O enviesamento de dados dificultará ou impossibilitará a

interpretação e obtenção de conclusões robustas sobre a relação entre os dados

de determinados biomarcadores e os resultados de concentração contaminantes.

Em suma, a padronização do ensaio EROD na ave L. dominicanus neste

relatório mostrou claramente o efeito do tempo post mortem (grau de

decomposição do animal) na atividade EROD, ao contrário do resultado

observado para atividade da enzima GST.

Essa diferença entre as enzimas poderia também estar associada a

composição de aminoácidos na extremidade amino-terminal destas enzimas, que

influencia na estabilidade biológica destas biomoléculas. Bachmair et al. (1986)

mostraram que variações na composição de aminoácidos, com resíduos de

metionina, serina, alanina, treonina, valina e glicina, na extremidade amino-

terminal da enzima β-galactosidase da levedura Saccharomyces cerevisiae

apresentaram valores de meia-vida que variaram de 3 minutos a 20 horas,






Pág. 132 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

quando comparados com outros resíduos de aminoácidos, como prolina, arginina

e tirosina. Entretanto, estudos adicionais seriam necessários para avaliar esta

hipótese.

IV.8 – RESUMO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO PARA ANÁLISE DE

BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS PARA AVES

As condições otimizadas para realização de futuros ensaios com tecido de

aves marinhas encontram-se sumarizadas nas tabelas abaixo. Todas as

condições ora apresentadas foram determinadas com base nos ensaios

realizados durante a etapa de padronização de biomarcadores bioquímicos do

presente projeto.

Tabela IV-3 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade glutationa S-

transferase (GST) com amostras de aves.


Tampão [GSH]

mM [CDNB]


Condições de

preservação


Fosfato de potássio (0,1 M,

pH 7,0) 2,5 2,5 37 °C Fígado

Freezer -80 °C

Larus dominicanus


pH 7,0) 2,5 2,5 37 °C Fígado

Freezer -80 °C

Tabela IV-4 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade etoxiresorufina-

O-deetilase (EROD) com amostras de aves.


Tampão [7-ER]

µM [NADPH]




TRIS/NaCl (50 mM/0,1 M, pH 7,4)

4 1 37 °C Fígado Freezer -80 °C

Larus dominicanus

TRIS/NaCl (50 mM/0,1 M, pH 7,4)

2 1 37 °C Fígado Freezer -80 °C

Pág. 133 / 203



para Aves



______________________




Revisão 02 06/2018

IV.9 – BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM AVES:


As tabelas comparativas apresentadas abaixo permitem observar que as

atividades GST e EROD padronizadas em fígado de aves marinhas no âmbito do

projeto PMP-BS são similares àquelas observadas em matrizes teciduais de

outras espécies de aves. Os resultados obtidos respaldam a otimização dos

ensaios realizados neste estudo, no que se refere às condições de concentração

de substratos e temperatura dos mesmos.

Especialmente para atividade EROD, os ensaios realizados permitiram obter

dados relacionados às concentrações potencialmente inibitórias do substrato 7-

ER, que variam significativamente entre grupos animais. Esse é um resultado de

extrema relevância, tendo em vista que concentrações elevadas de 7-ER

podem inibir a atividade EROD de aves marinhas, interferindo diretamente

na quantificação precisa da atividade enzimática.






Pág. 134 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Tabela IV-5 - Comparação de dados de atividade glutationa S-transferase (GST) oriundos da padronização do presente projeto com aqueles reportados na

literatura para aves.

ESPÉCIE MATRIZ TECIDUAL

ORIGEM DA

AMOSTRA

CONDIÇÃO DA

AMOSTRA

TRATAMENTO [GSH] (mM)

[CDNB] (mM)

TEMPERATURA DE ENSAIO

Km (μM) VMÁX (mU*mgprt-1)

REFERÊNCIA

Larus dominicanus

Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 0,011 - 6 0,125 - 2,5

37 °C GSH: 580 CDNB: 1109

GSH: 774,1 CDNB: 829,5

Presente trabalho

Larus Argentatus

Fígado Necrópsia Fresca NÃO 30 3 - - 755,9±122,7 Ruus et al., 2002

Larus atricilla Fígado Necrópsia Fresca MERCÚRIO (μg/g): 0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6

- - - - 370-460 Jenko et al., 2012


Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 0,011 - 6 0,125 - 2,5

37 °C GSH: 363,6 – 654,2 CDNB: 593,3 – 920,6

GSH: 310,6 – 918,5 CDNB: 256,6 – 626,9

Presente trabalho

Gallus gallus domesticus

Fígado Necrópsia Fresca NÃO 100 100 37 °C - Não infectadas: 184,2 ± 29,7, Infectadas: 206,8 ± 33,4

Biazus et al., 2017

Bursa de Fabricius

Necrópsia Fresca NA2SEO3; (CH3COO)2PB

kit kit - - Controle: 29000 a 33000; Se: 31000 a 35000; Pb: 14000 a 18000; Se/Pb: 21000 a 22000

Jiao et al., 2017

Pág. 135 / 203



para Aves



______________________




Revisão 02 06/2018

Cobb500 (Gallus gallus)

Plasma Biópsia Fresca ÓLEO DE UVA kit kit - - Controle: 8,11 Tratados: 9,67 a 10,54

Abu Hafsa et al., 2017

Milvus migrans

Pele Biópsia Fresca NÃO 12 - - - ~2±1 Abbasi et al., 2017

Athene brama Fígado Biópsia Fresca NÃO 12 - - - ~4±2,5 Abbasi et al., 2017

Ficedula hypoleuca

Plasma Biópsia Fresca NÃO kit kit - - Poluído: Ca-sup: 3,5±1,1 Controle:4,1±1,8 Não poluído: Ca-sup: 3,7±1,6 Controle: 2,8±1,4

Espín et al., 2017

Meleagris sp. Fígado Necrópsia Fresca Não 0,002 a 1

0,0025 a 1,25

0 – 70 °C GSH:0,154 CDNB: 0,380

CDNB: 2125 GSH: 1803 (mU/mL)

Akkemiket al., 2012






Pág. 136 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Tabela IV-6 - Comparação de dados de atividade etoxiresorufina-O-deetilase (EROD) oriundos da padronização do presente projeto com aqueles reportados na

literatura para aves.

ESPÉCIE MATRIZ TECIDUAL

ORIGEM DA AMOSTRA


TRATAMENTO [7-ER] (μM)

[NADPH] (mM)

TEMPERATURA DE ENSAIO

Km (μM)

VMÁX (pmol.mgprt-1. min-1)

REFERÊNCIA

Larus dominicanus

Fígado Necrópsia Fresca NÃO 1,5 0,6 nM 37 °C - Controle: 70,1 Tratado: 1550

Numata et al., 2008

Fígado Necrópsia Imediatamente após a morte (tempo zero)

SIM 0,0039 - 4

1 - 8 37 °C 0,11 30,31 Presente trabalho

Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 0,0039 - 4

1 - 8 37 °C - 40 Presente trabalho

Larus argentatus

Fígado Necrópsia Fresca NÃO 10 50 30°C - Resultado em log de pmol

Routti et al., 2013

Fígado Necrópsia Fresca NÃO 10 1 25 ou 37 °C - 10 – 180 Kennedy et al., 2003

Fígado Necrópsia Fresca NÃO 500 10 25 °C - 181,6±75 Ruus et al., 2002

Fígado Necrópsia Fresca NÃO 1,5 0,6 nM 37 °C - Diferentes regiões: 1) 11,4–118,3 2) 52,9–217,5 3) 173–616 4) 21–208 5) 38,5–391 6) 92,1–194 7) 4,5–205 8) 122–376 9) 209–483 10) 180–501 11) 165–1077 12) 198–470 13) 58–295 14) 87–184

Fox et al., 2005

Pág. 137 / 203



para Aves



______________________




Revisão 02 06/2018

15) 199–849 16) 69–427 17) 14–237

Phalacrocorax brasilianus

Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 2 2 37 °C - - Presente trabalho

Phalactrocorax carbo

Fígado Necrópsia Fresca NÃO

1,5 0,6 nM 42 °C - Machos: 171±139 Fêmeas: 127±133

Guruge et al., 1997

Puffinus puffinus

Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 2 2 37 °C - 13 Presente trabalho


Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 2 2 37 °C - 0,9 Presente trabalho

Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 4 1 37 °C 1,3±0,14

7,4±0,47 Presente trabalho

Pygoscelis adeliae

Fígado Necrópsia 30 min post mortem

NÃO - - - - ~10 Focardi et al., 1992

Fígado Necrópsia Fresca NÃO - 1 37 °C Km1 (nM) 51±109: 0.2–358 Km2 (nM) 872±703: 303–2450

Vmax1: 1,8±1,4 Vmax2: 9,6±3,7

Wanwimolruk, Wanwimolruk, 2006

Sterna hirundo Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 2 2 37 °C - - Presente trabalho

Sula leucogaster

Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 2 2 37 °C - 9 Presente trabalho

Tadorna variegata

Fígado Necrópsia Fresca NÃO 1,5 0,6 nM 37 °C - Controle: 16,2 Tratado: 1430

Numata et al., 2008

Catharacta maccormicki

Fígado Necrópsia 30 min post mortem

NÃO - - - - ~120 Focardi et al., 1992

Diomedea Fígado Necrópsia 2-6 horas post NÃO 0,9 150 37 °C - 21 Boon et al.,






Pág. 138 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

immutabilis mortem 1998 Histrionicus histrionicus

Fígado Necrópsia Fresca NÃO 2 50 - - Com óleo: 204,6 Sem óleo: 70,7

Trust et al., 2000

Bucephala islandica

Fígado Necrópsia Fresca NÃO 2 50 - - Com óleo: 94,3 Sem óleo: 49,5

Trust et al., 2000

Tachycineta bicolor

Fígado Necrópsia Fresca NÃO 1,5 0,6 nM 37 °C - NW: 52,6±7,4 HL: 44,8±7,0 DP: 26,7±4,6 PC: 28,5±2,5

Smits et al., 2000

Alle alle Fígado Necrópsia Fresca NÃO 0,25 Sistema de regen.

37 °C - 36,9±3,2 Borga et al., 2005

Uria lomvia Fígado Necrópsia Fresca NÃO 0,25 Sistema de regen.

37 °C - 8,2±1,5 Borga et al., 2005

Cepphus grylle Fígado Necrópsia Fresca NÃO 0,25 Sistema de regen.

37 °C - 10,1±0,7 Borga et al., 2005

Rissa tridactyla Fígado Necrópsia Fresca NÃO 0,25 Sistema de regen.

37 °C - 12±1,4 Borga et al., 2005

Perdix perdix Fígado Necrópsia Fresca

NÃO 0,25 0,25 37 °C - Selvagem: 13,06±2,87 Domésticos: 14,34±2,19

Liukkonen-Anttila et al., 2003

Tetrao urogallus Fígado Necrópsia Fresca



Phasianus colchicus

Fígado Necrópsia Fresca



Coturnix coturnix japonica

Fígado Necrópsia Fresca

NÃO 0,25 0,25 37 °C - Domésticos: 7,33±1,24


Columba livia Fígado Necrópsia Fresca

NÃO 0,25 0,25 37 °C - Domésticos: 15,11±1,43


Pág. 139 / 203

V. Padronização de Técnicas

de Biomarcadores

bioquímicos em quelônios



______________________




Revisão 02 06/2018

V – PADRONIZAÇÃO DE TÉCNICAS PARA ANÁLISE DE

BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM QUELÔNIOS

V.1 – OBTENÇÃO DE AMOSTRAS


em quelônios foram utilizadas amostras de fígado de dezessete espécimes de

Chelonia mydas. As amostras foram coletadas por equipes constituintes de bases

integrantes do PMP-BS.

Informações sobre as amostras utilizadas são apresentadas na Tabela V-1.

Tabela V-1 - Identificação dos espécimes de quelônios provenientes do PMP-BS cujas amostras hepáticas foram utilizadas para padronização da atividade das enzimas glutationa S-transferase (GST) e etoxiresorufina-O-deetilase (EROD).

Número do espécime

testado

Identificação

no SIMBA

Tecido biológico

utilizado

Código de decomposição

da carcaça

Chelonia mydas (SN8) 018575 Hepático 2

Chelonia mydas (3) 44151 Hepático 2















V.2 – HOMOGENEIZAÇÃO DAS AMOSTRAS

Para a homogeneização das amostras de tecido hepático de quelônios,

aproximadamente 150 mg de cada amostra foram homogeneizados em cinco

vezes o volume de tampão de homogeneização Tris-HCl (50 mM Tris-HCl pH

7,4), contendo 150 mM KCl, 1 mM DTT e 0,5 mM do inibidor de proteases PMSF.




de Biomarcadores


Pág. 140 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Os tecidos foram homogeneizados com o homogeneizador TissueTearorTM

(BiospecTM). Durante todo o procedimento, as amostras foram mantidas sobre o

gelo.



microssomal, que corresponde à membrana do retículo endoplasmático, foi

realizada uma segunda centrifugação da fração S9 a 100.000 xg por 60 minutos a

4°C com a ultracentrífuga Hitachi CP100WX. A fração sobrenadante resultante foi

acondicionada em novo microtubo e armazenada em freezer -80°C e a fração

microssomal foi ressuspendida em tampão Tris-HCl (0,1 M, pH 7,4), contendo

1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 M KCl e glicerol 20%. A fração microssomal foi

armazenada em freezer -80°C.

A fração sobrenadante foi utilizada para as etapas subsequentes de

quantificação de proteínas totais citosólicas e padronização da atividade GST,

enquanto a fração microssomal foi utilizada para a determinação de proteínas

totais microssomais e padronização da atividade EROD.

V.3 – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS DAS AMOSTRAS

A determinação de proteínas citosólicas e microssomais das amostras foi

realizada por meio do método de Bradford (BRADFORD, 1976). O método utiliza

o corante Coomassie Brilliant Blue (G-250), que reage com os aminoácidos das

proteínas, mostrando uma coloração que varia do tom marrom para o azulado. A

coloração da amostra varia de acordo com a massa de proteínas.


Assay® (Bio-Rad®) de acordo com instruções do fabricante. Em uma microplaca

com 96 poços foram adicionados, em duplicata, 2,5 ou 5 µL de cada amostra,

diluída em tampão de homogeneização quando necessário, e 200 µL do reagente

de Bradford filtrado. Após incubação de cinco minutos, foi realizada uma leitura

simples das amostras a 595 nm utilizando o espectrofotômetro de placas

SpectraMax® M5 (Molecular Devices®). As absorbâncias das amostras foram

comparadas a uma curva padrão de albumina sérica bovina (BSA) produzida no

Pág. 141 / 203


de Biomarcadores




______________________




Revisão 02 06/2018

mesmo ensaio das amostras. A concentração de proteínas totais nas amostras foi

expressa em mg.mL-1.

V.4 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA


V.4.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS

A determinação da atividade GST foi realizada de acordo com o método

descrito por Keen, Habig e Jakoby (1976) e modificado para espectrofotômetro de

microplaca. O princípio do método está baseado na reação de conjugação do

tripeptídeo γ-glutamil-cisteinil-glicina (GSH) com o substrato hidrofóbico 1-cloro-

dinitrobenzeno (CDNB). Essa reação é catalisada pelas enzimas glutationas S-

transferases (GSTs). Após a reação, o conjugado GS-DNB é detectado no

comprimento de onda de 340nm em espectrofotômetro.

No intuito de determinar as condições do ensaio GST para tecido hepático de

quelônios foram construídas duas curvas de cinética enzimática para GST para a

espécie Chelonia mydas. O espécime utilizado foi C. mydas SN8 (Tabela V-1). As

curvas cinéticas foram utilizadas para determinar os parâmetros cinéticos de

velocidade máxima (Vmax) e a constante de Michaelis-Menten aparente (Kmapp)

para os substratos CDNB e GSH.

Para os ensaios de determinação das condições de ensaio da atividade da

enzima GST para tecido hepático de C. mydas foram realizados ensaios com

concentração fixa de GSH (2,5 mM), concentrações crescentes de CDNB de

0,125; 0,156; 0,25; 0,312; 0,500; 0,625; 1; 1,25; 2 e 2,5 mM, e concentração final

de etanol de 7,5%, a fim de possibilitar a utilização de concentrações mais

elevadas de CDNB. Uma segunda curva de cinética enzimática de GST foi

construída, utilizando-se uma concentração fixa de CDNB de 2,5 mM e

concentrações crescentes de GSH de 0,011; 0,023; 0,046; 0,093; 0,187; 0,375;

0,75; 1,5; 3 e 6 mM. A concentração final de etanol no ensaio foi de 7,5%.

A atividade GST foi calculada com a fórmula:





de Biomarcadores


Pág. 142 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Onde,


milliAbs.min = taxa de formação de GS-DNB (ε = 9,6 mM.cm-1)





Para obtenção do Kmapp e Vmax, ambas as curvas de cinética enzimática

foram submetidas à regressão não linear, com a equação hiperbólica de

Michaelis-Menten, por meio do programa Graphpad Prism 5.

Vmax é compreendida como a velocidade máxima da enzima nas condições




parâmetros são importantes para padronização do ensaio GST em cada espécie

de tetrápode.




(𝐾𝑚+[𝑆])

Onde, Vmax = velocidade máxima Km = Km [S] = concentração do substrato vo = velocidade inicial

V.4.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO


dos Km aparentes obtidos para ambas as curvas cinéticas. Wilkinson (1971)

Pág. 143 / 203


de Biomarcadores




______________________




Revisão 02 06/2018

recomenda que para o estabelecimento de condições de ensaio enzimático o

substrato seja utilizado em concentrações de cinco a 10 vezes o Km. Com base

nessas diretrizes, o substrato GSH deveria ser utilizado em concentrações de

3,15 a 6,3 mM, enquanto CDNB deveria ser utilizado em concentrações entre 8,8

e 17,6 mM (Figura V.4-1).

No entanto, a concentração final de etanol necessária para solubilizar a

concentração requerida de CDNB (de 8,5 a 19 mM) seria maior que 10% de

etanol. Estas concentrações de álcool são muito discrepantes dos 5% de etanol

utilizado nos ensaios de Keen, Habig e Jakoby (1976) e Habig e Jakoby (1981).

Habig e Jakoby (1981) recomendam o uso da menor quantidade possível de

etanol, pois esse álcool pode inibir as reações enzimáticas. A escolha das

concentrações de GSH e CDNB, de 2,5 mM e 2,5 mM, respectivamente, foi

realizada de forma a otimizar as condições do ensaio, maximizando a atividade

GST, em concentrações de etanol que permitissem a solubilização do CDNB, e

não inibissem as reações enzimáticas. A escolha dessas concentrações permitirá

a comparação dos resultados obtidos com os dados encontrados na literatura,

cujos ensaios foram realizados em sua maioria com até 7,5% de etanol e

concentração dos substratos de 1 mM (vide Tabela V-4, apresentada na seção

V.7). Em relação aos ensaios descritos na literatura, a padronização realizada

neste trabalho tem a vantagem de utilizar concentrações de GSH apropriadas

especificamente à atividade GST em tecido hepático de C. mydas, conforme

determinado pelo Kmapp. A observação desta particularidade garante que os

ensaios sejam realizados em condições saturantes, ou seja, que as

concentrações de GSH não atuem como fator limitante à atividade enzimática.




de Biomarcadores


Pág. 144 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Figura V.4-1 - Curvas cinéticas de atividade GST em tecido hepático de Chelonia mydas construídas com concentrações crescentes dos substratos enzimáticos glutationa reduzida (GSH) (A) e 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (B). Condições do ensaio: tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 30°C. Km aparente e Vmax obtidos por meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Michaelis-Menten.

Desta forma, os futuros ensaios de atividade GST em tecido hepático de C.

mydas deverão ser realizados nas seguintes condições:

Tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0)

2,5 mM de GSH

Cinética enzimática de Chelonia mydas

0 2 4 6 80

1000

2000

3000

C. mydas SN8

Km= 0,6295

Vmáx= 2736

[GSH]

mU

/mg

prt

Cinética enzimática de Chelonia mydas

0 1 2 30

500

1000

1500

2000

C. mydas SN8

Km= 1,756

Vmáx= 3006

[CDNB]

mU

/mg

prt

A

B

Pág. 145 / 203


de Biomarcadores




______________________




Revisão 02 06/2018

2,5 mM de CDNB

7,5% etanol

Temperatura de 30°C

O Vmax obtido para esta espécie é maior que os valores quantificados nesta

e outras espécies de quelônios marinhos e de água doce (Tabela V-4,

apresentada na seção V.7). Este resultado reforça a importância da adequação

das condições de ensaio enzimáticas que foram padronizadas.

V.5 – DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO DA


V.5.1 – EXPERIMENTOS REALIZADOS

A determinação das condições de ensaio da EROD foi realizada por meio de

ensaios que utilizaram um ‘pool’ de tecido hepático de tartaruga Chelonia mydas.

Este ‘pool’ continha volumes similares de frações microssomais das quinze

amostras homogeneizadas dos espécimes de C. mydas que não foram utilizados

no ensaio da atividade de GST.

Para determinação dos parâmetros Vmax e Kmapp para o substrato 7-ER

foram realizados curvas cinéticas de atividade EROD com concentração fixa de

NADPH (1 mM) e concentrações crescentes de 7-ER (0,0156; 0,0312 0,0625;

0,125; 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8 e 16 µM).


(RFU) em picomoles de resorufina. A atividade foi expressa em fentomoles de

resorufina formada por minuto por mg de proteína (fmol.min-1.mgprt-1), usando a

seguinte fórmula:

Atividade EROD =((𝑹𝑭𝑼×𝒎𝒊𝒏−𝟏)×(𝒄𝒐𝒆𝒇.𝒓𝒆𝒔𝒐𝒓𝒖𝒇𝒊𝒏𝒂)

𝒎𝒈𝒑𝒓𝒐𝒕𝒆í𝒏𝒂 ) ∗ 𝟏𝟎𝟎𝟎

A curva de cinética enzimática foi avaliada por meio de regressão não linear,

com as equações de Michaelis-Menten e do modelo de inibição por substrato,

para obtenção do Kmapp e Vmax, usando o programa Graphpad Prism 5.




de Biomarcadores


Pág. 146 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018


(𝐾𝑚+[𝑆])

Onde,


Km = Km




𝐾𝑚+([𝑆]×(1+[𝑆]

𝐾𝑖))

Onde,


Km = Km




No caso de inibição de uma enzima pelo substrato, a padronização do método

com concentrações do substrato iguais a 100, 50, 10 ou 5 vezes o Km da enzima

deve ser aplicada com cautela, pois dependendo da concentração do substrato

pode haver inibição da enzima (BISSWANGER, 2011; 2014).



NADPH (0,25; 0,5; 1; 2 e 4 mM). A concentração fixa de 7-ER foi determinada

com base no Kmapp obtido para este substrato.



Elmer). Resumidamente, 60 µg de proteína microssomal de cada amostra foram

adicionados por poço, ajustando o volume final para 20 µL com tampão de

microssoma, se necessário, e incubadas com 140 µL de 7-etoxiresorufina (7-ER)

por 10 minutos a 30ºC (VENANCIO et al., 2013). Após a incubação, 40 µL de

NADPH foram adicionados em cada poço para iniciar a reação. O protocolo foi

adaptado de Burke e Mayer (1974). O par de excitação e emissão (ex/em) foi

ajustado para 530nm/585nm com filtro (cutoff) em 550 nm e fotomultiplicador

Pág. 147 / 203


de Biomarcadores




______________________




Revisão 02 06/2018

ligado no máximo (high) para otimizar a detecção de resorufina. Foram realizadas

20 leituras por poço em cada intervalo temporal de 30 s. A reação foi monitorada

por 600 s e o coeficiente angular da reta RFU.min-1 foi utilizado para o cálculo da

atividade enzimática.

V.5.2 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para o ensaio com NADPH, os resultados dos testes evidenciaram uma

menor atividade EROD nas concentrações de 0,25 e 4 mM de NADPH (Figura

V.5-1A). Dessa forma, concentrações entre 0,5 e 2 mM de NADPH mostraram-se

mais adequadas para este ensaio, garantindo que haja equivalentes redutores

suficientes para redução do citocromo P450 (HANNEMANN et al., 2007). O

ensaio cinético manter-se-á linear enquanto os substratos estiverem em

concentrações saturantes. Neste ensaio, apesar da concentração de 0,5 mM de

NADPH não ter atuado como fator limitante, optar-se-á para futuros ensaios

EROD em tecido hepático de C. mydas pela concentração final de 1 mM de

NADPH. Essa concentração possibilitará a ampliação do tempo de reação, tendo

em vista que serão realizadas diversas amostras simultaneamente durante a fase

de monitoramento.

A curva cinética de EROD em função de 7-ER (Figura V.5-1B) apresentou

um Kmapp de 1,146 µM e Vmax de 1084 fmol.min-1.mgprt-1. De acordo com

Wilkinson (1971), para o estabelecimento de condições ideais de qualquer ensaio

enzimático, a concentração de substrato sugerida é de cinco a dez vezes os

valores de Km. Com base nestas diretrizes, o substrato 7-ER deveria ser utilizado

em concentrações de 5,7 a 11 µM. No entanto, foi observada uma diminuição da

atividade EROD na concentração mais elevada de 7-ER.

Esse padrão sugere um perfil de inibição pelo substrato (Figura V.5-1B). De

fato, a curva cinética obtida foi significativamente melhor ajustada para um

modelo de inibição por substrato, do que por um modelo clássico de Michaelis-

Menten (p<0,0001).

A inibição por substrato já foi observada em reações enzimáticas catalisadas

por citocromo P450 (Lin et al., 2001). Stromme e Theodorsen (1976) propuseram

a utilização de gráficos duplo-recíprocos de Lineweaver-Burk para linearização

dos dados enzimáticos de γ-glutamil transferase, facilitando a identificação do




de Biomarcadores


Pág. 148 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

ponto no eixo X, referente à concentração do 1/[substrato], em que a relação

1/[substrato] versus1/V inverte-se, ou seja, o momento no qual o incremento de

substrato reflete em um decréscimo da atividade enzimática.

O gráfico linearizado de Eadie-Hofstee foi construído para a curva cinética de

EROD em tartaruga C. mydas (Figura V.5-1B – ‘inset’) permitiu identificar que a

inversão na relação V versus V/[7-ER] ocorreu na relação V/[7-ER] de 98,57,

referente ao ponto de 8 µM de 7-ER. Dessa forma, sugere-se a utilização de

concentrações de 7-ER abaixo de 8 µM para o ensaio EROD em tecido hepático

de tartaruga C. mydas.

Com base nos resultados obtidos, as condições para ensaio EROD em fígado

de C. mydas em estudos futuros serão:

60 µg de proteína microssomal em tampão Tris/NaCl (50 mM/0,1M, pH

7,4)

4 µM de 7-ER

1 mM de NADPH

Temperatura de 30ºC

A Vmax observada para C. mydas está abaixo da identificada na literatura

para tartarugas terrestres Chrysemys picta picta induzidas com PCBs, embora

seja similar à mensurada para atividade EROD de Phrynops geoffroanus (Tabela

V-5, apresentada na seção V.7). Dados sobre atividade EROD em tartarugas

marinhas não estão disponíveis na literatura para comparação.

Pág. 149 / 203


de Biomarcadores




______________________




Revisão 02 06/2018

Figura V.5-1 - A. Efeito de diferentes concentrações de NADPH na atividade EROD, normalizada pela atividade média da concentração 1 mM. B. Curva cinética de atividade EROD em tecido hepático de Chelonia mydas construída com concentrações crescentes do substrato enzimático 7-etoxiresorufina (7-ER), sendo Kmapp e Vmax obtidos por meio de regressão não linear dos dados ajustados ao modelo de Inibição por substrato, linhas hachuradas indicam o intervalo de confiança de 95%. ‘Inset’ – Gráfico de Eadie-Hofstee da curva cinética. O Vmax calculado pelo programa é o Vmax estimado na ausência de inibição por substrato.

0 1 2 3 4 50

300

600

900

6 8 10 12 14 16

Vmáx = 1084 60,68

Kmapp= 1,146 0,13

Ki = 25 4,9


[7-ER] (M)

fmo

l.m

in-1

. m

g p

rote

ina

-1

0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 20000

200

400

600

800

1000

[V/Substrate]

V

Atividade EROD - C. mydas

0,25

mM

0,5

mM

1 m

M

2 m

M

4 m

M

0

50

100

150

[NADPH] (mM)

% d

e a

tivid

ad

e e

m r

ela

çã

o

à m

éd

ia d

e 1

mM

A

B




de Biomarcadores


Pág. 150 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

V.6 – RESUMO DAS CONDIÇÕES DE ENSAIO PARA ANÁLISE DE

BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS PARA QUELÔNIOS

As condições ótimas para realização de futuros ensaios com tecido hepático

de C. mydas encontram-se sumarizadas nas tabelas abaixo. Todas as condições

ora apresentadas foram determinadas com base nos ensaios realizados durante a

etapa de padronização do presente projeto.

Tabela V-2 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade glutationa S-transferase (GST) com amostras de quelônios.


Tampão [GSH]

mM [CDNB]



Chelonia mydas


pH 7,0) 2,5 2,5 30 °C Fígado Freezer -80 °C

Tabela V-3 - Condições ótimas para a realização do ensaio de atividade etoxiresorufina-O-deetilase (EROD) com amostras de quelônios.


Tampão [7-ER]

µM [NADPH]



Chelonia mydas


7,4) 4 1 30 °C Fígado Freezer -80 °C

Pág. 151 / 203


de Biomarcadores




______________________




Revisão 02 06/2018

V.7 – BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS EM QUELÔNIOS:


A tabela comparativa apresentada abaixo (Tabela V-4) traz o resumo das

informações obtidas na literatura para a atividade GST de quelônios. Os dados

mostram que a atividade GST em fígado de Chelonia mydas, avaliada durante as

etapas de padronização do presente projeto, é maior que aquela observada para

a mesma e para outras espécies de tartarugas marinhas. A tartaruga de água

doce, Chrysemys picta, foi a única que apresentou atividade GST maior que C.

mydas.




de Biomarcadores


Pág. 152 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Tabela V-4 - Comparação de dados de atividade glutationa S-transferase (GST) oriundos da padronização do presente projeto com aqueles reportados na

literatura para quelônios.

ESPÉCIE TECIDO ORIGEM DA

AMOSTRA

CONDIÇÃO DA

AMOSTRA

TRATAMENTO [GSH] [CDNB] TEMPERATURA DO

ENSAIO

Km (μM)

VMÁX (mU.mgprt-1)

REFERÊNCIA

Chelonia mydas Fígado Necrópsia Código 2 Não 0,011 – 6 mM

0,125 – 2,5 mM

30 °C GSH: 629 CDNB: 1.756

GSH: 2736 CDNB: 3006

Este trabalho

Fígado Necrópsia <24 h post mortem

Não 1 mM 1 mM 25 °C - 1103 ± 267 Richardson et al., 2010


Não 1 mM 10 mM 25 °C - ~1000 Valdivia et al., 2007


Não 0,0625 - 1 mM

0,0625 - 1 mM

25 °C GSH: 163 CDNB: 547

GSH: 1254 CDNB: 1777

Richardson et al., 2009

Sangue Coleta direta

Fresca Não 1 mM 1 mM 25 °C - P.A.*: 990±170 B.M.*²: 620±110

Labrada-Martagón et al., 2011

Caretta caretta Fígado Necrópsia <24 h post mortem



Não 0,0625 - 1 mM

0,0625 - 1 mM

25 °C GSH: 172 CDNB: 269

GSH: 1201 CDNB: 134


Lepidochelys olivacea




Não 0,0625 - 1 mM

0,0625 - 1 mM

25 °C GSH: 225 CDNB: 373

GSH: 1059 CDNB: 1201


Eretmochelys imbricata


Não 0,0625 - 1 mM

0,0625 - 1 mM

25 °C GSH: 122 CDNB:

GSH: 712 CDNB: 929


Pág. 153 / 203


de Biomarcadores




______________________




Revisão 02 06/2018

455 Sangue Coleta

sanguínea Fresca Não 1 mM 1 mM 25 °C - 4 U mg Hb-1 Tremblay et

al., 2017 Chrysemys picta Fígado Necrópsia Coletado


Não 1 mM 1 mM 25 °C - I*³: 8000± 1300 NI*4: 8200± 1100

Rie et al., 2000

Phrynops geoffroanus

Fígado Necrópsia Coletado imediatamente após a morte

Não 2 mM 2 mM 30 °C - Controle: 2000±170 Área urbana: 2730±150

Venancio et al., 2013*

*Após comunicação via correio eletrônico com os autores foi percebido que o artigo apresentava um erro nas concentrações dos reagentes. As concentrações utilizadas nos

ensaios foram 2 mM para GSH e CDNB.

Tabela V-5 - Comparação de dados de atividade etoxiresorufina-O-deetilase (EROD) oriundos da padronização do presente projeto com aqueles reportados na

literatura para quelônios.



TRATAMENTO [7-ER] [NADPH] TEMPERATURA DO

ENSAIO

Km (μM)

VMÁX (pmol.mgprt-1.

min-1)

REFERÊNCIA

Chelonia mydas

Fígado Necrópsia Código 2 NÃO 0,015 - 16 µM

1 mM 30 °C 1,15±0,13

1,084±0,06 Presente trabalho

Chrysemys picta

Fígado TCB (5 – 50 mg kg-

1) BNF (25 – 50 mg kg-1) Aroclor (100 mg kg-

1) 2,3,3′,4,4′- PeCB (5 mg kg-1)

2 µM 1 mM 22 °C - Controle: ~5 BNF: ~45 Aroclor: ~35 PCB77: ~40 PCB105: ~40

Yawetz et al., 1998

Fígado Necrópsia Coletada imediatamente após a morte

Não 2 µM 1,67 mM 25 °C - I: Fêmeas - 3,3±0,5 a 4,2±0,5; Machos – ND a

Rie et al., 2000




de Biomarcadores


Pág. 154 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

5,8±1,5 NI: Fêmeas – 2,5; Machos – ND – 3,8±0,6

Phrynops geoffroanus


Não 3,32 µM 0,2 mM 25 °C - Controle: 0,4±0,049 Área urbana: 0,85±0,21

Venancio et al., 2013*

Chelydra serpentina serpentina


Não 2 µM 0,6 mM 37 °C - Lynde Park: 20 Algonquin: 5

Bishop et al., 1998

*Após comunicação via correio eletrônico com os autores foi percebido que o artigo apresentava um erro nas concentrações dos reagentes. As concentrações utilizadas nos

ensaios foram 3,32 mM de 7-ER e 0,2 mM de CDNB.

Pág. 155 / 203


de Biomarcadores




______________________




Revisão 02 06/2018

A otimização dos ensaios realizados neste estudo para substrato e

temperatura da reação permitiu uma análise mais robusta da atividade GST em

amostras de C. mydas, o que pode explicar a diferença em relação aos dados da

literatura. No entanto, é possível também que as diferenças estejam associadas à

variação interindividual, decorrente de características intrínsecas ao organismo,

como sexo, hábito alimentar e idade, e/ou relacionadas à exposição a

determinadas condições ambientais ou ao tempo post mortem.

Devido à ausência de trabalhos prévios que tenham mensurado atividade

EROD em tartarugas marinhas, somente foi possível a comparação dos dados

obtidos com aqueles obtidos em quelônios de água doce ou terrestres (Tabela V-

5). Pode-se observar uma elevada variabilidade de atividade EROD entre as

espécies. Em geral, os valores de Vmax obtidos em C. mydas foram menores que

a atividade EROD encontrada em outras espécies. Os ensaios realizados

permitiram a obtenção de informações importantes sobre as concentrações

inibitórias do substrato 7-ER, que variam significativamente entre espécies de

tetrápodes. Esta é uma informação de alta relevância, tendo em vista que

concentrações elevadas do substrato podem inibir a atividade EROD em C.

mydas, conforme discutido na seção V.5.2 deste relatório.



VI. Padronização de técnicas

para análise de

biomarcadores moleculares

Pág. 156 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

VI – PADRONIZAÇÃO DE TÉCNICAS PARA ANÁLISE DE

BIOMARCADORES MOLECULARES

O transcriptoma corresponde ao conjunto completo de RNAs, denominados

transcritos, produzidos por um organismo em um determinado tempo, local ou

condição ambiental. Por meio deste, é possível identificar quais genes estão

sendo expressos em resposta a diferentes estímulos, tais como a exposição a

contaminantes ambientais (SNAPE et al., 2004).

Considerando a complexidade desse tipo de análise, o número de amostras

coletadas, a diversidade de espécies e o ineditismo desse tipo de monitoramento,

o presente projeto prevê o sequenciamento do transcriptoma de quatro espécies:

uma ave, uma tartaruga e dois cetáceos marinhos. O desenvolvimento desta

ferramenta visa a identificação dos genes de interesse citocromo P4501A

(CYP1A), fator de transcrição E2F, chaperona HSP70, receptor de estrogênio

(ER), receptor de aril hidrocarboneto (AhR) e UDP-glicuronil-transferase (UDPGT)

(FOSSI et al., 2010, 2013, 2014; PANTI et al., 2011), conforme especificação

técnica do projeto.

A escolha das espécies deve seguir alguns critérios, tais como a

disponibilidade de amostras coletadas no âmbito do Projeto de Monitoramento de

Praias (PMP-BS) e do Projeto de Monitoramento de Cetáceos da Bacia de Santos

(PMC-BS), a distribuição geográfica da espécie (hábitos costeiros ou oceânicos),

e a disponibilidade pública de sequências gênicas. Desta forma, são discutidos, a

seguir, os critérios separados para cada grupo animal no âmbito dos projetos

PMC-BS e PMP-BS. São apresentados, ainda, os resultados da padronização de

biomarcadores moleculares, para as espécies selecionadas, realizados até o

momento pela equipe.

VI.1 – DEFINIÇÃO DE ESPÉCIES-ALVO: AVES MARINHAS

Em relação às aves marinhas, até o dia 03/05/2017, haviam sido coletados

168 espécimes de 15 espécies, conforme disponibilizado no banco de dados

SIMBA. Destas, o pinguim-de-magalhães, Spheniscus magellanicus, apresenta-se

como a espécie mais abundante, com 64 espécimes coletados para análise de

Pág. 157 / 203


para análise de




______________________




Revisão 02 06/2018

biomarcadores. A gaivota, Larus dominicanus, apresenta-se como a segunda

espécie mais coletada, com 39 indivíduos, seguida do bobo-pequeno, Puffinus

puffinus, com 28 espécimes. Para as demais espécies coletadas no PMP-BS,

existem disponíveis desde um até nove espécimes para a análise de

biomarcadores (Tabela VI-1).

Tabela VI-1 - Espécies de aves marinhas, respectivos números de espécimes coletados junto ao PMP-BS até o momento e dados de presença de transcriptoma público. As espécies com número amostral satisfatório para o desenvolvimento do transcriptoma estão destacadas em azul.

Classe Aves

Espécie Número de espécimes Transcriptoma público

Spheniscus magellanicus 64 Não

Larus dominicanus 39 Não

Puffinus puffinus 28 Não

Sula leucogaster 15 Não

Phalacrocorax brasilianus 06 Não

Fregata magnificens 06 Não

Calonectris diomedea 03 Não

Procellaria aequinoctialis 03 Não

Puffinus gravis 02 Não

Sterna hirundo 02 Não

Thalassarche melanophris 02 Não

Charadrius semipalmatus 01 Não

Macronectes giganteus 01 Não

Oceanites oceanicus 01 Não

Thalasseus acuflavidus 01 Não

Total 168 -

Dentre as aves mais abundantes, S. magellanicus caracteriza-se por ser uma

espécie migratória, encontrada no sul da América do Sul. Dos espécimes de S.

magellanicus coletados no âmbito do PMP-BS, 46 foram amostrados pela base

R3 Animal, seguido de seis indivíduos coletados pela equipe da UDESC, em

Laguna, SC. De um a quatro espécimes são provenientes das demais bases.

No Brasil, os pinguins-de-magalhães são encontrados ao longo da costa das

regiões sul e sudeste nas estações frias, para onde se deslocam em busca de

alimento, cuja dieta é formada basicamente por peixes, crustáceos e cefalópodes

(PINTO et al., 2007). De acordo com a Lista Vermelha de Espécies Ameaçadas

da União Internacional para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais

(IUCN), S. magellanicus é uma espécie classificada como quase ameaçada de

extinção (IUCN, 2017a). Dentre as principais ameaças, merece destaque a

poluição por óleo e derivados de atividades da indústria do petróleo, o que




para análise de


Pág. 158 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

justificaria sua escolha como espécie sentinela em estudos de monitoramento

ambiental. Entretanto, a espécie não utiliza a área onde ocorre a produção de

petróleo e gás natural pela PETROBRAS na Bacia de Santos, de forma que os

impactos dessa atividade não seriam monitorados. Por esse principal motivo a

espécie S. magellanicus, em acordo com o IBAMA, não foi selecionada como

prioritária para a análise de biomarcadores. Ainda, cabe mencionar que são

poucos os trabalhos no âmbito da ecotoxicologia realizados com S. magellanicus

(BALDASSIN et al., 2016; KEHRIG et al., 2015), cujas sequências nucleotídicas

de genes biomarcadores permanecem desconhecidas (Tabela VI-1).

A segunda espécie mais coletada pelo PMP-BS, L. dominicanus, caracteriza-

se pela sua ampla distribuição geográfica em regiões costeiras do hemisfério sul.

Dentre os espécimes de L. dominicanus disponíveis para a análise de

biomarcadores, doze foram coletados no Paraná pela equipe da UFPR, oito são

provenientes das bases da Univali e Univille, seguidos de sete, quatro e três

exemplares coletados pelas bases R3 Animal, da Udesc e CTA, respectivamente.

As demais bases coletaram um espécime cada.

Apresenta uma dieta alimentar generalista e oportunista, sendo capaz de

utilizar vários hábitats e diferentes presas (COULSON, COULSON, 1992;

LUDYNIA, GARTHE, LUNA-JORQUERA, 2005). De acordo com a Lista Vermelha

de Espécies Ameaçadas da IUCN, a gaivota não é considerada uma espécie

ameaçada de extinção, mas pode sofrer futuras ameaças, tais como aquelas

oriundas de derrames de petróleo (IUCN, 2016a). Assim como S. magellanicus, L.

dominicanus também não apresenta sequências gênicas disponíveis no banco de

dados público do NCBI. Desta forma, a espécie L. dominicanus foi selecionada

como prioritária para a análise de biomarcadores.

Em relação à bobo-pequeno, P. puffinus, embora apresente um pequeno

número amostral, sua coleta foi realizada de forma homogênea, com seis

indivíduos encontrados no litoral sul de São Paulo, pelo Biopesca, seguido de

cinco espécimes amostrados no Paraná, pela equipe da UFPR. Quatro

exemplares foram coletados em Florianópolis, pela equipe da R3 animal, e quatro

na região de Laguna, pela equipe da UDESC, além de três espécimes

provenientes do litoral norte de SC, pela equipe da Univille. Adicionalmente, dois

espécimes foram coletados pelas equipes da Univali (litoral central de Santa

Pág. 159 / 203


para análise de




______________________




Revisão 02 06/2018

Catarina) e CTA (Estado do Rio de Janeiro), e um indivíduo coletado em cada

uma das bases do IPeC e Argonauta (Estado de São Paulo).

Em termos biológicos, P. puffinus caracteriza-se por ser uma ave marinha

migratória, cosmopolita, com ampla distribuição geográfica e hábito alimentar

diverso, alimentando-se especialmente de pequenos peixes, crustáceos e lulas

(LEE, 1995). De acordo com a Lista Vermelha de Espécies Ameaçadas da IUCN,

bobo-pequeno não é considerada ameaçada de extinção, mas pode sofrer

ameaças de diversas atividades antropogênicas, como poluição luminosa,

diminuição de área de vida e poluição marinha (IUCN, 2016b). P. puffinus também

não apresenta sequências gênicas disponíveis no banco de dados público do

NCBI. Cardoso et al. (2014) observaram níveis significativos de metais,

organoclorados e presença de bactérias em exemplares de P. puffinus coletados

no litoral fluminense e capixaba e sugeriram a utilização desta espécie como

organismo sentinela. Além disso, desde o início do PMP-BS em agosto de 2015,

já foram registrados 45 indivíduos oleados, cujas amostras de óleo foram

encaminhadas para análise de fingerprint a fim de identificar a origem e o tipo do

óleo (bruto ou derivado). Apesar de constituir uma espécie de interesse global, em

termos de monitoramento, seu hábito migratório, vindo desde a região do Reino

Unido, no Atlântico Norte, até a costa brasileira, na primavera (GUILFORD et al.,

2009), impõe algumas incertezas dentro do escopo de monitoramento da

atividade de produção de petróleo e gás natural pela PETROBRAS na Bacia de

Santos.

A quarta espécie de ave marinha mais coletada (15 espécimes) no âmbito do

PMP-BS, Sula leucogaster, caracteriza-se por apresentar uma distribuição

geográfica extremamente abrangente. Dos 15 espécimes de atobá coletados,

quatro são provenientes do Paraná e quatro foram coletadas pela equipe do CTA,

três do litoral sul paulista, sendo os demais coletados pela R3 Animal, GREMAR e

pela base da UDESC. Não é considerada uma espécie migratória, sendo

residente em áreas marinhas, onde se alimenta de peixes e lulas. Em função de

sua larga ocorrência e amplo número populacional, o atobá não é considerado

ameaçado (IUCN, 2017b). Em relação às sequências gênicas dos biomarcadores

moleculares, há disponível no banco de dados do NCBI, somente uma sequência

parcial da proteína citocromo P450 19A1 (Número de Acesso GenBank

KY76069.1). Esta sequência foi recentemente depositada por Reddy et al. (2017).




para análise de


Pág. 160 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Esta espécie não foi escolhida como alvo nesta etapa do trabalho em função

do menor número amostral, comparativamente às outras espécies. No entanto,

caso haja um aumento no número de amostras e posterior interesse de sua

análise ao longo do projeto, não é descartada sua utilização futura.

VI.2 – DEFINIÇÃO DE ESPÉCIES-ALVO: TARTARUGAS

MARINHAS

Dentre as três espécies de tartarugas marinhas coletadas no PMP-BS, cujos

dados encontram-se disponíveis no SIMBA em 03/05/2018, 265 espécimes são

de Chelonia mydas, seguida de dois indivíduos de Caretta caretta, e um de

Eretmochelys imbricata (Tabela VI-2). Das 265 tartarugas-verdes amostradas, 95

são provenientes de coletas no litoral norte de São Paulo pelo Instituto Argonauta,

enquanto 41 e 37 foram coletadas no litoral sul paulista pela equipe do Biopesca,

e pela base da UFPR na costa paranaense, respectivamente. Os demais

indivíduos foram amostrados de forma homogênea pelas demais bases do PMP-

BS.

Tabela VI-2 - Espécies de tartarugas marinhas, respectivos números de espécimes

coletados junto ao PMP-BS até o momento e dados de presença de transcriptoma

público. A espécie com número amostral satisfatório para a análise de biomarcadores

moleculares está destacada em azul.

Classe Reptilia

Espécie Número de espécimes

Transcriptoma público

Chelonia mydas 265 Sim

Caretta caretta 02 Sim

Eretmochelys imbricata 01 Sim

Total 268 -

A espécie C. mydas possui distribuição cosmopolita, desde os trópicos até as

regiões temperadas, sendo a espécie de tartaruga marinha com hábitos mais

costeiros (HIRTH, 1997). É uma espécie altamente migratória, de vida longa e

com hábitos alimentares que variam de acordo com a fase de vida. Nos primeiros

anos de vida são onívoras, tornando-se exclusivamente herbívoras após a fase

pelágica. De acordo com Almeida et al. (2011), no Brasil as áreas reprodutivas

Pág. 161 / 203


para análise de




______________________




Revisão 02 06/2018

concentram-se nas ilhas oceânicas, embora seja frequente a ocorrência de

indivíduos juvenis ao longo de toda a costa.

Segundo a Lista Vermelha de Espécies Ameaçadas da União Internacional

para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais (IUCN), C. mydas é

uma espécie classificada como ameaçada de extinção (SEMINOFF, 2004).

Dentre as principais ameaças, merece destaque a captura incidental em artefatos

de pesca, além das mais variadas formas de poluição que modificam os hábitats

marinhos e terrestres. Segundo os dados disponibilizados no SIMBA, é nítido o

impacto antropogênico na costa sudeste brasileira, o que tem resultado na maior

ocorrência de amostras de tartarugas-verdes coletadas até o momento.

Em função de seu estado de vulnerabilidade ecológica e, portanto, com forte

apelo conservacionista, C. mydas já apresenta seu genoma sequenciado (WANG

et al., 2013). Assim, pode-se concluir que para C. mydas já se encontram

disponíveis as sequências de genes previamente selecionados como

biomarcadores moleculares (Tabela VI-3), sem a necessidade de

sequenciamento de seu transcriptoma.


Chelonia mydas e seus respectivos números de acesso no GenBank/NCBI.

Gene de interesse

Descritor Número de acesso no GenBank - NCBI

CYP1A Cytochrome P450 1ª 102933577

E2F1 E2F transcription factor 1 102941250

EEF2 Eukaryotic translation elongation factor 2 102932033

HSPA1-Like Chelonia mydas heat shock 70 kDa protein 1A/1B-like 102935471

HSPA5 Heat shock protein family A (Hsp70) member 5 102940886

HSPA12B Heat shock protein family A (Hsp70) member 12B 102948369


HSPA4L Heat shock protein family A (Hsp70) member 4 like 102941630



HSPA12A Heat shock protein family A (Hsp70) member 12A 102933776


ESR1 Estrogen receptor 1 102934699


AHR Aryl hydrocarbon receptor 102939242

UGT1A1 UDP glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide A1 102944299

Obs.: Acesso realizado em 15/06/2017.

Vale ressaltar que, embora o número de amostras coletadas junto ao PMP-

BS seja irrelevante para fins de monitoramento, o transcriptoma da espécie de




para análise de


Pág. 162 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

tartarugas marinhas C. caretta e E. imbricata foi recentemente sequenciado em

amostras de sangue (HERNANDEZ-FERNANDEZ, 2017; HERNANDEZ-

FERNANDEZ et al., 2017).

VI.3 – DEFINIÇÃO DE ESPÉCIES-ALVO: CETÁCEOS MARINHOS

Dentre os cetáceos marinhos, está previsto o sequenciamento do

transcriptoma de duas espécies, uma da subordem Odontoceti e outra da

subordem Mysticeti. Portanto, com o intuito de identificar potenciais espécies de

cetáceos para o desenvolvimento dos transcriptomas, foi realizado um

levantamento de todas as amostras obtidas para biomarcadores moleculares

durante os ciclos I, II, III, IV, V e VI das Campanhas de Avistagem Embarcada e

Telemetria realizados no âmbito do PMC-BS, bem como de amostras coletadas

pelo PMP-BS.

No total, 244 espécimes de 17 espécies foram amostrados ao longo dos seis

ciclos de campanhas do PMC-BS. Destes, 197 indivíduos pertencem a 14

espécies da subordem Odontoceti, e 47 espécimes pertencem a sete espécies da

subordem Mysticeti (Tabela VI-4). Estes números não incluem amostras de

cetáceos provenientes do PMP-BS.


ao PMC-BS até o momento e dados de presença de transcriptoma público. As espécies


destacadas em azul.

PMC-BS (Ciclos I a VI)

Classe Mammalia

Ordem Cetacea, Subordem Odontoceti



Stenella frontalis 64 Não

Tursiops truncatus 38 Sim

Stenella longirostris 47 Não

Stenella clymene 07 Não

Stenella attenuata 12 Não

Delphinus capensis 04 Não

Delphinus sp. 04 Não

Steno bredanensis 07 Não

Physeter macrocephalus 05 Sim

Peponocephala electra 05 Não

Sotalia guianensis 01 Não

Orcinus orca 01 Sim

Pág. 163 / 203


para análise de




______________________




Revisão 02 06/2018

Dentre os cetáceos amostrados pelo PMP-BS, 72 indivíduos pertencem a

seis espécies da subordem Odontoceti, e somente um espécime era da subordem

Mysticeti (Tabela VI-5). De todas as espécies de cetáceos marinhos amostradas,

três foram coletadas nos dois projetos: Tursiops truncatus, Stenella frontalis e

Stenella longirostris. Entretanto, pode-se observar um padrão de ocorrência

distinto, com maior frequência de espécies exclusivamente costeiras (Pontoporia

blainvillei e Sotalia guianensis) dentre as amostras obtidas pelo PMP-BS. Estas

espécies de pequenos delfinídeos são particularmente vulneráveis a impactos

antropogênicos, especialmente de atividades nos ambientes costeiros (SECCHI,

2012; ZERBINI et al., 2017).


ao PMP-BS até o momento e dados de presença de transcriptoma público. As espécies


destacadas em azul.

PMP-BS

Classe Mammalia

Ordem Cetacea, Subordem Odontoceti


Pontoporia blainvillei 28 Não

Sotalia guianensis 35 Não

Tursiops truncatus 04 Sim

Stenella frontalis 03 Não

Phocoena dioptrica 01 Não

Stenella longirostris 01 Não

Total 72 -

Ordem Cetacea, Subordem Mysticeti


Balaenoptera acutorostrata 01 Não

Total 01 -

Delphinus delphis 01 Não

Globicephala sp. 01 Não

Total 197 -

Ordem Cetacea, Subordem Mysticeti



Balaenoptera borealis 14 Não

Megaptera novaeangliae 14 Não

Balaenoptera brydei 08 Não

Balaenoptera physalus 06 Não

Balaenoptera bonaerensis 03 Não

Eubalaena australis 01 Não

Balaenoptera musculus 01 Não

Total 47 -




para análise de


Pág. 164 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Cabe ressaltar que as amostras hepáticas de cetáceos marinhos

provenientes do PMP-BS foram coletadas post mortem em animais em código 2

de decomposição. Desta maneira, para a definição das espécies para o

sequenciamento do transcriptoma, optou-se por amostras tegumentares de

cetáceos amostrados pelo PMC-BC. Assim, a qualidade do material biológico é

assegurada, evitando eventuais resultados falso-negativos. Diante deste cenário,

a discussão segue em relação às amostras tegumentares de biópsias remotas

obtidas junto ao PMC-BC.

Frente aos resultados apresentados, as espécies S. frontalis, T. truncatus e

S. longirostris representam, respectivamente, 32,5%, 19,3% e 23,8% dos

odontecetos biopsados. Dentre os misticetos, a baleia-sei, Balaenoptera borealis,

representa 29,8% dos animais amostrados, seguida da baleia jubarte, Megaptera

novaeangliae, com 29,8% das amostragens realizadas no PMC-BS e da baleia de

bryde, Balaenoptera brydei, com 17% das amostragens realizadas no PMC.

Portanto, até o momento, estas seis espécies possuem indivíduos biopsados com

número amostral satisfatório para o desenvolvimento dos transcriptomas.

Entretanto, como somente uma espécie de cada subordem será escolhida,

fez-se uma busca no banco de dados do NCBI por sequências de genes e

proteínas das cinco espécies de cetáceos marinhos. Destes, o boto-da-tainha, T.

truncatus, apresentou a maior quantidade de sequências, com 131.061

sequências de nucleotídeos e 54.358 sequências de proteínas depositadas no

NCBI (Tabela VI-7). Vale ressaltar que o transcriptoma desta espécie já foi

sequenciado em amostras de sangue (MOREY et al., 2016) e pele (VAN DOLAH

et al., 2015), corroborando com o grande número de sequências identificadas.

Ainda, 19 sequências referentes aos genes que codificam as proteínas

citocromo P4501A (CYP1A), fator de transcrição E2F, chaperona HSP70, receptor

de estrogênio (ER), receptor de aril hidrocarboneto (AhR) e UDP-glicuronil-

transferase (UDPGT) foram identificadas para T. truncatus no mesmo banco de

dados (Tabela VI-6). Portanto, pode-se concluir que para T. truncatus já se

encontram disponíveis as sequências de genes previamente selecionados como

biomarcadores moleculares, sem a necessidade de sequenciamento do

transcriptoma.

Pág. 165 / 203


para análise de




______________________




Revisão 02 06/2018


Tursiops truncatus e seus respectivos números de acesso no GenBank/NCBI.

Gene Descritor Número de Acesso no

GenBank/NCBI

CYP4501A1-like Cytochrome P450 1A1-like 101329596

EEF2 Eukaryotic translation elongation factor 2 101325570



HSPA12B Heat shock protein family A (Hsp70) member 12B 101332284



HSPA4L Heat shock protein family A (Hsp70) member 4 like 101326624

HSPA12A Heat shock protein family A (Hsp70) member 12 101324430





LOC101335433 Heat shock 70 kda protein 1B 101335433



AHR Aryl hydrocarbon receptor 101329569

UGT 1-3 UDP-glucuronosyltransferase 1-3, known as UGT1A1 101329554

UGT1A10 UDP glucuronosyltransferase family 1 member A10 101322091

Obs.: Acesso realizado em 10/03/2017.

Por outro lado, para as demais espécies selecionadas, S. frontalis, S.

longirostris, B. borealis, M. novaeangliae e B. brydei, um pequeno número de

sequências encontram-se disponíveis, conforme mostra a Tabela VI-7. Cabe

ressaltar que grande parte das sequências identificadas referem-se a genes e/ou

proteínas mitocondriais, com nenhuma relação aos genes pré-definidos como

potenciais biomarcadores moleculares para os tetrápodes marinhos, com exceção

da sequência identificada para AhR em baleia jubarte (Cógido de Acesso no

GenBank/NCBI 118419961).

Portanto, as informações apresentadas, associadas ao número amostral

disponível até o momento, reforçam o uso dos odontocetos S. frontalis ou S.

longirostris, e dos misticetos B. borealis ou B. brydei como espécies prioritárias

para o sequenciamento de transcriptoma visando a identificação de genes

biomarcadores moleculares de exposição a contaminantes ambientais.




para análise de


Pág. 166 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Destaca-se que na revisão 00 do presente Relatório protocolada em abril de

2018 pela Petrobras, foi utilizada a quantidade de amostras coletadas e entregues

pelo PMP-BS e PMC-BS até dezembro de 2017, sendo que as espécies S.

frontalis, B. borealis e T. truncatus foram recomendadas como espécies-alvo de

cetáceos para o monitoramento dos biomarcadores moleculares. Entretanto,

após a atualização da quantidade de amostras disponível para cada espécie

(maio de 2018) e consulta à equipe técnica do PMC-BS, que esclareceu questões

de uso de hábitat, hábitos migratórios e alimentares de cetáceos, decidiu-se pela

revisão da proposta, conforme apresentado na reunião realizada com o IBAMA

em 07/05/2018, tendo sido proposta a substituição de S. frontalis por S.

longirostris e de B. borealis por B. brydei.

Tabela VI-7 - Espécies e correspondente número de sequências gênicas (DNA e RNA) e

de proteínas, obtidas no banco de dados do NCBI.

Espécie Número de sequências gênicas

Número de sequências de proteínas

Tursiops truncatus 131.061 a 54.358 b

Megaptera novaeangliae

2.618 c 1.001 d

Stenella longirostris 823e 1.614 f

Stenella frontalis 319 g 33h

Balaenoptera borealis 102i 99j

Balaenoptera brydei 13l 78m

Fonte: a https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=Tursiops%20truncatus b https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=Tursiops%20truncatus c https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=Megaptera+novaeangliae d https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=Megaptera+novaeangliae

e https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=Stenella%20longirostris f https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=Stenella%20longirostris g https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=Stenella%20frontalis%20 h https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=Stenella%20frontalis%20 ihttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=Balaenoptera%20borealis j https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=Balaenoptera%20borealis l https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=Balaenoptera%20brydei m https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=Balaenoptera%20brydei Obs.: Acessos realizados em 20/05/2017 e 11/12/2017.

Em termos ecológicos, o golfinho-pintado-do-Atlântico, S. frontalis, é

encontrado no Oceano Atlântico, desde o sul do Brasil e até a costa oeste da

África, tanto em regiões costeiras até águas oceânicas profundas, onde

geralmente se desloca em busca de cardumes de peixes migratórios. Não é

considerada uma espécie migratória, e apresenta hábito alimentar diverso,

Pág. 167 / 203


para análise de




______________________




Revisão 02 06/2018

alimentando-se preferencialmente de peixes epi- e mesopelágicos, além de lulas

e invertebrados bentônicos (LOPES et al., 2012). De acordo com a Lista

Vermelha da IUCN, há dados insuficientes para estabelecer o seu estado de

conservação (HAMMOND et al., 2012).

Similarmente, para o golfinho rotador, S. longirostris, ainda não está

estabelecido o estado de conservação da espécie (BEARZI et al., 2012).

Entretanto, sabe-se que se trata de uma espécie com ampla distribuição

geográfica, sendo encontrada em todos os oceanos dos hemisférios norte e sul.

Embora geograficamente bem distribuído, este pequeno cetáceo parece ter

preferência por áreas de talude continental, sobrepondo-se às áreas de

exploração da Bacia de Santos (PETROBRAS, 2017).

Em relação aos misticetos, a baleia-sei, B. borealis, caracteriza-se por

apresentar uma ampla distribuição geográfica, sendo subdividida em duas

subespécies. Apresenta um comportamento migratório ao longo da costa

brasileira que é desconhecido, e se alimenta de copépodos, eufasídios e

anfípodos. Em função da captura ostensiva entre as décadas de 1950 e 1980, as

populações declinaram de forma vertiginosa, sendo atualmente considerada como

uma espécie ameaçada de extinção pela IUCN (REILLY et al., 2008a).

A segunda provável espécie de misticeto para desenvolvimento e análise de

biomarcadores moleculares, a baleia de bryde, B. brydei, é considerada

“deficiente em dados” pela IUCN (REILLY et al., 2008a) e, ao contrário do

comportamento observado para os demais misticetos, não apresenta hábito

migratório, permanecendo na costa brasileira ao longo do ano (PETROBRAS,

2017; WEDEKIN, 2018 COM. PESSOAL).

Por outro lado, a terceira provável espécie de misticeto para desenvolvimento

e análise de biomarcadores moleculares, a baleia jubarte, M. novaeangliae, é

considerada “pouco preocupante” em termos de conservação (REILLY et al.,

2008b), devido à significativas ações conservacionistas em todo o mundo. Esta

espécie cosmopolita caracteriza-se por ser migratória, com períodos de migração

bem definidos entre as áreas de alimentação e reprodução (ANDRIOLO;

ZERBINI, 2010).

Dentre as potenciais espécies-alvo de cetáceos delineadas acima, iniciou-se

a padronização de análise de biomarcadores moleculares apenas para T.




para análise de


Pág. 168 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

truncatus, tendo em vista a existência de sequências gênicas para esta espécie

depositadas no GenBank.

Por fim, e considerando todos os aspectos e critérios abordados neste

documento, a Tabela VI-8 apresenta uma listagem das espécies de tetrápodes

coletadas nos projetos PMP-BS e PMC-BS, e sua relação com a presença de

dados gênicos públicos. A tabela compila os dados apresentados, destacando

somente as espécies com número amostral relevante para fins de monitoramento

por meio da análise de biomarcadores moleculares.

Tabela VI-8 - Lista de espécies coletadas pelo PMP-BS e PMC-BS, e sua relação com

existência de dados gênicos públicos para a espécie.

Espécies com transcriptoma público Espécies sem transcriptoma público

Chelonia mydas Tursiops truncatus

Spheniscus magellanicus Larus dominicanus Puffinus puffinus Stenella frontalis Stenella longirostris Balaenoptera borealis Balaenoptera brydei Megaptera novaeangliae Pontoporia blainvillei Sotalia guianensis

VI.4 – PADRONIZAÇÃO DE BIOMARCADORES MOLECULARES

Considerando o grande número amostral disponível no PMP-BS e PMC-BS

bem como a existência de transcriptoma público, foi iniciada a etapa de

padronização de biomarcadores moleculares em amostras de fígado de Chelonia

mydas e amostras teciduais deTursiops truncatus.

Esses procedimentos foram realizados com o objetivo de: 1) aferir a qualidade

e integridade do RNA extraído com o reagente comercial Qiazol (Qiagen®); 2)

desenhar e verificar se os iniciadores desenhados são capazes de amplificar o

gene alvo em cada espécie com eficiência necessária para a quantificação; e 3)

verificar se os genes escolhidos para o biomonitoramento molecular são

transcritos nos tecidos e espécies avaliados.

Pág. 169 / 203


para análise de




______________________




Revisão 02 06/2018

Para a padronização de técnicas moleculares em C. mydas foi utilizada uma

amostra de tecido hepático de tartaruga verde coletada cerca de 6 horas após a

morte do indivíduo. Este espécime é proveniente do PMP-BS e identificado pelo

código SIMBA 050421.

Para a padronização de técnicas moleculares em T. truncatus foram

utilizadas amostras de baço, cérebro, fígado, gordura, músculo, pele, pulmão e

rim de um espécime, identificado pelo código SIMBA 002892. A coleta destas

matrizes teciduais não está contemplada no presente projeto e foi realizada pela

equipe da UDESC do PMP-BS, em parceira com a equipe do LABCAI, para

utilização em projetos de pesquisa em andamento no LABCAI. As amostras foram

utilizadas para esta etapa adicional de padronização, a fim de garantir que a

avaliação da eficiência e especificidade dos iniciadores pudesse ser identificada

mesmo para genes pouco ou não expressos na pele.

VI.4.1 – EXTRAÇÃO DE RNA E AVALIAÇÕES DE

CONCENTRAÇÃO E INTEGRIDADE

Para esta etapa de padronização, realizou-se, primeiramente, a extração de

RNA das amostras selecionadas. O protocolo de extração de RNA iniciou com a

homogeneização de 100 mg de cada tecido em 1 mL do reagente Qiazol

(Quiagen®). A homogeneização foi realizada com o homogeneizador mecânico

Tissue Tearor (Biospec®). Os tecidos homogeneizados foram incubado a 20ºC por

30 minutos e, após esse período de incubação, foi acrescentado 0,2 mL de

clorofórmio. Os tubos contendo a mistura de Qiazol, amostra e clorofórmio foram

agitados vigorosamente em vórtex por 15 s, mantidos a 20ºC por 3 minutos e

centrifugados a 14.000 xg por 30 minutos a 4ºC.

Após a centrifugação, a fase transparente superior de cada um dos tecidos foi

cuidadosamente separada em outros tubos, ao qual foram acrescentados 0,5 mL

de isopropanol. O conteúdo dos tubos foi misturado por inversão, incubado por 10

minutos a 20ºC e centrifugado a 14.000 xg por 30 minutos a 4ºC.

Após a centrifugação, o RNA (sedimento/pellet) foi mantido e o sobrenadante

descartado. O RNA de cada tecido foi cuidadosamente lavado duas vezes

consecutivas com etanol 75% para remover os reagentes utilizados durante a

extração. Após a purificação com etanol, o RNA foi secado a 40ºC e




para análise de


Pág. 170 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

ressuspendido com água própria para aplicações de biologia molecular. Todos os

reagentes, tubos e ponteiras utilizados no protocolo eram próprios para biologia

molecular (livres de RNAses, DNAses e pirógenos).

A avaliação de concentração e pureza do RNA extraído foi realizada

espectrofotometricamente com o equipamento Nanodrop®. As leituras foram

realizadas em 260 nm, 280 nm e 230 nm. A absorbância em 260 nm foi utilizada

para estimar a concentração de RNA, a razão 260/280 (ótimo entre 1,8-2,0) para

estimar a pureza com relação à contaminação por proteínas e a razão 260/230

(ótimo entre 2,0-2,2) para avaliar a pureza relativa a outros contaminantes, como

sal (WIECZOREK, DELAURIERE, SCHAGAT, 2012).

Além da determinação espectrofotométrica, faz-se necessária a avaliação de

integridade do RNA extraído. Esta avaliação foi realizada através de eletroforese

em gel de agarose 1,2%, tampão MOPS/formaldeído como desnaturante e

GelRed (Biotium®) como corante fluorescente, de acordo com o apêndice C do

manual do kit Omniscript Reverse Transcription (Qiagen).

Todos os reagentes utilizados eram livres de DNAse e RNAses e as cubas e

demais equipamentos foram lavados e descontaminados com dodecilsulfato de

sódio 0,2%, peróxido de hidrogênio e enxaguados com água previamente tratada

com Dietilpirocarbonato (DEPC) para inativar as RNAses.

Foi utilizado 1 µg de RNA das amostras para avaliação da qualidade do RNA

e analisaram-se parâmetros como: a integridade das bandas dos RNAs

ribossomais 18S e 28S, que reflete integridade do RNA; a presença de rastro

intenso de fundo (background), que reflete a degradação do RNA; a presença de

banda de DNA genômico contaminante de alto peso molecular e permanência de

parte do RNA no poço (contaminação por proteínas) (WIECZOREK,

DELAURIERE, SCHAGAT, 2012).

Os resultados das análises espectrofotoméricas e por meio de eletroforese

estão apresentados abaixo. A concentração e pureza (260/280nm e 260/230nm)

das quatro subamostras do mesmo fígado de Chelonia mydas foram

consideradas adequadas para análises de qPCR (Tabela VI-9).

Pág. 171 / 203


para análise de




______________________




Revisão 02 06/2018

Tabela VI-9 - Subamostras de Chelonia mydas com suas respectivas concentrações

(ng/µl) e purezas nas razões de 260/280 e 260/230.

Identificação das

subamostras Concentração

(ng/µL) Razão 260/280 Razão 260/230

Cm1 2093,54 1,94 2

Cm 2 2301,01 1,92 1,98

Cm 3 2128,02 1,94 1,97

Cm 4 1919,31 1,95 2,07

Para T. truncatus, apenas o músculo, gordura e pele apresentaram razão

260/230 dentro da faixa esperada (Tabela VI-10). No entanto, amostras que

apresentam essa contaminação ainda podem ser utilizadas nos ensaios

subsequentes em função da robustez do Kit de transcrição reversa da Qiagen

(Quantitect Reverse Transcription kit), dependendo da razão de pureza 260/280 e

da concentração do RNA extraído. Estas foram consideradas adequadas para as

aplicações de qPCR.

Tabela VI-10 - Concentração (ng/µL) e pureza e razões de 260/280 e 260/230 do RNA

extraído de tecidos de Tursiops truncatus.

Tecido Concentração


Baço 1320,64 1,87 1,75

Cérebro 1154,13 2,02 1,88

Fígado 1696,20 1,98 1,89

Gordura 315,53 1,82 2,16

Músculo 1125,38 1,96 2,18

Pele 1289,62 1,93 2,00

Pulmão 1052,30 1,98 1,91

Rim 160,94 2,00 1,19

Quanto à integridade do RNA extraído, o gel de RNA desnaturante para

amostras de C. mydas mostrou a presença das bandas de RNA ribossomal 28S e

18S, ausência de DNA genômico e contaminação por proteínas. O rastro foi

menor na primeira subamostra e gradativamente maior até a quarta subamostra

(Figura VI.4-1), que foram utilizadas nas análises preliminares de qPCR.




para análise de


Pág. 172 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Figura VI.4-1 - Resultado da avaliação da qualidade do RNA das quatro subamostras do

mesmo fígado de Chelonia mydas. Eletroforese em gel de agarose 1,2% desnaturante

(formaldeído) e corado com GelRed (Biotium). Foi aplicado 1 µg de RNA total. Presença

das bandas de RNA ribossomal 28S e 18S e ausência de DNA genômico e contaminação

por proteínas.

Para T. truncatus a qualidade do RNA extraído foi considerada razoável

apenas para os tecidos do fígado, cérebro, gordura, pele e músculo. Não foi

observado DNA genômico nem contaminação por proteínas como contaminantes

nas amostras (Figura VI.4-2). Entretanto, foi observado RNA de baixo peso

molecular em amostras de fígado gordura, músculo e pulmão, indicando

degradação de amostra. O pulmão não apresentou as bandas de RNA ribossomal

e foi excluído do ‘pool’ de amostras. Os tecidos do rim e baço mostraram um

rastro pouco intenso e ausência de bandas, indicando degradação total de

amostra e não foram considerados nas análises de qPCR (dados não

apresentados*).

Pág. 173 / 203


para análise de




______________________




Revisão 02 06/2018

Figura VI.4-2- Resultado da avaliação da qualidade do RNA das amostras de diferentes

tecidos de Tursiops truncatus. A seguir estão descritos os tecidos correspondentes aos

números apresentados na figura: 1) cérebro; 2) fígado; 3) gordura; 4) músculo; 5) pele; e

6) pulmão. *As amostras de rim e baço não aparecem na figura porque o

fotodocumentador foi incapaz de registrar a fraca intensidade do rastro. O pulmão não

apresentou bandas de RNA ribossomal.

VI.4.2 – DESENHO DE INICIADORES e qPCR

Para o desenho dos iniciadores de Chelonia mydas e Tursiops truncatus

foram utilizadas sequências já depositadas no GenBank para estas espécies

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). A fim de garantir que a amplificação seja

restrita a fragmentos do mRNA, não havendo a amplificação de DNA genômico,

os iniciadores foram desenhados em exons distintos ou em regiões de junção

exonexon.

As sequências foram submetidas ao programa de desenho de iniciadores

PrimerQuest, da Integrated DNA Technologies, disponível no endereço eletrônico

https://www.idtdna.com. Os parâmetros especificados para qPCR foram: tamanho

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/

https://www.idtdna.com/




para análise de


Pág. 174 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

do produto (amplicon) em 120 pb, tamanho do iniciador entre 20 e 26 pb e

temperatura de anelamento entre 58 e 60ºC. Os iniciadores desenhados foram

avaliados quanto à formação de Hairpin, dímeros próprios e não-próprios e

similaridade entre temperatura de dissociação (Tm). Sua qualidade e

complexidade também foram avaliadas pelo programa FastPCR 6.5 (Primer

Digital). Os iniciadores redesenhados encontram-se sumarizados nas Tabelas VI-

11 e VI-12.

Tabela VI-11 - Lista de iniciadores de Chelonia mydas para os genes de interesse do

PMP-BS.

Tabela VI-12 - Lista de iniciadores de Tursiops truncatus para os genes de interesse do

PMP-BS e PMC-BS.

Símbolo Gene Sequência iniciador 5' - 3'

CYP1A Citocromo P450 1A F - GGACACAACACTGAACGGCTTCTA R - GTGTCATGGGCAGTGAGGAATCT

E2F1 E2F fator de transcrição 1 F - CGCCAAGAAGTCCAAGAACCACATC R - CTGTCAGCATCCTCGGAAAGCAG

EEF2 Fator de alongamento F - TGATGATGTGGCAGACGCTGTAATG R - TCTGAGAGCTCGTAGAAGAGGGAAATG

HSPA1 Proteína de choque F - AGCACAAGAAGGACATCAGCCAGAAC

Símbolo Gene Sequência iniciador 5' - 3'

CYP1A Citocromo P450 1AF - ACATTCCTCCTTCCTGCCCTTCA

R - CATCGTGATTGACTTGCCATTGGTTGAC

F - CCCTCTGAGCAAATGGTGATGGTGATAAA

R - TGAAAGGACTCTTGACTGGGCTACAGE2F1 E2F fator de transcrição 1

EEF2 Fator de alongamento F - CTGTACCAGACCTTCCAGCGTATT

R - AAGCCAGAACCAAAGCCAACAG

F - CAGGCGAAGAAGAAGGTGATGGAGAA

R - TGATGCCCGTGGTGCTGTTACTTAHSPA1-like

Proteína de choque térmico

70 kDa 1A/1B-like

ESR1 Receptor de estrogênio alfaF - CTGGCTCAGCTCCTCCTCATAC

R - CTGGCTCCGATTCTCTTCTTCCATC

F - GTCTGGTTGAACTGGAGGAACAGAAG

R - GTGTCTCTTGGATGGATTGGACTTGG

Receptor de hidrocarbonetos

arilaAHR

UGT1A UDP glucuronosiltransferaseF - ACACAAAGCTAATCAAATGGCTAC

R - GTCTCCAAATAATGGCATCAGAAC

Pág. 175 / 203


para análise de




______________________




Revisão 02 06/2018

térmico 70 kDa 1B R - GCCCTGGTGATGGACGTGTAGAA

ESR1 Receptor de estrogênio α F - TTGAGGGCATGGTGGAGATCTTTG R - ACTTCAGGGTGCTGGACAGAAATG

AHR primer A Receptor de hidrocarbonetos arila

F - GGCTGTGTCAATGTACCAGTGC R - GATGGGTGGTAGGCTGAGTGTTATTTATG

AHR primer B Receptor de hidrocarbonetos arila

F - ACAGCAGCATCAGAAGCACAGA R - AAGGCACGGATTGGTTCGAGTT

UGT1A UDP glucuronosiltransferase

F - TCCGATGGTGATGATGCCCTTGTT R - GCGGTCCTTGTGAAGGCTAGAGA

Para amplificação dos genes de interesse, foi primeiramente realizada a

síntese de DNA complementar (cDNA), a partir do RNA extraído de C. mydas e T.

truncatus. Para tal, o RNA total foi tratado com DNAse e submetido à reação de

transcrição reversa para obtenção cDNA com o uso do kit Quantitect Reverse

Transcription® (Qiagen).

Todas as reações de PCR quantitativo (qPCR) foram realizadas com o kit

QuantiNova SYBR Green PCR (Qiagen), usando 0,7 µM de cada iniciador (em um

volume final de reação de 20 µL para cada gene.

Uma curva padrão com concentrações conhecidas de cDNA (200 ng, 100 ng,

50 ng, 25 ng e 12,5 ng) foi submetida às reações de qPCR no termociclador Rotor

Gene® (Qiagen) para obtenção da eficiência da reação. Para T. truncatus essa

curva foi obtida a partir de um ‘pool’ formado de volumes iguais dos cDNAs

sintetizados para cada tecido.

A verificação da especificidade dos produtos de PCR formados (amplicons)

para cada gene foi obtida por meio do monitoramento da fluorescência dos

produtos formados em função do aumento da temperatura (60ºC-95ºC) (i.e. curva

de dissociação, do inglês melting curve) no termociclador Rotor Gene® (Qiagen).

Por fim, um gel de agarose 1,2% em condições nativas em tampão TBE foi

produzido para visualmente aferir a especificidade dos iniciadores na reação de

qPCR.

Os iniciadores dos genes CYP1A1, E2F1, EEF2, ESR1, UGT1A amplificaram

seus respectivos transcritos em fígado de Chelonia mydas (Figuras VI.4-3 e VI.4-

4).




para análise de


Pág. 176 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Figura VI.4-3 - Curva de dissociação dos genes CYP1A1 (vermelho), E2F1 (roxo), EEF2

(laranja), ESR1 (ciano) em fígado de Chelonia mydas. AHR apresentou múltiplos

produtos e não foi mostrado por prejudicar a visualização dos demais picos; HSP não

amplificou. Eixo X (temperatura); Eixo Y (derivada negativa da fluorescência em função

da temperatura, -dF/dT). O ponto máximo de cada linha representa a temperatura de


um produto.

Os iniciadores de AHR amplificaram múltiplos produtos, sugerindo

inespecificidade do iniciador. Os iniciadores para HSP não amplificaram seu

respectivo gene e, portanto, não há curva de dissociação disponível.

Figura VI.4-4 - Curva de dissociação dos genes UGT1 (vermelho) em fígado de Chelonia

mydas. Eixo X (temperatura); Eixo Y (derivada negativa da fluorescência em função da

temperatura, -dF/dT). O ponto máximo de cada linha representa a temperatura de


um produto.

A especificidade do qPCR, testada em gel de agarose 1,2%, indicou que

todos os genes de C. mydas apresentaram um único produto formado,

confirmando a os resultados da curva de dissociação (Figura VI.4-5).

Pág. 177 / 203


para análise de




______________________




Revisão 02 06/2018

Figura VI.4-5 - Gel de agarose 1,2%, nativo, produtos de qPCR formados para os genes

UGT1A, CYP1A1, E2F, EEF2 e ESR1 de Chelonia mydas em duplicata. M representa o

marcador de peso molecular. Presença de outros produtos em E2F.

A análise de eficiência mostrou que a amplificação de todos os genes em

C. mydas, exceto AHR, HSP1A e E2F1, foi considerada satisfatória para a

quantificação de transcritos (0,9 até 1,1). Serão desenhados novos iniciadores

para AHR, HSP1A e E2F1 para amplificar os genes de forma específica e

eficiente.

UGT1A

CYP1A1

E2F

EEF2

ESR1

M




para análise de


Pág. 178 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Tabela VI-13 - Eficiência de amplificação dos genes de interesse em fígado de Chelonia

mydas. Não foi possível amplificar HSP1A e AHR. E: eficiência. A eficiência de 1,00

significa que os amplicons duplicam a cada ciclo e portanto a reação é 100% eficiente.

No mix de tecidos de T. truncatus, as curvas de dissociação dos produtos

amplificados (amplicons) dos genes CYP1A1 (vermelho), E2F (roxo), ESR1

(rosa), HSP (laranja), UDPGT1 (ciano) mostraram um único produto (amplicon)

(Figura VI.4-6). O par de iniciadores para EEF2 não amplificou seu gene no mix

de tecidos e por isso não há curva de dissociação correspondente. Outro gene

referência será escolhido (e.g. GAPDH) ou novos iniciadores serão desenhados

para esse gene (EEF2).

O par de iniciadores AHR primer A amplificou dois produtos e não será

utilizado neste estudo (Figura VI.4-6).

Símbolo Gene Sequência iniciador 5' - 3' E

CYP1A Citocromo P450 1AF - ACATTCCTCCTTCCTGCCCTTCA

R - CATCGTGATTGACTTGCCATTGGTTGAC

F - CCCTCTGAGCAAATGGTGATGGTGATAAA

R - TGAAAGGACTCTTGACTGGGCTACAGE2F1 E2F fator de transcrição 1

EEF2 Fator de alongamento F - CTGTACCAGACCTTCCAGCGTATT

R - AAGCCAGAACCAAAGCCAACAG

F - CAGGCGAAGAAGAAGGTGATGGAGAA

R - TGATGCCCGTGGTGCTGTTACTTAHSPA1-like

Proteína de choque térmico

70 kDa 1A/1B-like

ESR1 Receptor de estrogênio alfaF - CTGGCTCAGCTCCTCCTCATAC

R - CTGGCTCCGATTCTCTTCTTCCATC

F - GTCTGGTTGAACTGGAGGAACAGAAG

R - GTGTCTCTTGGATGGATTGGACTTGG

Receptor de hidrocarbonetos

arilaAHR

UGT1A UDP glucuronosiltransferaseF - ACACAAAGCTAATCAAATGGCTAC

R - GTCTCCAAATAATGGCATCAGAAC

0,96

1,12

1,00

N.A

1,03

N.A

1,00

Pág. 179 / 203


para análise de




______________________




Revisão 02 06/2018

Figura VI.4-6 - Curva de dissociação dos genes CYP1A1 (vermelho), AHR primer A (azul escuro), E2F1 (roxo), ESR1 (rosa), HSP (laranja), UGT1 (ciano) em mix de tecidos de Tursiops truncatus. Eixo X (temperatura); Eixo Y (derivada negativa da fluorescência em função da temperatura, -dF/dT). O ponto máximo de cada linha representa a temperatura de dissociação do produto. A presença de mais de um pico sugere a presença de mais de um produto.

A especificidade do qPCR para T. truncatus também foi testada em gel de

agarose 1,2%. Todos os genes apresentaram um único produto formado,

confirmando os resultados da curva de dissociação (Figura VI.4-7).

Figura VI.4-7 - Gel de agarose 1,2%, nativo, produtos de qPCR formados para os genes CYP1A, E2F, ESR1, HSPA, UGT1A e AHR primer B em mix de tecidos de Tursiops truncatus.

A análise de eficiência mostrou que a amplificação de todos os genes em

T. truncatus, exceto EEF2 e AHR, foi considerada satisfatória para a quantificação

de transcritos (0,9 até 1,1). Será utilizado um segundo iniciador para AHR já

desenhado e avaliado nas qPCRs, e um novo iniciador para EEF2 será




para análise de


Pág. 180 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

desenhado a fim de garantir a amplificação os genes de forma específica e

eficiente.

Tabela VI-14 - Eficiência de amplificação dos genes de interesse em tecidos de Tursiops

truncatus. E: eficiência. A eficiência de 1,00 significa que os amplicons duplicam a cada

ciclo e portanto a reação é 100% eficiente.

Símbolo Gene Sequência iniciador 5' - 3' E

CYP1A Citocromo P450 1A F - GGACACAACACTGAACGGCTTCTA R - GTGTCATGGGCAGTGAGGAATCT

1,15

E2F1 E2F fator de transcrição 1

F - CGCCAAGAAGTCCAAGAACCACATC R - CTGTCAGCATCCTCGGAAAGCAG

1,02

EEF2 Fator de alongamento F - TGATGATGTGGCAGACGCTGTAATG R - TCTGAGAGCTCGTAGAAGAGGGAAATG

N.A

HSPA1 Proteína de choque térmico 70 kDa 1B

F - AGCACAAGAAGGACATCAGCCAGAAC R - GCCCTGGTGATGGACGTGTAGAA

1,00

ESR1 Receptor de estrogênio α

F - TTGAGGGCATGGTGGAGATCTTTG R - ACTTCAGGGTGCTGGACAGAAATG

1,00

AHR primer B²

Receptor de hidrocarbonetos arila

F - ACAGCAGCATCAGAAGCACAGA R - AAGGCACGGATTGGTTCGAGTT

não realizado

UGT1A UDP glucuronosiltransferase

F - TCCGATGGTGATGATGCCCTTGTT R - GCGGTCCTTGTGAAGGCTAGAGA

1,00

Além da padronização aqui descrita para C. mydas e T. truncatus, também foi

iniciada a padronização para outras espécies de cetáceos, a partir de material

oriundo de biópsia pelo PMC-BS. No entanto, devido à ausência de informações

gênicas para as demais espécies, foi realizada apenas a extração de RNA e

avaliação quanto à sua concentração, pureza e integridade, seguindo a descrição

metodológica detalhada acima, a fim de determinar se a extração de RNA é

possível e eficiente a partir de quantidades reduzidas de material tegumentar de

cetáceos, como aqueles oriundos de biópsias, método de coleta realizadas pelo

PMC-BS.

Para tal, foram utilizadas massas variadas (25 mg, 50 mg, 75 mg e 100 mg)

de amostras de pele provenientes de uma amostra composta do PMC. Essa

amostra composta, denominada BM66, contém porções de pele de diversos

Pág. 181 / 203


para análise de




______________________




Revisão 02 06/2018

cetáceos que foram encontradas fora dos tubos de armazenamento no galão de

nitrogênio por problemas na armazenagem. As amostras constituintes da amostra

composta são: B4; B26; B27; BB56; BM58; BB58; BB63 e BM66.

O resultado da extração deste material encontra-se na Tabela VI-15 e Figura

VI.4-8. A concentração e pureza do RNA de todas as subamostras foram

consideradas adequadas para as aplicações subsequentes de transcrição reversa

e PCR quantitativo (qPCR) (Tabela VI-15). A razão 260/230 da subamostra de 25

mg ficou abaixo de esperado, mas essa razão pode ser otimizada aumentando o

número de lavagens com etanol ou utilizando protocolos para reprecipitação de

RNA em análises futuras.

O sucesso na extração do RNA de uma subamostra de 25mg com Qiazol®

(Qiagen) permitirá a análise de biomarcadores moleculares mesmo quando

houver pouco material biológico disponível.

Tabela VI-15 - Subamostras de tecidos de cetáceos com suas respectivas concentrações

(ng/µL) e purezas nas razões de 260/280 e 260/230.

Identificação das subamostras

(massa) Concentração


BM66 (25 mg) 527,19 1,84 1,18

BM66 (50 mg) 808,56 1,89 2,2

BM66 (75 mg) 1014,45 1,92 2,18

BM66 (100 mg) 1361,86 1,92 2,18

A integridade do RNA foi considerada satisfatória apenas para a subamostra

de 25 mg (Figura VI.4-8). Nas demais subamostras foram observados indicativos

de degradação de RNA, como ausência das bandas 28S e 18S ou presença de

um rastro muito intenso de RNA em relação às bandas dos rRNAs ribossomais.

O motivo da degradação de amostra nas subamostras de 50 mg, 75 mg e 100

mg é desconhecido, uma vez que o mesmo procedimento de extração de RNA foi

adotado para todas as subamostras (i.e. mesmos reagentes, temperaturas de

incubação, mesma centrífuga, mesmo pesquisador). A hipótese mais plausível é a

degradação da amostra em função do acondicionamento inadequado durante o

transporte, que provocou a abertura dos tubos e subsequente queda das biópsias

dentro do container de nitrogênio. Conforme mencionado anteriormente, este

teste foi realizado com o material biológico presente no tubo BM66, sem a prévia

identificação individual das amostras. A porção da amostra utilizada para compor




para análise de


Pág. 182 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

a subamostra de 25 mg possivelmente não é a mesma porção utilizada para as

subamostras de 50 ou 75 ou 100 mg. Desta maneira, recomenda-se cautela nas

comparações diretas entre as subamostras.

Vale ressaltar que este procedimento foi realizado com o intuito de verificar

qual a massa mínima possível de ser utilizada para extração de RNA. A partir dos

resultados obtidos, podemos garantir que todos os ensaios previstos podem ser

realizados com as amostras provenientes de biópsia remota no âmbito do PMC-

BS, que apresentam restrição em termos de massa.

A

B

Figura VI.4-8 - Gel de RNA 1,2%, desnaturante, mostrando resultado da avaliação da qualidade do RNA para as subamostras de pele de cetáceos (amostra BM66) com massas de 25 mg, 50 mg, 75 mg e 100 mg. Foi aplicado 1 µg de RNA total em cada poço e as amostras foram coradas com GelRed® (Biotium). A. Imagem obtida com luz ultravioleta. B. Mesma imagem trabalhada no Programa Adobe Photoshop para melhor visualização das bandas. As setas indicam: seta superior banda do gene 28S e seta inferior, gene 18S.

Pág. 183 / 203

VII. Conclusões Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes


______________________




Revisão 02 06/2018

VII – CONCLUSÕES

Analisando os dados referentes à padronização das técnicas de

biomarcadores bioquímicos e moleculares em tetrápodes marinhos apresentados

neste relatório, é possível constatar que foram atingidas as diversas metas

traçadas para o primeiro ano de padronização, com exceção da etapa de

padronização da imunoquantificação de CYP1A, que está aguardando a

instalação do fotodocumentador.

Os testes de padronização realizados entre dezembro de 2016 e dezembro

de 2017 permitiram otimizar a concentração de substratos e temperatura

utilizadas nos ensaios GST e EROD para cada espécie de tetrápode avaliada.

Ambos os ensaios enzimáticos para aves e cetáceos deverão ser realizados a

37ºC. Para Chelonia mydas, os ensaios deverão ser realizados a 30ºC.

Para o ensaio GST em tecido hepático de Spheniscus magellanicus, Larus

dominicanus, e C. mydas, os substratos CDNB e GSH deverão ser utilizados em

concentrações de 2,5 mM. Para análises em tecidos hepático e tegumentar de

Stenella frontalis e Sotalia guianensis, e em pele de Tursiops truncatus e

Balaenoptera borealis, GSH deverá ser utilizada em concentrações de 5 mM e

CDNB em concentrações de 2,5 mM.

Para EROD, ensaios com amostras de fígado de C. mydas e S. magellanicus

deverão utilizar 7-ER em concentrações de 4 µM e NADPH a 1 mM. Ensaios com

fígado de L. dominicanus deverão utilizar 7-ER em concentrações de 2 µM e

NADPH a 1 mM. Para tecido hepático de S. frontalis, 7-ER deverá ser utilizada

em concentrações de 0,5 µM e NADPH a 1 mM, enquanto para tecido hepático de

S. guianensis deverá ser utilizada concentração de 7-ER de 1 µM e NADPH a 0,5

mM. A padronização de atividade EROD em tecido tegumentar de cetáceos não

pôde ser realizada devido à inexistência de atividade EROD nesta matriz tecidual.

Sendo assim, somente será utilizado o protocolo estabelecido para a

quantificação de EROD no fígado.

Nossos resultados também permitiram identificar que, para algumas espécies

avaliadas, a atividade EROD apresenta um modelo cinético de inibição por

substrato, reforçando a necessidade de padronização espécie-específica das

concentrações de 7-ER para evitar a inibição enzimática.

A Tabela VII.1 apresenta o resumo das condições de ensaio de GST e EROD

em tetrápodes marinhos.



VII. Conclusões Pág. 184 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

Tabela VII-1 - Resumo das condições dos ensaios GST e EROD em tetrápodes

marinhos.

Grupo

Taxonômico Espécie

Matriz Tecidual

Atividade EROD Atividade GST

Répteis Chelonia mydas

Fígado

Tampão TRIS/NaCl (50 mM/0,1 M, pH 7,4), 7-ER 4 µM) e NADPH (1 mM). Temperatura de 30ºC.

Tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), GSH (2,5 mM) e CDNB (2,5 mM). Temperatura de 30°C.

Aves Spheniscus

magellanicus Fígado

Tampão TRIS/NaCl (50 mM/0,1 M, pH 7,4), 7-ER (4 µM) e NADPH (1 mM). Temperatura de 37ºC.


Larus

dominicanus Fígado

Tampão TRIS/NaCl (50 mM/0,1 M, pH 7,4), de 7-ER (2 µM) e NADPH (1 mM). Temperatura de 37ºC.


Cetáceos Stenella frontalis

Fígado e Pele

Tampão TRIS/NaCl (50 mM/0,1 M, pH 7,4), 7-ER (0,5 µM) e NADPH (1 mM). Temperatura de 37ºC.

Tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), GSH (5 mM) e CDNB (2,5 mM). Temperatura de 37°C.

Sotalia guianensis

Fígado e Pele

Tampão TRIS/NaCl (50 mM/0,1 M, pH 7,4), 7-ER (1 µM) e NADPH (0,5 mM). Temperatura de 37ºC.


Tursiops truncatus

Pele Sem atividade na pele



Pele Sem atividade na pele


Considerando-se a alteração nas espécies prioritárias definidas na reunião

realizada em maio de 2018 com representantes do IBAMA, deverá ser realizado

ensaio GST e EROD em fígado de Puffinus puffinus, e pele de Stenella

longirostris e Balaenoptera brydei. Os testes de padronização das condições

ideiais para cada espécie ocorrerão entre os meses de junho e setembro de 2018.

Além da padronização das condições de ensaio dos biomarcadores, testes

preliminares de estabilidade temporal realizados com espécimes de L.

dominicanus evidenciaram decaimento da atividade EROD a partir da segunda

Pág. 185 / 203

VII. Conclusões Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes


______________________




Revisão 02 06/2018

hora após a morte. Este padrão, no entanto, não foi observado para atividade

GST, que se manteve constante ao longo do tempo post mortem. Estes

resultados suportam a análise de atividade GST em L. dominicanus coletados em

código 2 pelo PMP-BS e a realização de análises de atividade EROD apenas em

L. dominicanus amostrados imediatamente após a morte. Coletivamente,

esses resultados indicam que o tempo decorrido desde a morte do indivíduo até a

coleta de material biológico pode alterar a integridade da amostra afetando a

quantificação do biomarcador. Dependendo do biomarcador, o efeito do tempo

post mortem poderá afetar mais ou menos a análise de atividade enzimática. Com

base nos dados obtidos neste relatório, recomendamos que o tempo post mortem

de coleta para biomarcadores não ultrapasse preferencialmente 30 minutos, pois

torna-se, difícil ter certeza da qualidade da amostra. Para minimizar este

problema, uma estratégia seria processar todas as amostras das espécies alvo

com código 2 e realizar as análises bioquímicas e moleculares posteriores

somente naquelas amostras que apresentarem uma boa qualidade de RNA. Esta

avaliação será realizada utilizando-se equipamento específico, a ser adquirido em

breve. Mesmo assim, será importante ter cautela na interpretação dos resultados.

Além da padronização bioquímica, dados preliminares da padronização de

análises de biomarcadores moleculares reforçam a possibilidade de extração de

RNA de amostras diminutas, de até 25 mg, de tecido tegumentar de cetáceos,

quadro similar àquele observado para o material de biópsia oriundo do PMC-BS, e

indicam que a maioria dos iniciadores desenhados pela equipe do LABCAI/UFSC

apresentaram eficiência e especificidade satisfatórios para análises de qPCR em

fígado de C. mydas e T. truncatus. Novos iniciadores serão desenhados para

substituir aqueles que não apresentaram índices satisfatórios.

Nas próximas etapas deste trabalho está prevista a padronização da

metodologia da imunoquantificação da isoforma de citocromo P450 (CYP1A) por

meio da técnica de imunoblot. Esta etapa iniciou em meados de abril de 2018,

após a chegada e instalação do fotodocumentador adquirido com recursos deste

projeto, com testes com anticoporpos comerciais.

As seis espécies prioritárias para o desenvolvimento da metodologia de

biomarcadores moleculares foram: C. mydas, L. dominicanus, T. truncatus, S.

longirostris, B. brydei e P. puffinus. Essas espécies foram também aprovadas em

reunião com o IBAMA realizada em 07/05/2018. . Para tal, será necessário o



VII. Conclusões Pág. 186 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

sequenciamento dos transcriptomas de S. longirostris e B. brydei, P. puffinus e L.

dominicanus.

Pág. 187 / 203

VIII. Próximas etapas Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes


______________________




Revisão 02 06/2018

VIII – PRÓXIMAS ETAPAS

Dando continuidade a este serviço será realizada a padronização das

condições de quantificação da expressão da isoforma de citocromo P450 1A

(CYP1A) em tecido hepático de quelônios, aves e cetáceos (PMP-BS) e

tegumentar de cetáceos (PMC-BS).

Serão sequenciados os transcriptomas das espécies alvo definidas em

reunião com representantes do IBAMA: Larus dominicanus, Puffinus puffinus,

Stenella longirostris e Baleonoptera brydei. Posteriormente será dada

continuidade à padronização das técnicas moleculares a partir da identificação

das sequências de nucleotídeos dos genes alvo nas espécies escolhidas.

Adicionalmente, será realizada a padronização das técnicas bioquímicas

para a espécie de ave Puffinus puffinus, e dos cetáceos Stenella longirostris e

Baleonoptera brydei.



IX. Bibliografia Pág. 188 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

IX - BIBLIOGRAFIA

ABBASI, N.A.; ARUKWE, A.; JASPERS, V.L.B.; EULAERS, I.; MENNILO, E.;

IBOR, O.R.; FRANTZ, A.; COVACI, A.; MALIK, R.N. Oxidative stress responses in

relationship to persistent organic pollutant levels in feathers and blood of two

predatory bird species from Pakistan. Science of the Total Environment, v. 580,

p. 26-33. 2017.

ABU HAFSA, S.H.; IBRAHIM, S.A. Effect of dietary polyphenol-rich grape seed on

growth performance, antioxidant capacity and ileal microflora in broiler chicks.

Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, v. 102, p. 268-275. 2017.

ALMEIDA, A.P.; SANTOS, A.J.B.; THOMÉ, J.C.A.; BELINI, C.; BAPTISTOTTE,

C.; MARCOVALDI, M.A.; SANTOS, A.S.; LOPEZ, M. Avaliação do Estado de

Conservação da Tartaruga Marinha Chelonia mydas (Linnaeus, 1758) no Brasil.

Biodiversidade Brasileira, v. 1, p. 12-19. 2011.

ANDRIOLO, A.; ZERBINI, A.N. Migração de baleias-jubarte: o que falta conhecer?

Revista de Etologia, v. 9, p. 31-33. 2010.

ADDISON, R.F.; BRODIE, P.F.; EDWARDS, A.; SADLER, M.C. Mixed function

oxidase activity in the harbor seal (Phoca vitulina) from Sable is, N.S.

Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Comparative

Pharmacology, v. 85, p. 121-124. 1986.

AKKEMIK, E.; TASER, P.; BAYINDIR, A.; BUDAK, H.; CIFTCI, M. Purification and

characterization of glutathione S-transferase from turkey liver and inhibition effects

of some metal ions on enzyme activity. Environmental Toxicology and

Pharmacology, v. 34, n. 3, p. 888-894. 2012.

BACHMAIR, A.; FINLEY, D.; VARSHAVSKY, A. In vivo half-life of a protein is a

function of its amino-terminal residue. Science, v. 234, p. 179-186. 1986.

BALDASSIN, P.; TANIGUCHI, S.; GALLO, H.; MARANHO, A.; KOLESNIKOVAS,

C.; AMORIM, D.B.; MANSILLA, M.; NAVARRO, R.M.; TABEIRA, L.C.; BICEGO,

M.C.; MONTONE, R.C. Persistent organic pollutants in juvenile Magellanic

Penguins (Spheniscus magellanicus) in South America. Chemosphere, v. 149, p.

391-399. 2016.

Pág. 189 / 203

IX. Bibliografia Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes


______________________




Revisão 02 06/2018

BASTOS, F.F.; HAUSER-DAVIS, R.A.; TOBAR, S.A.L.; CAMPOS, R.C.; ZIOLLI,

R.L.; CUNHA BASTOS, V.L.F.; CUNHA BASTOS, J. Enzymatic GST levels ans

overall health of mullets from contaminated Brazilian lagoons. Aquatic

Toxicology, v. 126, p. 414-423. 2013.

BEARZI, G.; BJØRGE, A.; FORNEY, K.A.; HAMMOND, P.S.; KARKZMARSKI, L.;

KASUYA, T.; PERRIN, W.F.; SCOTT, M.D.; WANG, J.Y.; WELLS, R.S.; WILSON,

B. Stenella longirostris. The IUCN Red List of Threatened Species 2012:

e.T20733A17837287.http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2012.RLTS.T20733A178

37287.en. Acesso em: 11 de dezembro de 2017.

BEGER, R.; YU, L.R.; DANIELS, J.; MATTES, W.B. Exploratory biomarkers:

Analytical approaches and their implications. Current Opinion in Toxicology, v.

4. p. 59-65. 2017.

BENJAKUL, S.; SEYMOUR, T.A.; MORRISSEY, M.T.; AN, H. Physicochemical

changes in Pacific Whiting Muscle proteins during iced storage. Journal of food

Science, v. 62, p. 729-733. 1997.

BIAZUS, A.H.; SILVA, A.S.; BOTTARI, N.B.; BALDISSERA, M.D.; CARMO, G.M.;

MORSCH, V.M.; SCHETINGER, M.R.C.; CASAGRANDE, R.; GUARDA, N.S.;

MORESCO, R.N.; STEFANI, L.M.; CAMPIGOTTO, G.; BOIAGO, M.M. Fowl

typhoid in laying hens cause hepatic oxidative stress. Microbial Pathogenesis, v.

103, p. 162-166. 2017.

BISHOP, C.; NG, P.; PETTIT, K.; KENNEDY, S.; STEGEMAN, J.; NORSTROM,

R. Environmental contamination and developmental abnormalities in eggs and

hatchlings of the common snapping turtle (Chelydra serpentina serpentina) from

the Great lakes-St. Lawrence river basin (1989-91). (R827102). Environmental

Pollution, v. 101, p. 143-156. 1998.

BISSWANGER, H. Practical Enzymology. 2a ed. Weinheim: Wiley-Blackwell,

2011.

BISSWANGER, H. Enzyme assays. Perspectives in Science, v. 1, p. 41-55.

2014.

BOON, J.P.; OOSTINGH, I.; VAN DER MEER, J.; HILLEBRAND, T.J. A model for

the bioaccumulation of chlorobiphenyl congeners in marine mammals. European




______________________




Revisão 01 06/2018

Journal of Pharmacology: Environmental Toxicology and Pharmacology, v.

270, p. 237-251. 1994.

BOON, J.P.; SLEIDERINK, H.M.; HELLE, M.S.; DEKKER, M.; SCHANKE, A.;

ROEX, E.; HILLEBRAND, M.T.J.; KLAMER, H.J.C.; GOVERS, B.; PASTOR, D.;

MORSE, D.; WESTER, P.G.; BOER, J. The use of a microsomal in vitro assay to

study phase I biotransformation of chlorobornanes (Toxaphene®) in marine

mammals and birds. Comparative Biochemistry and Physiology Part C:

Pharmacology, Toxicology and Endocrinology, v. 121, p. 385-403. 1998.

BOON, J.P.; LEWIS, W.E.; GOKSOYR, A. Immunochemical and catalytic

characterization of hepatic microsomal cytochrome P450 in the sperm whale

(Physeter macrocephalus). Aquatic Toxicology, v. 52, p. 297-309. 2001.

BORGÅ, K.; WOLKERS, H.; SKAARE, J.U.; HOP, H.; MUIR, D.C.G.;

GABRIELSEN, G.W. Bioaccumulation of PCBs in Arctic seabirds: influence of

dietary exposure and congener biotransformation. Environmental Pollution, v.

134, p. 397-409. 2005.

BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical

Biochemistry, v. 72, p. 248-254. 1976.

BURKE, M.D.; MAYER, R.T. Ethoxyresorufin: direct fluometric assay of a

microsomal o-dealkylation which is preferentially inducible by 3-

methylchloranthrene. Drug Metabolism and Disposition, v. 2, p. 583-588. 1974.

BUTZBACH, D.M. The influence of putrefaction and sample storage on post-

mortem toxicology results. Forensic Science, Medicine, and Pathology, v. 6, p.

35-45. 2010.

CANTÚ-MEDELLIN, N.; BYRD, B.; HOHN, A.; VÁZQUEZ-MEDINA, J.P.;

ZENTENO-SAVÍN, T. Differential antioxidant protection in tissues from marine

mammals with distinct diving capacities. Shallow/short vs. deep/long divers.

Comparative Biochemistry and Physiology, Part A, v. 158, p. 438-443. 2011.

CARDOSO, M.D.; DE MOURA, J.F.; TAVARES, D.C.; GONÇALVES, R.A.;

COLABUONO, F.I.; ROGES, E.M.; DE SOUZA, R.L.; RODRIGUES, D.P.;

MONTONE, R.C.; SICILIANO, S. The Manx shearwater (Puffinus puffinus) as a

Pág. 191 / 203



______________________




Revisão 02 06/2018

candidate sentinel of Atlantic Ocean health. Aquatic Biosystems, v. 1, p. 10-6.

2014.

CHANG, T.K.H.; WAXMAN, D.J. Cytochrome P450 Nomenclature. In: PHILLIPS,

I.R.; SHEPHARD, E.A. (Ed.). Cytochrome P450 Protocols. 2. ed. New Jersey:

Humana Press Inc, 2006. p. 73-84.

COULSON, R.; COULSON, G. Diets of the Pacific Gull Larus pacificus and the

Kelp Gull Larus dominicanus in Tasmania. EMU, v. 93, p. 50-53. 1992.

DANILEWICZ, D.; OTT, P.; SECCHI, E.; ANDRIOLO, A.; ZERBINI, A. Occurrence

of the Atlantic spotted dolphin, Stenella frontalis, in the southern Abrolhos Bank,

Brazil. Marine Biodiversity Records, v. 6, p. 1-3. 2013.

DEN BESTEN, P.J. Concepts for the implementation of biomarkers in

environmental monitoring. Marine Environmental Research, v. 46, p. 253-256.

1998.

ESPÍN, S.; GARCÍA-FERNÁNDEZ, A.J.; HERZKE, D.; SHORE, R.F.; VAN

HATTUM, B.; MARTÍNEZ-LÓPEZ, E.; COEURDASSIER, M.; EULAERS, I.;

FRITSCH, C.; GÓMEZ-RAMÍREZ, P.; JASPERS, V.L.; KRONE, O.; DUKE, G.;

HELANDER, B.; MATEO, R.; MOVALLI, P.; SONNE, C.; VAN DEN BRINK, N.W.

Tracking pan-continental trends in environmental contamination using sentinel

raptors - what types of samples should we use? Ecotoxicology, v. 25, p. 777-801.

2016.

ESPÍN, S.; RUIZ, S.; SANCHEZ-VIROSTA, P.; LILLEY, T.; EEVA, T. Oxidative

status in relation to metal pollution and calcium availability in pied flycatcher

nestlings – A calcium manipulation experiment. Environmental Pollution, v. 229,

p. 448-458. 2017.

FOCARDI, S.; FOSSI, M.C.; LEONZIO, L.L.; MARZILI, L. Mixed function oxidase

activity and chlorinated hydrocarbon residues in antarctic sea birds: south polar

skua (Catharacta maccormickl) and adélie penguin (Pygoscelis adeliae). Marine

Environmental Research, v. 34, p. 201-205. 1992.

FOSSI, M.C.; CASINI, S.; MALTESE, S.; PANTI, C.; MARSILI, L. Skin biopsy

slices of cetaceans as a multi-response “in vitro” method to detect toxicological

effects of lipophilic contaminants. Technical Report of International Whaling

Commission Agadir, Morocco, SC/62/E10. 2010.




______________________




Revisão 01 06/2018

FOSSI, M.C.; PANTI, C.; MARSILI, L.; MALTESE, S.; SPINSANTI, G.; CASINI, S.;

CALIANI, I.; GASPARI, S.; MUÑOZ-ARNANZ, J.; JIMENEZ, B.; FINOIA, M.G. The

Pelagos Sanctuary for Mediterranean marine mammals: Marine Protected Area

(MPA) or marine polluted area? The case study of the striped dolphin (Stenella

coeruleoalba). Marine Pollution Bulletin, v. 70, n. 1-2, p. 64-72. 2013.

FOSSI, M.C.; PANTI, C.; MARSILI, L.; MALTESE, S.; COPPOLA, D.; JIMENEZ,

B.; MUÑOZ-ARNANZ, J.; FINOIA, M.G.; ROJAS-BRACHO, L.; URBAN, R.J.

Could feeding habit and migratory behaviour be the causes of different

toxicological hazard to cetaceans of Gulf of California (Mexico)? Environmental

Science and Pollution Research, v. 21, n. 23, p. 13353-13366. 2014.

FOX, G.A.; WHITE, P.A.; TRUDEAU, S.; THEODORAKIS, C.; SHUTT, L.J.;

KENNEDY, S.W.; FERNIE, K.J. DNA strand length and EROD activity in relation

to two screening measures of genotoxic exposure in Great Lakes herring

gulls. Ecotoxicology, v. 14, p. 527-544. 2005.

GARRICK, R.A.; WOODIN, B.R.; WILSON, J.Y.; MIDDLEBROOKS, B.L.;

STEGEMAN, J.J. Cytochrome P4501A is induced in endothelial cell lines from the

kidney and lung of the bottlenose dolphin, Tursiops truncatus. Aquatic

Toxicology, v. 76, p. 295-305. 2006.

GOKSOYR, A.; SOLBAKKEN, J.E.; TARLEBO, J.; KLUNGSOYR, J. Initial

characterization of the hepatic microsomal cytochrome P-450-System of the Piked

Whale (Minke) Balaenoptera acutorostrata. Marine Environmental Research, v.

19, p. 185-203. 1986.

GOKSOYR, A.; ANDERSSON, T.; FORLIN, L.; STENERSEN, J.;

SNOWBERGER, E.A.; WOODIN, B.R.; STEGEMAN, J.J. Xenobiotic and steroid

metabolism in adult and foetal Piked (Minke) whales, Balaenoptera acutorostrata.

Marine Environmental Research, v. 24, p. 9-13. 1988.

GUILFORD, T.; MEADE, J.; WILLIS, J.; PHILLIPS, R.A.; BOYLE, D.; ROBERTS,

S.; COLLET, M.; FREEMAN, R.; PERRINS, C.M. Migration and stopover in a

small pelagic seabird, the Manx shearwater Puffinus puffinus: insights from

machine learning. Proceedings of the Royal Society B: Biological

Sciences, v. 276, p. 1215-1223. 2009.

Pág. 193 / 203



______________________




Revisão 02 06/2018

GURUGE, K.S.; TANABE, S. Congener specific accumulation and toxic

assessment of polychlorinated biphenyls in common cormorants, Phalacrocorax

carbo, from Lake Biwa, Japan. Environmental Pollution, v. 96, p. 425-433. 1997.

GUSTAFSSON, J.A.; MODE, A.; NORSTEDT, G.; SKETT, P. Sex steroid induced

changes in hepatic enzymes. Annual Review Physiology, v. 45, p. 51-60. 1983.

HABIG, W.H.; JAKOBY, W.B. Assays for differentiation of glutathione S-

transferases. Methods in Enzymology, v. 77, p. 398-405. 1981.

HAMMOND, P.S.; BEARZI, G.; BJØRGE, A.; FORNEY, K.A.; KARKZMARSKI, L.;

KASUYA, T.; PERRIN, W.F.; SCOTT, M.D.; WANG, J.Y.; WELLS, R.S.; WILSON,

B. 2012. Stenella frontalis. The IUCN Red List of Threatened Species 2012:

e.T20732A17832795.http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2012.RLTS.T20732A178

32795.en. Acesso em: 11 de dezembro de 2017.

HANNEMANN, F.; BICHET, A; EWEN, K.M.; BERNHARDT, R. Cytochrome P450

systems-biological variations of electron transport chains. Biochimica et

Biophysica Acta - General Subjects, v. 1770, p. 330-344. 2007.

HERNANDEZ-FERNANDEZ, J. Data of first de-novo transcriptome assembly of a

non-model species, hawksbill sea turtle, Eretmochelys imbricate, nesting of the

Colombian Caribean. Data in Brief, v. 15, p. 573-576. 2017.

HERNÁNDEZ-FERNÁNDEZ, J.; PINZÓN, A.; MARIÑO-RAMÍREZ, L. De novo

transcriptome assembly of loggerhead sea turtle nesting of the Colombian

Caribbean. Genomic Data, v. 13, p. 18-20. 2017.

HIRTH, H.F. Synopsis of the biological data on Green Turtle Chelonia mydas

(Linnaeus 1758). U.S. Fish and Wildlife Service. 1997.

HUGGETT, R.J.; KIMERLE, R.A.; MEHRLE, R.A.; BERGMAN, H.L. Biomarkers:

Biochemical, physiological, and histological markers of anthropogenic stress.

Lewis Publishers. 1992. 347 p.

IUCN, 2016a. BirdLife International. Larus dominicanus. The IUCN Red List of

Threatened Species 2016: e.T22694329A93448691.

http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2016-3.RLTS.T22694329A93448691.en.

Acesso em: 10 de dezembro de 2017.

IUCN, 2016b. BirdLife International. Puffinus puffinus. The IUCN Red List of





______________________




Revisão 01 06/2018

http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2016-3.RLTS.T22698226A86238815.en.

Acesso em: 10 de dezembro de 2017.

IUCN, 2017a. BirdLife International. Spheniscus magellanicus. (amended version

published in 2016) The IUCN Red List of Threatened Species 2017:

e.T22697822A119167908. Acesso em: 10 de dezembro de 2017.

IUCN, 2017b. BirdLife International. Sula leucogaster. (amended version

published in 2016) The IUCN Red List of Threatened Species 2017:

e.T22696698A111794509. http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2017-

1.RLTS.T22696698A111794509.en. Acesso em: 10 de dezembro de 2017.

JENKO, K.; KAROUNA-RENIER, N.K.; HOFFMAN, D.J. Gene expression,

glutathione status, and indicators of hepatic oxidative stress in laughing gull (Larus

atricilla) hatchlings exposed to methylmercury. Environmental Toxicology and

Chemistry, v. 31, n. 11, p. 2588-2596. 2012.

JIAO, X.; YANG, K.; AN, Y.; TENG, X.; TENG, X. Alleviation of lead-induced

oxidative stress and immune damage by selenium in chicken bursa of Fabricius.

Environmental Science and Pollution Research, v. 24, n. 8, p. 7555-7564.

2017.

KEEN, J.H.; HABIG, W.H.; JAKOBY, W.B. Mechanism for the several activities of

the glutathione S-transferase. Journal of Biological Chemistry, v. 251, p. 6183-

6188. 1976.

KEHRIG, H.A.; HAUSER-DAVIS, R.A.; SEIXAS, T.G.; FILLMANN, G. Trace-

elements, methylmercury and metallothionein levels in Magellanic penguin

(Spheniscus magellanicus) found stranded on the Southern Brazilian coast.

Marine Pollution Bulletin, v. 96, p. 450-455. 2015.

KEMP, C.J.; KÜLTZ, D. Controlling proteome degradation in Daphnia pulex.

Journal of Experimental Zoology, v. 317, p. 645-651. 2012.

KENNEDY, S.W.; FOX, G.A.; JONES, S.P.; TRUDEAU, S.F. Hepatic EROD

activity is not a useful biomarker of polychlorinated biphenyl exposure in the adult

herring gull (Larus argentatus). Ecotoxicology, v. 12, p.153-161. 2003.

KLOTZ, A.V.; STEGEMAN, J.J.; WALSH, C. An alternative 7-Ethoxyresorufin O-

deethylase activity assay: A continuous visible spectrophotometric method for

Pág. 195 / 203



______________________




Revisão 02 06/2018

measurement of cytochrome P-450 monooxygenase activity. Analytical

Biochemistry, v. 140, p. 138-145. 1984.

KUBOTA, K.; KIM, E.Y.; IWATA, H. Alkoxyresorufin (methoxy-, ethoxy-, pentoxy-

and benzyloxyresorufin) O-dealkylase activities by in vitro-expressed cytochrome

P450 1A4 and 1A5 from common cormorant (Phalacrocorax carbo). Comparative

Biochemistry and Physiology, Part C, v. 149, p. 544-551. 2009.

LABRADA-MARTAGNÓN, V.; RODRÍGUEZ, T.; MÉNDEZ-RODRÍGUEZ, L.C.;

ZENTENO-SAVÍN, T. Oxidative stress indicators and chemical contaminants in

East Pacific green turtles (Chelonia mydas) inhabiting two foraging coastal

lagoons in the Baja California peninsula. Comparative Biochemistry and

Physiology Part C, v. 154, p. 65-75. 2011.

LEE, D.S. The pelagic ecology of Manx Shearwaters Puffinus puffinus off the

southeastern. United States of America. Marine Ornithology, v. 23, p. 107-119,

1995.

LIN, Y.; LU, P.; TANG, C.; MEI, Q.; SANDIG, G.; RODRIGUES, A.D.;

RUSHMORE, T.H.; SHOU, M. Substrate inhibition kinectics for cytochrome P450-

catalyzed reactions. Drug Metabolism and Disposition, v. 29, p. 368-374. 2001.

LIUKKONEN-ANTTILA, T.; HONKANEN, H.; PELTOKANGAS, P.; PELKONEN,

O.; HOHTOLA, E. Cytochrome P450 enzyme activity in five herbivorous, non-

passerine bird species. Comparative Biochemistry and Physiology Part C:

Toxicology & Pharmacology, v. 134, p. 69-77. 2003.

LOPES, X.M.; SANTOS, M.C.O.; SILVA, E.; BASSOI, M.; SANTOS, R.A. Feeding

habits of the atlantic spotted dolphin, Stenella frontalis, in southeastern

Brazil. Brazilian Journal of Oceanography, v. 60, p. 189-198. 2012.

LÜCHMANN, K.H.; MATTOS, J.J.; SIEBERT, M.N.; GRANUCCI, N.;

DORRINGTON, T.S.; BÍCEGO, M.C.; TANIGUCHI, S.; SASAKI, S.T.; DAURA-

JORGE, F.G.; BAINY, A.C.D. Biochemical biomarkers and hydrocarbons

concentrations in the mangrove oyster Crassostrea brasiliana following exposure

to diesel fuel water-accomodated fraction. Aquatic Toxicology, v. 105, p. 652-

660. 2011.




______________________




Revisão 01 06/2018

LUDYNIA, K.; GARTHE, S.; LUNA-JORQUERA, G. Seasonal and Regional

Variation in the Diet of the Kelp Gull in Northern Chile. Waterbirds, v. 28, p. 359-

365. 2005.

MATEO, R.; BEYER, W.N.; SPANN, J.W.; HOFFMAN, D.J.; RAMIS, A.

Relationship between oxidative stress, pathology, and behavioral signs of lead

poisoning in mallards. Journal of Toxicology and Environmental Health Part A,

v. 66, p. 1371-1389. 2003.

McKINNEY, M.A.; ARUKWE, A.; De GUISE, S.; MARTINEAU, D.; BÉLAND, P.;

DALLAIRE, A.; LAIR, S.; LEBEUF, M.; LETCHER, R.J. Characterization and

profiling of hepatic cytochromes P450 and phase II xenobiotic-metabolizing

enzymes in beluga whales (Delphinapterus leucas) from the St. Lawrence River

Estuary and the Canadian Arctic. Aquatic Toxicology, v. 69, p. 35-49. 2004

MILLER, K.A.; ASSUNÇAO, A.G.L.; DANGERFIELD, N.J.; BANDIERA, S.M.;

ROSS, P.S. Assessment of cytochrome P450 1A in harbor seals (Phoca vitulina)

using a minimally-invasive biopsy approach. Marine Environmental Research, v.

60, p. 153-169. 2005

MOREY, J.; NEELY, M.G.; LUNARDI, D.; ANDERSON, P.E.; SCHWACKE, L.H.;

CAMPBELL, M.; VAN DOLAH, F. RNA-Seq analysis of seasonal and individual

variation in blood transcriptomes of healthy managed bottlenose dolphins. BMC

Genomics, v. 17. 2016.

NASH, S.B.; DAWSON, A.; BURKHARD, M.; WAUGH, C.; HUSTON, W.

Detoxification enzyme activities (CYP1A1 and GST) in the skin of humpback

whales as a function of organochlorine burdens and migration status. Aquatic

Toxicology, v. 155, p. 207-212. 2014.

NUMATA, M.; FAWCETT, J.P.; ROSENGREN, R.J. Induction of in vitro EROD

activity and in vivo caffeine metabolism in two species of New Zealand

birds. Environmental Toxicology and Pharmacology, v. 25, p. 358-364. 2008.

NYMAN, M.; RAUNIO, H.; PELKONEN, O. Expression and inducibility of members

in the cytochrome P4501 (CYP1) family in ringed and grey seals from polluted and

less polluted waters. Environmental Toxicology and Pharmacology, v. 8, p.

217-225. 2000.

Pág. 197 / 203



______________________




Revisão 02 06/2018

PANTI, C.; SPINSANTI, G.; MARSILI, L.; CASINI, S.; FRATI, F.; FOSSI, M.C.

Ecotoxicological diagnosis of striped dolphin (Stenella coeruleoalba) from the

Mediterranean basin by skin biopsy and gene expression approach.

Ecotoxicology, v. 20, p. 1791-1800. 2011.

PETROBRAS. 2º RELATÓRIO ANUAL do PROJETO DE MONITORAMENTO DE

CETÁCEOS NA BACIA DE SANTOS – PMC-BS. Volume único. 2017.

PINTO, M.B.L.C.; SICILIANO, S.; DI BENEDITTO, APM. Stomach contents of the

Magellanic Penguin Spheniscus magellanicus from the northern distribution limit

on the Atlantic coast of Brazil. Marine Ornithology, v. 35, p. 77-78. 2007.

POLOZ, Y.O.; O’DAY, D.H. Determining time of death: temperature-dependent

postmortem changes in calcineurin A, MARCKS, CaMKII, and protein phosphate

2A in mouse. International Journal of Legal Medicine, v. 123, p. 305-314. 2009.

RAINIO, M.J.; KANERVA, M.; WAHLBERG, N.; NIKINMAA, M.; EEVA, T.

Variation of basal EROD activities in ten passerine bird species-relationships with

diet and migration status. PLoS ONE, v. 7, p. e33926. 2012.

REDDY, S.; KIMBALL, R.T.; PANDEY, A.; HOSNER, P.A.; BRAUN, M.J.;

HACKETT, S.J.; HAN, K.L.; HARSHMAN, J.; HUDDLESTON, C.J.; KINGSTON,

S.; MARKS, B.D.; MIGLIA, K.J.; MOORE, W.S.; SHELDON, F.H.; WITT, C.C.;

YURI, T.; BRAUN, E.L. Why do phylogenomic data sets yield conflicting trees?

Data type influences the avian tree of life more than taxon sampling. Systematic

Biology, v. 66, p. 857-879. 2017.

REILLY, S.B.; BANNISTER, J.L.; BEST, P.B.; BROWN, M.; BROWNELL JR.,

R.L.; BUTTERWORTH, D.S.; CLAPHAM, P.J.; COOKE, J.; DONOVAN, G.P.;

URBÁN, J.; ZERBINI, A.N. 2008a. Balaenoptera borealis. The IUCN Red List of


http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2008.RLTS.T2475A9445100.en. Acesso em:

11 de dezembro de 2017.

REILLY, S.B.; BANNISTER, J.L.; BEST, P.B.; BROWN, M.; BROWNELL JR.,

R.L.; BUTTERWORTH, D.S.; CLAPHAM, P.J.; COOKE, J.; DONOVAN, G.P.;

URBÁN, J.; ZERBINI, A.N. 2008b. Megaptera novaeangliae. The IUCN Red List

of Threatened Species 2008: e.T13006A3405371.






______________________




Revisão 01 06/2018

RICHARDSON, K.L.; GOLD-BOUCHOT, G.; SCHLENK, D. The characterization

of cytosolic glutathione transferase from four species of sea turtles: Loggerhead

(Caretta caretta), green (Chelonia mydas), olive ridley (Lepidochelys olivacea),

and hawksbill (Eretmochelys imbricata). Comparative Biochemistry and

Physiology, Part C, v. 150, p. 279-284. 2009.

RICHARDSON, K.L.; LOPEZ CASTRO, M.; GARDNER, S.C.; SCHLENK, D.

Polychlorinated biphenyls and biotransformation enzymes in three species of sea

turtles from the Baja California, Peninsula of Mexico. Archives in Environmental

Contamination and Toxicology, v. 58, p. 183-193. 2010.

RIE, M.T.; LENDAS, K.A.; WOODIN, B.R.; STEGEMAN, J.J.; CALLARD, I.P.

Hepatic biotransformation enzymes in a sentinel species, the painted turtle

(Chrysemys picta), from Cape Cod, Massachusetts: seasonal-, sex- and location

related differences. Biomarkers, v. 5, p. 382-394. 2000.

ROUTTI, H.; LETCHER, R.J.; ARUKWE, A.; VAN BAVEL, B.; YOCCOZ, N.G.;

CHU, S.; GABRIELSEN, G.W. Biotransformation of PCBs in relation to phase I

and II xenobiotic-metabolizing enzyme activities in Ringed Seals (Phoca hispida)

from Svalbard and the Baltic Sea. Environmental Science and Technology, v.

42, p.8952-8958. 2008.

ROUTTI, H.; HELGASON, L.B.; ARUKWE, A.; WOLKERS, H.; HEIMSTAD, E.S.;

HARJU, M.; BERG, V.; GABRIELSEN, G.W. Effect of reduced food intake on

toxicokinetics of halogenated organic contaminants in herring gull (Larus

argentatus) chicks. Environmental Toxicology and Chemistry, v. 32, p.156-164.

2013.

RUUS, A.; SANDVIK, M.; UGLAND, K.I.; SKAARE, J.U. Factors influencing

activities of biotransformation enzymes, concentrations and compositional patterns

of organochlorine contaminants in members of a marine food web. Aquatic

Toxicology, v. 61, p. 73-87. 2002.

SECCHI, E. 2012. Sotalia guianensis. The IUCN Red List of Threatened

Species

2012:e.T181359A17583662.http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2012.RLTS.T1813

59A17583662.en. Acesso em: 11 de dezembro de 2017.

Pág. 199 / 203



______________________




Revisão 02 06/2018

SEMINOFF, J.A. (Southwest Fisheries Science Center, U.S.). Chelonia mydas.

The IUCN Red List of Threatened Species 2004: e.T4615A11037468.



SMITS, J.E.; WAYLAND, M.E.; MILLER, M.J.; LIBER, K.; TRUDEAU, S.

Reproductive, immune, and physiological end points in tree swallows on reclaimed

oil sands mine sites. Environmental Toxicology and Chemistry, v. 19, p. 2951-

2960. 2000.

SNAPE, J.R.; MAUND, S.J.; PICKFORD, D.B.; HUTCHINSON, T.H.

Ecotoxicogenomics: the challenge of integrating genomics into aquatic and

terrestrial ecotoxicology. Aquatic Toxicology, v. 67, p. 143-154. 2004.

STROMME, J.H.; THEODORSEN, L. γ-Glutamyltransferase: Substrate Inhibition,

Kinetic Mechanism, and assay conditions. Clinical Chemistry, v. 22, p. 417-421.

1976.

TREMBLAY, N.; ARANA, A.O.; JÁUREGUI, M.G.; OSTEN, J.R. Relationship

between organochlorine pesticides and stress indicators in hawksbill sea turtle

(Eretmochelys imbricata) nesting at Punta Xen (Campeche), Southern Gulf of

Mexico. Ecotoxicology, v. 126, p. 173-183. 2017.

TROISI, G.M.; MASON, C.F. Cytochromes P450, P420 and mixed-function

oxidases as biomarkers of polychlorinated biphenyl (PCB) exposure in harbor

seals (Phoca vitulina). Chemosphere, v. 35, p. 1933-1946. 1997.

TRUST, K.A.; ESLER, D.; WOODIN, B.R.; STEGEMAN, J.J. Cytochrome P450 1A

induction in sea ducks inhabiting nearshore areas of Prince William Sound,

Alaska. Marine Pollution Bulletin, v. 40, p. 397-403. 2000.

VALDIVIA, P.A.; ZENTENO-SAVÍN, T.; GARDNER, S.C.; AGUIRRE, A.A. Basic

oxidative stress metabolites in eastern Pacific green turtles (Chelonia mydas

agassizii). Comparative Biochemistry and Physiology, Part C, v. 146, p. 111-

117. 2007

VAN DOLAH, F.M.; NEELY, M.G.; MCGEORGE, L.E.; BALMER, B.C.; YITALO,

G.M.; ZOLMAN, E.S.; SPEAKMAN, T.; SINCLAIR, C.; KELLAR, N.M.; ROSEL,

P.E.; MULLIN, K.D.; SCHWACKE, L.H. Seasonal variation in the skin




______________________




Revisão 01 06/2018

transcriptome of common bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) from the

northern Gulf of Mexico. PlosOne, v.10, n. 6, p. 1-21. 2015.

VENANCIO, L.P.; SILVA, M.I.A.; DA SILVA, T.L.; MOSCHETTA, V.A.; DE

CAMPOS ZUCCARI, D.A.; ALMEIDA, E.A.; BONINI-DOMINGOS, C.R. Pollution-

induced metabolic responses in hypoxia-tolerant freshwater turtles.

Ecotoxicology and Environmental Safety, v. 97, p. 1-9. 2013.

WALKER, C.H. Biochemical biomarkers in ecotoxicology - some recent

developments. The Science of the total environment, v. 171, p. 189-195. 1995.

WANG, Z.; PASCUAL-ANAYA, J.; ZADISSA, A.; LI, W.; NIIMURA, Y.; HUANG, Z.;

LI, C.; WHITE, S.; XIONG, Z.; FANG, D.; WANG, B.; MING, Y.; CHEN, Y.;

ZHENG, Y.; KURAKU, S.; PIGNATELLI, M.; HERRERO, J.; BEAL, K.; NOZAWA,

M.; LI, Q.; WANG, J.; ZHANG, H.; YU, L.; SHIGENOBU, S.; WANG, J.; LIU, J.;

FLICEK, P.; SEARLE, S.; WANG, J.; KURATANI, S.; YIN, Y.; AKEN, B.; ZHANG,

G.; IRIE, N. The draft genomes of soft-shell turtle and green sea turtle yield

insights into the development and evolution of the turtle-specific body plan. Nature

Genetics, v. 45, p. 701-706. 2013.

WANWIMOLRUK, S.; WANWIMOLRUK, P. Characterization of CYP1A enzyme in

Adélie penguin liver. Comparative Biochemistry And Physiology Part C:

Toxicology & Pharmacology, v. 144, p. 148-154. 2006.

WHITE, R.D.; HAHN, M.E.; LOCKHART, W.L.; STEGEMAN, J.J. Catalytic and

Immunochemical characterization of hepatic microsomal cytochromes P450 in

Beluga whale (Delphinapterus leucas). Toxicology and Applied Pharmacology,

v. 126, p. 45-57. 1994.

WHITE, R.D.; SHEA, D.; SCHLEZINGER, J.J.; HAHN, M.E.; STEGEMAN, J.J. In

vitro metabolism of polychlorinated biphenyl congeners by beluga whale

(Delphinapterus leucas) and pilot whale (Globicephala melas) and relationship to

cytochrome P450 expression. Comparative Biochemistry and Physiology Part

C, v. 126, p. 267-284. 2000.

WIECZOREK, D.; DELAURIERE, L.; SCHAGAT, T. Methods of RNA Quality

Assessment. 2012. Promega Corporation Web site. Disponível em:

<https://www.promega.com.br/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-

assessment/>. Acesso em: 08 dez. 2017.

Pág. 201 / 203



______________________




Revisão 02 06/2018

WILKINSON, J.H. Enzyme kinetics and its relevance to enzyme assay. Journal of

Clinical Pathology, v. 24, p. 14-21. 1971.

WILSON, J.Y.; MOORE, M.J.; STEGEMAN, J.J. Catalytic and immunochemical

destection of hepatic and extrahepatic microsomal cytochrome P450 1A1

(CYP1A1) in white-sided dolphin (Lagenorhyncus acutus). Aquatic Toxicology, v.

96, p. 216-224. 2010.

WOLKERS, J.; WITKAMP, R.F.; NIJMEIJER, S.M.; BURKOW, I.C.; DE GROENE,

E.M.; LYDERSEN, C.; DAHLE, S.; MONSHOUWER, M. Phase I and phase II

enzyme activities in Ringed seals (Phoca hispida): characterization of hepatic

cytochrome P450 by activity patterns, inhibition studies, mRNA analyses, and

western blotting. Aquatic Toxicology, v. 44, p. 103-115. 1998.

YAWETZ, A.; WOODIN, B.; STEGEMAN, J.J. Cytochromes P450 in liver of the

turtle Chrysemys picta picta and the induction and partial purification of CYP1A-

likeproteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, v. 1381,

p. 12-26. 1998.

YAMAZAKI, M.; WAKASUGI, C. Postmortem changes in drug-metabolizing

enzymes of rat liver microsome. Forensic Science International, v. 67, p. 155-

168. 1994.

ZERBINI, A.N.; SECCHI, E.; CRESPO, E.; DANILEWICZ, D.; REEVES, R. 2017.

Pontoporia blainvillei. The IUCN Red List of Threatened Species 2017:

e.T17978A50371075.http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2017-

3.RLTS.T17978A50371075.en. Acesso em: 11 de dezembro de 2017.

Declaramos verdadeiras as informações constantes nesse 1º Relatório Técnico

Anual.

Afonso Celso Dias Bainy Jacó Joaquim Mattos

Coordenador da equipe Técnico Responsável


Marinhos provenientes do PMP-BS e PMC-BS X. Equipe Técnica

Pág. 202 / 203

______________________




Revisão 01 06/2018

X – EQUIPE TÉCNICA

Profissional Afonso Celso Dias Bainy

Formação Oceanógrafo e doutor em

Bioquímica

Função Coordenador

Registro no Conselho de Classe

Cadastro Técnico Federal de Atividades

e Instrumentos de Defesa Ambiental

Responsável pela(s) Seção(ões)

Assinatura

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

Profissional Karim Hahn Lüchmann

Formação Bióloga e doutora em Bioquímica

Função Vice-coordenadora





Assinatura

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

Profissional Jacó Joaquim Mattos

Formação Biólogo e mestre em Bioquímica

Função Técnico de laboratório

Registro no Conselho de Classe 63534-03D




Assinatura

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

Profissional Bárbara Pacheco Harrison Righetti

Formação Bióloga e mestre em Bioquímica

Função Técnica de laboratório

Pág. 203 / 203

X. Equipe Técnica Padronização de Técnicas e Análises de Biomarcadores em Espécies de Tetrápodes


______________________




Revisão 02 06/2018

Registro no Conselho de Classe 89632-01D



3300918


Assinatura

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

Profissional Vera Helena Vidal Dias

Formação

Função Bolsista de Extensão da

Graduação





Assinatura

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

Profissional Luiz Otávio de Barros Villas Bôas

Formação

Função Bolsista de Extensão da

Graduação





Assinatura

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

Profissional Daína de Lima

Formação Química Ambiental e doutora em

Bioquímica

Função Assistente administrativa





Assinatura

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

padronização de técnicas e análises de biomarcadores em ... · v.3 – quantificaÇÃo de...

Documents