p15 ink4b e p16 ink4a em síndrome mielodisplásica primária na...
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Eliane Ferreira Rodrigues
Estudo das Alterações Cromossômicas e
Análise de Metilação nos Genes p15INK4B e p16INK4A em
Síndrome Mielodisplásica Primária na Infância no Estado
do Rio de Janeiro
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A
OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS
BIOLÓGICAS (BIOFÍSICA)
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – 2007
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ELIANE FERREIRA RODRIGUES
Estudo das Alterações Cromossômicas e Análise de Metilação nos
Genes p15INK4B e p16
INK4A em Síndrome Mielodisplásica Primária
na Infância no Estado do Rio de Janeiro
2007
Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de
Pós-graduação em Biofísica, Instituto de Biofísica
Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio
de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Mestre em Ciências.
Orientadoras: Teresa de Souza Fernandez
Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay
ii
RODRIGUES, Eliane Ferreira
Estudo das Alterações Cromossômicas e Análise de Metilação nos Genes p15INK4B
e p16INK4A em Síndrome Mielodisplásica Primária na Infância no Estado do Rio de
Janeiro / Eliane Ferreira Rodrigues. Rio de Janeiro: UFRJ, IBCCF, 2007.
XVIII, 119 p.
Orientadoras: Teresa de Souza Fernandez e Eliana Saul Furquim Werneck
Abdelhay
Dissertação (Mestrado em Ciências) – UFRJ/ IBCCF/ Programa de Pós-
graduação em Biofísica - Biologia Molecular, 2007.
Referências Bibliográficas: f. 82-93
1. Síndrome Mielodisplásica Primária na Infância. 2. Alterações
Cromossômicas. 3. Metilação 4. p15INK4B e p16
INK4A. I Fernandez, Teresa de Souza;
Abdellhay, Eliana Saul Furquim Werneck II. Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Pós-graduação em
Biofísica. III. Título
iii
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Citogenética, no Centro de Transplante de Medula
Óssea do Instituto Nacional do Câncer (CEMO-INCA), em colaboração com o Serviço de Genética
Humana da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (SERVGEN-UERJ).
Durante o desenvolvimento deste projeto de pesquisa fomos beneficiados por auxílios do Ministério
da Saúde- INCA e da FAPERJ.
iv
v
A minha amada família.
vi
AGRADECIMENTOS
- À Deus por ter me protegido e acompanhado em toda a minha caminhada;
- Aos meus pais pelo amor incondicional, incentivo, apoio, compreensão e paciência ao
longo de toda a minha vida;
- Ao meu irmão por se fazer presente na minha vida e pelo apoio e incentivo;
- Ao meu namorado Leonardo, por tornar meus dias mais felizes e me incentivar a cada dia
a seguir sempre em frente, por toda a sua ajuda na confecção desta tese, compreensão, carinho
e paciência;
- Ao Dr. Luis Fernando Bouzas diretor do CEMO-INCA, pela oportunidade e todo o apoio
que recebemos para realização deste projeto de pesquisa;
- À Dra. Teresa de Souza Fernandez, minha orientadora, por acreditar no meu potencial
incentivando-me a sempre conseguir o melhor, por todo conhecimento transmitido e
principalmente pela amizade;
- À Dra. Eliana Abdelhay pelo seus ensinamentos, experiência, apoio e auxílio durante a
elaboração desta tese;
- Às Professoras Dra. Cíntia Barros Santos-Rebouças e Dra. Márcia Mattos Gonçalves
Pimentel do Laboratório de Serviço de Genética Humana da Universidade do Estado do Rio
de Janeiro (SERVGEN-UERJ), pela valiosa colaboração e enorme ajuda em toda a parte de
biologia molecular;
- À Dra. Gilda Alves Brown do Laboratório de Genética Aplicada – Serviço de
Hematologia do INCA pelo auxílio na obtenção e no cultivo da linhagem celular DLD-1;
- Aos pesquisadores Dr. André Vettore e Dra. Andréa Seixas e ao técnico Fabrício de
Carvalho do Instituto de Ludwig São Paulo por cederem a linhagem DLD-1 para a nossa
pesquisa;
vii
- À Dra. Hilda do Laboratório de Imunologia do Centro de Transpalnte de Medula Óssea –
INCA por ter cedido a linhagem Raji para a nossa pesquisa;
- À Beatriz e Lílian do Programa de Biologia Molecular do Instituto de Biofísica -UFRJ,
pelo auxílio no sequenciamento das amostras;
- Ás minhas amigas Daiane e Michelle por todo o carinho e companherismo durante toda a
minha vida acadêmica, e pelo enorme laço de amizade que nos une;
- Às minhas amigas Adriana e Luize por toda a ajuda prática, pelos conselhos e pelas
demonstrações de carinho e amizade ao longo destes anos;
- Aos amigos de trabalho Aline, Moises, Amanda e Luciano por todos os momentos de
descontração;
- Aos mais recentes amigos Eleonidas e Elenice por suas preciosas dicas e experiência;
- À todas as pessoas do laboratório SERVGEN-UERJ, Claúdia, Mário, Jussara, Juliana,
Karla, Natália, Adriana, Cristiane e Mariana por terem me recebido com carinho e amizade no
laboratório;
- À toda equipe do CEMO, médicos, enfermeiros e técnicos que de certa forma
contribuíram para a realização deste projeto;
- Aos meus professores da Faculdade de Formação de Professores da UERJ que
contribuíram para minha formação;
viii
RESUMO
A Síndrome Mielodisplásica (SMD) primária é rara na infância representando cerca de 4% de todas as malignidades hematológicas desta faixa etária. Devido a sua raridade muitas vezes torna-se difícil o seu diagnóstico. Alterações citogenéticas envolvendo o cromossomo 7 (-7/7q-) representam as principais alterações neste grupo de pacientes e estão associadas com mau prognóstico. Entretanto, existem controvérsias em relação ao valor prognóstico de algumas alterações cromossômicas como +8 e del(11)(q23). Mudanças no padrão de metilação do DNA são freqüentemente observadas em adultos e parecem estar associadas com a transformação leucêmica. No entanto, poucos estudos mostraram o papel de mudanças no padrão de metilação em genes importantes que controlam o ciclo celular, como p15
INK4B e
p16INK4A em SMD na infância. Este trabalho apresentou como objetivos caracterizar as
alterações cromossômicas em SMD primária na infância e analisar a presença de metilação na região promotora dos genes p15
INK4B e p16
INK4A, no sentido de identificar marcadores biológicos que auxiliem o diagnóstico e a definição de fatores prognósticos, contribiundo na escolha de protocolos de tratamento. Foram analisados citogeneticamente, no período de 1991 a 2006, 64 pacientes, com idades entre 5 meses a 18 anos. A análise citogenética foi realizada através da técnica de bandeamento G e através da citogenética molecular (FISH). A frequência de cariótipos anormais foi 72% dos 61 pacientes analisados. Em três casos o índice mitótico foi nulo. De acordo com a classificação para SMD da infância, 35 pacientes apresentaram CR, 14 AREB, 10 AREB-t e 5 LMMJ. Nos subtipos mais avançados da doença a freqüência de casos com alterações cromossômicas foi maior. As anomalias cromossômicas mais freqüentes foram: -7/7q-, del(11)(q23), cariótipos complexos e del(17)(p12). Não foi verificada uma alteração cromossômica específica por subtipo. Nossos resultados sugerem que o padrão cromossômico em SMD primária na infância é caraterizado principalmente por perdas parcias e completas de cromossomos (deleções e monossomias), assim como ganhos cromossômicos (trissomias). A análise citogenética auxiliou no diagnóstico dos casos com suspeita de SMD primária pediátrica e foi uma importante ferramenta para a escolha do tratamento. O estudo da presença de metilação na região promotora dos genes p15
INK4B e
p16INK4A em 45 pacientes foi realizado pela técnica reação em cadeia da polimerase específica
para a metilação (MSP). Todas as amostras positivas para a metilação de ambos os genes foram sequenciadas, como metodologia confirmatória. A análise molecular revelou que 16 pacientes (35,5%) apresentaram metilação para o gene p15
INK4B e apenas 4 (8,8%) para o
gene p16INK4A. As maiores freqüências de metilação para os genes p15
INK4B e p16
INK4A foram observadas nos subtipos mais agressivos de SMD. Evolução da doença foi verificada em 22 pacientes (36%). A correlação entre a presença de uma alteração cromossômica específica com metilação nos genes p15
INK4B e p16
INK4A mostrou uma forte associação entre a metilação em p15
INK4B e alterações envolvendo o cromossomo 7, sugerindo uma provável via de evolução da doença. Nossos resultados sugerem que as alterações cromossômicas, -7/7q-; +8 e del(11)(q23), e a presença de metilação em p15
INK4B e p16
INK4A estão associadas com mau prognóstico, sendo prováveis marcadores biológicos de evolução da doença.
ix
ABSTRACT
Primary Myelodysplastic Syndrome (MDS) is rare in children representing around 4% of all hematologic malignancies in childhood. Because of its rarity the diagnosis is usually difficult. Chromosomal alterations involving chromosome 7 (-7/7q-) represent the main alteration in this group of patients and are associated with poor prognosis. However, there is controversy in relation of prognosis value of some chromosomal alterations as +8 and del(11)(q23). Changes on the DNA methylation pattern are frequently observed in adults and seem to be associated with leukemic transformation. Nevertheless, few studies investigated the role of changes on methylation pattern in important genes that regulate cell cycle, as p15
INK4B and p16INK4A in primary MDS in childhood. The aim of this study was to characterize
chromosomal alterations in childhood MDS and analyze the presence of methylation in promoter regions of p15
INK4B and p16INK4A genes, to identify biologic markers that would aid
the diagnosis and the definition of prognostic factors, contributing on treatment choice. In this study 64 patients with age between 5 months to 18 years old were analyzed cytogenetically, between 1991 and 2006. Cytogentic analysis was performed by G banding and by molecular cytogenetic (FISH). The frequency of abnormal karyotypes was 72% in 61 patients analyzed. In three cases the mitotic index was null. Acording to the classification of primary MDS in childhood, 35 patients presented CR, 14 RAEB, 10 RAEB-t and 5 JMML. In more advanced subtypes of disease the frequency of cases with chromosomal alterations was higher. The most frequent chromosomal abnormalities were: -7/7q-, del(11)(q23), complex karyotypes and del(17)(p12). No specific chromosomal alteration could be related to subtype. Our results suggest that the chromossomal pattern in primary MDS childhood is characterized mainly by partial and complete lose of chromosomes (deletion and monosomy), as well as chromosomal gain (trisomy). The cytogenetic analysis aided in diagnosis of cases with suspicion of pediatric primary MDS and it was an important tool for treatment choose. The study of methylation in the promoter region of p15
INK4B and p16INK4A genes in 45 patients was
performed by methyl specific polymerase chain reaction (MSP). All samples positive for methylation in both genes were sequenced as a confirmatory methodology. The molecular analysis revealed that 16 patients (35,5%) presented methylation on p15
INK4B gene and 4 (8,8%) on p16
INK4A gene. The higher frequency of methylation in p15INK4B and p16
INK4A genes was observed in more aggressive subtypes of MDS. Evolution of disease was verified in 22 cases (36%). The correlation between karyotype and methylation in the p15
INK4B and p16INK4A
genes showed a strong association between methylation in p15INK4B gene and alterations
involving chromosome 7, suggesting a pathway of disease evolution. Our results suggest that chromosomal alterations –7/7q-, +8, del(11)(q23) and the presence of methylation in p15
INK4B
and p16INK4A were associated with poor prognosis, being possibe biologic markers of disease
evolution.
x
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS A adenina
ALIP localização anormal de precurssores imaturos
AR anemia refratária
ARDM anemia refratária com displasias multilinhagem
ARDM-SA anemia refratária com displasias multilinhagem com sideroblastos em anel
AREB anemia refratária com excesso de blastos
AREB-t anemia refratária com excesso de blastos em transformação
ARSA anemia refratária com sideroblastos em anel
ARA-C arabinosídeo citosina
ATG anti-linfócito globulina
C citosina
CDK quinases dependentes de ciclinas
CDKI inibidores de quinases dependentes de ciclinas
CpG região de alta densidade de dinucleotídeos citosina-guanina
CR citopenia refratária
CSF-1 fator estimulador de colônia 1
CTH células tronco hematopoéticas
DAPI 4,6-diamidino-2-fenilindol
dATP 2’ desoxiadenosina 5’ trifosfato
dCTP 2’ desoxicitidina 5’ trifosfato
del deleção
dGTP 2’ desoxiguanosina 5’ trifosfato
DNA ácido desoxirribonucléico
xi
DNMT DNA metiltransferase
dNTPs desoxirribonucleotídeos trifosfatos
dTTP 2’ desoxitimidina 5’ trifosfato
EDTA ácido etilenodiaminotetrácético
FAB Grupo Franco-Americano-Britânico
FISH hibridização “in situ” por fluorescência
FITC isotiocianato de fluoresceína
G guanina
GCB-MDS-PED Grupo Cooperativo Brasileiro em SMD Pediátrica
GDP guanosina 5’ difosfato
GM-CSF fator de estimulação de colônias granulócito-macrófago
GTP guanosina 5’ trifosfato
GTPase guanosina trifosfatase
G6PD glicose 6 fosfato desidrogenase
HDACs histonas desacetilases
HLA antígeno de histocompatibilidade
HPRT hipoxantina fosforibosil transferase
IMT inibidores da metiltransferase
inv inversão
IPSS Sistema Internacional de Escala Prognóstica
Kb Kilobases
LA leucemia aguda
LLA leucemia linfoblástica aguda
LMA leucemia mielóide aguda
xii
LMMC leucemia mielomonocítica crônica
LMMJ leucemia mielomonocítica juvenil
M metilado
MO medula óssea
mL mili litro
MPBs proteínas ligadoras de CpGs metilados
MSP reação em cadeia da polimerase específica para a metilação
NF1 neurofibromatose do tipo 1
OMS Organização Mundial de Saúde
p braço curto do cromossomo
Ph cromossomo Philadelphia
pRB proteína de retinoblastoma
q braço longo do cromossomo
RFLP polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição
RNA ácido ribonucléico
rpm rotações por minuto
RPMI “Roswell Park Memorial Institute” - meio de cultivo de células
SAM S-adenosil-L-metionina
SD Síndrome de Down
SMD Síndrome Mielodisplásica
T timina
t translocação
TCTCU transplante de células tronco de cordão umbilical
TCTH transplante de células tronco hematopoéticas
xiii
TMO transplante de medula óssea
TNF-α fator de necrose tumoral- α
TNFR-α receptor de fator de necrose tumoral- α
U não metilado
+ ganho de cromossomo
- perda de cromossomo
ºC graus Celsius
xiv
ISTA DE FIGURAS
Figuras p.
1 Modelo de Múltiplas Etapas no Desenvolvimento da SMD.......................................... 10
2 Região de metilação na seqüência do DNA e adição do grupamento metila pelas
enzimas DNMT..............................................................................................................
17
3 Atividade transcricional do gene de acordo com o padrão de metilação....................... 18
4 Modelo para o silenciamento transcricional dependente de metilação.......................... 19
5 Classificação da Síndrome Mielodisplásica e Doenças Mieloproliferativas na
Infância...........................................................................................................................
24
6 Efeito do tratamento com bissulfito em uma amostra de DNA com seqüências ricas
em dinucleotídeos CpG..................................................................................................
37
7 Freqüência das alterações cromossômicas em SMD primária na infância.................... 46
8 Análise por hibridização in situ por fluorescência utilizando a sonda de dupla
marcação do cromossomo 7 e a sonda da região 11q23 (MLL) ....................................
48
9 Análise por citogenética clássica e citogenética molecular (FISH) utilizando a sonda
da região p13.1 do cromossomo 17 (p53) e a sonda da região 11q23 (MLL) ...............
49
10 Análise por citogenética clássica e citogenética molecular (FISH) utilizando a sonda
de dupla marcação do cromossomo 5............................................................................
50
11 Análise por citogenética clássica e citogenética molecular (FISH) utilizando a sonda
da região p13.1 do cromossomo 17 (p53) .....................................................................
51
12
Análise por hibridização in situ por fluorescência utilizando a sonda de dupla
marcação do cromossomo 7 ..........................................................................................
52
13 Fotografia de gel de poliacrilamida 5% utilizado para verificar a amplificação dos
produtos de PCR referente a análise de metilação do gene p15INK4B após a
modificação do DNA com bisulfito ............................................................................
55
xv
14 Análise do sequenciamento do gene p15INK4B (5’→ 3’) através do programa
“BioEdit Sequence Alignment Editor” ........................................................................
57
15 Fotografia de gel de poliacrilamida 5% utilizado para verificar a amplificação dos
produtos de PCR referente à análise de metilação da região promotora do gene p16
após a modificação do DNA com bisulfito ...................................................................
60
16 Análise do sequenciamento do gene p16INK4A (5’→ 3’) através do programa
“BioEdit Sequence Alignment Editor” .........................................................................
61
17 Correlação entre a presença de metilação nos genes p15 INK4B e 16
INK4A e o cariótipo
em crianças portadoras de SMD primária .....................................................................
66
xvi
LISTA DE TABELAS
Tabelas p. 1 Classificação das Síndromes Mielodisplásicas segundo os critérios propostos pelo
Grupo FAB em 1982 ....................................................................................................
5
2 Classificação das Síndromes Mielodisplásicas segundo a proposta OMS em 2000..... 6
3 Pontuação segundo os Parâmetros Críticos do IPSS (1997) em Síndromes
Mielodisplásicas ...........................................................................................................
9
4 Diferenças entre SMD em Crianças e em Adultos ....................................................... 22
5 Oligonucleotídeos utilizados na técnica MSP para análise dos genes p15INK4B e
p16INK4A..........................................................................................................................
38
6 Análise Citogenética em Síndrome Mielodisplásica Primária na Infância .................. 41
7 Freqüência de Casos com Cariótipos Anormais em SMD Primária na Infância .......... 45
8 Distribuição do Padrão Cromossômico por Subtipo de SMD Primária na Infância .... 47
9 Freqüência de Pacientes com SMD Primária na Infância de acordo com o IPSS
(1997) que mostraram evolução da doença...................................................................
53
10 Identificação de Metilação no Gene p15INK4B em SMD Primária na Infância .............. 55
11 Freqüência de Metilação no Gene p15INK4B nos Subtipos da SMD Primária na
Infância............................................................................................................................
58
12 Identificação de Metilação no Gene p16INK4A em SMD primária na infância ............... 59
13 Freqüência de Metilação no Gene p16INK4A nos Subtipos da SMD Primária na
Infância............................................................................................................................
62
14 Correlação entre a Presença de Metilação nos Genes p15INK4B e p16
INK4A com o
Padrão Cromossômico em SMD Primária da Infância ..................................................
64
xvii
SUMÁRIO Resumo................................................................................................................................. viii
Abstract................................................................................................................................. ix
Lista de abreviaturas e siglas............................................................................................ ... x
Lista de figuras..................................................................................................................... xiv
Lista de tabelas..................................................................................................................... xvi
1. Introdução......................................................................................................................... 1
1.1 Síndrome Mielodisplásica........................................................................................... 1
1.1.1 Classificação e Escala Prognóstica em SMD Primária.......................................... 4
1.1.2 Teoria de Múltiplas Etapas no Desenvolvimento da SMD Primária..................... 9
1.1.3 Alterações Cromossômicas em SMD Primária .................................................... 11
1.1.4 Oncogengenes e Genes Supressores de Tumor Envolvidos no Desenvolvimento
da SMD Primária..................................................................................................................
14
1.1.5 Alterações Epigenéticas em SMD Primária: Metilação dos Membros da
Família InK4 p15 e p16 .......................................................................................................
16
1.1.6 SMD Primária na Infância..................................................................................... 21
2. Objetivos........................................................................................................................... 29
3. Materiais e Métodos......................................................................................................... 31
3.1 Pacientes...................................................................................................................... 31
3.2 Análise Citogenética ................................................................................................... 31
3.2.1 Cultura de Células de Medula Óssea..................................................................... 31
3.2.2 Término das Culturas e Preparação das Lâminas.................................................. 32
3.2.3 Bandeamento G..................................................................................................... 33
3.2.4 Análise Cromossômica ......................................................................................... 33
3.3 Citogenética Molecular: Análise por Hibridização “in situ” por Fluorescência
(FISH)...................................................................................................................................
33
3.4 Análise Molecular........................................................................................................ 34
3.4.1 Cultura de Células da Linhagem DLD-1 e Raji..................................................... 34
3.4.2 Extração de DNA................................................................................................... 35
3.4.3 Análise de Metilação dos Genes p15INK4B
e p16INK4A pelo Método MSP.............. 36
3.4.3.1 Tratamento do DNA com Bisulfito................................................................. 36
3.4.3.2 Reação em Cadeia da Polimerase Específica para a Metilação (MSP)........... 38
3.4.3.3 Avaliação dos Produtos Gerados pela PCR nos Genes p15INK4B
e p16INK4A.... 39
xviii
3.4.3.4 Sequenciamento de DNA................................................................................ 39
4. Resultados........................................................................................................................ 41
4.1 Análise Citogenética em Síndrome Mielodisplásica Primária na Infância................. 41
4.1.1 Freqüência de Casos com Alterações Cromossômicas por Subtipos de SMD
Primária na Infância .............................................................................................................
44
4.2 Citogenéica Molecular: Aplicação do FISH em SMD Primária na Infância............... 48
4.3 Distribuição dos Pacientes com SMD Primária na Infância segundo os Grupos de
Risco (IPSS)..........................................................................................................................
52
4.4 Análise Molecular........................................................................................................ 53
4.4.1 Análise da Freqüência de Metilação na Região Promotora do Gene p15INK4 em
Pacientes com SMD Primária na Infância ...........................................................................
54
4.4.1.1 Confirmação por Sequenciamento das Amostras Positivas para a Metilação
do Gene p15INK4B.................................................................................................................
56
4.4.2 Freqüência de Metilação em p15INK4B nos Subtipos de SMD Primária na
Infância ................................................................................................................................
57
4.4.3 Análise da Freqüência de Metilação no Gene p16INK4A em Pacientes com SMD
Primária na Infância .............................................................................................................
58
4.5.3.1 Confirmação por Sequenciamento das Amostras Positivas para a Metilação
do Gene p16INK4A..................................................................................................................
60
4.4.4 Freqüência de Metilação na Região Promotora do Gene p16INK4A nos
Subtipos de SMD Primária na Infância ...............................................................................
61
4.5 Correlação entre a Presença de Metilação nos Genes p15INK4B e p16
INK4A e o
Padrão Cromossômico em SMD Primária na Infância ........................................................
62
5. Discussão.......................................................................................................................... 67
6. Conclusões........................................................................................................................ 81
7. Referências Bibliográficas................................................................................................ 82
8. Anexos ............................................................................................................................. 94
8.1 Anexo 1........................................................................................................................... 94
8.1.1 Aprovação pelo Comitê de Ética do Projeto de Pesquisa .......................................... 95
8.1.2 Termo Informado e Esclarecido.................................................................................. 97
8.2 Anexo 2 .......................................................................................................................... 99
8.2.1 Cariótipos.................................................................................................................. 99
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Síndrome Mielodisplásica
A síndrome mielodisplásica (SMD) compreende um grupo de doenças hematopoéticas
de natureza clonal de célula tronco pluripotente, que se caracteriza por uma hematopoese
ineficaz, apoptose intramedular aumentada, presença de displasias na medula óssea e
citopenias em uma ou mais linhagens (DELFORGE, 2003).
Uma grande variedade de agentes genotóxicos têm sido implicada na sua etiologia,
sendo os mais conhecidos e estudados as drogas citotóxicas, especialmente os agentes
alquilantes e os inibidores da topoisomerase II, nestes casos a SMD é denominada secundária
(NISSE et al., 2001).
As SMDs primárias, ou “de novo”, ocorrem quando o paciente não foi submetido a
nenhum tratamento prévio com medicamentos citotóxicos nem esteve em contato com agentes
mutagênicos, não havendo portanto causa conhecida para o aparecimento da doença.
Entretanto, há um consenso de que fatores hereditários, ambientais e a senescência da
hematopoese podem influenciar no surgimento da SMD (LORAND-METZE, 2005). A SMD
primária afeta preferencialmente pessoas acima dos 50 anos de idade, sendo rara na infância.
A incidência anual desta síndrome é de aproximadamente 3.5-10 a cada 100.000 indivíduos
da população geral e de 12-50 a cada 100.000 indivíduos da população idosa. O aumento da
freqüência e da incidência da SMD podem ser atribuídos ao crescimento da expectativa de
vida e ao reconhecimento e diagnóstico desta doença (NISHINO & CHANG, 2005).
A história natural da SMD é altamente variável, podendo apresentar formas brandas,
com sobrevivência alta e baixa taxa de transformação leucêmica ou formas mais agressivas
que podem evoluir rapidamente para leucemia mielóide aguda (LMA). Pacientes com SMD
raramente transformam para leucemia linfóide aguda (LLA) (DELFORGE, 2003).
2
Uma das características da SMD é a presença de citopenias periféricas, isoladas ou em
associação. As citopenias mais comuns em SMD são anemia, neutropenia e a
trombocitopenia. Uma outra característica é a presença de alterações morfológicas decorrentes
de defeitos de diferenciação celular chamadas de displasias. Estas alterações ocorrem
principalmente nas linhagens eritróide, granulocítica e megacariocítica (OGATA, 2006).
A renovação celular é aumentada na maioria dos pacientes com mielodisplasia, sendo
a medula óssea geralmente, hipercelular ou normocelular. O aparente paradoxo entre medula
óssea hipercelular e sangue periférico com citopenias foi esclarecido quando se mostrou que
pacientes com SMD apresentam taxas de apoptose intra-medular aumentada, causando assim
as citopenias no sangue periférico. Nos estágios mais avançados da doença a taxa apoptótica
diminui, permitindo a proliferação de células imaturas (blastos) e contribuindo para a
transformação leucêmica (PARKER et al., 2000; HELLSTRÖM-LINDBERG et al., 2000).
Em alguns casos raros, pacientes podem apresentar a medula óssea hipocelular, podendo levar
a um diagnóstico duvidoso com anemia aplástica (WONG & SO, 2002). A SMD é
considerada hipocelular se tiver menos de 30% de celularidade em indivíduos jovens, e menos
de 20% em indivíduos idosos (TOMONAGA & NAGAI, 2002).
O diagnóstico da SMD é feito inicialmente através de um hemograma (que indica a
presença de uma ou mais citopenias no sangue periférico e ausência de resposta para vitamina
B12 e ácido fólico), seguido da análise de biópsia e de mielograma de medula óssea para
identificar as displasias presentes, a possível presença de blastos caracterizando estágios mais
avançados da doença e a presença de precursores imaturos com localização anormal (ALIP).
Estudos adicionais auxiliam no estabelecimento do diagnóstico, incluindo a análise
citogenética e a imunofenotipagem (LIST et al., 2004).
Grande variedade de tratamentos vem sendo utilizada em pacientes adultos e crianças
com SMD primária, com o objetivo de eliminar as citopenias, assim como de recuperar a
3
hematopoese. Uma das terapias utilizadas é a de suporte que envolve as transfusões
sanguíneas, antibióticos, fatores de crescimento isolados ou em combinação, ciclosporina ou
anti-linfócito globulina (ATG) que são também utilizados em pacientes que apresentam
medula óssea hipocelular. Nos subtipos mais avançados da SMD (AREB, AREB-t, LMMC) é
utilizada a quimioterapia com agente único: hidroxiurea, etoposídeo, mercaptopurina, baixa
dose de arabinosídeo citosina (ARA-C). Em alguns casos é utilizada a quimioterapia intensiva
similar àquela dada a pacientes com LMA, como a combinação de fludarabina e alta dose de
ARA-C, induzindo a remissão nesses doentes (HELLSTRÖM-LINDBERG et al., 2000).
O transplante de células tronco hematopoéticas (TCTH) alogenêico é a única opção
terapêutica curativa para pacientes com SMD, no entanto, o seu uso é limitado a pacientes até
55 anos de idade e que possuam doadores histocompatíveis (GIRALT, 2005; WONG et al.,
2005). Para pacientes jovens com SMD ou LMA secundária a SMD, o TCTH alogenêico é
apontado como a melhor opção de tratamento (YUSUF et al., 2004; ESPIGADO et al., 2005).
Atualmente, o sangue de cordão umbilical tem sido utilizado como uma satisfatória fonte de
células tronco para diversos grupos de pacientes adultos e pediátricos. Estudos demonstraram
que após o transplante de sangue de cordão umbilical a taxa de recaída, de sobrevida livre da
doença e a sobrevida total dos pacientes com malignidades mielóides é similar a de outras
fontes de células tronco hematopoéticas (BALLEN et al., 2006; BRUNSTEIN et al., 2007).
Desta forma, o sangue de cordão umbilical é uma fonte alternativa de células tronco
hematopoéticas para pacientes que necessitam de um transplante alogenêico, mas não
apresentam doadores histocompatíveis.
Com a delineação das características biológicas que norteiam o fenótipo da SMD,
novas drogas introduzidas no tratamento desta doença têm mostrado um grande potencial
terapêutico. Como por exemplo, agentes imunossupressores, anti-angiogênicos
(principalmente a talidommida) (MUSTO, 2004), citoprotetores (amifostina), inibidores do
4
receptor da tirosina quinase (mesilato de imatinibe) (GILES et al., 2003) e inibidor de farnesil
transferase (inibidor da via Ras) (KURZROCK et al., 2004). Além disso, uma nova classe
terapêutica chamada inibidores da metiltransferase (IMT) vem sendo utilizada no tratamento
da SMD. Os representantes desta classe incluem a azacitidina (5-azacitidina) e decitabina (5-
aza 2’ deoxicitidina). Ambos são agentes hipometilantes que se incorporam no DNA e então
irreversivelmente ligam-se e inibem a ação da DNA metiltransferase. Esta interação resulta
inicialmente em um DNA semi-metilado, no entanto, após outros ciclos celulares, este, torna-
se totalmente não metilado. A ação destes fármacos leva à reativação de genes
epigeneticamente reprimidos, como genes supressores de tumor. Resultados iniciais
demonstraram que pacientes com SMD de alto risco têm um aumento no tempo de
transformação para LMA e sobrevida (SILVERMAN & MUFTI, 2005; ATALLAH et al.,
2007).
Devido à introdução de novas formas de tratamento torna-se importante o estudo da
correlação das características citogenéticas, celulares e moleculares com as características
clínicas da doença e a resposta ao tratamento, auxiliando desta forma no desenvolvimento de
esquemas de classificação e de escalas prognósticas.
1.1.1 Classificação e Escala Prognóstica em SMD Primária
Até 1976 as mielodisplasias incluíam uma variedade de anormalidades hematológicas
classificadas como síndromes ou estados pré-leucêmicos. Entretanto, essa classificação era
insatisfatória, uma vez que não havia um termo definido para designar as citopenias
geralmente associadas com a medula hiperplásica, com displasias e progressão variável para
leucemia aguda.
Em 1982, um grupo internacional de hematologistas franceses, americanos e britânicos
(grupo FAB) aplicou o nome “síndrome mielodisplásica” e classificou esta doença em 5
5
subtipos (tabela 1), usando como critérios a porcentagem de blastos na medula óssea e no
sangue periférico e características morfológicas (a presença ou ausência de sideroblastos em
anel e de bastões de Auer) (BENNETT et al., 1982).
Tabela 1: Classificação das Síndromes Mielodisplásicas segundo os Critérios propostos pelo
Grupo FAB em 1982
Células Blásticas (%)
Subtipo
Monócitos
(µµµµl) Sangue
Periférico
Sideroblastos
em anel
(%) Medula óssea
Sangue
Periférico
Medula
óssea
Bastões de Auer
Medula óssea
AR Não < 15 < 1 < 5 Não
ARSA Não > 15 < 1 < 5 Não
AREB Não Não < 5 5 - 20 Não
AREB-t Não Não > 5 20 - 30 Sim ou Não
LMMC > 1000 Não < 5 < 20 Não
AR- anemia refratária; ARSA- anemia refratária com sideroblastos em anel; AREB- anemia refratária com excesso de blastos; AREB-t- anemia refratária com excesso de blastos em transformação; LMMC- leucemia mielomonocítica crônica (BENNETT et al., 1982).
Desde que foi introduzida, vários estudos comprovaram a utilidade da classificação
FAB, tanto para o monitoramento de estudos envolvendo um grande número de pacientes
com SMD, permitindo comparações entre os diversos trabalhos, quanto para o tratamento de
pacientes. No entanto, para a determinação de um prognóstico preciso, esta classificação
apresentava alguns problemas: distinguia somente duas categorias de risco, baixo (AR e
ARSA) e alto risco (AREB, AREB-t e LMMC) e dentro de um mesmo subgrupo FAB os
pacientes mostravam grandes variações na evolução da doença e na sobrevivência,
especialmente dentro dos subgrupos AR e ARSA. A denominação “anemia refratária” nem
sempre é adequada, sendo a anemia apenas uma de três possíveis citopenias em SMD; a
expressão citopenia refratária foi sugerida por alguns autores (GARANDEAU et al., 2000). A
LMMC apresenta em alguns casos características de síndrome mielodisplásica e em outros de
6
síndrome mieloproliferativa, desta forma sua inclusão na SMD vem sendo discutida nas
classificações mais recentes, como a classificação da Organização Mundial da Saúde (OMS)
(tabela 2) (HARRIS et al., 2000).
Tabela 2: Classificação das Síndromes Mielodisplásicas segundo a proposta OMS em 2000.
Subtipo Sangue periférico Medula óssea
AR
anemia / ausência de blastos
blastos <5%
celularidade variável
atipias discretas
ARSA
anemia
ausência de blastos
monócitos <1%
blastos <5%
sideroblastos em anel >15%
atipias discretas
ARDM
citopenias
sem ou raros blastos
displasia em : 10% das células
de 2 ou 3 linhagens
blastos <5%
sem bastonetes de Auer
ARDM - SA
citopenias
sem ou raros blastos
displasia em 2 ou 3 linhagens
blastos <5%
sem bastonetes de Auer
sideroblastos em anel >15%
AREB-1
blastos <5%
pancitopenia
blastos 5-9%
hipercelular com atipias
nas 3 séries
AREB-2
blastos <5%
pancitopenia
blastos 10-19%
hipercelular com atipias
nas 3 séries
Síndrome 5q-
anemia / blastos < 5%
plaquetas normais ou
aumentadas
micromegacariócitos
blastos < 5%
citogenética : del(5q)
SMD não
classificada
neutropenia e/ou plaquetopenia
mas não anemia
blastos <5%
atipias discretas
AR: Anemia Refratária; ARSA: Anemia Refratária com Sideroblastos em Anel; AREB: Anemia Refratária com Excesso de Blastos; ARDM: Anemia Refratária com Displasia Multilinhagem; ARDM-SA: Anemia Refratária com Displasia Multilinhagem com Sideroblastos em Anel; SMD: Síndrome Mielodisplásica (Harris et al , 2000).
7
A Organização Mundial da Saúde sugeriu novos critérios de classificação para SMD,
sendo incorporado muitos conceitos e definições do sistema FAB. Esta classificação
acrescentou dados para melhorar a definição dos subgrupos, assim como a sua relevância
clínica. A maior diferença entre as duas classificações é o desaparecimento do subtipo AREB-
t, sendo considerada a transformação para LMA a partir de 20% de blastos na medula óssea
(HARRIS et al., 2000).
As citopenias refratárias, com ou sem sideroblastos, são divididas em AR e ARSA,
quando a medula óssea apresenta somente uma displasia, e em citopenia refratária com
displasia em multilinhagem (CRDM) e CRDM com sideroblastos em anel (CRDM-SA),
quando a medula óssea apresenta várias displasias.
Foram criados dois subtipos para AREB: AREB-1 (5 a 10% de blastos na medula
óssea) e AREB-2 (11 a 20% de blastos na medula óssea). O subtipo LMMC foi retirado da
categoria de SMD para um novo grupo de doenças mielodisplásicas /mieloproliferativas.
Dados citogenéticos foram incorporados à classificação OMS, como a adição do
subtipo síndrome do 5q-, como uma entidade separada. Esta síndrome é bem estabelecida
entre os pacientes com SMD, estando associada com características clínicas específicas como
anemia macrocítica, hiperplasia micromegacariocítica, menos de 5% de mieloblastos
medulares com um diagnóstico de AR. A faixa etária alvo é constituída principalmente por
pacientes acima dos 50 anos de idade e do sexo feminino (MHAWECH P & SALEEM,
2001).
Apesar de ter como objetivos melhorar o valor prognóstico e clínico da classificação
FAB, esta classificação levantou algumas críticas (HEAD, 2002; HELLSTRÖM-LINDBERG
et al., 2000). As principais falhas apontadas foram a criação de categorias imprecisas e sem
bases biológicas ou genéticas (citopenias refratárias com displasias de várias linhagens e
SMD inclassificável) e a falta de precisão prognóstica. Estudos recentes comparando ambas
8
classificações sugerem que a classificação da OMS estabelece subgrupos mais homogêneos
de pacientes e apresenta um grande valor prognóstico quando comparada com o sistema FAB,
entretanto, controvérsias ainda permanecem (BENNETT, 2005).
Vários estudos têm sido realizados com o objetivo de determinar quais os fatores que
mais influenciam a sobrevivência e a freqüência de evolução para LMA nos pacientes com
SMD, de modo a permitir a elaboração de escalas prognósticas. A porcentagem de blastos na
medula óssea, as alterações citogenéticas e o número de citopenias são atualmente utilizados
como os parâmetros mais importantes para as escalas prognósticas; outros fatores de menor
importância incluem sexo, idade, contagem de plaquetas e de hemoglobina no sangue
periférico e presença de ALIP (GREENBERG et al., 1997).
A classificação de grupos de risco em SMD mais recente corresponde ao Sistema
Internacional de Escala Prognóstica (IPSS) (GREENBERG et al., 1997). Após estudarem
retrospectivamente os dados citogenéticos, morfológicos e clínicos de 816 pacientes, um
número maior do que o número usado para a elaboração de qualquer outra classificação, foi
concluído que a porcentagem de blastos na medula óssea, o número de citopenias no sangue
periférico e a citogenética eram os fatores prognósticos de maior importância, tanto em
relação ao tempo de sobrevivência, como quanto à taxa de transformação leucêmica. A
maneira como a pontuação foi atribuída a cada parâmetro está descrita na tabela 3.
O IPSS dividiu então a SMD em 4 grupos: baixo, intermediário 1, intermediário 2 e
alto risco. A aplicação do IPSS tem gerado discussão em relação aos grupos separados por
cariótipo. Em alguns estudos, a trissomia do cromossomo 8 e a del(11)(q23), por exemplo,
estão freqüentemente associadas com a evolução da doença (FERNANDEZ et al., 2000;
SOLÉ et al., 2000). Entretanto, o IPSS classifica estas alterações cromossômicas como
prognóstico intermediário, sendo, portanto, necessária uma análise mais refinada em relação
aos grupos de risco segundo o cariótipo.
9
TABELA 3: Pontuação segundo os Parâmetros Críticos do IPSS (1997) em Síndromes
Mielodisplásicas
Pontuação Variáveis Prognósticas
0 0,5 1 1,5 2,0
Blastos M.O. < 5% 5 -10% - 11 - 20% 21 - 30%
Cariótipo * Bom Intermediário Mau
Citopenias 0 - 1 2 - 3
“Pontuação” para os grupos de risco: Baixo risco (0 pontos); Intermediário 1 (0,5-1,0 pontos); Intermediário 2 (1,5-2,0); Alto risco (> ou = 2,5). Cariótipos*: bom prognóstico: cariótipos normais, -Y, del(5q), del(20q), mau prognóstico: cariótipos complexos, anomalias envolvendo o cromossomo 7; prognóstico intermediário: outras anomalias cromossômicas (GREENBERG et al., 1997).
Apesar de vários estudos na área de citogenética e de biologia molecular ainda não foi
identificado o preciso mecanismo que leva ao aparecimento da SMD e quais são os eventos
envolvidos na via de evolução da doença para leucemia aguda (DELFORGE, 2003; NISHINO
E CHANG, 2005; PANANI & ROUSSOS, 2005). No entanto, todos os modelos sugeridos
referem-se a um processo de múltiplas etapas (RASKIND et al, 1984; ROSENFELD & LIST,
2000; MUTFI, 2004; OGATA, 2006).
1.1.2 Teoria de Múltiplas Etapas no Desenvolvimento da SMD Primária
As investigações sobre a patofisiologia da SMD têm confirmado a heterogeneidade e a
complexidade biológica desta doença. Avanços na tecnologia têm promovido observações que
levam a sugerir hipóteses sobre o desenvolvimento da SMD. A hipótese mais aceita é que
uma mutação inicial na célula tronco hematopoética pluripotente (a qual pode ser herdada ou
adquirida), resulte na sua expansão limitada. Numa segunda etapa, uma dessas células adquire
uma nova mutação, que leva a alterações na função celular e conseqüentemente evolução do
clone pré-maligno. Este clone, o qual tem vantagens no crescimento, é associado com
displasias, disfunção celular (como excesso de secreção local de citocinas inibitórias), alta
10
taxa de morte celular programada (apoptose), hematopoese ineficiente, defeitos de
diferenciação e instabilidade genômica. Aquisições de novas mutações, como perda da função
de genes supressores de tumor ou mutações em oncogenes, dentro de uma célula neste clone
anormal levam a um aumento no número de células blásticas ocorrendo a evolução para
leucemia (transformação leucêmica) (fig. 1) (AUL et al., 1998; ROSENFELD & LIST, 2000;
MUFTI, 2004).
Fig. 1: Modelo de Múltiplas Etapas no Desenvolvimento da SMD. Evento 1- mutação inicial na célula tronco hematopética. Evento 2- aquisições de novas mutações que levam à alterações na função celular. Evento 3- aparecimento de novas mutações levando à perda de função de genes supressores de tumor e mutações em oncogenes (AUL et al., 1998).
Três linhas de evidências suportam este modelo e a existência de pré-disposição
genética para SMD: (1) a ocorrência de LMA e SMD em famílias com um defeito de reparo
no DNA herdado ou neurofibromatose tipo 1; (2) estudos de mapeamento genético em raras
11
famílias com histórico familiar de SMD e LMA; e (3) estudos da associação de vários
polimorfismos genéticos em LMA e SMD (HELLSTRÖM-LINDBERG et al., 2000).
Embora muitas alterações cromossômicas tenham sido detectadas em SMD, os genes
envolvidos estão sendo ainda identificados, este desconhecimento leva ao questionamento se
estas alterações genéticas são um evento inicial levando ao desenvolvimento da SMD ou se
são eventos secundários contribuindo para a transformação leucêmica (LOOK, 2005).
1.1.3 Alterações Cromossômicas em SMD Primária
A concepção de SMD como uma doença de célula tronco hematopoética de natureza
clonal, foi inicialmente demostrada por estudos envolvendo a inativação do cromossomo X
(JANSSEN et al., 1989), assim como estudos isoenzimáticos da glicose 6 fosfato
desidrogenase (G6PD) (RASKIND et al., 1984). A descoberta de alterações cromossômicas
não randômicas em SMD primária confirmou esta clonalidade, oferecendo um meio de
identificar o clone maligno e de apontar alguns oncogenes e genes supressores de tumor
possivelmente envolvidos com o desenvolvimento e a evolução da doença.
As alterações citogenéticas clonais podem ser detectadas em 30 – 50% dos pacientes
adultos com SMD primária, no entanto, nenhuma alteração citogenética específica foi ainda
definida para este grupo de pacientes (PANANI & ROUSSOS, 2005). Essas alterações variam
de uma simples mudança estrutural ou numérica a complexas lesões genômicas envolvendo
três ou mais cromossomos distintos. Aberrações citogenéticas simples ocorrem
freqüentemente nos estágios iniciais da doença, entretanto, em estágios de transformação
leucêmica e/ou durante a progressão da doença são comuns mudanças genômicas mais
complexas (FERNANDEZ et al., 2000).
As alterações cromossômicas mais freqüentes em SMD são a deleção do braço longo
dos cromossomos 5 (del5q), 7 (del7q), 11 (del11q) e 20 (del20q), a monossomia do 7 (-7), a
12
deleção do braço curto dos cromossomos 17 (del 17p) e 12 (del 12p), a trissomia do
cromossomo 8 (+8) e inversão do cromossomo 3 (inv 3). Translocações recíprocas são raras e
incluem: t(1;7)(q10;p10), t(1;3)(p36;q21), t(3;3)(q21;q26); t(6;9)(p23;q34), t(5;12)(q33;p13),
e t(5;7)(q33;p11.2) (DELFORGE, 2003; PANANI & ROUSSSOS, 2005, BORGONOVO et
al., 2005).
Anormalidades citogenéticas envolvendo o cromossomo 5 incluem a del(5q), -5 e as
translocações não balanceadas. A deleção do braço longo do cromossomo 5 pode ser terminal,
ou na maioria dos casos intersticial, com o ponto de quebra na região 5q13q33 ou 5q31q33.
Neste caso, não se observa uma freqüência aumentada de evolução para leucemia, a menos
que exista uma combinação com outros defeitos cromossômicos (PANANI & ROUSSOS,
2005).
Monossomia do 7 é a alteração cromossômica de maior freqüência em SMD primária
da infância. Esta alteração está associada com mau prognóstico, sendo a sobrevivência dos
pacientes baixa devido a complicações causadas pelas citopenias, disfunção medular ou
transformação para LMA (KARDOS et al., 2003). Deleção 7q é também freqüentemente
encontrada em SMD, sendo geralmente acompanhada de outras alterações cromossômicas
predizendo mau prognóstico (MHAWECH & SALEEM, 2001).
A incidência do ganho do cromossomo 8 em SMD primária é de aproximadamente
10%, sendo observada em todos os subtipos FAB (PANANI & ROUSSOS, 2005).
Anormalidades do braço longo do cromossomo 11 são comuns em malignidades
mielóides, sendo observadas em 5% dos casos de SMD primária. Geralmente esta alteração
está acompanhada de cariótipos complexos e tem um prognóstico não favorável (PANANI &
ROUSSOS, 2005).
A deleção do braço curto do cromossomo 17, del(17p), tem sido descrita em 4% dos
pacientes com SMD, estando freqüentemente associada com alterações adicionais envolvendo
13
principalmente os cromossomos 5 e 7. Pacientes com esta alteração geralmente apresentam as
seguintes características morfológicas: disgranulopoese com hipolobulação pseudo-Pelger-
Hüet, hipo-granulação e vacúolos observados em pequenos neutrófilos (VALLESPI et al.,
1998). Clinicamente a doença é agressiva com resistência ao tratamento e curta sobrevida. O
gene p53 localizado na região 17p13 é tipicamente perdido nestes casos e inativação do
segundo alelo no cromossomo homólogo ocorre em aproximadamente 70% dos casos (LAI et
al., 1995).
Deleção do braço longo do cromossomo 20 como anomalia única ou em associação
com outras alterações, ocorre com uma incidência de aproximadamente 5%. A deleção 20q é
usualmente intersticial, afetando em geral a região 20q11 e 20q13 (PANANI & ROUSSOS,
2005). De acordo com o IPSS e um estudo recente, pacientes que apresentam esta alteração
de forma isolada apresentam um prognóstico favorável (LIU et al., 2006), entretanto, alguns
estudos demonstram que esta anomalia está associada com um pior prognóstico (CAMPBELL
& GARSON, 1994).
A incidência destas alterações citogenéticas pode refletir em uma instabilidade
genômica clonal, levando a uma pré-disposição para aquisições adicionais de lesões genéticas.
Estudos citogenéticos de acompanhamento da evolução de SMD para LMA puderam
demonstrar que anomalias cromossômicas simples ocorrendo em subtipos de SMD são
acrescidas de outras anomalias durante a progressão da doença (FERNANDEZ et al., 2000),
estando envolvidas alterações em oncogenes e genes supressores de tumor (MORI et al.,
2000; MHAWECH & SALEEM, 2001).
14
1.1.4 Oncogengenes e Genes Supressores de Tumor Envolvidos no Desenvolvimento da
SMD Primária
Múltiplas vias genéticas estão envolvidas na patogênese da SMD. Estudos têm
demonstrado que a ativação de certos oncogenes, assim como a inativação de genes
supressores de tumor exercem um papel importante no desenvolvimento desta doença.
Alterações em oncogenes como N-ras (FERNANDEZ et al., 1998) e, genes supressores de
tumor como NF1e p53 foram descritas em SMD (KIKUKAWA et al., 1999; SIDE et al.,
1998).
A função da proteína RAS é transduzir sinais a nível da membrana plasmática para o
interior da célula, associados a divisão e diferenciação celular. As proteínas ras se ligam a
nucleotídeos de guanina GDP e GTP com alta afinidade e possuem uma atividade GTPase
intrínsica. Essas proteínas funcionam como “switches” moleculares que são ativas quando
GTP é ligado a elas e inativas quando GDP está ligado.
Mutação no proto-oncogene N-ras sinaliza de forma constitutiva sinais para a
proliferação celular. Estudos demonstraram mutação pontual no oncogene N-ras em 10% a
40% das SMD, sendo esta alteração associada com diminuição na sobrevida e alta incidência
de progressão leucêmica (NIIMI et al., 2006). Entretanto, alguns estudos sugerem que a
mutação N-ras ocorre em estágios iniciais da SMD, uma vez que pacientes com cariótipos
normais dos subtipos menos agressivos da doença AR e ARSA podem apresentar N-ras
mutado (FERNANDEZ et al., 1998). Os achados de mutação N-ras em SMD ainda são
controversos e têm sido sugerido que a mutação no oncogene N-ras pode ocorrer em estágios
inicias ou avançados da doença podendo contribuir para a patogênese da SMD por estimular
inicialmente a expansão clonal ou tardiamente a transformação leucêmica (NISHINO &
CHANG, 2005).
15
Outro gene alterado descrito em pacientes com SMD é o fms. O gene fms codifica o
receptor de superficíe celular CSF-1 ou CSF de macrófagos, sendo sua atividade dependente
da ligação à tirosina quinase. CSF-1 quando ativo promove a proliferação e diferenciação de
células hematopoéticas da série monócito-macrófago. Mutações no gene c-fms resulta em uma
proteína com mudanças conformacionais, levando à ativação constitutiva do receptor.
Mapeado na região q33 do cromossomo 5, o gene fms tem sido implicado na patogênese de
doenças hematológicas da linhagem mielóide. Uma mutação pontual no codon 969 tem sido
reportada com aumentada incidência em subtipos mais avançados de SMD (NISHINO &
CHANG, 2005).
O gene MLL, mapeado na região q23 do cromossomo 11, age como fator de
transcrição envolvido na diferenciação celular e foi descrito como associado com a
transformação para LMA em pacientes com SMD (IBRAHIM et al., 2000).
Os produtos dos genes descritos participam como fatores fundamentais nos programas
de proliferação e diferenciação celular. Já as proteínas derivadas dos proto-oncogenes bcl-2,
c-myc e do gene supressor de tumor p53 têm sido descritas como elementos regulatórios
chave da via apoptótica. Bcl-2 representa uma classe de reguladores negativos da apoptose.
Realiza sua função através da dimerização com membros de sua família e com outros
reguladores, como p53 e RAS. Aumento da expressão de bcl-2 tem sido correlacionado com a
progressão da SMD, sendo observada uma super expressão dessa proteína em subtipos de
maior risco (AREB e AREB-t) (BOUDARD, 2002).
Além destes oncogenes diversos genes supressores de tumor parecem ter papéis de
destaque no estabelecimento e evolução de neoplasias, como o p53. O gene p53 se localiza no
braço curto do cromossomo 17 na posição 17p13, em humanos e o seu produto é uma
fosfoproteína nuclear. A proteína p53 atua como um "guarda molecular" monitorando a
integridade do genoma, tendo um papel de pivô na mediação da resposta celular ao dano do
16
DNA, induzindo a parada de crescimento em G1 e a apoptose (CHANG et al., 1993; PERRY
& LEVINE, 1993). Mutação no gene p53 têm sido correlacionada com estágios mais
avançados da doença, sugerindo que seja um evento relacionado ao processo de
transformação leucemica (ADAMSON et al., 1995; KIKUKAWA et al., 1999).
Recentemente alterações epigenéticas, como metilação aberrante da ilha CpG na
região promotora de genes envolvidos no controle do ciclo celular, têm sido descritas
inativando genes supressores de tumor e contribuindo para o desenvolvimento de neoplasias
(GALM et al., 2006).
1.1.5 Alterações Epigenéticas em SMD Primária: Metilação dos Membros da Família
InK4 p15 e p16
O termo epigenética refere-se a modificações covalentes reversíveis e herdadas da
molécula de DNA, sem que haja alteração na seqüência de bases (GALM et al., 2006). O
principal mecanismo epigenético conhecido é o controle da atividade transcricional através da
alteração da estrutura da cromatina, sinalizada pela metilação do DNA (WEINHOLD, 2006).
Essa modificação endógena desempenha um papel essencial no silenciamento transcricional
em muitos processos, tais como a inativação do cromossomo X, a impressão parental, o
controle da expressão gênica tecido-específica e a manutenção da integridade cromossômica,
agindo também na defesa do genoma contra elementos genéticos móveis (LAIRD &
JAENISCH, 1996).
A metilação do DNA é um processo epigenético natural que constitui a modificação
endógena mais comum no genoma de mamíferos, sendo essencial para o desenvolvimento do
organismo (GALM et al, 2006). A metilação ocorre somente nas bases citosina que estão
localizadas próximas das bases guanina de um dinucleotídeo simétrico, CpG (fig. 2A).
17
Citosinas metiladas representam 0,75-1% do total de bases do DNA (WORM &
GULDBERG, 2002).
O padrão de metilação da célula é precisamente reproduzido após a síntese do DNA e
estavelmente transmitido para as células filhas. A adição de um grupamento metila (CH3) na
posição 5 da citosina é um evento catalisado por um grupo de enzimas chamadas DNA
metiltransferases (DNMT). A S-adenosil-metionina (SAM) serve como doadora de radicais
metila nas reações de transmetilação (fig. 2B). A transmetilação é inibida, através de
competição, pela S-adenosil-homocisteína (WORM & GULDBERG, 2002).
Fig. 2: Região de metilação na seqüência do DNA e adição do grupamento metila pelas enzimas DNMT. (A) O genoma humano apresenta grupos metil, os quais ocorrem exclusivamente em resíduos de citosina dentro de um dinucleotídeo simétrico CpG. (B) A adição do grupo metil a citosina é catalizada pela DNA metiltransferase (DNMT), usando a S-adenosil-L-metionina (SAM) como um substrato (WORM & GULDBERG, 2002).
As ilhas CpGs são encontradas em pequenas regiões de 1-2 Kb, representando,
aproximadamente, 2% do genoma, e possuem propriedades distintas quando comparadas com
18
o restante do DNA genômico. Com relação a sua distribuição, as ilhas CpGs são comumente
encontradas dentro ou próximas a promotores de genes de manutenção (RAKYAN et al,
2001). Aproximadamente 70% dos dinucleotídeos CpGs estão metilados, no entanto, muitas
ilhas CpGs apresentam-se livres de metilação, estando associadas com a atividade
transcricional do gene. Genes que são ativamente transcritos tendem a ter baixos níveis de
metilação das suas regiões promotoras, enquanto que genes silenciosos, isto é, que não se
expressam em determinados tecidos ou circunstâncias, têm sua região promotora altamente
metilada (fig. 3) (WORM & GULDBERG, 2002).
Fig. 3: Atividade transcricional do gene de acordo com o padrão de metilação. Citosinas não metiladas são amplamente encontradas em ilhas CpGs, as quais usualmente mapeiam no promotor e nas regiões do primeiro exon de genes “housekeeping”. (A) O estado completamente desmetilado de uma ilha CpG na região promotora esta relacionado com a atividade transcricional, entretanto (B) metilação completa causa o silenciamento transcricional (WORM & GULDBERG, 2002).
A metilação do DNA promove mudanças na estrutura da cromatina, modificando as
interações entre o DNA e os fatores de transcrição. Tais mudanças podem, reversível ou
irreversivelmente, regular as funções do genoma atuando na repressão transcricional e na
organização da cromatina.
Estudos iniciais sobre o efeito inibitório da metilação sugeriram uma interferência
direta dos grupamentos metila na ligação de fatores de transcrição a seus sítios de
reconhecimento na cromatina. Sendo assim, os fatores de transcrição que se associam a
19
seqüências que contêm dinucleotídeos CpG não conseguem se ligar a essas seqüências
quando os resíduos CpG estão metilados. No entanto, modelos alternativos referem-se a
mudanças na arquitetura do nucleossomo como um elemento de repressão. Este modelo foi
reforçado pela identificação de uma família de proteínas que preferencialmente ligam-se a
CpGs metilados (MBPs - proteínas ligadoras de CpG metilados) (WADE, 2001). Algumas
destas proteínas têm sido diretamente implicadas no silenciamento de genes dependentes de
metilação, por recr9utar histonas desacetilases (HDACs) para o local da metilação. HDACs
catalizam a remoção dos grupos acetil dos nucleossomos, convertendo a estrutura da
cromatina aberta para transcrição para uma estrutura fechada, a qual torna-se inacessível à
maquinaria transcricional basal (fig. 4) (WORM & GULDBERG, 2002; GALM et al.,2006).
Fig. 4: Modelo para o silenciamento transcricional dependente de metilação. Citosinas metiladas são reconhecidas por proteínas ligadoras de metil CpG (MBPs), as quais recrutam histonas desacetilases (HDACs) para o local da metilação, convertendo a cromatina em uma estrutura fechada que se torna inacessível à maquinária de transcrição (WORM & GULDBERG, 2002).
20
A metilação do DNA foi observada pela primeira vez em câncer humano em 1983
(FREINBERG & VOLGELSTEIN, 1983). No câncer, a hipermetilação de regiões promotoras
de genes supressores de tumor é uma importante alteração epigenética que está despertando
um grande interesse para o de desenvolvimento de novas terapias. Estudos em malignidades
hematológicas têm mostrado uma forte relação entre metilação e fenótipo neoplásico, estando
envolvidos principalmente os membros da família INK 4, p15 e p16, que desempenham um
importante papel no controle do ciclo celular (LEHMANN et al., 2004).
Os genes p15INK4B
e p16INK4A estão localizados na região p21 do cromossomo 9. As
proteínas codificadas por esses genes induzem a parada do ciclo celular na fase G1-S através
da inibição da atividade do complexo ciclina D e CDK4 e CDK6. A transição da fase G1 para
S, representa um ponto extremamente importante no relógio do ciclo celular. A metilação em
regiões promotoras dos genes p15INK4B
e p16INK4A induz a repressão transcricional desses dois
genes, contribuindo para a passagem direta da célula para a fase S (COTRAN et al., 2000).
Dessa forma, a inibição da expressão deses genes está associada com alta taxa de proliferação
celular (LEES, 1995).
Em neoplasias hematológicas, através de estudos cromossômicos, têm sido verificado
que os genes p15INK4B
e p16INK4A estão freqüentemente deletados em leucemia linfóide aguda
em crianças e adultos (STREFFORD et al., 2007). No entanto, em SMD estes dois genes são
raramente mutados ou deletados (NAKAMAKI et al., 1997). Estudos mostraram que p15INK4B
atua como um importante regulador da proliferação e diferenciação das linhagens mielóides,
monocítica e megacariocítica, inibindo esses processos (TEOFILI et al., 2001).
Posteriormente, foi demonstrado através do emprego de técnicas de biologia molecular (MSP-
PCR) que o silenciamento transcricional dos genes p15INK4B
e p16INK4A via metilação
aberrante é um evento crítico na leucemogênese, e a metilação no gene p15INK4B têm sido
21
freqüentemente associada a leucemias agudas, tanto linfóide quanto mielóide, em crianças e
adultos (HERMAN et al., 1996, AU et al., 2003; GARCIA-MANERO et al., 2002).
No sentido de verificar o papel desses dois genes no processo de desenvolvimento e
evolução da SMD para LMA foram realizados alguns estudos correlacionando alterações nos
genes com os subtipos da doença segundo a classificação FAB. Alguns grupos demonstraram
que a metilação aberrante de p15INK4B ocorre com maior incidência nos casos de expansão
blástica como AREB, AREB-t e LMA resultante de transformação de SMD e mais raramente
nos subtipos iniciais da doença (UCHIDA et al., 1997; QUESNEL et al., 1998). No entanto,
outros estudos mostraram que alterações nos padrões de metilação em p15INK4B podem ocorrer
em todos os subtipos da doença (TIEN et al., 2001; AGGERHOLM et al., 2006; HOFMANN
et al., 2006). Dessa forma, não é claro se esta alteração epigenética ocorre em fases iniciais do
diagnóstico ou se é um evento associado à transformação leucêmica e qual o seu impacto
prognóstico.
A maioria desses trabalhos foi realizada em pacientes adultos com SMD primária,
existindo poucos estudos de investigação da incidência e do papel da metilação dos genes
p15INK4B
e p16INK4A no prognóstico em SMD primária na infância.
1.1.6 SMD Primária na Infância
A SMD primária na infância representa cerca de 4% de todas as malignidades
hematológicas da faixa pediátrica (HASLE et al., 2003). Em alguns casos, ela pode estar
presente em crianças com doenças genéticas como a Síndrome de Down ou a Anemia de
Fanconi. Nestes casos existe uma predisposição genética para o desenvolvimento da SMD.
Em outros casos ela apenas se manifesta idiopaticamente. Crianças que apresentam essa
doença hematológica estão associadas a um pior prognóstico quando comparadas com os
adultos. No Brasil, de acordo com o Grupo Cooperativo Brasileiro em SMD Pediátrica (GCB-
22
MDS-PED), a taxa de sobrevida total para pacientes com SMD na infância que não foram
tratados com transplante de medula óssea é de 20-25% (VALERA et al., 2004).
Embora a SMD na infância seja considerada uma doença com características
displásicas e hematopoese ineficaz, como a SMD do adulto, as características clínicas, a
presença de anormalidades associadas e a caracterização das alterações cromossômicas têm
indicado que a SMD durante a infância represente uma diferente questão biológica
(POLYCHRONOPOULOU et al., 2004). As principais diferenças entre a SMD na infância e
no adulto são: incidência extremamente rara de ARSA na infância ao passo que em adultos
consiste em cerca de 25% dos casos; a monossomia do 7 é a alteração cromossômica mais
freqüente na infância e nos adultos é a deleção do braço longo do cromossomo 5; as
possibilidades terapêuticas em adultos com SMD são limitadas devido à idade avançada,
sendo indicada geralmente uma terapia paliativa, enquanto que nas crianças com SMD a
principal terapia é a curativa, através do transplante de medula óssea (HASLE &
NIEMEYER, 2002). Na tabela 4 podemos observar as principais diferenças entre a SMD em
crianças e em adultos.
Tabela 4: Diferenças entre SMD em Crianças e em Adultos
Parâmetros Crianças Adultos • Incidência/milhão 3.6 >35 • ARSA <2% 25% • Alterações Citogenéticas 60% 40% • -7/7q- 30% 10% • -5/5q- 1-2% 20% • Anormalidades clínicas associadas 30% <5% • Objetivo principal do tratamento Curativo Paliativo
(HASLE & NIEMEYER, 2002)
A SMD na infância pode apresentar características específicas que dificultam a sua
inclusão nos sistemas de classificação tradicionais, tendo sido propostos subgrupos
específicos da SMD para a infância. Por exemplo, pacientes de menos de 4 anos que
apresentavam monossomia do cromossomo 7 foram inicialmente classificados em uma
23
síndrome distinta, a síndrome de monossomia do 7 (GYGER et al., 1982; HUTTER et al.,
1984; PASSMORE et al., 1995). Esta estava tipicamente associada a uma doença
mieloproliferativa crônica rara na infância, com mau prognóstico (EVANS et al., 1988). No
entanto, outros estudos mostraram que pacientes com monossomia do 7 podiam por vezes ser
classificados nos outros subgrupos FAB, descartando conseqüentemente a síndrome de
monossomia do 7 (BRANDWEIN et al., 1990; HASLE et al., 1999). Para diferenciar os
pacientes que apresentavam SMD com características mieloproliferativas, foi adotado um
novo subgrupo, a leucemia mielomonocítica juvenil (LMMJ). A LMMJ diferencia-se da
LMMC do tipo adulto, tanto biologicamente (a contagem de leucócitos é mais alta, sendo
superior a 13000/µL e a faixa etária atingida é de menos de 4 anos de idade, ao contrário do
que acontece geralmente na LMMC) como citogeneticamente (as translocações encontradas
em LMMC, como t(5;12), ainda não foram descritas em LMMJ) (NIEMEYER et al., 1997;
SIDE et al, 1998; LUNA-FINEMAN et al, 1999). A LMMJ, assim como a LMMC do tipo
adulto, é diferenciada citogeneticamente das doenças mieloproliferativas pela ausência do
cromossomo Philadelphia (Ph). O prognóstico dos pacientes com LMMJ é significativamente
pior do que de LMMC (EMANUEL, 1999; ARICO et al., 1997). A SMD infantil tem sido
portanto classificada em SMD do tipo adulto, à qual se aplica a classificação FAB,
acrescentando a LMMJ (SASAKI et al., 2001).
Entretanto, a utilização dos sistemas de classificação tradicionais FAB (BENNETT et
al., 1982) e OMS (HARRIS et al., 2000) baseados em SMD do adulto, têm sido tema de
muita discussão em SMD na infância. Hasle et al. em 2003 sugeriram novos critérios para
classificação da SMD da infância, sendo os critérios mínimos: citopenias sem uma causa
esclarecida (anemia, neutropenia e trombocitopenia); pelo menos duas linhagens apresentando
displasias, alteração citogenética clonal adquirida e número de blastos igual ou maior que 5%
na medula óssea. Nesta classificação da SMD na infância são reconhecidos três grupos: o
24
grupo das doenças mieloproliferativas e mielodisplásicas (LMMJ), o qual apresenta
características mieloproliferativa e mielodisplásica; o grupo da síndrome de Down associada
com a SMD, uma vez que esses pacientes apresentam características clínicas e prognósticas
distintas; e o grupo da SMD primária propriamente dita, o qual foi subdividido em: citopenia
refratária (CR), anemia refratária com excesso de blastos (AREB) e anemia refratária com
excesso de blastos em transformação (AREB-t) (fig. 5).
Fig. 5: Classificação da Síndrome Mielodisplásica na Infância. LMMJ- leucemia mielomonocítica juvenil; CR - Citopenia Refratária; AREB - Anemia Refratária com excesso de blastos; AREB-t - Anemia Refratária com excesso de blastos em transformação; SMD- síndrome mielodisplásica; LMA- leucemia mielóide aguda SP- sangue periférico; MO- medula óssea (modificado de HASLE et al., 2003).
A LMMJ ocorre principalmente em meninos com menos de 2 anos de idade, que
apresentam hepatoesplenomegalia, febre, infecção, sangramento, alta contagem leucocitária
com monocitose absoluta, anemia, trombocitopenia e hemoglobina fetal aumentada. Pacientes
que apresentam neurofibromatose do tipo 1 (NF1) possuem risco aumentado de
desenvolverem LMMJ. Citogeneticamente a LMMJ é caracterizada em 25-30% dos casos
Síndrome Mielodisplásica
Células Blásticas(%) S.P. M.O. CR 2% ≥5%
AREB <2 – 19% 5–19%
AREB-t >20 -29% 20–29%
Síndrome de Down
LMMJ
Doenças Mieloproliferativas/
Mielodisplásicas
25
pela monossomia do cromossomo 7, 10% apresentam outras alterações cromossômicas e em
cerca de 60% dos casos os cariótipos são normais. Em nível molecular é freqüentemente
caracterizada por mutações em NF1 e N-ras, apresentando a via de sinalização para
proliferação celular ativada de forma permanente (EMANUEL, 1999). As crianças com
LMMJ apresentam mau prognóstico e resistência à quimioterapia convencional (WOODS et
al., 2002), sendo o transplante de células tronco alogenêico o único tratamento curativo. Com
este tratamento, aproximadamente 30% dos pacientes alcançam a cura, entretanto, a taxa de
recaída é alta (em torno de 40-50% dos casos) (YUSUF et al., 2004).
A Síndrome de Down (SD) é a condição de predisposição genética mais freqüente
observada em crianças com o diagnóstico de SMD, estando presente em 25% dos casos
diagnosticados com AR, AREB ou AREB-t. A LMMJ ocorre com uma menor freqüência. A
alteração cromossômica clonal mais comum em crianças com SMD associada com a SD é a
trissomia do cromossomo 8 e o ganho de um cromossomo 21, dessa forma a criança apresenta
uma tetrassomia (sendo um cromossomo 21 constitucional associado com a SD e o outro
adquirido associado com a SMD). Estudos moleculares relataram a presença de mutações no
gene GATA-1 associado com o desenvolvimento de LMA em pacientes portadores de SD
(MUNDSCHAU et al, 2003). No entanto, até o momento não existem relatos de alterações
moleculares relacionadas com SMD em crianças com SD. Em relação ao prognóstico,
crianças com SD e SMD apresentam prognóstico bom ou intermediário, evoluindo
freqüentemente para LMA-M7. Essas crianças são tratadas com protocolos de LMA, tendo
uma boa evolução clínica com baixo risco de recaída. O transplante de células tronco
alogenêico está associado com excesso de toxicidade sem ganho terapêutico (BEVERLY et
al, 1998).
26
Como podemos notar, essa classificação exclui o subgrupo anemia refratária com
sideroblastos em anel (ARSA) devido a sua freqüência ser muito baixa na infância,
aproximadamente 2% dos casos (CHAN et al., 1997; HASLE et al., 2003).
Em relação à distribuição de casos segundo os subtipos, AR tem sido apontada por
alguns estudos como relativamente comum, acometendo em torno de 40-60% dos pacientes
(POLYCHRONOPOULOU et al., 2004), enquanto os subtipos AREB e AREB-t aparecem
em cerca de 15-20% da SMD na infância (WEBB et al., 2001; PASSMORE et al., 2003). No
entanto, outros estudos mostraram que a maior freqüência de casos de SMD na infância
ocorre nos subtipos mais avançados da doença (AREB e AREB-t) (VIDAL et al., 2006).
Grandes diferenças vêm sendo demonstradas entre crianças e adultos com SMD. As
características clínicas são diferentes e os fatores que predizem a sobrevida ou a progressão
em adultos são de pouco valor para crianças. Hasle et al. em 2004, avaliando o sistema de
escala prognóstica, o IPSS, em um grupo de 308 crianças com SMD primária e LMMJ,
verificaram que esta escala apresenta valor limitado, tanto para SMD pediátrica quanto para
LMMJ. Crianças com SMD freqüentemente apresentam citopenias em duas ou três linhagens,
sendo poucas crianças classificadas como de baixo risco, segundo esse sistema.
Estudos sobre as características morfológicas do sangue periférico e medula óssea
demonstraram presença de displasias nas linhagens eritróide, mielóide e megacariocítica. Tem
sido descrita a presença de medula óssea hiper e normocelular em SMD na infância
(POLYCHRONOPOULOU et al., 2004). Estudos de biópsia de medula óssea revelaram a
presença de hipocelularidade nos pacientes do subtipo AR em cerca de 60% dos casos, sendo
que este achado é atribuído ao fato de que a avaliação da celularidade da medula óssea em
crianças não é adequadamente descrita (POLYCHRONOPOULOU et al., 2004). Ainda não
existem estudos relatando se a hipocelularidade da medula óssea está relacionada com um
prognóstico diferencial em comparação com a medula normocelular ou hipercelular.
27
Em relação aos estudos citogenéticos, estes mostraram um papel fundamental no
diagnóstico de todos os casos de suspeita de SMD pediátrica, sendo utilizados para a
confirmação da natureza clonal desta doença (SASAKI et al., 2001; PASSMORE et al.,
2003). Alterações citogenéticas podem ser detectadas em 50-70 % dos pacientes com SMD
primária da infância (WEBB et al., 2001; KARDOS et al , 2003; YSUSUF et al., 2004). A
monossomia do 7 é a anormalidade cromossômica mais freqüente nestes pacientes, sendo
encontrada em aproximadamente 19 a 23% dos casos. Esta alteração está associada com mau
prognóstico e uma rápida progressão para LMA (SASAKI et al., 2001; PASSMORE et al.,
2003; AKTAS & TUNCBILEK, 2006). O transplante de células tronco hematopoéticas
alogenêico, na fase inicial da doença, tem sido apontado como a terapia mais indicada para
essas crianças (YSUSUF et al., 2004). Outras alterações descritas em SMD primária na
infância foram: del(5q), +8, del(17p), del (11q) e hiperdiploidia (FERNANDEZ et al., 2003;
PITMAN et al., 2006; KARDOS et al., 2003).
Os mecanismos moleculares envolvidos em SMD na infância ainda não estão bem
definidos. Um recente estudo com os genes p53 e fms demonstrou a inexistência de mutação
nas seqüências analisadas, sugerindo que os mecanismos moleculares de evolução da SMD
em crianças são diferentes daqueles observados em adultos (JEKIC et al, 2006). A presença
de mutações no onocogene N-ras e K-ras ocorre em uma freqüência muito baixa em SMD da
infância. Em um estudo de 35 pacientes, apenas três mostraram a presença de mutação em
N-ras, estando esse grupo associado com cariótipos normais (JEKIC et al., 2004).
A metilação aberrante do DNA é freqüentemente observada em adultos com SMD e tem
sido reconhecida como uma importante alteração epigenética em sua patogênese . Hasegawa
et al. em 2005 realizaram o primeiro estudo mostrando a presença de metilação envolvendo os
genes p15INK4B e p16
INK4A em crianças com SMD. Neste estudo foi verificado que a freqüência
de metilação em p15INK4B foi alta estando presente em 78% dos casos, entretanto, foi um
28
achado raro em LMMJ. Não foi detectada neste estudo presença de metilação em p16INK4A
(HASEGAWA et al., 2005). O estudo de metilação do DNA é importante uma vez que um
dos tratamentos mais recentes para SMD utiliza inibidores da metilação do DNA como
decitabina e azacitidina que têm promovido resposta citogenética para os pacientes de alto
risco. Entretanto, não é conhecida nenhuma correlação entre uma alteração epigenética
envolvendo um gene específico e a resposta a um agente inibidor de metilação (ATALLAH et
al., 2007).
Devido à raridade da SMD na infância, estudos sobre a sua patogênese não têm sido
adequados e a via que leva a uma hematopoese anormal e a associação com alterações
genéticas e epigenéticas precisam ser estudadas, existindo poucos dados na literatura que
correlacionem estas alterações com o diagnóstico, prognóstico e evolução da doença. Dessa
forma, torna-se fundamental a caracterização de marcadores citogenéticos e moleculares que
auxiliem o diagnóstico e a definição de fatores prognósticos em SMD primária na infância,
principalmente em relação a definição de grupos de risco de acordo com a presença de uma
alteração cromossômica específica ou uma alteração molecular, sendo importante esse
esclarecimento para auxiliar na escolha de protocolos de tratamento.
29
2. OBJETIVOS
A síndrome mielodisplásica primária é um grupo de doenças altamente heterogêneo do
ponto de vista clínico, morfológico e biológico, tanto em pacientes adultos quanto em
crianças. No sentido de definir os fatores prognósticos em SMD primária na infância
relacionados com o desenvolvimento desta doença e com a evolução para leucemia mielóide
aguda, o presente trabalho apresentou como objetivos:
1) Realizar uma análise citogenética retrospectiva e prospectiva em pacientes portadores
de SMD primária na infância e acompanhar citogeneticamente e clinicamente estes pacientes
para observar as principais anomalias numéricas e estruturais envolvidas no processo de
transformação leucêmica;
2) Caracterizar o padrão cromossômico de pacientes com SMD primária na infância;
3) Aplicar a técnica de FISH para confirmar as alterações cromossômicas nos seguintes
casos: quando os cromossomos apresentassem baixa resolução pela técnica de bandeamento G,
quando o número de metáfases analisadas para caracterizar um clone fosse pequeno e para o
monitoramento do tratamento quando a preparação citogenética fosse sem mitose;
4) Analisar o padrão de metilação na região promotora do gene p15INK4B em células de
medula óssea de pacientes com SMD primária na infância e comparar com o padrão obtido em
doadores para o TMO;
5) Analisar o padrão de metilação na região promotora do gene p16INK4A em células de
medula óssea de pacientes com SMD primária na infância e comparar com o padrão obtido em
doadores para o TMO;
6) Correlacionar o padrão de metilação dos genes p15INK4B
e p16INK4A com os subtipos da
classificação de SMD primária na infância;
30
7) Correlacionar o padrão de metilação na região promotora dos genes p15INK4B
e p16INK4A
com o cariótipo dos pacientes, na tentativa de sugerir vias de evolução da SMD para LMA;
31
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Pacientes
Foram estudadas retrospectivamente e prospectivamente no período de 1991 a 2006, 64
amostras de medula óssea de pacientes com síndrome mielodisplásica primária na infância
provenientes das seguintes Instituições: Centro de Transplante de Medula Óssea (CEMO-
INCA), Serviço de Hematologia (INCA), Instituto Estadual de Hematologia Arthur Siqueira
Cavalcanti (HEMORIO), Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE-UERJ) e Instituto de
Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira (IPPMG -UFRJ). A idade dos pacientes variou de
5 meses a 18 anos, sendo 40 do sexo masculino e 24 do sexo feminino. Os estudos
hematológicos e clínicos foram realizados pelos próprios hematologistas nas instituições de
origem, como parte da investigação de rotina e os diagnósticos seguiram os critérios
propostos pela classificação de SMD primária da infância segundo HASLE et al (2003).
Foram excluídos deste estudo os pacientes acima de 18 anos de idade e portadores de
SMD secundária. Para as análises moleculares foram utilizados como grupo controle células
de medula óssea de doadores provenientes do CEMO-INCA.
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Nacional de
Câncer (Anexo 1). Todos os procedimentos realizados seguiram as normas de bioética
segundo a resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde.
3.2 Análise Citogenética
3.2.1 Cultura de Células de Medula Óssea
Para este procedimento, utilizamos a técnica de TESTA et al(1985) com algumas
modificações. As células da medula óssea foram lavadas com meio RPMI 1640 (Sigma), em
seguida, foi feita uma diluição de 1:20 da suspensão celular em líquido de Thomas (1mL de
ácido acético glacial, uma gota de violeta genciana, 100mL de água destilada) e as células
32
foram contadas na câmara de Newbauer em microscópio ótico Olympus (contraste de fase).
Foram incubadas de 5 x 106 a 10 x 106 células/mL em 80% de RPMI e 20% de soro fetal
bovino GIBCO, a 37oC, numa atmosfera de 5% de CO2, por 24 horas. Duas horas antes do
término da cultura, foram adicionados 0.05µg/mL de colchicina e a cultura foi incubada
novamente por mais 1 hora nas mesmas condições.
3.2.2 Término das Culturas e Preparação das Lâminas
Neste procedimento o método utilizado foi o de HUNGERFORD (1965) com
modificações. Ao final da incubação, o material foi centrifugado a 1500 rpm (centrifuga
EPPENDORF- modelo 5804) por 6 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado
ressuspenso em 5mL de uma solução hipotônica (KCl 0,075M). O material foi incubado a
37oC por 15 minutos, sendo em seguida centrifugado a 1500 rpm (centrifuga EPPENDORF-
modelo 5804) por 6 minutos. O precipitado foi fixado com Solução Carnoy 3:1 (metanol :
ácido acético), sendo na primeira fixação adicionado lentamente um volume de 5mL. Após 20
minutos à temperatura ambiente, o material foi centrifugado a 1500 rpm (centrifuga
EPPENDORF- modelo 5804) durante 6 minutos e o sobrenadante desprezado. O
procedimento foi repetido mais 2 vezes e o precipitado da última fixação foi ressuspenso em
um pequeno volume de fixador, que variou de acordo com a quantidade de material. As
lâminas foram preparadas pingando-se uma gota de suspensão celular em uma lâmina limpa e
umedecida e o material foi fixado sobre a lâmina na chama. A primeira lâmina obtida foi
corada com corante Giemsa 2% em tampão fosfato (0,102M de NaH2PO4; 0,098M de
Na2HPO4, pH 6,8) e observada no microscópio ótico para verificar o índice mitótico e a
qualidade das metáfases. As demais lâminas foram envelhecidas de 1 dia a 1 semana à
temperatura ambiente para o bandeamento G.
33
3.2.3 Bandeamento G
Para obtenção de padrões de bandeamento G foi utilizada a técnica de SEABRIGHT
(1971), com o seguinte procedimento: as lâminas foram incubadas em uma solução de tripsina
0.1% em solução Dulbeco (0,137M NaCl; 0,0027M KCl; 0,0015M KH2PO4; 0,011M
NaH2PO4; pH 7.8), em tempos que variaram de 1 segundo a 1 minuto. Em seguida, as lâminas
foram lavadas com solução de soro fisiológico (NaCl 9%) e coradas em uma solução de
Giemsa (Merck) a 2% em tampão fosfato durante 15 minutos.
3.2.4 Análise Cromossômica
Os cromossomos foram identificados e classificados de acordo com o Sistema
Internacional de Nomenclatura de Citogenética Humana de 1995 (ISCN, 1995). A análise
cromossômica foi realizada em microscopia ótica utilizando no mínimo 20 metáfases por
paciente. Um caso foi considerado anormal quando três ou mais células apresentaram a
mesma anomalia cromossômica estrutural e/ou numérica. Foram adquiridas através do
Sistema de Cariotipagem Cytovision Applied Image de 5 a 10 metáfases para a montagem dos
cariótipos de cada paciente.
3.3 Citogenética Molecular: Análise por Hibridização “in situ” por Fluorescência (FISH)
Para a técnica de FISH foi utilizado o material da preparação citogenética (metáfases e
núcleos interfásicos em fixador). Foram utilizadas as sondas para a investigação das regiões
q33-q34 do cromossomo 5 (LSI CSF1R SO/ LSID5S23:D5S721 SG) e da região q31 do
cromossomo 7 (LSI D7S486 spectrum orange/CEP 7 spectrum green), do gene MLL mapeado
no cromossomo 11 na região q23 (LSI MLL dual color break apart rearrangement probe) e do
gene p53 mapeado no cromossomo 17 na região p13 ( LSI p53, spectrum orange). Todas as
sondas utilizadas foram da Vysis, Abbott Laboratories, USA.
34
As lâminas foram preparadas em lençol d’água e envelhecidas durante 24 horas. Após
este período, as lâminas foram colocadas em uma solução 2x SSC (a partir de diluição de uma
solução 20x SSC: 3,0M NaCl e 0,3M Citrato de Sódio, pH 7,0) a 37º C por 30 minutos;
desidratadas em série com etanol 70%, 80% e 95% à temperatura ambiente por 2 minutos. Em
seguida, o material foi desnaturado em uma solução de 70% formamida / 2x SSC, a 73o C por
5 minutos. Foi dimensionado 10µl de sonda previamente desnaturada a uma temperatura de
73ºC por 5 minutos, em uma área de 25mm x 25mm e aplicada lamínula de vidro. As lâminas
foram seladas com cola de isopor e incubadas por 16 horas em câmara úmida a 37ºC. Após o
período de hibridização, as lâminas foram transferidas para solução de 0,4x SSC e 0,3%
IGEPAL (SIGMA) a 73oC durante 2 minutos. Os cromossomos e os núcleos interfásicos
foram corados em uma solução de DAPI/Antiphade (125ng/mL) e a área foi coberta com uma
lamínula de vidro e selada com esmalte incolor. A análise foi realizada em microscópio de
fluorescência (OLYMPUS BX51) com filtros apropriados e o resultado obtido foi adquirido
pelo Sistema de FISH da Cytovision Applied Image.
3.4 Análise Molecular
3.4.1 Cultura de Células da linhagem DLD-1 e Raji
Para a análise da presença de metilação na região promotora dos genes p15INK4B
e
p16INK4A em células da medula óssea dos pacientes com SMD primária na infância foram
utilizados como controles negativos, DNA de células de medula óssea de doadores para o
TMO e como controles positivos DNA de células das linhagens Raji (derivada de Linfoma de
Burkitt), que apresenta metilação para o gene p15INK4B
(HERMAN et al., 1996) e DLD-1
(derivada de adenocarcinoma de coloretal), que apresenta metilação para o gene p16INK4A
(comunicação pessoal com o grupo de pesquisa do Dr. André Vettore e Dra. Andréa Seixas do
Instituto Ludwig). As células em cultura das linhagens DLD-1 e Raji foram cedidas
35
gentilmente pelo Instituto Ludwig - São Paulo e pelo Laboratório de Imunologia do CEMO-
INCA, respectivamente.
As células da linhagem DLD-1 foram cultivadas em 90% de meio de cultura RPMI
1640 (Sigma) e 10% de soro fetal bovino (HYCLONE) em garrafas de cultura (50mL) a
37oC, numa atmosfera de 5% de CO2. As culturas foram observadas diariamente em
microscópio invertido (Leitz). Após dois dias de cultura, quando as células encontravam-se
em uma monocamada homogênea, foi adicionanda uma solução de 0,25% de tripsina e
0,53mM de EDTA à temperatura ambiente para o repique das células (em uma razão de 1:3
células) e estas foram novamente incubadas nas mesmas condições, para amplificação celular
e posterior extração de DNA.
As células da linhagem Raji foram cultivadas nas mesmas condições da linhagem
DLD-1, no entanto, devido este tipo celular crescer em suspensão, não foi adicionada solução
de tripsina antes de realizar o repique. Para o repique, as células foram centrifugadas a 1500
rpm (centrifuga EPPENDORF- modelo 5804) por 5 minutos, em seguida foi feita uma
diluição de 1:20 da suspensão celular em líquido de Thomas e as células foram contadas na
câmara de Newbauer em microscópio óptico (OLYMPUS BX50). Foram incubadas 4x105/mL
células em garrafas de cultura (50mL) em 90% de meio RPMI 1640 (Sigma) e 10% de soro
fetal bovino (GIBCO) a 37oC, numa atmosfera de 5% de CO2.
Para a obtenção de DNA das amostras dos controles positivos, negativos e dos
pacientes foi realizado o procedimento descrito a seguir.
3.4.2 Extração de DNA
O DNA das células de medula óssea de 45 crianças (17 amostras prospectivas e 28
amostras retrospectivas) com SMD primária, 10 doadores de medula óssea (controles
negativos), e das linhagens Raji (controle positivo para metilação no gene p15INK4B) e DLD-1
36
(controle positivo para metilação no gene p16INK4A) foi extraído pelo método de Dnazol
(INVITROGEN), segundo o protocolo do fabricante. As células mononucleares foram
separadas por centrifugação a 1500 rpm por 20 minutos (centrifuga EPPENDORF- modelo
5804) utilizando gradiente de densidade Ficoll-Paque (AMERSHAM BIOSCIENCES) e
lavadas com solução de soro fisiológico (9% NaCl). Após a lavagem foi adicionado 1mL do
reagente Dnazol (INVITROGEN). O material foi homogeneizado lentamente, em seguida o
DNA foi precipitado. A precipitação do DNA foi feita em etanol 100% e o material foi lavado
em etanol 75%. A amostra de DNA foi seca à temperatura ambiente, ressuspensa em solução
de Tris-EDTA (10mM de Tris e 1mM de EDTA, pH 7,4) e armazenada a uma temperatura de
aproximadamente 15ºC. Um gel de agarose de 0,8% corado com brometo de etídeo
(0,5µg/mL) foi feito para a verificação da integridade do DNA e presença de RNA. A
concentração de DNA nas amostras foi verificada no espectrofotômetro através de leitura em
comprimento de onda 260nm (Biophotometer 8,5mm- EPPENDORF).
3.4.3 Análise de Metilação dos genes p15INK4B
e p16INK4A pelo Método MSP
3.4.3.1 Tratamento do DNA com Bisulfito
Cada amostra de DNA (pacientes, controles negativos e controles positivos) foi tratada
com bisulfito de acordo com o método descrito por Herman et al. (1996) com algumas
modificações. O tratamento com bisulfito induz a desaminação das bases citosinas não
metiladas, convertendo-as em uracil, as quais após a reação de PCR são amplificadas como
timina, no entanto, citosinas metiladas permanecem inalteradas (fig. 6).
37
Fig. 6: Efeito do tratamento com bisulfito em uma amostra de DNA com seqüências ricas em dinucleotídeo CpG. Todas as citosinas fora do dinucleotídeo CpG são desaminadas e convertidas em uracil. As citosinas não metiladas que se encontram dentro do dinucleotídeo CpG sofrem a ação do bisulfito e são convertidas em uracil, no entanto, as citosinas metiladas permanecem inalteradas (*) (GALM, 2006).
Amostras de DNA (2µg) em 50µL de água destilada foram previamente desnaturadas em
uma solução de NaOH 0.2mol/L por 10 minutos a 37°C. Após este período foram adicionados
30µL de hidroquinona (10mM, SIGMA) e 520µL de sulfito de sódio hidrogenado, pH 5,0
(3M, SIGMA). Foi adicionado óleo mineral sobre as amostras, sendo estas então mantidas em
banho-maria a 50°C durante 16 horas. Após este período, o óleo mineral foi retirado das
amostras e o DNA foi purificado utilizando o kit Wizard DNA Clean-Up System
(PROMEGA). Foi adicionado 1mL de resina no material, homogenizado lentamente e filtrado
em uma coluna. As colunas foram lavadas utilizando 2mL de isopropanol 80%. Para eluir o
DNA da coluna foi utilizado 50µL de água MILIQ a 70°C. A modificação do DNA foi
finalizada com o tratamento em uma solução de NaOH 0.3mol/L por 5 minutos a temperatura
ambiente. Em seguida, para a precipitação do DNA foi adicionada 5.5µL de acetato de sódio
(3M, pH 5,2) e 200µL etanol 100%. As amostras foram mantidas a uma temperatura de 3°C
durante 16 horas. Após este periodo, as amostras foram centrifugadas a 7000 rpm (centrifuga
EPPENDORF- modelo 5804) por 30 minutos e o sobrenadante desprezado. O DNA foi
lavado em etanol 70%, seco à temperatura ambiente e ressuspenso em 20µL de água
destilada.
38
3.4.3.2 Reação em Cadeia da Polimerase específica para a Metilação (técnica MSP)
Para verificar a presença de metilação na região promotora dos genes p15INK4B
e p16INK4A
utilizamos a técnica MSP (reação da polimerase específica para a metilação). Nesta análise,
usamos os oligonucleotídeos descritos na tabela 5 segundo Herman et al. (1996).
Tabela 5: Oligonucleotídeos* utilizados na técnica MSP para análise do gene p15
INK4B e
p16INK4A
Genes Seqüencia dos Oligonucleotídeos (5’ – 3’)
p15-Mf GCGTTCGTATTTTGCGGTT
p15-Mr CGTACAATAACCGAACGACCGA
p15-Uf TGTGATGTGTTTGTATTTTGTGGTT
p15-Ur CCATACAATAACCAAACAACCAA
p16-Mf TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC
p16-Mr GACCCCGAACCGCGACCGTAA
p16-Uf TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT
p16-Ur CAACCCCAAACCACAACCATAA
M- oligonucleotídeo específico para o alelo metilado; U- oligonucleotídeo específico para alelo não metilado; f- “forward” = senso; r- “reverse” = anti-senso (*HERMAN et al.,1996).
As condições finais, nas quais as reações de PCR foram conduzidas, consistiram de 3µL
do DNA modificado por bisulfito, MgCl2 6.7mM (INVITROGEN), 5µL de tampão de reação
(200mM tris-HCl pH 8.4, 500mM KCl) (INVITROGEN), dATP 1.25mM, dTTP 1.25mM,
dCTP 1.25mM e dGTP 1.25mM (INVITROGEN), 1nmol de cada oligonucleotídeo e 1U de
Taq polimerase (INVITROGEN) para um volume final de 50µL.
A reação foi realizada utilizando-se o termociclador PTC-150 (MJ Research) e as
condições de ciclagem para ambos os genes incluíram: desnaturação inicial a 95ºC por 10
minutos, “hot-started” a 72ºC por 5 minutos, 35 ciclos de desnaturação a 95ºC por 1 minuto,
pareamento a 60ºC por 30 segundos, extensão a 72°C por 30 segundos; e extensão final a
72°C por 10 minutos. Após a amplificação, os produtos foram visualizados em gel de
poliacrilamida.
39
3.4.3.3 Avaliação dos Produtos gerados pela PCR nos Genes p15INK4B
e p16INK4A
Após a amplificação, os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de
poliacrilamida 5%.
O preparo do gel foi realizado com 1,5mL de solução de acrilamida (AMERSHAM
BIOSCIENCES): bis-acrilamida (AMERSHAM BIOSCIENCES) 20% (19:1), 0,3 mL de
tampão TBE 10X [tris 0,89M (AMERSHAM BIOSCIENCES); ácido bórico 0,89M
(ISOFAR); EDTA 0,02M (AMERSHAM BIOSCIENCES)], 42µL de persulfato de amônio
10% (AMERSHAM BIOSCIENCES), 6µL de TEMED (INVITROGEN) e água destilada
para volume final de 6mL. Em um volume de 5µL do produto de PCR foram acrescentados
2µL do corante de corrida [azul de bromofenol 0,25% (AMERSHAM BIOSCIENCES);
xileno cianol 0,25% (AMERSHAM BIOSCIENCES); glicerol 30% (ISOFAR)]. A
eletroforese foi realizada em cuba vertical (Cuba Mini-Protean – BIO-RAD) a 110V por 50
minutos e o TBE 0,5X foi utilizado como tampão de corrida. Em seguida, o gel foi corado
com nitrato de prata (MERCK) (Santos, 2002). Para fins comparativos, foi utilizado o padrão
de peso molecular “Low DNA Mass Ladder” (INVITROGEN).
3.4.3.4 Sequenciamento de DNA
Em todas as amostras positivas para a presença de metilação na região promotora dos
genes p15INK4B
e p16INK4A foi realizado o sequenciamento automático do DNA, como uma
metodologia adicional confirmatória. As amostras positivas derivadas do produto de PCR
foram purificadas utilizando o kit GFXTM PCR (DNA and Gel Band purification Kit-
AMERSHAM BIOSCIENCES), segundo recomendações do fabricante. Um volume de 30µL
do produto de PCR foram acrescentados em 500µL de tampão de captura e colocadas em um
tubo contendo uma coluna. A amostra foi centrifugada a 6000 rpm por 30 segundos e o
precipitado descartado. Foi adicionado 500µL de tampão de lavagem (10mM TE; etanol 80%)
40
na coluna e centrifugado novamente a 6000 rpm por 30 segundos. A coluna foi lavada com
20µL de água destilada e centrifugada a 6000 rpm por 1 minuto para eluir o DNA. O DNA
purificado foi quantificado através do espectrofotômetro em leitura em comprimento de onda
de 260nm(Biophotometer 8,5mm- EPPENDORF).
O sequenciamento foi realizado utilizando a Plataforma ABI PRISM 3100 Genetic
Analyser (Applied Biossistems). Para cada amostra de produto de PCR foram realizados dois
sequenciamentos, um utilizando oligonucleotídeos senso (f) e outro oligonucleotídeos anti-
senso (r). Para a reação de sequenciamento foi utilizado 100ng do DNA purificado e 3,2pmol
do oligonucleotídeo (tabela 7), em um volume total de 7µL, 1 µL de tampão 5x (Tris HCl
400mM; MgCl2 10mM, pH 9,0), 1µL de H2O ultra pura e 1µL do “Mix Big Dye” (Taq +
fluoróforos + MgCl2). As condições de ciclagem foram 25 ciclos de desnaturação a 96ºC por
10 segundos, pareamento a 50ºC por 5 segundos e extensão a 60ºC por 4 minutos.
Após a PCR, o material foi precipitado com 40µL de isopropanol 75%, deixado a
temperatura ambiente por 15 minutos e centrifugado a 4000 rpm (centrifuga EPPENDORF-
modelo 5804) por 45 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado lavado com
50µL de etanol 70% e centrifugado por 15 minutos a 4000 rpm (centrifuga EPPENDORF-
modelo 5804). Após secar por 15 minutos a 37°C foram acrescentados 10µL de formamida
ultrapura (MERCK). O material foi então desnaturado por 10 min a 96°C em máquina de
PCR e mantido no gelo. A placa foi então colocada na Plataforma 3100 para a leitura da
seqüência. A análise do resultado do sequenciamento foi feita através do programa “BioEdit
Sequence Alignment Editor”
41
Resultados
4.1 Análise Citogenética em Síndrome Mielodisplásica Primária na Infância No presente estudo foi feita a análise citogenética em 64 pacientes com síndrome
mielodisplásica primária na infância com idades que variaram de 5 meses a 18 anos, sendo 40
do sexo masculino e 24 do sexo feminino. Do total de pacientes analisados de acordo com a
classificação para SMD da infância (HASLE et al., 2003), 35 apresentaram CR, 14 AREB, 10
AREB-t e 5 LMMJ. Neste estudo não foram caracterizados pacientes com ARSA. Duas
crianças eram portadoras da Síndrome de Down (pacientes nº36 e nº58, tabela 6). Em três
casos (pacientes nº7, nº11 e nº37, tabela 6) não foi possível a obtenção de mitoses para a
análise citogenética. Nos demais casos, o índice mitótico variou de regular para bom, com
uma boa qualidade de cromossomos metafásicos para definição do padrão cromossômico.
Alterações cromossômicas foram detectadas em 44 pacientes (72%) dos 61 casos
analisados (tabela 6). A análise citogenética auxiliou no diagnóstico dos casos com suspeita
de SMD primária pediátrica e foi uma importante ferramenta para a escolha do tratamento.
Tabela 6: Análise Citogenética em Síndrome Mielodisplásica Primária na Infância
Nº Idade/
Sexo
Subtipo Cariótipo Evolução
da doença
Grupos
de Risco
(IPSS)
1 8a /F CR 46,XX,del(9)(p21)[3]/46,XX[19] não/TMO/óbito int-1
2 13a /M CR 46,XY,del(17)(p12)[9]/46,XY,del(17)(p12),
del(12)(p13)[5]/46,XY,del(11)(q23)[3]/46,XY[34]
não /TCTCU int-1
3 9a /M CR 46,XY,del(3)(p23)[5]/46,XY[38] sim/ Epo/AREB int-1
3a 10a /M AREB 46,XY,del(3)(p23)[11]/46,XY[21] Epo/óbito int-2
4 1a /M CR 46,XY[32] não/transfusão int-1
5 3a /M CR 46,XY,+der(3)del(3)(q21),-7,-9,+mar[2]/46,XY[27] sim/AREB/
QT
int-2
6 13a /F CR 46,XX,del(5)(q15q35)[15]/46,XX[38] não/TMO int-1
42
7 5m /M CR sem mitose não/transfusão ------
8 14a /M CR 46,XY,del(11)(q23)[5]/46,XY[27] não/ transfusão int-1
9 7a /F CR 46,XX,del(12)(p13)[10]/46,XX[28] não/TMO int-1
10 11a /M CR 46,XY[26] não/ transfusão int-1
11 8a /M CR sem mitose não transfusão ------
12 15a /F CR 46,XX[22] não/ transfusão int-1
13 5a /M CR 46,XY[35] não/ transfusão/
óbito
int-1
14 8a /M CR 46,XY[33] não/ transfusão/
óbito
int-1
15 7a /M CR 46,XY[20] não/ transfusão int-1
16 16a /M CR 46,XY[41] não/ transfusão int-1
17 18m/F CR 46,XX[40] sim/GM-CSF
/AREB
int-1
17a 2a /F AREB 46,XX,del(11)(q23)[15]/46,XX[18] óbito int-2
18 7a /M CR 46,XY,-7,+20[13]/46,XY[17] não/TMO int-2
19 7a /M CR 46,XY,del(12)(p12)[6]/46,XY[37] não/TMO int-1
20 8a /F CR 46,XX[30] não/ transfusão int-1
21 18a/F CR 46,XX,del(6)(q21)[13]/46,XX[25] sim /AREB int-1
21a 18a/F AREB 46,XX,del(6)(q21)[10]/46,XX[12] TMO int-2
22 7a /M CR 46,XY[32] não/ transfusão int-1
23 15a /F CR 46,XX[36] não/ transfusão int-1
24 16a /F CR 47,XX,+mar[2]/46,XX[27] não/TMO/óbito int-1
25 7a /F CR 46,XX[30] não/ transfusão int-1
26 6a /F CR 46,XX[32] não/ transfusão int-1
27 14a /M CR 46,XY,del(17)(p12)[15]/46,XY[28] não/TMO int-1
28 18a /M CR 46,XY,del(17)(p12)[4]/ 46,XY[25] não/TMO int-1
29 7a /M CR 46,XY[20] não/TMO int-1
30 12a /M CR 46,XY,del(17)(p12)[12]/46,XY[8] não/TMO int-1
31 11a /F CR 46,XX[20] não/TMO int-1
32 17a /F CR 51,XX,+4,+6,+8,+14,+20[3]/46,XX[41] não/TMO int-1
33 18a /M CR 46,XY,csb[6]/46,XY[20] não/TMO int-1
34 9a /M CR 46,XY,del(17)(p12)[5]/46,XY[16] não/TMO int-1
43
35 10a /F CR 46,XX,csb[8]/46,XX[31] não/TMO int-1
36 17m /F AREB 47,XX,der(17)t(1?;17)(q32?,p13),+21c[15]/
47,XX,+21c[6]
sim/LMA/
QT/óbito
alto-risco
37 7a/M AREB sem mitose não/ transfusão ------
38 2a /M AREB 45,XY,-19[4]/46,XY[25] não/ transfusão int-2
39 9m /M AREB 46,XY,del(6)(q23)[5]/46,XY[15] não/ transfusão int-2
40 5a /M AREB 47,XY,+8[11]/46,XY[34] sim/ LMA/
QT /óbito
int-2
41 16a /M AREB 47,XY,+8[30]/46,XY[21] sim /LMA/
QT/óbito
int-2
42 7a /F AREB 46,XX,i(9)(q10)[15]/46,XX[7] sim/LMA/
TMO/ óbito
int-2
43 15a /F AREB 46,XX,del(11)(q23)[14]/46,XX[23] sim/LMA/
TMO/óbito
int-2
44 13a /F AREB 46,XX,del(7)(q22)[10]/46,XX[12] não/TMO alto risco
45 12a /M AREB 46,XY,del(11)(q23)[12]/46,XY[8] sim/LMA/
QT/ óbito
int-2
46 6a /F AREB 58,XX,+X,+3,+5,+6,+8,+10,+11,+12,+13,+18,+20,
+21[5]/58,XX,idem,dup(1)(q21q31)[14]/46,XX[21]
sim /LMA/
QT/óbito
alto risco
47 14a /M AREB 46,XY,del(7)(q22)[10]/46,XY,del(7)(q22),
del(12)(p12)[3]/46,XY[7]
sim /LMA/
QT/óbito
alto risco
48 18a /M AREB 46,XY[20] não/TMO int-1
49 17a /M AREB 46,XY[20] não/TMO int-1
50 2a /F AREB-t 46,XX,t(4;7)(p16;p15)[16]/46,XX[23] sim/LMA/
QT/óbito
alto risco
51 4a /F AREB-t 49,XX,dup(1)(q21q32),+6,+8,+mar[4]/46,XX[16] sim /LMA/
QT/óbito
alto risco
52 1a /M AREB-t 46,XY,add(9)(q34)[5]/46,XY,inv(1)(q21),
add(9)(q34)[4]/46,XY[22]
sim /LMA/
QT/óbito
alto risco
53 10a /M AREB-t 45,XY,-7[26]/46,XY[4] sim /LMA/
QT/óbito
alto risco
54 21m/M AREB-t 45,XY,-7[24]/46,XY[6] sim /LMA/
QT/óbito
alto risco
55 12a /M AREB-t 45,XY,-7[18]/46,XY[2] não/ TMO/ óbito alto risco
44
56 5a /M AREB-t 46,XY,t(5;8)(q32;q22)[23]/46,XY[8] sim/LMA/
QT/ óbito
alto risco
57 22m/M AREB-t 45,XY,-7[14]/46,XY[6] sim /LMA/
QT/óbito
alto risco
58 12a /M AREB-t 58,XY,+8,+13,+13,+14,+15,+20,+21c,+21,+21,
+21,+22,+22[20]/47,XY,+21c[2]
sim /LMA/
QT/óbito
alto risco
59 17a /M AREB-t 47,XY,+8[22]/46,XY[4] sim /LMA/
TMO/óbito
alto risco
60 21m /F LMMJ 46,XX,inv(5)(q11q21),-9,+mar[2]/46,XX[38] não/QT/óbito alto risco
61 2a /M LMMJ 47,XY,+16[6]/46,XY[17] não/QT int-2
62 2a /M LMMJ 46,XY,del(11)(q23)[10]/46,XY[10] sim /LMA/
QT/óbito
int-2
63 1a /F LMMJ 46,XX,del(11)(q23)[5]/46,XX[24] não/QT/óbito int-2
64 8a /M LMMJ 45,XY,-7[20]/46,XY[2] não/ TMO/ óbito alto risco
CR - citopenia refratária; AREB - anemia refratária com excesso de blastos; AREB-t - anemia refratária com excesso de blastos em transformação; LMMJ- leucemia mielomonocítica juvenil; LMA- leucemia mielóide aguda; a - ano(s), m- meses, F- feminino, M- masculino, TMO- transplante de medula óssea alogenêico, TCTCU- transplante de células tronco de cordão umbilical, QT- quimioterapia; GM-CSF - fator de estimulação de colônias granulócito-macrófago, Epo- eritropoetina; int-1- intermediário 1; int-2- intermediário 2; números 3a, 17a e 21a- acompanhamento dos paciente 3, 17 e 21 respectivamente. 4.1.1 Freqüência de Casos com Alterações Cromossômicas por Subtipos de SMD
Primária na Infância
Para o cálculo da freqüência de casos com anomalias cromossômicas nos subtipos foi
considerado como 100% o total de casos analisados por subtipo. Dos 33 pacientes com CR,
18 (54,5%) apresentaram cariótipo anormal. Nos subtipos mais avançados da doença a
freqüência de casos com alterações cromossômicas foi maior, sendo verificada em 11 (85%)
dos 13 pacientes com AREB, em 10 (100%) dos casos com AREB-t e em 5 (100%) dos casos
de LMMJ (tabela 7). Portanto, podemos perceber que conforme o subtipo da SMD se torna
mais avançado o número de casos com cariótipos anormais aumenta.
45
Tabela 7: Freqüência de Casos com Cariótipos Anormais em SMD Primária na Infância
Classificação Total de Pacientes Analisados Nº de casos com cariótipos anormais
CR 33 18 (54,5%) AREB 13 11 (85%) AREB-t 10 10 (100%) LMMJ 5 5 (100%) Total 61 44 (72%)
Verificamos que diferente das leucemias, o padrão cromossômico em pacientes
portadores de SMD primária na infância é caracterizado principalmente por perdas parciais e
completas de cromossomos (as deleções e as monossomias), assim como o ganho
cromossômico (trissomias). Neste estudo foram encontrados poucos casos de translocações
cromossômicas. Como podemos observar na figura 7, as anomalias cromossômicas mais
freqüentes foram: alterações envolvendo o cromossomo 7 (-7/7q-), sendo verificadas em 8
pacientes (18%), cariótipos complexos em 6 pacientes (14%), del(11)(q23) em 5 pacientes
(11%), e a del(17)(p12) em 4 pacientes (9%). Outras alterações encontradas com menor
freqüência foram: +8, alterações envolvendo o cromossomo 9 [add(9)(q34), del(9)(p21) e
i(9)(q10)] e translocações cromossômicas, sendo observados em 3 pacientes (7%) cada
alteração cromossômica; del(6)(q21), del(12)(p13) e quebras cromatídicas em 2 pacientes
(4,5%) e del(3)(p23), del(5)(q15q35),+16, alteração cromossômica biclonal, -19 e +mar em 1
paciente (2%). Os cariótipos mostrando as principais alterações cromossômicas detectadas
neste estudo podem ser visualizados no anexo 2.
46
Fig. 7: Freqüência das alterações cromossômicas em SMD primária na infância.
Estudando a distribuição das alterações cromossômicas por subtipo, foi verificado que
aparentemente não há uma especificidade de uma alteração cromossômica por subtipo. No
subtipo CR, os pacientes apresentaram cariótipos normais, del(3p), del(5q), del(6q), -7
associado com +20, del(9p), del(11q), del(12p), del(17p), +mar e cariótipo complexo, sendo a
alteração mais freqüente a del(17p). No subtipo AREB a incidência de cariótipos normais foi
baixa predominando as seguintes alterações cromossômicas: del(6q), del(7q), +8, i(9q),
del(11q), der(17), -19 e cariótipos complexos, no entanto, a del(7q), +8 e del(11)(q23) foram
as alterações mais freqüentes; em AREB-t todos os pacientes apresentaram alterações
cromossômicas, como: -7, add(9q) associado com inv(1q), +8, t(5;8) e cariótipos complexos,
sendo a alteração mais freqüente a -7. Os pacientes classificados como LMMJ não
0%
2%
4%
6%
8%
10%
12%
14%
16%
18%
Fre
qü
ênci
a d
e ca
sos
del(7
q)/-7
del(1
1)(q
23)
del(1
7p) +8
add(9
q)/ del
(9p)/
i(9q)
del(6
q)
del(1
2p)
del(3
p)
del(5
q)+1
6
biclo
nal -19
+mar
47
apresentaram cariótipos normais, tendo como alterações cromossômicas a -7, del(11)(q23),
+16 e cariótipos complexos, no entanto, a del(11)(q23) foi a alteração mais freqüente.
Podemos observar que a monossomia do cromossomo 7 esteve presente principalmente nos
subtipos mais avançados da doença (tabela 8).
Tabela 8: Distribuição do Padrão Cromossômico por Subtipo de SMD Primária na Infância
Subtipo
Cariótipo N° de pacientes
%/ subtipo
CR (33 pacientes)
cariótipo normal del(3p) del(5q) del(6q) -7 e +20 del(9p) del(11)(q23) del(12p) del(17p) +mar alteração biclonal quebras cromatídicas cariótipos complexos
15 1 1 1 1 1 1 2 4 1 1 2 2
46% 3% 3% 3% 3% 3% 3% 6% 12% 3% 3% 6% 6%
AREB (13 pacientes)
cariótipos normais del(6q) del(7q) +8 i(9q) del(11)(q23) -19 translocações cromossômicas cariótipos complexos
2 1 2 2 1 2 1 1 1
15% 8% 15% 15% 8% 15% 8% 8% 8%
AREB-t (10 pacientes)
cariótipos normais -7 +8 add(9q) e inv(1q) translocações cromossômicas cariótipos complexos
0 4 1 1 2 2
0% 40% 10% 10% 20% 20%
LMMJ (5 pacientes)
cariótipos normais -7 del(11)(q23) +16 cariótipos complexos
0 1 2 1 1
0% 20% 40% 20% 20%
48
4.2 Citogenéica Molecular: Aplicação do FISH em SMD Primária na Infância
(B A metodologia da citogenética molecular (FISH) foi utlizada em sete pacientes com
SMD primária na infância. Em três pacientes, que não apresentaram mitose para análise
através da citogenética clássica, para afastarmos alterações cromossômicas de mau
prognóstico foram utilizadas as sondas do cromossomo 7 e da região q23 do cromossomo 11.
Os três pacientes mostraram os sinais normais, respectivos de cada cromossomo (fig. 8).
Fig 8: Análise por hibridização in situ por fluorescência. (A) FISH utilizando a sonda do cromossomo 7 (LSI D7S486 spectrum orange/CEP 7 spectrum green, Vysis, Inc. Downers Grove, USA). Podemos observar quatro marcações nos núcleos interfásicos, caracterizando uma célula normal para o cromossomo 7. O segmento da sonda de cor verde marca a região centromérica do cromossomo 7 e o de cor vermelha, a região q31. (B) FISH utlizando a sonda da região 11q23 (LSI MLL Dual Color, Vysis, Inc. Downers Grove, USA). Podemos observar que ocorreu a marcação normal do gene nos dois cromossomos na metáfase, mostrando a presença dos dois alelos. O mesmo podemos observar no núcleo interfásico.
Utilizamos a técnica de FISH para confirmação da presença da deleção do braço curto
do cromossomo 17 e a deleção do braço longo do cromossomo 11 na região q23, em uma
criança com SMD hipocelular, CR, que apresentou dois clones caracterizados
citogeneticamente:46,XY,del(17)(p12)[9]/46,XY,del(17)(p12),del(12)(p13)[5]/46,XY,del(11)
(q23)[3]/ 46,XY[34] (fig.9A). Neste caso foram realizadas duas preparações, uma utilizando a
sonda do gene p53 mapeado na região p13.1 do cromossomo 17 e a outra utilizando a sonda
do gene MLL mapeado no braço longo do cromossomo 11, na região q23. A análise por FISH
(A)
(A)
(B)
49
17p(12) 17p(12) 12p(13) 11q(23)
(A)
detectou a ausência dos alelos dos genes p53 e MLL (fig. 9B e 9C, respectivamente). Este
caso é o primeiro relato da literatura, mostrando uma alteração citogenética biclonal
envolvendo os cromossomos 11 e 17 em SMD hipocelular na infância. A análise citogenética
exerceu um papel fundamental para a confirmação da doença, uma vez que esta criança não
apresentava diagnóstico concluído. Este paciente foi indicado para o transplante de medula
óssea alogenêico (TMO), entretanto, não possuía doador HLA compatível, sendo submetido
ao transplante de células tronco de cordão umbilical (TCTCU) (doador feminino) e hoje, 15
meses após o transplante ele se encontra em remissão citogenética completa (100% de células
femininas).
Fig. 9: Análise por citogenética clássica e citogenética molecular (FISH). (A) Cariótipo parcial, bandeamento G, mostrando a alteração cromossômica biclonal: del(17)(p12)/ del(17)(p12),del(12)(p13) e del(11)(q23); FISH utilizando as sondas dos genes p53 (B) e MLL (C). Podemos observar que tanto em B quanto em C ocorreu a marcação do gene em apenas um cromossomo na metáfase, mostrando a ausência de seu respectivo alelo (setas). O mesmo podemos observar no núcleo interfásico (setas). Na figura C podemos observar um núcleo interfásico com duas marcações, caracterizando uma célula normal.
(C) (B)
50
A técnica de FISH também foi aplicada em um caso de SMD hipocelular classificada
como CR que apresentou o seguinte padrão cromossômico: 46,XX,del(5)(q15q35)[15]/
46,XX[38] (fig. 10A). A del(5q) corresponde a uma alteração cromossômica muito rara na
infância, desta forma, para caracterizarmos melhor esta alteração e verificarmos se houve a
perda do gene c-fms (localizado na região q33), utilizamos a sonda que marca o braço curto
do cromossomo 5 (cor verde) e a região 5q33-q34 (cor vermelha) (LSI CSF1R SO/
LSID5S23:D5S721 SG – Vysis, Inc. Downers Grove, USA). Nosso resultado mostrou a
perda da região q33-q34 do cromossomo 5 neste paciente (fig. 10B), confirmando nosso
achado prévio da citogenética clássica.
Fig. 10: Análise por citogenética clássica e citogenética molecular (FISH). (A) Cariótipo parcial, bandeamento G, mostrando a alteração cromossômica: del(5)(q15q35). (B) FISH utilizando a sonda de dupla marcação do cromossomo 5. O segmento da sonda de cor verde marca o braço curto do cromossomo 5 e o de cor vermelha, a região 5q33-q34. Podemos observar a marcação em dois núcleos interfásicos, um núcleo apresentando quatro sinais caracterizando os dois cromossomos 5 normais e outro núcleo apresentando três sinais(seta), confirmando a perda da região q33-q34.
Para investigarmos o envolvimento do gene supressor de tumor p53, em um
cromossomo derivativo, resultante da translocação não balanceada envolvendo provavelmente
o braço longo do cromossomo 1 e o braço curto do cromossomo 17, utilizamos a técnica de
FISH. Este paciente era portador da SD e a análise por citogenética clássica mostrou o
(A)
(B)
51
seguinte padrão cromossômico: 47,XX,der(17)t(1?;17)(q32?;p13),+21c[15]/47,XX,+21c[6]
(fig. 11A). Através da análise por FISH foi confirmado o derivativo do cromossomo 17, sem
o envolvimento do gene supressor de tumor p53 (fig. 11B). Esta paciente foi tratada com
quimioterapia, evoluindo para LMA e logo após foi a óbito.
Fig. 11: Análise por citogenética clássica e citogenética molecular (FISH). (A) Cariótipo parcial, bandeamento G, mostrando a alteração cromossômica: der(17)t(1?;17)(q32?;p13). (B) Análise por FISH utilizando a sonda do gene p53 localizado na região p13.1 do cromossomo 17, mostrando a presença do gene p53 nos dois cromossomos.
Para realizar o acompanhamento de evolução da doença e monitoramento terapêutico
(pós QT) de um paciente apresentando AREB-t e monossomia do cromossomo 7 ao
diagnóstico (fig. 12A), aplicamos a técnica de FISH. Para esta análise foi utilizada a sonda
com dupla marcação do cromossomo 7 (fig. 12B). Esta metodologia foi aplicada, pois para
definição do padrão cromossômico no acompanhamento de evolução da doença, o número de
metáfases analisadas foi pequeno, apenas 12, entretanto, não observamos a presença de
alterações cromossômicas adicionais. O FISH mostrou através de 300 células analisadas
(metáfases e núcleos interfásicos) um aumento do clone apresentando a monossomia do
cromossomo 7 (95%). Esta criança evoluiu para LMA e foi tratada com QT. No
monitoramento da terapia observamos células com monossomia do cromossomo 7, indicando
a recaída da doença.
(A)
(B)
52
Fig. 12: Análise por citogenética clássica e citogenética molecular (FISH). (A) Cariótipo parcial, bandeamento G, mostrando a alteração cromossômica: -7. (B) FISH: sonda do cromossomo 7 (LSI D7S486 spectrum orange/ CEP 7 spectrum green, Vysis, Inc. Downers Grove, USA). O segmento da sonda de cor verde marca a região centromérica do cromossomo 7 e o de cor vermelha, a região q31. Podemos observar quatro marcações nos núcleos interfásicos, caracterizando uma célula normal para o cromossomo 7. Observamos a presença de alguns núcleos com apenas dois sinais, caracterizando a monossomia de 7 (setas). Na metáfase, observamos também a marcação em apenas um cromossomo, confirmando a monossomia de 7 (seta).
4.3 Distribuição dos Pacientes com SMD Primária na Infância segundo os Grupos de
Risco (IPSS)
Utilizamos os critérios adotados pelo IPSS (tabela 3) para classificar os pacientes com
SMD primária na infância de acordo com os grupos de risco. O IPSS tem por objetivo prever
o tempo de sobrevivência e a taxa de transformação leucêmica. Verificamos que nenhum dos
nossos pacientes foi classificado como de baixo risco, sendo o grupo de risco mais freqüente o
intermediário 1 (tabela 9). Dos 61 pacientes 33 (54%) foram classificados como intermediário
1, 12 (20%) intermediário 2 e 16 (26%) alto risco.
Evolução da doença foi verificada em 34,4% (22) do total dos 64 pacientes estudados.
Correlacionando os grupos de risco com a taxa de evolução da doença, verificamos que os
pacientes classificados com alto risco, apresentaram a maior taxa de evolução da doença. Dos
(A)
(B)
53
pacientes classificados como intermediário 1 (33) e intermediário 2 (12), apenas 3 (9%) e 5
(42%) apresentaram evolução da doença e 18% e 58,3% foram à óbito respectivamente. No
entanto, 12 (75%) dos 16 pacientes classificados como alto risco apresentaram evolução da
doença, revelando um pior prognóstico e alta taxa de mortalidade (94%).
Tabela 9: Freqüência de Pacientes com SMD Primária na Infância de acordo com o IPSS
(1997) que mostraram evolução da doença
Classificação IPSS
Grupos de Risco
Total de Pacientes
Pacientes que mostraram evolução da doença (%)
N° de óbitos
Baixo 0 0 0
Intermediário 1 33 3 (9%) 6 (18%)
Intermediário 2 12 7 (58,3%) 7 (58,3%)
Alto 16 12 (75%) 15 (94%)
Total 61 22 (36%) 28 (46%)
OBS: três pacientes não apresentaram mitose, dessa forma não foi possível aplicar o IPSS.
Diferentes tratamentos foram utilizados em nossos pacientes como transfusão
sanguínea que foi aplicada em 18 pacientes (28%), fatores de crescimento em 2 pacientes
(3%), quimioterapia em 19 pacientes (30%) e TMO em 25 pacientes (39%). A quimioterapia
revelou-se como sendo o pior tratamento para estes pacientes com uma taxa de mortalidade de
84%. O transplante de medula óssea alogenêico demonstrou ser eficaz para este grupo de
pacientes, apresentado uma taxa de mortalidade de 28%.
4.4 Análise Molecular
A análise do padrão de metilação na região promotora dos genes p15INK4B
e p16INK4A em
45 pacientes com SMD primária na infância foi realizada pela técnica MSP. Os pacientes
foram distribuídos segundo a classificação em: 26 casos com CR, 9 com AREB, 8 com
AREB-t e 2 com LMMJ. A metilação em p15INK4B
foi detectada em 35,5% dos pacientes e em
p16INK4A em 8,8% do total de casos analisados.
54
4.4.1 Análise da Freqüência de Metilação na Região Promotora do Gene p15INK4B em
Pacientes com SMD Primária na Infância
Para a análise da presença de metilação no gene p15INK4B em pacientes com SMD
primária na infância, nós utilizamos como controle negativo o DNA de células mononucleares
de doadores de medula óssea e como controle positivo o DNA das células da linhagem Raji.
Em todas as amostras foram amplificadas as regiões promotoras do gene p15 INK4B através da
reação em cadeia da polimerase específica para a metilação (MSP) com 100% de sucesso
após otimização das concentrações dos reagentes e das condições de ciclagem.
Não foi detectada a presença de metilação no gene p15INK4B
nas 10 amostras de DNA dos
doadores de medula óssea. As células da linhagem Raji não apresentaram 100% de metilação
para este gene, sendo detectada também a presença de células não metiladas para este gene,
como observado por Herman et al., 1996 (fig. 13A).
Das 45 amostras de DNA de pacientes com SMD primária analisadas 16 (35,5%)
apresentaram metilação na região promotora deste gene (tabela 10). No entanto, nenhum
destes pacientes apresentou metilação em 100% das células analisadas, como podemos
verificar na fig.13B, a qual mostra a presença do gene tanto nas reações que foram utilizados
oligonucleotídeos específicos para metilação (M), quanto nas reações com oligonucleotídeos
específicos para o gene não metilado (U), sugerindo desta forma que o gene apresenta-se
metilado em apenas uma porcentagem de células.
55
(A) (B) Fig. 13: Fotografia de gel de poliacrilamida 5% utilizado para verificar a amplificação dos produtos de PCR referente à análise de metilação do gene p15
INK4B após a modificação do DNA com bisulfito. (A) Linha L: marcador de peso molecular “Low DNA Mass Ladder” (INVITROGEN); linhas U: fragmentos relativos ao produto de PCR de 154pb realizado com oligonucleotídeos específicos para o gene não metilado; linha M: fragmentos relativos ao produto de PCR de 148pb realizado com oligonucleotídeos específicos para o gene metilado. Água: controle da reação; doador: controle negativo para metilação; linhagem celular Raji: controle positivo para metilação e paciente nº1 (tabela 10). (B) 1-4: pacientes positivos para a metilação na região promotora do gene p15
INK4B (pacientes nº. 9, 18, 42, 53 da tabela 10) Tabela 10: Identificação de Metilação no Gene p15
INK4B em SMD Primária na Infância
Paciente Subtipo Idade / Sexo Metilação no gene p15 1 CR 8a / F - 2 CR 13a / M - 4 CR 1a / M - 5 CR 3a / M - 6 CR 13a / F - 7 CR 5m /M - 8 CR 14a / M - 9 CR 7a / F +
10 CR 11a / M - 11 CR 8a / M - 12 CR 15a / F + 13 CR 5a / M - 14 CR 8a / M - 15 CR 7a / M - 16 CR 16a / M - 17a AREB 18m / F + 18 CR 7a / M + 19 CR 7a / M - 20 CR 8a / F - 21 CR 18a/F + 22 CR 7a / M - 23 CR 15a / F -
56
24 CR 16a / F + 25 CR 7a / F - 26 CR 6a / F - 27 CR 14a / M - 29 CR 7a/M - 36 AREB 17m / F - 40 AREB 5a / M - 41 AREB 16a / M - 42 AREB 7a / F + 43 AREB 15a / F - 44 AREB 13a / F + 45 AREB 12a / M + 47 AREB 14a / M + 50 AREB-t 2a/F + 53 AREB-t 10a / M + 54 AREB-t 21m / M + 55 AREB-t 12a / M + 56 AREB-t 5a / M - 57 AREB-t 22m / M + 58 AREB-t 12a / M - 59 AREB-t 17a / M - 60 LMMJ 21m / F - 63 LMMJ 1a /F +
4.4.1.1 Confirmação por Sequenciamento das Amostras Positivas para a Metilação na
Região Promotora do Gene p15INK4B
Todas as 16 amostras de produto da MSP positivas para metilação (M) na região
promotora do gene p15INK4B dos pacientes com SMD primária, uma amostra da linhagem
celular Raji (controle positivo) e uma amostra para ausência de metilação (U) (controle
negativo, doador de medula óssea) foram seqüenciadas com o objetivo de confirmar a
presença de metilação e demonstrar a modificação do DNA pelo tratamento com bisulfito,
comprovando a eficiência desta técnica. Para cada paciente foram realizadas duas reações de
sequenciamento, uma utilizando oligonucleotídeo F (“forward”= senso) e a outra utilizando o
oligonucleotídeo R (reverse = anti-senso).
A análise do sequenciamento demonstrou que os DNAs foram modificados pelo
tratamento com bisulfito. Como podemos verificar na fig. 14, quando comparamos a
seqüência selvagem (S) com a seqüência não metilada (U) percebemos, que todas as citosinas
57
não metiladas foram convertidas em timinas após a técnica MSP em ambos os genes. Além
disso, quando comparamos a seqüência não metilada (U) com a seqüência metilada (M),
verificamos os sítios de metilação (*), confirmando dessa forma, a presença de metilação
nestes pacientes.
S U M
* * * * * * *
Fig. 14: Análise do sequenciamento do gene p15INK4B (5’→ 3’) através do programa “BioEdit
Sequence Alignment Editor”. (A) Comparação da seqüência da região promotora do gene p15INK4B
selvagem (S) com amostra de DNA tratada com bisulfito de um doador- seqüência não metilada (U) e um paciente com SMD positivo para a metilação (M), mostrando que houve a conversão de todas as citosinas não metiladas em timinas após a amplificação e os sítios específicos de metilação na sequência metilada (*); (B) Gráfico mostrando o resultado do sequenciamento do gene p15
INK4B de um paciente positivo para metilação.
4.4.2 Freqüência de Metilação em p15INK4B nos Subtipos de SMD Primária na Infância
A correlação entre a freqüência de metilação no gene p15 INK4B e os diferentes subtipos foi
calculada e pode ser vista na tabela 11. Como podemos notar as maiores freqüências de
metilação para o gene p15INK4B estiveram presentes nos subtipos mais agressivos de SMD
como AREB, AREB-t e LMMJ, com as freqüências de 55,5% e 62,5% e 50%
respectivamente. No subtipo menos agressivo da doença como, CR, a freqüência foi mais
baixa sendo 19% do total de pacientes analisados para este grupo. Dos 16 pacientes positivos
para metilação, 9 apresentaram evolução da doença (56%) e 11 pacientes faleceram (69%).
(A)
(B)
58
Nossos resultados sugerem que a metilação na região promotora do gene p15INK4B está
associada com maior risco de evolução da doença e confere mau prognóstico.
Tabela 11: Freqüência de Metilação no Gene p15INK4B nos Subtipos de SMD Primária na
Infância
Classificação N° de pacientes N° de pacientes com metilação em
p15INK4B
CR 26 5 (19%)
AREB 9 5 (55,5%)
AREB-t 8 5 (62,5%)
LMMJ 2 1 (50%)
Total 45 16 (35,5%)
4.4.3 Análise da Freqüência de Metilação na Região Promotora do Gene p16INK4A em
Pacientes com SMD Primária na Infância
No estudo do padrão de metilação no gene p16INK4A em pacientes com SMD primária
na infância, foram utilizados como controle negativo DNA de células mononucleares de
doadores de medula óssea e como controle positivo DNA de células da linhagem DLD-1. A
análise do padrão de metilação nos DNAs dos 10 doadores de medula óssea revelou ausência
de metilação em todas as amostras. A amostra de DNA das células da linhagem DLD-1
apresentou 100% de metilação.
A metilação na região promotora do gene p16INK4A foi detectada em apenas quatro
(8,8%) dos 45 pacientes portadores de SMD primária na infância (tabela 12). No entanto,
nenhum dos pacientes apresentou este gene totalmente metilado, sendo positivos também para
a MSP com oligonucleotídeos específicos para o gene não metilado (fig. 15).
59
Tabela 12: Identificação de Metilação no Gene p16INK4A em SMD Primária na Infância
Paciente Subtipo Idade / Sexo Metilação no gene p16INK4A
1 CR 8a / F - 2 CR 13a / M - 4 CR 1a / M - 5 CR 3a / M - 6 CR 13a / F - 7 CR 5m /M - 8 CR 14a / M - 9 CR 7a / F - 10 CR 11a / M - 11 CR 8a / M - 12 CR 15a / F - 13 CR 5a / M - 14 CR 8a / M - 15 CR 7a / M - 16 CR 16a / M - 17a AREB 18m / F + 18 CR 7a / M - 19 CR 7a / M - 20 CR 8a / F - 21 CR 18a/F - 22 CR 7a / M - 23 CR 15a / F - 24 CR 16a / F - 25 CR 7a / F - 26 CR 6a / F - 27 CR 14a / M - 29 CR 7a/M - 36 AREB 17m / F - 40 AREB 5a / M - 41 AREB 16a / M - 42 AREB 7a / F - 43 AREB 15a / F + 44 AREB 13a / F - 45 AREB 12a / M - 47 AREB 14a / M - 50 AREB-t 2a/F - 53 AREB-t 10a / M - 54 AREB-t 21m / M - 55 AREB-t 12a / M - 56 AREB-t 5a / M + 57 AREB-t 22m / M + 58 AREB-t 12a / M - 59 AREB-t 17a / M - 60 LMMJ 21m / F - 63 LMMJ 1a /F -
60
(A) (B)
Fig. 15 – Fotografia de gel de poliacrilamida 5% utilizado para verificar a amplificação dos produtos de PCR referente à análise de metilação da região promotora do gene p16
INK4A após a modificação do DNA com bisulfito. (A) Linha L: marcador de peso molecular “Low DNA Mass Ladder” (INVITROGEN); linhas U: fragmentos relativos ao produto de PCR de 151pb, realizado com oligonucleotídeos específicos para o gene não metilado; linha M: fragmentos relativos ao produto de PCR de 150pb realizado com oligonucleotídeos específicos para o gene metilado. Água: controle da reação; doador: controle negativo para metilação; linhagem celular DLD-1: controle positivo para metilação e paciente nº1 (tabela 12). (B) 1-4: pacientes positivos para a metilação na região promotora do gene p16
INK4A (pacientes nº 56, 17a, 57 da tabela 12)
4.4.3.1 Confirmação por Sequenciamento das Amostras Positivas para a Metilação na
Região Promotora do Gene p16INK4A
As quatro amostras do produto da MSP positivas para metilação (M) no gene p16INK4A
de pacientes com SMD primária, uma amostra da linhagem DLD-1 (controle positivo) e uma
amostra para ausência de metilação (U) (controle negativo - doador de medula óssea) do gene
p16INK4A foram seqüenciadas.
A análise do sequenciamento foi realizado pelo programa “BioEdit Sequence Alignment
Editor” demonstrando que os DNAs foram modificados pelo tratamento com bisulfito,
comprovando a eficiência do método. Podemos verificar através da comparação da seqüência
selvagem (S) que todas as citosinas não metiladas foram convertidas em timinas após a
técnica MSP. O resultado do sequenciamento dos pacientes selecionados confirmou a
presença de metilação nesta região do gene p16INK4A, sendo este dado verificado quando
61
comparamos a seqüência não metilada (U) com a seqüência metilada (M), na qual podemos
perceber os sítios de metilação (*) (fig. 16).
S-
U
M-
* * * * * * * Fig. 16: Análise do sequenciamento do gene p16
INK4A (5’→ 3’) através do programa “BioEdit Sequence Alignment Editor”. (A) Comparação da seqüência da região promotora do gene p16
INK4A selvagem (S) com a amostra de DNA tratada com bisulfito de um doador - seqüência não metilada (U) e um paciente com SMD positivo para a metilação (M), mostrando que houve a conversão de todas as citosinas não metiladas em timinas após a amplificação e os sítios específicos de metilação na sequência metilada (*); (B) Gráfico mostrando o resultado do sequenciamento do gene p16
INK4A de um paciente positivo para metilação.
4.4.4 Freqüência de Metilação na Região Promotora do Gene p16INK4A nos Subtipos de
SMD Primária na Infância
A freqüência de metilação no gene p16INK4A em nossos pacientes com SMD primária na
infância foi baixa, sendo obervada apenas em 8,8% dos pacientes. No entanto, aqueles que
apresentaram esta alteração estavam classificados dentro dos subtipos mais agressivos da
doença, como AREB e AREB-t, ocorrendo como uma freqüência de 22,2% e 25%,
respectivamente. Não foram observados casos de metilação deste gene em pacientes
classificados com CR e LMMJ (tabela 13). Dos 4 pacientes que apresentaram metilação para
região promotora do gene p16INK4A, todos apresentaram evolução da doença (100%) e
(A)
(B)
62
faleceram. Nossos resultados sugerem que a presença de metilação está associada com
evolução da doença e mau prognóstico.
Tabela 13: Freqüência de Metilação no Gene p16INK4A nos Subtipos de SMD Primária na
Infância
Classificação
N° de pacientes N° de pacientes com metilação em
p16INK4A
CR 26 0
AREB 9 2 (22,2%)
AREB-t 8 2 (25%)
LMMJ 2 0
Total 45 4 (8,8%)
4.5 Correlação entre a Presença de Metilação na Região Promotora dos Genes p15INK4B e
p16INK4A com o Padrão Cromossômico em SMD Primária na Infância
Na tabela 14 é possível observar que a metilação no gene p15INK4B esteve presente em
todos os subtipos de SMD primária na infância. No subtipo CR foi verificada metilação em
células apresentando cariótipo normal e com as alterações cromossômicas del(6q), -7 e +20,
del(12p) e +mar. Estes pacientes não apresentaram evolução da doença. No subtipo AREB foi
observada metilação nos pacientes com as alterações cromossômicas: del(7q) (2 pacientes),
i(9q) (1 paciente) e del(11)(q23) (2 pacientes). Os pacientes com estas alterações
apresentaram evolução para LMA, exceto o paciente apresentando del(7q) (paciente nº 44,
tabela 14), que foi submetido ao TMO.
No subtipo AREB-t, a metilação na região promotora do gene p15INK4B esteve presente
nos pacientes com - 7 (4 pacientes) e t(4;7) (1 paciente). Destes 5 pacientes, 4 apresentaram
evolução para LMA, o paciente (nº 55, tabela 14) apresentando -7 foi submetido ao TMO e
não mostrou evolução da doença.
63
Foi detectada metilação no gene p15INK4B em um dos dois pacientes com LMMJ. Este
paciente apresentava a del(11)(q23) e não apresentou evolução da doença.
A presença de metilação em p15 INK4B não foi observada nos pacientes apresentando
trissomia do cromossomo 8, hiperdiploidia, t(5;8), no entanto, estes pacientes apresentaram
evolução da doença. Desta forma, provavelmente, existem diferentes vias que levam à
transformação leucêmica.
A metilação na região promotora do gene p16INK4A foi observada apenas nos subtipos
mais agressivos AREB e AREB-t, estando presente em pacientes com as alterações
cromossômicas -7 (1 paciente), del(11q) (2 pacientes) e t(5;8) (1 paciente). Todos os quatro
pacientes evoluiram da doença e faleceram.
Apenas os pacientes 17a e 57 mostraram metilação em ambos os genes. O paciente
17a foi inicialmente diagnosticado com CR e cariótipo normal. No entanto, apresentou
evolução da doença para um subtipo mais agressivo AREB, adquirindo alteração cariotípica, a
del(11)(q23). A análise do DNA para presença de metilação após a evolução detectou
positividade para ambos os genes. Já o paciente 57 classificado como AREB-t apresentou
como alteração citogenética a monossomia do 7. A análise molecular revelou a presença de
metilação nos dois genes estudados. Este paciente também apresentou evolução da doença.
Ambos os pacientes foram a óbito.
64
Tabela 14: Correlação entre a Presença de Metilação nos genes p15INK4B e p16
INK4A com o
padrão cromossômico em SMD primária da infância
N° Idade/
Sexo
Subtipo Cariótipo Metilação
nos genes
p15 p16
Evolução
da
doença
1 8a /F CR 46,XX,del(9)(p21)[3]/46,XX[19] - - não
2 13a /M CR 46,XY,del(17)(p12)[9]/46,XY,del(17)(p12),
del(12)(p13)[5]/ 46,XY,del(11)(q23)[3]/46,XY[34]
- - não
4 1a /M CR 46,XY[32] - - não
5 3a /M CR 46,XY,+der(3)del(3)(q21),-7,-9,+mar[2]/46,XY[27] - - sim
6 13a /F CR 46,XX,del(5)(q15q35)[15]/46,XX[38] - - não
7 5m /M CR sem mitose - - não
8 14a /M CR 46,XY,del(11)(q23)[5]/46,XY[27] - - não
9 7a /F CR 46,XX,del(12)(p13)[10]/46,XX[28] + - não
10 11a /M CR 46,XY[26] - - não
11 8a /M CR sem mitose - - não
12 15a /F CR 46,XX[22] + - não
13 5a /M CR 46,XY[35] - - não
14 8a /M CR 46,XY[33] - - não
15 7a /M CR 46,XY[20] - - não
16 16a /M CR 46,XY[41] - - não
17a 2a /F AREB 46,XX,del(11)(q23)[5]/46,XX[18] + + sim
18 7a /M CR 46,XY,-7,+20[13]/46,XY[17] + - não
19 7a /M CR 46,XY,del(12)(p12)[6]/46,XY[37] - - não
20 8a /F CR 46,XX[30] - - não
21 18a/F CR 46,XX,del(6)(q21)[13]/46,XX[25] + - sim
22 7a /M CR 46,XY[32] - - não
23 15a /F CR 46,XX[36] - - não
24 16a /F CR 47,XX,+mar[2]/46,XX[27] + - não
25 7a /F CR 46,XX[30] - - não
26 6a /F CR 46,XX[32] - - não
27 14a /M CR 46,XY,del(17)(p12)[15]/ 46,XY[28] - - não
29 7a/M CR 46,XY[20] - - não
36 17m /F AREB 47,XX,der(17)t(1?;17)(q32?,p13),+21c[15]/
47,XX,+21c[6]
- - sim
65
40 5a /M AREB 47,XY,+8[11]/46,XY[34] - - sim
41 16a /M AREB 47,XY,+8[30]/46,XY[21] - - sim
42 7a /F AREB 46,XX,i(9)(q10)[15]/46,XX[7] + - sim
43 15a /F AREB 46,XX,del(11)(q23)[14]/46,XX[23] - + sim
44 13a /F AREB 46,XX,del(7)(q22)[10]/46,XX[12] + - não
45 12a /M AREB 46,XY,del(11)(q23)[12]/46,XY[8] + - sim
47 14a /M AREB 46,XY,del(7)(q22)[10]/46,XY,del(7)(q22),
del(12)(p12)[3]/46,XY[7]
+ - sim
50 2a/F AREB-t 46,XX,t(4;7)(p16;p15)[16]/46,XX[23] + - sim
53 10a /M AREB-t 45,XY,-7[24]/46,XY[6] + - sim
54 21m/M AREB-t 45,XY,-7[14]/46,XY[8] + - sim
55 12a /M AREB-t 45,XY,-7[18]/46,XY[2] + - não
56 5a /M AREB-t 46,XY,t(5;8)(q32;q22)[23]/46,XY[8] - + sim
57 22m/M AREB-t 45,XY,-7[14]/46,XY[6] + + sim
58 12a /M AREB-t 58,XY,+8,+13,+13,+14,+15,+20,+21c,+21,+21,+21,
+22,+22[20]/ 47,XY,+21c[2]
- - sim
59 17a /M AREB-t 47,XY,+8[22]/46,XY[4] - - sim
60 21m /F LMMJ 46,XX,inv(5)(q11q21),-9,+mar[2]/46,XX[38] - - não
63 1a /F LMMJ 46,XX,del(11)(q23)[5]/46,XX[24] + - não
A correlação entre a presença de metilação na região promotora dos genes p15 INK4B e
p16 INK4A com o padrão cromossômico em crianças portadoras de SMD primária com pode ser
observada na fig. 17. Nossos resultados sugerem uma forte correlação entre a metilação do
gene supressor de tumor p15INK4B e alterações envolvendo o cromossomo 7 (del(7q)/-7). Dos
16 pacientes positivos para a metilação no gene p15INK4B, 7 (44%) apresentaram alterações
envolvendo o cromossomo 7 e 3 (19%) apresentaram a del(11)(q23). Com uma menor
freqüência (6,2%), a metilação no gene p15INK4B foi observada em pacientes com cariótipo
normal, del(6q), i(9q), del(12p), t(4;7) e +mar. Em relação ao estudo de correlação entre o
cariótipo e a metilação em p16 INK4A, nossos resultados sugerem que a metilação neste gene é
um evento raro em SMD da infância, entretanto parece estar associado com a transformação
leucêmica.
66
Fig. 17: Correlação entre o padrão cromossômico em crianças portadoras de SMD primária e presença de metilação na região promotora dos genes p15
INK4B e 16 INK4A. U- não metilado, M- metilado.
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
Fre
qü
ênci
a d
e ca
sos
del(5
q)
del(6
q)-7
/ de
l(7q) +8
i(9q)
/del(
9p)
del(1
1q)
del(1
2p)
del(1
7p)
+mar
p15U p15M p16U p16M
67
5. DISCUSSÃO
A síndrome mielodisplásica primária (SMD) é uma doença clonal de célula tronco
hematopoética, a qual ocorre predominantemente em idosos, sendo rara na infância. Embora
os aspectos clínicos, morfológicos e laboratoriais da SMD durante a infância não estejam
ainda completamente definidos, alguns estudos sugerem distintas características entre a SMD
no adulto e na criança (SASAKI et al., 2001; HASLE et al., 2003). No sentido de entender
melhor os mecanismos envolvidos nesta patogênese diversos estudos têm sido realizados.
Estudos iniciais em SMD na infância, utilizando a classificação FAB, mostraram que
a freqüência de pacientes apresentando o subtipo menos agressivo AR era baixa, ocorrendo
com maior incidência casos de AREB, AREB-t e LMMJ (NOWELL, 1992; LOCATELLI et
al., 1995; MARTINEZ-CLIMENT, 1997). No entanto, estudos mais recentes têm revelado
uma predominância do subtipo AR (KARDOS et al., 2003; POLYCHRONOPOULOU et al.,
2004). Provavelmente estas diferenças aconteceram devido à dificuldade do diagnóstico de
SMD primária na infância, principalmente nos casos com menos de 5% de blastos na medula
óssea, onde na prática clínica em pediatria, temos as anemias carenciais por deficiência de
vitamina B12 e folato, patologias mitocondriais e infecções virais que podem levar a achados
com dispoese de células hematopoéticas. Nestes casos tornam-se importantes diagnósticos
diferenciais para a SMD em pediatria, sendo de extrema importância a análise do mielograma,
biópsia de medula óssea e a análise citogenética. O estudo das alterações cromossômicas
nesse contexto auxilia não só no diagnóstico, mas evidencia aspectos importantes da biologia
da doença que se refletem no prognóstico e na evolução do paciente.
A classificação FAB para SMD primária, muito utilizada em adultos, vem sendo
substituída pela classificação proposta por Hasle et al. em 2003, por este grupo de pacientes
apresentar características particulares, como por exemplo a associação de doenças genéticas,
como a Síndrome de Down. Portanto, já existindo uma pré-disposição para o
68
desenvolvimento de neoplasias. Em nosso estudo foi utilizada a classificação proposta por
Hasle et al. (2003) em 64 pacientes sendo identificados os seguintes subtipos: 35 casos de CR,
14 casos de AREB, 10 casos de AREB-t e 5 casos de LMMJ, sendo dois pacientes portadores
de Síndrome de Down (1 AREB, 1 AREB-t). As idades dos pacientes variaram de 5 meses a
18 anos.
Existem poucos estudos com um grande número de pacientes com SMD primária na
infância devido a sua raridade. Entretanto, estudos multicêntricos ou de um longo período de
acompanhamento demonstraram que a incidência de alterações cromossômicas é de 40 a 80%.
Estes estudos revelaram uma alta freqüência de anormalidades citogenéticas, principalmente
nos subtipos mais agressivos da doença como AREB e AREB-t (LUNA-FINEMAN et al,
1999; SASAKI et al, 2001; POLYCHRONOPOULOU et al, 2004; LOPES et al, 2006). Em
três pacientes do nosso estudo não foi possível a obtenção de mitoses para o estudo do padrão
cromossômico. Anormalidades cromossômicas foram detectadas em 72% dos 61 casos
estudados. Com relação à distribuição da freqüência de alterações cromossômicas por subtipo
foi verificado que dos 33 pacientes com CR, 18 pacientes (54,5%) apresentaram cariótipos
anormais, nos subtipos mais avançados da doença a freqüência de casos com alterações
cromossômicas foi maior, sendo verificada em 11 (85%) dos 13 pacientes com AREB, em 10
pacientes com AREB-t (100%) e em 5 pacientes com LMMJ (100%). Nossos resultados são
semelhantes aos descritos na literatura, entretanto, tem sido descrita a presença de cariótipos
normais em pacientes portadores de LMMJ, fato não encontrado no presente estudo.
A variação na porcentagem de casos com alterações cromossômicas pode ser creditada
a diversos fatores como variações no número de mitoses analisadas ou amostragem com
tendências para subtipos específicos. Assim, em estudos contendo um maior número de casos
de AREB e AREB-t, o índice de anormalidades cromossômicas é elevado. Em nosso estudo,
procuramos analisar um grande número de metáfases por paciente, uma vez que no subtipo
69
inicial da SMD na infância, CR, o clone citogeneticamente anormal pode ser muito pequeno,
ao contrário do que acontece nos subtipos mais avançados da doença (AREB, AREB-t e
LMMJ).
Nossos resultados mostraram no subtipo CR a presença de células com cariótipos
normais e células com cariótipos anormais. Dente as células com cariótipos anormais
observamos as seguintes alterações: del(3p), del(5q), del(6q), -7, del(9p), del(11q), del(12p),
del(17p), +mar e cariótipos complexos. Nos subtipos AREB e AREB-t e LMMJ a incidência
de cariótipos normais foi baixa, sendo encontradas diversas anomalias citogenéticas como:
inv(1q), t(5;8), inv(5q), del(6q),-7, del(7q), +8, i(9q), add(9q), del(11q), +16, der(17), -19 e
cariótipos complexos. Ao contrário do que é encontrado em outras neoplasias hematológicas
(leucemias e linfomas), não tem sido possível estabelecer uma correlação entre anomalias
citogenéticas e subtipos de SMD. Dessa forma, assim como em outros estudos (LUNA-
FINEMAN et al., 1999; HARBOTT et al., 2000), nossos resultados sugerem a ausência de
uma alteração específica correlacionada com um subtipo da doença.
Neste estudo as anomalias cromossômicas mais freqüentes foram: as alterações
envolvendo o cromossomo 7 (18%); cariótipos complexos (14%), a del(11)(q23) (11%), e a
del(17)(p12) (9%). Portanto, assim como na SMD do adulto, as alterações cromossômicas em
SMD primária na infância são caracterizadas principalmente por perdas parciais ou totais de
cromossomos, com uma incidência relativamente alta também de ganho cromossômico e
ocorrendo em menor incidência as translocações cromossômicas. O padrão citogenético em
SMD primária sugere a inativação de genes supressores tumorais (ou sua haploinsuficiência)
necessária para o desenvolvimento de células hematopoéticas normais, principalmente as da
linhagem mielóide.
As alterações cromossômicas mais freqüentes em SMD primária na infância são: a
monossomia de 7 e a deleção 7q (AKTAS & TUNCBILEK, 2006). Estas alterações estão
70
associadas com mau prognóstico e elevado risco de transformação leucêmica. Nestes casos
têm sido sugerido o transplante de medula óssea alogenêico, principalmente em estágios
iniciais da doença (KARDOS et al, 2003). Vale a pena ressaltar, a importância da citogenética
selecionando pacientes com baixa contagem de blastos na medula óssea, para tratamentos
mais agressivos como o TMO. Esse fato aconteceu durante a realização deste estudo em dois
pacientes, um apresentando CR com a alteração cromossômica –7, +20, e o outro
apresentando AREB (com 7% de blastos na medula óssea) com a alteração cromossômica 7q-
Hoje, ambos pacientes estão vivos desempenhando suas funções normais e apresentando uma
boa qualidade de vida. Nossos resultados mostraram que dos 8 pacientes que apresentaram
alterações cromossômicas envolvendo o cromossomo 7, 4 (50%) evoluíram da doença e 6
(75%) foram a óbito.
Cariótipos complexos corresponderam ao segundo tipo de alteração cromossômica de
maior incidência em nosso estudo. Esta alteração esteve associada com todos os subtipos. Um
cariótipo complexo envolve três ou mais alterações cromossômicas, estruturais e/ou
numéricas e está associado com mau prognóstico. A hiperdiploidia é considerada um cariótipo
complexo. A hiperdiploidia I (número cromossômico modal maior que 46) é observada em
várias crianças com diferentes neoplasias como a LLA e sua presença confere um prognóstico
favorável (PUI, 1995). Já hiperdiploidia II (mais de 70 cromossomos), uma marca nos
tumores anaplásicos, em combinação com translocações pode identificar pacientes com alto
risco de apresentarem falha ao tratamento (DOUGLAS et al., 1986). Em nosso estudo
tivemos quatro casos de hiperdiploidia, dois associados com alteração cromossômica
estrutural, a duplicação do braço longo do cromossomo 1. Somente um paciente era do
subtipo inicial da doença CR, os outros três eram portadores de AREB e AREB-t. Poucos
estudos em SMD na infância correlacionaram o valor prognóstico da hiperdiploidia em SMD
na infância. Acar et al. (2001) descreveram uma criança com SMD hipocelular apresentando
71
hiperdiploidia associada com mau prognóstico, no entanto, esta criança apresentava alterações
congênitas. Portanto, em SMD da infância é necessário que um maior número de pacientes
com hiperdiploidia sejam estudados para definição do seu valor prognóstico.
A deleção do braço longo do cromossomo 11 na região q23 foi a terceira alteração mais
freqüente em nosso estudo. Nesta região cromossômica está mapeado o gene MLL,
frequentemente envolvido em leucemias agudas da infância (LLA e LMA). Geralmente, esse
gene está associado a alterações cromossômicas do tipo translocação, conferindo mau
prognóstico (MATHEW et al., 1999). De acordo com o IPSS alterações envolvendo o
cromossomo 11 são consideradas de prognóstico intermediário, no entanto, nossos resultados
sugerem que esta alteração está envolvida em casos de evolução da SMD (CR para AREB),
sendo necessário o estudo de um maior número de casos que confirmem esse achado.
A deleção do braço curto do cromossomo de 17 também apresentou uma significativa
incidência (10%) na nossa amostra, esta alteração é apontada segundo o IPSS como
prognóstico intermediário. Em nossos pacientes, a del(17p) esteve presente nos subtipos
iniciais CR e em casos com medula óssea hipocelular. Nestes casos vale a pena ressaltar o
valor da citogenética como um diagnóstico diferencial entre SMD hipocelular e anemia
aplástica, onde a presença de uma alteração cromossômica clonal carateriza a SMD. Esse
dado é muito importante, pois ambas as doenças são indicadas para o TMO alogenêico, no
entanto, o condicionamento pré-TMO é específico para cada doença (YOUNG et al., 2006;
DONEY et al., 1997). A nivel morfológico a del(17p) esteve associada com uma dispoese
significativa no setor granulocítio, ocorrendo a presença de células Pelguer-Hüet e assência de
granulações. Essas crianças apresentaram sérias infecções e foram indicadas para o
transplante de medula óssea apresentando uma boa resposta ao tratamento. Na literatura não
existem relatos da del(17p) na SMD na infãncia e seu valor prognóstico.
72
A trissomia do cromossomo 8 foi observada em 8% do total de casos analisados, esta
alteração cromossômica esteve presente em casos de AREB e AREB-t, estes pacientes
apresentaram evolução para LMA e faleceram. A trissomia do cromossomo 8 é a alteração
numérica mais comum em SMD primária nos adultos e parece ser predominante no sexo
masculino. Não se associa a um subtipo específico, mas geralmente se apresenta com
citopenia de uma ou três linhagens (CHAUFFAILLE, 2006). Pacientes com trissomia de 8
como anomalia isolada têm risco significativamente maior de transformação leucêmica e pior
comportamento do que esperado para o grupo intermediário de prognóstico segundo o IPSS,
fato que lança dúvidas quanto a definição prognóstica. Solé et al. (2000) e Fernandez et al.
(2000) sugerem que alterações envolvendo o cromossomo 8 estão associadas com mau
prognóstico e risco aumentado de transformação leucêmica.
A deleção do braço longo do cromossomo 5 foi observada em apenas um dos nossos
pacientes. Esta alteração cromossômica é extremamente rara em crianças. Uma revisão da
literatura descrita por Pitman et al. (2006) mostraram apenas 7 casos. Em SMD primária nos
adultos a del(5q) apresenta características morfológicas e clínicas específicas sendo
reconhecida como a Síndrome 5q-, entidade adotada pela classificação OMS. A clássica
síndrome 5q- foi descrita pela primeira vez em 1974 por Van den Berghe e colaboradores.
Esta alteração ocorre predominantemente em indivíduos do sexo feminino e idades
avançadas, estando relacionada com bom prognóstico e baixo risco de transformação
leucêmica. Entretanto, os poucos casos descritos na literatura apresentando del(5q) na infância
estiveram associados com mau prognóstico (PITMAN et al., 2006). Em nosso estudo, um
paciente do sexo feminino, de 13 anos de idade apresentou a del(5q) como única alteração
citogenética. Através da análise por FISH foi detectada a perda em um dos alelos do gene
c-fms localizado na região q33q34. Este gene codifica o receptor de crescimento de
macrófago e apresenta uma função importante para a proliferação e diferenciação de células
73
mielóides (KRYSINSKA et al., 2007). Um grande número de genes codificando fatores de
crescimento e receptores de fatores de crescimento tem sido localizados no braço longo do
cromossomo 5 na região 5q23q33. Isso inclui IL-3, IL-5, IL-9 e GM-CSF. Análises
moleculares detalhadas da anomalia 5q- têm demonstrado inversões submicroscópicas e
duplicações adjacentes nesta região, assim como deleções ou mutações de c-fms (BARTRAM,
1996; CRESCENZI et al., 2004). Dessa forma, é provável que a perda desta região esteja
diretamente envolvida com com desenvolvimento da doença. Devido à presença de citopenias
graves, nossa paciente foi indicada para o TMO alogenêico. Atualmente 15 meses pós TMO,
se encontra com 100% de quimerismo.
Clones citogeneticamente não relacionados (alteração cromossômica biclonal)
correspondem a um achado extremamente raro em doenças hemotólogicas. Em SMD, esta
alteração tem sido descrita com uma freqüência de 4.3-6.5% (HAN et al, 2006). Em nosso
estudo, foi observado um paciente com SMD hipocelular com a alteração cromossômica
biclonal, envolvendo os cromossomos 17 e 11. A freqüência da alteração citogenética biclonal
foi de 1,6%. Ainda não é claro, se clones citogeneticamente não relacionados indicam uma
verdadeira biclonalidade da doença hematológica ou se é um resultado de uma evolução
clonal de um precursor em comum. Nós acreditamos na hipótese de que clones não
relacionados cariotipicamente se originam de um clone maligno comum através de mudanças
moleculares submicroscópicas e processos de evolução. O clone com del(17p) adquiriu uma
segunda alteração del(12p) sugerindo evolução da doença. Neste caso, a análise por FISH
detectou a ausência dos alelos dos genes p53 e MLL, confirmado a deleção do braço curto do
cromossomo 17 e a deleção do braço longo do cromossomo 11, respectivamente. O clone
contendo a del(11q) estava presente em pequeno número, sendo visto em apenas 3 das 51
células analisadas, dessa forma a técnica de FISH foi fundamental para a confirmação desta
alteração. As alterações mais freqüentes descritas envolvendo clones não relacionados foram:
74
del(5q), +8, del(20q), del(7q),+11, +21 e –22 (HAN et al, 2006). De acordo com uma revisão
da literatura, este representa o primeiro caso de SMD pediátrica mostrando o envolvimento
destas alterações cromossômicas em SMD hipocelular- CR.
As alterações cromossômicas associadas à SMD são, na imensa maioria das vezes,
detectadas pela citogenética clássica, mas há casos, em particular aqueles em que ocorre
ausência de metáfases ou com clones pequenos, nos quais a anormalidade cromossômica não
é identificada pela técnica de bandeamento G, mas diagnosticada por FISH. Já foi
demonstrado que clones pequenos são mais bem detectados por citogenética molecular
(FISH) (CHAUFFAILLE et al., 2006). Além disso, a análise por FISH auxilia na confirmação
de alterações cromossômicas e estabelecimento de pontos de quebra. Pela técnica de FISH um
grande número de células podem ser examinadas e alterações cromossômicas específicas
podem ser detectadas, tanto em interfase quanto em metáfases. No entanto, esta técnica
apresenta algumas limitações, uma dessas limitações envolve a incapacidade de detecção de
anormalidades envolvendo regiões que não estejam na região da sonda (PANANI &
ROUSSOS, 2005). Estudos estabelecendo vantagens e desvantagens da análise cariotípica
clássica e FISH, sugerem que a combinação das duas metologias pode levar a um diagnóstico
mais acurado (ROMEO et al, 2002) .
Aplicamos a metodologia da citogenética molecular-FISH para afastar alterações
cromossômicas de mau prognóstico, nos casos sem mitose ou quando o índice mitótico foi
muito baixo, e para confirmação de alterações cromossômicas previamente identificadas pela
citogenética clássica.
Devido à importância da citogenética esta foi incorporada em escalas prognósticas. O
Sistema Internacional de Escala Prognostica (IPSS) utiliza como variáveis prognósticas a
porcentagem de blastos na medula óssea, as alterações citogenéticas e o número de citopenias
para separar os pacientes em quatro grupos de risco. O IPSS tem mostrado grande valor
75
prognóstico para adultos com SMD. No entanto, alguns estudos sugerem que os fatores
prognósticos que predizem a sobrevida ou progressão em adultos são de pouco valor para
crianças (HASLE et al, 2004). Nós verificamos que dos 61 pacientes 33 (54%), foram
classificados como intermediário 1, 12 (19,6%) intermediário 2 e 16 (26%) alto risco. Em um
estudo japonês com crianças com SMD, a sobrevida diferiu entre os grupos de risco
citogenético adotado pelo IPSS (SASAKI et al, 2001). Estudos encontraram uma tendência
para uma sobrevida maior no grupo citogenético de risco intermediário (HASLE et al, 2004;
PASSMORE et al., 2003). Nossos dados revelaram que pacientes classificados como
intermediário 1, tiveram uma menor taxa de óbito. Não foram identificados pacientes de baixo
risco. Este fato aconteceu devido a todos os nossos pacientes com CR apresentarem 2
citopenias (anemia e neutroponia; anemia e trombocitopenia; neutropenia e trombocitopenia),
recebendo pontuação 0,5. Esta escala revelou que pacientes de alto risco apresentaram uma
alta probabilidade de transformação leucêmica e alta taxa de óbito. Mesmo quando protocolos
mais agressivos de tratamento foram utilizados, como TMO alogenêico, a resposta foi muito
baixa.
Várias estratégias terapêuticas vêm sendo utilizadas no tratamento para SMD da
infância e LMMJ. Um estudo brasileiro revisando os tipos de tratamentos aplicados em
crianças com SMD, verificou que as modalidades de tratamentos são muito heterogêneas não
havendo um grupo cooperativo com protocolo específico (VALERA et al, 2004). Devido a
SMD ser uma doença de célula tronco imatura, é considerada uma doença incurável quando
terapias convencionais são utilizadas. Atualmente o TMO permanece como a única opção
curativa para este grupo de pacientes, no entanto, para aquelas crianças que o TMO não é
possível, outras modalidades terapêuticas como quimioterapia, fatores de crescimento e
diversos outros agentes terapêuticos, são utilizados objetivando diminuir o número de
citopenias.
76
Nosso estudo mostrou que a melhor opção de tratamento para crianças com SMD
primária foi o TMO alogenêico. Entretanto, alguns pacientes apresentaram doença enxerto
versus hospedeiro, comprometendo a qualidade de vida dessas crianças. Apesar do TMO
alogênico ser o único tratamento atual que proporciona a cura, ele apresenta uma série de
complicações. Dentre essas complicações podemos citar aquelas relacionadas com a
recuperação da função medular, como um longo período de aplasia e o mais grave, a doença
enxerto versus hospedeiro, que dependendo do grau de severidade pode levar à morte.
Dessa forma é de extrema importância o conhecimento da biologia da SMD primária,
na tentativa de elaborar novas formas de tratamento. Neste sentido, a identificação de
alterações no padrão de metilação em genes supressores de tumor em SMD em adultos tornou
possível o desenvolvimento e a utilização de protocolos de tratamento que utilizam agentes
desmetilantes.
Alguns grupos já demonstraram a freqüência e a importância da hipermetilação na
região promotora de alguns genes como p15INK4B
e p16INK4A, que estão envolvidos no controle
do ciclo celular, e no gene CALCA (calcitonina) que está envolvido com a regulação dos
níveis de cálcio no sangue em pacientes adultos com SMD. A freqüência de metilação do
gene p15INK4B em adultos com SMD ou leucemia aguda (LA) variou de 38% a 69% (UCHIDA
et al., 1997; QUESNEL et al, 1998; HOFMANN et al, 2006), podendo ser verificada no
diagnóstico ou durante a progressão da doença (TIEN et al, 2001).
Entretanto, apenas dois estudos mostraram a presença de metilação em SMD primária
na infância (HASEGAWA et al, 2005; VIDAL et al, 2006). Isso nos levou a investigar a
presença de metilação na região promotora dos genes p15INK4B
e p16INK4A em 45 crianças com
SMD primária da infância, incluindo 25 do subtipo AR, 11 AREB, 7 AREB-t e 2 LMMJ pelo
método MSP. Metilação em pelo menos um destes genes foi verificada em 40% (18/45) dos
pacientes.
77
A freqüência de metilação no gene p15INK4B
nos nossos pacientes com SMD da
infância foi de 35,5% (16/45). Hasegawa et al. (2005), em um estudo similar, apresentou uma
freqüência superior de metilação neste gene (78%), esta diferença pode estar relacionada ao
fato da maioria dos seus pacientes terem sido classificados dentro dos subtipos mais
agressivos AREB e LMMC ou em um subtipo duvidoso entre SMD e LMA-M6, o qual ele
denominou de AREB/M6. Outro estudo demonstrou uma freqüência de metilação em p15INK4B
de 50%, sendo também todos os pacientes classificados dentro dos subtipos AREB e AREB-t
(VIDAL et al, 2006). Em nosso estudo as maiores freqüências de metilação para o gene
p15INK4B estiveram presentes nos subtipos mais agressivos de SMD como AREB, AREB-t e
LMMJ, com as freqüências de 54,5% e 71,5% e 50% respectivamente. No subtipo menos
agressivo da doença como CR, a freqüência de metilação foi mais baixa sendo observada em
16% dos pacientes. Hasegawa et al., em uma população de 18 pacientes classificados com
LMMJ detectou metilação em apenas 17% dos casos.
A metilação de vários genes tem sido associada a um pior prognóstico em pacientes com
leucemia aguda (LA), como por exemplo, o gene da calcitonina em LLA (GARCIA-
MANERO et al., 2002) e o gene MDR1 em LMA (GUARCIA-MANERO, 2003). No entanto,
metilação no gene ER foi associada com um bom prognóstico em pacientes com LMA
(TOYOTA et al., 2001). Em adultos com SMD, a metilação do gene p15INK4B
esteve
associada com estágio agressivo da doença (AREB e AREB-t), sugerindo exercer um papel na
progressão e evolução para LMA (UCHIDA et al., 1997; QUESNEL et al., 1998). Em SMD
pediátrica tem sido verificada uma alta freqüência de metilação do gene p15INK4B, no entanto,
estes estudos não indicam se esta alteração está associada a bom ou mau prognóstico
(HASEGAWA et al., 2005). Dos 45 pacientes estudados para o padrão de metilação 17
mostraram evolução da doença e 9 (53%) desses pacientes tiveram metilação em p15INK4B. Os
nossos dados mostraram que metilação do gene p15INK4B provavelmente está envolvida no
78
processo de evolução da doença em direção à LMA, sugerindo que a proliferação de células
leucêmicas pode requerer um escape da regulação da fase G1 do ciclo celular.
A proteína codificada pelo gene p16INK4A age também como um regulador negativo do
ciclo celular, inibindo a ação das proteínas CDK4/6. Além disso, está associada ao processo
de diferenciação celular e manutenção da homeostase durante a diferenciação da linhagens
eritróides (MINAMI et al, 2003). Estudos têm demonstrado silenciamento deste gene por
metilação em tumores sólidos, como carcinoma hepatocelular (FUKAI et al, 2005). No
entanto, em malignidades hematológicas a freqüência de metilação neste gene é baixa ou nula
(TOYOTA et al., 2001; GARCIA-MANERO et al., 2002; HASEGAWA et al., 2005;
HOFMANN et al., 2006). Vidal et al. (2006) analisando o padrão de metilação de vários
genes em SMD da infância, não detectou metilação no gene p16 em nenhum dos pacientes
analisados. O mesmo resultado foi obtido por Hasegawa et al. (2005). Dos nossos 45
pacientes, apenas 4 (8,8%) apresentaram metilação neste gene. Todos os pacientes positivos
para metilação no gene p16INK4A estavam classificados dentro dos subtipos mais agressivos
AREB e AREB-t. Dessa forma, concordando com os dados da literatura, nossos resultados
mostraram uma baixa freqüência de metilação no gene p16INK4A, sugerindo que provavelmente
este não seja o principal evento envolvido na patogênese da SMD, tanto em adultos quanto
em crianças.
Metilação aberrante em ambos os genes foi vista em apenas 2 (4,4%) dos 45 pacientes
analisados. Embora o número de pacientes seja pequeno, a metilação em ambos os genes
p15INK4B e p16
INK4A revelou ser um pior prognóstico para pacientes com SMD da infância,
visto que os pacientes evoluíram da doença e foram a óbito.
Em nosso trabalho estudamos a correlação entre a presença de uma alteração
cromossômica específica com a metilação na região promotora dos genes p15INK4B e p16
INK4A.
Nossos resultados sugerem um forte associação envolvendo alterações no cromossomo 7
79
(-7/del7q) e metilação do gene p15INK4B, levando à evolução da doença. Além disso,
observamos associação entre a del(11)(q23) e alteração no padrão de metilação nos genes
p15INK4B e p16
INK4A, relacionados também com a evolução da doença. Não foi encontrada
correlação entre alterações citogenéticas e presença de metilação em vários genes em
pacientes adultos e crianças com malignidades hematológicas primárias (LLA, LMA e SMD)
(GARCIA-MANERO et al., 2002). No entanto, Au et al.(2003) verificaram uma forte
correlação entre metilação do gene p15INK4B e alterações cromossômicas envolvendo o
cromossomo 7 (-7/7q-) em pacientes adultos com SMD secundária. Dos nossos 16 pacientes
positivos para a metilação no gene p15INK4B, 7 (44%) possuíam alterações envolvendo o
cromossomo 7, sugerindo que a metilação pode ser uma outra característica que confere a este
grupo de pacientes um pior prognóstico. No entanto, um estudo com maior número de
pacientes, é necessário para confirmar o nosso achado.
Embora algumas das alterações citogenéticas estejam associadas a um pior
prognóstico, as alterações moleculares envolvidas na iniciação e evolução desta doença
permanecem desconhecidas. Alguns estudos levantam a seguinte questão: se alterações
cromossômicas detectadas em SMD primária são eventos iniciais que levam ao
desenvolvimento da doença (causa) ou se são apenas fenômenos secundários (conseqüencia)
(CHAUFFAILLE, 2006). De acordo com a teoria de multíplas etapas, nossos resultados
sugerem que as alterações cromossômicas são eventos intermediários, desencadeando uma
grande instabilidade genética. A aquisição de alteração no padrão de metilação da região
promotora dos genes p15INK4B e p16
INK4A seria um evento mais tardio, associado com a
transformação leucêmica. Seguindo este modelo uma provável via de evolução em SMD
primária na infância seria a associação -7/del(7q) e metilação em p15INK4B.
Nossos resultados apresentam implicações potenciais para a classificação e prognóstico
da SMD primária na infância. A detecção de metilação anormal em genes de pacientes com
80
SMD da infância pode ter um grande potencial como um fator prognóstico, podendo também
ser utilizado na identificação de pacientes que podem ser beneficiados pelo tratamento com
inibidores da metilação.
81
6. CONCLUSÕES
� A SMD primária na infância apresenta uma alta freqüência de alterações cromossômicas
(72%);
� O estudo citogenético mostrou que o padrão cariotípico da SMD primária na infância é
caracterizado principalmente por perdas parciais ou completas de cromossomos (deleções e
monossomias) e ganhos cromossômicos (trissomias);
� As translocações cromossômicas são encontradas com uma menor freqüência;
� A análise citogenética mostrou ser essencial no processo de diagnóstico de todos os casos
de suspeita de SMD pediátrica e foi uma importante ferramenta para a escolha do tratamento;
� As anomalias cromossômicas de maior freqüência neste estudo foram as alterações
envolvendo o cromossomo 7 (-7/ 7q-), cariótipos complexos, del(11)(q23) e del(17)(p12);
� A metilação da região promotora do gene p15INK4B é um evento frequente em subtipos
mais avançados da SMD primária na infância e está associada com a transformação
leucêmica.
� A metilação na região promotora do gene p16INK4A é um evento raro em SMD primária
na infância, estando possivelmente associada com a evolução da doença;
� A correlação entre o padrão de metilação em p15INK4B
e p16INK4A e alterações
cromossômicas específicas mostrou uma forte associação entre -7/7q- e metilação em
p15INK4B, sugerindo uma provável via de evolução da doença;
� As alterações cromossômicas, -7/7q-; +8 e del(11)(q23), e a presença de metilação em
p15INK4B
e p16INK4A estão associadas com mau prognóstico, sendo prováveis marcadores
biológicos de evolução da doença.
82
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94
8. ANEXOS 8.1 Anexo 1
95
96
97
TERMO DE CONSENTIMENTO INFORMADO E ESCLARECIDO A – JUSTIFICATIVA A síndrome mielodisplásica (SMD) é considerada um estado pré-leucêmico, cerca de 10 a 40% dos casos evoluem para leucemia mielóide aguda (LMA). As causas principais de óbito estão associadas com infecções de repetição, devido à queda de glóbulos brancos; sangramentos, devido à queda de plaquetas; além da presença de cansaço, devido a anemia refratária (que não responde ao tratamento). Para estes pacientes é necessário transfusões sanguíneas periódicas. Atualmente é o transplante de medula óssea (TMO) que pode proporcionar a cura para um grupo de pacientes com faixa etária até 55 anos. Para o grupo de pacientes com idade superior aos 55 anos é oferecido tratamento com outros métodos (por exemplo: transfusões sanguíneas, uso de fatores de crescimento entre outros). Para os pacientes com SMD independente da idade é necessário a investigação diagnóstica, pois em alguns casos esta doença pode ser semelhante a anemia aplástica grave ou uma doença mieloproliferativa. Este diagnóstico é possível através de testes realizados no sangue e em amostras de medula óssea, utilizando modernas técnicas de citogenética e de biologia molecular. O emprego destas técnicas é fundamental no diagnóstico diferencial e é importante quanto à decisão do regime preparatório (quimioterapia e ou radioterapia) para o TMO. Além disso, alguns estudos relatam que os pacientes com SMD devem ser transplantados no início da doença, antes do aparecimento de células leucêmicas na medula óssea (diagnóstico precoce). Desta forma, a detecção de um pequeno número de células anormais caracterizado a nível citogenético e/ou molecular está relacionado a um curso clínico pós-transplante favorável. Estamos realizando este estudo para definir quais são os testes mais eficientes na identificação de marcadores citogenéticos e moleculares para um diagnóstico inicial e para a caracterização de estágios de transformação leucêmica. B – DESCRIÇÃO DO PROGRAMA Este estudo propõe a análise das características citogenéticas e moleculares de amostras de medula óssea de pacientes e de doadores. Serão colhidas amostras de sangue e de medula óssea (mielograma) para realização dos testes. Ressaltamos que estas amostras são necessárias para todos os pacientes para auxiliar o diagnóstico. Não estaremos realizando nenhum procedimento adicional aos da rotina. Os pacientes serão submetidos a biópsia, sendo o material enviado para estudo no serviço de Patologia. As técnicas de coleta de material são as mesmas aplicadas na rotina do serviço. Os resultados obtidos serão relacionados com quadro clínico dos pacientes, afim de contribuir o para o diagnóstico e prognóstico do mesmo. C – INFORMAÇÕES GERAIS As informações obtidas serão tratadas de forma confidencial e utilizadas para avaliação proposta bem como para o estabelecimento de um programa de melhoria na rotina de diagnóstico e definição do estágio da doença. Este é um benefício real para você e outros pacientes participantes do programa. Você não será identificado em nenhuma apresentação ou publicação. Não haverá qualquer ressarcimento pela participação no estudo. A qualquer momento o paciente e doador poderá desistir da participação, sem contudo apresentar prejuízo quanto ao seguimento do tratamento a ser realizado nesta instituição. Nos casos de necessidade de atendimento este será prestado, como habitualmente, na unidade de pacientes externos e internos das instituições Em caso de dúvidas quanto ao protocolo, o contato no Comitê de Ética em Pesquisa
98
Divisão de Assistência Médica
TERMO DE CONSENTIMENTO INFORMADO
Nome: _______________________Data de nascimento: _____________Idade: ____
Endereço:________________________________________Bairro: _______________
Cidade:____________________Estado:_______________CEP: _________________
Telefone: _______________________
Membro da equipe: _________________________ Carimbo: ____________________
Declaro que:
- Entendo que estarei participando deste estudo conforme informações obtidas acima
e com esclarecimento do médico.
- Entendo que as amostras de sangue e medula óssea estarão sendo colhidas
conforme o protocolo de rotina do serviço e que nenhum procedimento adicional será
necessário para o estudo.
- Entendo que não serei ressarcido por participar deste estudo.
- Entendo que as informações obtidas serão confidenciais e em nenhuma publicação
serei identificado.
- Consinto que as informações sejam utilizadas para publicações e apresentações.
- Consinto que as informações sejam utilizadas para um programa que beneficiará
pacientes prè e pós-transplante de medula óssea com diagnóstico de Síndrome
Mielodisplásica Primária.
Em conseqüência aceito, nos termos acima, participar deste estudo:
Data: __________________________
Assinatura do Médico: ________________________________________________
Assinatura do Paciente:________________________________________________
Em caso de Paciente menor de idade:
Assinatura do responsável (legal): _______________________________________
Testemunhas:
1)_______________________________________
2) _______________________________________
99
8.2 Anexo 2
8.2.1 Cariótipos
100
Paciente 2, 13 anos, masculino, CR. Cariótipo:46,XY,del(17)(p12)/46,XY,del(17)(p12),del(12)(p13)/46,XY,del(11)(q23).
101
Paciente 3, 9 anos, masculino, CR. Cariótipo: 46,XY,del(3)(p23).
102
Paciente 5, 3 anos, masculino, CR. Cariótipo: 46,XY,+der(3)del(3)(q21),-7,-9,+mar.
103
Paciente 6, 13 anos, feminino, CR. Cariótipo: 46,XX,del(5)(q15q35).
104
Paciente 8, 14 anos, masculino, CR, Cariótipo: 46,XY,del(11)(q23).
105
Paciente 9, 7 anos, feminino, CR. Cariótipo: 46,XX,del(12)(p13).
106 Paciente 27, 14 anos, masculino, CR. Cariótipo: 46,XY,del(17)(p12).
107
Paciente 36, 17 meses, feminino, AREB. Cariótipo: 47,XX,der(17)t(1?;17)(q32?,p13),+21c.
108
Paciente 38, 2 anos, masculino, AREB. Cariótipo: 45,XY,-19.
109
Paciente 39, 9 meses,masculino, AREB. Cariótipo: 46,XY,del(6)(q23).
110
Paciente 40, 5 anos, masculino, AREB. Cariótipo: 47,XY,+8.
111 Paciente 42, 7 anos, feminino, AREB. Cariótipo: 46,XX,i(9)(q10).
112
Paciente 50, 2 anos, feminino, AREB-t. Cariótipo: 46,XX,t(4;7)(p16;p15).
113
Paciente 51, 4 anos, feminino, AREB-t. Cariotipo: 49,XX,dup(1)(q21q32),+6,+8,+mar.
114
Paciente 52, 1 anos, masculino, AREB-t. Cariótipo: 46,XY,inv(1)(q21),add(9)(q34).
115
Paciente 53, 10 anos, masculino, AREB-t. Cariótipo: 45,XY,-7.
116
Paciente 56, 5 anos, masculino, AREB-t. Cariótipo: 46,XY,t(5;8)(q32;q22).
117
Paciente 58, 12 anos, masculino, AREB-t. Cariótipo: 58,XY,+8,+13,+13,+14,+15,+20,+21c,+21,+21,+21,+22,+22.
118
Paciente 60, 21 meses, feminino, LMMJ. Cariótipo: 46,XX,inv(5)(q11q21),-9,+mar.
119
Paciente 61, 2 anos, masculino, LMMJ. Cariótipo: 47,XY,+16.
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