naparticulas polimericas preparaÇÃo e aplicaÇÃo aula 4 qf-933-2008

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NAPARTICULAS POLIMERICAS PREPARAÇÃO E APLICAÇÃO AULA 4 QF-933-2008

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Page 1: NAPARTICULAS POLIMERICAS PREPARAÇÃO E APLICAÇÃO AULA 4 QF-933-2008

NAPARTICULAS POLIMERICAS PREPARAÇÃO E

APLICAÇÃO

AULA 4 QF-933-2008

Page 2: NAPARTICULAS POLIMERICAS PREPARAÇÃO E APLICAÇÃO AULA 4 QF-933-2008

Introdução

• Liberação de fármacos a uma velocidade e/ou numa localização indicada para a necessidade do corpo ou estado da doença em um período especificado de tempo:

– Liberação temporal: controle sobre a velocidade da liberação do fármaco

– Liberação espacial: controle sobre a localização do fármaco

Liberação Controlada de Fármacos

Hamid Ghandehari in <[email protected] >

Page 3: NAPARTICULAS POLIMERICAS PREPARAÇÃO E APLICAÇÃO AULA 4 QF-933-2008

IntroduçãoLiberação espacial

TUMOR

= Molécula do fármaco

LIBERAÇÃO EXCLUSIVA DO FÁRMACO A TIPOS ESPECÍFICOS DE CÉLULAS

Hamid Ghandehari in <[email protected]>.

Page 4: NAPARTICULAS POLIMERICAS PREPARAÇÃO E APLICAÇÃO AULA 4 QF-933-2008

Introdução

Liberação temporal

Efeitos adversos

Níveis tóxicos

Faixa terapéutica

Concentração

Min. efetiva

Sem efeito

Convencional

Liberação ordem zero

P

L

s

m

a

l

e

v

e

l

Tempo/dosagem administrada

Page 5: NAPARTICULAS POLIMERICAS PREPARAÇÃO E APLICAÇÃO AULA 4 QF-933-2008

Sistema de Liberação Controlada • O comportamento do fármaco in vivo pode ser mudado

drasticamente ao incorpora-lo num carregador. Os veículos de

liberação de fármacos coloidais podem prover:– Liberação lenta de compostos as vezes tóxicos– Habilidade de guiar uma distribuição sistêmica– Habilidade de proteger fármacos de degradação ambiental– Habilidade de direcionar a alvos específicos diretamente em

tecidos

• Sistemas coloidais em uso são:– Nanopartículas d<1m– Microesferas d>1m– Emulsões 100nm<d<5m– Lipossomas 20nm<d<2m

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Micro/nanoesferas e capsulas

NANOCAPSULAS

NANOPARTICULAS

NANOESFERASMonoliticas

ReservatorioAdapted of Lambert,G. Oligonucleotide and Nanoparticles Page,

<http://perso.clubinternet.fr/ajetudes/nano/index. html> dez/ 2003.

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METODOS DE PREPARAÇÃO

• 1- Através de polimerização de monômeros• Problemas: obtidas induzindo-se a

polimerização. Difícil controle da extensão da reação-massa molar não controlada. Purificação posterior. Interação do polímero com o ativo.

• 2- Diretamente da macromolécula ou polímero pré-formado.

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Polímeros biodegradaveis

Poly(3-hydroxybutyrate-co-valerate) or PHBV

O CH2 C n

O

Poli(acido glicolico) ou PGA

Poli(acido lactico) ou PLAO CH C n

OCH3

C

O

(CH2)5 OnPoli (-caprolactona)

ou PCL

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BIOPOLÍMEROS TÍPICOS

Polímeros biodegradáveis e bioabsorvíveis;

Degradação depende de: MM, estrutura,

solubilidade,composição da cadeia,grau de

cristalinidade.

(PLGA)

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EMULSIFICAÇÃO/EVAPORAÇÃO DE SOLVENTE

• Trata-se de um método simples, de fácil transposição de escala e cuja realização em condições assépticas garante a esterilidade final do produto.

• Em linhas gerais o polímero é dissolvido em solvente volátil em água, como CHCl3 ou CH2Cl2. Se dispersa em água por emulsificação com temnsoativo apropriado.

Algumas revisões: Couvreur et al. Eur. J. Pharm. 41, 2 (1995); Alonso. Nanoparticulate drug carrier technology. In Cohgen (Ed). Microparticuate Systems for the delivery of proteins and Vaccines. M. Dekkrt, N.Y. 2996, p. 203; Soppomath et al., J. Control. Rel. 70, 1 (2001).

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MÉTODOS MAIS IMPORTANTES DE PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS

Maria I. Rê e M.F.A. Rodrigues-IPT-2004

1-MÉTODO DE EMULSIFICAÇÃO/EVAPORAÇÃO DE SOLVENTE

FASE AQUOSA Água destilada Tensoativo

FASE ORGÂNICA Solvente orgânico

Homogenizaçào PolímeroSonicação Agente ativo

EMULSÃO Óleo em água

Extração do solventeEvaporação do solvente

SUSPENSÃO DE NANOPARTÍCULAS

Após a formação da nanoemulsão, o solventese difunde para a fase externa (extração paraa fase aquosa) até saturação da mesma. Com aevaporação das moléculas do solvente que atingem a interfase fase aquosa-ar, reestabelece-seo gradiente de concentração, ou seja, a força motrizpara a difusão do solvente orgânico das nanogotas paraa fase aquosa. Ao ser eliminado o solvente, o polímero precipita levando a formação das nanoesferas.

Sanchez et al. Int. J. Pharm. 99, 263(1993); Zambaux et al. J. Control. Rel. 50, 31 (1998); Verrechia et al., J. Biom. Mater. Res. 27, 1019 (1993)

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PREPARAÇÃO

Evaporação de solvente modificado

(nanoesferas).

SEI, 2.300 x, 20 kV, topografia

SEI, 22.000x, 20 kV, topografia

Laboratório -

Preparação: 10% (surfatante), 0,8%

(polímero), 40%etanol/acetona

2 solventes

solúveis

entre si

(um é não-

solvente

para o

polímero)

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APLICAÇÃO1- Formação de nanoesferas para substâncias lipofílicas. Este método tem sido modificado para uma emulsão múltipla do tipo água/óleo/água.

2- Limitações: a) Emulsão óleo/água deve ter uma fase dispersa (óleo) bastante fina e homogênea (requer bastante tensoativo e técnicas de agitação elevada). b) Solventes orgânicos (clorados) e tensoativos usados (álcool polivinílico, p.ex.) não são compatíveis com aplicações biológicas.

3- Alternativas: Uso de tensoativos como albumina de soro humano .

4- Propriedades otimizadas: diâmetro médio e distribuição de tamanho; re-suspensão num veículo aquoso sem agregação; teor de fármaco; taxa de liberação, taxa de degradação; esterilidade; apirogenecidade; e teor desolvente residual.

5- Variáveis: Volume da fase aquosa para a fase orgânica; concentração do polímero na fase orgânica; concentração do fármaco na fase orgânica; presença de tensoativo em ambas fases (orgânica e aquosa); solubilidade do fármaco na fase aquosa (nível de saturação); método e velocidade de agitação.

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-2-MÉTODO DE EMULSIFICAÇÃO

ESPONTÂNEA/DIFUSÃO DE SOLVENTE

Um solvente miscível em água (acetona, etanol ou metanol) é misturado ao solvente immiscível (CHCl3, ou CH2Cl2). A difusão espontânea do solvente miscívil no meio aquoso cria uma turbulência interfacial entre as duas fases levando a formação de partículas menores.

Faseorgânica Difusão rápida do

solvente miscível com água

Nanopartículas

Fase aquosa

Quanto maior a proporção do solvente miscívil na misturamenores as partículas formadas.

(Niwa et al. J. Pharm. Biopharm. 25, 89 91993).

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3-MÉTODO DE NANOPRECIPITAÇÃO

FASE AQUOSA Água destilada Tensoativo

FASE ORGÂNICA FASE ORGÂNICASolvente orgânico Solvente orgânico Óleo Polímero Polímero Agente ativo Agente ativo

Agitação

SUSPENSÃO DE NANOPARTÍCULAS

Envolve o uso de um solvente orgânico que é completamente solúvel na fase aquosa externa consequentemente a extração e a evaporação do solventenão são nescesárias para a precipitação do polímero.

nanoesferas

nanocapsulas

p.ex. acetona

Fessi et al. Eur Pat. 0275796 B1 (1987).

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1,2% PLURONIC (1)

3% (PLGA / acetona) + 4 mg de agente ativo (2)

(2) colocado em (1)

“Nanoprecipitação” – método de deslocação de

solvente

m/2m/2 n

CH2CH2OHO CHCH2O

CH3CH2CH2 HO

Metodo – Encapsulação de agente ativo

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PLGA nanoesferas – Encapsulamento de violaceina

PLGA-PLURONIC-PVA system

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4-MÉTODO DE SALTING-0UT

FASE ORGÂNICA Solvente orgânico Polímero Agente ativo

FASE AQUOSA (sal) Água destilada

Agitação Tensoativo (PVA)

EMULSÃOÁgua em óleo

Água destilada

SUSPENSÃO DE NANOPARTÍCULAS

Esta é baseada na formação de uma emulsão pela incorporação, sob agitação, de umasolução aquosa saturada de alcool polivinílico (PVA) em uma solução de polímero dissolvido em acetona. O PVA tem o papel de estabilizar a dispersão. Aqui a miscibilidade das duas fases é impossibilitada pela saturação da fase aquosa com PVA. A precipitação do polímeroocorre quando uma quantidade adicional de água é adicionadapermitindo então a difusãoda acetona para a fase aquosa. Este método é adequado quando ativo e polímeros são solúveis em solventespolares como acetona ou etanol.

Ibrahim et al. Int. J. Pharm. 87, 239 (1992); Allemann et al., Int. J. Pharm. 87, 247 (1992).

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5-MÉTODO DE EMULSIFICAÇÃO/DIFUSÃO DE SOLVENTE

FASE AQUOSA (saturada em solvente orgânico)

Água destilada Tensoativo

FASE ORGÂNICA (saturada em água)

Agitação Solvente orgânico Polímero

Agente ativoEMULSÃOÓleo em água

Água destilada

SUSPENSÃO DE NANOPARTÍCULAS

Envolve o uso de um solvente parcialmente miscível em água, que é previamente saturado em água para garantir o equilíbrio termodinâmico inicial de ambas as fases. A precipitaçãoOcorre quando uma quantidade adicional de água é adicionado ao sistema, permitindo então a difusão do solvente para a fase aquosa.

Formada a emulsão do tipo óleo/água e o tensoativo éadsorvido na superfície das gotas da fase orgânica dispersas na fase aquosa

A adição de água ao sistema desestabiliza o estado de equilíbrioe promove a difusão do solvente na fase aquosa levando à formaçãodas nanopartículas

Leroux et al. Eur. J. Pharm.Biopharm. 41, 14 (1995).Quintanar-Guerreo et al.Pharm Res. 15, 1056 (1998).

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VANTAGENS

Este método apresenta algumas vantagens sobre o método de nanoprecipitação como a possibilidade de controle do tamanho das nanopartículas. Estas apresentam tamanhos superiores àquelas preparadas por nanoprecipitação, normalmente entre 250-600 nm, dependendo de vários parâmetros como tipo e concentração do tensoativo e do polímero, tempo e velocidadede agitação.

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Métodos para a preparação de nanopartículas carregadas com fármacos convencionais

--------------------------------------------------------------Método Polímero Fármaco Tamanho(nm)o/w PLA, PLA-b-PEG Lidocaine 247-817 o/w PLA-PEG-PLA Progesterone 193-335o/w PLGA Dexamethasone 109-155o/w PEO-b-PBLA Doxorubicin 37solv-disp PMLAiPr Halofantrin 150-160solv-disp PMLAnHe Halofantrin 90-190solv-disp PLGA Vancomycin 160-170solv-disp PLGA Procaine Hydr. <210solv-disp PCL, PLA, Nimodipine 81-132

PCL-co-PLA o/w PEO-b-PCL Enalapril maleate 50 o/w PLA Lidocaine 115-123b

a PBLG = poly(-benzyl L-glutamate); PBLA = poly(-benzyl L-aspartate); PMLAiPr = poly(-malic acid isopropil ester); PMLAnHe = poly(-malic acid neohexil ester). b Dimension of unloaded particles. 

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PREPARAÇÃO DE MICRO E NANOPARTICULAS CARREGADAS COM FÁRMACOS PROTEÍCOS.a Método Polímero Proteina Tamanho (nm)

w/o/w PLGA L-asparaginase 196-226 w/o/w PLGA BSA sw/o/w PLGA BSA 100-200w/o/w PLGA, PLA BSA sw/o/w PLGA/PLA blend BSA sw/o/w PLGA, PCL BSA 20-1000w/o/w PLA Protein C 230-340 w/o/w PLGA FITC-BSA s

FITC-HRPw/o/w PLGA TRH 250-800 w/o/w PLGA IL-1+BSA so/w PLGA Rism. porcine so/w Biod. polym. Peptides -

PLGA BSA 300-600w/o/w PLGA rhBMP sw/o/w PEG-PLGA BSA - w/o/w PEG-co-PBT BSA s

w/o/w PLGA-b-PEO BSA s

a s = microsize; CP = coprecipitation; FITC-BSA = fluorescein isothiocyanate-labeled BSA; FITC-HRP = fluorescein isothiocyanate-labeled horseradish peroxidase; IL-1 = recombinant human interleukin-1; rhBMP = recombinant human bone morphogenetic protein-2

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Spontaneous emulsification solvent diffusion (SESD) method

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METODOLOGIA

No método original SESD, PLGA é dissolvido na mistura de solventes orgânicos consistindo em diclorometano e acetona, que são os solventes orgânicos menos miscíveis em água e um solúvel livremente em água, respectivamente. A solução polimérica obtida acima é lentamente vertida no emulsificante contida na fase aquosa com agitação mecânica. As nanopartículas são formadas via dos seguintes passos: quando a solução polimérica é agregada, gotículas do emulsificante são formadas na fase aquosa; acetona rapidamente difunde para fora de cada gotícula de emulsificante, reduzindo drasticamente seu tamanho a ordem-nano e consequentemente processo de evaporação do solvente, no qual o diclorometano remanescente é removido do sistema, fazendo que as gotículas solidifiquem para finalmente formar as nanopartículas poliméricas.

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COMENTÁRIOS

Este processo parece bastante razoável, baseado num fenômeno físico-químico interessante. Entretanto, devido a quantidade considerável de diclorometano residual, as partículas tendem a se agregar durante o processo de evaporação do solvente. Logo, quando uma grande quantidade de solução polimérica é usada, a agregação não pode ser prevenida devido a que a probabilidade de colisão entre partículas na fase aquosa poderia aumentar. Alem disto, o processo de recuperação e purificação no método SESD original deverá ser melhorado, já que a ultra-centrifugação ( 156200 x g, 1 h) é inaceitável para processos industriais em grande escala de produção. Também que se evitar o uso de solventes clorados tais como diclorometano devido a sua toxicidade.

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No processo modificado-SESD, a mistura de dois solventes orgânicos miscíveis em água, tais como etano:acetona ou metanol:acetona foram empregados em vez de usar a mistura de diclorometano e acetona. Esta alteração previne a agregação de partículas ainda em condições de alta quantidade de solução do polímero, resultando na melhora do rendimento aceitável para propósitos industriais. Esta alteração também permite alguma vantagens adicionais; por exemplo o uso de solventes tóxicos como o diclorometano o processo de purificação e recuperação podem ser simplificados usando ultrafiltração para omitir processos de evaporação do solvente; e nanopartículas uniformes podem ser obtidas sempre por agitação suave.

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Figura 2. Efeito de quantidade adicionada de PLGA sobre orendimento de nanopartículas. (●) método modificado SESD(Etanol:acetonas 4:6); (O)SESD original (DCM:acetona 4:96)

Figura 3. Efeito da concentração de PLGA no rendimento de nanopartículas preparadas por etanol:acetona 4:6.

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Tabela 1. Diametro e polidispersidade de nanopartículas de PLGA preparadaspelo método modificado-SESD.

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Figura 3. Efeito da concentração de PVA no rendimento da nanopatícula preparadapor etanol:acetona 4:6. PLGA 8%.

Tabela 2. Diâmetro médio e PVA residual nasnanopartículas de PLGA após lavagem e ultrafiltração

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Galindo-Rodriguez et al. Pharm. Res. 21, 1428 (2004)

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Preparação de nanopartículas

Salting-out. Tipicamente, 50 g de solução aquosa de cloreto de magnésio hexahidratado (30,4%, p/p) e PVAL (5- 21%, p/p) são agregados sob agitação mecânica a 30 g de fase orgânica contendo 9,0% (p/p) de E L100-55 (polímero eudragit) em acetona. A agitação foi mantida a 2000 rpm por 15 min. Após emulsificação, 50 g de água pura foram adicionados para induzir a difusão do solvente orgânico na água e a formação das nanopartículas.

Emulsificação-Difusão. Para este método, 30 g de uma solução aquosa de PVAL (7–21%, p/p) foi adicionado sob agitação a 21 g de uma solução orgânica de polímero em álcool benzílico (14.3%, p/p). A emulsificação resultante o/w foi agitada continuamente a 2000 rpm por 15 min, e logo, 660 g de água foram introduzidos para permitir a difusão do solvente orgânico para a água. levando a formação das nanopartículas.

Nanoprecipitação. A fase orgânica foi preparada por dissolver E L100-55 (360–810 mg) em 25 ml de solvente orgânico (acetona, dimetil sulfoxido, álcool isopropílico, etanol, ou lactato de etila). A solução orgânica foi adicionada na fase aquosa (50 ml) contendo PVAL (0.4%, p/p) e agitada magneticamente.

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Tabela 1. Influencia da concentração de PVA na fase aquosa no tamanho da nanoparticula preparada por salting-out e emulsificação-difussão

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Para copolímero como PVA na interfase da gotícula, além da redução da tensão interfacial outro citério de estabilização inclui: (1) coberta total da gota, (2) uma forte fixação na interfase, (3) formação de um filme grosso e (4) uma conformação ótima das cadeias do polímero na fase externa. Estes fenômenos tem sido pesquisados para o PVA na interfase solvente orgânico/água. De fato, dois importantes conclusões foram concluídos destes estudos: (i) interpenetração é o mecanismo proposto para explicar a ligação do PVA na interfase da gotícula da emulsão, e(ii) a forte interação do PVA na interfase leva a uma adsorção irreversível do PVA na superfície da nanopartícula. Dados dp PVA residual na nanopartícula, que estão presente, demonstram a presença de PVA não- removivel na nanopartícula. Isto sugere que PVA-E L100-55 interpenetração deveria ocorrer na interfase da gotícula durante a emulsificação (Figura 2). Logo, é assumido que o pacote de cadeias compactada resultam desde uma interpenetração levando a formação de filmes rígidos na interfase da gotícula que resiste cortes e confere estabilidade mecânica para as gotículas da emulsão durante a emulsificação.

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Tabela II mostra os valores solvente-água que aumentam na seguinte ordem: etanol < dimetil sulfoxido < álcool isopropilico < etillactato < acetona. Comparando a mesma concentração de polímero (p.ex. 14.4 mg/ml), o tamanho médio da NP preparado usando estes solventes aumenta quase na mesma ordem: etanol < dimetil sulfoxido <álcool isopropil < acetona < etillactato. Etanol, mostrando o valor menor (27.0 MPa1/2), produz a menor NP. Inversamente, acetona, com o valor mais alto (34.4 MPa1/2), deu a NP com o tamanho médio maior. Em geral, esta primeira aproximação sugere que a afininidade solvente-água, correspondendo ao menor valor solvente-água, poderia melhorar a difusão do solvente na fase aquosa externa e logo permitir obter a menor NP.

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CONCLUSIONSOs tamanhos por salting-out (123–710 nm) e emulsificação-difusão (108–715 nm) foram maiores que os de nanoprecipitação (147–245 nm). Para os método o tamanho das naniopartículas foram associados as propriedades físico-químicas do solvente e da fase aquosa usadas para suas preparações. Tanto para salting-out como para emulsificação-difusão a nanoemulsão formada foi analisada por MEV e o papel do PVA como emulsificante durante o processo de emulsificação foi amplamente descrito (teoria de emulsificação). Vários mecanismos de estabilização fora, envolvidos: (i) na interfase da gotícula na cadeia polimérica pode não somente reduzir a tensão superficial mas também induzir uma estabilização mecânica como estérica, e (ii) na centro da solução as cadeias de PVA podem aumentar a viscosidade da fase externa induzindo uma estabilização hidrodinâmica. As características do solvente como solubilidade e parâmetros de interação foram considerados para relacionar as propriedades do solvente na formação das nanopartículas (fenômeno de difusão dirigida)(diffusion-stranding phenomenon). Em geral, estas foram encontrada proporcionais a o tamanho das nanopartículas. de outra maneira, usando E L100-55 como polímero, solventes com um (interação de solvente-água) ≈ 11 (ou Δ (solubilidade solvente-água) ≈ 27 MPa1/2) permitem nanopartículas com um faixa larga para obter tamanhos médios.

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Isto demonstra que interação de água com solvente e assim movimento de difusão do solvente, joga um papel importante na explicação da variação do tamanho das nanopartículas pelo método de nanoprecipitação. Finalmente, estes experimentos mostram não somente o papel de cada componente básico (solventes, polímeros, e sais) nas propriedades físico-químicas das fases aquosa e orgânica (viscosidade, tensão superficial e solubilidade), mas também o efeito de tais propriedades na formação das nanopartículas. Isto é importante já que este conhecimento é importante no controle racional de parâmetros ou variáveis que influenciam a formação das nanopartículas permitindo o desenho de nanopartículas com determinados tamanho, características especificas para alvos dirigidos para atingir células ou órgãos.

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APLICAÇÕESE ALVOS DIRIGIDOS

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MOLECULAR PHARMACEUTICS. 2, 373-383 (2005)

A função mais importante da transferina (Tf), uma glicoproteína encontrada abundantemente na sangue, é transportar ferro através da sangue a células através de receptores (TfR). Como os receptores TfR são sobre-expressados em tecidos malignos comparados com os normais, Tf é também pesquisado intensamente como ligante para fármacos com alvos dirigido.

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Formulação de NPs: NPs contendo Tx foi preparada pelo método de emulsão-evaporação. Em breve: PLGA e Tx em cloroformio e logo emulsificado em 5% de PVA. A emulsificação foi feita na presença de um sonicador. Após agitação por 12 h e evaporação do solvente as NPs foram lavadas com água para eliminar o PVA e logo liofilizadas.

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Figure 3. Internação celular de nanopartículas com Tf-conjugado e não-conjugado em células MCF-7. Uma suspenssão de NPs (100 ug/mL) foi incubado com MCF-7 (5 x 104 células) por 1 h, as células foram lavadas e o nível de NPs na célula foi determinado por HPLC. Para determinar a competitividade na inibição de internalização das NPs-Tf conjugadas, um excesso de Tf livre (50 ug) foi adicionado ao médio antes de incubar as células com NPs de Tf-conjugado.

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Atividade anti-proliferativa do Tx ( ▄ ), Tx-NPs(●) e Tx-Tf-NPs (▲)

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RETENÇÃO INTRACELULARPOR

FLUORESCENCIA CONFOCAL

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MICROSCOPIA DE LASER

CONFOCAL

Page 51: NAPARTICULAS POLIMERICAS PREPARAÇÃO E APLICAÇÃO AULA 4 QF-933-2008
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PCL/ microesferas de violaceina– Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)

Violaceina dispersa em matriz poliméricaBarra = 10 m

Durán e De Azevedo, 2005

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Gel + nanoparticulas(multitracking)

Nanoparticulas + violaceinaMatriz do gel

Microscopia Confocal: gel e nanopartículas

Duran e De Azevedo, 2005

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Retenção intracelular do Taxol (Tx) por flurescência confocal

fluoroforo: 6-cumarina

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Conclusões

Foi demonstrado que a conjugação a Tf nas nanopartículas resulta em maior internação do fármaco na célula, sustentando uma retenção intracelular do fármaco e assim melhorar o efeito anti-proliferativo do agente antineoplásico encapsulado nas células cancerosas. Os dados com Tf-conjugado a NPs numa cultura celular resistente ao fármaco sugere que a resistência pode ser sobre passado por retenção intracelular do fármaco. É possível que a liberação do fármaco das NPs poderia influenciar ainda mais o efeito anti-proliferativo da formulação e isto poderia ser otimizado. Seria de interesse determinar como outros ligantes, tais como ácido fólico ou fator de crescimento epidermal, para os quais os receptores são sobre expressados na maioria das células cancerosas, seguindo sua conjugação a NPs influenciariam a retenção celular do fármaco e sua eficácia terapêutica.

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REDE NANOTUB0SDE CARBONOCNPq/MCT

AGRADECIMENTOS

CNPq/MCT