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Estabelecimento in vitroàe explantes de pau-rosa{Aníba rosaeodora Ducke)

Lúcia Handa

Dissertação apresentada ao Programa dePós-Graduação em Biologia Tropical eRecursos Naturais do convênio INPA/UA,como parte dos requisitos para obtençãodo título de Mestre em Ciências deFlorestas Tropicais.

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2001

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Universidade do Amazonas - UA

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - iNRA

Estabelecimento in vitro de explantes de pau-rosa{Aniba rosaeodora Ducke)

^ Lúcia Handaa

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■Q^ Orientador: Paulo de Tarso Barbosa Sampaio, Dr.V?

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Dissertação apresentada ao Programa dePós-Graduação em Biologia Tropical eRecursos Naturais do convênio INPA/UA,como parte dos requisitos para obtençãodo título de Mestre em Ciências de

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MANAUS- AM2001

Handa, L.

Estabelecimento in vitro de explantes de pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke) /Lúcia Handa. - Manaus, 2001.

54 p.: il.

Dissertação de mestrado-INPA/UA.

1. Pau-rosa 2. Embriões e rebrota 3. desinfestação de explantes4. estabelecimento in vitro

(CDDIS.ed.) 634.956

Sinopse:

Cultura in vitro de explantes sob diferentes tipos de assepsia e meios decultura de Aniba rosaeodora Ducke.

Palavras-chave; cultura in vitro, estabelecimento in vitro, explantes, desinfestação, pau-rosa, Aniba rosaeodora.

INSTITUTO NACIONAL DF.PESQUISAS DA AMAZÔNIA

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Ao meu filho Maurício Naoto,Aos meus pais, Jirson e RitsukoAos meus irmãos Jaime e Erikae demais familiares...

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AGRADECIMENTOS

'% Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (IMPA), em especial à

^ Coordenação de Pesquisas em Silvicultura Tropical (CPST) pela oportunidadeconcedida para a realização do curso de mestrado e por ter cedido material

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0 vegetal para a montagem dos experimentos.

^ À Embrapa Amazônia Ocidental por ter propiciado juntamente com o

Projeto SHIFT ENV-42/2 e o Laboratório de Biotecnologia Vegetal, a oportunidade

de desenvolver o trabalho.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

^ (CNPq), pela concessão da bolsa de mestrado.

(!) Á Fundação O Boticário de Proteção à Natureza pelo auxílio na parte de

^ material laboratorial.

^ Ao prof°. Dr. Paulo de Tarso Barbosa Sampaio pela orientação, amizade esugestões neste trabalho.

C5 Agradeço especialmente, à pesquisadora Regina Caetano Quisen

(Embrapa Amazônia Ocidental) pela co-orientação, amizade, sugestões e críticas

ao trabalho, bem como pela contribuição com material bibliográfico.

Aos pesquisadores Luiz Marcelo Rossi e Regina Quisen pelo auxílio com as

fotos deste trabalho.

Aos pesquisadores Celso Paulo de Azevedo (Embrapa Amazônia

Ocidental) e Joaquim dos Santos (INPA) pelo incentivo, sugestões e grandiosa

amizade.

À Rosimar Souza Carvalho, Christiane Lopes e Sebastião Sales pela

paciência, amizade e pelo auxílio nas atividades de laboratório e a todos os

demais funcionários da Embrapa Amazônia Ocidental, que contribuíram de

alguma forma, ao longo da execução do trabalho.

Ao Wilson Roberto Spironello, pelo auxílio na identificação fenológica das

sementes de pau-rosa.

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^ Aos amigos Hildemberg Cruz e Kikue Muroya por auxiliarem em algumas^ fases de implantação dos experimentos.'ijy

^ À todos os funcionários do INPA que auxiliaram ao longo do curso.# À turma do Curso de Ciências de Florestas Tropicais do INPA, Antônio

^ Carlos Hummel, Cláudio Yano, Francimari Colares, Hélio Paracaima de

^ Magalhães, Luciana Couto, José Ricardo Araújo Lima, Luís Cláudio de Oliveira,Rosana de Miranda Rocha, Roseana Pereira da Silva, meus sinceros

agradecimentos pela amizade, sinceridade e coleguismo ao longo do curso, sem a

^ qual esta etapa não teria o mesmo valor.

^ Aos demais alunos de Pós-Graduação do INPA, em especial, Mary Jane0

Brandão de Almeida, Alexandre Silva, Adriano Nogueira, Lígia Toledo, Mabiane

^ França, Hildemberg Cruz, entre outros, agradeço pela amizade.

Aos professores do curso de Pós-Graduação do INPA, Antenor Barbosa,

^ Bruce Nelson, Carlos Bueno, Gil Vieira, Hiroshi Noda, João Ferraz, Joaquim dos

Santos, Kaoru Yuyama, Luís Antônio de Oliveira, Niro Higuchi, Paulo de Tarso

Sampaio, Rosana Parente e Vânia Varella, agradeço pelas contribuições com os

conhecimentos transmitidos.

Agradeço especialmente, à amiga Kikue Muroya, pela valiosa amizade e

consideração nos mais diversos momentos de minha vida.

Aos amigos Germaine Souza, Doriney Lobato de Sousa, Edieno Moura e

Plácido Mitoso, agradeço pela força e amizade.

À minha família, meus sinceros agradecimentos pelo apoio e carinho.

À todos aqueles que contribuíram de alguma forma na realização deste

' trabalho.

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SUMARIO

Cí LISTA DE FIGURAS@ LISTA DE TABELAS

LISTA DE ANEXOS vRESUMO Y'

^ SUMMARY@ 1. INTRODUÇÃO O""íS 2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo gerai ^2.2. Objetivos específicos

3. REVISÃO DE LITERATURA3.1. Descrição da espécie3.2. Distribuição geográfica ^3.3. Potencial econômico da espécie3.4. Propagação vegetativa3.5. Cultura de Tecidos Vegetais

^ 3.5.1. Usos da Cultura de Tecidos VegetaisO 3.5.2. Fases da cultura in vitro

0 3.5.3. Fatores que afetam a cultura in vitro O®3.5.4. Desinfestação

_ 3.5.5. Contaminação e Oxidação^ 3.5.6. iWe/os nutritivos e Reguladores de crescimento IoO 3.5.7. Cultura de embriões

4. MATERIAL E MÉTODOS4.1. Localização e caracterização da área de estudo 214.2. Fontes de explante4.3. Desinfestação e isolamento do material vegetal 22

4.3.1. Ápices caulinares e segmentos nodais 224.3.2. Explantes foliares4.3.3. Embriões

4.3.4. Material de rebrota ^4.4. Meio de cultura

4.5. Reguladores de crescimentoO 4.6. Controle da oxidação

4.7. Condições ambientais das culturas4.8. Delineamento experimental

® 5. RESULTADOS E DISCUSSÕES® 5.1. Ápices caulinares e Segmentos nodais ^(J 5.2. Embriões

5.3. Explantes foiiares^ 5.4. Rebrota ^^ 6. Conclusões^ 7. Recomendações@ 8. Referências bibliográficas

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LISTA DE FIGURAS

® Figura 01 - Mudas de pau-rosa mantidas em casa de vegetação 22^ Figura 02 - Ápices caulinares e segmentos nodais de pau-rosa 239 Figura 03 - Redução preliminar dos ápices caulinares e segmentos nodais de pau-^ 240 rosa ^

Figura 04 — Processo de assepsia em câmara de fluxo laminar 25^ Figura 05 - Sementes de pau-rosa em diversos estádios de maturação (A —^ imatura; B e C - madura)

Figura 06 - Embriões imaturos de pau-rosa em meio MS aos 15 dias 37Figura 07 - Embriões de pau-rosa com radícula aos 30 dias 38Figura 08 — Embriões de pau-rosa com formação completa aos 45 dias 39

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LISTA DE TABELAS

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33 Tabela 01 - Preparo do meio de Murashige & Skoog 29

Tabela 02 - Reguladores de crescimento e suas características 30

Tabela 03 - Reguladores de crescimento adicionados ao meio de cultura MS, para

os explantes foliares de pau-rosa 30

Tabela 04 - Efeito da concentração de hipoclorito de sódio e do período de

exposição na desinfestação de segmentos apicais de pau-rosa

32?

úTabela 05 - Efeito da concentração de hipoclorito de sódio e do período de

exposição na desinfestação de segmentos nodais de pau-rosa.33

Tabela 06 - Efeito das concentrações de sacarose e água de côco naíV) desinfestação de embriões de pau-rosa 35

Tabela 07 - Porcentagem de germinação de embriões de pau-rosa 37

Tabela 08 - Efeito da concentração de hipoclorito de sódio e do período de> exposição na desinfestação de folhas de pau-rosa 40

Tabela 09 - Efeito da concentração de Agrimicina na desinfestação de rebrota depau-rosa 41

Tabela 10 - Efeito da concentração de Agrimicina e Ampicilina na desinfestação derebrota de pau-rosa 42

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LISTA DE ANEXOS

# ANEXO 01 - Resumo dos experimentos realizados em explantes de pau-rosa...54

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RESUMO

<í^ Este trabalho teve como objetivo o estabelecimento in vitro de explantes de^ pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke) por meio da obtenção de explantes livres de^ contaminações e de oxidação fenólica.^ Foram utilizados explantes de ápices caulinares, segmentos nodais, folhas,

gemas da rebrota de mudas e em embriões de sementes em diversos estágios de

maturação. Os explantes foram tratados com o antibiótico Ampicilina, Agrimicina,etanol (70%) e hipoclorito de sódio com concentrações e tempo de exposição

. variando em função do tratamento. Para o controle da oxidação foram utilizados0 imersão em ácido ascórbico (250 mg/l) e PVP (Polivinilpirrolidona) no meio de

cultura. Os explantes foram inoculados em meio de Murashige & Skoog (MS) com

adição de hormônios de crescimento ANA (ácido naftalenoacético) e BAP(6-benzilaminopurina) a diversas concentrações.

O delineamento estatístico empregado foi o inteiramente ao acaso com

tratamentos e repetições em função do tipo de explante.

Foi observado 100% de sobrevivência e 53% de germinação de embriões

tratados com hipoclorito de sódio (50%) por 10 minutos e inoculados em meio MScontendo 20 mg/l de água de côco após 45 dias. Explantes de rebrota tambémobtiveram resultados satisfatórios (51% de sobrevivência) com a utilização de

^ solução com Sulfato de Estreptomicina (Agrimicina) na concentração de 300 mg/l(1h) ou quando submetidas ao pré-tratamento com o emprego de bomba a vácuo(180 mmHg) contendo antibiótico Ampicilina (500 mg/l), alcançando 25% desobrevivência.

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^ SUMMARY

The purpose of this work was the establishment in vitro of Aniba rosaeodora

^ Ducke explants, without fungical and endogenous contaminations, and phenolicoxidation.

^ Explants from caulinar apixes, nodal segments, leaves, buds and embryos

^ from seeds in many stages of maturation were used in this work. The explants. were desinfested with Ampicilin antibiotic, Streptomicine Sulphate (Agrimicina),

etanol (70%), sodium hipoclorite in many concentrations and time of exposition in

é acording to the type of explant.

For the phenolic oxidation control, the immersion on ascorbic acid and PVP

^ (Polyvinilpirrolidone) in culture médium were used. The explants were inoculated in^ MS médium suppiemented with ANA (Naphtalenacetic acid) and BAP (6-

Benzylaminopurine) in various concentrations.

The statistical design was the completely randomized and the treatments

^ and repetitions varied in according to the type of explant adopted.

^ After 45 days, 100% of survival and 53% of germination in embryos were^ observed, which have been desinfested by sodium hipoclorite (50%) for 10 minutest) and inoculated in MS médium, suppiemented with 20 ml of coconut milk.

Satisfactory resuits (25% of survival) were observed with explants from buds,

^ which have been treated by the immersion in 300 mg/l of Streptomicine Sulphate^ (Agrimicina) or when submitted on vacuum pre-treatment with Ampicilin antibiotic^ (500 mg/l).

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^ 1. INTRODUÇÃO

O pau-rosa {Aniba rosaeodora Ducke) é uma espécie de notável valor

^ econômico, no que se refere a produção de óleo, do qual é extraído o linalol,^ essência largamente empregada como fixador de perfumes pelas indústrias de

^ perfumadas de âmbito nacional e internacional.

^ O processo tradicional de produção do óleo consiste no abate de árvoresadultas na floresta, que são cortadas em pequenos cavacos e triturados para a

^ destilação em usinas móveis próximas à área explorada.^ A adoção do corte raso de todos os indivíduos adultos em idade de

^ reprodução acabou provocando a erosão genética e impossibilitando a

regeneração natural da espécie, causando desta forma, uma considerável redução

nas populações naturais, que a colocam em sério risco de extinção.

A propapagação desta espécie é viável por sementes (Araújo, 1967),

estacas (Sampaio, 1988) e por mudas de regeneração natural (Alencar & Araújo,

1980; Sampaio et aL, 2000), todos eles apresentam fatores limitantes, tais como: a

produção irregular de sementes, a dificuldade de acesso ás populações

remanescentes, a predação dos frutos por pássaros e a baixa porcentagem de

^ germinação das sementes (Rosa et ai., 1993).

O desenvolvimento de técnicas de reprodução, a exemplo da cultura de

tecidos, pode contribuir para a reposição e aumento da produtividade das

populações naturais através da multiplicação de genótipos superiores.

A cultura de tecidos abrange diversas técnicas as quais têm em comum o

I' uso de meio nutritivo e de serem conduzidas in vitro. Assim, diversas partes da

r planta como gemas, meristemas apicais, embriões, segmentos de caule,

' extremidade de raízes e outros, podem ser usados como tecidos iniciais a cada

uma, podendo ser cultivada por diferentes métodos dependendo do objetivo da

pesquisa, caracterizando como sendo, o cultivo de órgãos, tecidos ou células

vegetais em meio nutritivo apropriado em ambiente asséptico (Grattapaglia &

Machado, 1998).

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Em diversas espécies florestais tem-se obtido resultados que indicam a

possibilidade de obtenção num curto espaço de tempo, de grandes quantidadesde novas plantas a partir de um único explante em subcultivos periódicos.

A propagação in vitro do pau-rosa possibilitará a produção de uma maiorquantidade de mudas, contribuindo para a reposição desta espécie através deplantios in situ e ex-situ.

Espera-se obter com este trabalho, resultados satisfatórios para o processo

de desinfestação dos explantes de pau-rosa destinados a condução de futurostrabalhos voltados a propagação massal da espécie pela técnica da cultura invitro.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Estabelecer metodologia para a assepsia dos explantes de pau-rosa {Aniba

rosaeodora Ducke) que possa viabilizar a cultura in vitro desta espécie.

2.2. Objetivos Específicos

• Obter explantes livres de contaminações e controlar os processos de oxidaçãodo material propagativo.

• Testar as técnicas de assepsia em diversos tipos de explantes, como porçõesapicais e nodais, folhas, embriões e material de rebrota.

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^ 3. REVISÃO DE LITERATURAê

^ 3.1. Descrição da Espécie

^ Nome Científico: Aniba rosaeodora Ducke

Nomes comuns: Pau-rosa, Pau-rosa-itaúba, Bois de rose, Cara-cara, Rosenhout,

Rosewood

Família: Lauraceae

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A espécie caracteriza-se por ser uma árvore de grande porte, chegando a

atingir 30 m de altura por 0,8 m de diâmetro. Todas as suas partes aromáticas

(Kubitzki, 1982). A árvore tem copa estreita e ovalada, com tronco geralmente

retilíneo e cilíndrico, além de casca delgada e descamante em placas grandes

(Lorenzi, 1992).

As folhas são distribuídas igualmente ao longo dos ramos, alternas, semi-

coriáceas, margens revolutas, elípticas, obovaladas, base obtusa ou acuminada,

ápice obtuso e curtamente acuminado, glabras na parte superior

í() microscopicamente papilosa e levemente pubescente, pecíolos glabros,

O canaliculados, de 0,8 a 1,7 cm de comprimento. Inflorescência em panículas

subterminais nas axilas de brácteas caducas ou folhas persistentes, densamente

tomentosas de 4 a 17 cm de comprimento (Kubitzki, 1982). As flores são

ferrugíneas pequenas, com 1 mm de comprimento, apresentando pedicelo pouco

evidente, filetes curtos, anteras com lojas muito miúdas (Loureiro et al., 1979;

Lorenzi, 1992). O fruto é uma baga elíptica, glabra, inserido em uma cúpula

espessa em forma de funil, de polpa carnosa e de cor violácea bem escura,

medindo entre 2,5 a 3,5 cm de comprimento (Loureiro et al., 1979; Kubitzki, 1982;

Lorenzi, 1992).

A espécie é do tipo hermafrodita com dicogamia sincronizada (Kubitzki &

Kurz, 1984). A floração, frutificação e mudança foliar da espécie apresenta

características irregulares, com dependência dos locais de ocorrência. Contudo,

Magalhães & Alencar (1979) verificaram a ocorrência do florescimento e da

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^ frutificação sempre coincidindo com a época chuvosa, apresentando uma relação^ direta com a mudança foliar. A floração ocorre entre setembro e fevereiro e a^ frutificação, entre novembro e março, na região de Manaus.

^ O fator limitante na produção de sementes está ligada à coleta dos frutos,

principalmente devido ao assincronismo na produção dos frutos (Araújo, 1967).

Além disso, o comprometimento pela intensa ocorrência da predação das

sementes é provocada pelo ataque de pássaros como araras, papagaios, tucanos

e periquitos (Araújo, 1967; Magalhães & Alencar, 1979; Ohashi et al., 1995) e

ainda, por causa da perda no potencial de germinação acarretada pela curta

longevidade das sementes (Araújo, 1967).

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espécie apresenta registros de ocorrência em Suriname, Guiana

Francesa, Colômbia, Peru, Equador, Venezuela e Brasil (Kubitzki, 1982; Lorenzi,

1992).j

(!) No Brasil, sua ocorrência é registrada no Amapá, fronteira com a Guiana

Francesa, porém seu habitat ótimo situa-se no médio e alto rio Amazonas, com

maior concentração desde o Rio Curuá-Una até a fronteira com o Peru, na parte

meridional, e do Rio Trombetas até a fronteira da Colômbia (Ohashi et al., 1995).

O pau-rosa ocorre em florestas tropicais úmidas, planta perenifólia, xerófita,

clímax, característica exclusiva da mata pluvial Amazônica de terra firme, onde

sua freqüência é ocasional com dispersão descontínua e um tanto irregular.

Ocorre preferencialmente no interior da mata primária densa de terrenos altos e de

meia encosta, onde o solo é profundo e bem drenado e é essencialmente de terra

firme e alta, com preferência às cabeceiras de igarapés (Lorenzi, 1992).

Segundo Loureiro et al. (1979), o pau-rosa atinge até 30 metros de altura e

distribuição irregular no terreno, ocorre em grupos de cinco a oito árvores,

distanciados de 50 a 100 metros entre árvores e de 300 a 400 entre grupos

(Alencar & Fernandes, 1978).

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3.3. Potencial econômico da espécie

^ (Sua madeira é pesada, de fácil trabalhabilidade, sendo empregada na

^ marcenaria, carpintaria e pelos índios na confecção de canoas (Loureiro, 1976).^ Além desses usos, a madeira, quando destilada, produz um óleo essencial, do^ qual é extraído o linalol, empregado nas indústrias de perfumaria como fixadorQ (Gottlieb,1957; Loureiro et al., 1979, Rosa et al., 1993), podendo ser obtido de

^ diversas partes da planta (Morais ef a/., 1972; Loureiro, 1979). O óleo essencial de

^ pau-rosa apresenta ainda outras substâncias de uso medicinal, com potencial para

fins farmacêuticos (Gottlieb & Mors, 1958)JA essência apresenta odor agradável,

de fácil oxidação, com densidade variando entre 0,863 a 0,867 e destilação entre

â 194®C e 199®C (Le Cointe, 1931).

(O conteúdo de óleo produzido, a partir da madeira e das folhas de pau-

rosa, varia de 0,9 a 2,6%, com um conteúdo de linalol entre 73-78% (Morais et al.,

1972; Ohashi et aí., 1997^ O óleo essencial de pau-rosa apresenta ainda,(f) potencial para outros fins por conter substâncias como a anibina, que pode ser

(!) utilizada na fabricação de ácido nicotínico e seus derivados podem servir de

estimulantes para o sistema nervoso central e para a cura da língua preta de cães;

a madeira pode ser empregada na marcenaria e na carpintaria (Loureiro ,1976).

3.4. Propagação vegetativa

A propagação por meio de sementes é dificultada por apresentar problemas

de baixa produção e alta predação no que se refere a coleta de sementes, visto

que a espécie além de sofrer a predação dos frutos por pássaros, ainda conta com

a dificuldade de acesso às áreas de ocorrência, que por terem sido intensamente

exploradas, encontram-se em sua maioria, isoladas ou em pequenos grupos

(Ohashi et ai., 1995).

A propagação vegetativa do pau-rosa tem sido viável pela utilização do

método da estaquia como tratamento silvicultural mais indicado conforme Vieira

(1972) e Sampaio (1988), sendo que este último, recomenda a utilização de

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estacas de material juvenil retiradas da rebrota de árvore, com resultados

satisfatórios para a sobrevivência e para o enraizamento.

3.5. Cultura de Tecidos VegetaisO

^ A cultura de tecidos consiste num conjunto de técnicas nas quais um

^ explante é isolado e cultivado sob condições de plena assepsia, em um meionutritivo artificial (Cestari, 1975; Hartman & Kester, 1990; FAO, 1993; Pasqual et

aí., 1998). Cestari (1975) considera como sendo uma forma de conservação de

Ô tecidos vivos em laboratório para os mais diversos fins, por um tempo limitado ou

^ indefinido, enquanto que Dir & Heuser (1987) procuram utilizar a cultura de tecidoscomo uma alternativa para a propagação vegetativa convencional.

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3.5.1. Usos da Cultura de Tecidos Vegetais

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A cultura de tecidos é considerada como um instrumento valioso na

conservação de germoplasma, obtenção de plantas livres de vírus e patógenos,

elevada taxa de multiplicação, rápida propagação clonal, melhoramento deplantas, além de ser aplicável em espécies cujas sementes sejam dos tiposrecalcitrantes e ortodoxas e com dificuldades de propagação (Vaz, 1986; Dir &

Heuser, 1987; FAO, 1993; Serra, 1999). Pasqual et ai (1998), detalhando estes

usos citam a preservação e intercâmbio de germoplasma, a micropropagação, ahibridação interespecífica e intergenérica, a obtenção de plantas haplóides, avariação somaclonal e indução de mutações, a floração e fertilização in vitro, astécnicas bioquímicas e moleculares aplicadas à cultura de tecidos vegetais, e a

produção de metabólitos secundários.

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(m3.5.2. Fases da cultura in vitro

O conceito de fases de desenvolvimento no processo de propagação in

vitro foi definido por Murashige (1974) como sendo: (1) de estabelecimento, (2)multiplicação e (3) aclimatização, embora Grattapaglia & Machado (1998) e

^ Pasqual et ai. (1998) adotem ainda, as fases estabelecidas por Debergh & Maene(1981) como sendo, (0) de condicionamento da planta matriz, (1) estabelecimentodo cultivo in vitro, (2) proliferação dos explantes, (3a) alongamento das brotações,

(3b) enraizamento das brotações e (4) aclimatização (Debergh & Maene, 19813 apud Pasqual et ai., 1998).

Na fase de estabelecimento realiza-se a seleção dos explantes, a

desinfestação e a cultura em meio nutritivo sob condições assépticas. Nestaseleção deve-se considerar o órgão que sirva como tipo de tecido, estadofisiológico e ontogenético do órgão, época de obtenção do explante, o tamanho ea qualidade da planta em abastecer o explante (Grattapaglia & Machado, 1998).Esta fase abrange um dos processos mais difíceis do estabelecimento que é adesinfestação. A quantidade de explantes sobreviventes nesta fase é quedeterminará o sucesso do experimento.

A fase de multiplicação visa a obtenção de um maior número de plantaspossível em um curto espaço de tempo (Pasqual et aí., 1998). Este estágiobaseia-se na rápida multiplicação dos órgãos (brotos primários) ou outrasestruturas que eventualmente formem uma planta completa sem que ocorra a

perda da variabilidade genética, visando o enraizamento ou a manutenção doestoque de material vegetal in vitro (Grattapaglia & Machado, 1998). O materialpode ser multiplicado por proliferação das gemas axilares, organogênese direta ouindireta ou ainda por embriogênese somática, devendo-se atentar para acomposição do meio de cultura, que deve conter concentração de sacarose emtorno de 2 a 4% e os hormônios de crescimento como o BAP (6-benzilaminopurina), uma citocinina utilizada em concentrações de 0,1 a 5,0 mg/lpara promover a quebra da dominância apical, induzir a proliferação de gemasaxilares. As auxinas, como o ANA (ácido naftalenoacético) são utilizadas emconcentrações inferiores a 0,5 mg/l para favorecer a multiplicação e o

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crescimento das partes aéreas (Pasqual et a/., 1998). Os mesmos autoresressaltam que além do meio de cultura, a luminosidade tem papel fundamentalnos processos morfogenéticos, com exceção da capacidade fotossintética que é

0 reduzida nas condições in vitro, devendo estar em torno de 2000 a 3000 lux, num^ fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas no escuro, com temperatura em torno de

20 a 27° C.

As gemas induzidas na fase de multiplicação são em geral, de pequeno0 tamanho e devem passar pela fase de alongamento, realizada comumente pela^ adição de ácido giberélico, pela transferência de meio com baixa concentração de

citocinina ou a manutenção no escuro ou sob pouca intensidade luminosa parapromover o alongamento dos caules (Pasqual et al., 1998).

O enraizamento é necessário para a formação de uma planta completa e0 varia conforme a espécie e o tipo de explante a ser utilizado, não necessitando de

adição de reguladores de crescimento para induzir o enraizamento das partesaéreas em muitas espécies, sendo recomendado introduzir algum tipo de auxinapor um curto período de tempo para inibir a formação de calos, como o AIA (ácidoindoleacético) nas concentrações de 1,0 a 10 mg/l, ANA (ácido naftalenoacético)nas concentrações de 0,05 a 1,0 mg/l ou o AIB (ácido indoibutírico) nasconcentrações de 0,5 a 3,0 mg/l. Em geral, a fase de enraizamento ocorre após afase de multiplicação e alongamento das partes aéreas, quando se apresentamas características de diferenciação de tecidos, tamanho e presença de folhas(Pasqual ef a/., 1998).

A aclimatização consiste numa fase intermediária de adaptação das plantas' mantidas em condições in vitro, para um ambiente com as condições climáticas

naturais do campo, que ocorre inicialmente em casas de vegetação, com sistemade nebulização intermitente e sombreamento, procurando evitar o estresse e aperda do material causado pelo impacto entre os ambientes (Silva et ai., 1995).

3.5.3. Fatores que afetam a cultura in vitro

Os fatores mais importantes na regeneração de plantas por cultura detecidos são o genòtipo, as condições ambientais da cultura, referindo-se ao

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suprimento de nutrientes, os reguladores de crescimento e as condições físicas,bem como o estágio de desenvolvimento da planta doadora (Pierik, 1997).

^ A retirada de explantes deve advir, preferencialmente, de brotações novas,coletados de regiões meristemáticas juvenis, de ápices e gemas laterais, deembriões ou tecidos da semente, embora teoricamente, qualquer tecido possa ser

^ utilizado como explante, por causa da totipotenciaüdade das células vegetais(Pierik, 1997; Grattapaglia & Machado, 1998). Segundo estes autores, explantes

3 obtidos a partir de tecidos jovens e com maior atividade metabólica são mais3 adequados para estimular a formação de calos, conferindo a estes maior^ facilidade para emitirem radículas e brotações novas.

Cestari (1975) ressalta que os melhores explantes são os provenientes departes de crescimento ativo, tais como meristemas apicais de caule e de raiz,meristemas de folhas, gema e floema, podendo ainda considerar embriões, pólen,

^ endosperma, esporos e primórdios de sementes.

^ O tamanho do explante exerce influência na obtenção da assepsia e nadeterminação das possibilidades de sobrevivência e capacidade de crescimentodo mesmo (Grattapaglia & Machado. 1998). Quanto menor o explante excisado

O em condições assépticas, menores são as chances de se introduzir fontes decontaminação nos meios de cultura, embora em muitos casos, dificulte ou retarde

^ o estabelecimento do material introduzido (Hartman et ai, 1990, Pierik, 1997,O^ Grattapaglia & Machado. 1998).

Os resultados obtidos in vitro podem ser influenciados pela maneira em que

^ as plantas matrizes são tratadas e pelo ambiente em que elas cresceram, onde omelhor explante é o procedente de plantas sadias e vigorosas que se encontramem estado ativo de crescimento, sem apresentar indícios de estresse (Henao,

rv 1991). Plantas matrizes mantidas no campo estão mais sujeitas à infestação porn propágulos de fungos, bactérias e microorganismos. Para diminuir a infestação

nos explantes, procura-se cultivar as matrizes em casas de vegetação,preferencialmente, a partir de mudas selecionadas ou explantes de plântulas,

^ adotando algum procedimento fitossanitário, visando a redução das infestações

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^ por patógenos e o estresse da planta, bem como a perda do material (Roca &^ Mrogiski, 1991; Pasqual etal., 1998).^ Os explantes retirados no início ou durante o crescimento ativo da planta

matriz encontram maior facilidade de serem estabelecidos em uma cultura in vitro,

sendo que a influência da época de coleta dos explantes é de extrema importância

na condução dos experimentos, sendo ressaltado por Pasqual et ai (1998) que a

^ melhor época de coleta é quando as plantas matrizes produzem brotações novas

^ e vigorosas, embora existam algumas exceções, podendo ainda variar de acordo

^ com a espécie e com o tipo de explante a ser utilizado. Bonga (1987) e1"^

Grattapaglia & Machado (1998) também afirmam que a época de coleta dos

- explantes influencia bastante no estabelecimento da cultura in vitro de material

adulto, ocasionada principalmente pelos ciclos climáticos e pelas flutuações

ocorridas em outros fatores do meio, que acabam afetando as condições

fisiológicas dos indivíduos no campo. A idade relativa dos tecidos e órgãos sofre

alteração à medida em que avançam as estações de crescimento e o nível de

contaminação encontrado em explantes, especialmente aqueles coletados de

plantas que crescem no campo, ocorrendo variações também conforme a estação

do ano (Pasqual etal., 1998).

O efeito genotípico é um fator que interfere no crescimento de tecidos de

órgãos cultivados e na morfogênese in vitro e tem causa originária das interações

entre o genótipo da planta e o ambiente de cultura, resultando em exigências

metodológicas diferenciadas de meios e ambientes de cultura entre gêneros ou

espécies de uma planta para outra (Henao, 1991).

A temperatura ideal para as condições in vitro variam conforme a planta, e

está entre 20 a 28°C, não devendo ser superior a 30®C para não provocar o

aumento da evaporação de água do meio, que pode resultar em toxidez (Henao,

1991; Grattapaglia & Machado, 1998; Pasqual et ai., 1998). A simulação das

variações naturais de temperatura da espécie pode ser empregado ainda como

forma de determinação de condições ótimas de crescimento in vitro (Henao,

1991). Aliada à temperatura deve estar também a umidade, que em torno de 70%,

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10

^ procura auxiliar no crescimento da cultura e no controle asséptico evitando a^ proliferação de possíveis contaminações (Pasqual et a/., 1998).^ Na cultura de tecidos, o fotoperíodo, o comprimento de onda e a

intensidade luminosa influenciam o crescimento e a morfogênese in vitro,

^ variando as necessidades luminosas de acordo com a espécie, sendo de grande

^ importância na formação de plântulas (Henao, 1991; Pasqual et al., 1998).

A prática do subcultivo visa o rejuvenescimento dos tecidos in vitro, mas

^ podem levar a perda gradual do potencial morfogenético e da variabilidade

^ genética que ocorrem em algumas espécies dependendo do explante a ser

^ utilizado (Henao, 1991).

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3.5.4. Desinfestação

'<1 (JD processo de desinfestação é uma das etapas mais importantes da cultura

de tecidos, visto que nesta fase ocorre a assepsia dos explantes. Uma das

O

maiores dificuldades em se propagar uma espécie é a obtenção de explantes

livres de contaminação, causando danos mínimos ao explante e sem a ocorrência

de necrose nos tecidos (Roca & Mroginski, 1991; Grattapaglia & Machado, 1998).

A condução de muitos experimentos tem sido prejudicada pela alta incidência de

contaminações, que acaba reduzindo o número de explantes viáveis para o

estabelecimento das culturas (Lopes, 1996; Pasqual et ai., 1998).j

O desenvolvimento de culturas assépticas está relacionado com o explante a

ser utilizado, com as condições locais de trabalho e os meios de cultura (Silva et

ai., 1988; Roca & Mroginski, 1991).

I^As condições fitossanitárias da planta matriz devem ser observadas naescolha do material a ser coletado, bem como a adoção de medidas de controle

de insetos e microorganismos devem ser realizados com a utilização de

fungicidas, inseticidas e bactericidas no campo, e de preferência, em casas de

vegetação, existindo ainda a possibilidade de utilizar agentes sistêmicos como o

benomyl (Benlate) e oxitetraciclina (Terramicina), com sulfato de estreptomicina

11

3

(Agrimicina), alternados com fungicidas não-sistêmicos com princípios ativos

diferentes no pré-tratamento de algumas espécies (Pasqual et aL, 1998]^

^ (iQuanto ao local de trabalho deve-se atentar para a assepsia e a esterilização

do ambiente e dos materiais a serem utilizados no laboratório, bem como os

cuidados de higiene e manuseio do laboratorista (Pierik, 1997).j

jO material coletado primeiramente passa por uma lavagem em água corrente

para a retirada superficial de agentes contaminantes. Em seguida, inicia-se o

<3 processo de desinfestação realizado em câmara de fluxo laminar, mantido sob

^ condições assépticas. O sucesso da desinfestação está diretamente relacionado

^ ao pré-tratamento e ao tratamento a ser adotado em cada tipo de cultura(Grattapaglia & Machado, 1998).J

jp etanol a 70 e 80% acrescido de algumas gotas de espalhante adesivo,

3 como por exemplo, o Tween 20, apresenta ação germicida e é empregado, por

alguns minutos, para facilitar o contato dos explantes com outros agentes

desinfestantes. O uso de vácuo à solução de desinfestação, aumenta a dilatação

dos poros do explante, auxiliando na penetração da solução (Pasqual et a/., 1998)j

Para a realização da desinfestação dos explantes costuma-se utilizar

substâncias com ação germicida, sendo os mais comumente adotados o etanol,

hipoclorito de sódio ou de cálcio, água oxigenada, ácido clorídrico e o cloreto de

benzaicônio e em menor escala, por ser altamente tóxico, o cloreto de mercúrio

(Roca & Mroginski, 1991; Pierik, 1997; Grattapaglia & Machado, 1998; Pasqual et

a/, 1998).

[As concentrações e os agentes desinfestantes variam conforme a«-V

consistência do tecido a ser desinfestado de acordo com a espécie (Pierik, 1997^

como nos casos do hipoclorito de sódio (NaOCI), na concentração de 0,5 a 2%,

-N que em exposição entre cinco a trinta minutos apresenta facilidade de remoção e

alta eficiência na desinfestação, enquanto que o cloreto de mercúrio (HgCl2) a 1%,

exposta entre dois e 30 minutos apresenta eficiência satisfatória e pouca facilidade

de remoção (Pasqual ef a/., 1998).

(^pós a desinfestação, prossegue-se com a lavagem em água destilada eautoclavada, por três vezes, para a remoção do acúmulo de resíduos de

12

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substâncias empregadas na assepsia, que pode ser prejudicial aos tecidos e

^ comprometer o desenvolvimento do explante (Pasqual et al., 1998).

# ̂xplantes provenientes de gemas apicais e axilares de caule em plantas^ lenhosas apresentam uma variedade de patógenos endógenos, incluindo

bactérias e fungos, que persistem mesmo após os procedimentos tradicionais de

desinfestação, necessitando portanto, da avaliação do grau e da natureza de

contaminantes residuais que escapam da desinfestação tradicional para que

> possam ser realizados tratamentos com fungicidas ou antibióticos (Grattapaglia &

Machado, 1998)j

Pré-tratamentos com fungicidas são realizados como procedimento padrão

^ na desinfestação do material de Eucalyptus sp. em casa de vegetação para^ minimizar a contaminação em segmentos nodais (Wiecheteck, 1990).

Carvalho (1988) obteve 70% de explantes livres de contaminação fúngica com a

utilização de fungicida Benomyl, na concentração de 50 mg/l e utilizando 0,2% de

hipoclorito de sódio por dez minutos com o Eucalyptus grandils, enquanto que

Wiecheteck (1990) obteve 0% de contaminação com 1% de hipoclorito de sódio

por dez minutos para segmentos nodais de Eucalyptus viminalis.

3.5.5. Contaminação e Oxidaçâo

rp ^ contaminação tem sido um problema freqüente na condução deexperimentos In vitro, sendo citado por Pierik (1997) como principais fontes de

contaminação; a planta, o meio de cultura, o ambiente e o laboratorista, onde

inicialmente deve-se levar em consideração a questão da planta matriz, quanto

aos cuidados em casa de vegetação que pos sibilite a máxima eliminação das

contaminações provenientes do campoj;[^O material proveniente do campo abriga uma variedade de patógenos que

são inofensivos às plantas, mas de rápida multiplicação em meio de cultura,

modificando a composição do meio e dificultando o desenvolvimento dos

explantes (Carvalho, 1988).

O meio de cultura é um ambiente favorável ao desenvolvimento de

microorganismos, onde altos níveis de contaminação e a localização sistêmica de

13

^ microorganismos podem inviabilizar o estabelecimento das culturas (Pasqual et^ a/., 1998), ocasionada pela competição entre os microorganismos e o explante

pelo mesmo meio de cultura ou ainda, causar a modificação do meio (Roca &# Mroginski, 1991).

® Os principais contaminantes são os fungos e bactérias, onde a altacontaminação pelos primeiros, tem sido fator limitante na condução de muitos

experimentos, tornando-se mais propícia em locais com a umidade elevada,devendo-se atentar para a manutenção da umidade relativa do ar mais baixa

possível (Pierik, 1997).

^ Os fungos multiplicam-se rapidamente e são detectados facilmente num meiode cultura a partir do terceiro dia após a inoculação do explante (Pasqual et a/.,1998).

^ A utilização de fungicidas durante a desinfestação, ou as suas inclusões em

^ meio de cultura podem minimizar ou até mesmo eliminar a contaminação emalgumas espécies (Carvalho, 1988; Grattapaglia & Machado, 1998).

A presença de bactérias, muitas vezes de caráter endógena, acabam inibindo

o desenvolvimento de plantas livres de contaminações (Silva et ai, 1988; Pierik,1990). As bactérias apresentam a característica de não se multiplicarem ou de se

multiplicarem lentamente em meio de cultura, levando uma semana ou até meses,

para o seu aparecimento. As contaminações são detectadas em meio de culturaapós a incubação por uma semana à temperatura em torno de 26°C, sendovisualizadas ao se inclinar o frasco (Pasqual et ai, 1998), sob a forma de colônias

ou pela turbidez do meio (Lopes, 1996).

J A tentativa de se empregar antibióticos aos meios de cultura tem sidoadotado em alguns trabalhos (Pollock et ai, 1983; Albarrán et ai, 1997), levando

sempre em consideração a questão da intoxicação dos explantes e do própriomeio de cultura. Os antibióticos procuram manter o desenvolvimento do explante,reduzindo a multiplicação das bactérias dentro dos tecidos, de modo que sejapossível isolar explantes livres de contaminação (Grattapaglia & Machado, 1998).

jOutra dificuldade encontrada durante o estabelecimento é a altaconcentração de oxidação fenólica, característica presente na maioria das

14

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^ espécies lenhosas. As substâncias fenólicas são liberadas pelas células^ danificadas com o corte, provocando o escurecimento do meio e do tecido isolado

tornando-se tóxica ao resto do explante e provocando a paralização do

® crescimento e morte do tecido (Carvalho, 1988; Vicentini, 1995)^

^s formas de se atenuar o problema da oxidação consistem na lavagemem água corrente, dos explantes coletados antes da desinfestação, bem como a

utilização de substâncias antioxidantes como o ácido ascòrbico, ácido cítrico, PVP

(Polivinilpirrolidona) e o carvão ativado em forma de imersão ou em meio de

^ cultura (Vicentini, 1995; Pasqual et al., 1998), visto que a enzima catalizadora dasíntese de fenòis (fenilalanina amonialiase) é ativada pela luz, recomenda-se a

^ . .. ~manutenção das culturas no escuro por uma semana para inibir a produção de

(3 fenòis pelo explante no meio de cultura (Carvalho, 1988).J

Em trabalhos como o de Eucalyptus viminalis, a redução da oxidação foi

obtida com PVP (Polivinilpirrolidona) a 10 mg/l (Carvalho, 1988), enquanto

Dombroski (1997) comenta que a utilização de 100 mg/l de PVP no meio foi eficazno controle da oxidação de Caryocar brasiliense quando mantidos em condições

^ de baixa luminosidade.

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3.5.6. Meios nutritivos e reguiadores de crescimento

Os meios nutritivos são constituídos de substâncias indispensáveis ao

crescimento dos tecidos baseados nas exigências das plantas quanto aos

nutrientes minerais, sacarose e água, que controlam o padrão de desenvolvimento

da cultura de células, tecidos e órgãos de plantas (Grattapaglia & Machado, 1998).

As soluções presentes em um meio de cultura são a base de sais minerais,

vitaminas, reguladores de crescimento, açúcares e um agente solidificante

(Pasqual et ai., 1998).

As formulações nutritivas presentes na maioria dos meios de cultura

utilizados derivam da formulação do meio de White (1943) que continha vitaminas,

sacarose e meios nutritivos e alguns hormônios vegetais. Com o passar do tempo

foram surgindo novos meios de cultura que variavam na concentração dos

15

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^ elementos e tinham finalidades específicas para cada tipo de cultura a ser(i^ empregada.^ O meio de Murashige & Skoog, denominado meio "MS" é considerado um

® meio básico para a cultura de tecidos, sendo feitas algumas modificações e

® diluições para adaptações nos diferentes tipos de cultura. Este meio apresentaalta concentração de amônia e nitrato, o que lhe confere ganhos significativos no

crescimento de tecidos e células nas mais diversas espécies vegetais, e foi

d desenvolvido a partir de testes de suplementação do meio de White com extrato

de folhas de fumo (Murashige & Skoog, 1962).

^ Os meios de cultura são compostos basicamente de água, carboidratos,^ nutrientes minerais, vitaminas, agentes geleificantes ou solidificantes, reguladores

de crescimento e outros compostos (Roca & Mroginski, 1991; Pasqual et aL, 1991;

S Caldas et al., 1998).

^ A água encontra-se no meio nutritivo em maior quantidade, devendo-se^ observar a qualidade da água a ser utilizada, em virtude do mesmo, apresentar^ um potencial elevado de impurezas que afetam no crescimento dos explantes

(Pasqual et al., 1998).

Os nutrientes minerais são absorvidos pelo meio de cultura sob a forma de

sais e são essenciais no crescimento da planta in vitro (Roca & Mroginski, 1991;

Pasqual et ai., 1998) e são constituídos de fósforo, cálcio, magnésio e enxofre

(Roca & Mroginski, 1991). O nitrogênio difere dos demais macronutrientes por se

apresentar tanto na forma de cátion (amônio) como na de ânion (nitrito e nitrato),

auxiliando no crescimento e desenvolvimento da cultura in vitro (Caldas et aí.,

1998).

O crescimento e desenvolvimento in vitro das culturas está diretamente

relacionada aos carboidratos. Estes, são responsáveis pelo fornecimento de

energia, devido ao heterotrofismo proporcionado pela deficiência da capacidade

fotossintética das culturas mantidas in vitro (Roca & Mroginski, 1991; Pierik, 1997;

Caldas et al., 1998). A sacarose é uma das fontes de carbono mais utilizadas

devido a sua alta solubilidade, rápida metabolização e por ser de fácil transporte e

armazenamento pela maioria das células vegetais. Sua concentração da sacarose

16

7

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^ deve estar associada acordo com o tipo e idade do material a ser utilizado e^ dependendo da concentração pode afetar na assimilação de nutrientes e no efeito^ dos reguladores de crescimento (Pasqual et al., 1998).

^ As vitaminas servem para suprir as deficiências das células e tecidos

vegetais quanto ao crescimento e sobrevivência, sendo mais comuns: a tiamina,

^ ácido nicotínico, piridoxina, a glicina e o mio-inositol.

Os agentes solidificantes são adicionados ao meio para dar sustentação ao

^ explante (Henao, 1991). De acordo com o meio no qual o explante precisa ser

^ mantido, os agentes geleificantes são adicionados aos meios de cultura quandosão do tipo semi-sólido, coferindo ao meio um aspecto gelatinoso (Pasqual et al.,

1998), que são solidificados mediante a utilização de ágar, constituído de

polissacarídeo extraído de algas marinhas, existindo ainda, o amido e o "phytagel",

^ este último, constituído de polissacarídeos de ácido glucurônico, ramnose e

glicose, com grupos 0-acetil (Caldas et aí., 1998)

Os reguladores de crescimento, quando adicionados ao meio de cultura,

dependendo da composição e da concentração, são considerados fatores

determinantes no crescimento e no padrão de desenvolvimento da maioria das

^ espécies, podendo muitas vezes, mostrar dependência total da presença de

reguladores exógenos no meio, enquanto outros sintetizam as quantidades que

necessitam (Pierik, 1997).

Os principais processos metabólicos são regulados principalmente pelas

^ auxinas, giberelinas e citocininas, que auxiliam no desenvolvimento, crescimento e

diferenciação celular.

^ ̂As auxinas e as citocininas são as classes de reguladores de crescimento

mais empregadas na cultura de tecidos, sendo responsáveis pela regulação do

crescimento e da morfogênese dos tecidos e órgãos. O crescimento e a

morfogênese in vitro são regulados pela interação e balanço entre os reguladores

de crescimento, mas dependem ainda das condições ambientais, do tipo de

explante, do genótipo da planta e do estágio em que se encontra a cultura,

enquanto que as auxinas e giberelinas podem regular o crescimento e

alongamento celulares (Pasqual et ai., 1998)J

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Zaer & Mapes (1982) comentam que todos os sistemas de cultura de tecidos

^ e órgãos de espécies florestais requerem o uso de reguladores de crescimento, a^ fim de propiciarem uma maior taxa de sobrevivência e maior crescimento.

#

^ 3.5.7. Cultura de Embriões

A cultura de embriões vem sendo adotada como uma prática constante na

cultura de tecidos que permite estudar as necessidades nutricionais e fisiológicas

^ dos embriões; obter embriões híbridos imaturos de cruzamentos incompatíveis;^ onde ocorrem barreiras sexuais na formação de sementes; na multiplicação

rápida do material selecionado; superar a dormência em certos tipos de sementes

("1 em virtude da imaturidade do embrião ou da presença de substâncias inibidoras

no endosperma e ainda, como fonte de explantes com tecido de elevada

^ totipotência (Henao, 1991; Pierik, 1997; Ribeiro etal., 1997; Hu & Ferreira, 1998).^ Por estarem alojados em ambiente estéril dentro da semente, os embriões

são considerados como fontes de explante que apresentam baixos índices de

contaminação (Pierik, 1997; Hu & Ferreira, 1998).

O embrião ao longo do seu desenvolvimento passa pelas fases globular,

cordiforme, torpedo e adulto (Pasqual & Pinto, 1988; Pierik, 1997). Dependendo

do seu crescimento e desenvolvimento são requeridas exigências nutricionais

diferenciadas capazes de sustentar o crescimento in vitro dos embriões (Pasqual

& Pinto, 1988; Ribeiro et al., 1997), onde quanto mais jovens os embriões, maiores

as dificuldades de cultivo in vitro, por causa do pequeno tamanho, dos danos

durante a excisão e a necessidade de complexas exigências nutricionais (Pasqual

atai., 1998).

Alguns fatores são levados em consideração na cultura de embriões, como

é o caso da escolha do meio adequado, a utilização dos reguladores de

crescimento, a liberação de compostos fenólicos, o estágio de desenvolvimento do

embrião, as condições da planta matriz e a remoção inadequada do embrião

(Pierik, 1997; Andrade, 1998).

A necessidade de sacarose decresce de acordo com o o crescimento do

embrião, onde embriões imaturos necessitam de 8 a 12% de sacarose para um

18

bom desenvolvimento, enquanto os embriões maduros requerem apenas 2 a 3%

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ci^ deste carboidrato (Pierik, 1997). As altas concentrações de sacarose para

# embriões imaturos deve-se às características heterotróficas dos embriões

® imaturos, que requerem além da sacarose, diferenciadas exigências nutricionais

de sais minerais e vitaminas (Pasqual & Pinto, 1988; Henao, 1991), enquanto que

os embriões maduros são quase autotróficos, conseguindo germinar e crescer em

(f meio inorgânico (Hu & Ferreira, 1998). A utilização de água de côco é uma das

alternativas usadas na suplementação do meio de cultura, por fornecer ao meio

^ açúcares e outros glicídios, aminoácidos e suas amidas, fitormônios e outros^ metabólitos, como forma de suprir as exigências nutricionais dos embriões, em

especial, os imaturos (Henao, 1991; Roca & Mroginski, 1991; Hu & Ferreira,

1998).

Os reguladores de crescimento são pouco necessários na cultura de

embriões, execeção feita aos embriões retirados nos estádios iniciais do

^ desenvolvimento ou aos que servirem para a multiplicação rápida (Hu & Ferreira,1998), embora pouco se saiba sobre os efeitos dos reguladores de crescimento

em embriões nos primeiros estádios de desenvolvimento (Roca & Mroginski,

1991).

A manutenção dos embriões no escuro por 15 dias á temperatura entre 22

a 28 ®C acelera o processo de desenvolvimento dos mesmos e evita a oxidação

(Pierik, 1997).

Sementes e embriões de pau-rosa {Aniba rosaeodora) foram testadas para

a produção de plántulas in vitro empregando-se a termoterapia Souza et ai,

1997), enquanto que Andrade (1998) procurou otimizar as técnicas de cultura de

tecidos utilizando embriões de café para avaliar a influência dos reguladores de

crescimento.

19

4.1. Localização e caracterização da área de estudo

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't 4. MA TER!AL E MÉTODOS

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(§o trabalho foi conduzido no Laboratório de Biotecnologia Vegetal da

(9 Embrapa Amazônia Ocidental, localizado no km 29 da Rodovia AM-010, Manaus,

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Os explantes de pau-rosa foram retirados de mudas produzidas no viveiro® X. . -^ florestal da Estação Experimental de Sllvicultura Tropical (INPA), localizada no km

45 da Rodovia BR-174, Manaus, AM, e de sementes coletadas na Reserva

Florestal Adolfo Ducke (INPA), localizada em Manaus, AM, no km 26 da Rodovia

^ AM-010.

7

4.2. Fontes de explante

As mudas de pau-rosa foram tratadas na casa de vegetação da Embrapa

^ Amazônia Ocidental (Figura 01), durante 2 meses com aplicações quinzenals de^ fungicida Benomyl 500 (metll-1 (butllcarbomll)-2-benzlmldazol carbamato) na

concentração de 3 g/l por aplicação durante todo o período de coleta dos

explantes. A cada três meses foram realizadas adubações de NPK na proporção

de 1:2:1.

O substrato utilizado para a produção das mudas foi composto de uma

•T^istura de terriço e de substrato estéril Plantmax, na proporção de 2:1.

Os explantes utilizados consistiram de ápices caulinares, segmentos

nodals, rebrota de mudas, embriões e folhas.

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Figura 01 - Mudas de pau-rosa mantidas em casa de vegetação

4.3. Desinfestação e isolamento do materíai vegeta!r

4.3.1. Ápices caulinares e segmentos nodaís

Os ápices caulinares e os segmentos nodais das mudas de pau-rosa(Figuras 02 e 03) foram seccionados em torno de 5 cm na casa de vegetação,eliminando-se as folhas. O material foi transportado ao laboratório imerso emácido ascórbico (1 g/l) para reduzir a oxidação.

21

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Figura 02 - Ápices caulinares e segmentos nodais de pau-rosa.

O pré-tratamento foi realizado pela imersão dos explantes em Benomyl (300

mg/l) por 16 h, seguido do processo de assepsia na câmara de fluxo laminar. Os

explantes foram tratados em diferentes concentrações de solução de hipoclorito

de sódio (O, 10, 15%) em diferentes tempos de exposição (O, 10, 20 min) (Anexo

01).

22

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Figura 03 - Redução preliminar dos ápices caulinares e segmentos nodais depau-rosa

Os ápices caulinares e os segmentos nodais foram seccionados (Figura 04)em torno de 1,5 cm de comprimento e inoculados em tubos de ensaio contendomeio MS (Murashige & Skoog, 1962). Foram testados 5 tratamentos, com 10repetições por tratamento, totalizando, 50 explantes (Tabelas 04 e 05).

Os dados foram submetidos a análise de variância e à comparação de

médias dos tratamentos pelo Teste de Tukey.

23

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Figura 04 - Processo de assepsia em câmara de fluxo laminar

4.3.2. Limbo foliar

Na casa de vegetação, as folhas com aproximadamente cinco centímetros

de comprimento foram coletadas e mantidas em água destilada até a chegada no

laboratório, prosseguindo o pré-tratamento com a imersão em Benomyl (300 mg/l)

por 48 h.

Em câmara de fluxo laminar, a assepsia consistiu na imersão em etanol

(70%) com Tween-20 por 90 segundos, 20% de hipoclorito de sódio (NaOCI) por

15 minutos, seguido das três lavagens em água destilada e autoclavada.

Após a desinfestação, o material de tecido foliar sofreu cortes de

aproximadamente Icm^ nas posições distai e proximal do limbo foliar e inoculado

em meio MS contendo reguladores de crescimento BAR (O, 0.5 mg/l) e ANA (O, 1,

2 mg/l) (Anexo 01).

24

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Os tratamentos consistiram da combinação dos meios de cultura com

diferentes concentrações de reguladores de crescimento. Foram testados 10

tratamentos com 10 repetições (Tabela 08).

Os dados foram submetidos a análise de variâncía e comparação de

médias entre os tratamentos pelo teste de Tukey.

4.3.3. Embriões

Os embriões foram retirados de sementes coletadas em diversos estágios

de maturação (Figura 05) que foram imersos por uma noite em Benomyl (300

mg/l). Para a obtenção dos explantes, as sementes foram cortadas ao meio e

retirados os embriões que não haviam sofrido o ataque de larvas.

A 5c

Figura 05 - Sementes de pau-rosa em diversos estádios de maturação (Aimatura; B e C - madura)

25

#

#

#^ Na câmara de fluxo laminar, os embriões foram imersos em etanol (70%)

acrescido de Tween-20 por um minuto e trinta segundos, seguido de hipoclorito de

# sódio (50%) por 10 minutos, seguidos das três lavagens em água destilada e

® autoclavada.m^ Os explantes foram inoculados em tubos de ensaio contendo meio MS^ (Tabela 01), com pH ajustado em 6,2. Foram adicionados ao meio MS, 0,5 g/l de

S antioxidante PVP (Polivinilpirrolidona), 1,8 g/l de fitagel, água de coco (O, 10, 20

ml) e sacarose (O, 5, 10 e 15%) para estimular a germinação (Anexo 01). O

experimento contou com 12 tratamentos, com 10 repetições por tratamento

#

m

ü^ (Tabela 06).^ Os dados foram submetidos a análise de variância e comparação de média

# dos tratamentos pelo teste de Tukey.

4.3.4. Material de rebrota

As gemas axilares e terminais foram obtidas das rebrotas das mudas

cultivadas em casa de vegetação.

No primeiro experimento, o pré-tratamento foi realizado a partir da imersão

das gemas em Benomyl (400 mg/l) por uma noite. Na seqüência, foram imersos

em Agrimicina (O, 300, 400 e 500 mg/l), em etanol (70%) com Tween-20 por 90

segundos e em hipoclorito de sódio (10%) por 10 minutos e lavadas em água

destilada. Os explantes foram inoculados em meio MS com suplementação de

sacarose a 3% e ágar a 0,7% (Anexo 01). Este experimento contou com 4

tratamentos e 10 repetições (Tabela 09).

No segundo experimento foi combinado Agrimicina com o antibiótico

Ampicilina. O pré-tratamento consistiu na imersão por 48 h em Benomyl (400

mg/l). Em seguida, o material recebeu tratamento com bomba a vácuo em solução

combinada entre Agrimicina (0,300, 500 mg/l) e Ampicilina (O, 300, 500 mg/l).

Posteriormente, os explantes passaram pelo processo normal de desinfestação,

com etanol (70%) com Tween-20 por 90 segundos, seguido de hipoclorito de sódio

(NaOCI) a 20% por 10 minutos e as lavagens. O meio adotado foi o MS com

26

suplementação de sacarose a 3% e ágar a 0,7%. Foram testados 7 tratamentos

#

#

#

#A com 10 repetições (Tabela 10).

^ Os dados foram submetidos a análise de variãncia e comparação de

médias dos tratamentos pelo teste de Tukey.

#

9

9

9

9

9

9

4.4. Meio de Cultura

O meio de cultura adotado foi o de Murashige & Skoog (MS)(Murashige &

Skoog, 1962), com suplementação de sacarose (30 g/l), ágar (7 g/l) ou "phytagel"9

. .^ (1,8 g/l) e mio-inositol (10 g/l). Os macronutrientes, micronutrientes, as vitaminas e^ a glicina (Tabela 01) foram mantidos em forma de soluções-estoque concentradas,

sob refrigeração ou à temperatura ambiente até o preparo do meio de cultura.

Apenas para os explantes do tipo embrião, adicionou-se água de côco nas

concentrações de 10 e 20 ml, de acordo com o tratamento adotado (Tabela 06).

Os meios de cultura foram preparados com água destilada e autoclavada

sob pressão de 1,5 atm e mantidos à temperatura de 120®C por 40 minutos. Após

o preparo e antes da autoclavagem, o pH dos meios de cultura foram ajustados de

acordo com o experimento, em 5,8 ou 6,2 com hidróxido de sódio (NaOH) a IN ou

com ácido clorídrico (HCI) a IN.

Os meios nutritivos foram levados ao forno de microondas para a

dissolução do ágar pelo tempo de nove minutos.

A distribuição dos meios em tubos de ensaio com 10 ml cada foram

vedados com papel alumínio e levados para a autoclavagem sob pressão de 1,5

atm e mantidos à temperatura de 120®C, durante 20 minutos.

Após a autoclavagem, os meios de cultura foram mantidos em repouso por

uma semana para a verificação de possíveis contaminações.

27

#

m

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

Tabela 01 - Preparo do meio de Murashige & Skoog (1962).Macronutríentes Concentração (g.l'^)

NH4NO3 (Solução A) 165

KNO3 (Solução B) 190

CaCl2.2H20 (Solução C) 44

MgS04.2H20 (Solução D) 37

KH2PO4 (Solução E) 17

Micronutrientes Concentração (g.r)MnS04.Hs0 (Solução F) 1,69

H3BO3 (Solução F) 0,62

ZnS04.7H20 (Solução F) 0.86

Kl (Solução F) 0.083

Na2Mo04.2H20 (Solução F) 0.025

CUSO4.5H2O (Solução F) 0,0025

C0CI2.6H2O (Solução F) 0.0025

Na2EDTA.2H20 (Solução G) 3.73

FeS04.7H20 (Solução G) 2.78

Vitaminas e aminoácidos Concentração (g.l'^)Tlamlna.HCI 0,02

Ácido nicotínico 0.1

Piridoxina.HCI 0.1Glicina 0.4

Outros Concentração (g.i~^)MIo-inositol 10

Sacarose 30

Agar 6

4.5. Reguladores de crescimento

Os reguladores de crescimento utilizados em determinados meios de

cultura estão na Tabela 02.

Devido a facilidade de degradação pelo calor, a esterilização em autociave

não é permitida para algumas substâncias orgânicas. Portanto, empregou-se a

esterilização a frio, utilizando filtros de membrana tipo "miiiipore" com 0,45 pm de

diâmetro, que são adicionados ao meio de cultura quando em processo de

resfriamento, segundo recomendações de Caldas et al. (1998).

28

#

ê

#

#

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

Tabela 02 - Reguladores de crescimento e suas características

Nome comum Nome químico Classe de

reguladoresDissolução Esterilização

KOH ou NAOH

AIA Ácido 3-lndolacétlco Auxína (0,1N) a frio

KOH ou NAOH

ANA Ácido naftalenoacético auxina (0.1N) autoclavável

BAP S-Benzíiaminopurina citocinina HCl (0.1 N) autoclavável

No experimento com explantes foliares foi utilizado a combinação de ácido

naftalenoacético (ANA) e de 6-benzilaminopurina (BAP) em duas concentrações

(Tabela 03).

Tabela 03 - Reguladores de crescimento adicionados ao meio de cultura MS, para

Tratamento ANA (mg/i) BAP (mg/i)

1 0,0 0.02 1.0 0,03 1,0 0,54 2.0 0,05 2,0 0,5

4.6. Controle da Oxidação

O controle da oxidação foi realizado por meio da imersão dos explantes em

solução de ácido ascórbico a 1 g/l ou com a adição de antioxidante PVP

(Polivinilpirrolidona) no meio de cultura.

29

4.7. Condições ambientais das culturas

#

ê

#^ Após a inoculação, as culturas foram mantidas no escuro por uma semana.^ Posteriormente, foram transferidas para a sala de crescimento, sob controle de

# fotoperíodo, luminosidade e temperatura. O fotoperíodo foi de 16h e a intensidade

^ luminosa de 3000 lux, fornecida por lâmpadas fluorescentes branca-fria. Atemperatura ambiente manteve-se em torno de 25±2°C em todos os tratamentos

§ durante a condução dos experimentos.

#

t

9 4.8. Deiineamento Experimental

^ Foram instalados seis experimentos em parcelas inteiramente casualizadas

^ com 10 repetições por tratamento. Os dados foram submetidos a análise de

9 variância, com níveis de significância de 1 a 5% de probabilidade para o teste de^ F. A comparação de média dos tratamentos foi feita pelo teste de Tukey a 5% de^ probabilidade. Os parâmetros avaliados foram as porcentagens de sobrevivência,^ contaminação por fungos e bactérias e a porcentagem de oxidação.

30

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

#

#

#

#

m

9

9

(|^ 5.1. Ápices caulinares e Segmentos nodais9

9A eliminação total dos explantes caulinares de Aniba rosaeodora antes de

9 completarem 30 dias (Tabelas 4 e 5), demonstrando que os tratamentos não9 foram eficazes no controle fúngico deste tipo de explante.

^ A oxidação mostrou-se presente somente na testemunha (2%), evidenciando^ que a imersão em ácido ascórbico a 1 g/i, durante o transporte do material da

casa de vegetação até o laboratório inibiu a oxidação dos explantes.

m

^ Tabela 04 - Efeito da concentração de hipoclorito de sódio e do período de^9 exDosicão na desinfestacão de ápices caulinares de pau-rosa.

Os resultados indicam a contaminação total por fungos, resultando na

Tratamentos

NaCIO

{%)Tempo deexposição(min)

Contaminação (%)

Fungo Bactéria Oxidação(%)

Sobrevivência

(%)

1 0 0 100 20 2 0

2 10 10 100 30 0 0

3 10 20 100 20 0 0

4 15 10 100 0 0 0

5 15 20 100 20 0 0

A contaminação por fungos e bactérias como ocorreu nos segmentos nodais

e ápices caulinares de pau-rosa foi tratada com diferentes concentrações de

hipoclorito de sódio (NaOCI) e tempos de exposição. Este produto foi utilizado com

sucesso em espécies como Malpighia glabra (Oliveira & Carneiro, 1995) e Ocotea

sp. (Vicentini, 1995). Em Tectona grandis (Monteuuis et al., 1998) e Aspidospenva

polyneuron (Ribas et al., 1999) foi usado o bicloreto de mercúrio, o que possibilitou

o sucesso na assepsia dos explantes.

Fatores como a época de coleta dos explantes e a condição fitossanitária da

planta matriz exercem influência no grau de contaminação no estabelecimento da

31

w

m

#

m

#

m

#

#

9

9

9

9

9

9

9

m

9

9

9

9

9

9

9

m

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

Fatores como a época de coleta dos explantes e a condição fitossanitária da

planta matriz exercem influência no grau de contaminação no estabelecimento da

cultura in vitro (Grattapaglia & Machado, 1998). As mudas de pau-rosa das quais

foram coletados os ápices caulinares e segmentos nodais, apesar do bom estado

nutri dona! e sem o ataque visível de fungos, apresentaram alto grau de

contaminação, após a assepsia dos explantes. Fatores como a elevada umidade

relativa do ar e temperatura favorecem o desenvolvimento de microorganismos e

podem ter contribuído para o alto grau de contaminação dos explantes.

Tabela 05 - Efeito da concentração de hipociorito de sódio e do período de

Tratamentos NaCIO

(%)

Tempo deexposição(min)

Contaminação (%)

Fungo Bactéria Oxidaçâo(%)

Sobrevivência

(%)

Testemunha 0 0 100 9 1 0

2 10 10 100 33 0 0

3 10 20 100 57 0 0

4 15 10 100 32 0 0

5 15 20 100 8 0 0

A contaminação e a mortalidade dos explantes podem estar relacionadas

com a época de coleta e o estado fisiológico da planta, sugerindo a aplicação

periódica de fungicidas e a irrigação freqüente na base das plantas, bem como o

crescimento do material em casas de vegetação, auxiliam o processo de

desinfestação.

Estudos indicam que o aumento do tempo de exposição dos agentes

desinfestantes de 10 para 15 minutos causam redução na taxa de sobrevivência,

provocada pela necrose dos tecidos em imbuía e sassafrás (Vicentini, 1995). O

baixo índice de sobrevivência ê atribuído ao maior contato do agente desinfestante

sobre os tecidos do explante, onde quanto maior o tempo e a concentração do

agente desinfestante, menores são as porcentagens de sobrevivência,

evidenciadas pela queima dos explantes (Wiecheteck, 1990).

32

t

'.I

I

H o grau de oxidação dos segmentos nodais de pau-rosa não pôde serI quantificado devido a eliminação dos mesmos pelo intenso ataque de fungos.% Menores porcentagens de oxidação de explantes de Caryocar brasiliense foram

I obtidos por Dombroski (1997), quando mantidos em condições de baixa

luminosidade, com área oxidada ou com necrose inferior a 30%, enquanto que

Wiecheteck (1990) verificou que o tempo de exposição do hipoclorito de sódio

também exerce influência sobre a oxidação do meio de cultura em segmentos

% nodais de Eucalyptus viminalis por meio da liberação de fenóis por parte dos

tecidos, provocando a oxidação.

Ao utilizar 100 mg/l de PVP (Polivinilpirrolidona) no meio, Dombroski (1997)

constatou a eficácia no controle da oxidação de Caryocar brasiliense quando

mantidos em condições de baixa luminosidade, enquanto que Carvalho (1988)

trabalhando com os mesmos explantes em Eucalyptus viminalis conseguiu

controlar a oxidação utilizando apenas 10 mg/l do mesmo antioxidante,

evidenciando que o emprego do mesmo antioxidante revela resultados diferentes

ocasionada principalmente pelas diferenças nas concentrações de fenóis que

^ variam conforme a espécie adotada (Carvalho etal., 1988).

%

%

%

%

%

%

«

%

%

%

^ 5.2. Embriões

%

Os resultados referentes ao estabelecimento dos embriões de pau-rosa

encontram-se na Tabela 06 e indicam a existência de diferenças significativas na

contaminação fúngica, oxidação e sobrevivência quanto ao efeito da

concentração de sacarose e de água de côco para este tipo de explante.

A sobrevivência de 100% para o tratamento 3 foi evidenciada pelo baixo

índice de contaminação fúngico e bacteriano, embora não tenha diferido

estatisticamente dos tratamentos 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10 e 11. Isso indica que o baixo

índice de contaminação dos embriões deve-se à localização em ambientes

estéreis dentro da semente. A contaminação visível nos tratamentos pode estar

associada a habilidade no manuseio das sementes durante a retirada dos

33

r

#

#

#

#

#

embriões, fato verificado no tratamento 12 com a maior porcentagem de

contaminação, e portanto, a menor em sobrevivência.

A eficiência da assepsia dos embriões cultivados in vitro possibilitará o

'# estabelecimento de explantes livres de fungos e bactérias.

Tabela 06 - Efeito das concentrações de sacarose e água de côco na

Trata

mento

Sacarose

{%)Água decôco

(mg/l)

Contaminação (%)

Fungo Bactéria

Oxidação(%)

Sobrevivência

(%)

1 0 0 28 abe Oa 2 abe 72 abe

2 0 10 10 bc 0 a 3 abe 90 ab

3 0 20 0 c 0 a 4 abe 100 a

4 5 0 19 bc 3 a 0 c 71 abe

5 5 10 30 abe 4a 1 bc 70 abe

6 5 20 20 bc Oa 7a 80 ab

7 10 0 58 abe 3a 1 bc 42 abe

8 10 10 38 abe 3 a 6 ab 62 abe

9 10 20 69 ab 5a 1 bc 31 bc

10 15 0 19 bc 0 a 2 abe 81 ab

11 15 10 59 abe 6a 4 abe 41 abe

12 15 20 89 a 7a 0 c 11 c

Nas colunas, médias seguidas de mesma letra nâo diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

Resultados similares foram observados por Gomes et al. (1997), que

trabalhando com embriões de Cedrela odorata obtiveram 100% de germinação

com assepsia em hipoclorito de sódio (2%) e adição de 1% de sacarose em meio

de cultura, enquanto que sementes e embriões de pau-rosa (Aniba rosaeodora)

tratados com temperatura (40°C por 30 minutos) e hipoclorito de sódio por 30

minutos obtiveram 95% de embriões assépticos (Souza et al., 1997). Em embriões

imaturos de Coffea sp., a utilização de 0,5% de bicloreto de mercúrio proporcionou

100% de embriões assépticos. (Raghuramuiu, 1989 api/d Andrade, 1998).

O controle da oxidação em explantes cultivados in vitro é um fator de

fundamental importância para o sucesso da cultura. Observa-se pela Tabela 6 que

existem diferenças significativas entre as médias, pelo teste de Tukey. Os

tratamentos mais eficientes para reduzir a oxidação dos explantes de pau-rosa

34

%

%

■3^

foram o 4 e o 12, embora não tenham diferido estatisticamente de 1, 2, 3, 5, 7, 9,%

10 e 11, indicando que nestes tratamentos ocorreu uma menor liberação de fenóis

^ no momento da inoculação.

Esta característica apesar de ser comum em espécies lenhosas, pelo altoteor de substâncias fenólicas, pode estar associada a habilidade e tempo no

isolamento de embriões que acaba incorrendo em danos e contaminações no

m momento da excisão (Pierik, 1997).

^ A oxidação fenólica foi o fator limitante no estabelecimento da cultura de

embriões imaturos de manga {Mangifera indica), resultando em morte dos tecidos^ e conseqüente descarte do material, sendo recomendado a troca constante de^ meio de cultura e o uso de antioxidantes (Rodríguez, 1989).^ A manutenção das culturas no escuro por 7 a 15 dias dificulta o aparecimento

da oxidação fenólica (Pierik, 1997), onde em trabalhos como o de embriões e

endosperma de andiroba {Carapa guianensis) o problema da oxidação foisolucionado mediante a adoção de omissão de luz por uma semana (Amaral etai., 1997).

Aos 45 dias, os explantes isentos de contaminação foram avaliados quanto aporcentagem de germinação (Tabela 7), existindo diferenças significativas entre ostratamentos pelo teste de Duncan. O melhor tratamento foi o 4, com

suplementação de 20 mg/l de água de côco, induzindo 53% de germinação,embora este tratamento não tenha diferido de 3, 5 , 6, 7 e 10. Os explantesavaliados apresentavam liberação dos primórdios foliares e a formação deradícula em alguns tratamentos, como 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9 (Figuras 06 e 07),evidenciando que as concentrações de sacarose e de água de côco sãofundamentais no estabelecimento de embriões de acordo com o estágio dedesenvolvimentos dos mesmos.

35

w

ê

Sacarose Agua de côcoTratamento (%) (mg/l) Germinação (%)

T1 0 0 8 c

T2 0 10 9 c

T3 0 20 25 abe

T4 5 0 53 a

T5 5 10 25 abe

T6 5 20 48 ab

17 10 0 42 ab

18 10 10 18 bc

19 10 20 18 be

T10 15 0 34 abe

T11 15 10 19 bc

TI 2 15 20 10 c

Nas colunas, as médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Duncan a 5%. de probabilidade.

Figura 06 - Embriões imaturos de pau-rosa em meio MS aos 15 dias.

36

' í7

J

Figura 07 - Embriões de pau-rosa com radícula aos 30 dias.

Após a avaliação, os explantes foram transferidos para meio MS acrescidos

de reguladores de crescimento ANA (0,1; 0,5) e BAP (0,1; 0,5), para dar

continuidade ao processo de estabelecimento desta cultura. Observou-se o início

de indução de formação de calos em determinados tratamentos (tratamentos 4 e

5) e a germinação a partir de embriões (Figura 08), indicando a possibilidade da

propagação a partir de embriões por embriogênese somática.

37

#

#

m

desinfestação em etanol (70%) e hipoclorito de sódio (50%) por 1 hora,

^ trabalhando com bertalha {Boussingaultia basellaceas).

#

«

# Tabela 08 - Efeito da concentração de hipoclorito de sódio e do período deexposição na desinfestação de folhas de pau-rosa.

#

#

#

#

Contaminação (%)Trata NaOCI Tempo ANA BAP Oxidaçâo Sobrevimento (%) (min) (mg/l) (mg/l) Fungo Bactéria (%) vência

(%)1 20 0 0,0 0.0 100 32 1 02 20 5 1.0 0.0 100 34 0 0

3 20 10 1.0 0.5 100 48 1 0

4 20 15 2.0 0.0 100 36 0 0

5 20 20 2.0 0,5 100 38 3 0

Em trabalhos como o de explantes foliares de caju (Anacardium

occidentale) observou-se a desinfestação com etanol (70%), hipoclorito de sódio

(1,5%) e inoculação em meio MS contendo Benomyl (Nenartavis & Miranda,

1995). Ao trabalharem com explantes foliares maduros e juvenis de castanha-do-

Brasil {BerthoHetia excelsa), Camargo & Pasqual (1995) utilizaram no processo de

assepsia, o etanol (90%), hipoclorito de sódio (30%) por 20 minutos, atingindo um

percentual 100% de sobrevivência em folhas jovens e 30% nas folhas maduras,

comprovando que fontes de explantes oriundos de material juvenil apresentam

menor facilidade de contaminação (Montoya, 1991).

A combinação de detergente antimicrobiano Povidex, a Ampicilina (250

mg/l) e o hipoclorito de sódio (0,8%) por 20 minutos, contribuiu para a eliminação

da contaminação bacteriana endógena em explantes foliares de mogno, atingindo

uma eficácia de 87% (Albarrán et al., 1997).

39

Na Tabela 10, observa-se o efeito dos tratamentos com Agrimicina e

antibiótico Ampicilina advindo da rebrota das mudas, mediante o emprego de

vácuo na desinfestação dos explantes. As menores porcentagens de

contaminação fúngica (40%) foram obtidas nos tratamentos 3 e 5, pela

combinação de Agrimicina e Ampicilina, ambas na concentração de 300 mg/l,

embora não tenha diferido estatisticamente de 2, 4, 6 e 7. A maior porcentagem de

sobrevivência foi observada no tratamento 5.

Neste estudo não foi possível a identificação das bactérias endógenas

desta espécie, o que dificultou o uso de um antibiótico específico para a

eliminação das bactérias. A combinação de Agrimicina e Ampicilina e as possíveis

falhas na assepsia devido a elevada contaminação por fungos não favoreceram o

estabelecimento in vitro destes explantes.

Tabela 10 - Efeito da concentração de Agrimicina e Ampicilina na desinfestação

Contaminação (%)Tratamentos Agrimicina

(mg/l)Ampicilina(mg/l) Fungo Bactéria Oxidação

(%)

Sobrevivência

(%)

1 0 0 100 a 50 a 80 a 0 b

2 300 0 56 ab 50 a 68 a 11 ab

3 300 300 40 b 50 a 73 a 18 ab

4 300 500 59 ab 20 a 73 a 12 ab

5 500 0 40 b 30 a 82 a 25 a

6 500 300 47 ab 40 a 74 a 9ab

7 500 500 50 ab 50 a 78 a 8 ab

Nas colunas, as médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

A utillização de antibióticos é necessária no controle da contaminação por

bactérias endógenas presentes nos explantes de pau-rosa, para que seja possível

o estabelecimento da cultura in vitro.

A toxidez de mais de vinte tipos de antibióticos foi examinada em culturas de

protoplastos de Nicotiana piumbaginifolia, verificando que a ação dos antibióticos

a base de Ampicilina, Estreptomicina, Rifampicina, possuem amplo espectro de

ação (Pollock, 1983).

41

Mesmo com a utilização do vácuo no processo de desinfestação, que permite

o aumento da dilatação dos poros do explante e o auxiliando na penetração da

solução (Pasqual et a/., 1998), os resultados indicam que a média de

sobrevivência do material inoculado ainda é baixa, quando comparada ao

processo tradicional de desinfestação.

No entanto, quando comparado com a utilização de ápices e segmentos

nodais, o ápice proveniente de rebrota, oferece melhores condições de isolamento

para a organogênese direta in vitro.

42

6. CONCLUSÕES

De acordo com os resultados obtidos neste trabalho, pode-se concluir que:

1) As rebrotas tratadas com Sulfato de Estreptomicina (Agrimicína) na

concentração de 300 mg/l indicaram 33% de contaminação fúngica e 29% de

contaminação bacteriana, com 48% de sobrevivência.

2) A menor incidência por bactérias endógenas em explantes de rebrota das

mudas está associada a época de coleta e ao tipo de explante empregado e

diminuiu, à medida que, novas brotações foram utilizadas.

3) O uso do ácido ascórbico em ápices caulinares e segmentos nodaís e de PVP

(Polivinilpirrolidona) em meio de cultura foram fundamentais na redução da

oxidação dos explantes de pau-rosa in vitro.

4) A maior sobrevivência (100%), porcentagem de germinação (53%) e a menor

contaminação (0%), foram obtidos com embriões tratados com hipoclorito de

sódio a 50% em meio MS contendo 20 ml de água de côco.

44

7. RECOMENDAÇÕES

1) Explantes de rebrotas das mudas devem ser melhor estudados para a

determinação de metodologias mais consistentes em relação a desinfestações

envolvendo antibióticos e fungicidas para esta espécie.

2) Trabalhos envolvendo a cultura de meristemas e embriões são fontes

promissoras no estabelecimento da cultura in vitro para esta espécie, bem

como a adoção da técnica de termoterapia.

3) A formação inicial de calos em explantes de pau-rosa, principalmente nos

embriões, demonstra a aptidão da espécie para a embriogênese somática,

como outra opção de regeneração de material in vitro.

4) Metodologias mais consistentes devem ser estudadas para a desinfestação de

ápices caulinares, segmentos nodais e explantes foliares desta espécie.

5) A utilização de antibióticos específicos para o controle da contaminação por

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Anexo 01 - Experimentos realizados com diferentes tipos de explante de pau-rosaPré-tratamento

Experi- Tipo de Meio de Campo- Assepsia dos expiantes na câmara de fluxo laminarmento Explante cultura laboratório

Pré-tratamento com imersâo em Benomyl (300 mg/l) por 16 h.Etanol 70% + 2-3 gotas de Tween 20/100 mL de solução por 1 minuto e

Campo: benomyl 30 segundos, seguido do processo de assepsia em câmara de fluxo(1000mg/l) laminar com os tratamentos consistindo da combinação de diferentes

01 Ápice MS laboratório: concentrações de hipocloríto de sódio (NaOCO a (O, 10, 15%) combenomyl (300 diferentes tempos de exposição (O, 10, 20 min) dos expiantes àsmg/l/16horas) soluções

Lavagem 3 vezes em água destilada e autoclavada

02 Segmentonodal

MS

03 Rebrota MS

Campo: benomyl(1000mg/l)

Campo: benomyl(1000 mg/l)laboratório:

benomyl (400 mg/I/16 horas)

Pré-tratamento com imersão em Benomyl (300 mg/l) por 16 h.Etanol 70% + 2-3 gotas de Tween 20/100 ml de solução por 1 minuto e30 segundos, seguido do processo de assepsia em câmara de fluxolaminar com os tratamentos consistindo da combinação de diferentesconcentrações de hipoclorito de sódio (NaOCI) a (O, 10, 15%) comdiferentes tempos de exposição (O, 10, 20 min) dos expiantes àssoluções. Inoculação em meio MS com suplementação de sacarose a 3%e ágar a 0,7%.Lavagem 3 vezes em água destilada e autoclavada

Imersão em Benomyl (400 mg/l) por uma noite como pré-tratamento.Imersão em Agrimicina nas seguintes concentrações (O, 300, 400 e 500mg/l) por 1h e mantidas em etanol a 70% por um minuto e trintasegundos e hipoclorito de sódio a 10% por 10 minutos prosseguindo-secom as lavagens em água destilada e autoclavada e inoculados em meioMS com suplementação de sacarose a 3% e ágar a 0,7%.

Campo: benomyl(lOOOmgfl)

04 Rebrota MS laboratório:benomyl (400 mg/l/

48 horas)

Pré-tratamento com imersão por 48 h em Benomyl (400 mg/l).Tratamento com bomba a vácuo a 180 mmHg por 30 segundos, pelacombinação entre Agrimicina (0,300, 500 mg/l) e Ampicilina (O, 300, 500mg/l) e desinfestação com etanol a 70% com Tween-20, seguido dehipoclorito a 20% por 10 minutos e as lavagens, contando então, com 7tratamentos com 10 repetições por tratamento. O meio adotado foi o MScom suplementação de sacarose a 3% e ágar a 0,7%.

05

06

Limbo foliar

Embrião

MS +BAP(0,0.5mg/l)+

ANA (0,1,2 mg/l)

MS + águade côco +

PVP

Campo: benomyl(lOOOmg^)laboratório:

benomyl (300 mg/Lpor 48 horas)

Campo: benomyl(1000 mg/l)Laboratório:benomyl (300mg/1/16horas)

Pré-tratamento com imersão em Benomyl (300 mg/l) por 48 h.Assepsia com imersão em etanol a 70% com Tween-20 por 1 rninuto e30 segundos, hipoclorito de sódio a 20% por 15 minutos, seguido dastrés lavagens em água destilada e autoclavada.Tratamentos consistiram na combinação dos reguladores de crescimentoBAP (O, 0.5 mg/l) e ANA (0,1,2 mg/l) ao meio MSPré-tratamento com imersão por uma noite em Benomyl (300 mg/l).Assepsia em etanol a 70%, seguido de hipoclorito de sódio a 50% por 10minutose as três lavagens em água destilada e autoclavada.Material inoculado em meio MS com 0,5 g/l de antioxidante PVP(Polivinilplrrolidona), 1,8 g/l de fitagel, água de cõco (O, 10, 20 ml) esacarose nas concentrações de 0,5.10,15, 20%.

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