monografia felipe paranhos

ELETROFORESE EM GIS DE POLIACRILAMIDA COM GEOMETRIA 3D I. Aplicao no estudo de agregados proticos

FELIPE DAMASCENO DA ROCHA PARANHOS

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE CENTRO DE BIOCINCIAS E BIOTECNOLOGIA LABORATRIO DE BIOLOGIA CELULAR E TECIDUAL SETOR BIOLOGIA DA REPRODUO Campos dos Goytacazes - RJ Janeiro 2011



Monografia Apresentada ao Centro de Biocincias e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das

exigncias para a obteno do ttulo de Bacharel em Cincias Biolgicas.

Orientador: Prof. Claudio Retamal Martinez Co-orientadora: Profa. Mara Luisa Lpez Alvarez

Campos dos Goytacazes RJ Janeiro 2011

II



Monografia Apresentada ao Centro de Biocincias e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das

exigncias para a obteno do ttulo de Bacharel em Cincias Biolgicas.

Aprovada em 26/01/2011 as 10:00 am.

Comisso Examinadora:

_______________________________________________________________ Orientador Prof. Claudio Andrs Retamal Martinez

_______________________________________________________________ Prof. Anna L. Okorokova Faanha

_______________________________________________________________ Prof. Olga L. T. Machado

III

Este

trabalho de

foi

desenvolvido Celular

no e da

Laboratrio Tecidual;

Biologia de

Setor

Biologia

Reproduo; do Centro de Biocincias e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, sob a orientao dos Professores Cludio Andrs Retamal Martinez e Maria Luisa Lpez Alvarez.

Apoio Financeiro:

UENF FAPERJ TECNORTE

IV

Dedico este trabalho a minha me, Rosangela Damasceno, de ao Nazar meu pai, Batista Ronaldo

Pinheiro da Rocha Paranhos e ao meu irmo, Danilo Damasceno da Rocha Paranhos, e a todos que estiveram me dando fora nesses anos.

V

AGRADECIMENTOSAgradeo a Deus.

Agradeo ao amor de meus pais Ronaldo e Rosa; tenho orgulho de ser filho deles. Meu pai sempre me abenoou com o seu dom da palavra, enquanto, minha me com carinho. Agradeo ao meu lindo irmo Danilo, pela sua eterna amizade. Agradeo as minhas avs Maria Lea e Maria Lcia pelas inmeras histrias, e em alguns momentos serem as nicas dispostas a me ouvir. Agradeo ao meu av Luis por me apresentar o glorioso time de futebol Vasco da Gama. Agradeo a Marta, meus tios e tias pelos inmeros conselhos que me deram ao longo dos anos. Agradeo a por ter conhecido uma pessoa to doce e engraada que roubou meu corao, grande beijo pra minha linda e maravilhosa namorada Flavinha. Na UENF fiz diversas amizades, e creio que algumas sero para o resto da vida. Dentre estas incrveis criaturas lembro sempre dos meus companheiros que convivi nas repblicas Mo Joana (Betinho, Andr Joselito, Marcelino, Firula e Miltonlpia), S.A (Gabriel Requebra, Douramod, Maguila, Claudinho Tucunar e Fofura), sabo em p (Diego Xabiro e Josephlpia) e atualmente os amigos que moram comigo Valado e Kbea. Outros inesquecveis amigos so os integrantes da equipe gode, realizamos as festas mais elaboradas do perodo em que tive o prazer de estudar nesta universidade, so eles: Milzuza, Nego, Braulim, Ranatim, Vito, Andr Kreca, Saulo, Kdu, Vitim, Marcell, Sardinha e Leo. Agradeo espacialmente a rapeize (Vitu maneiro, Eduardo maneiro, Renan maneiro, Bruno maneiro, He-man caidinho, Igor cado, Iguinho smeagol, Hip-Ossada-Hop, Tape Tea, Arthur Brake, Mutumzeira, L.D, Mc Sardosas, Jay.Cida, Conchabiro, Fraga- JACK, Alex birow, Scooby, Chazam, Leito, P.V., Arhur Fly, Cristiano, Ninja - ao trio mais espumante da terra: Bruno Masi, Camile Espumante e Renato Tur e todos os outros que no me lembrei aqui.

Agradeo ao meu orientador Dr. Claudio Retamal por me ensinar a magia da eletroforese, ao melhor tcnico de laboratrio do mundo Arthur Rodrigues, a Dra. Maria Luisa por todos os ensinamentos, Joseph Albert por ter me apresentado a pesquisa em laboratrio e Glauber por ser um grande companheiro de risadas.

VI

Certa

vez,

um

cosmonauta discutiam

e

um sobre

neurologista

russos

religio. O neurologista era cristo, e o cosmonauta no. J estive vrias vezes no espao, gabou-se o cosmonauta, e nunca vi nem Deus, nem anjos. E eu j operei muitos crebros inteligentes, respondeu o neurologista, e tambm nunca vi um pensamento.O Dia do Curinga Jostein Gaarder

VII

SUMRIO LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................. X RESUMO .............................................................................................................. XII ABSTRACT ......................................................................................................... XIII 1. 2. INTRODUO. ..............................................................................................1 REVISO BIBLIOGRFICA..........................................................................2 2.1 ESTRUTURA PROTEICA. ASPECTOS GERAIS. ........................................ 2 2.2 AGREGADOS PROTEICOS ......................................................................... 8 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.2.6 Agregao por formao de intermedirio no processo de desenovelamento .................................................................................... 9 Agregao por auto-associao............................................................ 10 Agregaes por meio de ligaes qumicas. ......................................... 11 Agregaes por degradao qumica. .................................................. 11 A reversibilidade da agregao protica. .............................................. 12 Morfologia dos agregados proticos ................................................... 133

2.3 ANALISES DE COMPLEXOS PROTEICOS ............................................... 13 2.4 ANALISE PROTEOMICA DE FLUIDO EPIDIDIMARIO .............................. 20 3. OBJETIVOS .................................................................................................... 22 3.1 OBJETIVO GERAL ...................................................................................... 22 3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS. ....................................................................... 22 4. MATERIIS E MTODOS. .......................................................................... 23 4.1 MATERIIS ............................................................................................... 233 4.2 MTODOLOGIAS ....................................................................................... 23 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.2.5 4.2.6 4.2.7 Obteno de amostras .......................................................................... 23 Marcao de protenas sulfidriladas de espermatozoides epididimrios. ........................................................................................ 24 Determinao da concentrao de protenas. .................................... 255 Electrofores em geis de poliacrilamida (1-de). ...................................... 25 Electroforeses em geis de poliacrilamida (nativo/ sds (2-de) ................ 26 Electroforeses em geis de poliacrilamida com geometria 3d (3-de) ...... 27 Anlise da mobilidade eletrofortica e massas moleculares das protenas em gis de poliacrilamida. ................................................... 322

5.

RESULTADOS E DISCUSSO. ................................................................ 344

VIII

5.1 AVALIAO DO TEMPO E PADRO DE TRANSFERNCIA DE PROTENAS ENTRE UM GEL MATRIZ E O SEPARADOR. ............................ 34 5.2 PERFIL PROTICO NATIVO E DESNATURANTE DAS AMOSTRAS COMERCIAIS E DE FLUIDO EPIDIDIMRIO (1-DE). .................................... 366 5.2.1 5.2.2 Perfil protico nativo. ........................................................................... 366 Perfil protico desnaturante. ................................................................. 37

5.3 DETERMINAO DO PERFIL PROTEICO NAT/SDS-PAGE 12%, SEGUNDA DIMENSO (2D), E SUA ANLISE DENSITOMTRICA. ............. 40 5.3.1 5.3.2 Albumina srica bovina (bsa). ........................................................... 4141 Kit de protenas padres, contendo albumina do ovo de galinha, anidrase carbnica do eritrocito bovino -lactalbumina do leite bovino e urease. ............................................................................................... 43 Fludo epididimrio ................................................................................ 41

5.3.3

5.4 TRANSFERENCIA DO PERFIL PROTEICO NAT/SDS 12% (2-DE), PARA UM SANDUICHE GES SEPARADORES, COM AGENTE REDUTOR, TERCEIRA DIMENSO (3-DE). ........................................................................ 43 5.4.1 5.4.2 Albumina srica bovina sigma (bsa). .................................................. 465 Protenas do kit comercial de peso molecular nativo (albumina do ovo de galinha, albumina srica de soro bovino, anidrase carbnica de eritrocito bovino, -lactalbumina de leite bovino e urease). .................. 52 Fluido epididimrio da regio cabea proximal. .................................... 58 Fluido epididimrio da regio do corpo. ................................................ 65 Fluido epididimrio da regio da cauda................................................. 71

5.4.3 5.4.4 5.4.5

6. CONCLUSES . ............................................................................................... 75 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................................. 78

IX

LISTA DE ABREVIATURAS - l Microlitros. - 1-DE Eletroforese de primeira dimenso. - 2-DE Eletroforese de segunda dimenso - 3-DE Eletroforese de terceira dimenso. - BSA Albumina sria bovina. - Azul brillante de Coomassie R-250 Azul Brilhante de Coomasie. - CD - Protenas do fluido epididimrio da regio da cauda. - Cn-PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida nativa sem cor. - COR - Protenas do fluido epididimrio da regio do corpo. - CP Protenas do fluido epididimrio da regio da cabea proximal. - EDTA cido etilenodiamino tetra-actico. - g Gravidade. - HCL cido clordrico. - IEF Focalizao Isoeltrica. - kDa quilo Dalton. - M Molar. - mBBr - Monobromobimane . - mDa Megadalton. - mg Miligrama. - min Minutos. - ml Mililitros - mm milmetros - mM Mili molar - Nat/SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida Nativo, seguido de SDS-PAGE. - Nat-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida nativo. - nm Nanometros - C Graus Celsius. - PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida. - pH Logaritmo do inverso da concentrao de hidrognio. - pI Ponto isoeltrico. X

- Rf Mobilidade Relativa - rpm - Rotaes por minuto. - SDS dodecil sulfato de sdio. - SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com presena de dodecil sulfato de sdio. - TEMED N,N,N,N,-tetrametilenodiamino. - Tricine-SDS-PAGE - Tris Tris (hidrxidometil) aminometano. - V Volts.

XI

RESUMO A formao de agregados proticos um dos temas candentes da cincia moderna, e hoje em dia reconhecido como um srio problema biomdico e biotecnolgico. Diversas so as possibilidades e causas da formao de tais agregados, estes representam o nvel de compartimentalizao natural em que as protenas esto empacotadas sob uma disposio de mltiplas

subunidades. Um complexo protico a menor estrutura biolgica de compartimentos celulares que composta de protena e/ou co-fatores, em que podem ao mnimo catalisar uma reao especifica em seu estado isolado. Estes complexos podem definir uma estrutura celular que podemos resolver, ou reconstituir bioquimicamente. Agregados e complexos proticos contribuem nas funes celulares sob todos os nveis de complexidade do organismo no espao e tempo. Um ponto crucial na pesquisa de estas macromolculas e determinar quais tecnologias de separao ns devemos considerar a fim de isolar um complexo protico e\ou agregado em um estado ativo para a anlise enzimtica, identificao de uma protena para a reconstituio ou para uma estratgia gentica molecular nocaute. Neste trabalho apresentamos um mtodo de anlise eletrofortica em que se possibilita a separao de protenas, complexos proticos e agregados, conduzido por gis nativo (1-DE PAGE), desnaturante (2-DE Nat/SDS PAGE) e a transferncia do perfil desnaturante para um sandwich de gis SDS\PAGE de 1,5 mm, em srie, baseado em uma geometria tridimensional denominado 3-DE. Nossos resultados mostram que na ausncia de DTT, as protenas migraram como uma simples transferncia. Entretanto, quando submetidas terceira dimenso 3-DE -na presena de DTT- no local de protenas de alta massa molecular se visualizam manchas em profundidades diferentes, sugerindo que so protenas agregadas (de alta e baixa massa molecular) ligadas por pontes de enxofre. Electroforeses 3-DE de protenas padro e em protenas separadas de fluido epididimrio de eqinos so mostradas como uma aplicao da tcnica. Nossos resultados mostram que esta metodologia possibilita separar protenas de agregados e complexos devido profundidade dos gis em srie o que facilita a identificao, fracionamento e origem dos fragmentos proticos. Palavras Chaves: Agregados Proticos, Eletroforese, Protenas Epiddimarias. XII

ABSTRACT The formation of protein aggregates actually is one of the hottest themes in modern science; this subject nowadays is recognized as a serious biomedical and biotechnological problem. Several are the possibilities and causes that rounds the formation of such aggregates, they represent the natural level of compartmentalization that bundle proteins into an array of multi subunits. A protein complex is the smallest biological cellular structure that is composed by protein and co-factors, which can at least in its isolated state, catalyze a specified reaction. These complexes can define a cellular structure that we can resolve, or rebuilt in biochemistry ways. These aggregates and proteins complexes contribute in organelles and cellular functions, in all levels of complexity in time and space. It shows consequently necessary address which separation technologies we should consider in propose to isolate a protein complex or aggregate in its active state to an enzymatic analysis, identify subunits for protein re-built or to apply a molecular genetics strategy. We introduce new PAGE system that give us the possibility to separate proteins, proteins complexes and aggregates, that is carried by native gel (1-DE PAGE 8%), denaturing (2-DE Nat/SDS PAGE 12%) and the transference of the denaturing profile to a sandwich of gels (SDS\PAGE 12% with 1,5mm of thickness) in series based in a three dimensional geometry denominated 3-DE (three dimensional electrophoresis. Our results show that in the absence of DTT, the protein migrates as a usual transference. But when submitted to an 3DE in presence of DTT in the place of proteins with high molecular weight we visualize spots of different deepness, which suggests that these proteins are aggregated linked by sulfur bounds. 3D- elecrophoreses of epididymal and standard aggregated proteins are shown. This technique shows us possibilities to separate proteins from aggregates and complexes by the deepness of the gels in series, this property facilitate the identification, fractioning and origin of the protein fragments.

Keywords: Protein Aggregates, Electrophoresis, Epididymal Proteins.

XIII

1.

INTRODUO. As protenas, molculas que desenvolvem funes enzimticas,

estruturais e regulatrias so responsveis da grande maioria dos processos biolgicos de nosso organismo. Assim como um sistema biolgico vai alem da soma dos processos individuais; as protenas geralmente no trabalham como entidades monomricas, mas interagem entre si formando complexos estveis ou transientes que as tornam funcionais. interessante mencionar que o seqenciamento dos genomas de eucariontes superiores sugere que a complexidade dos organismos mais evoludos no mediada por um dramtico aumento no numero de genes, mas pelo padro mais complexo de interaes protena - protena (Rubin et al., 2001). O rpido desenvolvimento da protemica e de novas metodologias e combinaes destas destinadas a revelar o mximo possvel de protenas de um organismo ou um material biolgico especfico permitiu a identificao de milhares de protenas (Petko et. al., 2009). Hoje em dia, uma das estratgias mais utilizada para caracterizar protenas e complexos proticos celulares sua purificao seguida de espectrometria de massas. Entretanto, a agregao destas macromolculas e os fatores que subjazem as causas deste processo so ainda um grande desafio ao desenvolvimento cientfico. O estudo das interaes moleculares que constituem a base das redes regulatrias uma das mais importantes metas da biologia molecular na era ps-genmica. Em biomedicina, a agregao de protenas constitui um fator que promove, ou pelo menos est associado, a um amplo espectro de patologias humanas. Nas pesquisas farmacuticas a agregao e precipitao de protenas so um grande empecilho manufatura, armazenamento, transporte e comercializao de drogas proticas. Diversas so as possibilidades e causas da formao de tais agregados, que representam o nvel de compartamentalizao natural em que as protenas esto empacotadas sob uma disposio de mltiplas subunidades. Entretanto para se caracterizar individualmente uma protena, de um extrato protico complexo necessrio empregar diversas tcnicas at o seu seqenciamento. A eletroforese em gis de poliacrilamida (PAGE) uma metodologia intermediria ao seqenciamento protico. Diversos protocolos tm sido descritos relativos s tcnicas de 1

separao unidimensional (1-DE) nativo e desnaturantes, bidimensionais (2DE) desnaturantes e sob focalizao isoeltrica (IEF). Apesar de ser um pouco complexa em determinadas etapas, 2-DE possui um alto poder de resoluo apresentando em certas vezes mais de 10.000 protenas spots por gel, se constituindo em uma das ferramentas mais utilizadas na protemica (ZimnyArndt et. al., 2009). Entretanto os mtodos da eletroforese bidimensional, sob IEF, para separao de extratos proticos complexos no mudaram fundamentalmente desde sua descrio original no final da dcada de 70 (Levenson et. al., 1990). Apesar de apresentar um alto poder de resoluo no que diz respeito separao de extratos proticos complexos e agregados, a clssica tcnica de eletroforese bidimensional (IEF/SDS 2-DE) utilizando a focalizao isoeltrica deixa de separar protenas hidrofbicas que se agregam e so consideradas sub-representadas nesses perfis (Burr et. al. 2009). Atualmente diversos laboratrios desenvolvem tecnologias alternativas e complementares, visando resolver tanto os extratos proticos complexos bem como agregados. Neste trabalho apresenta-se uma tcnica de separao de componentes proticos presentes em agregados baseado no mtodo de anlise

eletrofortico, conduzido por gis de poliacrilamida nativo (1-DE Nat-PAGE), desnaturante (2-DE Nat/SDS-PAGE) e a transferncia do perfil desnaturante para um sandwich de gis SDS-PAGE, em srie, em condies redutoras, baseado em uma geometria tridimensional (3-DE). Esta tcnica possibilita separar protenas de agregados devido profundidade (Rf em 3D) dos gis em srie facilitando a identificao, fracionamento e origem dos fragmentos proticos com bastante preciso. 2. 2.1 REVISO BIBLIOGRFICA ESTRUTURA PROTEICA. ASPECTOS GERAIS. As protenas so as macromolculas mais complexas, sofisticadas e versteis dos sistemas vivos. Elas constituem grande parte da massa celular seca e participam de funes cruciais na maioria dos processos biolgicos. Quanto a sua composio, so polmeros formados por uma seqncia 2

definida de aminocidos. O material gentico de cada clula capaz de produzir seqncias de aminocidos de uma maneira bastante reprodutvel. Entretanto, estas seqncias unidimensionais de aminocidos experimentam diversos rearranjos, dobrando-se sobre si mesma e formando assim uma macromolcula de estrutura tridimensional definida. Este processo conhecido como enovelamento protico. A protena final (dita nativa) apresenta uma estrutura secundria (alfa hlices e folhas beta), terciria (arranjo

tridimensional) e quaternria (no caso de oligmeros com mais de uma subunidade protica) completamente definida. Associaes supramoleculares com carter permanente do origem estrutura quinaria (Lehninger et. al., 2002). Estudos relativos conformao, funo e evoluo de protenas revelaram a importncia de um nvel estrutural distinto daqueles descritos acima: o domnio protico, que conseqncia do enovelamento

independentemente de qualquer parte da cadeia polipeptdica resultando numa estrutura compacta e estvel. Um domnio protico contm entre 40 e 350 resduos aminoacdicos, As protenas pequenas geralmente possuem somente um domnio, enquanto as grandes protenas so formadas por vrios domnios ligados um a outro por pequenos segmentos de cadeia polipeptdica. Os diferentes domnios de uma protena esto geralmente associados a diferentes funes. Os domnios que participam da formao de um grande nmero de protenas so conhecidos como mdulos proticos. At agora,

aproximadamente mil diferentes modos de se enovelar um domnio foram observados em mais de 10.000 estruturas proticas (Alberts et al., 2004). A estrutura enovelada da protena mantida por um somatrio de interaes fracas (pontes de hidrognio, interaes inicas, interaes hidrofbicas), porm altamente especficas que se estabelecem entre diferentes regies da protena. Contudo, a estrutura protica no rgida e pode ter partes mveis, cujos mecanismos de ao so acoplados a eventos qumicos. Esta combinao de propriedades qumicas e movimento o que d s protenas sua extraordinria versatilidade e por tanto a capacidade de sustentar os processos dinmicos das clulas vivas (Alberts et al., 2004).

3

O mecanismo do enovelamento (folding) de protenas uma questo que tem motivado e intrigado aos pesquisadores durante muito tempo. Na dcada dos anos trinta os pesquisadores estudavam principalmente o processo inverso (a desnaturao) e conseguiram xito na renaturao de vrias protenas (hemoglobina, quimiotripsina, tripsingeno). Nos anos 50-60, foram publicados vrios estudos termodinmicos de desnaturao - renaturao que discutiam o papel das interaes no-covalentes. Em 1960, a primeira estrutura tridimensional de uma protena foi determinada por cristalografia de raios X, metodologia que ofereceu novas bases ao estudo deste processo. Nesta mesma poca Linus Pauling identificou os dois arranjos de estrutura secundria definidos como hlice- e folha- . Contudo, a grande discusso comea aps Christian Anfinsen propor que uma protena desenovelada poderia retornar ao seu estado nativo sem a necessidade de componentes do meio biolgico, sugerindo que a codificao para a formao tridimensional funcional deveria estar contida na ordem seqencial de aminocidos. Embora os mecanismos finos que subjazem ao enovelamento protico no estejam totalmente elucidados, avanos significativos se obtiveram atravs destas analises tericas e experimentais, baseadas principalmente em estudos in vitro. Essas publicaes pioneiras foram revisadas por Ghlis & Yon (1982). Diversos trabalhos tm demonstrado que outras protenas tambm contribuem no processo de enovelamento (disulfeto isomerases, cis-trans prolil isomerases, chaperonas, entre outras). O descobrimento das chaperonas moleculares, por exemplo, permitiu importantes progressos na compreenso dos mecanismos utilizados por estas molculas no enovelamento de protenas. As chaperonas, devido a sua associao transiente s protenas nascentes, desestabilizadas ou translocadas previnem enovelamento imprprio e a subseqente agregao, conduzindo o processo pela rota energeticamente mais favorvel. Elas no interagem com protenas enoveladas, e sim se associam a um intermedirio da via de enovelamento por interaes hidrofbicas. A maioria das pequenas chaperonas se une s regies hidrofbicas das cadeias polipeptdicas nascentes, enquanto as grandes chaperonas como o sistema GroEL-GroES (em procariotes) e sistema TriC (em eucariotes) seqestram molculas parcialmente enoveladas em um domnio 4

central, o suficientemente grande para acomodar protenas at 70 kDa. Contudo, elas no portam informao capaz de direcionar uma protena a assumir uma estrutura diferente da ditada pela seqncia aminoacdica (Weber et. al., 1998). A maioria das mutaes proticas que alteram a funo das protenas altera tambm sua estabilidade sendo, portanto, deletrias. Chaperonas e protenas de choque trmico parecem tamponar mutaes e assim facilitar a diversidade gentica e certo grau de adaptabilidade (Tokuruki & Tawfik, 2009). Embora muito se conhea sobre o(s) mecanismo(s) que possibilitam a uma protena adotar espontaneamente sua estrutura tridimensional definitiva muito ainda h para ser desvendado. Hoje em dia, o enovelamento de protenas um campo extremamente ativo de investigao, incluindo os aspectos biolgicos, qumicos, bioqumicos, fsicos e das cincias da computao. Os trabalhos de Anfinsen levantaram questes relacionadas predio de estruturas secundrias e sua organizao espacial tridimensional. Nessa vertente, algoritmos de reconhecimento de padres como redes neurais, mtodos estatsticos e outras tcnicas destinadas a calcular a disposio de cadeias laterais ou esqueleto principal so amplamente empregados. Seus princpios bsicos tm tido aplicao prtica na investigao genmica, na compreenso de diversas patologias e no desenho de novas protenas com funes especiais (Yon, 2002; Meli et. al., 2008; Zhang et. al., 2008) A partir da comparao cuidadosa das conformaes das protenas conhecidas, os bilogos estruturais tm concludo que h um nmero limitado de maneiras no qual um domnio protico pode enovelar-se. Estudos em andamento visam a criao de um catlogo dos enovelamentos proticos que existem nos organismos vivos (Reisinger & Eichacker, 2007). O processo de enovelamento um bom modelo para estudar tanto o mecanismo pelo qual uma cadeia polipeptdica nascente alcana sua conformao nativa no microambiente da clula, quanto para o melhor conhecimento do papel que os processos de agregao tm em diversas patologias, incluindo aquelas induzidas por prons, e na doena de Alzheimer; bem como no desenvolvimento de drogas; oferecendo assim novas perspectivas no diagnstico mdico e farmacutico (Yon, 2002). 5

O conhecimento ainda parcial do processo de enovelamento de uma protena um obstculo nossa compreenso dos vrios processos celulares, pois a converso de uma cadeia de aminocidos em uma protena corretamente enovelada um elemento chave na traduo da informao gentica dos organismos. O enovelamento parece sofrer desvios medida que o organismo envelhece, podendo ser um sinalizador para doenas

(principalmente as neuro-degenerativas), pois vrias delas so ocasionadas pelo enovelamento incorreto. Este fenmeno causa uma deposio da protena na clula na forma de agregados ou de fibrilas amilides, ambos com efeito txico. Uma maneira da clula se proteger atravs das chaperonas moleculares, as quais auxiliam durante o enovelamento e podem ter funo na dissoluo de agregados. O mecanismo de enovelamento protico apresenta grande relevncia na indstria biotecnolgica, dada a competio entre as vias de enovelamento produtivas, que geram protenas enoveladas e funcionais e as vias de agregao, levam ao aparecimento de agregados proticos insolveis ou corpos de incluso (Wetzel, 1994; Rudolph & Lilie, 1996). Estes ltimos ocorrem in vivo quando protenas heterlogas so clonadas e expressas em E. coli em determinadas condies de crescimento e expresso. No presente, a indstria biotecnolgica tem utilizado estratgias complicadas para resgatar as protenas de interesse dos corpos de incluso. O uso de altas concentraes de agentes qumicos como uria ou cloreto de guanidina, ou o uso de solventes como glicerol somados as grandes diluies das protenas clonadas constituem algumas destas estratgias adotadas. Obviamente, tais estratgias esto na contramo do objetivo principal quando se clona uma protena de interesse que o da sua obteno em grande escala, em alta concentrao e com pureza adequada para consumo humano e animal. Desta forma, faz-se necessrio o desenho de novas estratgias e metodologias que atendam as necessidades apontadas (Arakawa et. al., 2006). Temos mencionado que cada protena consiste de uma seqncia de aminocidos precisa que permite seu enovelamento em uma conformao tridimensional e funcional caracterstica. Entretanto, pesquisas recentes questionam a exatido da especificidade protica; por estar em contradio 6

com a marcada capacidade das protenas de adaptar-se, evoluir e desenvolver, em seqncia, novas funes e estruturas. Este paradigma tem sido substitudo por uma viso de vanguarda que considera as protenas como macromolculas conformacionalmente dinmicas as quais podem exibir certa promiscuidade funcional (Tokuruki & Tawfik, 2009). A evoluo ocorre pelo enriquecimento de diversidades pr-existentes, a evidncia de adaptao evolutiva de protenas tem sido observada, no apenas no vasto campo de protenas que tenham presumidamente divergido de alguns ancestrais comuns, mas tambm em recentes eventos evolucionrios como a resistncias a drogas e enzimas que degradam produtos qumicos que tem aparecido neste planeta apenas h algumas dcadas (Tokuruki & Tawfik, 2009). Atualmente prevalece a viso onde as protenas, se mostram como um conjunto de alternadas subestruturas, ou conformaes, em equilbrio com o seu chamado estado nativo. Este conceito consistente com a adaptao evolutiva, originalmente proposta por Baldwin (1995) e Chan & Dill (1998) em relao ao enovelamento protico e mais tarde aplicado a descrever conjuntos de protenas em seu estado nativo (Tawfik & James, 2003). Protenas mostram um grande dinamismo, uma alta viabilidade conformacional, que uma propriedade inerente de qualquer cadeia polimrica. Sua diversidade conformacional engloba flutuaes de cadeias laterais e movimentos de stios ativos para estruturas secundrias promovendo um rearranjo em todo o enovelamento protico, o que pode refletir uma promiscuidade funcional. Conformaes estruturais distintas podem mediar alternados enovelamentos e funes. Entretanto certas classes de enzimas demonstram mais evolutibilidade do que outras. O metabolismo secundrio responde constantemente a mudanas do meio, enquanto o metabolismo nuclear se mantm quase intacto. As propriedades biofsicas que capacitam s protenas a evoluir, de forma de poder desempenhar diversas funes, desconhecida (James & Tawfik, 2003; Meier & zbek , 2007).

7

2.2

AGREGADOS PROTEICOS As protenas geralmente tendem a se agregar sob uma diversidade de

condies ambientais. A extenso da agregao depende de muitos fatores que podem ser classificados como extrnsecos (primrio, secundrio, tercirio ou quaternrio) ou extrnsecos (ambiente em que a protena esteja presente, condies de processamento, etc). As protenas agregadas podem exibir propriedades no desejveis chegando inclusive a perder sua atividade biolgica ou provocar outros efeitos co-laterais A agregao de protenas sem duvida uma manifestao de instabilidade protica e um dos maiores empecilhos na fabricao de drogas. A agregao e degradao protica tm sido classicamente associadas com o seu fenmeno gmeo: o armazenamento protico. 15-20 anos atrs se acreditava que a agregao era um artefato experimental conseqncia da degradao protica, entretanto nunca foi proposto como causa da degradao (Sharma & Lutha-guptasarma, 2009). Considerando o autoconjunto pepetdico, na analise do agregado protico de grande interesse que se caracterize no apenas a estrutura final, mas tambm os passos iniciais da formao oligomrica (Sesshadri et. al., 2009; Meli et. al., 2008). Diversas so as possibilidades e causas da formao de agregados proticos. As principais vias de agregao esto resumidas na Fig. 1 e podem ser divididas em: agregao por intermedirios desenovelados ou estado protico desenovelado (1 via); agregao por auto-associao protica (via 2a) ou ligaes qumicas (via 2b); e agregao por degradao qumica (3 via) (Wang et al., 2010).

8

Figura 1 - Grfico ilustrando as principais vias de agregao protica (Wang et.al., 2010)

2.2.1 AGREGAO POR FORMAO DE INTERMEDIRIO NO PROCESSO DE DESENOVELAMENTO Como se observa na Fig. 1, sobre condies normais as protenas nativas, em soluo, esto em equilbrio, com um pequeno percentual protico de estado intermedirio (I) ao desenovelamento, bem como a protenas desnaturadas ou completamente desenoveladas (D). Dependendo do grau do desnovelamento protico, os intermedirios desenovelados podem ser divididos em: intermedirios-nativo e intermedirios-desenovelados. Sob os termos do processo de agregao fsica, as evidencias sugerem que o estado intermedirio da protena entre enovelado e desenovelado um precursor do processo de agregao. Isto porque, estes intermedirios, expem mais suas pores hidrofbicas e possuem uma maior flexibilidade relativa ao estado enovelado. Protenas completamente enoveladas ou desenoveladas, em contraste, no se agregam facilmente, desde que pores da cadeia hidrofbica estejam privadas ao contacto gua ou aleatoriamente posicionado na superfcie. Simulaes recentes indicam que a agregao de protenas nativas, com pores hidrofbicas acessveis em sua superfcie, intensificada quando as condies da soluo favorecem a conformao parcialmente desenovelada, se opondo tanto ao estado nativo bem como a conformao totalmente desenovelada. A interao dos intermedirios leva a formao de agregados 9

proticos. Tem se proposto que agregados proticos como qualquer espcie protica fora de seu estado nativo e de tamanho dobrado de seu estado nativo. Dmeros, trmeros, em que mantenham o seu estado nativo no se caracterizam como agregados. Os agregados proticos iniciais so solveis, porm gradualmente se tornam insolveis quando estes excedem certo tamanho e limite de solubilidade (precipitados; P). O estado P pode assumir diferentes formas como precipitado amorfo bem como o de estruturas ordenadas como as fibrilas. A precipitao amorfa e formao de fibrilas vm sido descrito, respectivamente, como via de agregao ordenada e desordenada. Contudo a definio dos agregados recm formados ainda tema de debate (Zhang et al.,2008; Wang, 2010).

2.2.2 AGREGAO POR AUTO-ASSOCIAO. Um indeterminado nmero de protenas podem fisicamente associar-se em agregados proticos no seu estado nativo enovelado, (via 2a na Fig. 1) sem que se passe pelo estgio intermedirio.Tais associaes podem ser apenas eletrostticas bem como eletrosttica e de hifrofobicidade, de acordo com as condies do experimento. Outras foras menores, como as de Van der Waals, podem dar inicio ao processo associativo. A auto-associao protica pode, ou no, ser acompanhada de uma sutil mudana conformacional. Tal associao leva a formao de oligmeros e/ou agregados reversveis; tais agregados podem ser considerados precursores de agregados irreversveis. Se a autoassociao protica considerada um passo limitante no processo de agregao protica, agregados proticos resultantes de auto-associao so tambm considerados associaes limitadas (Weiss & Grg, 2009). Diversos stios de uma mesma protena podem participar no processo associativo (Kakai et al., 2008). A auto associao protica diretamente relacionada estabilidade coloidal, e a formao de intermedirios relacionada estabilidade conformacional. Tanto a estabilidade conformacional quanto a coloidal podem, potencialmente, ser limitadas dependendo das condies da soluo. Portanto na realidade s vezes se torna difcil de diferenciar entre estas duas vias. (Wang. et al., 2010). 10

2.2.3 AGREGAES POR MEIO DE LIGAES QUMICAS.

Diversas degradaes qumicas formam ligaes cruzadas nas cadeias das protenas que levam a agregao protica (via 2b na Fig. 1), a reao mais comum, de ligao cruzada, a formao e/ou troca das pontes dissulfeto. A formao de agregados ligados por pontes dissulfeto pode promover agregao fsica de protenas (Cabra et al., 2008). claro, que cistenas, localizadas na superfcie, so mais facilmente envolvidas do que as cistenas de posio mais interna, na formao ou troca das ligaes dissulfetos. Protenas com ligaes dissulfeto sem cistenas livres, ainda podem participar de agregao protica, devido a eliminao ou troca de pontes dissulfeto. A formao de agregados com ligaes dissulfetos ainda um grande desafio no desenvolvimento de produtos industriais como frmacos e drogas.

Recentemente foram descritas outras vias de ligao cruzada, sem pontes dissulfeto, que culminam com a formao de agregados proticos, mediadas por formaldedo e oxidao (Wang et al., 2010). Estudos sobre agregao protica realizados com albumina srica bovina (BSA), no seu estado slido e em soluo, visando elucidar o efeito da mobilidade da gua na taxa de agregao sugerem que ao se armazenar BSA na sua forma liofilizada esta forma agregados covalentemente ligados via ligaes, dissulfeto, em seu estado slido, umedecido e em soluo. A taxa de agregao em soluo aumenta ao se adicionar gua protena (diminuindo a sua concentrao), sugerindo que o aumento da taxa de agregao relacionado com o aumento da mobilidade da gua (Jordan, et al., 1994).

2.2.4 AGREGAES POR DEGRADAO QUMICA.

Uma grande via de agregao protica induzida por degradao qumica (via 3 na Fig. 1). Diversas vias de degradao qumica, tem sido descritas, entre elas aquelas que incluem auto-oxidao e/ou oxidao (Rosenfeld et al., 2009), dimerizao (Roostaee et al., 2009), desamidao (Takata et al., 2008) e hidrolise (Van Buren et al., 2008). A degradao qumica promove, certas vezes, alteraes nas propriedades fsicas das protenas 11

como: hidrofobicidade, tendncia de associao, estrutura secundria e terciria e a barreira cintica e/ou termodinmica ao desenovelamento protico. Logo essencial se analisar a composio e estrutura de um agregado protico para se determinar o verdadeiro motivo da agregao antes de desenvolver uma estratgia para se inibir, bem como prevenir, a agregao protica (Wang et al., 2010). Teoricamente, o estado desnaturado (D na Fig. 1) de uma protena pode diretamente formar agregados (via 2a na Fig. 1). Isto verdade para diversas protenas que aparentam estar naturalmente no estado desenovelado, ou demonstram possuir apenas dois estados: nativo e desnaturado. O estado desnaturado ainda pode sofrer degradao qumica, e/ou formar agregados tanto diretamente (via 2b na Fig. 1) ou indiretamente (via 3 na Fig. 1). Entretanto a maioria das protenas de produtos, como drogas e frmacos, esto em um estado enovelado. A contribuio da agregao protica pelo estado desenovelado neste caso pouco significante. Em tais casos, uma via de agregao normalmente domina (Wang et al., 2010).

2.2.5 A REVERSIBILIDADE DA AGREGAO PROTICA.

A reversibilidade da agregao protica nada mais que a habilidade dos agregados proticos de se dissociarem em equilbrio, ou de forma reversa, s condies de soluo (pH, temperatura ou concentrao de sais), quando a agregao induzida. Um teste de diluio pode ser conveniente para se examinar a reversibilidade da agregao protica dependente de concentrao. A possibilidade de se reverter agregao protica depende, principalmente, de qual estgio se encontra a protena no processo de agregao. Enquanto o processo de agregao est em um estgio inicial, a reversibilidade tende a ser possvel (de N A na Fig. 1). Estgios tardios de agregao ou precipitao tendem a ser irreversveis. A reversibilidade obviamente atua sob uma escala temporal, onde a agregao protica e o tamanho dos agregados so avaliados, entretanto a agregao protica induzida por temperatura irreversvel. Entender a reversibilidade da agregao protica de suma

12

importncia, visto que a reversibilidade est relacionada s conseqncias biolgicas das protenas e dos agregados (Wang et al., 2010).

2.2.6

MORFOLOGIA DOS AGREGADOS PROTICOS.

Os agregados proticos se apresentam sob uma variedade de conformaes. Podem se apresentar como: fibrilas (agregados ordenados), particulados (irregulares ou esfricos), gis, ou mesmo a combinao destes. As fibrilas se apresentam sob diferentes tipos, com diferentes estruturas secundarias e interaes intramoleculares (Natalello et al., 2008). A forma final dos agregados demonstra depender da via de agregao (Giurleo et al., 2009). O pH da soluo um parmetro chave para se determinar a forma dominante dos agregados, j que o pH da soluo afeta o tipo, a carga de superfcie, densidade de carga da superfcie e o grau de estabilidade estrutural da protena. Foi demonstrado que cinco diferentes protenas, no relacionadas (insulina bovina, lactoglobulina bovina, mioglobulina do corao de cavalo, lysosima do ovo branco de galinha, soro albumina bovina) podem formar fibrilas, sobre condies ideais de pH, que favoream uma rede de alta carga. Entretanto sobre condies de baixa carga, formam-se partculas (Krebs et al., 2007). Estes resultados sugerem que a formao de particulados no regime onde a carga sobre as molculas seja mnima, uma propriedade comum a todas as protenas. Logo o enovelamento protico por acidente formando agregados bem definidos aparentemente um processo genrico em que depende, solenemente, das propriedades gerais do estado protico durante a agregao, ao invs de uma seqncia especifica de aminocidos.

2.3

ANALISES DE COMPLEXOS PROTEICOS A aplicao das tcnicas electroforticas em gis de poliacrilamida tem

permitido a anlise de protenas presentes em vrios sistemas proticos complexos. Entretanto, nos ltimos trinta anos a nfase tem se focalizado na anlise genmica das espcies biolgicas. Vrias databases de genomas encontram-se disponveis sendo possvel comparar seqncias aminoacdicas 13

de protenas preditas a partir da seqncia de DNA com aquelas presentes nos diferentes sistemas de nosso organismo, Esses estudos tm demonstrado que este tipo de anlise no suficiente para estudar a estrutura e funo fisiolgica de uma protena. A meta ltima, na anlise de um sistema protico complexo, reconstruir a estrutura e funo de uma protena ou um complexo dentro de um sistema como um todo. Algumas reconstrues baseados em nveis estruturais de complexos proticos so assinaladas Fig. 2 (Manabe et. al. 2003).

Figura 2 Grfico ilustrando os nveis estruturais de complexos proticos. Os planos centrais mostram nveis estruturais de complexos proticos, cada plano contm informao de todas as molculas individuais ou unidades estruturais. Obter a informao estrutural completa de um nvel, no promove a elucidao das estruturas dos nveis subseqentes. A caracterizao de uma funo protica ser obtida em seu nvel estrutural respectivo, bem como as estruturas em nveis superiores so mais diretamente relacionadas s funes do sistema protico como um todo (Manabe et. al. 2003)

14

Existem mltiplas nveis estruturais em um sistema, desde a seqncia aminoacdica mostrada com um plano posicionado na base da figura aos complexos tridimensionais de estruturas celulares mostradas na parte alta da figura. Os planos representam nveis estruturais presentes, situados muito prximos, porem separados, uns de outros. Isto indica que ainda aps ter analisado os constituintes de um nvel, no podemos deduzir os presentes em outros nveis. Diferentes metodologias sero necessrias para a anlise global do sistema (Manabe et. al. 2003). Entre as metodologias mais comumente empregadas na anlise de sistemas proticos complexos mencionaremos a eletroforese bidimensional em geles de poliacrilamida (2D-PAGE) seguido de extrao protica e

caracterizao com seqnciamento qumico ou espectrometria de massas. Contudo, esta metodologia tem a desvantagem de ser uma metodologia lenta, trabalhosa e requer a identificao das protenas uma a uma. Na analise electrofortica de protenas, o principal objetivo desta tcnica obter uma boa resoluo entre duas protenas em questo. Mencionaremos algumas variantes de esta tcnica:

Eletroforese em gel de poliacrilamida no desnaturante, ditos gis nativos (Davis et. al., 1964). Esta tcnica se utiliza no fracionamento de extratos proticos complexos, visando conhecer a composio das subunidades proticas, ou como uma ferramenta de purificao de amostras para prximas aplicaes e um meio adequado para se observar agregao protica. Na PAGE, as protenas migram em resposta a um campo eltrico por meio de poros no gel matriz. O tamanho do poro diminui, com o aumento da concentrao de acrilamida. A combinao do poro do gel e da carga da protena, seu tamanho e sua forma determina a taxa de migrao de uma protena (Gallagher et. al., 2001). Os gis de acrilamida utilizados so geralmente caracterizados pela porcentagem total de sua concentrao (%t) dos monmeros (acrilamida e a bisacrilamida de ligao cruzada) e pela percentagem de concentrao de ligao cruzada (%C) relativa ao total da concentrao (Hjerten, 1962).

15

Protenas cidas possuem o ponto isoeltrico abaixo de oito e se pode separar mediante o sistema Laemli Tris-glicina ou pelo sistema de Schgger e Von Jagow (1987). Para protenas bsicas, o gel nativo, requer de uma cuidadosa otimizao e padronizao das condies, incluindo o tampo e tipo de gel, pH e o tempo de eletroforeses. Panyim e Chalkley (1969) padronizaram a tcnica de PAGE de alta resoluo em presena de uria para histonas. Para protenas cidas, no sistema SDS-PAGE, estas so carregadas negativamente pelo detergente e ento migram em direo ao anodo (Arakawa et al. 2006). A migrao das protenas realizada com polaridade reversa eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE), e de gel nativo para protenas cidas. As protenas bsicas so carregadas positivamente, e assim elas migram em direo ao catodo. Eletroforese em gel de poliacrilamida com corante azul brilhante de Coomasie. O sistema BN-PAGE tem sido utilizado em diversas pesquisas biolgicas, bioqumicas e investigaes clinicas, como foi revisado

recentemente (Krause, 2006). de longe o mais verstil e poderoso sistema eletrofortico no desnaturante, aparentemente capaz de separar todos os tipos de agregados, protenas solveis e de membrana mesmo de extratos complexos. Foi descrito por Schgger e von Jagow em 1991, e acabou sendo denominado como Blue Native devido colorao aninica Azul Brilhante de Coomassie. O corante empregado nas amostras solubilizadas antes da eletroforese, o que outorga uma fraca carga negativa as protenas e complexos proticos. O mtodo prov informaes sobre o tamanho, nmero, composio protica, estequiometria, ou abundncia relativa dos complexos multiproticos. O gel separa protenas, em sua conformao nativa, baseando-se na colorao com Azul brillante de Coomassie R-250. Este corante se liga no especificamente a todas as protenas, conferindo uma carga negativa as mesmas. Em adio, estas ligaes entre o Azul brillante de Coomassie R-250 e as protenas diminuem as tendncias destas a se agregarem durante o passo do empacotamento das protenas (Swamy et al., 2006). Entretanto outros estudos revelam que processos agregados, como a biotinilao de complexos proticos pode resultar em agregao bem como a perda de subunidades quando revelado pelo sistema BN-PAGE. Complexos 16

multiproteicos no marcados com biotina so resolvidos com uma banda singular, enquanto marcadas por biotina os complexos demonstram diversas bandas, indicando que a biotinilao leva a agregao de complexos bem como a perda de subunidades, demonstrando assim uma limitao no estudo de multi complexos proticos (Schamel, 2001). Tcnicas convencionais electroforticas como o BN-PAGE seguidos de um SDS-PAGE tem sido aplicadas em estudos protemicos de mitocndrias dada as propriedades fsico qumicas das protenas hidrofbicas de membrana interna (Andringa et. al., 2009). Existe apenas um pequeno grupo de protenas que no podem ser separadas pelo BN-PAGE (Blue Native PAGE). Estas so protenas solveis em gua que no se ligam a corante e possuem um pI >7 bsico ou neutro e so perdidas com o tampo do catodo por apresentam migrao em direo ao catodo. A maioria das protenas migram como bandas azuis o que facilita a sua extrao dos gis. O corante Azul brillante de Coomassie R-250 possui outras desvantagens para o sistema BN-PAGE. Quando combinado com detergentes neutros, utilizados nos procedimentos iniciais de solubilizao protica, micelas aninicas misturadas so geradas o que pode mimetizar certas propriedades de detergentes aninicos. Sub-unidades das protenas ligadas ao detergente podem se dissociar de um complexo multiproteico e estruturas

supramoleculares podem se dissociar. O corante Azul brillante de Coomassie R-250 tambm interfere com diversos ensaios de atividade cataltica e fluorimtricos nos gis de primeira dimenso BN-PAGE (Witting & Schgger, 2008). Eletroforese em gel de poliacrilamida com ausncia do corante azul brilhante de coomasie. Basicamente a verso do CN-PAGE originalmente denominado colorless-native PAGE (Schgger et al. 1994), foi descrito apos o desenvolvimento do sistema BN-PAGE (Schgger et al 1991). Este mtodo foi utilizado principalmente como referncia para se ilustrar o importante papel do corante negativamente carregado, azul brillante de Coomassie R-250 no sistema BN-PAGE. J que nenhum corante com carga utilizado no CNPAGE, a mobilidade eletrofortica das protenas, em contraste com a tcnica BN-PAGE, depende da carga intrnseca das protenas. A massa molecular de 17

estados oligomricos proticos e complexos no so facilmente determinados por esta tcnica, a no ser que protenas de interesse possuam parmetros fsico-qumicos favorveis, especialmente com pI abaixo de 5.4 (Witting & Schgger, 2005; Witting & Schgger, 2008). A resoluo do CN-PAGE foi considerada menor comparada ao sistema BN-PAGE, este ltimo est estabelecido em diversos laboratrios como uma excelente ferramenta em pesquisas clnicas e bioqumicas. Por estas razes, a aplicao do CN-PAGE para se resolver complexos proticos de membrana parece no oferecer nenhuma vantagem, exceto para estudos de protenas no ligadas ao azul brillante de Coomassie R-250. Este procedimento era pouco utilizado at recentemente onde foi possvel se reter conjuntos proticos de membrana intactos quando se substituiu detergentes neutros, como Triton X100 ou dodecilmaltose [dodecylmaltoside](DDM), na solubilizao protica por digitonina (Pfeiffer et. al., 2003). Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE): O sistema glicina SDS-PAGE, tambm conhecido como Laemmli SDS-PAGE, foi descrito por Uli Laemmli (1970), durante seus estudos sobre a dissociao de protenas do bacterifago T4. As protenas dissociadas eram submetidas a PAGE contendo SDS sob um sistema de tampo descontnuo. Ele descobriu que protenas de 60 kDa ou menores migram juntas em um sistema de corrente descontinua em gis SDS com 5% de poliacrilamida, Laemmli usou 10% de poliacrilamida para os estudos de clivagem de protenas da cabea do bacterifago T4, a sua pesquisa reconhecida pelo grande numero de citaes (155.000 at agosto de 2004) O detergente aninico dodecil sulfato de sdio (SDS) um poderoso desnaturante com caractersticas nicas. Ele desenovela e desnatura completamente todas as protenas, bem como estruturas secundrias especficas ou domnios hidrofbicos, e gera complexos SDS-proticos que so caracterizados por uma carga massa uniformes. Isto torna o SDS-PAGE em geral um mtodo simples e uma valiosa tcnica de separao protica e com algumas modificaes para determinao de massas (Schgger, 2006) Geis Laemmli-SDS de concentrao uniforme no conseguem resolver protenas de baixo peso molecular; as pequenas protenas usualmente so 18

resolvidas como bandas muito prximas no frente do gel. Neste caso recomenda-se utilizar gis gradiente. O gel gradiente Laemmli-SDS-PAGE, por exemplo, com concentraes na faixa 8-16% e 10-27% de acrilamida resolvem protenas de 6-250 kDa e 2-200 kDa respectivamente. O SDS-PAGE se tornou um mtodo essencial em quase todos os laboratrios em que se pesquisem protenas, resolvendo ilimitados problemas bioqumicos devido a habilidade do SDS-PAGE de se dissociar quase todos os complexos proticos e de resolver individualmente cadeias proticas pela sua massa (Maizel et. al., 2000). Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante de tricina (TRICINESDS-PAGE). O gel PAGE de tricina comumente utilizado para se separar protenas de massa entre 1-100 kDa. o sistema preferido eletroforese quando se pretende obter uma resoluo de protenas de massa menor que 30 kDa. As concentraes de acrilamida utilizadas nos gis so menores do que os outros sistemas de eletroforese. Essas concentraes menores facilitam o eletroblotting, que crucial para protenas hidrofbicas e tambm utilizado preferencialmente em um sistema duplo SDS-PAGE (dSDS-PAGE), uma ferramenta protemica utilizada para se isolar protenas extremamente hidrofbicas para identificao em espectrometria de massas, e apresenta tambm vantagens na resoluo sendo realizado antes da segunda dimenso (Schgger, 2006) Focalizao isoeltrica (IEF-PAGE): A eletroforese 2D (2-DE) com gradientes de pH imobilizados (IPGs) (O Farrell, 1975) combinado com a identificao protica por espectrometria de massas atualmente a base da maioria de projetos relacionados proteomica. Entretanto tecnologias alternativas e complementares emergem recentemente principalmente para conseguir resolver a carncia desta tcnica em resolverem diversos extratos proticos complexos (Weiss & Grg, 2005; Grg et. al., 1983). Chama a ateno, diversos artigos baseados na 2-DE que apresentam protenas

continuadamente expressas em diversos tecidos ou espcies. Os mesmos autores sugerem que a freqente identificao dessas protenas deve ser considerado na interpretao de qualquer estudo envolvendo a tcnica 2D-E, acreditando que possa ser resposta ao estresse celular, ou reflexo das limitaes tcnicas da 2-DE (Petrak et. al., 2008). Uma outra limitao 19

apresentada pela tcnica 2-DE devido a sua separao inapropriada para mtodos comparativos em larga escala nos estudos de expresso protica devido a sua profundidade limitada (Yentzki et al., 2007). Determinao de massa molecular nativa: Determinar o peso molecular de protenas na presena de SDS um dos principais objetivos da PAGE (Weber et.al., 1975), convertendo as protenas em estruturas que diferem apenas em seus pesos moleculares por unidade de massa. Ao se ligar com detergentes todas as protenas demonstram possuir forma similar e aproximadamente uma carga negativa constante, porem a PAGE na presena de agentes desnaturantes no permite determinar o peso molecular de uma protena oligomrica nativa. Com este propsito se poderia, alternativamente, modificar o efeito peneira dos gis sem alterar a carga neta das protenas. Assim tem surgido diversos mtodos para determinar o tamanho das protenas nativas Retamal e Babul em 1988 propuseram uma estratgia experimental onde se tornou possvel determinar a molecular de protenas por PAGE em gis gradiente de poro transverso com ligaes cruzadas de poliacrilamida na ausncia de agentes desnaturantes. 2.4 ANALISE PROTEOMICA DE FLUIDO EPIDIDIMARIO Como j foi mencionado a anlise protemica utiliza duas ferramentas principais: eletroforese e espectrometria de massas, na separao e identificao de protenas. A anlise protemica do fluido epididimrio obtido por geles uni e bidimensionais demonstra que cada protena presente no fluido apresenta um padro de distribuio diferente ao longo deste rgo de crucial importncia no processo de maturao espermtica em mamferos. Este tipo de anlise reflete tanto a captao/degradao ou remodelamento de protenas bem como a secreo e acumulao de novos componentes. Nos ltimos anos nosso grupo vem trabalhando na caracterizao de algumas protenas presentes no fluido epididimrio de eqino. Nossos resultados demonstram que varias protenas (entre elas glicosidases, proteases, superoxido dismutases, entre outras) apresentam um padro eletroforrico diferente nas amostras de do fluido coletado das diferentes regies epididimrias. Analisados em conjunto, os ensaios do comportamento destas enzimas em funo do pH, 20

analises eletroforeticas em condies nativas ou desnaturantes sugerem que no fluido epididimrio estas protenas podem se encontrar formando agregados transitrios com outros componentes de menor massa molecular. Algumas protenas podem estar na forma de monmeros, dmeros, trmeros e, outras conformaes. As ligaes atuantes na formao dessas estruturas seriam de tipo S-S e outras ligaes no covalentes, mediado por ligaes S-S (Dias, 2002; Domingos, 2008; Curty, 2008; Amorim, 2008; Dias et al., 2004; Dias, 2006). A maioria das protenas que chegam ao epiddimo via rete testis desaparece na poro proximal do ducto. Muitos dos componentes do fluido so produtos de secreo das clulas principais do epitlio epididimrio, principalmente das regies de cabea proximal e corpo epididimrio. No fluido epididimario um grande nmero de protenas tem sido detectado; protenas que apresentam um alto polimorfismo devido s glicosilaes e outras modificaes ps-traduo (Fouchecourt et al., 2000; Gattti et al., 2004). Contudo seu papel no est bem elucidado. Algumas so secretadas como isoformas especfias e aps serem remodeladas na via seminal superior estas so ativadas. A protena ativada pode ter um efeito direto no espermatozide ou no fluido no qual est imerso e pode ser parte de uma cascata de eventos que conduzem maturao espermtica. Existe a hiptese que muitas das protenas espermticas so sintetizadas como molculas precursoras no testculo e logo so remodeladas e ativadas durante os processos de maturao e capacitao espermtica. O fluido epididimrio tem uma grande influencia nos processos de maturao pos-testicular e como resultado destas interaes o espermatozide adquire tanto a motilidade progressiva unidirecional como o potencial fertilizante. A anlise das principais protenas epididimrias constitui um primeiro passo na compreenso do processo de maturao espermtica. A demonstrao que proteases e cascatas de proteases esto envolvidas no engatilhamento da transformao de formas inativas a ativas de protenas, no fluido epididimrio ou na superfcie espermtica refora o conceito de que as protenas epididimrias tm um papel importante no processo de maturao espermtica.

21

Em nosso laboratrio temos desenvolvido uma tcnica eletrofortica que permite separar as protenas presentes em complexos proticos de espermatozides e fluido epididimrio de eqinos baseado no mtodo de anlise eletrofortico de uma geometria tridimensional (3-DE), a qual apresentada nesta monografia.

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL Esse trabalho tem como objetivo central apresentar um novo mtodo de separao de protenas presentes em agregados proticos, conduzido por gis de poliacrilamida nativos, desnaturantes e em condies redutoras baseado em uma geometria tridimensional (3-DE).

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS. Desenvolver, padronizar e aplicar a tcnica de electroferese 3-DE em protenas de massa molecular conhecida. Aplicar a tcnica de electroforese 3-DE em protenas epididimrias de E. caballus.

22

4. 4.1

MATERIIS E MTODOS. MATERIIS Os reagentes utilizados foram obtidos de: Bio Rad (Hercules, CA, USA)

[EDTA, acrilamida, persulfulfato de amnio, TEMED, Tris, DTT, betamercaptoetanol, glicina, Padres de massa molecular conhecida para SDSPAGE]; Sigma (St. Louis, MO, USA) [BIS acrilamida, BSA, Azul de bromofenol, azul de coomassie R-250, azul brilhante de coomassie G 250, dodecil sulfato de sdio, kit de peso molecular Nat-PAGE (-Lactalbumina de leite bovino, Anidrase Carbnica de eritrcito bovino, Albumina do ovo de galinha, Albumina Srica e Urease); Calbiochem-Nova Biochem [mBBr]; (Co. San Diego, CA, USA) Reagentes de uso geral como cido clordrico, metanol, lcool, cido Actico, lcool issoproplico, Glicerol, Fosfato monobsico e dibsico, HCl, Cloreto de Sdio, e outros foram obtidos de Merck (Rj, Brasil) ou VETEC (RJ, Brasil). 4.2 MTODOLOGIAS

4.2.1 OBTENO DE AMOSTRAS Neste estudo foram utilizados dois tipos de amostras: Protenas comerciais de massa molecular conhecida [Albumina srica bovina (BSA), Lactalbumina, Anidrase carbnica, Ovoalbumina e Urase]. Protenas obtidas do fludo epididimrio de equinos: 1. Protenas do fluido epididimrio livre de espermatozides das regies de cabea proximal (CP), corpo (COR) e cauda epididimria (CD). 2. Protenas espermticas da regio da cauda epididimria.

Os epiddimos utilizados neste estudo foram obtidos de animais sadios, sexualmente maduros, castrados em haras da regio Norte Fluminense. Os epiddimos foram dissecados e divididos em trs regies: (1) cabea proximal, (2) corpo e (3) cauda (Fig. 3). Cada regio foi acondicionada em uma placa de 23

Petri de 10 cm de dimetro contendo PBS, pH 7,0 e fragmentada de forma a liberar o contedo luminal em 5mL de tampo, Tris HCL 20mM EDTA 1mM, na regio de cabea proximal e em 10mL nas regies de corpo e cauda epididimria. O homogeneizado de cada regio foi submetido a filtrao em gaze dupla e centrifugao a 700x g por 30 minutos a 4C, numa centrifuga Hitachi. Os sobrenadantes (fluido epididimrio) foram centrifugados a 15000x g e armazenados a -20C para posterior determinao da concentrao relativa de protenas, e anlise eletrofortica. Os precipitados (pellets) (composto principalmente por espermatozides) foram lavados trs vezes em PBS, pH 7,0 e centrifugados 760x g por 10 min. O pellet obtido foi diludo em tampo de extrao (Tris HCL 20mM, EDTA 1mM), sonicado em equipamento Sonic Dismembrator 60 (Fisher Scientific) de alta intensidade (20W) durante 15 min (15 ciclos de 30 segundos cada) e centrifugados a 17000x g (4C) por 30 min (Retamal et al., 1999). Os sobrenadantes foram armazenados a -20C para posterior determinao da concentrao reativa de protenas, marcao fluorescente do grupamento tiol-especfico com monobromobimane e analise eletrofortica.

Figura 3 - Fotografia das diferentes regies do epiddimo de Equus caballus. 1 - Regio da cabea proximal. 2 - Regio do corpo. 3 - Regio da cauda epididimria.

4.2.2

MARCAO

DE

PROTENAS

SULFIDRILADAS

DE

ESPERMATOZOIDES EPIDIDIMRIOS. Visando detectar protenas espermticas sulfidriladas, espermatozides da regio da cauda do epiddimo foram lavados duas vezes por centrifugao em soluo salina, re-suspendidos e incubados (no escuro) por 20 min em uma soluo 2mM de monobromobimane fluorescente (mBBr, preparado de uma 24

soluo estoque de 50mM de mBBr com acetonitrila). A marcao e extrao das protenas tiol foram realizadas segundo os procedimentos descritos por Kosower, et al. 1987 e Dias, 2006.

4.2.3 DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENAS.

A concentrao de protenas foi determinada pelo mtodo de Bradford (1976), utilizando BSA como padro. As amostras foram ensaiadas com concentraes de BSA variando de 0 a 25g, com intervalos de 5g. As leituras foram realizadas em um espectrofotmetro (Modelo UV-VIS espectrofotmetro Shimadzu) a 595nm de comprimento de onda. Em cada ensaio eletrofortico foi utilizado 30g de protena.

4.2.4 ELECTROFORES EM GEIS DE POLIACRILAMIDA (1-DE). Eletroforese em gis de poliacrilamida sob condies no desnaturantes (PAGE) As amostras foram submetidas PAGE sob condies nativas 8% (Davis, 1964) a 4o C. A todas as amostras foram acrescentados 10l de soluo salina contendo cloreto de sdio (NaCl) 400mM e fosfato monocido de potasio (K2HPO4) 8mM, no intuito de melhorar a resoluo das bandas no gel. Aps a migrao eletrofortica das protenas os gis foram corados com uma soluo de azul brillante de Coomassie R-250 0,1%, (Reisner, 1984). Os gis corados com azul de Coomassie foram descorados em banhos sucessivos de gua aquecida a 100 C. Aps decorados, os gis foram fotografados com mquina digital e as imagens obtidas foram guardadas no formato TiFF, e analisados densitometricamente, atravs do programa computacional Gel Perfect (Bozzo & Retamal, 1991). Eletroforese em gis de poliacrilamida sob condies desnaturantes (SDS-PAGE) As amostras foram submetidas a eletroforeses em condies desnaturantes SDS-PAGE 10%, segundo a tcnica de Laemmli (1970). Trs partes de amostra foram adicionadas a uma parte de tampo de amostra 4x 25

(Tris HCl 0,5 M, pH 6,8, glicerol 10%, azul de bromofenol 1% e SDS 2%). A eletroforese ocorreu a 70 V no gel concentrador e a 100 V no gel separador, em tampo de eletroforese SDS (Tris HCl 25 mM, pH 8,3, glicina 1,4%, SDS 0,1%) at a marcao do azul de bromofenol (fronte de eletroforese) chegar a base do gel. Aps a migrao eletrofortica das protenas, os gis foram processados para a deteco de fluorescncia e ento fotografados com mquina digital e as imagens obtidas foram guardadas no formato TiFF, e posteriormente corados com uma soluo de azul de Coomassie R-250 0,1%, (Reisner, 1984). Os gis j corados foram submetidos banhos sucessivos de gua aquecida a 100 C para o descoramento. Aps decorados, os gis foram re-fotografados com mquina digital e as imagens obtidas foram guardadas no formato TiFF, transformadas para 400 dpi em tons de cinza e posteriormente analisados por densitometra, atravs do programa computacional Gel Perfect (Bozzo & Retamal, 1991). 4.2.5 ELECTROFORESES EM GEIS DE POLIACRILAMIDA (NATIVO/ SDS (2-DE) Foram realizados gis 2-DE nativo 8% - SDS 12%, segundo Sun & Pan, (1999) e Dias (2002). Primeiramente, foram feitos gis de poliacrilamida

(PAGE) nativos 8% (v/v) com as amostras de fluido epididimrio. Um volume de 50 L de cada amostra foi depositado em um poo de 2,8 cm para a migrao eletrofortica (Nativo 8% a 4o C). Uma vez completada a eletroforese, tiras verticais de 0,7 cm de largura foram cortadas do gel. Foi utilizada uma tira para deteco das protenas para corar com azul de Coomassie R-250 e o restante foi lavado com trs trocas de gua destilada e incubado em tampo de amostra 2X, contendo 0.1% de SDS por 20 minutos a temperatura ambiente, para a realizao das segundas dimenses subseqentes. Aps esse perodo, cada tira foi inserida no aparelho de eletroforese j contendo o gel separador (SDS-PAGE 12%) e o gel concentrador previamente polimerizados, tomandose cuidado para no deixar formar bolhas entre a tira e o gel separador conforme a Fig. 4. Os gis foram revelados com Azul brillante de Coomassie R250 e opticamente capturado por fotografia digital, as imagens foram

armazenadas no formato TiFF e JPEG.

26

Figura 4 - Modelo esquemtico do ensaio 2-DE Nativo/SDS PAGE 12%. 1 Gel Nat-PAGE 8%, onde a separao protica ocorre em funo da carga e massa das protenas preservando complexos e agregados proticos. 2 Gel SDS-PAGE 12%, a separao da amostra protica de acordo com a carga negativa imposta pelo detergente SDS, os agregados e complexos so dissociados em subunidades. MW Padro de peso molecular.

4.2.6 ELECTROFORESES GEOMETRIA 3D (3-DE)

EM

GEIS

DE

POLIACRILAMIDA

COM

Durante a padronizao da tcnica foram realizados gis de espessura entorno de 9 mm visando transferir protenas de um gel unidimensional ou bidimensional de 3mm para este gel de maior grossura. Neste experimento as protenas dos gis foram transferidas por 1h e 30 min utilizando-se uma unidade de transferncia Amersham Biosciences mini Vertical Electrophoresis System a 100V. O gel de 6 mm foi elaborado colocando-se duas placas de 1,5mm posicionadas uma frente a outra, e adicionando-se 2 espaadores de 1,5mm de acordo com a Fig. 5. Os gis foram feitos segundo a tcnica de Laemmli (1970).

27

Figura 5 Polimerizao de um gel de poliacrilamida de 6mm de espessura.

Determinao do tempo de transferncia de um gel SDS-PAGE de 1,5mm a um outro semelhante, utilizando protenas marcadas fluorescentes:

As protenas espermticas previamente marcadas com mBBr foram submetidos a uma eletroforese 1-DE. Aps a migrao eletrofortica das protenas, o gel contendo 10 canais com a mesma amostra foram transferidos, utilizando-se uma unidade de transferncia Amersham Biosciences mini Vertical Electrophoresis System a 50V, para um outro gel SDS-PAGE 12% de caractersticas semelhantes.

Figura 6 - Modelo esquemtico do ensaio para determinao do tempo de transferncia de protenas um gel SDS-PAGE 12% a outro semelhante. A Gel SDS-PAGE 12%, contendo protenas de peso molecular entre 200-21,5 kDa, marcadas com mBBr. B Gel SDS-PAGE 12%. No instante 30 e 75 ambos os gis foram submetidos ao ultravioleta a 480nm para se revelar as posies das protenas.

28

A eletroforese foi detida, nos intervalos de tempo 0, 15, 30, 45 e 75 min. Em cada intervalo de tempo um canal contendo os dois gis foi fatiado, e o restante continuou o processo da eletroforese. Cada canal fatiado aos distintos tempos foi observado em um trans-iluminador ultravioleta a 480nm, para que se revelassem as posies das bandas proticas devido s caractersticas fluorescentes do monobromobimane tanto no gel matriz (a) como no separador (b), conforme o modelo monstrado na Fig. 6. Estas bandas foram comparadas com as bandas iniciais. Desta maneira foi possvel determinar um padro de mobilidade protica na transferncia, relacionando o peso molecular com os intervalos de tempo. Os gis posteriormente foram revelados com Azul brillante de Coomassie R-250 e opticamente capturado por fotografia digital, as imagens foram armazenadas no formato TiFF

Determinao do tempo de transferncia de um gel SDS-PAGE de 3mm a um outro de 6 mm de espessura: Em este ensaio analisou-se a migrao das protenas no gel separador de 6.0 mm de espessura. O perfil 2-DE NAT/SDS 12% foi posicionado sobre o gel separador SDS-PAGE 12% de 6 mm de grande profundidade.

Figura 7 - Modelo esquemtico do sistema Amersham Biosciences mini Vertical Electrophoresis System utilizado na transferncia do perfil 2-DE Nativo/SDS-PAGE 12% para o gel separador SDS-PAGE 12% de 6mm.

29

O conjunto do perfil 2D e o gel separador de 6mm foi acondicionado em uma cuba eletrofortica ou unidade de transferncia, onde os catodos esto dispostos horizontalmente conforme se mostra na cuba utilizada nos experimentos de transferncia protica Amersham Biosciences mini Vertical Electrophoresis System (Fig.7 ). A transferncia ocorreu em um perodo de 90 min. Aps da transferncia os gis foram corados com Azul brillante de Coomassie R-250 0,1%. O gel de 6 mm foi seccionado verticalmente em fatias de 1.5mm conforme a Fig.8. As fatias foram opticamente capturadas por fotografia digital, as imagens foram armazenadas no formato TiFF .

Figura 8 Modelo esquemtico do procedimento de seco do gel separador SDS-PAGE 12% com 6mm de espessura em fatias de 1.5mm.

30

Transferncia do perfil protico 2D Nativo/SDS, para um sandwich de gis separadores em serie, com agente redutor em uma geometria 3D(3DE): Devido a dificuldade de se fatiar os gis precisamente, de forma empirica utilizamos os 4 gis de 1,5mm ao invs do gel grosso (6mm). Aps as eletroforeses 2-DE Nat/SDS 12% o gel foi incubado com uma soluo tampo Tris 1X adicionando 1 ml de DTT 1M em uma placa de petri de 10 cm de dimetro, durante 15 min. Aps o perodo de tempo previamente descrito o gel incubado foi posicionado sobre um conjunto ou uma pilha de gis SDS-PAGE 12%, ligeiramente maior e sem gel de staking ou concentrador dispostos em srie semelhando um gel grosso de 6 mm como demonstra a Fig. 9.

Figura 9 - Modelo esquemtico do posicionamento do perfil 2D Nat/SDS-PAGE 12% sobre os gis SDS-PAGE 12% dispostos em srie.

O conjunto destes gis foi acondicionado em uma cuba eletrofortica

Amersham Biosciences mini Vertical Electrophoresis System, onde oscatodos estavam dispostos horizontalmente, como se observa na Fig. 10.

31

Figura 10 - Modelo esquemtico do sistema utilizado na transferncia do perfil 2-DE Nativo/SDS-PAGE 12% para gis SDS-PAGE 12% em srie,com presena de DTT no tampo.

As protenas do gel Nat/SDS-PAGE 12% foram ento transferidas para os gis separadores em srie, na presena de DTT no tampo, a 50 V, com um sistema de geometria 3D. Todos os gis foram corados com Azul brillante de Coomassie R-250 e fotografados, as imagens foram armazenadas no formato TiFF .

4.2.7 ANLISE

DA

MOBILIDADE

ELETROFORTICA

E

MASSAS

MOLECULARES DAS PROTENAS EM GIS DE POLIACRILAMIDA.

A

quantificao relativa foi determinada

das protenas presentes nos gis de por densitometria usando o programa

poliacrilamida

computacional Gel Perfect (Bozzo & Retamal, 1991; Retamal et al., 1999). Com o auxlio do programa foi calculada a mobilidade relativa (Rf) de cada banda protica e a rea ocupada por ela, dando tambm uma representao diagramtica das bandas e sua concentrao relativa em relao ao total de 32

protenas por canal. A determinao das massas moleculares relativas foi realizada relacionando-se a mobilidade das protenas das amostras em estudo com protenas comercializadas de massas moleculares conhecidas, que foram utilizadas como um padro. As imagens digitais foram previamente obtidas com mquina fotogrfica Canon Rebel Xt com tamanho original de 8 Megapixels e, em seguida, foram transformadas em imagem de cor cinza e formato TiFF com um tamanho de 0,15 Mb. A imagem obtida foi transformada em 256 tons de cinza atravs do Ulead PhotoImpact 7.0, um programa comercial de tratamento de imagens. O princpio da anlise densitomtrica utilizado pelo programa Gel-Perfect, a converso dos diferentes tons de cinza em tons de cores, mediante um algoritmo matricial. Para o clculo de rea, este programa utiliza outro algoritmo gaussiano. O fator Gauss foi utilizado para calcular as reas das projees laterais, que em ltima anlise seriam reflexos das intensidades dos tons de cores contidos no diagrama do gel. Desta forma foi determinado o padro de mobilidade relativa (Rf) da protena de interesse bem como sua percentagem em relao ao contedo protico (corado com Azul brillante de Coomassie R-250 ) total na raia do gel analisado.

33

5.

RESULTADOS E DISCUSSOES.

Nossos resultados esto referidos a um sistema de geometria 3D, onde as protenas do gel Nat/SDS-PAGE 12% foram transferidas para os gis

separadores SDS-PAGE 12%, em srie na presena de DTT no tampo, a 50 V. Na seo metodologia se descreve a tcnica de eletroforese desenvolvida durante o estagio de iniciao cientfica. Vrios parmetros foram previamente avaliados durante o desenvolvimento da tcnica, entre eles:

5.1 AVALIAO DO TEMPO E PADRO DE TRANSFERNCIA DE PROTENAS ENTRE UM GEL MATRIZ E O SEPARADOR. As figuras 11 e 12 mostram o perfil eletrofortico das protenas espermticas, marcadas com mBBr, que foram transferidas de um gel matriz para um separador (mostrado na Fig. 6). No instante 0 (zero minutos), se observa o estado onde todas as protenas esto no gel matriz. A colorao das protenas intensa e igual por todo o gel. Aos 15 (quinze minutos) a colorao das protenas de 21 a 31 kDa menos intensa no gel matriz, logo estas protenas de tamanho reduzido comearam a ser transferidas do gel matriz ao gel separador. No instante 15T, do gel separador, protenas de 21 a 31 kDa comearam a se tornar visveis quando este foi submetido ao ultravioleta a 480 nm. Aos 30(trinta minutos) no gel matriz no se observou colorao nas bandas correspondentes a 21 e 31 kDa, sugerindo que protenas desta faixa foram totalmente transferidas do gel matriz ao separador. No gel separador de instante 30T a intensidade da fluorescncia emitida pelas protenas de 21 a 31 kDa se demonstrou intensa e evidente, a ausncia destas no gel de 30 nos indica que as protenas desta faixa foram totalmente transferidas do gel matriz ao separador. Nos instantes subseqentes o mesmo fenmeno em escala foi observado em taxa crescente.

34

Figura 11 - Avaliao do tempo de transferncia do gel matriz ao separador. 0 75 - Gel matriz com o perfil ,SDS-PAGE 12%, de protenas espermticas de Equus Caballus coradas com Azul brillante de Coomassie R-250 , nos intervalos de tempo 0 at 75 minutos. 15T 75T -Gel separador, SDS-PAGE 12%, observado no transiluminador ultravioleta a 480nm, que manifesta a fluorescncia das protenas marcadas, nos seus grupamentos tiol, nos intervalos de tempo de 15 a 75 minutos. MW Padro de peso molecular.

O ensaio pode ser demonstrado sob uma outra perspectiva, conforme a Fig. 12. O gel separador foi seccionado de forma sagital nos intervalos de tempo 15(quinze minutos), 30(trinta minutos), 45(quarenta e cinco minutos) e 75 (setenta e cinco minutos). Nos cortes de 1,5mm se observa nos instantes 15 at 75 que as protenas espermticas continuam a migrar, ao longo do tempo, dentro do gel separador.

Figura 12 Avaliao do tempo de transferncia do gel matriz ao separador. 15 75 Corte sagital das tiras do Gel separador, SDS-PAGE 12%. Com UV a 480nm se observa a fluorescncia das protenas marcadas nos seus grupamentos tiol, nos intervalos de tempo de 15 a 75 minutos. 0 75 - Corte sagital das tiras do Gel matriz SDS-PAGE 12%, de protenas espermticas de Equus Caballus, coradas com Azul brillante de Coomassie R-250 , nos intervalos de tempo 0 at 75 minutos.

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Na Fig.13 se mostra o perfil 2D Nat/SDS-PAGE 12% de protenas do fluido epididimrio que foram transferidas de um gel matriz de 1,5mm a um separador de grosso com 6mm durante 90 minutos (Fig. 5.), e depois

seccionado em forma sagital de acordo com o modelo esquemtico demonstrado na Fig. 8. partir destes cortes em srie observamos que as protenas migram continuamente dentro do gel separador at serem freadas em uma regio determinada devido ao efeito peneira, que atrasa a taxa de migrao das protenas de tamanho maior em relao s protenas de tamanho menor. Logo protenas de menor tamanho ficaram posicionadas ao lado direito de cada tira enquanto as protenas de tamanho superior se encontram prximas ao lado esquerdo de cada tira.

Figura 13 - Cortes sagitais de um gel separador SDS-PAGE 12% grosso, com 6 mm de espessura, reveladas por azul brillante de Coomassie R-250 , aps a transferncia de protenas provenientes de um gel matriz 2D Nativo/SDS-PAGE 12% contendo protenas do fludo epididimrio de Equus Caballus.

5.2

PERFIL PROTICO NATIVO E DESNATURANTE DAS AMOSTRAS

COMERCIAIS E DE FLUIDO EPIDIDIMRIO (1-DE). 5.2.1 PERFIL PROTICO NATIVO. O perfil eletrofortico Nat-PAGE 8% apresentado na figura 14, contem todas as amostras utilizadas neste trabalho em condies nativas. A protena isolada BSA Sigma (nmero 1 da Fig.14) bem como a BSA do kit de protenas (nmero 3 da Fig.14) apresentam monmero e dmeros por algumas vezes trmeros e tetrmeros. O mesmo fenmeno acontece com as protenas isoladas de 36

nmero 2, 4, e 6 na mesma figura. Os nmeros 7,8 e 9 so correspondentes as protenas do fludo epididimrio da CP, COR e CD respectivamente.

Figura 14 Nat-PAGE 8% revelado com Azul brillante de Coomassie R-250. 1 BSA Sigma. 2 - Albumina do ovo de galinha. 3 BSA do Kit comercial de protenas. 4 - Anidrase Carbnica do eritrcito bovino. 5 - -Lactalbumina do leite bovino. 6 - Urease . 7 Fluido epididimrio da CP. 8 - Fluido epididimrio do COR. 9 - Fluido epididimrio da CD.

Nossas analises de gis nativo ratificam as descries de Schgger (1994) que assinalam que a eletroforese em gel nativo uma boa ferramenta analtica e preparatria, permitindo o isolamento direto de complexos proticos nativos do tecido homogeneizado de animais.

5.2.2 PERFIL PROTICO DESNATURANTE. No perfil eletrofrtico SDS-PAGE 12% da Fig. 15 todas as amostras utilizadas neste trabalho esto representadas no mesmo gel sob condies desnaturantes. As protenas do kit comercial foram misturadas e colocadas no mesmo poo.

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Figura 15 Gel SDS-PAGE 12% revelado com Azul brillante de Coomassie R-250 1 BSA Sigma. 2 Protenas do Kit contendo: albumina do ovo de galinha, albumina do soro bovino, anidrase carbnica do eritrcito bovino, -lactalbumina do leite bovino, urase.3 Fluido epididimrio da CP. 4 - Fluido epididimrio do COR. 5 - Fluido epididimrio da CD. MW Padro de peso molecular.

As protenas do kit (albumina do ovo de galinha, albumina do soro bovino, anidrase carbnica do eritrcito bovino, -lactalbumina do leite bovino, urase) apresentam massas moleculares entre 200-21,5 kDa. Estas so protenas nativas e puras, entretanto nos experimentos subseqentes ao se experimentar todas misturadas em um nico poo de um gel nativo-PAGE 8%, para se fazer a eletroforese 3D (3-DE), estas protenas podem formar

agregados proticos. Na figura 16 mostramos elas separadas em cada poo(1), juntas no mesmo poo(7) e depois a separao do conjunto em um perfil 2D Nat/SDS-PAGE 12%(9). Neste gel 2D se observam trens de protenas de uma massa molecular idntica.

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Figura 16 Modelo esquemtico mostrando as interaes entre as protenas do o kit comercial. 1 Gel Nat-PAGE 8% contendo as protenas do kit comercial. 2 Albumina do ovo de galinha. 3 BSA. 4 - Anidrase Carbnica do eritrcito bovino. 5 - -Lactalbumina do leite bovino. 6 Urease . 7 Gel Nat-PAGE 8% contendo todas as protenas misturadas do kit. 8 Perfil SDSPAGE12% contendo todas as protenas misturadas do kit de protenas na presena de SDS. 9 Perfil 2D Nat/SDS-PAGE 12% contendo o conjunto de protenas do kit de protenas comerciais.

Como j tm sido demonstrado por numerosos pesquisadores as protenas contidas em um gel SDS-PAGE migram de um gel a outro devido carga eltrica empregada, porosidade dos gis de poliacrilamida, carga massa e tamanho. As protenas so separadas devido ao efeito peneira que atrasam a taxa de migrao de protenas de tamanhos maiores em relao s protenas menores.

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5.3 DETERMINAO DO PERFIL PROTEICO NAT/SDS-PAGE 12%, SEGUNDA DIMENSO (2D), E SUA ANLISE DENSITOMTRICA. As amostras proticas foram previamente caracterizadas de acordo com sua carga/massa pelo sistema nativo, representado pelo item 1 nas figuras 17,18, 19, 20 e 21. Anexo a cada tira submetida a eletroforese est posicionado o densitograma referente. No item 2, de cada figura, a separao do perfil nativo das amostras proticas est de acordo com a carga negativa imposta pelo detergente SDS, logo os agregados e complexos puderam ser dissociados em subunidades como demonstrado na Fig. 4. A associao dos dois sistemas oferece uma separao dos agregados e complexos proticos, seguido da caracterizao destes em subunidades. O item 5 de cada figura o densitograma referente ao perfil 2D Nat/SDS-PAGE 12% de cada amostra protica, ele se apresenta bem parecido com o densitograma do perfil nativo (item 4). O item 3 das figuras 17, 18, 19, e 20 a amostra protica em questo a mesma que fora submetida a condies nativas, entretanto est sob

condio desnaturante SDS-PAGE 12%, sem antes ser submetida o tratamento nativo, e serve como referncia.

Os ensaios Bi-dimensionais Nat/SDS-PAGE 12% separaram complexos proticos e agregados de suas subunidades com alta resoluo. Concordamos com Burr (2009) que a clssica 2-DE (IEF/SDS) utilizando a focalizao isoeltrica (IEF) e SDS-PAGE para a segunda dimenso oferece alta resoluo para a separao de complexos proticos de extratos de protenas. Entretanto protenas hidrofbicas podem se agregar e serem sub-representadas nestes gis.

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5.3.1 ALBUMINA SRICA BOVINA (BSA).

Figura 17 Modelo esquemtico das imagens do perfil protico 2D Nat/SDS-PAGE 12%, contendo BSA Sigma, corados com Azul brillante de Coomassie R-250 . 1 Tira de gel NatPAGE 8% de BSA. 2 - Gel 2D Nat/SDS-PAGE 12% de BSA Sigma. 3 Perfil SDS-PAGE 12% de BSA Sigma. 4 Densitograma referente tira de gel (1) Nat-PAGE 8%. 5 Densitograma referente ao gel 2D ( 2 ) Nat/SDS-PAGE 12%. 6 Densitograma referente ao perfil (3) SDSPAGE 12%. MW Padro de peso molecular.

Como se observa na Fig. 17, a BSA se apresenta no gel nativo-PAGE 8% (1) em monmero Rf 0.9, dmero Rf 0.6 e trmero Rf 0.3. No gel 2D Nat/SDS-PAGE 12% (2) o monmero possui o peso molecular de 66 kDa, o dmero 132 kDa e o trmero 198 kDa.

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5.3.2 KIT DE PROTENAS PADRES, CONTENDO ALBUMINA DO OVO DE GALINHA, ANIDRASE CARBNICA DO ERITROCITO BOVINO -

LACTALBUMINA DO LEITE BOVINO E UREASE.

Figura 18 - Modelo esquemtico das imagens do perfil protico 2D Nat/SDS-PAGE 12%, corados com Azul brillante de Coomassie R-250 .1 Tira de gel Nat-PAGE 8%, do kit de protenas comerciais. 2 - Gel 2D Nat/SDS-PAGE 12%, do kit de protenas comerciais. 3 Perfil SDS-PAGE 12% do kit de protenas. 4 Densitograma referente tira de gel (1) Nat-PAGE 8%. 5 - Densitograma referente ao gel 2D ( 2 ) Nat/SDS-PAGE 12%. 6 Densitograma referente ao perfil (3) SDS-PAGE 12%. MW Padro de peso molecular.

Como se observa na Fig. 18, a separao do conjunto(1) de protenas do Kit comercial em um gel 2D Nat/SDS-PAGE 12%. A urease apresenta um peso molecular de 272 kDa e uma Rf de 0.1 e 0.2 do estado nativo. A BSA apresenta um peso molecular de 66 kDa e uma Rf de 0.8 do estado nativo. A albumina do ovo de galinha possui um peso molecular de 45 kDa e uma Rf de 0.9 do estado nativo (isoformas eltricas). A anidrase carbnica possui um peso molecular de 29 kDa e uma Rf de 0.3,0.4 e 0.5 (isoformas eltricas). A -Lactalbumina apresenta um peso molecular entorno de 14,2 kDa e uma Rf 0.9 do estado nativo.

42

5.3.3 FLUDO EPIDIDIMARIO Como se observa nas figuras 19, 20 e 21 a composio protica do fluido luminal do epiddimo fortemente modificada ao longo do conduto epididimrio provavelmente como resultado das funes de secreo e absoro deste rgo. Algumas bandas observadas na primeira dimenso parecem ser compostas de vrias protenas que co-migram quando feita a segunda dimenso sob condies desnaturantes. Estas protenas em condies nativas podem co-migrar por efeito de sua carga eltrica e massa molecular ou devido formao de agregados. As protenas de 200, 116, 9766 kDa provavelmente encontram-se formando agregados proticos.

Figura 19 Modelo esquemtico contendo imagens que constituem e provm referncia ao perfil protico 2D Nat/SDS-PAGE 12%, corados com Azul brillante de Coomassie R-250 .1 Tira de gel Nat-PAGE 8%, de protenas do fluido epididimrio da regio da CP. 2 - Gel 2D Nat/SDS-PAGE 12%, de protenas do fluido epididimrio da regio da CP. 3 Perfil SDSPAGE 12% de protenas do fluido epididimrio da regio da CP. 4 Densitograma referente tira de gel (1) Nat-PAGE 8%. 5 - Densitograma referente ao gel 2D ( 2 ) Nat/SDS-PAGE 12%. 6 Densitograma referente ao perfil (3) SDS-PAGE 12%. MW Padro de peso molecular.

Na Fig. 19, as protenas do fluido epididimrio da regio da CP esto apresentadas no gel nativo-PAGE 8% (1) com uma Rf de 0.3. No gel 2D Nat/PAGE 12% (2) observamos duas protenas com a mesma Rf de 0.3 do estado nativo e com massas moleculares diferentes uma com 116 kDa e a outra com massa molecular entre 97-66 kDa.

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Na Fig. 20, as protenas do fluido epididimrio da regio do COR esto apresentadas no gel nativo-PAGE 8% (1) e distribudas por todo gel observamos 5 picos no densitograma com Rf 0.0, 0.4, 0.5, 0.6 e 0.9. No gel 2D Nat/PAGE 12% (2) observamos um agregado protico com massa molecular entre 200 e 116 kDa de Rf entre 0.2-0.4 do estado nativo. Observamos diversas protenas com o peso molecular de 66 kDa, entretanto com Rf de 0.1, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 e entre 0.8-1.0 do estado nativo.

Figura 20 Modelo esquemtico contendo imagens que constituem e provm referncia ao perfil protico 2D Nat/SDS-PAGE 12%, corados com Azul brillante de Coomassie R-250 .1 Tira de gel Nat-PAGE 8%, de protenas do fluido epididimrio da regio do COR. 2 - Gel 2D Nat/SDS-PAGE 12%, de protenas do fluido epididimrio da regio do COR. 3 Perfil SDSPAGE 12% de protenas do fluido epididimrio da regio do COR. 4 Densitograma referente tira de gel (1) Nat-PAGE 8%. 5 - Densitograma referente ao gel 2D ( 2 ) Nat/SDS-PAGE 12%. 6 Densitograma referente ao perfil (3) SDS-PAGE 12%. MW Padro de peso molecular.

Na Fig. 21, as protenas do fluido epididimrio da regio do CD esto apresentadas no gel nativo-PAGE 8% (1) e distribudas por todo gel observamos diversos pequenos picos no densitograma com Rf 0.0, 0.4, 0.5 e 0.9. No gel 2D Nat/PAGE 12% (2) observamos um agregado protico com massa molecular entre 200 e 116 kDa de Rf entre 0.2-0.4 do estado nativo. Observamos diversas protenas com o peso molecular de 66 kDa, entretanto com Rf de 0.1, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 e entre 0.8-1.0 do estado nativo.

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Visualizados tambm protenas com pequeno peso molecular menores do que 31 kDa com Rf de 0.5 e 0.6.

Figura 21 - Modelo esquemtico contendo imagens que constituem o perfil protico 2D Nat/SDS-PAGE 12%, corados com Azul brillante de Coomassie R-250. 1 Tira de gel NatPAGE 8%, do fludo epididimrio da regio da CD. 2 - Gel 2D Nat/SDS-PAGE 12%, do fludo epididimrio da regio CD. 3- Densitograma referente tira de gel (1) Nat-PAGE 8%. 4 Densitograma referente ao gel 2D ( 2 ) Nat/SDS-PAGE 12%. MW Padro de peso molecular.

5.4 TRANSFERENCIA DO PERFIL PROTEICO NAT/SDS 12% (2-DE), PARA UM SANDUICHE GES SEPARADORES, COM AGENTE REDUTOR, TERCEIRA DIMENSO (3-DE). Os perfis Nat/SDS 12% (2-DE) de BSA Sigma, kit de protenas comerciais, e fluido epididimrio das regies da CP, COR e CD foram posicionados sobre o sanduche de gis SDS-PAGE 12%, em srie, sistema 3D, de acordo com o modelo esquemtico da Fig. 9. A transferncia ocorreu de acordo com o modelo descrito na Fig. 10.

Nossos resultados demonstram que os experimentos eletroforticos com alta profundidade, ditos de terceira dimenso, frutos da combinao de tcnicas eletroforticas em srie, permitem a separao de complexos proticos, com algumas limitaes . Contudo ainda pouco o que conhecemos

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sobre os comportamentos dinmicos e no perm

monografia felipe paranhos

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