mutações no gene nt5e e calcificações arteriais

Universidade Federal do Triângulo MineiroInstituto de Ciências Biológicas e Naturais (ICBN)

Disciplina de Biologia Molecular Aplicada

Professor André Luiz Pedrosa

Mutações no gene NT5E e calcificações

arteriais

Juliana de Morais Palmieri da SilvaJuliana Mendes Junqueira

Lais de Melo Valente Verônica Nascimento Mendes

Curso de BiomedicinaUberaba - MG

Novembro/2014

Objetivo/justificativa do artigo

Tentar elucidar as bases genéticas e

moleculares das calcificações

arteriais, as quais estão associadas a

um risco cardiovascular aumentado

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

Introdução MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

A calcificação arterial foi considerada uma doençadesconhecida até pouco tempo;

2008 - NIH (National Institutes of Health) – Programapara Doenças não diagnosticadas;

Inicialmente era considerada uma resposta passiva paraeventos degenerativos;

Em uma família, nenhum dos pais era afetado peladoença, somente os filhos.

Um depósito de cálcio nas artérias localizadas na metade

inferior do corpo e nas articulações das mãos e dos pés dos

pacientes;

Acomete a camada íntima ou média de vasos;

Associada a um risco excessivo de eventos

cardiovasculares;

Calcificação arterial infantil idiopática (calcificação arterial

generalizada da infância).

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

ALC

IFIC

AÇ

ÕE

S

AR

TE

RIA

IS

CALCIFICAÇÃO ARTERIAL:

Introdução

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

PARA REALIZAÇÃO DESSE ESTUDO:

Introdução

Primeiramente foi realizado esse estudo para avaliar o início da

doença em indivíduos adultos de três famílias;

Indivíduos das Famílias 1 e 3 – aprovadas do NIH pelo Programa

de doenças não Diagnosticadas;

Estudos genéticos para Família 2 foram aprovados pelo Comitê

de Ética da universidade Azienda Ospedaliera Universitaria San

Giovanni Battista (Universidade de Torino, na Itália);

Todos informados com consentimento escrito.

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

Figura 1. Genealogia do estudo dos pacientes.

O painel A mostra a genealogia dos estudos das três famílias (família 1).

Símbolos abertos indicam membros não afetados na família, enquanto que os

símbolos vermelhos mostram membros afetados. Setas indicam os

probandos. □ sexo masculino/ o: sexo feminino/ Símbolos cortados:

falecidos/ Dupla linha horizontal: consanguinidade/◊: número desconhecido

de indivíduos/ △: gravidez perdida

Introdução

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

ISITB: Índice pressórico tornozelo-braquial

Introdução

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

ISManifestações clínicas

Extensa oclusão das artérias ilíaca, poplítea e tibiais, com

vasta colateralização;

Calcificação extensa com áreas de arteriomegalia (aumento

do diâmetro das artérias);

Revelou calcificação das cápsulas articulares justa-articulares

dos dedos , pulsos, tornozelos e pés.

Todos os 4 irmãos dessa paciente:

Diminuição da claudicação intermitente;

Diminuição hemodinamicamente significante da doença

arterial periférica obstrutiva das extremidades inferiores;

Oclusão da artéria poplítea;

Três dos cinco irmãos mostraram que as lesões obstrutivas

eram difusas e intensamente calcificadas;

Uma das irmãs tinha calcificações vasculares circunferenciais

periféricas proeminentes nas extremidades inferiores;

Obstrução vascular extensiva com calcificação difusa

Manifestações Clínicas – Família 1

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

Família 3

Paciente II.1

Família 1

Paciente VI.1

Família 2

Paciente II.4 Família 1

Paciente VI.1

Família 1 - Paciente

VI.1

Manifestações clínicas

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

FAMÍLIA 2

Mulher 68 anos

Dor articular intensa nas mãos tratada com

glicocorticóides (tratamento sem efeito)


MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

Condrocalcinose;

Níveis séricos de eletrólitos, como cálcio e

colesterol, foram normais;

Duas irmãs, de 73 e 70 anos de idade, também

tiveram dor nas extremidades inferiores

e tiveram calcificações vasculares que

eram semelhantes àquelas do probando .

Manifestações Clínicas – Família 2Família 2

Paciente II.4


FAMÍLIA 3

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

Mulher, 44 anos

Com 42 anos teve parestesia nas pernas, avaliaçõesreumatológicas negativas e isquemia na perna direita –procedimento cirúrgico bypass


MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

Extensas calcificações nas artérias distais, com preservação

das artérias carótidas, aorta e das

artérias coronárias;

Isquemia na perna direita, tendo

sido solicitado um desvio (bypass)

femoro-poplíteo;

Os níveis séricos de proteína

C-reativa, colesterol, lipídios,

cálcio, fosfato e vitamina D

estavam dentro da normalidade.

Manifestações Clínicas – Família 3

Família 3

Paciente II.1


Conceitos básicos:

Pontuação LOD : uma estimativa estatística para saber se dois

genes, ou um gene qualquer e um gene da doença, são susceptíveis

de serem localizados perto um do outro em um cromossomo e,

portanto, são susceptíveis de serem herdados juntos. Uma

pontuação LOD de 3 ou superior a 3 é geralmente entendida como

significando que dois genes estão localizados perto um do outro no

cromossomo.

Touchdown-PCR: pré ciclos de amplificações, onde há variação

na temperatura de anelamento que reduz o número de bandas

inespecíficas da reação.

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

Materiais & Métodos + Resultados

1) CULTURA DE FIBROBASTOS

Foram preparadas a partir de uma biópsia por punção contendo 4

mm de amostra de pele;

Obtidas de cada paciente e cultivadas em meio Eagle modificado

por Dulbecco (DMEM);

Contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-

estreptomicina;

As células foram alimentadas a cada dois dias e divididas 1:2 até a

confluência.

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

2) ANÁLISE de POLIMORFISMOS de NUCLEOTÍDEO

ÚNICO (SNPs)

DNA genômico na Família 1 foi isolado a partir de leucócitos

periféricos e genotipados por genotipagem array;

Amostras de alelos homozigotos foram geradas com a utilização

de Software GenomeStudio;

Regiões anômalas de homozigose foram identificadas visualmente

e confirmadas por meio de imputação de haplótipo (ENT programa);

Uma pontuação LOD foi estabelecida mediante o uso de análise

paramétrica de ligação múltipla.

Materiais & Métodos + Resultados MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

3) ANÁLISE de MUTAÇÕES da CD73

Éxons codificantes e junções íntrons-éxons do gene NT5E foramamplificados por PCR-touchdown

• 50 ng de DNA genômico

• 3 μM de oligonucleotiótidos senso e antissenso

• 5 μL de HotStart Master Mix

• Em um volume final de 10 μL

Os produtos de PCR foram sequênciados em ambas as direçõescom o uso do Kit Big Dye terminator e um sequenciador capilarautomatizado;

Compararam as sequências derivadas de eletroferograma com sequências de referência para o gene NT5E;

Screening de 200 amostras de DNA de indivíduos-controles daraça branca foi realizado por meio de análise de discriminação alélica5’-nuclease(TaqMan)

Materiais & Métodos + ResultadosM

UT

AÇ

ÕE

SN

OG

EN

EN

T5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

SNPs - RESULTADOS

Foram identificadas mutações bialélicas do tipo nonsense, do tipo

missense e mutações com mudança de fase;

Devido a inserções de um único nucleotídeo na região da ecto-

5'nucleotidase do gene NT5E;

Gene que codifica a enzima CD73, a qual gera adenosina

extracelular, imediatamente a downstream ao gene da ENPP1 na via

extracelular de degradação do ATP.


MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

A linhagem consanguínea da família 1, com uma doença

confinada a uma geração, sugeriu herança autossômica recessiva;

Procuraram por uma região do genoma na qual todos os cinco

irmãos afetados eram homozigotos e idênticos por meio da

descendência, mas da qual ambos os pais eram heterozigotos;

Havia apenas uma dessas regiões em todo o genoma: uma região

de 22,4 Mb no cromossomo 6q14, contendo 7977 SNPs genotipados e

92 genes;

A pontuação na escala LOD para essa região nesta família, foi de

4,81.


MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

Análise de mutações da CD73 - RESULTADOS

Dos 92 genes desta região, apenas três foram avaliados:

• Os genes ATG5 e CASP8AP2, porque estavam envolvidos em

processos celulares degenerativos que podem levar à calcificação;

• O gene NT5E, porque o seu substrato enzimático é o produto da

ENPP1, e que mutações nesse gene geram calcificações arteriais em

crianças.

O sequenciamento direto identificou uma mutação nonsense

homozigota (c.662C →A, resultando em p.S221X) no éxon 3 do gene

NT5E em todos os irmãos da família 1 e a mesma mutação nonsense

foi encontrada no estado heterozigoto em ambos os pais



TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

Figura 2. Resultados de estudos genéticos e enzimáticos na família

1.

O painel A mostra ensaios de polimorfismos de nucleotídeo único

(SNPs) das amostras homozigotas dos cinco irmãos afetados da

família 1 e também das amostras dos seus pais.

Região de homozigose

idêntica entre os pacientes

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS


1.

O painel B mostra sequências cromatográficas de um controle, um dos

pais de um membro afetado da família 1 e de um membro afetado; a

mutação sem sentido (p.S221X) é indicada


4) ESTUDOS de EXPRESSÃO

RNA isolado culturas de fibroblastos (RNeasy kit ® - Qiagen);

cDNA gerado de amostras de 1μg de RNA (SuperScript ® II

Reverse Transcriptase – Invitrogen);

Ensaio de qPCR + tecnologia SYBR Green ® expressão do gene

NT5E

Método 2-ΔCt =2-(Ct de CD73 – Ct de 18S)

Primers


TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

4) Estudos de expressão - RESULTADOS

⇩ da expressão do mRNA do gene NT5E ⇨ pacientes VI.1 e VI.4(família 1);

Afetados da família 2 ⇨ homozigotos para mutação missensec.1073G→A (p.C358Y) no éxon 5 do gene NT5E;

Mãe dos afetados da família 2 ⇨ heterozigota para estavariante do aminoácido (conservado em 16 espécies);

Membro afetado da família 3 ⇨ heterozigoto para a mutaçãoc.662C→ A (família 1) + mutação nonsense c.1609dupA(V537fsX7) no éxon 9 do gene NT5E

- OBS.: 400 alelos-controle pareados etnicamente ⇨ nenhuma dasmutações relacionadas.


TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS


1.

O painel C mostra a expressão do mRNA (DNA complementar

[cDNA]) do gene NT5E nos pacientes VI.4 e VI.1 e a sua comparação

com os respectivos controles.


Fig.1. (Apêndice Complementar) Mutações no gene NT5E nas

famílias 2 e 3

A. Sequência cromatográfica dos membros afetados da família 2,

mostrando a mutação missense (p.C358Y). Ao lado do cromatograma

está a comparação do aminoácido na posição 358 entre as espécies.

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

ISMateriais & Métodos + Resultados

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

Fig.1. (Apêndice Complementar) Mutações no gene NT5E nas

famílias 2 e 3

B. Sequências cromatográficas da família 3, mostrando a mutação

p.S221X e uma inserção de nucleotídeo único (p.V537fsX7)7,

respectivamente, ao nível dos nucleotídeos.


MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA


5) TÉCNICA de WESTERN BLOTTING para CD73

Células cultivadas até a confluência

Tripsinizadas + sedimentadas + lisadas

Solução

50 mM de Tris-HCl a pH 7,4;

150 mM de NaCl;

2 mM de EDTA;

1% NP-40;

1% de SDS (tampão de RIPA)

Suplementação:

0,5% Triton-x

1x Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail ® - Roche

10 minutos no gelo ⇨ vórtice a 4ºC (5 minutos) + centrifugaçãoa 15.000 xg ⇨ quantificar a proteína sobrenadante

5) TÉCNICA de WESTERN BLOTTING para CD73

30 mg de proteína + solução SDS para corrida em gel

Gel de poliacrilamida (PAGE) de 4 a 20% + eletroforese (1,5 hora)

Transferência das proteínas ⇨ anticorpos anti-CD73 + actina

Resultados

⇩⇩⇩ expressão da proteína CD73

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

Actina

Afetados Controles

Fig.2. (Apêndice Complementar) Western blot de fibroblastos

mostrando a proteína CD73 ausente nos pacientes VI.4 e VI.1,

comparados com controles. A actina foi utilizada como um controle

para garantir uma carga proteica igual.


MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA


6) ENSAIO ENZIMÁTICO da CD73

Fibroblastos ⇨ lavados com solução de:

2 mM de MgCl2

120 mM de NaCl

5mM de KCl

10 mM de glicose

20 mM de HEPES

Tampão de incubação: solução de lavagem + 2mM de AMP

Células encubadas a 37ºC, por 10 minutos

Medição de fosfato inorgânico (Pi) ⇨ SensoLyte MG Phosphate ®

- AnaSpec

- OBS.: medições do Pi ⇨ normalizadas para mg de proteína


6) Ensaio enzimático da CD73 - RESULTADOS

Atividade da proteína CD73 quase ausente

Pais dos pacientes ⇨ ~72% do nível do controle

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

Figura 2. Resultados de

estudos genéticos e

enzimáticos na família 1.

O painel D mostra uma

deficiência na atividade

enzimática da CD73

(representada pela produção

de fosfato inorgânico

dependentemente de AMP)

em culturas de fibroblastos

dos pacientes VI.4 e VI.1 da

família 1

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

Fig. 3. Atividade enzimática da CD73 em fibroblastos dos controles, dos pais heterozigotos da família 1 e dos indivíduos afetados. Os dados

representam as médias ± os desvios padrões (standard deviations – SD) e foram analizados utilizando-se do One-way ANOVA com o teste t de

comparação múltipla de Dunnett. Controles X pais dos afetados e controles X afetados (***), com p<0,0001. Duas amostras coletadas em triplicata foram

descritas nos grupos dos controles e dos pais; três amostras coletadas em triplicada foram descritas no grupo dos afetados.


Fo

sfat

o i

no

rgân

ico (μg

/μgde

pro

teín

a)

Controles Pais Afetados

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA


7) CLONAGEM de MUTAÇÕES e PRODUÇÃO de LENTIVÍRUS

Foram utilizadas sequências de primers em ambas as direções

Para a transdução:

Meio de crescimento contendo 6µg/mL de polibreno

Adicionado ao meio de blasticidina 4 dias depois

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA


8) TRANSFECÇÃO em CÉLULAS HEK293

A célula HEK293 cultivados em meio Eagle suplementado com

10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina.

1µg de pCMV-Sport 6 + cDNA mutado

para o gene NT5E

proteína verde fluorescente

Transfectados em células HEK293

Analise para a atividade de CD73 3 dias após a transecção

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA


9) ENSAIOS IN VITRO de FOSFATASE ALCALINA e CÁLCIO

Os fibroblastos dos pacientes coloração tripisinização

As culturas foram tratadas com

0,1µM de dexametazona

50µM de acido ascórbico-2-fosfato

10mM de β-glycerol fosfato

Meio com 10% de soro bovino fetal e 1% penicilina-estreptomicina

21 ͦ dia

Lavadas com tampão salino fosfato

Fixados com formalina a 10% por 10 minutos

Cristais fosfato de cálcio corados com alizarina vermelha Sa 2%; pH4,2

Fosfatase alcalina foi quantificada pela medição de p-nitrofenolproduzida, medida por absorção a 405nm

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA


Estudos Celulares - RESULTADOS

Fig.3. Estudos dos fibroblastos obtidos do paciente VI.4 da

família 1. O painel A mostra os resultados do aumento da

concentração da fosfatase alcalina tecido não-específica (TNAP) em

fibroblastos de um controle e do paciente VI.4 após a incubação por 3

dias em meio calcificante. O aumento exacerbado nas células do

paciente (imagem central) foi reduzido pela adição diária de 30 μM de

adenosina ao meio de incubação (imagem à direita).

Materiais & Métodos + ResultadosM

UT

AÇ

ÕE

SN

OG

EN

EN

T5

E&

CA

LC

IFIC

AÇ

ÕE

SA

RT

ER

IAIS

Fig.3. Estudos dos fibroblastos obtidos do paciente VI.4 da família 1.O painel B mostra a atividade da TNAP em fibroblastos de um controle e dopaciente VI.4 após a incubação por 3 dias em meio calcificante. A transduçãocom um vetor-controle expressando a β-galactosidase apresentou um efeitodiscreto na atividade da fosfatase alcalina, enquanto que a transdução comum vetor que codifica a CD73 reduziu significativamente a atividade dessaenzima; a incubação com 30μM de adenosina resultou em níveis da TNAPsimilares aos vistos nos controles. Os dados apresentados correspondem atrês experimentos que foram analisados pelo método de análise da variânciamediante comparação com o teste hoc do múltiplo de Dunnett’s. Os valoresde p foram apresentados para permitir a comparação com a ausência detratamento. As barras I indicam os desvios padrão.

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA


Fig.3. Estudos dos fibroblastos obtidos do paciente VI.4 da família 1.O painel C mostra os efeitos das intervenções na formação dos cristais defosfato em fibroblastos de um controle e do paciente VI.4. A coloração para ocálcio com vermelho de alizarina S mostrou uma cristalização abundante nascélulas do paciente, como é visível na comparação com a coloração dascélulas controle, após 21 dias em meio calcificante. A formação de cristais decálcio foi evitada/prevenida pela transdução com um vetor lentiviral quecodifica a CD73, mas não por um vetor-controle expressando a β-galactosidase, e pelo tratamento a cada 4dias com 1 mM de levamisol; otratamento diário com 30 μM de adenosina extinguiu parcialmente oprocesso de calcificação.

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

Bisfosfanato análogo ao pirofosfato, inibidor da

calcificação tecidual

Dipiridamol fármaco antitrombotico, poderia promover o

salvamento da adenosina por inibir a recaptação celular da

mesma, onde seria degradada.

Outras possibilidades terapeêticas uso de antagonistas

dos receptores de adenosina ou um inibidor direto da fosfatase

alcalina, como o Lanzoprazol


Discussão + Conclusão MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

Fizeram várias revisões de literatura pra mostrar como essadoença já vinha sendo estudada e sem muito sucesso noresultado.

A calcificação arterial medial das extremidades inferiores comcalcificação periarticular foi descrita primeiramente porMagnus-Levy em 1914 e novamente por Levitin em 1945.

Sharp em 1954 fez um relato de dois irmãos que foramafetados e depois registrou na base de dados OMIM(Banco dedados Online sobre Herança Mendeliana em Humanos – númeroOMIM, 211800)

Nosaka e More com colaboradores descreveram casos isoladosficando um total de sete casos publicados até 2001.

Este trabalho descreveu as bases moleculares e enzimáticasdessa desordem em nove pacientes com três diferentes

Evidencias consideráveis apoiam a associação da doença vascular

dessas famílias com mutações no gene NT5E;

Os resultados das análises de segregação foram consistentes com os

observados nas famílias estudas, e a mutação nonsense (p.S221X) e a

inserção de um único nucleotídeo (p.V537fsX7) prevê proteínas CD73

truncadas;

A mutação missense (p.C358Y), prediz uma modificação patológica

em um aminoácido conservado ao longo da evolução e é localizada no

domínio crítico da nucleotidase da proteína CD73;

A mutação nonsense resultou em uma redução significativa nos

níveis de RNAm da CD73 e da própria proteína CD73 em células

cultivadas;

Cada uma das três diferentes mutações nas três famílias estudadas

produziu essencialmente a proteína CD73 não funcional.

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

ISDiscussão + Conclusão

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

AMPATP

ENPP1

Adenosina

PPi Pi

CD73

TNAP

Calcificação

Discussão + Conclusão

Panorama atual MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

Nesse estudo foram identificadas mutações no gene NT5E emmembros de três famílias com calcificações sintomáticas, tantoarteriais quanto articulares (cápsulas articulares); O gene NT5E codifica a nucleotidase CD73, a qual atua naconversão do AMP em adenosina;

Os resultados apresentados apresentam papel importantepara essas vias metabólicas, permitindo a inibição da calcificaçãotissular ectópica.

ENPP1

CD73

2009 = 23

2010 = 322

2011 = 360

2012 = 424

2013 = 526

2014 = 335

Referências Bibliográficas

Disponível em:

<http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAsgEAK/tecido-osseo>.

Acesso em 16/11/2014, às 13h04min

Disponível em: <

http://www.lume.ufrgs.br/bitstream/handle/10183/12713/000633516.p

df?sequence=1>. Acesso em 23/11/2014, às 10h45min

Disponível em: <

http://meriva.pucrs.br/dspace/handle/10923/1439>. Acesso em

23/11/2014, às 12h02min

Disponível em <http://www.biotec-

zone.net/?do=vernoticia&id=941 Acesso em 17/11/2014, 16h49min;

Disponível em

<http://gazetaweb.globo.com/noticia.php?c=227129&e=7 >Acesso

em 17/11/2014, 17h13min;

SKINNER, H.B; MCMAHON, P.J. CURRENT ortopedia:

diagnóstico e tratamento. 5 ed. Porto Alegre: Artmed-Mc Graw Hill,

2015. 672p. ISBN: 978-85-8055-436-6

MU

TA

ÇÕ

ES

NO

GE

NE

NT

5E

& C

AL

CIF

ICA

ÇÕ

ES

AR

TE

RIA

IS

http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAsgEAK/tecido-osseo

http://www.lume.ufrgs.br/bitstream/handle/10183/12713/000633516.pdf?sequence=1

http://meriva.pucrs.br/dspace/handle/10923/1439

http://www.biotec-zone.net/?do=vernoticia&id=941

http://gazetaweb.globo.com/noticia.php?c=227129&e=7

mutações no gene nt5e e calcificações arteriais

Health & Medicine