Nutrição Mineral - Fisiologia Vegetal

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  • 7/31/2019 Nutrio Mineral - Fisiologia Vegetal

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    Relatrio do trabalho prtico 7Nutrio Mineral

    Fisiologia Vegetal

    Autores: Henrique Fernandes, Joana Marques, Lus Castro e Ricardo AlmeidaLicenciatura em Bioqumica | 2011/2012

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    Licenciatura em BioqumicaFisiologia Vegetal 2011/2012

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    Introduo

    As plantas autotrficas so todas aquelas cuja fonte de carbono o dixido de

    carbono (CO2) e portanto o carbono constitui um dos elementos fundamentais para a

    sobrevivncia das mesmas.[1] Para alm do CO2, tambm a gua (H2O) e o oxignio

    (O2) so tambm fonte de dois outros elementos essenciais para as plantas, o

    hidrognio e o oxignio. No entanto, existem ainda outros 14 elementos qumicos que

    so absorvidos pelas plantas na forma inorgnica e que so considerados essenciais.[2]

    Assim, por definio, um elemento essencial se na sua ausncia a planta fica

    impedida de completar o seu ciclo de vida (segundo Arnon e Stout, 1939) ou ento

    aquele que tem um papel fisiolgico claro (segundo Epstein, 1999), ou seja, que esteja

    relacionado diretamente com o metabolismo da planta e que no possa ser substitudo

    por outro elemento na funo que desempenha.[2][3]

    Os macronutrientes so portanto

    os 6 elementos presentes em maior quantidade comparativamente aos micronutrientes

    (restantes 8 elementos). Consideram-se macronutrientes, o azoto (1,5%), o potssio

    (1,0%), o clcio (0,5%), o magnsio (0,5%), o fsforo (0,2%) e o enxofre (0,2%)1. Os

    micronutrientes so o cloro, ferro, boro, mangans, cobre, zinco, nquel e molibdnio,

    cujas concentraes variam entre 0,00001% e 0,01% na matria seca. A nutrio

    desequilibrada consiste no fornecimento deficiente de alguns destes nutrientes,situao esta que acarreta sintomas de deficincia no desenvolvimento. Dependendo

    do elemento em falta, podemos ter situaes de clorose (por exemplo por carncia de

    mangans) que corresponde ao aparecimento de manchas amareladas nas reas

    foliares, necrose (por exemplo por carncia de mangans e ferro) que no mais do

    que a morte localizada de tecidos, a produo anormal de antocianinas (pigmentos) e

    tambm situaes de nanismo principalmente por carncia de azoto.[2][3]

    Os sintomas

    de deficincia manifestados esto relacionados com a funo de cada elemento naplanta, bem como a sua localizao e a sua capacidade de mobilidade na planta. Pela

    anlise dos sintomas possvel perceber qual o nutriente em falta ou qual o

    problema na sua absoro e/ou utilizao. No entanto, existem ainda nutrientes que

    quando em situao de deficincia apresentam os mesmos sintomas do que um outro

    sopreposio de sintomas macroscpicos. Quando isto acontece necessrio

    proceder a testes qumicos de composio mineral ou ento a testes bioqumicos de

    1 Os valores apresentados correspondem concentrao dos elementos em matriaseca.

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    modo a quantificar a atividade de certas enzimas ou protenas onde a presena de um

    determinado nutriente essencial.

    O objectivo desta atividade perceber as diferenas entre os sintomas de

    plantas que foram submetidas a carncia de determinados nutrientes. Para isso, utiliza-se uma soluo carente em N (um macronutriente) e outras duas carentes em Fe e Mn.

    Assim, possvel analisar qualitativamente por diagnstico visual os efeitos da

    carncia de N nas plantas e por tcnicas bioqumicas a diferena entre dois

    micronutrientes que apresentam sintomatologias por diagnose visual muito idnticas.

    Assim, procede-se quantificao da atividade da peroxidase que biologicamente

    ativa na presena de Fe. A peroxidase uma oxiredutase que catalisa reaes do tipo

    RH2 + H2O2 2 H2O + RNeste trabalho recorre-se ao guaiacol (2-metoxifenol), como

    substrato, que oxidado num produto com cor e em que a

    velocidade a que isto acontece indicadora da atividade da enzima

    peroxidase. A peroxidase uma enzima do qual o Fe2+ um

    constituinte estrutural e. portanto. essencial para a atividade da mesma. Como a planta

    obtm o Fe ao nvel da raz reduzindo-o de Fe3+

    a Fe2+

    , forma biologicamente ativa, a

    presena de Mn que, por ser um agente oxidante, tende a oxidar o Fe 2+ e portanto a

    diminuir a concentrao da forma biologicamente ativa para a enzima. Assim, ser de

    esperar que a atividade da enzima seja superior em plantas nutridas com um meio

    carente em Mn, seguido do meio completo e por fim o meio carente em Fe.

    Mtodos e procedimento

    Parte I - Preparao das solues stock1. Preparou-se 25 mL de soluo stock de Fe (FeNa - EDTA 75mM);

    2. Preparou-se 1L de soluo de macronutrientes (tabela I) e 1L de soluo demicronutrientes (tabela II) com os seguintes componentes:

    Tabela I Solues stock de macronutrientes

    Reagentes Volume final (mL)Concentrao final da

    soluo (mol.L-1

    )Ca(NO3)2.4H2O 100 1

    KNO3 100 1

    MgSO4.7H2O 50 1

    NH4H2PO4 50 1

    KH2PO4 50 1CaCl2.2H2O 50 1

    KCl 50 1

    Na2SO4 50 1

    Imagem 1 - Guaiacol

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    Tabela II Solues stock de micronutrientes

    Reagentes Soluo A Soluo B

    H3BO3 2.86g 2.86g

    MnSO4 1.54g -

    ZnSO4.7H2O 0.23g 0.23gCuSO4.5H2O 0.09g 0.09g

    (NH4)6Mo7O24 0.02g 0.02g

    Parte 2 Preparao dos meios nutritivos1. Preparou-se 1L de cada soluo. Uma soluo de meio completo, deficiente em Azoto,

    deficiente em Ferro e deficiente em Mangans, de acordo com a tabela III. Retificou-se

    o pH (6.5 -7.0) da soluo;

    Tabela III Preparao dos meios nutritivos

    Solues stock Completo (mL) Def. N (mL) Def. Fe (mL) Def. Mn (mL)Ca(NO3)2.4H2O 4 - 4 4

    KNO3 6 - 6 6MgSO4.7H2O 2 2 2 2

    NH4H2PO4 1 - 1 1

    KH2PO4 - 1 - -FeNa - EDTA 1 1 - 1

    CaCl2.2H2O - 4 - -KCl - 1.5 - -

    Soluo A 1 1 1 -

    Soluo B - - - 1

    2. Encheu-se vasos com uma mistura de 1 para 1 de vermiculite e perlite;

    3. Regou-se e identificou-se os vasos com o nome da respetiva soluo;

    4. Colocou-se as sementes de alface (Lactuca sativa) e colocou-se na estufa com

    condies de luz, temperatura e humidade propcias ao seu crescimento;

    5. Regou-se os vasos periodicamente por forma a no deixar secar a mistura de

    envasamento;

    6. Passadas 5-6 semanas comparou-se a morfologia das plantas dos quatro vasos (tendo

    como referencia as plantas do meio completo) e registou-se as alteraes verificadas;

    7. Interpretou-se sintomatologia verificada e relacionou-se com as funes dos nutrientes

    na planta.

    Parte 3 Determinao da atividade da enzima PeroxidasePreparao dos reagentes:

    Tampo fosfato a 0.1 mol.L-1 (pH= 7.0) : Preparou-se 100 mL da soluo de KH2PO4 (0.1 mol.L-

    1) e 50 mL da soluo de K2HPO4 (0.1 mol.L-1) Adicionou-se esta ultima primeira at obter o

    pH desejado;

    Guaiacol 0.5% (V/V): preparou-se 50 mL;

    H2O2 (0.03 mol.L-1): preparou-se 50 mL

    Execuo laboratorial

    1. Pesou-se 0.20 g de folha sem nervura;

    2. Cortou-se as folhas em pequenas pores e homogeneizou-se com o tampo fosfato no

    almofariz em gelo;

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    3. Transferiu-se o contedo para um tubo Falcon e centrifugou-se a 3000rpm durante 10

    min a 5 ;

    4. Recolheu-se o sobrenadante para um novo tubo;

    5. Realizou-se a determinao da atividade da peroxidase de cada amostra, atravs de

    espectrofotometria. Para essa quantificao adicionou-se a cada amostra os volumes

    das solues presentes na tabela IV:

    Tabela IV Volume de soluo a adicionar cuvete de cada amostra

    CuveteVSoluo Guaiacol 0.5%

    (mL)

    Volume de

    amostra

    VSoluo H2O2 0.03

    mol.L-1 (mL)

    Meio completo 0.5 0.4 0.5

    Meio def. em Mn 0.5 0.4 0.5

    Meio def em Fe 0.5 0.4 0.5

    Branco 0.5 -* 0.5

    *- Substituiu-se o volume de amostra (0.4 mL) por tampo fosfato com o mesmo

    volume.6. Calibrou-se o espectrofotmetro com o branco e fez-se a leitura da absorvncia

    (imediatamente aps se juntar o H2O2) durante 1 min a 460 nm;

    7. Registou-se os valores obtidos.

    Parte IV Quantificao de protenas pelo mtodo de Bradford

    1. Adicionou-se 1 mL de reagente de Bradford e 100 L de amostra (sobrenadante

    recolhido na parte 3) cuvete. Para o branco substitui-se o volume de amostra por gua

    desionizada;

    2. Misturou-se bem e deixou-se repousar por 15 min;

    3. Calibrou-se o espectrofotmetro com o branco e fez-se as leituras a 595 nm;

    4. Registou-se os valores obtidos e relacionou-se com os valores obtidos na parte III.

    Resultados Experimentais

    Dados Observacionais

    Imagem 2 - Folhas de alface aps o tratamento.(1 - Meio nutritivo completo; 2 - Meio nutritivodeficiente em Azoto; 3 - Meio nutritivo deficienteem Ferro; 4 - Meio nutritivo deficiente emMangans

    Imagem 2 - Plantas de alface aps o tratamento.(1 - Meio nutritivo completo; 2 - Meio nutritivodeficiente em Azoto; 3 - Meio nutritivo deficienteem Ferro; 4 - Meio nutritivo deficiente emMangans

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    Tabela V - Resultados da determinao da atividade da peroxidase equantificao de protenas

    NOTAOs valores de Protenas (g/mL); Protenas (g/0,4mL); Abs460 min

    -1mg

    -1prot.; Abs460 min

    -1

    gp.f. resultaram de clculo e so apresentados abaixo exemplos desse clculo. Def. Fe e Def. Mnso abreviatura de meio nutritivo deficiente em Ferro e Mangans respectivamente. + Verde e +

    Senes so abreviatura de quantificao efectuada em folhas mais verdes ou mais senescentes,respectivamente.

    Grfico 1 Indicao da atividade da peroxidase pela Abs460 min-1

    gp.f. de plantas submetidas adiferentes meios nutritivos.

    ClculosTeor de Protenas (g/mL)Absorvncia = 0,5865

    Protena = 0,2200Absorvncia 0,0089 gL!! Protena = 0,22000,5865 0,0089Protena = 0,1201gL!!1000 = 120,1gmL!!

    Teor de Protenas (g/0,4mL)Protena = 120,1gmL!!!!"#$%!"!"#!,!!"!"!"#!$%&'$( = Protena 0,4!"!!"#$%!"!"#!,!!"!"!"#!$%&'$( = 48,052g/0,4mL

    0,00

    2,00

    4,00

    6,00

    8,00

    10,00

    12,00

    14,00

    16,00

    18,00

    Abs460min-1gp.f.

    CompletoDef.FeDef.Mn

    MeiosNutritivos

    Variaodaabsorvnciaemfunodosmeiosnutritivos

    Verde

    Senescente

    MeioPeso

    (g)

    Abs

    (595nm)

    Protenas

    (g/mL)

    Protenas

    (g/0,4mL)

    Abs460min

    -1

    0,4mL-1

    Abs460min

    -1mg

    -1

    protenas

    Abs460

    min

    -1

    gp.f.

    Completo 0,20 0,5865 120,1 48,052 0,1151 2,395 11,51

    Def.

    Fe

    + Verde 0,24 0,5397 109,8 43,934 0,06291 1,432 5,243

    + Senes 0,20 0,2404 43,98 17,595 0,1553 8,826 15,53

    Def.

    Mn

    + Verde 0,22 0,6553 135,2 54,106 0,1338 2,473 12,16

    + Senes 0,21 0,2220 39,94 15,976 0,09134 5,717 8,699

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    Abs460 min-1 mg-1 de protena

    Abs!"# = 0,1151min!!0,4mL!!Abs!"# min

    !!mg!!deprotena = Abs!"# min!!0,4mL!! 1000m!"#$%'(!"#!,!"#!"!"#!$%&'$( !!,!"#

    Abs!"# = 2,395min!!mg!!deprotenaAbs460 min

    -1 por grama de peso fresco (gp.f.)Abs!"# = 0,1151min!!0,4mL!!Peso = 0,20gAbs!"# min

    !!gp. f. = Abs!"# min!!0,4mL!!!"#$ ! !,!"#

    !,!"#

    Abs!"# = 11

    ,

    51min!!gp. f.Discusso de resultados

    Com este trabalho pretendeu-se avaliar os efeitos de carncia nutritiva no

    crescimento e desenvolvimento de Lactuca sativa. A experincia decorreu ao longo de

    6 semanas, ao fim das quais se observou o aspeto das plntulas.

    Pelo diagnstico observacional verificou-se que no meio nutritivo completo as

    plntulas, embora no tenham sido transplantadas, apresentavam um crescimento

    abundante e saudvel, factor este que foi inferido pela predominncia de cor verde e

    rea foliar. No vaso em que se limitou a fonte de azoto, as folhas apresentavam

    crescimento muito reduzido comparativamente com o vaso de meio completo (controlo)

    e clorose uniforme. Nas plntulas cujo os meios nutritivos so deficientes em Ferro ou

    Mangans, os sintomas foram semelhantes: o crescimento foi menos acentuado em

    relao s plntulas de controlo e algumas das folhas observadas apresentavam

    necrose nas suas extremidades. Para alm disso, verificou-se a presena de cloroseinterfascicular nas plntulas de meio nutritivo carente em Ferro e alguma clorose na

    margem foliar das plntulas do meio carente em Mangans.[2]

    Como os resultados obtidos por diagnstico visual so sobreponveis no caso

    dos meios nutritivos carentes em Ferro ou em Mangans procedeu-se anlise

    bioqumica atravs da determinao da atividade da enzima peroxidase. Pela anlise

    da Tabela V constata-se que a atividade da enzima maior nas plntulas de meio

    nutritivo carente em Mangans comparativamente s restantes. J nas plntulas de

    meio nutritivo deficiente em Ferro a atividade da enzima menor relativamente ao meio

    nutritivo completo. Averiguou-se ainda que as folhas mais senescentes de plntulas do

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    meio nutritivo carente em Mangans apresentam uma atividade enzimtica da

    perixodase inferior das folhas verdes. No caso das plntulas cujo meio nutritivo

    carecido em Ferro ocorre precisamente a situao inversa.

    Concluso

    As plntulas cujo meio nutritivo carente em Azoto apresenta nanismo porque o

    Azoto um elemento essencial para o seu desenvolvimento e crescimento, visto que

    est presente na maioria dos compostos orgnicos envolvidos no metabolismo e na

    constituio da planta. No que diz respeito s plntulas dos meios nutritivos deficientes

    em Ferro e Mangans, a diferena por diagnstico visual no conclusiva porque os

    fenmenos sintomatolgicos so muito idnticos pelo facto das diferenas acarretarem

    apenas consequncias visveis ao nvel celular. Os sintomas observados na carncia

    de Azoto so mais evidentes do que os de Ferro ou Mangans, visto que a planta

    necessita em muito maior quantidade do Azoto do que dos dois ltimos.

    Portanto, para distinguir quais as consequncias da carncia de Ferro ou

    Mangans procedeu-se a uma anlise quantitativa da atividade da peroxidase pelo que

    se verificou que no caso do meio carente em Ferro a atividade da enzima inferior

    comparativamente ao meio carecido em Mangans. Isto ocorre porque o Ferro entra na

    constituio da peroxidase na forma de catio Fe2+

    , pelo que a atividade da enzima

    ser menor quando em situao de carncia deste nutriente. A carncia em Mangans

    por sua vez aumenta a atividade da enzima, pois sendo um elemento oxidante do Fe2+

    (forma biologicamente ativa) a Fe3+

    , em menor concentrao propicia maiores

    concentraes de Fe2+ e portanto fomenta a atividade da peroxidase. Verificou-se

    ainda que a atividade da enzima superior comparativamente ao meio completo

    porque neste ltimo a presena de Mangans oxida tambm o Fe2+

    e portanto existemenor quantidade da forma ativa do Ferro condicionando a atividade da enzima.

    Comparando os resultados obtidos na atividade da peroxidase para folhas mais

    verdes ou mais senescentes verifica-se uma irregularidade, sendo que as folhas mais

    senescentes possuem um comportamento diferente face s mais verdes que

    resultaram como o esperado. As discrepncia pode decorrer do facto de mesmo em

    situao de carncia nutritiva em Fe, possa ainda haver algumas quantidades deste

    nutriente e que por ser um elemento mvel tanto no xilema como no floema possa ter

    migrado para as zonas mais senescentes. Acontecimento este que ocorre em

    situaes de senescncia como forma de eliminar possveis agentes oxidantes.

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