ministÉrio da educaÇÃo universidade federal ......11 resumo copernicia prunifera (miller) h.e....

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO

UNIDADE ACADÊMICA ESPECIALIZADA EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS - UECIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FLORESTAIS

DISSERTAÇÃO

MODELAGEM DE NICHO ECOLÓGICO E DIVERSIDADE GENÉTICA DE Copernicia

prunifera (Miller) H.E. Moore (ARECACEAE): IMPLICAÇÕES PARA A

CONSERVAÇÃO

JÉSSICA RITCHELE MOURA DOS SANTOS

Macaíba-RN

2017

2

JÉSSICA RITCHELE MOURA DOS SANTOS

MODELAGEM DE NICHO ECOLÓGICO E DIVERSIDADE GENÉTICA DE Copernicia

prunifera (Miller) H.E. Moore (ARECACEAE): IMPLICAÇÕES PARA A

CONSERVAÇÃO

Orientador: Prof. Dr. Fábio de Almeida Vieira

Macaíba-RN

2017

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Ciências Florestais da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte,

como pré-requisito para obtenção do título de

Mestre.

3

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial da Escola Agrícola Jundiaí - EAJ

Santos, Jéssica Ritchele Moura dos.

Modelagem de nicho ecológico e diversidade genética de

Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore (Arecaceae): implicações

para a conservação / Jéssica Ritchele Moura dos Santos. -

Macaíba/RN, 2017. 56f.: il.

Dissertação (Mestre) Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias

Campus Macaíba, Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais.

Orientador: Prof. Dr. Fábio de Almeida Vieira.

1. Carnaúba - Dissertação. 2. Gargalo genético - Dissertação.

3. ISSR - Dissertação. 4. Predição de habitat - Dissertação. I.

Vieira, Fábio de Almeida. II. Título.

RN/UF/BSPRH CDU 633.9

5

DEDICO

A minha avó, Maria Araújo de Moura

- In Memoriam

6

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela oportunidade de iniciar e concluir o mestrado e por me guiar em todos os momentos

da minha vida.

Aos meus pais Marilene e Sérgio, e ao meu irmão Jefferson pelo incentivo e por acreditarem em

mim.

Aos meus avós, Antônio e Conceição (in memoriam), Roselita e Zequinha, por construírem a

base da minha família.

A todos os familiares que acompanharam minha caminhada e que torceram por minha vitória.

Ao meu orientador, professor Dr. Fábio de Almeida Vieira, pela paciência e atenção.

A professora Drª Cristiane, pelo apoio em minha graduação e mestrado.

Aos meus queridos amigos, Anny e Richeliel por toda amizade e companheirismo em mais uma

etapa da minha formação.

A todos os amigos do Laboratório de Genética e Melhoramento Florestal (LabGeM) –

UAECIA/UFRN por me acolher e proporcionar bons momentos de aprendizado e descontração.

E a todos que de forma direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.

Meus sinceros agradecimentos!

7

SUMÁRIO

APRESENTAÇÃO ........................................................................................................................ 10

RESUMO....................................................................................................................................... 11

ABSTRACT .................................................................................................................................. 12

INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 13

REFERÊNCIAS ............................................................................................................................ 14

Capítulo 1: DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DA PALMEIRA Copernicia prunifera (Miller) H.

E. Moore COM BASE EM MODELAGEM DE NICHO ECOLÓGICO ..................................... 16

RESUMO....................................................................................................................................... 16

ABSTRACT .................................................................................................................................. 16

INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 17

MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................................... 19

RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................................... 20

CONCLUSÕES ............................................................................................................................. 22

AGRADECIMENTOS .................................................................................................................. 22

REFERÊNCIAS.............................................................................................................................23

ANEXO I........................................................................................................................................27

Capítulo 2: GENETIC DIVERSITY OF Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore

(ARECACEAE): IMPLICATIONS FOR CONSERVATION…………………….….................30

ABSTRACT...................................................................................................................................30

INTRODUCTION………………………………………………………………………………..30

MATERIAL AND METHODS……………………………………………………….….............32

RESULTS………………………………………………………………………………………...37

DISCUSSION…………………………………………...……………………………………......45

IMPLICATIONS FOR CONSERVATION……………………………………………………...48

ACKNOWLEDGMENTS…………………………………………………………………..........49

REFERENCES…………………………………………………………………………………...49

CONCLUSÕES ............................................................................................................................. 56

8

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 1:

Figura 1. Representação da adequabilidade do habitat de Copernicia prunifera no Brasil com

base em Maxent. Cores quentes (amarelo ao vermelho) representam valores maiores de

probabilidade e cores frias (verde a azul) menores valores de probabilidade de potencial de

ocorrência do nicho ecológico da espécie. Quadros brancos representam os registros de presença

usados para treinamento e quadros roxos para testes.....................................................................21

CAPÍTULO 2:

Figure 1. Geographic location of the sampled populations of Copernicia prunifera in Rio Grande

do Norte and Ceará States, Brazil……………………………………………...…………………33

Figure 2. Pattern of ISSR amplification fragments resulting from UBC primer 857 for 12

Copernicia prunifera individuals from the Apodi population, Rio Grande do Norte. L = Ladder 1

kb....................................................................................................................................................37

Figure 3. Relationship between the genetic and geographic distances between Copernicia

prunifera populations….................................................................................................................40

Figure 4. UPGMA dendrogram based on Nei’s genetic identity between the 11 studied

Copernicia prunifera populations……..........................................................................................41

Figure 5. Principal component analysis of the studied Copernicia prunifera populations, based

on Nei’s genetic distance…….......................................................................................................42

Figure 6. Plot of the mean values of LnP (D) of the Bayesian analysis (solid line) and ΔK

analysis (dotted line). The bars indicate standard deviations of LnP (D) values...........................43

Figure 7. Bayesian analysis of Copernicia prunifera with the proportion of genotypes in the

sampled populations. The dark vertical lines delimit populations.................................................43

9

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1:

Tabela 1. Variáveis utilizadas na modelação da área de distribuição potencial de Copernicia

prunifera e sua contribuição percentual utilizadas na construção do modelo com Maxent. Fonte:

WorldClim (2016) .........................................................................................................................26

CAPÍTULO 2:

Table 1. Location of sampled Copernicia prunifera populations, population code, geographic

coordinates, number of individuals, and region of occurrence. RN - Rio Grande do Norte; CE –

Ceará…….......................................................................................................................................34

Table 2. Nucleotide sequence of ISSR primers, number of loci, and PIC value of each primer...37

Table 3. Genetic diversity parameters of Copernicia prunifera natural populations………...….38

Table 4. Estimates of genetic distance (Nei, 1978) below the diagonal, and geographic distance

(km) above the diagonal, between populations of Copernicia prunifera. Minimum and maximum

values are shown in bold................................................................................................................39

Table 5. Analysis of molecular variance (AMOVA) between and within Copernicia prunifera

populations……………………………..........................................................................................39

Table 6. Matrix of historical gene flow values among pairs of Copernicia prunifera populations.

Minimum and maximum values are shown in bold.......................................................................41

Table 7. Tests of equilibrium between mutation and genetic drift for the studied Copernicia

prunifera populations based on IAM and SMM models………………..………………………..44

10

APRESENTAÇÃO

A presente dissertação está organizada em dois capítulos constituídos de artigos

elaborados a partir de estudos realizados com a espécie Copernicia prunifera (Miller) H. E

Moore. O primeiro capítulo “Distribuição geográfica da palmeira Copernicia prunifera com base

em modelagem de nicho ecológico” tem como objetivo estudar a distribuição geográfica de

Copernicia prunifera e identificar as variáveis ambientais que influenciam na sua distribuição,

usando como ferramenta a modelagem de nicho ecológico. Foi submetido a revista Pesquisa

Agropecuária Brasileira.

O segundo capítulo se refere ao artigo “Genetic diversity of Copernicia prunifera (Miller)

H.E. Moore (Arecaceae): implications for conservation” e objetivou analisar a diversidade

genética entre populações naturais de Copernicia prunifera. Será submetido ao periódico

Biodiversity and Conservation.

11

RESUMO

Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore é uma palmeira nativa do nordeste do Brasil, possui

múltiplas formas de uso, sendo seu principal produto o pó cerífero. Devido ao extrativismo

realizado ao longo dos anos nas populações naturais da espécie, estudos sobre a distribuição

geográfica e diversidade genética de suas populações são cada vez mais necessários. Desta forma,

o presente trabalho teve como objetivos estudar a distribuição geográfica de Copernicia prunifera

como base em modelagem de nicho ecológico (MNE) e analisar a diversidade genética entre

populações naturais da espécie. Os modelos de nicho ecológico foram construídos baseados em

80 pontos de ocorrência da espécie e em 19 variáveis ambientais. Os resultados gerados sugerem

que o modelo de distribuição potencial da Copernicia prunifera se concentrou nos estados do

Ceará, Rio Grande do Norte, sudoeste de Pernambuco, norte da Bahia e vale do Rio São

Francisco, norte e sudoeste do Piauí e norte do Maranhão. A variável ambiental que mais

contribuiu com a MNE foi a precipitação do trimestre mais seco. No estudo de diversidade

genética foram amostrados 180 indivíduos distribuídos em 11 populações naturais nos estados do

Rio Grande do Norte e Ceará. Sete iniciadores ISSR foram utilizados e forneceram 100 locos

com 99,09% de polimorfismo. O Conteúdo de informação polimórfica (PIC) de cada iniciador foi

considerado mediamente informativo. A diversidade genética de Nei (He) variou de 0,071 a

0,288 e o Índice de Shannon (I) de 0,103 a 0,418. A AMOVA indicou maior variação genética

entre indivíduos dentro das populações (58,11%) do que entre as populações (41,89%). O teste de

Mantel revelou correlação positiva e significativa (r = 0,423; P = 0,006) entre as distâncias

genéticas e geográficas, sugerindo isolamento pela distância. O maior valor de fluxo gênico

ocorreu entre as populações de AR1 e AR2 (Nm = 29), assim como a maior semelhança genética.

A análise bayesiana revelou que os genótipos foram divididos em três grupos distintos (K=3). A

maioria das populações apresentaram gargalo genético populacionais. Os resultados obtidos

sugerem que as populações de Copernicia prunifera estão perdendo sua diversidade genética,

sendo necessárias medidas de conservação de suas populações a fim de minimizar a perda de

alelos importantes, contribuindo para manutenção da espécie.

Palavras-chave: Carnaúba; Gargalo genético; ISSR; Predição de habitat.

12

ABSTRACT

Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore is a native palm tree from northeastern Brazil, it has

multiple forms of use, its main product being the ceriferous powder. Due to the extractivism

carried out over the years in the natural populations of the species, studies on the geographical

distribution and genetic diversity of their populations are increasingly necessary. The present

study aimed to study the geographic distribution of Copernicia prunifera as a basis in ecological

niche modeling (MNE) and to analyze the genetic diversity among natural populations of the

species. The ecological niche models were constructed based on 80 species occurrence points and

on 19 environmental variables. The results suggest that the potential distribution model of

Copernicia prunifera was concentrated in the states of Ceará, Rio Grande do Norte, southwest of

Pernambuco, north of Bahia and the valley of the São Francisco River, north and southwest of

Piauí and north of Maranhão. The environmental variable that contributed most to the MNE was

the rainfall of the driest quarter. In the study of genetic diversity 180 individuals were sampled in

11 natural populations in the states of Rio Grande do Norte and Ceará. Seven ISSR primers were

used and provided 100 locus with 99.09% polymorphism. The Polymorphic Information Content

(PIC) of each primer was considered to be medium to informative. The genetic diversity of Nei

(He) ranged from 0.071 to 0.288 and the Shannon Index (I) ranged from 0.103 to 0.418. AMOVA

indicated greater genetic variation among individuals within populations (58.11%) than among

populations (41.89%). The Mantel test revealed a positive and significant correlation (r = 0.423;

P = 0.006) between the genetic and geographic distances, suggesting isolation by distance. The

highest value of gene flow occurred among the populations of AR1 and AR2 (Nm = 29), as well

as the greatest genetic similarity. Bayesian analysis revealed that the genotypes were divided into

three distinct groups (K = 3). Most populations presented genetic bottleneck populations. Most

populations presented genetic bottleneck populations. The results suggest that the populations of

Copernicia prunifera are losing their genetic diversity, being necessary measures of conservation

of their populations in order to minimize the loss of important alleles, contributing to the

maintenance of the species.

Key words: Carnauba; Bottleneck; Habitat prediction; ISSR.

13

INTRODUÇÃO

A palmeira Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore é uma espécie nativa do Nordeste

do Brasil, pertencente à família Arecaceae. Conhecida popularmente por carnaúba, pode ser

encontrada principalmente nos estados do Piauí, Ceará e Rio Grande do Norte. A espécie é

conhecida como árvore da vida, pois oferece ao homem uma infinidade de usos dos produtos dela

extraídos, com produtos bem aceitos no mercado e valor econômico agregado (GOMES et al.,

2009).

As práticas extrativistas da espécie vêm mantendo a várias décadas grande importância

econômica no Nordeste brasileiro, principalmente em períodos de estiagem com o corte das

folhas dos carnaubais. A extensa exploração das populações naturais de Copernicia prunifera

pode ocasionar fragmentação florestal que resulta na redução da diversidade genética

(CARDOSO et al., 2000). Ademais, as práticas extrativistas de forma desordenada favorecem a

redução do tamanho efetivo populacional, compromete a taxa de cruzamento entre os indivíduos

e o comportamento dos dispersores e polinizadores afetando a estrutura genética das populações,

assim, contribuindo com o aumento dos níveis de endogamia e na redução da heterozigosidade

(YOUNG et al., 1996). De fato, segundo Vieira et al. (2016), a extração mensal das folhas

imaturas da Coperncia prunifera a 50% e 75%, ocasionou a redução da produção de folhas,

flores, frutos e sementes, assim, tais autores sugerem que a taxa de extração mensal das folhas

não exceda 25% e que haja um pousio preferencialmente durante o período de maturação dos

frutos, para minimizar os danos no desenvolvimento da espécie.

Para se compreender como a diversidade genética é distribuída estudos de diversidade e

estrutura genética são necessários (NYBOM; BARTISH, 2000) aliado aos marcadores

moleculares que podem ser utilizados como ferramentas para avaliar a diversidade genética entre

indivíduos (CHAGAS et al., 2015) e dentro e entre populações (SANTOS et al., 2015).

Com isso, conhecer a diversidade genética de populações naturais é importante na geração

de informações úteis para definir estratégias de conservação e manejo das espécies (DUARTE et

al., 2015). Além disso, conhecer a distribuição geográfica de uma espécie é também fundamental

para elaboração de programas de conservação. Para isso, estudos de modelagem de nicho

ecológico são amplamente utilizados para estimar a relação entre as espécies e seus locais de

ocorrência, predizendo áreas que uma espécie pode potencialmente se estabelecer (ELITH et al.,

2011). Para tais estudos o software Maxent tem sido bastante empregado, necessitando apenas

14

dados de presença da espécie e de variáveis ambientais para gerar modelos de nicho ecológico e

tem frequentemente demonstrado melhor desempenho que outros algoritmos (ELITH et al., 2006;

PHILLIPS et al., 2006; PETERSON et al., 2007).

Neste contexto, o trabalho teve como objetivos:

• Estudar a distribuição geográfica de Copernicia prunifera e identificar as variáveis

ambientais que influenciam na sua distribuição;

• Analisar a diversidade genética entre populações naturais de Copernicia prunifera.

• Verificar se há correlação entre distância genética e distância geográfica nas populações

amostradas;

• Estimar o fluxo gênico histórico entre as populações de Copernicia prunifera;

• Avaliar a similaridade genética entre as populações estudadas;

• Observar a ocorrência de possíveis gargalos genéticos populacionais;

• Definir populações prioritárias para conservação.

REFERÊNCIAS

CARDOSO, S. R. S.; ELOY, N. B.; PROVAN, J.; CARDOSO, M. A.; FERREIRA, P. C. G.

Genetic differentiation of Euterpe edulis Mart. populations estimated by AFLP analysis.

Molecular Ecology, n. 9, p. 1753–1760, 2000.

CHAGAS, K. P. T.; SOUSA, R. F.; FAJARDO, C. G.; VIEIRA, F. A. Seleção de marcadores

ISSR e diversidade genética em uma população de Elaeis guineenses. Agrária, v.10, n.1, p.147-

152, 2015.

DUARTE, J. F.; CARVALHO, D.; VIEIRA, F. A. Genetic conservation of Ficus

bonijesulapensis R.M. Castro in a dry forest on limestone outcrops. Biochemical Systematics

and Ecology, v. 59, p. 54-62, 2015.

ELITH, J.; PHILLIPS, S. J.; HASTIE, T., DUDIK, M.; CHEE, Y.; YATES, C. J. A statistical

explanation of MaxEnt for ecologists. Diversity and Distributions, n 17, p. 43–57. 2011.

ELITH, J.; GRAHAM, C.H.; ANDERSON, R.P.; DUDÍK, M.; FERRIER, S.; GUISAN, A.;

HIJMANS, R.J.; HUETTMANN, F.; LEATHWICK, J.R.; LEHMANN, A.; LI, J.; LOHMANN,

L.G.; LOISELLE, B.A.; MANION, G.; MORITZ, C.; NAKAMURA, M.; NAKAZAWA, Y.;

OVERTON, J.M.; PETERSON, A.T.; PHILLIPS, S.J.; RICHARDSON, K.; SCACHETTI-

15

PEREIRA, R.; SCHAPIRE, R.E.; SOBERÓN, J.; WILLIAMS, S.; WISZ, M.S.;

ZIMMERMANN, N.E. Novel methods improve prediction of species distributions from

occurrence data. Ecography, v. 29, p. 129-151, 2006.

GOMES, J.A.F.; LEITE, E.R.; CAVALCANTE, A.C.R.; CÂNDIDO, M.J.D.; LEMPP, B.;

BOMFIM, M.A.D.; ROGÉRIO, M.C.P. Resíduo agroindustrial da carnaúba como fonte de

volumoso para a terminação de ovinos. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.44, n.1, p.58- 67,

2009.

NYBOM, H.; BARTISH, I. V. Effects of life history traits and sampling strategies on genetic

diversity estimates obtained with RAPD markers in plants. Perspectives in Plant Ecology,

Evolution and Systematics, Zurich, v. 3, n. 2, p. 93-114, 2000.

PETERSON, T.; PAPES, M.; EATON, M. Transferability and model evaluation in ecological

niche modeling: a comparison of GARP and Maxent. Ecography, v. 30, p. 550-560. 2007.

PHILLIPS, S. J.; ANDERSON, R. P.; SCHAPIRE, R. E. Maximum entropy modeling of species

geographic distributions. Ecological Modelling, v. 190, p. 231-259. 2006.

SANTOS, R. R. M.; CAVALLARI, M. M.; PIMENTA, M. A. S.; ABREU, A. G.; COSTA, M.

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fragmented areas of southeast Brazil. Genetics and Molecular Research, v.14, p. 6472-6481,

2015.

VIEIRA, I. R.; OLIVEIRA, J. S.; LOIOLA, M. I. B. Effects of harvesting on leaf production and

reproductive performance of Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore. Revista Árvore,

Viçosa-MG, v.40, n.1, p.117-123, 2016.

YOUNG, A.; BOYLE, T.; BROWN, T. The population genetic consequences of habitat

fragmentation for plants. Trends Ecology Evolutionary, Oxford, v. 11, n. 10, p. 413-418, Oct.

1996.

16

CAPÍTULO 1: DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DA PALMEIRA Copernicia prunifera

COM BASE EM MODELAGEM DE NICHO ECOLÓGICO

RESUMO – Estudos de modelagem de nicho ecológico são ferramentas importantes para prever

áreas de potencial ocorrência para espécies, auxiliando programas de conservação. Dessa forma,

o objetivo deste trabalho foi estudar a distribuição geográfica da palmeira Copernicia prunifera e

identificar as variáveis ambientais que influenciam na sua distribuição. Através da modelagem de

nicho ecológico (MNE) utilizando o algoritmo de máxima entropia (Maxent) com base em 80

pontos de ocorrência conhecidos, foram gerados mapas preditivos da distribuição potencial da

espécie. A ocorrência potencial da Copernicia prunifera se concentrou nos estados do Ceará, Rio

Grande do Norte, sudoeste de Pernambuco, norte da Bahia e vale do Rio São Francisco, norte e

sudoeste do Piauí e norte do Maranhão. A variável ambiental que mais contribuiu para o modelo

foi a precipitação do trimestre mais seco. Este é o primeiro estudo utilizando a modelagem de

nicho ecológico para prever a distribuição da Copernicia prunifera no Brasil. Tais informações

serão úteis para estudos de filogeografia e distribuição geográfica, contribuindo com informações

para o estabelecimento de estratégias de conservação da espécie.

PALAVRAS-CHAVE: Arecaceae, Caatinga, Carnaúba, Maxent, Predição de habitat.

GEOGRAPHICAL DISTRIBUTION OF THE PALM Copernicia prunifera BASED ON

ECOLOGICAL NICHE MODELING

ABSTRACT – Ecological niche modeling studies are important tools for predicting areas of

potential occurrence for species, supporting conservation programs. Thus, the objective of this

work was to study the geographical distribution of the palm tree Copernicia prunifera known as

carnauba and identify environmental variables that influence on their distribution. Through

ecological niche modeling (MNE) using the Maximo entropy algorithm (Maxent) based on 80

known occurrence points, predictive maps of the potential distribution of the species were

generated. The potential occurrence of Copernicia prunifera was concentrated in the states of

Ceará, Rio Grande do Norte, southwest of Pernambuco, north of Bahia and the valley of the São

Francisco River, north and southwest of Piauí and north of Maranhão. The environmental

variable that contributed most to the model was the precipitation of the driest quarter. This is the

17

first study using ecological niche modeling to predict the distribution of Copernicia prunifera in

Brazil. Such information will be useful for studies of phylogeography and geographic

distribution, contributing with information for the establishment of conservation strategies of the

species.

KEYWORDS: Arecaceae, Caatinga, Carnauba, Maxent, Habitat prediction.

INTRODUÇÃO

O bioma Caatinga ocupa uma área de aproximadamente 844.453 km², que equivale a

cerca de 11% do território brasileiro tornando-se presente nos estados do Maranhão (1%), Piauí

(63%), Ceará (100%), Bahia (54%), Rio Grande do Norte (95%), Paraíba (92%), Pernambuco

(83%), Alagoas (48%), Sergipe (49%) e o norte de Minas Gerais (2%) (MMA, 2011). Diante da

escassez de água, as plantas que integram a Caatinga são xerófilas, espécies que se adaptam a

essas condições (BARBOSA, 2009; MMA, 2011). A precipitação média anual varia entre 240

mm e 1.500 mm, no entanto, grande parte da região recebe menos de 500 mm (PRADO, 2003).

A Caatinga possui um considerável número de espécies endêmicas que devem ser

consideradas como um patrimônio biológico de alto valor (KILL, 2002). São escassos os estudos

na Caatinga que relacionam a ocorrência de espécies florestais com o ambiente como o de Vieira

et al. (2015) em estudo de filogeografia e modelagem de nicho com Ficus bonijesulapensis, uma

espécie endêmica brasileira e restrita de afloramentos de rocha calcária, e o de Rodrigues et al.

(2015) que avaliaram a modelagem de nicho ecológico para as espécies Anadenanthera

colubrina, Aspidosperma pyrifolium e Myracrodruon urundeuva de florestas tropicais secas. Tais

autores tiveram como resultados que as áreas mais adequadas para a ocorrência das espécies em

estudo estão concentradas na região nordeste do Brasil.

Para espécies como Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore (Arecaceae), é importante

conhecer a sua distribuição geográfica e compreender as condições ecológicas que influenciam

na sua distribuição (PRIMACK; RODRIGUES, 2001). Silva et al. (2014), em estudo sobre

distribuição espacial em microescala da Copernicia prunifera, concluíram que os indivíduos

apresentam um padrão de distribuição espacial agregado até 10 metros que pode ser devido a

dispersão restrita ao parental. Segundo os autores, por ser uma espécie bastante utilizada por

extrativistas, foi observado uma diminuição na densidade populacional, sugerindo maior

aleatoriedade entre indivíduos com distâncias maiores a 10 metros do indivíduo focal. Tais fatos

18

podem contribuir para a divergência genética entre populações da espécie, associando-se a

fragmentação das populações, o que pode comprometer a distribuição geográfica da espécie.

Entretanto não há estudos avaliando a distribuição geográfica de Copernicia prunifera em macro-

escala espacial.

A distribuição geográfica potencial de uma espécie se relaciona ao conceito de nicho

ecológico proposto por Hutchinson (1957), no qual uma espécie pode ocorrer quando as

condições ambientais e recursos necessários são adequados para sua sobrevivência. Assim, os

modelos de nicho ecológico (MNE) são cada vez mais utilizados como ferramentas para prever a

distribuição geográfica de espécies (PHILLIPS et al., 2006; ELITH et al., 2010). Tais modelos

baseiam-se nas informações de ocorrências de espécies, como por exemplo de listas florísticas e

de herbários, com dados de variáveis ambientais para identificar ambientes propícios para a

ocorrência e manutenção das populações (PEARSON, 2007). Vários algoritmos têm sido

utilizados para modelagem de nichos ecológicos, como GAM (Generalised Additive Models),

GARP (Genetic Algorithm for Rule Set Production), GLM (Generalised Linear Models), ENFA

(Ecological-Niche Factor Analysis), BIOCLIM (Bioclimatic variables) e Maxent (Maximum

Entropy Modeling) (PHILLIPS et al., 2006).

O modelo de Máxima Entropia (Maxent) tem sido bastante utilizado, por ser de simples

manuseio e apresentar bom desempenho em relação aos outros (ELITH et al., 2006). Este modelo

utiliza dados de variáveis ambientais e dados de presença de espécies, sem nenhuma abordagem

quantitativa. A modelagem é feita através do software Maxent, que organiza as coordenadas

geográficas da espécie estudada em mapas que indicam sua distribuição potencial (PHILIPS et

al., 2006). É crescente o interesse por essa ferramenta, devido a possibilidade de obter

informações consistentes e rápidas para conduzir práticas conservacionistas, contribuindo para a

manutenção da biodiversidade (GIANNINI, 2012).

Estudos de modelagem de nicho auxiliam na previsão dos efeitos da mudança climática

na distribuição das espécies (RODRIGUES et al., 2015), para definir locais favoráveis para

adaptação das espécies visando plantio comercial ou conservação ex-situ (MEDINA et al., 2010),

para prever áreas susceptíveis a espécies invasoras (FABRICANTE et al., 2015), na compreensão

da história evolutiva da espécie, quando associada aos estudos de filogeografia (VIEIRA et al.,

2015),

19

Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a distribuição geográfica da Copernicia

prunifera e identificar as variáveis ambientais que influenciam na sua distribuição, com o intuito

de gerar subsídios para o estabelecimento de estratégias de conservação e manutenção da espécie.

MATERIAL E MÉTODOS

A espécie alvo do estudo é a Copernicia prunifera conhecida popularmente como

carnaúba, nativa do Nordeste brasileiro, representante da família Arecaceae. O extrativismo das

folhas dos carnaubais vem mantendo há várias décadas grande importância econômica no

Nordeste brasileiro, principalmente em períodos de estiagem. A atividade de produção de cera a

partir da palha de carnaúba representa a principal atividade extrativista (D’ALVA, 2007).

A distribuição da Copernicia prunifera ocorre principalmente nos estados do Ceará

(MORO et al., 2011), Piauí (FILHO et al., 2015) e Rio Grande do Norte (SOUSA et al., 2015),

podendo ser encontrada na Paraíba (GUERRA et al., 2012), Bahia, Alagoas, Sergipe, Maranhão,

Pernambuco, Mato Grosso e Tocantins (LEITMAN et al., 2015).

Os registros de ocorrência da Copernicia prunifera foram obtidos através do site Species

Link (http://splink.cria.org.br/), que é um sistema distribuído de informação que integra em

tempo real, dados primários de coleções científicas em ambiente computacional de acesso

gratuito (SPECIES LINK, 2012). Além disso, expedições foram realizadas pelos estados do Rio

Grande do Norte e Ceará. Os MNE foram construídos baseados em 80 pontos de ocorrência para

a palmeira Copernicia prunifera (Anexo 1).

As variáveis climáticas foram obtidas a partir da base de dados Worldclim (HIJMANS et

al., 2005), disponível em: http://www.worldclim.org/bioclim, em uma resolução de 1 km (30

arco-segundos). Foram consideradas no total 19 variáveis ambientais denominadas de ”Bio” na

base de dados (Tabela 1).

Foi utilizado o algoritmo de máxima entropia do software Maxent versão 3.3.3k

(PHILLIPS; DUDIK, 2008) para construção dos modelos de nicho ecológico. O Maxent se baseia

apenas nos dados de presença e variáveis ambientais para gerar modelos de nicho ecológico. O

Maxent calcula o índice AUC (area under the curve of receiver-operator characteristic) para

medir o nível de ajuste do modelo. Dessa forma, os valores da AUC próximos a 1 indicam que o

modelo é de alta precisão em prever a ocorrência da espécie enquanto que valores próximos ou

menores que 0,5 indicam que o modelo não é melhor em prever a ocorrência da espécie

(PHILLIPS et al., 2006).

http://splink.cria.org.br/

20

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O valor da AUC foi de 0,986, considerado alto, próximo a 1,0. O teste AUC foi 0,940

com desvio padrão de 0,026. Resultado semelhante foi encontrado por Vieira et al. (2015) com

Ficus bonijesulapensis, cujo valor da AUC foi 0,991. Visto que o valor máximo que este teste

pode assumir é inferior a 1,0 e que a AUC varia com a amplitude natural do nicho das espécies

(PHILLIPS et al., 2006), os indicadores avaliados sugerem que o modelo é satisfatório na

estimação da distribuição da adequabilidade do habitat potencial da Copernicia prunifera, pois o

valor da AUC foi superior a 0,9, ou seja, a acurácia do modelo foi considerada alta (SWETS,

1988).

A precipitação do trimestre mais seco foi a variável que mais contribuiu para o modelo

(39,4%), seguida da temperatura mínima do mês mais frio (17,5%), temperatura média anual

(12,1%). Estas variáveis têm uma contribuição mais forte (69%) do que as demais (Tabela 1).

Rodrigues et al. (2015) em estudo de modelagem de nicho ecológico para as espécies

Anadenanthera colubrina, Aspidosperma pyrifolium e Myracrodruon urundeuva de florestas

tropicais secas a variável “Precipitação do trimestre mais seco” teve pouca participação na

modelagem de nicho com 1,2% de contribuição, diferindo do presente trabalho.

Os modelos sugerem que são adequados para Copernicia prunifera os locais com variação

nas precipitações no trimestre mais seco (bio17), sugerindo que a espécie se adaptada bem a

ambientes estressantes quanto ao déficit hídrico temporal. De fato, indivíduos de Copernicia

prunifera podem ser encontrados nos vales de rios sazonais nordestinos, nos tabuleiros litorâneos

e em áreas alagadas intermitentes, demonstrando resistência tanto à ausência prolongada de água

como à inundação (D’ALVA, 2007).

A distribuição da adequabilidade do habitat da Copernicia prunifera desenvolvido com o

Maxent é mostrado no mapa da Figura 1. A imagem usa cores para indicar a probabilidade de que

as condições do ambiente são adequadas para a ocorrência da espécie.

21

Figura 1. Representação da adequabilidade do habitat de Copernicia prunifera no Brasil com

base em Maxent. Cores quentes (amarelo ao vermelho) representam valores maiores de

probabilidade e cores frias (verde a azul) menores valores de probabilidade de potencial de

ocorrência do nicho ecológico da espécie. Quadros brancos representam os registros de presença

usados para treinamento e quadros roxos para testes.

A ocorrência potencial da Copernicia prunifera se concentrou na região Nordeste, com

baixa probabilidade de ocorrência nas regiões centro-oeste e norte do Brasil. Na região nordeste,

as condições ambientais adequadas e consideradas como altamente provável para a ocorrência de

Copernicia prunifera é predominante nos estados do Ceará, Rio Grande do Norte, sudoeste de

22

Pernambuco, norte da Bahia e vale do Rio São Francisco, norte e sudoeste do Piauí e norte do

Maranhão. Dessa forma, essas áreas podem ser consideradas prioritárias para conservação da

espécie.

O modelo de distribuição da Copernicia prunifera foi similar à distribuição conhecida da

espécie em regiões da Caatinga e Cerrado (LEITMAN et al., 2015). Todavia, a região norte do

estado de Roraima também se mostrou com condições típicas dos locais de ocorrência da espécie.

A vegetação norte do estado de Roraima é caracterizada por savanas, com espécies adaptadas

para resistir ao estresse hídrico causado tanto pela falta de água no período seco, quanto pelo

excesso de água no período chuvoso (BARBOSA; MIRANDA, 2005; BARBOSA et al., 2007).

Há também a presença buritizais (Mauritia flexuosa L.) que acompanham pequenos cursos

d’agua (BARBOSA; MIRANDA, 2005). Segundo Leitman et al. (2015) a Copernicia prunifera

também pode ser encontrada no estado do Tocantins.

O presente estudo não avaliou os aspectos biológicos da espécie e as características do

solo, porém, são fatores importantes na ocupação potencial das espécies de plantas em relação às

mudanças climáticas, conforme estabelece Colombo e Joly (2010). Segundo Peterson et al.

(2001), a espécie pode dispersar, aclimatar, adaptar-se ou extinguir-se em resposta às alterações

climáticas. Sendo assim, torna-se necessários estudos complementares, como filogeografia das

populações naturais da Copernicia prunifera, para compreensão da história evolutiva e dos

padrões de dispersão geográfica, além de prever possíveis consequências frente às alterações

climáticas e gerar implicações para a conservação das populações naturais.

CONCLUSÕES

Os resultados obtidos sugerem, com base no modelo de nicho ecológico (MNE), que a

distribuição geográfica potencial para a ocorrência da Copernicia prunifera se concentra na

região nordeste do Brasil. A variável ambiental que mais contribui com o MNE foi a precipitação

do trimestre mais seco (bio17), sugerindo que Copernicia prunifera se adaptada bem a ambientes

estressantes ao déficit hídrico sazonal.

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo auxílio

financeiro concedido, processo de n° 471099/2012-0. À Coordenação de Aperfeiçoamento de

Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa de estudo (Mestrado).

23

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Tabela 1. Variáveis utilizadas na modelação da área de distribuição potencial de Copernicia

prunifera e sua contribuição percentual utilizadas na construção do modelo com Maxent. Fonte:

WorldClim (2016).

Variáveis Contribuição percentual

bio17: Precipitação do trimestre mais seco (mm) 39,4

bio6: Temperatura mínima do mês mais frio (°C) 17,5

bio1: Temperatura média anual (ºC) 12,1

bio12: Precipitação anual (mm) 9,4

bio9: Temperatura média do trimestre mais seco (°C) 3,4

bio4: Sazonalidade da temperatura (desvio padrão *100) 3,2

bio18: Precipitação do trimestre mais quente (mm) 2,8

bio11: Temperatura média do trimestre mais frio (°C) 2,2

bio3: Isotermalidade (bio2/bio7) (*100) 1,9

bio2: Amplitude diurna média (ºC) 1,8

bio8: Temperatura média do trimestre mais úmido (°C) 1,5

bio5: Temperatura máxima do mês mais quente (°C) 1,3

bio7: Amplitude térmica anual (BIO5-BIO6) (°C) 1,1

bio19: Precipitação do trimestre mais frio (mm) 1

bio10: Temperatura média do trimestre mais quente (°C) 0,5

bio14: Precipitação do mês mais seco (mm) 0,3

bio15: Sazonalidade da precipitação (coeficiente de variação) 0,3

bio13: Precipitação do mês mais úmido (mm) 0,1

bio16: Precipitação do trimestre mais úmido (mm) 0

27

Anexo 1 - Localização geográfica das populações de Copernicia prunifera, coordenada

geográfica e Estado de ocorrência (SPECIES LINK, 2012).

Espécie Longitude Latitude Estado

1 Copernicia prunifera -43,233 -11,683 Bahia















16 Copernicia prunifera -38,998 -7,701 Ceará












28

28 Copernicia prunifera -42,800 -2,750 Maranhão

29 Copernicia prunifera -44,054 -2,473 Maranhão

30 Copernicia prunifera -51,750 -11,283 Mato Grosso

31 Copernicia prunifera -50,669 -11,222 Mato Grosso

32 Copernicia prunifera -35,333 -7,329 Paraíba






38 Copernicia prunifera -40,674 -9,459 Pernambuco














52 Copernicia prunifera -42,131 -7,025 Piauí






29







64 Copernicia prunifera -38,255 -6,371 Rio Grande do Norte











75 Copernicia prunifera -35,461 6,209 Rio Grande do Norte






30

Capítulo 2: GENETIC DIVERSITY OF Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore

(ARECACEAE): IMPLICATIONS FOR CONSERVATION

ABSTRACT - The palm tree Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore is a natural resource that

suffers intense exploitation as it is economically important in extractive communities. The

objective of this study was analyze the genetic diversity among natural populations of Copernicia

prunifera. We sampled 180 individuals distributed across 11 natural populations in the states of

Rio Grande do Norte and Ceará, Brazil. Seven ISSR primers were used, providing 100 loci with

99.09% polymorphism. The polymorphic information content (PIC) of each primer is considered

to be moderately informative. Nei’s genetic diversity (He) ranged from 0.071 to 0.288 and the

Shannon Index (Ho) ranged from 0.103 to 0.418. The results from AMOVA indicate greater

genetic variation within populations (58.11%) than among populations (41.89%). Mantel’s test

revealed positive and significant correlation (r = 0.423; P = 0.006) between genetic and

geographic distances, suggesting isolation by distance. The greatest value for gene flow occurred

between the populations AR1 and AR2 (Nm = 29), which is consistent with the dendrogram

(UPGMA) of Nei's genetic identity, indicating genetic similarity between these two populations.

According to a Bayesian analysis, genotypes can be divided into three distinct groups (K = 3).

Only populations AR2 and SMG show balance between mutation and drift, while the others

present evidence of genetic bottleneck. Thus, conservation of Copernicia prunifera populations is

necessary to minimize the loss of important alleles and contribute to the maintenance of the

species.

KEYWORDS: Bottleneck; Carnauba; Genetic differentiation; ISSR; Palms.

INTRODUCTION

Indiscriminate exploitation of natural forest resources has significantly decreased the size

of natural populations, resulting in fragmented areas and population isolation (COTA et al., 2011;

MELO JÚNIOR et al., 2012). Furthermore, fragmentation can significantly limit the movement

of animals, pollen, and seeds, making the remaining populations susceptible to changes in gene

pool patterns, which can change the genetic structure of populations (FUCHS; HAMRICK,

2010). The reduced size of natural areas and fragmentation may also lead to a loss of the genetic

31

diversity contained within and among populations (YOUNG et al., 1996). Previous studies have

demonstrated the impact of population reduction on genetic diversity in natural populations

(GAIERO et al., 2011; SANTOS et al., 2015).

As such, studies of genetic structure and diversity in natural populations are needed to

understand how diversity is distributed, and the factors that affect this distribution, as well as to

quantify and evaluate the genetic diversity distributed between and within populations (NYBOM;

BARTISH, 2000). Factors that may influence the distribution of genetic diversity include the

effective population size (JABEEN et al., 2015), geographical occurrence of the species

(SANTOS et al., 2015), and reproduction mode and breeding systems (ABREU et al., 2012).

Gene flow (SILVA et al., 2011) also has an impact on genetic diversity, which is influenced not

only by the ability of dispersers and pollinators to reach other populations, but also by

geographical barriers that may exist between populations (BAWA, 1992).

Studies of genetic diversity are useful in defining conservation strategies and developing

management and genetic improvement programs for a species (LOUSADA et al., 2011;

BRANDÃO et al., 2015; DUARTE et al., 2015). To estimate genetic diversity, the use of

molecular markers based on the amplification of the DNA sequence is necessary, providing a

useful tool to study genetic structure and diversity between individuals (CHAGAS et al., 2015)

and within and between populations (SANTOS et al., 2015). Although several genetic studies of

palm tree populations have been published (LOUSADA et al., 2011; GAIERO et al., 2011;

SILVA et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2012; SHAPCOTT et al., 2012), few studies use ISSR

(inter-simple sequence repeat) markers for palm tree species. Using ISSR markers is a quick and

simple method to effectively analyze the genetic diversity of natural populations: such markers

generate a large number of polymorphic bands; the method does not require prior information of

the genome; and it is low cost. Although ISSR markers cannot differentiate heterozygous from

homozygous individuals as they are dominant markers, analyzes multiple loci on a single reaction

(REDDY et al., 2002; WOLFE, 2005).

For species that have undergone extensive exploitation and are located in fragmented

areas, such as the palm Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore, greater genetic diversity is

expected between populations than within populations (GITZENDANNER; SOLTIS, 2000). In

addition, due to the impacts of anthropogenic activities on Copernicia prunifera populations,

genetic bottlenecks are expected to occur in natural populations (TANG et al., 2014). Thus, the

32

objective of this study is to analyze the genetic diversity among natural populations of

Copernicia prunifera to provide information that may be useful in defining strategies for the

maintenance and conservation of the species.

MATERIAL AND METHODS

Target species

Copernicia prunifera, commonly known as carnauba, is native to the semi-arid region in

northeastern Brazil. Copernicia prunifera individuals can be found in river valleys and in flooded

areas, where they generally form monodominant populations known as carnaubais. The species is

highly resistant to the prolonged absence of water and permanent floods (D'ALVA, 2007). The

main product extracted from the species is a wax produced from the leaves which is used in

cosmetics, pharmaceutical capsules, electronics, food products, polishing waxes, and coatings

(CAVALCANTE; DINIZ, 2005; SILVA et al., 2009).

The species presents multiple inflorescences, which are made up of yellowish,

hermaphroditic flowers (SILVA et al., 2014a). The flowers are composed of three sepals, three

petals, six stamen, and three carpels. The species is pollinated by insects like the irapuá bee

(Trigona spinipes Fabricius) and the maribondo-caboclo wasp (Polistes canadensis Linnaeus)

(SILVA, 2014a); the likely dispersers of the fruits are the Palm Tanager (sanhaçu-do-coqueiro;

Tangara palmarum Wied) (SILVA et al., 2014a) and bats (SOUSA et al., 2015).

33

Study locations and sampling

The study was conducted in 11 natural populations of Copernicia prunifera located in Rio

Grande do Norte and Ceará States, Brazil (Figure 1), from which 180 individuals were sampled

(Table 1).

Figure 1. Geographic location of the sampled populations of Copernicia prunifera in Rio Grande

do Norte and Ceará States, Brazil.

Target species (Copernicia prunifera)

34

The populations SER and LGP are the closest geographically, with a distance of 4.6 km,

and LGP and AR1 are separated by the greatest distance, at 310.4 km.

Table 1. Location of sampled Copernicia prunifera populations, population code, geographic

coordinates, number of individuals, and region of occurrence. RN - Rio Grande do Norte; CE –

Ceará.

Population/State Code Latitude/longitude N Region

Lagoa de Pedras (RN) LGP 6°12’ S/35°27’ W 15 Mesoregion of Agreste potiguar

Serrinha (RN) SER 6°14’ S/35°29’ W 15 Mesoregion of Agreste potiguar

Macaíba (RN) MAC 5º59’ S/35º30’ W 15 Mesoregion of east potiguar

São Miguel do Gostoso (RN) SMG 5°07’ S/35°41’ W 18 Mesoregion of east potiguar

Jucurutu (RN) JUC 6º04’ S/37º03’ W 12 Mesoregion of west potiguar

Apodi (RN) APD 5°43' S/37°44' W 12 Mesoregion of west potiguar

Mossoró (RN) MOS 5°11' S/37°18' W 22 Mesoregion of west potiguar

Icapuí (CE) ICA 4º46’ S/37º17’ W 14 Mesoregion of Jaguaribe

Aracati 1 (CE) AR1 4º34’ S/37º44’ W 22 Mesoregion of Jaguaribe

Aracati 2 (CE) AR2 4º51’ S/37º27’ W 11 Mesoregion of Jaguaribe

Russas (CE) RUS 4°55' S/37°54' W 24 Mesoregion of Jaguaribe

Sampling ranged from 11 to 24 individuals per population, which is consistent with other

studies on palm tree genetic diversity using ISSR markers (GAIEIRO et al., 2011; ROSSI et al.,

2014; SANTOS et al., 2015). Leaf samples were placed in plastic tubes containing 2 mL CTAB

2X (cationic hexadecyl trimethylammonium bromide), labelled, and stored in a freezer -20°C

until DNA extraction.

DNA extraction, PCR, and Electrophoresis

DNA extraction was performed using the CTAB method, as described by Doyle and

Doyle (1987). We tested 29 ISSR primers and selected seven that best amplified the DNA of

Copernicia prunifera. For polymerase chain reaction (PCR), the Veriti automatic thermocycler

was used in a volume of 12 μL containing genomic DNA. The PCR mix was composed of buffer

(10x), BSA (1.0 mg.mL-1), MgCl2 (50 mM), dNTP (2.5 mM), primer (2 μM), Taq polymerase

(5.0 U.μL), DNA (diluted 1:50), ISSR primer (2 µM), and ultrapure water. The reaction sequence

consisted of denaturation at 94 °C for 2 min followed by 37 cycles of amplification at 94 °C for

15 seconds, 47 °C for 30 seconds, and 72 °C for 1 min. The process was completed with a final

step at 72 °C for 7 min and then cooled to 4 °C. The products generated from the amplification

35

were subjected to 1.5% (p/v) agarose gel electrophoresis, stained with GelRed™ in 1 X TAE

(Tris-Acetate-EDTA) buffer using a horizontal vessel at a voltage of 100 V, for two and a half

hours. The 1 kb molecular weight size marker (Ladder) was used. Subsequently, the gels were

photographed in ultraviolet light using the E-Box VX2.

Statistical analyses

PIC value

Polymorphic information content (PIC) was calculated to test the ability of the ISSR

primers to distinguish polymorphism between individuals, with the absence or presence of bands

as indicators. According to Botstein et al. (1980), molecular markers with values lower than 0.25

are classified as being slightly informative, values ranging between 0.25 to 0.5 are reasonably

informative, and PIC values above 0.5 are satisfactory. For the calculation, we used the formula

proposed by Anderson et al. (1993): PICi = 1 − ∑ Pij2n

j=1 , where Pij is the frequency of allele "j"

in marker "i".

Genetic diversity

For analysis of genetic diversity parameters, we used the POPGENE program version 1.3

(YEH et al., 1997) to assess the total number of alleles observed (Na), number of effective alleles

(Ne), Nei's genetic diversity (He), and Shannon index (I) for each population. The genetic

distance obtained using POPGENE was classified into three classes based on Nei (1978): low,

when the distance is less than < 0.05; average, between 0.05 and 0.15; and high, when > 0.15. To

compare the values of Nei’s genetic diversity and Shannon index between populations, analysis

of variance (ANOVA) was conducted using the program Assistat 7.7 (SILVA, 2016), with

averages subjected to the Tukey test at 5% probability.

Genetic population structure

We used the program ALERQUIN 3.1 (EXCOFFIER et al., 2007) for the Analysis of

Molecular Variance (AMOVA) of the studied populations. Mantel’s test was performed using the

PC-Ord 4.14 program (MCCUNE; MEFFORD, 1999), resampled using the Monte Carlo method

(1000 permutations), to verify the existence of a correlation between Nei’s genetic distance

(1978) and geographic distance. The NTSYS program (ROHLF, 1993) was used to produce a

dendrogram of UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic mean) to simplify the

36

genetic identity of Nei’s (1978) obtained with the POPGENE program. For principal component

analysis (PCA), we used the GenAlEx program based on Nei’s genetic distance (PEAKALL;

SMOUSE, 2006). Historical gene flow (Nm) was calculated with the formula: Nm = 0.5 (1 -

GST) / GST (MCDERMOTT; MCDONALD, 1993), where GST is Nei’s genetic distance.

Bayesian analysis

Bayesian analysis was performed using the program Structure v.2.2 (PRITCHARD, 2002)

to infer the number of genetic groups (K) that represent the sampled populations. Ten

independent runs for each K (ranging from 1 to 13) were conducted, with the estimates of K

based on the model of mixed ancestry (admixture) and the frequency of correlated alleles. Each

run was comprised of 250.000 simulations via Markov Chain Monte Carlo (MCMC) and a burn-

in of 500.000 iterations. The number of K populations was identified according to the method ∆K

(EVANNO et al., 2005), as implemented in the Structure Harvester program (EARL;

VONHOLDT, 2012).

Detection of genetic bottlenecks

Recent reductions in effective population size were analyzed using the Bottleneck

program version 1.2 (CORNUET; LUIKART, 1996). The Infinite Allele Model (IAM) and

Stepwise Mutation Model (SMM), based on Kimura and Crow (1964) and Kimura and Otha

(1978), respectively, were used to infer the presence of genetic bottlenecks. The mutation model

of the ISSR loci is intermediary between IAM and SMM (LUIKART et al., 1998), thus we use

both models. Signal test was applied (α = 0.05) based on the frequency of alleles to determine the

existence of recent significant genetic bottlenecks (CORNUET; LUIKART, 1996).

37

RESULTS

Genetic polymorphism

The seven selected primers provided 100 loci with 99.09% polymorphism. The number of

loci per primer varied from 13 to 18 with an average of 14.4 (Table 2).

Table 2. Nucleotide sequence of ISSR primers, number of loci, and PIC value of each primer.

ISSR primers Sequence (5’ – 3’) Number of Loci PIC

UBC 825 (AC)8-T ACACACACACACACACT 14 0.424

UBC 841 (GA)8-YC GAGAGAGAGAGAGAGAYC 18 0.446

UBC 857 (AC)8-YG ACACACACACACACACYG 14 0.405

UBC 873 (GACA)4 GACAGACAGACAGACA 15 0.431

UBC 880 (GGAGA)3 GGAGAGGAGAGGAGA 13 0.411

UBC 881 (GGGTG)3 GGGTGGGGTGGGGTG 14 0.339

M1 CAA (GA)5 CAAGAGAGAGAGA 13 0.422

Average 14.4 0.418

R = purine (A or G); Y = pyrimidine (C or T); PIC = Polymorphic information content

The PIC of each primer used varied from 0.339 to 0.446, with an average of 0.418. The

profile of the loci using UBC primer 857 is shown in Figure 2.

Figure 2. Pattern of ISSR amplification fragments resulting from UBC primer 880 for 12

Copernicia prunifera individuals from the Apodi population, Rio Grande do Norte. L = Ladder 1

kb.

38

Genetic diversity

The percentage of polymorphic loci of the populations ranged from 16.83% in SER to

79.21% in SMG. Nei’s genetic diversity (He) for all populations was 0.356 and the Shannon

index (Ho) was 0.529 (Table 3).

Table 3. Genetic diversity parameters of Copernicia prunifera natural populations.

Code L / %P Na Ne He I

LGP (RN) 49/48.51 1.485±0.130 1.353±0.099 0.201±0.055abc 0.293±0.079abc

SER (RN) 17/16.83 1.168±0.097 1.125±0.074 0.071±0.041d 0.103±0.059d

MAC (RN) 46/45.54 1.455±0.129 1.322±0.100 0.182±0.054bc 0.267±0.077bc

SMG (RN) 80/79.21 1.792±0.095 1.490±0.090 0.280±0.045a 0.416±0.062a

JUC (RN) 37/36.63 1.366±0.139 1.245±0.104 0.140±0.057cd 0.205±0.082cd

APD (RN) 35/34.65 1.346±0.138 1.187±0.089 0.113±0.050cd 0.171±0.073cd

MOS (RN) 72/71.29 1.713±0.096 1.518±0.084 0.288±0.044a 0.418±0.062a

ICA (CE) 73/72.28 1.723±0.120 1.509±0.108 0.282±0.055a 0.411±0.077a

AR1 (CE) 74/73.27 1.733±0.095 1.475±0.082 0.270±0.042ab 0.400±0.059a

AR2 (CE) 63/62.38 1.624±0.146 1.407±0.117 0.232±0.063ab 0.342±0.088ab

RUS (CE) 70/69.31 1.693±0.094 1.495±0.079 0.280±0.041a 0.408±0.059a

Total 100 / 99.09 1.990±0.007 1.613±0.022 0.356±0.030 0.529±0.012

Polymorphic locus (L), percentage of polymorphic loci (% P), number of alleles observed (Na),

number of effective alleles (Ne), Nei’s index (He), Shannon index (I). The values represent the

mean ± standard error. Data followed by the same letter do not differ statistically at the 5%

confidence level based on the Tukey test.

In Rio Grande do Norte State, the populations MOS and SMG obtained the highest

percentage of polymorphic loci, at 71.29% and 79.21%, respectively. LGP, SMG, and MOS

populations differed statistically from the others, presenting higher values of Nei’s genetic

diversity. In Ceará State, Nei’s genetic diversity indexes (He) did not vary statistically among the

four populations. The results of the Shannon index show (I) that the LGP, SMG, MOS, ICA,

AR1, AR2, and RUS populations have higher values and differ statistically from the others.

According to the matrix of genetic distance and geographic distance (Table 4), we found the

39

greatest genetic distance between SMG and SER (0.581). The populations with the lowest genetic

distance were AR1 and AR2 (0.017). The mean genetic distance was 0.261.

Table 4. Estimates of genetic distance (Nei, 1978) below the diagonal, and geographic distance

(km) above the diagonal, between populations of Copernicia prunifera. Minimum and maximum

values are shown in bold.

LGP SER MAC SMG JUC APD MOS ICA AR1 AR2 RUS

LGP 0 4.6 25.5 124.2 176.8 258.3 233.8 257.43 310.4 266.5 306.9

SER 0.180 0 28.4 127.4 174.5 256.5 233.2 257.64 310.3 266.3 306.2

MAC 0.247 0.410 0 98.9 171.5 249.5 218.4 238.8 292.4 249.2 291.7

SMG 0.487 0.581 0.388 0 185.1 238.3 180.8 181.61 235.1 198.4 248.4

JUC 0.284 0.287 0.246 0.254 0 85.4 100.8 146.04 182 140.4 158.6

APD 0.316 0.396 0.274 0.229 0.134 0 75.7 117.42 127.7 100.4 90.7

MOS 0.270 0.272 0.323 0.135 0.175 0.134 0 47.26 83.4 39.9 73.3

ICA 0.301 0.337 0.315 0.110 0.233 0.226 0.122 0 54.38 21.73 71.97

AR1 0.256 0.301 0.249 0.148 0.124 0.072 0.064 0.117 0 44.8 43.9

AR2 0.265 0.289 0.277 0.133 0.104 0.084 0.064 0.102 0.017 0 51.4

RUS 0.238 0.248 0.260 0.147 0.117 0.096 0.035 0.124 0.053 0.048 0

Population genetic structure

The analysis of molecular variance (AMOVA) indicates that there is greater genetic

variation occurring among individuals within populations (58.11%) than between populations

(41.89%) (Table 5).

Table 5. Analysis of molecular variance (AMOVA) between and within Copernicia prunifera

populations.

Source of variation d.f Sum of

squares

Variance

components % of variance P

Between populations 10 544.438 3.08671 41.89 < 0.0001

Within populations 169 723.556 4.28140 58.11

Total 204 1033.073 5.25500

Fixation Index Fst: 0.419

d.f. = degrees of freedom.

40

The Mantel test revealed the existence of a positive and significant correlation (r = 0.423;

P = 0.006) between the genetic and geographic distances between populations (Figure 3).

Figure 3. Relationship between the genetic and geographic distances of Copernicia prunifera

populations.

According to the dendrogram, the results show that populations located in geographical

proximity to each other tend to have greater genetic similarity. We identified two groups (Figure

4): the first group consists of AR1, AR2, RUS, MOS, APD, JUC, ICA, SMG, and MAC, with

MAC being the most divergent of the group; the second group consists of LGP and SER. We

note that the greatest genotypic similarity between populations occurred between AR1 and AR2,

followed by RUS and MOS.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 50 100 150 200 250 300 350

Geographic distance (km)

Gen

etic

dis

tance

fro

m N

eir= 0.423

P= 0.0060.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

41

Nei’s genetic identity

Figure 4. UPGMA dendrogram based on Nei’s genetic identity between the 11 studied

Copernicia prunifera populations.

The highest level of historical gene flow (Nm) was 29 between AR1 and AR2, and the

lowest level of gene flow was 0.4 between SER and SMG populations (Table 6). This result

corroborates the genetic distance matrix, in which SER and SMG had the highest value and AR1

and AR2 had the lowest (Table 4).

Table 6. Matrix of historical gene flow values among pairs of Copernicia prunifera populations.

Minimum and maximum values are shown in bold.

LGP SER MAC SMG JUC APD MOS ICA AR1 AR2 RUS

LGP

SER 2.3

MAC 1.5 0.7

SMG 0.5 0.4 0.8

JUC 1.2 1.2 1.5 1.5

APD 1.1 0.7 1.3 1.7 3.2

MOS 1.3 1.3 1.0 3.2 2.4 3.2

ICA 1.2 1.0 1.1 4.0 1.6 1.7 3.6

AR1 1.4 1.2 1.5 2.8 3.5 6.4 7.3 3.7

AR2 1.4 1.2 1.3 3.2 4.3 5.4 7.2 4.4 29.0

RUS 1.6 1.5 1.4 2.9 3.7 4.7 13.7 3.5 8.9 9.8

42

PCA revealed that the first and second principal components accounted for the majority of

total diversity (PC 1 = 47.73%; PC 2 = 14.66%) (Figure 5).

Figure 5. Principal component analysis of the studied Copernicia prunifera populations, based

on Nei’s genetic distance.

LGP

SER

MAC

SMGJUCAPD

MOSICA

AR1AR2

RUS

Axis

2

Axis 1

43

Bayesian analysis

The results obtained by Bayesian analysis using the method described by Evanno et al.

(2005) suggest the existence of three genetic groups (K = 3) (Figure 6).

Figure 6. Plot of the mean values of LnP (D) of the Bayesian analysis (solid line) and ΔK

analysis (dotted line). The bars indicate standard deviations of LnP (D) values.

We found that the 11 sampled populations can be structured into three distinct groups

(Figure 7): the first group is formed by LGP, SER, and MAC; the second by ICA and SMG; and

the third is formed by JUC, APD, MOS, AR1, AR2, and RUS.

Figure 7. Bayesian analysis of Copernicia prunifera with the proportion of genotypes in the

sampled populations. The dark vertical lines delimit populations.

K = 3

44

Genetic bottleneck testing

Most of the studied populations present a significant genetic bottleneck (Table 7).

Table 7. Tests of equilibrium between mutation and genetic drift for the studied Copernicia

prunifera populations based on IAM and SMM models.

IAM SMM

Population n Hd/He P n Hd/He P

LGP 47.72 54/47 0.483 57.55 54/47* 0.022

SER 47.85 84/17 0.000** 56.48 84/17 0.000**

MAC 47.94 63/38 0.029* 56.63 63/38 0.000**

SMG 51.36 43/58 0.110 50.80 49/52 0.445

JUC 42.51 69/32 0.020* 53.47 71/30 0.000**

APD 42.40 76/25 0.000** 53.44 78/23 0.000**

MOS 43.95 36/65 0.000** 53.16 41/60 0.102

ICA 46.26 43/58 0.012* 57.44 45/56 0.423

AR1 44.15 40/61 0.000** 53.42 42/59 0.155

AR2 40.42 55/46 0.151 50.76 57/44 0.106

RUS 45.58 35/66 0.000** 48.92 35/66 0.000**

n = expected number of loci with excess heterozygosity under the respective model; Hd / He =

number of loci with a deficit of heterozygosity / excess of heterozygosity; P = probability; * and

** = significant at 5% and 1% probability, respectively.

For SER, MAC, JUC, APD, and RUS, the signal test revealed a highly significant deficit

in heterozygosity under both IAM and SMM models, thus demonstrating the occurrence of

population bottlenecks. MOS, ICA, and AR1 populations show a significant bottleneck based on

the IAM model and only the LGP population showed a significant genetic bottleneck based on

the SMM model. The populations AR2 and SMG show equilibrium between mutation and drift.

45

DISCUSSION

PIC value

The polymorphic information content determines the effectiveness of molecular markers

in detecting polymorphism between individuals. From this we can infer the genetic diversity of a

population (RESENDE et al., 2009). Thus, according to Botstein et al. (1980), all the PIC values

found in the present study are classified as moderately informative, with values ranging from

0.339 to 0.446. Tiwari et al. (2015) and Vieira et al. (2015), using ISSR primers, found PIC

values ranging from 0.240 to 0.390 and 0.057 to 0.444, respectively. Thus, the values obtained in

the current study are comparable to previous studies.

Genetic diversity

We found a high percentage of polymorphic loci, which demonstrates that the ISSR

primers are effective in identifying the genetic diversity of the studied Copernicia prunifera

populations. In a study on Butia Becc. (Arecaceae) using ISSR primers, Gaiero et al. (2011)

found similar results to those reported herein with a percentage of polymorphic loci of 96%. The

results for Nei’s genetic diversity and Shannon index were also similar to those found in other

studies of palm trees using ISSR primers. Rossi et al. (2014), evaluating the distribution of

genetic diversity in natural populations of Mauritia flexuosa L. f. (Arecaceae), obtained Nei’s

index values ranging from 0.185 to 0.238. While Santos et al. (2015), in a study of the genetic

structure of Attalea vitrivir Zona (Arecaceae), found Nei’s genetic diversity index ranging from

0.259 to 0.340 and Shannon index ranging from 0.377 to 0.516, results that are slightly higher

than the present study. Furthermore, Chagas et al. (2015), studying a population of Elaeis

guineensis Jacq (Arecaceae), obtained a Shannon index value of 0.285. Most populations showed

lower genetic diversity for long-lived perennial species (0.250) (NYBOM, 2004).

Populations occurring in the northern region of the species geographic distribution,

particularly in the Jaguaribe mesoregion, present higher values of genetic diversity that differ

statistically from the others. We note that the highest level of gene flow occurs in this region,

which may have contributed to greater diversity in the populations of AR1, AR2, RUS, ICA, and

MOS. Thus, there is a clear need for further phylogeographic studies in order to determine if the

Jaguaribe mesoregion has a diverse lineage, and is thus a probable center of origin, or if it is a

center of genetic diversity. The low rates of genetic diversity found in some populations may

reflect anthropogenic pressures on Copernicia prunifera populations as shown by the presence of

46

genetic bottlenecks (Table 7). A decrease in effective population size may cause a decrease in

gene flow and favor a reduction in genetic diversity in populations (DEFAVARI et al., 2009).

Population genetic structure

According to AMOVA, greater genetic variation occurred among individuals within

populations than between populations. Other studies on palm trees show similar results, with

greater genetic variation occurring among individuals within populations (ROSSI et al., 2014;

SANTOS et al., 2015). However, in the present study genetic differentiation among populations

was high (Fst = 0.419), suggesting limited gene flow among populations, which may be related to

the large geographical distances between populations. According to Lee et al. (2002), historical

events and recent evolutionary processes may influence the genetic diversity maintained between

and within populations.

Thus, isolated populations with limited gene flow tend to have high levels of population

genetic differentiation, as found in the current study (TANG et al., 2014). In a study by Cardoso

et al. (2000) on the palm Euterpe edulis Mart., their results show 42.6% diversity among

populations and 57.4% within populations. The authors suggest that the observed genetic

divergence could be due to forest fragmentation. The results obtained by Cardoso et al. (2000) are

similar to those found herein, in which extractive exploitation of Copernicia prunifera

populations leads to fragmentation, which can result in the reduction of genetic diversity within

populations.

The Mantel test confirms the genetic divergence between the populations, suggesting that

there is isolation by distance between the sampled populations. Similar results were also found by

Gaiero et al. (2011) for Butia using ISSR primers. Silva et al. (2014b) suggest that Copernicia

prunifera individuals present an aggregate spatial distribution pattern up to 10 meters which may

be related to restricted seed and pollen dispersal. In addition, this result corroborates the genetic

distance between populations, with an average of 0.260, which is high according to Nei (1978).

This high level of divergence may be due to population fragmentation, extensive exploitation of

the species, and restricted range of pollinators and dispersers, leading to low levels of gene flow

among populations.

We found the greatest genetic similarities between populations AR1 and AR2, and RUS

and MOS, which are located near to each other geographically. In addition, this similarity can be

47

explained by the high values of gene flow Nm = 29 and 13.7, respectively (Table 6). The MAC

population was genetically isolated from the others, therefore its genetic divergence should be

considered when developing breeding programs. Despite the large geographic distance between

the ICA and SMG populations, they are grouped within the dendrogram. This grouping can be

related to the location of the populations near to the coast where the surrounding vegetation may

contribute to gene flow of the species. The results of the UPGMA dendrogram are similar to the

clusters generated by PCA based on Nei’s genetic distance.

According to Wang (2004), Nm values between 1.0 and 10 migrants per generation

among populations, can prevent differentiation due to genetic drift. Gene flow values greater than

4.0 migrants per generation may avoid the impacts of breeding among related individuals, which

can occur within populations (SLATKIN, 1987). In the current study, low historical gene flow

was found among the studied populations, with an average of 2.7. This result may be due to the

geographical distances between populations (average of 160.7 km). Other factors that may

contribute to low levels of gene flow is the efficiency of dispersers and pollinators in reaching

other populations, and geographical barriers between populations (BAWA, 1992). Rossi et al.

(2014) evaluated the distribution of genetic diversity in populations of the Mauritia flexuosa palm

and observed higher levels of gene flow than our study. This difference may be due to the

significantly shorter geographic distance between their studied populations (an average of 40

km), than in the present study.

Bayesian analysis revealed that Copernicia prunifera genotypes in the 11 analyzed natural

populations belong to three distinct groups (K = 3). Populations in similar geographic regions

share genotypes, such as the populations in the western mesoregion (JUC, APD, and MOS) and

the Jaguaripe mesoregion (AR1, AR2, and RUS), as well as the populations in the Agreste

potiguar (LGP and SER). The ICA and SMG populations share genotypes despite the large

geographical distance between them, as is also shown in the UPGMA dendrogram. All other

populations show limited genetic structure with higher allele frequencies. The groups formed

show a similar pattern to those identified by the UPGMA and PCA, based on Nei’s genetic

identity and distance.

48

Genetic bottleneck

In light of the high genetic divergence between the Copernicia prunifera populations and

the fragmentation of the areas sampled in this study, it is important to identify populations that

have undergone population decline, so as to understand the risks of possible local extinction due

to reduced population size (LEE et al., 2002). Most of the populations showed a genetic

bottleneck, which is possibly due to the significant anthropogenic pressures in these areas.

Although the SMG population indicates equilibrium between mutation and drift, it is affected by

extensive anthropization due to the development of wind power plants and the occurrence of

fires, which can result in future genetic bottlenecks.

The reductions in Copernicia prunifera population size found in the present study may be

the result of intense exploitation of the species, due to its wide range of uses in industry and

commerce (ARRUDA; CALBO, 2004), which has compromised the genetic diversity of these

populations. In a study by Chagas et al. (2015) on Elaeis guineenses Jacq. (Arecaceae), the

authors suggest that reductions in the species’ population size could be due to local agricultural

activities and the loss of habitats. According to Defavari et al. (2009), a reduction in effective

population size may lead to a reduction in gene flow, reducing the number of alleles, and

favoring the loss of genetic diversity within populations.

IMPLICATIONS FOR CONSERVATION

Based on the results of the present study, we can infer that the studied populations are

losing genetic diversity within their populations. This can be observed through the high genetic

divergence between populations, suggesting geographic isolation and limited gene flow, possibly

due to anthropogenic factors that have reduced population sizes. Thus, conservation measures for

natural populations of Copernicia prunifera are necessary in order to minimize the loss of

important alleles, which may have consequences for the future of the species. In addition to in

situ conservation of natural populations, one strategy would be the creation of germplasm banks

for ex situ conservation, with seeds coming from the most diverse populations.

For populations with greater genetic diversity, such as those located in the state of Ceará,

another strategy could include the preservation of several populations across the geographic

distribution of the species. This would contribute to the maintenance of gene flow and the genetic

diversity found in these populations.

49

Population genetic bottlenecks were observed in most populations sampled. As such,

Luikart et al. (1998) recommend mitigation procedures to manage or introduce immigrants to

avoid or minimize the deleterious effects of bottlenecks. Therefore, we suggest that in situ and ex

situ conservation of the populations that present genetic bottlenecks is a priority.

Copernicia prunifera is not on the list of endangered species, however it has been affected

by the expansion of agricultural activities over time (REIS et al., 2011), contributing to

reductions in the species’ natural populations. To counteract the effects of this anthropization,

there is a need to implement sustainable management of non-timber forest products, such as

leaves and waxes, which are the main extraction products of Copernicia prunifera. These

activities help limit the advance of livestock and deforestation of these natural areas (WADT et

al., 2005), as well as contribute to the income of rural communities (TICKTIN, 2004).

ACKNOWLEDGMENTS

The authors acknowledge the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq) for their financial support (Process 471099/2012-0) and the Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) for a Masters Grant. We also thank Dr.

Evelyn R. Nimmo for editing the English language of the manuscript.

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CONCLUSÕES

A distribuição potencial da Copernicia prunifera concentra-se na região nordeste do

Brasil, sendo a precipitação do trimestre mais seco (bio17) a variável ambiental que mais

contribui com o MNE, sugerindo que Copernicia prunifera se adaptada bem a ambientes

estressantes ao déficit hídrico sazonal. A maior variação genotípica foi encontrada entre

indivíduos dentro das populações. No entanto, foi verificada a existência de correlação positiva e

significativa entre as distâncias genéticas e geográficas, sugerindo alta divergência genética entre

as populações que pode ser explicada pelo modelo de isolamento por distância.

Populações próximas geograficamente apresentaram maior similaridade genética, como

por exemplo, as populações AR1 e AR2 que também apresentam elevado fluxo gênico. A análise

de gargalo genético apontou que as populações de AR2 e SMG indicaram equilíbrio entre

mutação e deriva, no entanto, todas as outras populações estudadas apresentaram redução

populacional. As populações AR1, AR2, ICA, RUS e MOS podem ser prioritárias para

conservação, devido aos elevados índices de diversidade encontrados nessas áreas, quando

comparado com as outras populações. A população de SER apresentou os mais baixos valores de

diversidade genética e deve ser urgentemente protegida.

ministÉrio da educaÇÃo universidade federal ......11 resumo copernicia prunifera (miller) h.e....

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