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NEVES, S.C.V. Ácido fumárico em dietas para juvenis...

1

Universidade Federal Rural de Pernambuco

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS PESQUEIROS E AQUICULTURA

Ácido fumárico em dietas para juvenis de tilápia-do-nilo

Suzane Christina Varela das Neves

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Recursos Pesqueiros e

Aquicultura da Universidade Federal

Rural de Pernambuco como exigência

para obtenção do título de Mestre.

Co-orientadora

Recife,

Maio/2018

Prof. Dr. Álvaro José de Almeida Bicudo

Orientador

Prof. Dr. Eudes de Souza Correia

Co-orientador

Prof.(a) Dr.(a) Suzianny Maria Bezerra Cabral da Silva


2

Universidade Federal Rural de Pernambuco

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS PESQUEIROS E AQÜICULTURA

Ácido fumárico em dietas para juvenis de tilápia-do-nilo

Suzane Christina Varela das Neves

Dissertação julgada _________ para

obtenção do título de mestre em

Recursos Pesqueiros e Aquicultura.

Defendida e ________ em 21/05/2018

pela seguinte Banca Examinadora.

Prof.(a) Dr.(a) Álvaro José de Almeida Bicudo

(Orientador)

[Departamento de Zootecnia]

[Universidade Federal do Paraná – Setor Palotina]

Profª. Drª. Maria do Carmo Mohaupt Marques Ludke

[Departamento de Zootecnia]

[Universidade Federal Rural de Pernambuco]

Profª Drª Roberta Borda Soares

[Departamento de Pesca e Aquicultura]

[Universidade Federal Rural de Pernambuco]


3

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Sistema Integrado de Bibliotecas da UFRPE Biblioteca Central, Recife-PE, Brasil

N518a Neves, Suzane Christina Varela das Ácido fumárico em dietas para juvenis de tilápia-do-nilo / Suzane Christina Varela das Neves. – 2018. 40 f. : il. Orientadora: Álvaro José de Almeida Bicudo. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal Rural de Pernambuco, Programa de Pós-Graduação em Recursos Pesqueiros e Aquicultura, BR-PE, 2018. Inclui referências. 1. Peixes - Alimentação e rações 2. Tilápia (Peixe) 3. Nutrição animal 4. Ácidos I. Bicudo, Álvaro José de Almeida, orient. II. Título CDD 664


4

Dedicatória

A minha mãe Izabel Varela e meu pai João Roberto,

pelas orações, incentivo, força, conselhos e por serem

meu exemplo de vida, no qual me permitiram chegar

até aqui.


5

Agradecimentos

Agradeço a Deus por mais um caminho trilhado e conquistado na minha vida acadêmica, aos

meus pais e familiares por todas as orações, força e todo amor.

Ao Programa de Pós-Graduação em Recursos Pesqueiros e Aquicultura, pela honra em fazer

desse programa e aos Professores responsáveis pela Coordenação, pelas disciplinas ofertadas.

Ao Prof. Dr. Álvaro José de Almeida Bicudo pela oportunidade que me concedeu, pela

orientação, paciência, pelos puxões de orelha e por me ajudar no crescimento profissional.

Ao Prof. Dr. Eudes de Souza Correia e Profª Drª Suzianny Maria Bezerra Cabral da Silva,

meus coorientadores, não tenho palavras pra expressar o carinho e admiração que tenho por vocês,

obrigada por me acolher em vossos Laboratórios e me ajudar no que precisei ao longo dessa

caminhada.

Aos Professores do Departamento de Pesca e Aquicultura que, quando necessitei de uma

ajuda, não mediram esforços e prontamente me auxiliaram.

As secretárias do DEPAq, por estarem sempre nos ajudando com nossas documentações, nos

fazendo sorrir e dando uma palavra de apoio quando chegamos aperreados, muito obrigada.

Aos amigos do LAPAq, que carregaram o peso comigo de realizar um experimento, que

infelizmente não chegou ao fim, mas estavam ali me dando todo apoio naquele dia tão difícil.

Aos amigos do LASAq, em especial Gisely, Slaython, Álvaro e Yago. Não tem palavras e

dinheiro que pague o tanto que vocês me ajudaram (fisicamente e emocionalmente) e tem me

ajudado até hoje, meus mais sinceros, MUITO OBRIGADA!

Beth e Carol, vocês me socorreram tantas vezes e isso está marcado no meu coração. Muito

obrigada por cada ato, gesto, palavra, vocês são demais.

Aos Laboratórios tanto do Departamento de Pesca e Aquicultura quanto do Departamento de

Zootecnia que abriram as portas pra mim pra que análises pudessem ser realizadas.

Aos meus amigos – Cláudia Patrícia, Ingrid, Wilma, Beth Lima, Ana Luísa, Soninha,

Priscyla, Geni, Julia, João Alfredo, José Vitor, João Neto, Jade, Rebeca, Kamilla, aos Filhos do Rei,

ao Kades, ao Raio de luz – vocês foram de extrema importância nessa caminhada, ouvindo meus

choros, minhas vitórias diárias, orando por mim, dando força. Que Deus recompense a todos com

ricas bênçãos dos céus, eu amo vocês.

MUITO OBRIGADA!


6

Resumo

O objetivo do presente estudo foi avaliar o uso de ácido fumárico como aditivo alimentar para

dietas de alevinos de tilápia-do-nilo. Seis dietas isocalóricas (3,4 kcal de energia bruta / g) e

isonitrogenadas (29% de proteína bruta) suplementadas com ácido fumárico (0,0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 e

3,0% da dieta) foram formuladas com quatro repetições cada e os animais foram distribuídos em

delineamento inteiramente casualizado. Treze peixes (± 1,7 g) foram distribuídos em tanques e

alimentados às 8:00, 12:00 e 16:00 horas até a saciedade aparente durante 35 dias. Todos os dados

de desempenho zootécnico e contagem de bactérias viáveis totais (UFC-1) foram submetidos à

análise de variância e as diferenças entre as médias foram avaliadas pelo teste de Tukey (p <0,05).

Redução significativa de bactérias gram-negativas e comunidades de Enterobacteriaceae foi

observada em peixes alimentados com dieta suplementada com ácido fumárico a 1,5% (p <0,05).

Da mesma forma, ganho de peso, eficiência alimentar, taxa de crescimento específico e eficiência

protéica foram numericamente maiores no tratamento de 1,5% comparado ao grupo controle e

outros tratamentos (p <0,05). Por outro lado, não houve diferença significativa no consumo diário

de ração (p> 0,05). A suplementação de 1,5% de ácido fumárico melhora o desempenho zootécnico

e resulta em efeito antibacteriano em tilápias do Nilo.

Palavras-chave: tilápia do Nilo, ácido orgânico, nutrição, desempenho zootécnico, microflora

intestinal


7

Abstract

The objective of the present study was to evaluate the use of fumaric acid as a feed additive for Nile

tilapia fry diets. Six iso-caloric (3.4 kcal gross energy/ g) and iso-nitrogenous (29% crude protein)

diets supplemented with fumaric acid (0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 and 3.0% of diet) were formulated with

four replicate each and the animals were distributed in a completely randomized design. Thirteen

fish (± 1.7g) were distributed in tanks and fed at 8:00 a.m., 12:00 a.m. and 4:00 p.m. up to apparent

satiety during 35 days. All zootechnical performance and total viable bacterial count (CFUg-1

) data

were subjected to analysis of variance and differences between means were assessed by Tukey's test

(p<0.05). Significant reduction of gram-negative bacteria and Enterobacteriaceae communities were

observed in fish fed diet supplemented with fumaric acid at 1.5% (p<0.05). Similarly, weight gain,

feed efficiency, specific growth rate and protein efficiency was numerically higher in 1.5%

treatment compared with control group and other treatments (p<0.05). On the other hand, there was

no significant difference in daily feed intake (p>0.05). The supplementation of 1.5% fumaric acid

improves zootechnical performance and results an antibacterial effect in Nile tilapia fry.

Key words: Nile tilapia, organic acid, nutrition, zootechnical performance, gut microflora


8

Lista de figuras

Páginas

Figura 1 - Contagens totais das bactérias gram-negativas presentes no intestino

proximal de juvenis de tilápia-do-nilo alimentados com dietas suplementadas

com ácido fumárico por 35 dias.

31

Figura 2. Contagens totais das enterobactérias presentes no intestino proximal de

juvenis de tilápia-do-nilo alimentados com dietas suplementadas com ácido

fumárico por 35 dias.

32


9

Lista de tabelas

Páginas

Tabela 1 - Diferentes mecanismos de ações apresentadas pelos ácidos orgânicos e

seus sais na nutrição animal.

11

Tabela 2 - Pesquisas realizadas com ácidos orgânicos e seus sais em animais

aquáticos.

12

Tabela 1 - Formulação e composição química da dieta experimental. 24

Tabela 2 - Concentração de ácido fumárico nas dietas experimentais. 25

Tabela 3 - Desempenho zootécnico (média ± desvio padrão) de juvenis de tilápia-do-

nilo alimentados com dietas suplementadas com ácido fumárico por 35 dias.

28

Tabela 4 - Contagem total de enterobactérias (média ± desvio padrão) de juvenis de

tilápia-do-nilo alimentados com dietas suplementadas com ácido fumárico por 35

dias.

30

Tabela 5 - Contagem total de Gram-negativas (média ± desvio padrão) de juvenis de

tilápia-do-nilo alimentados com dietas suplementadas com ácido fumárico por 35

dias.

31


10

Sumário

Páginas

Dedicatória 3

Agradecimento 4

Resumo 5

Abstract 6

Lista de figuras 7

Lista de tabelas 8

1- Introdução 10

2- Artigo - Suplementação de ácido fumárico em dietas para juvenis de

tilápia-do-nilo

21

3- Considerações finais 34

4- Referências 35


11

1- Introdução

A tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) é uma espécie pertencente à família

Cichlidae que se destaca na piscicultura mundial pela rusticidade, facilidade na

reprodução, adaptação a diversos sistemas de cultivo, bom desempenho produtivo,

baixa taxa de conversão alimentar, hábito alimentar onívoro (COWARD e BROMAGE,

2000; MCINTOSCH e LITTLE, 1995), aceitação de dietas industrializadas desde o

estágio larval (ZIMMERMANN e FITZSIMMONS, 2004), carne com coloração branca

e também resistência a altas salinidades e temperaturas (VICENTE e FONSECA-

ALVES, 2013). Em termos numéricos, O. niloticus é a principal espécie cultivada no

Brasil, correspondendo a aproximadamente 45% da produção aquícola nacional. Sua

produção está concentrada principalmente nos estados do Ceará, Paraná, São Paulo e

Santa Catarina (IBGE, 2015), caracterizada principalmente pelo uso de sistemas semi

intensivos e intensivos, tendo como meios produtivos mais comuns o cultivo em

viveiros escavados e tanques-rede (SEBRAE, 2014).

Em geral, o aumento da produtividade exige quase que exclusivamente o uso de

rações comerciais nutricionalmente completas (URBINATI e CARNEIRO, 2004)

tornando este item o de maior custo operacional (FURLANETO et al., 2006). Neste

sentido, pesquisas visando à redução dos custos com alimentação sem prejudicar o

desempenho dos animais tornam-se necessárias. Por se tratar de uma espécie onívora,

muitas pesquisas com a tilápia-do-nilo foram desenvolvidas na redução do uso da

farinha de peixe por ingredientes de origem vegetal nas dietas (BOSCOLO et al., 2001).

Entretanto, ingredientes de origem vegetal apresentam deficiências em um ou mais

aminoácidos essenciais e baixa concentração e disponibilidade do fósforo (FURUYA et

al., 2010). O uso de dietas com elevadas concentrações de alimentos vegetais demanda

o uso de estratégias para mitigar os efeitos negativos destas deficiências (BUTOLO,

2002). Isto pode ser feito pela suplementação ou o uso de aditivos dietéticos que

aumentem a disponibilidade dos nutrientes presentes (ANDERSON et al., 1995;

AKSNES et al., 1997).

De acordo com a Instrução Normativa MAPA nº 44, de 15 de dezembro de 2015,

aditivos são classificados como:


12

A utilização dos ácidos orgânicos e seus sais têm aumentado bastante seus estudos

nos últimos anos, e os mais utilizados comercialmente com a finalidade de preservação

dos alimentos são os ácidos: fórmico, propiônico, láctico, butírico e cítrico. Eles

apresentam efeitos diferentes na dieta, no trato intestinal e metabolismo do animal

cultivado, conforme sumarizado na Tabela 1.

Tabela 1. Diferentes mecanismos de ações apresentadas pelos ácidos orgânicos e seus

sais na nutrição animal.

Local de ação Forma efetiva Ações

Dieta H+

Redução do pH;

Desnaturação de proteínas;

Redução no crescimento

microbiano.

Trato Intestinal H+

e íons Efeito antimicrobinao

H+ Redução no pH do

estômago e duodeno;

Aumento da atividade de

pepsina.

Disponibilidade de cátions

(Ca2-

, Mg2-

, Fe2-

, Cu2-

, Zn2-

)

Metabolismo H+

e Ânion Fonte de energia

Fonte: adaptado de Lückstädts (2008). H+: Forma não ionizada. Ânion: Forma ionizada

Além disso, há um elevado interesse pelo desenvolvimento de substâncias

alternativas com potencial para substituir ou minimizar o uso dos antibióticos (LIM;

LÜCKSTADTS; KLESIUS, 2010; PARTANEN et al., 2002). O uso dos antibióticos

“Substância, micro-organismo ou produto formulado, adicionado

intencionalmente aos produtos, que não é utilizado normalmente

como ingrediente, tenha ou não valor nutritivo e que melhore as

características dos produtos destinados à alimentação animal dos

produtos animais, melhore o desempenho dos animais sadios ou

atenda às necessidades nutricionais.”


13

nos sistemas de cultivo, servindo como agentes terapêuticos e promotores do

crescimento aumentou o risco de desenvolverem bactérias resistentes e com efeitos

nocivos para a saúde humana e animal, bem como para o ambiente aquático

(CABELLO, 2006). Com isso, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

(MAPA) proibiu o uso dos antibióticos cloranfenicol e nitrofuranos (Instrução

Normativa nº 09/2003), quilononas e sufonamidas (Instrução Normativa nº 26/2009),

espiramicina e eritromicina (Instrução Normativa nº 14/2012) como aditivos

alimentares na produção animal.

Os estudos sobre a suplementação dietética com ácidos orgânicos iniciaram-se

com aves e suínos. Por exemplo, Lu et al. (2012) registraram que a suplementação de

0,3% de butirato de sódio na dieta de porcas gestantes aumentou em 13% o ganho de

peso diário. Já Gheler et al. (2009), adicionando ácido benzoico na dieta de leitões de

28 a 70 dias de idade, observaram melhora na conversão alimentar e ganho de peso

com, respectivamente, 0,62% e 0,79% de inclusão dietética de ácido benzoíco. A adição

de 2 a 3% dos ácidos butírico, fumárico ou lático em dietas para frangos de corte

aumentou o ganho de peso e a altura das vilosidades intestinais após 42 dias de oferta

(ADIL et al., 2010, 2011)

Em relação aos estudos com a suplementação de sais orgânicos na dieta de

animais aquáticos, os primeiros foram publicados nos anos de 1990 por Ringo (1991) e

Ringo; Olsen e Castell (1994). Estes estudos mostraram que a adição de 1% de lactato

de sódio durante 70 dias nas dietas de “Charr do Ártico” (Salvelinus alpinus), aumentou

o crescimento e reduziu a conversão alimentar. Além do desempenho zootécnico, estas

substâncias também são utilizadas na nutrição de animais aquáticos por participarem de

várias vias metabólicas, gerando energia e melhorando a digestibilidade dos principais

nutrientes, bem como induzindo a inibição de bactérias devido a sua capacidade de

redução do pH intestinal (GOOSEN et al, 2011). Na Tabela 2 são sintetizados os

resultados de estudos prévios sobre a suplementação de ácidos orgânicos em dietas para

organismos aquáticos.

Tabela 2. Pesquisas realizadas com ácidos orgânicos e seus sais em animais aquáticos.

Ácido orgânico % com melhor

resposta

Espécie Resultados Referência

bibliográfica

Formiato + 1% Oncorhynchus Não houve efeitos Gao et al.


14

butirato (2:1) mykiss benéficos. (2011)

Mix (ácido

fórmico,

benzoico e

HMTBa)

0,12% Litopenaeus

vannamei

Aumento da

sobrevivência do

cultivo e após

desafio

com V. harveyi.

Jueliang et

al.

(2013)

Acetato,

butirato,

citrato,

formiato,

propionato,

lactato

2% Litopenaeus

vannamei

Mudanças na

atratividade,

consumo e

digestibilidade

Silva et al.

(2013)

Proionato de

sódio ou

butirato de

sódio

0,5 a 2%

Litopenaeus

vannamei

Melhorou o peso

final e taxa de

crescimento

específico

Silva et al.

(2014)

Ácido

Fumárico

0,1% e 0,5% Clarias

gariepinus

Melhorou o

crescimento, os

parâmetros

hematológicos e a

sobrevivência

Omosowone

et al. (2015)

O ácido fumárico é um ácido dicarboxílico (C4H4O4) que vem se destacando

dentre os ácidos orgânicos por ser caracterizado como um ácido fraco, não tóxico e ter

alta capacidade de dissociação (pka), características estas que o fizeram ser usado como

aditivo alimentar desde 1946 (MALONE, 2000; XIE et al., 2003). Com a capacidade de

dissociação, torna-se apto a agir como antimicrobiano no trato gastrointestinal afetando

principalmente as bactérias gram-negativas, por atravessar a membrana celular

bacteriana quando dissociado, liberando prótons no citoplasma neutro e reduzindo o pH

intracelular (KNARREBORG et al., 2002; DIBNER e BUTTON, 2002). Além disso,


15

devido à ação antimicrobiana, também atua como conservante de alimentos (MROZ et

al., 2000) por resistir a alcalinização do meio, possibilitando a redução do pH das dietas

(PARTANEN e MROZ, 1999).

Estudos com suplementação de ácidos orgânicos para não ruminantes, como

relatado anteriormente, encontram-se bastante consolidados, porém, as pesquisas com

ácido fumárico, especificamente, ainda apresentam resultados controversos. Gomes et

al. (2011) estudando leitões recém-desmamados suplementados com ácido fumárico

(0,5%) e sua combinação com o ácido lático e o propionato de cálcio, não determinaram

melhora nos parâmetros analisados quanto ao desempenho e as características

intestinais. Similarmente, Silveira (2004) ao avaliar diferentes níveis de ácido fumárico

(0,5%; 1,0%; 1,5% e 2,0%) não observou quaisquer efeitos sobre o desempenho dos

leitões desmamados aos 28 dias de idade, com resultados similares ao grupo controle.

Por outro lado, Scapinello et al. (1999) e Omosowone et al. (2015) observaram relação

positiva entre a adição de ácido fumárico e desempenho zootécnico dos animais

avaliados. No primeiro estudo, após a submissão a dietas suplementadas aos níveis de

0,5%; 1,0%; 1,5% e 2,0% por 70 dias de idade ficou determinada que a suplementação

de 2% de ácido fumárico melhorou a conversão alimentar de coelhos da raça Nova

Zelândia. Da mesma forma, Omosowone et al. (2015), ofertaram 0,5%; 1,0%; 1,5% e

2,0% de suplementação de ácido fumárico para o bagre africano (C. gariepinus,

68.14±1.5 g), por 56 dias, e observaram que os níveis de 0,5 e 2%, mostraram melhores

resultados quanto ao desempenho, parâmetros hematológicos e sobrevivência.

Apesar destes estudos, informações sobre os benefícios da inclusão de ácidos

orgânicos e/ou seus sais em dietas aquícolas ainda são escassos, podendo-se apresentar

variadas respostas de acordo com as espécies, tamanhos, idades dos animais, tipos e

níveis dos ácidos orgânicos e suas combinações. Portanto, é necessário o

desenvolvimento de pesquisas que supram estas lacunas, sendo O. niloticus um bom

modelo biológico para isso pela sua importância produtiva na aquicultura mundial.

1.2 Objetivos

1.2.1 - Objetivo geral

Avaliar o ácido fumárico como aditivo alimentar em dietas para juvenis de tilápia do

Nilo.


16

1.2.2- Objetivos específicos

Avaliar o efeito da suplementação dietética do ácido fumárico sobre o desempenho

zootécnico e microbiota intestinal de juvenis de tilápia do Nilo.


17

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266.


22

2- Artigo Científico

Suplementação de ácido fumárico em dietas para juvenis de tilápia-do-nilo

Resumo

O objetivo do presente estudo foi avaliar o uso de ácido fumárico como aditivo

alimentar para dietas de alevinos de tilápia-do-nilo. Seis dietas isocalóricas (3,4 kcal de

energia bruta / g) e isonitrogenadas (29% de proteína bruta) suplementadas com ácido

fumárico (0,0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 e 3,0% da dieta) foram formuladas com quatro

repetições cada e os animais foram distribuídos em delineamento inteiramente

casualizado. Treze peixes (± 1,7 g) foram distribuídos em tanques e alimentados às

8:00, 12:00 e 16:00 horas até a saciedade aparente durante 35 dias. Todos os dados de

desempenho zootécnico e contagem de bactérias viáveis totais (UFC-1) foram

submetidos à análise de variância e as diferenças entre as médias foram avaliadas pelo

teste de Tukey (p <0,05). Redução significativa de bactérias gram-negativas e

comunidades de Enterobacteriaceae foi observada em peixes alimentados com dieta

suplementada com ácido fumárico a 1,5% (p <0,05). Da mesma forma, ganho de peso,

eficiência alimentar, taxa de crescimento específico e eficiência protéica foram

numericamente maiores no tratamento de 1,5% comparado ao grupo controle e outros

tratamentos (p <0,05). Por outro lado, não houve diferença significativa no consumo

diário de ração (p> 0,05). A suplementação de 1,5% de ácido fumárico melhora o

desempenho zootécnico e resulta em efeito antibacteriano em tilápias do Nilo.

Palavras-chave: tilápia do Nilo, ácido orgânico, nutrição, desempenho zootécnico,

microflora intestinal


23

Abstract

The objective of the present study was to evaluate the use of fumaric acid as a feed

additive for Nile tilapia fry diets. Six iso-caloric (3.4 kcal gross energy/ g) and iso-

nitrogenous (29% crude protein) diets supplemented with fumaric acid (0.0, 0.5, 1.0,

1.5, 2.0 and 3.0% of diet) were formulated with four replicate each and the animals

were distributed in a completely randomized design. Thirteen fish (± 1.7g) were

distributed in tanks and fed at 8:00 a.m., 12:00 a.m. and 4:00 p.m. up to apparent satiety

during 35 days. All zootechnical performance and total viable bacterial count (CFUg-1

)

data were subjected to analysis of variance and differences between means were

assessed by Tukey's test (p<0.05). Significant reduction of gram-negative bacteria and

Enterobacteriaceae communities were observed in fish fed diet supplemented with

fumaric acid at 1.5% (p<0.05). Similarly, weight gain, feed efficiency, specific growth

rate and protein efficiency was numerically higher in 1.5% treatment compared with

control group and other treatments (p<0.05). On the other hand, there was no significant

difference in daily feed intake (p>0.05). The supplementation of 1.5% fumaric acid

improves zootechnical performance and results an antibacterial effect in Nile tilapia fry.

Keywords: Nile tilapia, organic acid, nutrition, zootechnical performance, gut

microflora


24

Introdução

Os ácidos orgânicos e/ou seus sais são constituintes naturais de alguns

subprodutos do metabolismo bacteriano e do trato gastrointestinal de animais e,

caracterizam-se pela presença de uma ou mais carboxilas (LIM et al., 2015). Efeitos

ligados a adição dos ácidos orgânicos incluem melhora da palatabilidade, maior

eficiência alimentar em consequência da redução do pH gástrico, diminuição do

crescimento bacteriano, aumento da atividade da pepsina e efeitos metabólicos, motivos

pelos quais, quando inseridos nas rações, podem auxiliar na melhoria da utilização de

nutrientes em animais aquáticos (ROMANO et al., 2015; SUKOR et al., 2016).

Dentre os ácidos orgânicos avaliados na suplementação de animais aquáticos, os

ácidos cítricos, fórmico, propiônico, láctico e butírico e o fumárico têm mostrado efeito

positivo no desempenho zootécnico das espécies avaliadas. Estudos conduzidos por

Sarker et al (2005); Hossain et al (2007) mostraram que o uso de ácido cítrico, nas

concentrações de 1% a 3% para pargo vermelho (Pagrus major), resultaram na melhoria

do crescimento, taxa de conversão alimentar e absorção e retenção de N e P. No caso de

tilápias híbridas (Oreochromis sp.), após a oferta de dietas suplementadas com

diformato de potássio, houve maior ganho de peso e alteração da microbiota intestinal

nos espécimes submetidos a adição deste composto a 0,6% (ZHOU et al,. 2009).

Além destes ácidos, o ácido fumárico também tem sido avaliado por sua ação

antimicrobiana relacionada à sua alta capacidade de dissociação que ao atravessar a

membrana celular bacteriana, libera prótons e reduz o pH intracelular, culminando com

a morte da célula (LEHNEN, 2009). Este ácido é um dicarboxílico com quatro carbonos

(C4H4O4), bastante estável à temperatura ambiente, pouco solúveis em água (LUDKE,

1993), não volátil, inodoro, não tóxico e pode ser encontrado naturalmente em plantas e

fungos (PARTANEN e MROZ, 1999; BUHLER, 2009).

Gomes et al. (2007) estudaram a inclusão de ácido fumárico e suas combinações

com ácido butírico ou fórmico na dieta de leitões recém-desmamados, e concluíram que

dietas suplementadas com 0,5% melhoraram o desempenho dos animais nas duas

primeiras semanas pós-desmame. A suplementação de 2 a 3% de ácido butírico,

fumárico ou lático na engorda de frangos aumentou o ganho de peso e a altura das

vilosidades intestinais (ADIL et al., 2010, 2011). Omosowone et al. (2015) ofertaram

0,5%; 1,0%; 1,5% e 2,0% de suplementação de ácido fumárico para o bagre africano (C.

gariepinus, 68,14±1,5 g) por 56 dias, e observaram que os níveis de 0,5 e 2%,


25

mostraram melhores resultados quanto ao desempenho, parâmetros hematológicos e

sobrevivência.

Entretanto, ainda há escassez de resultados consistências sobre os efeitos da

inclusão de ácidos orgânicos e seus sais em dietas na aquicultura, uma vez que, sua ação

no organismo é dependente do tipo e níveis de suplementação dos ácidos orgânicos

usados e da espécie e tamanho que estão sendo avaliados. Neste sentido, o presente

estudo teve por objetivo avaliar o ácido fumárico como aditivo alimentar em dietas para

alevinos de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus).

Material e métodos

Todos os procedimentos descritos neste experimento foram previamente aprovados pela

Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal Rural de

Pernambuco (UFRPE) através da licença nº 08/2017.

Dietas experimentais

Uma dieta basal sem suplementação de ácido fumárico foi formulada para

conter 35% de proteína bruta de modo a atender as exigências nutricionais da espécie

(NRC, 2011). Outras cinco dietas similares à dieta basal foram suplementadas com

ácido fumárico (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 3,0% da dieta) (Tabela 1). O ácido fumárico foi

adicionado às dietas substituindo o inerte em uma relação 1:1. Para a preparação das

dietas, os ingredientes foram moídos (≤ 0,8 mm), pesados, misturados, umedecidos

(25% de água), peletizados (3 mm de diâmetro), secos em estufa de ventilação forçada

(55ºC por 24 horas) e resfriados em temperatura ambiente, com posterior

armazenamento das rações em recipientes plásticos a 10°C até o fornecimento aos

peixes.

Tabela 1 – Formulação e composição química da dieta experimental

Ingredientes % Dieta

Base

Farelo de soja 34,44

Farinha de peixe 20,00

Milho 29,44


26

Amido de milho 10,00

Óleo de soja 2,00

Ácido fumárico1

0,00

Inerte2

3,1

Sup. Vitamínico/Mineral3

1,00

BHT 0,02

Composição Química Analisada

Umidade (%) 7,66

Extrato etéreo (%) 11,54

Proteína bruta (%) 35,3

Matéria mineral (%) 8,19

Cálcio (%) 1,55

Fósforo (%) 1,12

1Ácido Fumárico – Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Germany.

2Celulose MC 101 – Rhoster®. Araçoiaba da Serra – SP.

3Níveis de garantia (kg-1 produto): vit. A, 1.000.000 UI; vit. D3, 312.500 UI; vit. E, 18.750 UI; vit. K3, 1.250 mg; vit. B,2.500 mg;

vit. B2, 2.500 mg; vit. B6, 1.875 mg; vit. B12, 4 mg; Vitamina C, 31.250 mg; Ác. Nicotínico, 12.500 mg; Pantotenato de cálcio,

6.250 mg; Biotina, 125 mg; Ác. Fólico, 750 mg; Colina, 50.000 mg; Inositol, 12.500 mg; Sulfato deferro, 6.250 mg; Sulfato de

cobre, 625 mg; Sulfato de zinco, 6.250 mg; Sulfato de manganês, 1875 mg; Selenito de sódio, 13 mg; Iodato de cálcio, 63 mg;

Sulfato de cobalto, 13 mg.

As concentrações de ácido fumárico nas dietas experimentais foram analisadas segundo

a metodologia da AOAC (2005) (Tabela 2).

Tabela 2 – Concentração de ácido fumárico nas dietas experimentais.

0% 0,5% 1,0% 1,5% 2,0% 3,0%

Ác.

Fumárico

(mg/kg) 426,23 5.636,53 9.064,21 15.713,98 21.171,69 30.481,13

Peixes e condições experimentais

Alevinos de tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus) provenientes da Estação de

Piscicultura de Itiúba da Companhia de Desenvolvimento do Vale do São Francisco e

Parnaíba - CODEVASF (Porto Real do Colégio, AL) foram doados e aclimatados às

condições laboratoriais sete dias antes do início do experimento, sendo alimentados


27

diariamente até a aparente saciedade com dieta comercial (35% de PB), três vezes ao

dia (8, 12 e 16 horas).

Ao início do experimento, os peixes foram pesados (1,7±0,1g), distribuídos em

24 caixas (40L) retangulares de polietileno (13 peixes/caixa) dotadas de aeração

constante e filtros biológicos, constituindo um delineamento experimental inteiramente

casualizado (n=4). Diariamente, todas as caixas eram sifonadas para retirada de fezes e

outros resíduos, com reposição do volume perdido (15%) com água filtrada a 200 μm.

Durante 35 dias os peixes foram alimentados com as dietas experimentais em

três refeições diárias (8, 12 e 16 horas) até a aparente saciedade. O oxigênio dissolvido

(6,71 ± 0,23 mg/L), a temperatura (27,5 ± 0,3ºC) e o pH (7,5 ± 0,2) da água foram

monitorados diariamente com ajuda de uma sonda YSI (modelo F-55, EUA) e

condutivímetro portátil (AK90 – AKSO, Brasil). O nitrogênio amoniacal total

(0,33±0,123 mg/L) e o nitrito (0,25±0 mg/L) foram monitorados semanalmente com

auxílio de kits colorimétricos comerciais (Labcon®, Brasil).

Coleta e processamento das amostras

Semanalmente, após jejum prévio de 24 horas, quatro peixes de cada tratamento

foram coletados, anestesiados (benzocaína 100 mg/L) e eutanasiados por secção da

medula espinhal. Após a eutanásia, a superfície corporal foi esterilizada por aspersão de

solução etanólica a 70%, de modo a garantir um ambiente asséptico para a necropsia.

Foram amostrados 3 cm do intestino proximal para análise microbiológica, o conteúdo

alimentar foi cuidadosamente removido com solução salina estéril a 0,85%.

Posteriormente, a amostra foi macerada em 1 ml de solução salina estéril (NaCl a

0,85%), diluída sucessivamente (10-1

a 10-5

) e 100 μL foram semeados em duplicata

pela técnica Pour plate em Ágar MacConkey (Merck, Alemanha) - meio seletivo para

gram-negativas - e em Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB) (Merck, Alemanha) - meio

seletivo para enterobactérias. As placas foram incubadas a 30ºC por 24 horas para

posterior contagem do número de unidades formadoras de colônia (UFC/g) utilizando o

contador de colônias.

Análises químicas

As dietas experimentais foram analisadas quanto a sua composição química de

acordo com as normas preconizadas pela Association of Official Analytical Chemists


28

(2005). A umidade foi determinada pelo método gravimétrico, em estufa a 105 °C, até

peso constante. O conteúdo de cinzas foi determinado também pelo método

gravimétrico após 5 h em mufla a 550°C. A proteína bruta (N×6,25) foi determinada

pelo método de Kjedhal. O extrato etéreo pelo método de Soxhlet. As análises para

determinação de cálcio (espectroscopia de absorção atômica), fósforo (técnica analítica

de colorimetria) de acordo com metodologia descrita no Compêndio Brasileiro de

Alimentação Animal (2013), e ácido fumárico (Cromatografia líquida de alta eficiência

- HPLC) adicionados à dieta, foram realizadas pela empresa

CBO Análises Laboratoriais (Vale Verde, Valinhos – SP).

Variáveis de desempenho zootécnico

Ao final do período experimental, todos os peixes foram anestesiados (100 mg

benzocaina/L), pesados e calcularam-se as seguintes variáveis, com suas respectivas

fórmulas:

Ganho de peso – GP (%): GP = Pf – Pi x 100;

Taxa de eficiência alimentar – EA (%): EA = GP/I;

Taxa de crescimento específico (%/dia-1

): TCE = (ln (Pf) – ln (Pi))/t x 100;

Taxa de eficiência proteica – TEP (%): TEP = GP/IP x 100.

Onde: GP – ganho de peso; Pf – peso final; Pi – peso inicial; I – ingestão total de

alimento; IP - Ingestão total de proteína; ln – logaritmo natural e t – tempo.

Análise estatística

Os dados foram previamente analisados quanto à normalidade e homogeneidade

das variâncias. Atendidos estes preceitos, foi realizada a análise de variância de uma via

e, quando significativa (P<0,05) as médias foram comparadas pelo teste de Tukey.

Todas as análises foram realizadas utilizando o software SAS versão 9.1.

Resultados e Discussão

Desempenho zootécnico


29

Os resultados das variáveis de desempenho analisadas revelam que existiu

diferença estatística entre os tratamentos (p<0,05) (Tabela 3).

Tabela 3. Desempenho zootécnico (média ± desvio padrão) de juvenis de tilápia-do-nilo

alimentados com dietas suplementadas com ácido fumárico por 35 dias.

Ácido

Fumárico

Consumo

diário de

ração

(g/peixe/dia)

Ganho de

Peso (%)1

Taxa de

Eficiência

alimentar (%)2

Taxa de

crescimento

específico

(%/dia-1

)3

Taxa de

eficiência

proteica (%)4

0% 0,84±0,00a

857,10±8,79c

0,41±0,01d

6,45±0,03c

1,17±0,02c

0,5% 0,80±0,06a

939,71±6,39b

0,45±0,04cb

6,69±0,02cb

1,31±0,11b

1,0% 0,78±0,06a

928,80±20,02b

0,46±0,03b

6,66±0,06b

1,35±0,09b

1,5% 0,84±0,00a

1163,64±7,58a

0,52±0,00a

7,25±0,02a

1,50±0,01a

2,0% 0,84±0,01a

946,49±21,2b

0,43±0,01cbd

6,71±0,06cbd

1,26±0,02cb

3.0% 0,83±0,01a

831.47±16.49c 0.39±0.01

d 6.38±0.05

c 1.14±0.03

c

Médias sobrescritas com letras minúsculas na mesma coluna são estatisticamente diferentes (P<0,05) pelo teste de Tukey.

1 Regressão polinomial quadrática: Y = 16,13440+4,40277x-1,48601x2; R2=0,54; P<0,01.

2 Regressão polinomial quadrática: Y = 0,41504 + 0,10014x – 0,03650x²; R2=0,57; P<0,01.



Para os resultados de consumo diário de ração podemos observar que não

apresentou diferença significativa (p>0,05) entre os tratamentos. Este fator pode estar

associado a boa qualidade dos ingredientes, principalmente a farinha de peixe que ainda

é considerado um dos principais ingredientes atrativos na dieta, e o cuidado na hora de

realizar o preparo. Assim o efeito palatabilizante característico do ácido pode ter sido

suprimido pelo bom resultado final, com relação a sabor, apresentado na dieta. Este

resultado difere dos obtidos por Roth e Kirchgessner (1998), Partanen e Mroz (1999),

Boling et al. (2000) e Kluge et al. (2006) que verificaram melhor consumo de ração,

ganho de peso e conversão alimentar em leitões quando utilizaram bland de ácidos

orgânicos, ácido cítrico e ácido benzoico respectivamente.

Os resultados de taxa de crescimento específico e ganho de peso apresentaram

diferenças significativas (p<0,05) e o ganho de peso apresentou uma maior variação,

com taxa de 30% (848,31 a 1171,22), com valores diretamente proporcionais a


30

suplementação de até 1,5% de ácido fumárico nas dietas ocorrendo uma diminuição a

partir deste ponto. A ação antimicrobiana dos ácidos orgânicos favorece o

desenvolvimento de microrganismos não patogênicos, formando uma espécie de

barreira protetora contra patógenos, assim influenciando na morfologia intestinal dos

animais (SILVA, 2011) auxiliando no desenvolvimento das vilosidades proporcionando

dessa forma maior capacidade de absorção e aproveitamento dos nutrientes (MROZ,

2005) acarretando num melhor desempenho, principalmente o ganho de peso, como

observado neste presente estudo. Assim como Panda et al (2009), concluindo que a

inclusão de 0,4% de ácido butírico na dieta melhorou o desempenho de frangos de corte

e aumento das vilosidades intestinais aos 35 dias de idade em relação ao controle e Zhu

et al. (2015) adicionando 2% do ácido cítrico na dieta de juvenis de yellow catfish

(Pelteobagrus fulvidraco), resultou em um aumento significativo do ganho de peso.

Um dos mecanismos de ação dos ácidos orgânicos é a melhoria da

digestibilidade proteica, através da redução do pH no estômago e no início do intestino,

favorecendo a atividade da pepsina. A ação sobre as enzimas digestivas faz com que os

produtos finais da digestão pela pepsina e a digesta com pH baixo entram no duodeno e

estimulem a secreção das enzimas pancreáticas (BURNELL et al. 1988). Este aumento

na secreção pancreática em resposta ao efeito acidificante dos ácidos orgânicos no trato

gastrointestinal resulta no aumento da digestibilidade das dietas ofertadas

(PARTANEN, 2001). Como pôde ser evidenciado por Castillo et al. (2014) onde

observaram que suplementação de 1,5% de ácido cítrico melhorou o desempenho em

crescimento de juvenis de red drum Sciaenops ocellatus, devido ao aumento da

atividade das enzimas digestivas pepsina, tripsina, lipase e amilase. Isto pode ser um

dos fatores que auxiliou numa melhor eficiência proteica e eficiência alimentar (p<0,o5)

nos peixes que foram suplementados com 1,5% do ácido fumárico.

Ramli et al. (2005) determinou que 0,2% diformiato de potássio (KDF) para

tilápia na Indonésia melhoraram significativamente que a eficiência proteica, o consumo

de ração e ganho de peso. E nos estudos de Partanen e Mroz (1999), verificou-se o

efeito positivo do ácido fumárico na digestibilidade total aparente da matéria seca,

energia bruta, proteína bruta, e na retenção de N.

Resultados positivos foram observados nos peixes que foram suplementados

com 1,5% do ácido fumárico, mas a partir desse nível de suplementação podemos notar

que houve uma diminuição nos índices zootécnicos analisados. Omosowone et al.,

(2015) suplementando diferentes níveis de ácido fumárico em dietas para catfish


31

africano, observou melhoras no crescimento dos animais resultado de uma melhora na

utilização dos nutrientes. Porém ao submeter tecidos do fígado, rim e intestino a análise

histológica, observaram que as células apresentavam algum tipo de alteração

independente do nível de suplementação. Este fator pode explicar a diminuição

apresentada neste estudo com níveis mais altos de suplementação do ácido fumárico.

Apesar de muitos resultados positivos serem apresentados na literatura, as

respostas a utilização dos ácidos orgânicos irá depender de fatores como as espécies a

serem utilizadas, tamanhos, idade dos animais, tipos e níveis dos ácidos orgânicos e

suas combinações. Isto pode ser visto no estudo de Vielma et al. (1997), que não

observaram melhorias significativas no desempenho trutas arco-íris (Oncorchynchus

mykiss) com peso médio de 520 g, quando suplementadas com 0,48% e 1,6% de ácido

cítrico por 4 semanas. E por Gomes et al. (2011), em pesquisa com leitões recém-

desmamados suplementados com ácido fumárico (0,5%) e sua combinação com o ácido

lático e o propionato de cálcio (0,5% e 0,5%, respectivamente), não determinaram

melhora com relação ao ganho de peso diário, consumo de dieta diário, conversão

alimentar e as características intestinais.

Análise da microbiota intestinal

No presente estudo, as análises microbiológicas do intestino proximal de

tilápias submetidas a dietas com ácido fumárico revelaram que houve uma redução na

contagem total das bactérias gram-negativas a partir do 14º dia nos tratamentos com

0,5%; 1,5% e 2,0% com menor concentração na suplementação de 1,5% (p<0,05).

Porém, para os tratamentos controle e 2% de ácido fumárico houve um pico nas

contagens de UFC/g no 21º dia com posterior declínio (Figura 1), devido provavelmente

a uma colonização bacteriana tardia no intestino (Tabela 4).

Tabela 4. Contagem total de bactérias Gram-negativas (média ± desvio padrão)

presentes no intestino proximal de juvenis de tilápia-do-nilo alimentados com dietas

suplementadas com ácido fumárico por 35 dias.

Contagem total de bactérias Gram-negativas em UFC/g

Ácido Fumárico (%)

Tempo 0 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0

7 2,72±1,6x 2,55±0,1x 2,44±0,0x 2,51±0,1x 2,59±0,0x 2,61±0,1x


32

106a

106ab

106b

106b

106ab

106ab

14 1,31±1,2x

106ab

6,43±8,2x

105ab

1,87±0,1x

106a

4,86±7,6x

105b

9,87±9,8x

105ab

1,61±0,9x

106ab

21 2,72±0,2x

106a

8,70x±8,x

105bc

4,86±7,2x

105bc

3,21±4,8x

105c

1,13±0,5x

106bc

1,30±0,8x

106a

28 2,62±0,2x

105ab

6,67±5,5x

105ab

2,41±2,4x

105ab

3,63±4,0x

104b

6,34±6,6x

105a

2,25±3,5x

105ab

35 2,67±0,2x

105a

7,07±6,3x

105a

2,27±2,3x

105a

1,92±3,2x

105a

5,71±5,9x

105a

1,66±2,6x

105a

Médias sobrescritas com letras minúsculas na mesma linha são estatisticamente diferentes (P<0,05) pelo teste de Tukey.

Figura 1. Contagens totais das bactérias gram-negativas presentes no intestino proximal de juvenis de

tilápia-do-nilo alimentados com dietas suplementadas com ácido fumárico por 35 dias.

Na contagem das enterobactérias, pode-se observar que entre os tratamentos, a

suplementação de 1,5% do ácido fumárico ocasionou uma redução da contagem total já

a partir do 21º dia (p<0,05). Analisando ao longo do tempo, determinou-se que houve

uma redução absoluta na contagem total de enterobactérias a partir do 28º dia em todas

as dietas que continham o aditivo (Figura 2), indicando o efeito benéfico do ácido

fumárico no impedimento da colonização intestinal por bactérias potencialmente

patogênicas (Tabela 5).

Tabela 5. Contagem total de enterobactérias presentes no intestino proximal de juvenis

de tilápia-do-nilo alimentados com dietas suplementadas com ácido fumárico por 35

dias.

Contagem total de enterobactérias (média ± desvio padrão) em UFC/g


33

Ácido Fumárico (%)

Tempo 0 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0

7 2,78±0,01x

106a

2,56±0,x

105a

2,33±0,0x

105cd

2,44±0,0x

105bc

2,47±0,x

105b

2,29±0,0x

105d

14 4,96±8,77x

105a

1,64±0,x

105a

4,18±6,0x

105a

3,89±6,4x

105a

5,96±6,x

105a

5,27±3,0x

105a

21 2,53±0,22x

105a

2,99±2,x

104b

6,76±5,3x

104ab

4,21±4,1x

104ab

1,07±1,x

105ab

2,01±3,2x

105ab

28 2,52±0,11x

105a

0.00±0.0b 0.00±0.00

b 0.00±0.00

b 0.00±0.0

b 0.00±0.00

b

35 8,68±0,11x

105a

0.00±0.0b 0.00±0.00

b 0.00±0.00

b 0.00±0.0

b 0.00±0.00

b

Médias sobrescritas com letras minúsculas na mesma linha são estatisticamente diferentes (P<0,05) pelo teste de Tukey.

Figura 2. Contagens totais das enterobacterias presentes no intestino proximal de juvenis de tilápia-do-

nilo alimentados com dietas suplementadas com ácido fumárico por 35 dias.

A eficiência antimicrobiana dos ácidos orgânicos depende da sua constante de

dissociação (pKa) e quanto maior o pKa, mais eficiente ele será. O ácido fumárico,

aditivo testado no presente estudo, tem um alto potencial de dissociação apresentando

valores entre 3,02 e 4,38 (GAUTHIER, 2002), sendo capaz de atravessar a membrana

celular bacteriana. No caso específico das bactérias gram-negativas, este efeito é

potencializado devido a sua parede celular fina, formada por uma ou poucas camadas de

peptideoglicano e por uma membrana externa, separadas pelo espaço periplasmático

(PRESCOTT et al., 2002).


34

A colonização e o estabelecimento é um processo complexo e depende de fatores

como: composição microbiana da água, da dieta fornecida, do estágio de desenvolvimento,

do estresse sofrido e do ambiente. Isto se da pelo intestino ser um local com uma grande

variedade de microrganismos aeróbios e anaeróbios (KORSNES et al., 2006; RING et al.,

2006b; FJELLHEIM et al., 2007; NAYAK, 2010) e isto justifica a possível colonização

tardia observada neste estudo.

Estudos utilizando dietas suplementadas com ácido orgânicos, em particular, o

ácido fumárico, são escassas em termos de avaliação da comunidade bacteriana no trato

gastrointestinal de tilápias. Em ensaios in vitro, o uso de alguns ácidos orgânicos, como

ácido fórmico, acético, propiônico e butírico, inibiu o crescimento do víbrio patogênico

(V. harveyi), tendo sido o ácido fórmico que apresentou efeito inibitório mais forte

(MINE e BOOPATHY, 2011).

Dos agentes bacterianos presentes no ecossistema aquático, as

Enterobacteriaceae que são bactérias gram-negativas tem destaque podendo ser

encontrada na pele, brânquias e intestinos dos peixes (HUBER et al., 2004). Algumas

espécies, como Enterobacter spp., Klebsiella spp., Escherichia coli, Proteus spp.,

Serratia marcescens, Salmonella spp. Citrobacter spp., (LYNCH et al., 2013) são

patógenos oportunistas importantes que podem causar doença intestinal (FRENEY et al.

1988; SABAT et al. 2000; STONE et al. 2007).

Para a tilápia híbrida (Oreochromis sp.), além de alterar a comunidade bacteriana

intestinal, os animais alimentados com um suplemento de 0,6% de diformiato de

potássio incorporado a dieta também apresentaram aumento do ganho de peso (ZHOU

et al,. 2009). Kluge et al. (2006) também investigaram a microflora gatrointestinal de

leitões por um período de 35 dias e constataram uma diminuição de bactérias aeróbias,

anaeróbias totais, formadoras de ácido lático e gram-negativas.


35

3 – Considerações finais

A adição do ácido fumárico nas dietas de juvenis de tilápia do nilo apresentou efeitos

positivos nos parâmetros zootécnicos de desempenho e se mostrou eficaz na redução

das bactérias gram-negativas do intestino, quando suplementadas com o nível de 1,5%

no período de 34 dias.


36

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