'O Lago'-1928

Controle biológico de Produtos Farmacêuticos

Esterilidade(1932 na Inglaterra, primeiro teste)

• Conceito: total ausência de formas viáveis capazes de reprodução.

• Estatisticamente: esterilidade é um termo absoluto que não pode ser garantido.

• USP-33: a condição de esterilidade de um produto deve ser considerada quando o processamento ocorreu em condições adequadas e a análise de uma amostra representativa do lote, submetida ao teste de esterilidade, indique ausência de micro-organismos viáveis.

Teste de EsterilidadeTeste de Esterilidade

Produto1.000 mL

Filtração em membrana

200 mL

tioglicolato caseína-soja

14

dias

TESTE DE ESTERILIDADE “INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADO”

negativo

positivo

APROVAR O LOTE

positivo

negativo

•Revisão de registros da produção;

• Verificar possibilidade de contaminação acidental;

• Realizar RETESTE

positivo negativo

APROVADOREPROVADO

REPIQUE (+ 4 dias)

positivo negativo

APROVADOREPROVADO

Coleta de amostraColeta de amostra

• Os testes de esterilidade e de Os testes de esterilidade e de pirogêniopirogênio são são realizados em diferentes etapas críticas do realizados em diferentes etapas críticas do processo, mas seguindo o mesmo roteiro.processo, mas seguindo o mesmo roteiro.

Amostragem:( de acordo com a monografia ou tabelas)

exemplos:

PREPARO DA AMOSTRA

• A natureza da amostra exige preparação prévia para que o resultado do teste seja válido

Cuidados:

• - Proceder a desinfecção externa dos frascos, ampolas, materiais de acondicionamentos ou embalagens com soluções anti-sépticas por imersão ou nebulização. Tempo de contacto determinado experimentalmente;

• - Solução para desinfecção: fenol 5%, álcool iodado, formaldeido 5%, álcool isopropílico,etc;

• - Violação da amostra somente no momento da inoculação no meio de cultura;

• - Agitar o frasco e retirar, assepticamente, um número suficiente de unidades, ou volume de cada meio.

Limitante do Teste de Esterilidade

• Os testes de esterilidade não detectam a presença de impurezas tóxicas.

Impurezas tóxicas: substâncias que, por ação direta, ou indireta sobre um órgão, ou sistema passam a produzir alterações nocivas

ao paciente.

“Algumas dessas substâncias são classificadas como PIROGÊNICAS”

PIROGÊNIO

São “COMPOSTOS” QUE, QUANDO EM CONTATO COM O SANGUE, DESENCADEIAM REAÇÃO FEBRIL

Os pirogênios não são eliminados das preparações pelos processos de esterilização convencionais e também apresentam um elevado grau de termoestabilidade.

FEBRE

• É definida como uma elevação controlada da temperatura interna do indivíduo acima dos níveis normais, decorrente da elevação do ponto de regulagem hipotalâmico.

DINARELLO et al. 1988

PIROGÊNIO

FEBRE• É uma resposta fisiológica complexa a infecção ou lesão;• É o primeiro componente da resposta de fase aguda (RFA)

a ser observada na resposta inflamatória.Hasday et al., 2000

• A RFA é uma reação imediata e complexa a agressões, como:– Infecções:

• Bacterianas;• Virais;• Parasitária.

– Traumas:• “Químicos”;• Mecânicos;• Térmicos;

– Necrose isquêmicas;– Tumores– “Tóxinas”

Koj, 1996

PIROGÊNIO

PIROGÊNIO

Centanni - última década do século XIX: isolamento de toxina bacteriana responsável pela febre;

Hort e Penfold – febre das injeções (material estéril, porém pirogênio) 1912: teste de pirogênio em coelhos;

Seibert - 1923: pirogênios filtráveis e termoestáveis.esterilidade ≠ apirogenicidade (exige controle em todos os estágios da

produção)

USP XII – 1942: desenvolvimento do primeiro teste oficial em coelhos;

Shear e Turner – termo lipopolissacarídeo (LPS);

Atualmente sabe-se que a porção lipídica do LPS, uma endotoxina, é responsável pelas reações biológicas.

Histórico

Lipopolissacarídeo (LPS)

• Também conhecido como endotoxina é uma molécula altamente tóxica derivada da membrana celular externa de bactérias gram-negativas.

Fonte: GIROIR, B.P. Mediators of septic shock: new approaches for interrupting the endogenous inflammatory cascade. Crit. Care Med., v.21, p. 780-9, 1993.

Estrutura do LPS

•O antígeno O (polissacarídeos) varia em composição e comprimento entre as bactérias Gram -;

•O núcleo e o lipídeo A são mais constantes. (conservados entre diferentes espécies) ;

•O lipídeo A é o principal

responsável pela toxicidade da endotoxina.

LPS

(presente na parede das bactérias Gram -)

Endotoxina

Nos produtos farmacêuticos podem ser

encontradas unidades não purificadas nas

etapas do processo, ou no produto acabado –

POR ISSO USA-SE A TERMINOLOGIA

ENDOTOXINA;

Para a industria farmacêutica o termo

endotoxina se refere a LPS, o pirogênio mais

significativo.

PIROGÊNIO

Endotoxina(exógena, estão no interior do corpo mas foram “formadas” fora)

Alto peso molecularMembrana externa de bactériasPurificadas – lipopolissacarídeos (LPS)TermoestáveisInativação - ciclos extensos de calor seco,

condições alcalinas ou ácidasAtividade biológica - porção lipídica

PIROGÊNIO

Classes de PIROGÊNIO(2 classes)

exógeno

Lipopolissacarídeo (endotoxina)

Induzem a febre quando injetados

endógeno

resposta a pirogênio (toxina)exógeno

Produzido internamente pelo

hospedeiro

Mediador primário da febre

PIROGÊNIO

Mecanismo da febre

Fagocitose do lipídeo AProdução pirogênio endógeno

Atravessa barreira hematoencefálicaRegulação da temperatura

Prostaglandina E2 e AMPc

PIROGÊNIO

pirogenicidade unidade lipídica da endotoxina

Níveis aceitáveis de pirogênios:

•Parenterais de grande volume - 0,5 EU/mL

•Água para injeção - 0,25 EU/mL

•Drogas intratecais - 0,2 EU/mL

•Solução salina - 0,5 EU/mL

•Solução glicose injetável 5% - 0,5 EU/mL

PIROGÊNIO

EU/ mL = unidades de endotoxina por mL

TESTES

Os testes para determinar a presença, ou não de pirogênio em uma amostra pode ser in

vitro ou in vivo.

PIROGÊNIO

MÉTODOS ANALÍTICOS(a USP – 33 recomenda qual a ser usado)

Ponto final de geleificação

Ensaio turbidimétrico

Método cromogênico

Outros…

PIROGÊNIO

TESTE DE PIROGÊNIO POR MÉTODO IN VITRO

1885 – sangue de Limulus polyphemus formava um coágulo em gel sólido;

Amebócitos- única célula circulante encontrada no sangue de Limulus polyphemus ;

Posteriormente – bactérias marinhas Gram (-) provocavam coagulação intravascular e morte dos caranguejos;

Origem: Derivado termoestável das bactérias;

1964 – Levin e Bang: (1) amebócitos eram necessários para a reação, (2) quantidades de endotoxina eram inativadas na reação

PIROGÊNIO

Tachypleus gigas (in Indonesia)

Tachypleus gigas (in Indonesia)

MECANISMO DA REAÇÃO

(1)reação é dependente da ativação da enzima de

alto peso molecular pela endotoxina (dependente de Ca++ e outros íons bivalentes)

(2) geleifica proteínas coaguláveis de baixo peso molecular (coagulógeno)

PIROGÊNIO

Cascata de coagulação

Preparo do lisado do amebócito de Limulus (LAL)

Sangria do caranguejo

Lavagem do amebócito

Liberação do conteúdo intracelular do amebócito

Liofilizar

LAL introduzido na USP XX e 4a. Edição Farmacopéia Brasileira 1996

PIROGÊNIO

MÉTODOS ANALÍTICOS

Ponto final de geleificação (LAL + solução teste incuba a

37±1ºC por 1 hora (+-2`). Observar formação do gel (inverter cuidadozamente o tubo para 180º)Ensaio limiteSensibilidade: 0,25 a 0,015 EU/mL

PIROGÊNIO

Outro método: MÉTODO CROMOGÊNICO

CURVA PADRÃO

LAL + EU/mL

(incuba 10 min 37 ºC)

Substrato cromogênico (37 ºC)

(20 min a 37 ºC)

ácido acético (interromper a reação)

Leitura a 405 nm

PIROGÊNIO

Teste de PirogênioTeste de Pirogênio((MÉTODO CROMOGÊNICO)

Padrões Amostra (em triplicata*)

0,05

(10%)

0,25

(50%)

0,50

(100%)

0,75

(150%)

1,00 EU/mL

(200%) *

* USP 33

+ LAL

+ substrato cromogênico

10 min, 37ºC

20 min, 37ºC

+ ác. acético leitura (405 nm)

C1 C2 C3

Resultado Resultado (exemplo)(exemplo)

C C (EU/mL)(EU/mL) A A (405 nm)(405 nm)

0,050,05 0,0600,060

0,250,25 0,3000,300

0,500,50 0,6000,600

0,750,75 0,9000,900

1,001,00 1,2001,200

CC11 0,0970,097

CC22 0,0820,082

CC33 0,0860,086

Resultado Resultado (exemplo)(exemplo)

A = 0,288C - 0,252

R2 = 0,9983

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0,05 0,25 0,5 0,75 1

Endotoxina (EU/mL)

A (

405

nm

)

C1 = 0,080 EU/mL

C2 = 0,068 EU/mL

C3 = 0,072 EU/mL

C = 0,088 EU/mL

FluxogramaFluxogramaRecebimento das amostras

Preparo da sala de esterilidade. Desinfecção com nebulizador

Paramentação dos analistas Vestimento de roupa, sapato e EPEI’S estéreis na ante-sala

Entrada na sala de esterilidade

Aspiração da amostra com seringa e transferência para frasco estéril

Preparo da amostra (em triplicata)

Fluxograma (continuação)Fluxograma (continuação)

Adição de 0,1 ml de cada diluição em frasco de L.A.L com 0,1 ml de reagente de L.A.L.

Incubação 10 min, 37ºC

Adição substrato cromogênico

Incubação 20 min, 37ºC

Adição ácido acético

Leitura (405 nm)

Produto aprovado

Não mais que 0,5 EU/mL

Produto reprovado

Mais que 0,5 EU/mL

PIROGÊNIO

APLICAÇÃO

Utilizado em produtos parenterais, água para injeção e em fluidos biológicos

Método extremamente sensível, específico,reprodutível, simples e rápido.

TESTE DE PIROGÊNIO POR MÉTODO IN VIVO

TESTE DE PIROGÊNIO POR MÉTODO IN VIVO

- Ensaio limite-Aprovar ou rejeitar uma amostra mediante as variações do estado febril de um grupo de coelhos

☻ Cada grupo de animais (coelhos) recebe injeção intravenosa da amostra e é observado durante um período de 3 horas

Pontos a serem considerados: Valor igual ou maior que 0,6 ºC

Somatória de elevação térmica individual de todos os animais testados

Valores até 0,6ºC podem ser considerados normais

PIROGÊNIO

EXIGÊNCIAS PARA O TESTE

- Material utilizado (vidraria, injeção) - despirogenizado, tratamento térmico (250 graus por 1 hora) ou material apirogênico descartável

- Animal sadio

- Avaliação do peso do animal equivalência entre as espécies;Injetáveis de grande volume (10 mL/Kg)

- Raça de escolha

- Triagem dos animais em relação à resposta febril – indução de tolerânciaInoculação de nucleianato sódico 5 mg/Kg – resposta febril de 0,8 a 1,2 ºC

-Treinamento dos animais - tempo para resposta febril

-Reutilização dos animaisDescanso de 2-3 dias quando material apirogênicoDescanso de 2-3 semanas quando material pirogênicoAtenção com doses sub-pirogênicas mecanismo de tolerância

- Controle da temperatura fisiológica

PIROGÊNIO

AMOSTRA

Injetáveis, equipos de transfusão, infusão, dispositivos implantáveis ou descartáveis

Injetáveis de grande e pequeno volume

Produtos em forma de aerossol

Via de administração intratecal (a endotoxina é 1000 vezes mais potente)

Material plástico (preferência pelo LAL)

PIROGÊNIO

AMOSTRA

- Grande volume e líquidos extratores: 10 mL/Kg

- Velocidade da injeção: 4 a 6 mL/min (não ultrapassar 4 min)

- Temperatura da amostra: 37 a 38 ºC

Fármacos que atuam sobre o sistema termo-regulador

Produtos incompatíveis com a metodologia animal: hipnóticos, anestésicos, gluconato de

cálcio, radiofármacos

PIROGÊNIO

ANIMAL(coelhos adultos de 1,5Kg aproximadamente)

Manuseio do animal é fundamental

Suspender alimentação no dia do ensaio

Determinar temperatura corporal basal (40 a 90 min antes da injeção, 3 determinações a cada 30 min)

Solução teste na veia marginal da orelha

Registro temperatura corporal – 3 horas

Ideal: tomada contínua da temperatura

PIROGÊNIO

INTERPRETAÇÃO

USP XXXIII e Farmacopéia Brasileira IVDuas condições PARA RESULTADO NEGATIVO (liberar lote): Todos os animais com elevação térmica crítica ≤ 0,6oCSomatória da elevação térmica dos 3 coelhos < 1,14oC

AMOSTRA APROVADAAMOSTRA APROVADA

UMA DAS CONDIÇÕES NÃO ATENDIDA – RETESTE+ 5 animais – não mais que 3 animais devem acusar

elevação térmica crítica ≥ 0,6oCValor da somatória (8 animais) não deve exceder 3,7

oC

PIROGÊNIO

Teste in vivo

(vantagem)

Detecta qualquer contaminante estranho capaz de ser detectado pelo teste animal

PIROGÊNIO

PROCESSOS DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO DAS PROCESSOS DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO DAS ENDOTOXINASENDOTOXINAS

Hidrólise ácido-baseSepara o lipídeo A do restante da molécula do LPSAltera a conformação (lipídeo A) em sítios funcionais essenciaisHCl 0,05 N por 30 min a 100 ºCÁcido acético glacial 1,0% por 2-3 horas a 100 ºC

OxidaçãoH2O2 – oxidação dos ácidos graxos presentes no lipídeo A do LPSInativação dependente do tempo, pH e concentraçãoOutros: O2 molecular, ácido hipocloroso ou hipoclorito, ácido periódico, permanganato de potássio diluído

AlquilaçãoAnidrido acético e succínico- redução de 100 a 1000 vezesÓxido de etileno- redução significativa de endotoxinasMaiores informações – quantidade de endotoxinas

Calor secoMateriais termo resistentes: frascos de vidro, instrumentos metálicos250 ºC/30 min – mecanismo incineração

PIROGÊNIO

DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO DE ENDOTOXINASDESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO DE ENDOTOXINAS

Lavagem (aplicação em embalagens)Lavagem com solvente apirogênico – água estéril para injeção

Destilação (aplicação em água)Mudança de estado físicoMoléculas de LPS são grandes e de elevado peso molecularÁgua recém destilada é estéril e apirogênica

Ultrafiltração (aplicação em antibióticos)Exclusão por peso molecular

Osmose reversa (aplicação em água)Membrana de acetato de celulose ou poliamidaRemoção de endotoxinas por exclusão (porosidade 10 Aº)

PIROGÊNIO

OBTENÇÃO DE PRODUTOS APIROGÊNICOSOBTENÇÃO DE PRODUTOS APIROGÊNICOS

Processo produtivo em condições adequadas de higiene

Operadores: qualificado e treinado

Matéria-prima com baixa carga microbiana

Processos validados

Ambiente

Boas práticas de fabricação

Monitorização do processo (técnicas analíticas validadas – in vivo e in vitro)

PIROGÊNIO