ministÉrio da educaÇÃo universidade federal rural da...
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA
KÁTIA REGINA DE ANDRADE CAMPOS
IDENTIFICAÇÃO DE Ralstonia solanacearum E CONTROLE ALTERNATIVO DA
MURCHA BACTERIANA DO TOMATEIRO
BELÉM
2018
KÁTIA REGINA DE ANDRADE CAMPOS
IDENTIFICAÇÃO DE Ralstonia solanacearum E O CONTROLE ALTERNATIVO DA
MURCHA BACTERIANA DO TOMATEIRO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao
curso de Agronomia da Universidade Federal
Rural da Amazônia como requisito para
obtenção do título de Engenheiro Agrônomo.
Área de concentração: Fitopatologia
Orientador: Sérgio Antônio Lopes de Gusmão
Co-orientadora: Alessandra Keiko Nakasone
Ishida
BELÉM
2018
Bibliotecária-Documentalista: Letícia Lima de Sousa – CRB2/1549
Campos, Kátia Regina de Andrade
Identificação de Ralstonia solanacearum e controle alternativo da
murcha bacteriana do tomateiro / Kátia Regina de Andrade Campos . –
Belém, 2018. 39 f.
Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Agronomia) –
Universidade Federal Rural da Amazônia, Belém, 2018.
Orientador: Dr. Sérgio Antônio Lopes de Gusmão.
1. Solanum lycopersicum - Tomateiro 2. Solanum lycopersicum - Murcha
bacteriana 3. Tomateiro - Extratos vegetais 4. Plantas de tomateiro –
Município de Altamira I. Gusmão, Sérgio Antônio Lopes de (orient.) II. Título.
CDD – 635.642
Aos meus pais, à minha filha, que
dispensaram os momentos de convívio
para a conquista deste curso.
AGRADECIMENTOS
No final desta etapa quero deixar presente nestas palavras o meu mais profundo agradecimento
àqueles que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho;
Em primeiro lugar quero agradecer a Deus porque sem ele não teria traçado meu caminho até aqui;
À Universidade Federal Rural da Amazônia pela oportunidade de realizar este curso;
À minha orientadora de estágio Alessandra Keiko Nakasone Ishida pela oportunidade, confiança,
orientação, compreensão, paciência, e principalmente pelos ensinamentos transmitidos, pela
disponibilidade em esclarecer minhas dúvidas e atenção sempre em todos os momentos durante o
período do curso;
Ao meu orientador professor Sergio Antônio Lopes de Gusmão pela orientação neste trabalho e
principalmente pelos ensinamentos nas aulas da universidade;
À professora Íres Lettiere por me acompanhar sempre ao longo do curso, pela disponibilidade em
todos os momentos e pelas sugestões na conclusão deste trabalho.
À minha família, em especial minha mãe, Maria dos Milagres pelo amor incondicional, pela
compreensão em todos os momentos, força e apoio de sempre;
Ao meu pai, Antônio Campos que Deus chamou pra perto dele, mas deve estar me abençoando de
onde ele estiver;
Ás minhas amadas irmãs Carina, Karilia, Karla e Mary pela amizade e por me apoiarem sempre;
Ao meu companheiro Clemerson Loureiro, pela compreensão, companheirismo e incentivo em
todas as minhas escolhas e á minha filha Clarice, pois o tempo que está escrito nestas linhas era
deles;
Á todos do Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Amazônia Oriental, em especial Clenilda
Tolentino, por me auxiliar sempre em todas as etapas de meu aprendizado, ao Sr. Manoel, Aline,
pela colaboração, sugestões, apoio e amizade de sempre;
Uma palavra especial, a minha colega de curso e amiga Cryslaine Almeida, que me acompanhou
ao longo da minha caminhada, pelos ensinamentos transmitidos, pela paciência, pelo constante
incentivo e amizade de sempre.
A amiga Sandra Cardoso pela amizade, parceria e principalmente pela ajuda no inicio dos
trabalhos no laboratório, às amigas, Silvia do Nascimento, Rayane, Regiane, Késsia, Luana, Lídia
e ao Victor pela ajuda em meu trabalho e pelo apoio recebido de cada um;
À Kézia Alves, por estar sempre disponível, pelos ensinamentos transmitidos e principalmente
pelas palavras fé, apóio, incentivo e amizade de sempre, à professora e amiga Marilene Oliveira
pela parceria, pelos ensinamentos e colaboração que foram fundamentais na elaboração deste
trabalho e principalmente à amizade; ao Sr. Nivaldo pela orientação, amizade e auxilio no preparo
e na adubação das mudas de tomateiro em casa de vegetação;
Aos meus amigos da turma B de Agronomia, que foram meus companheiros de sala, Renan,
Rodrigo pela grande amizade nos trabalhos,
Finalmente, quero agradecer a este trabalho por ter crescido com ele, e também porque gostei de
aprender o que ele me ensinou.
RESUMO
O presente trabalho teve como objetivo identificar o isolado bacteriano obtido de plantas de
tomateiro com sintoma de murcha provenientes do município de Altamira, PA e avaliar o efeito de
extratos de plantas medicinais no controle da murcha bacteriana em tomateiro. Para a identificação
do isolado RS22 foram realizados teste de patogenicidade, crescimento em meio Kelman,
identificação de biovar e PCR para identificação da espécie e filotipo. O efeito dos extratos sobre o
patógeno e a murcha bacteriana foi avaliado in vitro e em casa de vegetação. Os extratos foram
testados em concentração de 1%. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente
casualizado com 10 tratamentos e 5 repetições (1 placa por repetição). Para o ensaio in vivo, o
delineamento experimental utilizado foi em blocos casualizados com 10 tratamentos e 4 repetições
(5 plantas por repetição). As avaliações foram efetuadas nos dias 3, 5, 7, 12e 14 dias após a
inoculação (DAI), atribuindo-se uma escala de notas variando entre 0 e 5 para a severidade do
isolado. No teste de patogenicidade as plantas inoculadas apresentaram sintomas típicos de murcha
bacteriana. No teste em meio Kelman, foram obtidas colônias típicas do gênero Ralstonia,
contendo o centro avermelhado. O isolado foi identificado como biovar 1. Quando submetido a
PCR o isolado bacteriano amplificou um fragmento de 280 pb, específico para as espécies do
complexo R. solanacearum. Para o estudo do filotipo, houve a amplificação de banda de 372 pb,
permitindo sua identificação como pertencente ao filotipo II. No ensaio in vitro, com exceção do
extrato de gengibre, todos os extratos diferiram significativamente da testemunha, com reduções
acima de 61% no crescimento bacteriano, sendo que o extrato de eucalipto apresentou inibição de
100% do crescimento bacteriano. Em casa de vegetação, com exceção dos extratos de boldo do
reino e manjericão, todos os demais extratos vegetais apresentaram diferença significativa em
relação à testemunha. Observou-se que o extrato de eucalipto permaneceu expressivo em casa de
vegetação reduzindo a severidade da doença em 96,28%. Assim, o isolado bacteriano responsável
pela murcha em amostras de tomateiro provenientes de Altamira, foi identificado como Ralstonia
solanacearum, biovar 1, filotipo II. A caracterização de populações de R. solanacearum a partir de
bioquímicos e moleculares é fundamental para definir os próximos passos para o desenvolvimento
de novas estratégias de controle da doença. Os extratos de plantas medicinais inibiram o
crescimento de R. solanacearum e, reduziram a severidade da murcha bacteriana em casa de
vegetação mostrando-se promissores para serem inseridos em programas de manejo integrado de
doenças.
Palavra-chave: Solanum lycopersicum. Murcha bacteriana. Extratos vegetais.
ABSTRACT
The present work aimed to identify the bacterial isolate obtained from tomato plants with wilt
symptom from the municipality of Altamira, PA and to evaluate the effect of extracts of medicinal
plants in the control of bacterial wilt in tomato. Pathogenicity, growth in Kelman medium,
identification of biovar and PCR for identification of the species and phylotype were performed to
identify the RS22 isolate. The effect of the extracts on the pathogen and the bacterial wilt was
evaluated in vitro and in greenhouse. The extracts were tested at a concentration of 1%. The
experimental design was completely randomized with 10 treatments and 5 replicates (1 plaque per
replicate). For the in vivo assay, the experimental design was a randomized block with 10
treatments and 4 replicates (5 plants per replicate). The evaluations were carried out on days 3, 5,
7, 12 and 14 days after inoculation (DAI), assigning a score scale ranging from 0 to 5 for the
severity of the isolate. In the pathogenicity test the inoculated plants presented typical symptoms
of bacterial wilt. In the test in Kelman medium, typical colonies of the genus Ralstonia were
obtained, containing the reddish center. The isolate was identified as biovar 1. When submitted to
PCR the bacterial isolate amplified a 280 bp fragment specific for R. solanacearum complex
species. For the study of the phylotype, there was the band amplification of 372 bp, allowing its
identification as belonging to the phylotype II. In the in vitro assay, except for the ginger extract,
all extracts differed significantly from the control, with reductions above 61% in bacterial growth,
and the eucalyptus extract showed 100% inhibition of bacterial growth. In the greenhouse, except
for the boldo extracts of the kingdom and basil, all other extracts showed significant difference in
relation to the control. It was observed that the eucalyptus extract remained expressive in
greenhouse, reducing the severity of the disease in 96.28%. Thus, the bacterial isolate responsible
for wilt in tomato samples from Altamira was identified as Ralstonia solanacearum, biovar 1,
phylotype II. The characterization of populations of R. solanacearum from biochemical and
molecular is fundamental to define the next steps for the development of new strategies of control
of the disease. Herbal extracts inhibited the growth of R. solanacearum and reduced the severity of
bacterial wilt in the greenhouse, showing promise for inclusion in integrated disease management
programs.
Keyword: Solanum lycopersicum. Bacterial wilt. Plant extracts.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Plantio de tomateiro apresentando murcha generalizada em Altamira, PA.
Figura 2 - Inoculação de Ralstonia solanacearum em mudas sadias 25 dias após a semeadura.
Corte da raiz com tesoura (A) e imersão de raízes em suspensão bacteriana (B). Câmara úmida por
24h (C).
Figura 3 - Determinação de biovares de acordo com a capacidade do isolado em oxidar diferentes
fontes de carbono. Fontes de carbono diluídas e filtradas (A). Adição das fontes de carbono ao
meio básico (B). Adição de suspensão bacteriana em cada poço (C). Resultados para Biovar 1( D),
Biovar 2 (E) e Biovar 3 (F).
Figura 4 - Reação de mudas de tomate aos 5 dias após a inoculação de Ralstonia solanacearum.
Figura 5 – Identificação do biovar 1, de acordo com a capacidade do isolado em oxidar diferentes
fontes de carbono.
Figura 6- Gel de eletroforese indicando a espécie e o filotipo de Ralstonia solanacearum. Setas à
esquerda indicam o tamanho dos fragmentos amplificados. Identificação da espécie (1).
Determinação do filotipo (2).
Figura 7 - Efeito dos diferentes extratos vegetais sobre Ralstonia solanacearum.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Iniciadores (primers) utilizados na identificação da espécie e do filotipo de Ralstonia
solanacearum.
Tabela 2- Nomes populares, científicos e famílias botânicas das plantas medicinais utilizadas
neste estudo.
Tabela 3- Efeito in vitro de extratos vegetais sobre o crescimento de Ralstonia solanacearum.
EMBRAPA. Belém. 2018.
Tabela 4 - Efeito de extratos vegetais sobre a severidade de murcha bacteriana em tomateiro
(Solanum lycopersicum). EMBRAPA. Belém. 2018
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...........................................................................................................................12
2 OBJETIVO ..................................................................................................................................14
2.1 ObjetivoGeral............................................................................................................................14
2.2 Objetivo Específico ...................................................................................................................14
3 REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................................15
3.1 A cultura do tomate ..................................................................................................................15
3.2 Murcha bacteriana ...................................................................................................................16
3.3 Identificação do patógeno ........................................................................................................16
3.4 Extratos de plantas medicinais ................................................................................................17
4 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................................19
4.1 Obtenção do isolado de Ralstonia solanacearum ...................................................................19
4.2 Crescimento bacteriano em meio Kelman..............................................................................19
4.3 Teste de patogenicidade ..........................................................................................................20
4.4 Identificação de biovares .........................................................................................................21
4.5 Identificação molecular........................................................................................................... 22
4.5.1 Extração de DNA bacteriano ...................................................................................................22
4.5.2 PCR para confirmação da espécie e classificação em filotipo ................................................22
4.6 Obtenção das plantas medicinais ............................................................................................23
4.7 Preparo dos extratos alcoólicos de plantas medicinais .........................................................24
4.8 Preparo da suspensão bacteriana............................................................................................24
4.9 Efeito in vitro de extratos vegetais sobre Ralstonia
solanacearum...................................................................................................................................24
4.10 Efeito dos extratos vegetais sobre a severidade da murcha bacteriana em tomateiro em
casa de vegetação............................................................................................................................25
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................................26
5.1 Crescimento bacteriano em meio Kelman..............................................................................26
5.2 Teste de patogenicidade ..........................................................................................................26
5.3 Identificação de biovares.........................................................................................................26
5.4 Identificação molecular............................................................................................................27
5.4.1 PCR para confirmação da espécie e classificação em filotipo................................................27
5.5 Efeito in vitro de extratos vegetais sobre Ralstonia solanacearum .....................................28
5.6 Efeito dos extratos vegetais sobre a severidade da murcha bacteriana em casa de
vegetação..........................................................................................................................................30
6. CONCLUSÃO............................................................................................................................32
REFERÊNCIAS............................................................................................................................33
12 1. INTRODUÇÃO
A produção de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) no Brasil concentra-se em regiões
frias e secas que compreendem o centro-sul do país, onde predominam condições ideais para o
crescimento e produção da espécie. Na Amazônia Oriental, as condições de umidade e temperatura
elevadas resultam em baixa produtividade e desestímulo aos produtores (CHENG, 2000).
O tomateiro está entre as hortaliças mais cultivadas no Brasil, alcançando no ano de 2016
uma produção de 37.398 hectares nas principais regiões produtoras, sendo 18.674 para tomate de
mesa e 18.724 para o tomate industrial (CEPEA, 2017). No entanto, o produto está sujeito a uma
gama considerável de patógenos, sendo as bactérias responsáveis por grandes prejuízos (LOPES;
MENDONÇA, 2014).
A murcha-bacteriana, causada pelo complexo Ralstonia solanacearum (Smith), é uma
doença de importância econômica no cultivo de solanáceas em climas tropicais, e historicamente
limitante à produção de tomate na Região Norte do Brasil (LOPES, 2015). Ralstonia
solanacearum é uma bactéria gram negativa, habitante do solo, conhecida por sua capacidade de
infectar diferentes espécies vegetais (HAYWARD, 1994).
A doença caracteriza-se pela murcha rápida da planta de cima para baixo. Em plantas de
tomate a infecção pode ocorrer em qualquer estádio de desenvolvimento (LOPES; ROSSATO,
2013). Além da murcha, outro sintoma típico é a necrose vascular, um escurecimento característico
na região dos vasos (ROMEIRO; NETO, 2005).
Ralstonia solanacearum é considerada uma espécie complexa, sendo classificada em
diferentes níveis taxonômicos por apresentar variabilidade fenotípica e genética dentro da própria
espécie (GILLINGS; FAHY, 1994). Devido às perdas econômicas causadas em áreas infestadas, é
fundamental o conhecimento a respeito da ocorrência do patógeno para auxiliar no
desenvolvimento de cultivares resistentes para determinadas regiões do Brasil, bem como novas
estratégias de controle da doença (MORAIS et al., 2015).
A caracterização de isolados de R. solanacearum em biovares (HAYWARD, 1964) ainda
é bastante utilizada como padrão de classificação para a bactéria. Seguido da identificação da
espécie (Opina et al., 1997), a classificação em filotipo proposta por Fegan e Prior (2005), ambas
utilizando técnicas moleculares, as quais são bastante aceitas pelos pesquisadores (VIANA et al.,
2012).
Estudos sobre virulência, caracterização e identificação molecular de R. solanacearum têm
sido realizados com solanáceas no Brasil, principalmente com batata no Sul do Brasil observado
por Silveira et al. (2005) e solanáceas na Amazônia verificado por Coelho Neto (2003). Além
disso, a vulnerabilidade das hortaliças às doenças amplia o grau de complexidade do controle
fitossanitário no setor da olericultura. Atualmente, o cenário olerícola nacional é caracterizado por
valorizar produtos de boa aparência, ou seja, hortaliças com tamanho, formato e cor dentro dos
13 padrões estéticos exigidos pelo mercado, o que contribui para que os agrotóxicos ainda sejam
considerados essenciais à sustentabilidade econômica dos produtores (LOPES, 2017).
A limitação na disponibilidade de produtos químicos no controle das bacterioses plantas é
uma realidade. São usados alguns antibióticos com ação bactericida ou fungicida à base de cobre
(SILVA et al., 2008).
Entretanto, esses produtos nem sempre são eficientes, havendo a necessidade do
desenvolvimento de produtos eficazes com baixa toxicidade e impacto ambiental reduzido.
Mostra-se cada vez mais a necessidade pela busca de métodos alternativos ao controle
convencional das doenças de plantas cultivadas pelo homem. Consequentemente tem-se um
crescente avanço nos estudos com produtos naturais, pois a demanda por alimentos livres resíduos
tóxicos também aumentou nos últimos anos (CAMPANHOLA; BETTIOL, 2003).
Os extratos de plantas medicinais vêm sendo reconhecidos cientificamente, como novas
fontes de produtos no controle das doenças de plantas. Estudos demonstram a atividade desses
produtos em várias regiões do mundo, orientados pelo uso popular das espécies nativas
(DUARTE, 2006).
Para R. solanacearum diversos extratos vegetais e seus componentes vêm sendo relatados
por promoverem efeito bactericida sobre o patógeno e a redução da murcha bacteriana em
tomateiro, de modo que representa uma alternativa para programas de manejo integrado de pragas
e doenças, além de possibilitar aumento dos rendimentos na cadeia produtiva do tomate
(DEBERDT et al., 2012).
14
2. OBJETIVO
2.1 Objetivo Geral
Identificar o isolado bacteriano obtido de plantas de tomateiro com sintoma de murcha
provenientes do município de Altamira, PA e avaliar o efeito de extratos de plantas medicinais no
controle da murcha bacteriana em tomateiro.
2.2 Objetivos Específicos
Identificar o isolado bacteriano por meio de testes bioquímicos e moleculares;
Avaliar o efeito in vitro dos extratos de plantas medicinais sobre R. solanacearum;
Avaliar o efeito dos extratos de plantas medicinais sobre a severidade da murcha
bacteriana do tomateiro em condições de casa de vegetação.
15
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1 A cultura do tomate
O tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), apesar de ser associado à cultura italiana, é uma
espécie originária da região dos Andes, de onde saiu para ganhar o mundo (CARVALHO, et al.
2016). A domesticação foi efetuada pelos mexicanos e posteriormente os espanhóis levaram para a
Europa. No entanto, a Itália foi pioneira no registro da hortaliça fora do continente americano em
1544, cultivando-a inicialmente como planta ornamental e, certamente foi a responsável em
introduzir pela primeira vez a espécie no consumo humano em 1560 (BECKER, 2016),
Em 1710 estabeleceu-se nos Estados Unidos e a partir de então tornou-se apreciada. Em
1850 foi estabelecido seu uso como alimento e o primeiro cultivar surgiu em 1900. No Brasil o
fruto foi inserido no inicio do século XX pelos imigrantes portugueses e italianos. Atualmente, o
tomate é a hortaliça mais consumida no mundo, adquiriu grande importância econômica para a
indústria e produtos de consumo humano (BECKER, 2016).
Apesar de ser confundido com um legume, por ser muito utilizado no preparo de saladas, o
tomate é uma hortaliça do tipo fruto pertencente à família Solanaceae, e a planta chega a atingir
até 2,5 metros de altura. O progresso na cadeia produtiva do tomate pode ser atribuído ao aumento
demanda do consumidor adquirir alimentos benéficos ao organismo humano. O tomate é
considerado um alimento funcional por ser rico em vitamina A e C, vitaminas do complexo B,
sais minerais, licopeno (CARVALHO, et al., 2016).
A indústria de tomate movimenta por ano perto de 3,2 bilhões de reais. Em 2017 a área
colhida no Brasil foi de 58,6 mil ha, o que representa uma produtividade de 64,68 Kg/ha e
produção de 3,74 mil toneladas. A produção atual é considerada bastante desenvolvida
principalmente no Centro – Oeste, a qual concentra a maior parcela da produção para fins
industriais, correspondente a 25,3% da produção nacional, configurando o estado de Goiás como
maior produtor brasileiro (IBGE, 2017).
Já a produtividade do tomate de mesa, a qual representa grande importância
socioeconômica em função do seu potencial de produção e geração de empregos, possui polos
produtivos distribuídos em várias regiões do país. Os estados de São Paulo, Minas Gerais, Goiás e
Bahia possuem as maiores áreas cultivadas do fruto (CARVALHO, et al., 2016). O tomate de
mesa é responsável por uma massa salarial de R$ 400 milhões no meio rural (ABCSEM, 2016). A
produção de tomate brasileira garante a oitava posição na lista dos dez maiores produtores
mundiais (WPTC, 2015).
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3.2 Murcha Bacteriana
A murcha bacteriana causada pelo complexo Ralstonia solanacearum já havia sido
observada por produtores japoneses cerca de 200 anos antes de seu primeiro registro infectando
cultivos de batata, tomate e berinjela nos Estados Unidos (KELMAN et al., 1994). No Brasil, a
doença foi mencionada pela primeira vez em 1922 por Von Parseval em plantas de fumo e batata
no Rio Grande do Sul. Na região norte a murcha bacteriana foi relatada em tomateiro no
Amazonas, Pará, Acre (COSTA et al., 2007) e em Roraima (LIMA, et al., 2010). É uma doença de
grande importância econômica para o cultivo de tomate nessa região do Brasil, pois representa
uma limitação aos produtores, acarretando grandes perdas na produção (COELHO NETO et al.,
2004).
Na região norte, a ocorrência da doença é fortemente relacionada às condições ambientais
como temperatura elevada, altos níveis de umidade no solo e plantas suscetíveis (LOPES; ÁVILA,
2005). Bactérias do complexo R. solanacearum são gram negativas, habitantes do solo, possuem
uma capacidade de infectar diferentes espécies vegetais (HAYWARD, 1994) e sobrevivência no
solo por vários anos (DENNY, 2006). A família solanácea reúne as espécies mais suscetíveis à
doença na qual além do tomate, a batata, berinjela, pimentão e jiló também são hospedeiras do
patógeno (LOPES; ROSSATO, 2013).
A doença caracteriza-se pela murcha rápida da planta de cima para baixo. Em plantas de
tomate a infecção pode ocorrer em qualquer estádio de desenvolvimento. Ao infectar a planta por
ferimentos nas raízes, a bactéria se aloja nos vasos condutores de água (xilema) no qual, sob
condições favoráveis, a bactéria se multiplica, produzindo alta população de células produtoras de
polissacarídeos extracelulares viscosos, promovendo a obstrução do xilema, responsável por
conduzir a água absorvida pelas raízes até a parte aérea da planta, ocasionando a murcha das folhas
a partir do ápice da planta, principalmente nas horas mais quentes do dia, podendo recuperar-se à
noite (LOPES; ROSSATO, 2013). Além da murcha, outro sintoma típico é a necrose vascular, um
escurecimento característico na região dos vasos (ROMEIRO; NETO, 2005).
3.3 Identificação de Ralstonia solanacearum
Ralstonia solanacearum é considerada uma espécie complexa, sendo classificada em
diferentes níveis taxonômicos por apresentar variabilidade fenotípica e genética dentro da própria
espécie (GILLINGS; FAHY, 1994). Hayward (1994) relatou que a classificação do patógeno deve
ser realizada quanto ao fenótipo, em cinco raças, de acordo com a gama de hospedeiros.
A bactéria também é classificada em cinco biovares com base no consumo de três
carboidratos (lactose, maltose e celobiose) e três alcoóis (manitol, sorbitol e dulciol) como fonte de
carbono. Porém, ambas as metodologias de identificação, apesar de bastante utilizadas em função
17 da praticidade, não representam a diversidade dos isolados de R. solanacearum (PINHEIRO et al.,
2011). Diante disso, Fegan e Prior (2005) propuseram uma nova classificação hierárquica dividida
em quatro níveis taxonômicos: espécie, filotipo, sequevar e clone. A identidade de R.
solanacearum pode ser facilmente confirmada por meio de reação em cadeia da polimerase (PCR)
com os oligonucleotídeos iniciadores (primers) específicos 759/760 (OPINA et al., 1997).
Safni et al. (2014), baseados na heterogeneidade da espécie, relataram evidências de uma
nova revisão taxonômica e na nomenclatura atual dos membros deste complexo, a partir de estudos
filogenéticos de sequências de genes ITS da região 16s-23s e sequências da região do espaço
intergênico da mesma região e da sequências do gene da endoglucanase (egel). As análises
demonstraram que este complexo agrupa três espécies classificadas como: a primeira espécie para
R. solanacearum, são todas as bactérias agrupadas no filotipo II, a segunda inclui cepas de R.
syzygii que contém apenas cepas do filotipo IV e, a ultima espécie é composta por estirpes de R.
solanacearum pertencentes ao filotipo I e III, classificadas como Ralstonia pseudosolanacearum.
A identificação em filotipos é obtida através de uma reação de PCR multiplex a qual é realizada
utilizando um conjunto de primers Nmults conforme indicado por (FEGAN; PRIOR, 2005).
Os filotipos são analisados de acordo com as diferenças de tamanhos nas sequências da
região ITS. Esta classificação está fortemente ligada à origem geográfica do patógeno, pois este
conhecimento é fundamental para os estudos de epidemiologia e orientação de programas de
controle da doença (PINHEIRO et al, 2011).
Além disso, auxiliam no desenvolvimento de estratégias que visam resistência especifica de
estirpes, devido às perdas econômicas causadas em áreas infestadas pela bactéria e para auxiliar no
desenvolvimento de cultivares resistentes para determinadas regiões do Brasil (MORAIS et al.,
2015).
3.4 Extratos de plantas medicinais
A utilização de defensivos naturais no controle fitossanitário não é algo recente, havendo
um predomínio do uso desses produtos até meados do século XIX, como medida de controle de
pragas e doenças na agricultura, devido à ação inseticida e fungicida desses produtos. A partir do
início do século XX, iniciou-se a introdução e produtos com níveis de toxidez mais elevados, pois
além das plantas também eram adicionados substâncias à base de enxofre, sabão, óleo de baleia,
boro e arsênio (BOYCE, 1947). A mudança contribuiu para estimular a troca desses produtos por
outros de menor toxidez ao organismo humano. Porém, neste momento ainda não havia uma
consciência ambiental (DECKER, 1942).
O uso de agroquímicos na produção de alimentos iniciou após a segunda guerra mundial e
a partir de então, os produtos naturais bem como, rotação e consórcio de culturas, foram deixados
de lado em virtude das vantagens obtidas com os produtos sintéticos. Dentre as vantagens
18 destacam-se: aumento das áreas de cultivo, redução do número de trabalhadores na lavoura, e
aumento na produtividade (SAITO; LUCCHINI,1998). Posteriormente, os agricultores observaram
que o uso contínuo dos agrotóxicos era prejudicial, sendo estes responsáveis por eliminar inimigos
naturais, causar intoxicação aos agricultores e aos animais, contaminar os alimentos, reduzir a
biodiversidade. Além disso, prejudica a ciclagem de nutrientes e matéria orgânica em função da
eliminação de microrganismos benéficos presentes no solo e, estimula a resistência de pragas e
fitopatógenos (BETTIOL; MORANDI, 2009; LONDRES, 2011).
Diante disso, iniciou-se um processo de conscientização à respeito do efeito negativo dos
agrotóxicos, havendo um resgate da prática de utilização de produtos de origem vegetal, como
alternativa de controle de pragas e doenças nos cultivos agrícolas (BULHÕES, 2012). Outro fator
importante para retomar a prática, foi o progresso do sistema de produção orgânica fundamentado
em princípios que pregam a substituição de métodos convencionais por medidas fitossanitárias
menos nocivas ao homem e ao meio ambiente (BETTIOL, 2009).
As plantas sintetizam compostos como: açúcares, aminoácidos e nucleotídeos, entre outros,
os quais garantem a sobrevivência das espécies na natureza, esse processo é denominado de
metabolismo primário (SILVA et al., 2008). Os vegetais também possuem a capacidade de
produzir substâncias provenientes do metabolismo secundário, as quais desempenham a função de
beneficiar sua sobrevivência propiciando adaptabilidade às condições impostas e atuando também
como pesticida natural contra fitopatógenos (VIZZOTO et al., 2010).
Os resultados obtidos em avaliações do potencial de extratos vegetais atuando no controle
de fitopatógenos têm-se mostrado promissores (TAKANO et al., 2007). Fontana (2017) relatou a
redução de crescimento micelial e o índice de velocidade de crescimento micelial utilizando
extratos vegetais de canela, boldo e cravo da índia no controle de Monilinia fructicola, causador da
podridão parda do pessegueiro. Ferreira et al. (2014) avaliaram o efeito dos extratos vegetais de
Azadirachta indica A. Juss., Anonna muricata L. e de Lippia alba (Mill) N. E. Brown. no controle
de Colletotrichum gloeosporioides Penz. in vitro. Os resultados obtidos apontaram maior inibição
do patógeno com o uso dos extratos de folhas de erva-cidreira e de sementes de graviola.
Assim como para as doenças fúngicas, o potencial dos extratos tem sido comprovado no
controle das bacterioses. Motoyama et al. (2003) avaliaram a atividade de um extrato citrico
(produto comercial Ecolife40) na atividade antibacteriana. O produto foi testado nas concentrações
de 1, 10, 100, 1000 e 5000 ppm sobre as bactérias Ralstonia solanacearum e Xanthomonas
axonopodis pv. Manihotis avaliando-se halo de inibição, densidade óptica e número de unidades
formadoras de colônias. Através dos resultados obtidos verificou-se que o extrato cítrico
apresentou atividade antibacteriana. A concentração de 5000 ppm foi a mais eficiente.
Han-Qian et al. (2009) avaliaram o efeito de extratos aquoso e alcoólico de alho, na
inibição de R.solanacearum em laboratório. Os resultados mostraram que os extratos de alho
podem inibir efetivamente R. solanacearum. As taxas de inibição dos extratos alcoólicos nas
19 concentrações de 0,2; 0,3 e 0,4 g · mL-1 foram de 65,56%, 69,26% e 75,93%,
respectivamente; enquanto os extratos aquosos nas concentrações de 0,3 e 0,4 g · mL-1 foram
61,85% e 72,59%, respectivamente, com maior porcentagem de inibição para os extratos
alcoólicos, demonstrando que o extrato alcoólico de alho pode ser utilizado como alternativa no
controle da bactéria.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Obtenção do isolado bacteriano
O isolado bacteriano utilizado neste estudo foi obtido de plantas com sintoma de murcha
provenientes do município de Altamira-PA (Figura 1), e encontra-se preservado em água destilada
no laboratório de Fitopatologia da Embrapa Amazônia Oriental.
Figura 1 - Plantio de tomateiro apresentando murcha generalizada em Altamira, PA.
Fonte: A.K.N.Ishida
4.2 Crescimento bacteriano em meio de Kelman
O isolado foi inoculado em meio de Kelman (1954), com e sem cloreto de trifeniltetrazólio,
para diferenciação de colônias virulentas das avirulentas. Posteriormente as placas foram
incubadas por 48 h a 28ºC. Após esse período observou-se o crescimento das colônias.
20
4.3 Teste de patogenicidade
A patogenicidade do isolado foi constatada através da inoculação de plantas de tomateiro.
O estudo foi realizado em casa de vegetação da Embrapa Amazônia Oriental, Belém, Pará. No
ensaio, o isolado foi inoculado em plantas de tomate Carolina, com 30 dias de idade e
apresentando 4 pares de folhas verdadeiras, cultivadas em bandejas em casa de vegetação. A
inoculação foi realizada por meio de corte da raiz com tesoura e imersão destas raízes por 5
minutos em suspensão bacteriana, calibrada para 108 Unidades Formadoras de Colônia (UFC)/mL
(Figura 2). Em seguida as plantas foram transplantadas para vasos de 2L. Para o preparo da
suspensão bacteriana, o isolado foi cultivado em meio 523 (KADO; HESKETT, 1970) pelo
método de estrias paralelas e posterior incubação por 48 horas a 28 ºC.
A suspensão foi preparada com água de torneira. As plantas inoculadas foram mantidas por
24 h em câmara úmida (Figura 2). O delineamento utilizado foi em blocos casualizados com seis
tratamentos e quatro blocos (cinco plantas por bloco). As avaliações foram efetuadas nos dias 3, 5,
7, 12 e 14 dias após a inoculação (DAI), atribuindo-se uma escala de notas variando entre 0 e 5
para avaliar a severidade da doença, sendo: 0 = plantas sadias; 1= plantas com uma folha murcha;
2 = plantas com duas folhas murchas; 3 = plantas com três folhas murchas; 4 = plantas com todas
as folhas murchas, exceto o ápice; 5 = plantas com todas as folhas murchas ou mortas
(MORGADO et al., 1992).
Para o cálculo da severidade aplicou-se o índice de Mckinney (1923). Os valores de índices
obtidos foram utilizados para calcular área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) para
cada isolado. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias foram comparadas
pelo teste Scott-Knott a 5% de probabilidade.
21 Figura 2 - Inoculação de Ralstonia solanacearum em mudas sadias 25 dias após a semeadura. Corte da raiz com
tesoura (A) e imersão de raízes em suspensão bacteriana (B). Câmara úmida por24h (C).
Fonte: CAMPOS, K.R.A.
4.4 Identificação de Biovar
Foi realizada a identificação do biovar, baseada na utilização de diferentes açúcares
(celobiose, lactose, maltose) e álcoois (dulcitol, manitol e sorbitol) pela bactéria (Hayward, 1991).
Foi preparado um meio básico, sem fonte de carbono, com PH neutro. Para o preparo do meio, foi
utilizada água destilada pré-aquecida em microondas, para garantir a solubilização dos
componentes da solução.
Após a solubilização dos reagentes o meio foi divido em alíquotas de 90 mL e distribuído
em frascos de Erlenmeyers de 250 mL e posteriormente adicionado ágar para a autoclavagem.
Após a esterilização e resfriamento do meio, dentro de uma câmara de fluxo laminar, as fontes de
caborno foram diluídas em 10 mL de água destilada autoclavada, e com o auxilio de uma seringa
previamente esterilizada foram filtrados em membrana de milipore 0,22µL . Em seguida, cada
carboidrato e álcool foram depositados nos seus respectivos frascos, para a obtenção de uma
concentração final de 1% de cada fonte de carbono. A seguir, agitou-se para a homogeneização da
solução e distribuição de 2,5 ml de meio em cada poço existente na placa de cultura (Figura 3).
22 A suspensão bacteriana foi preparada com água destilada autoclavada. Foram pipetados
20µl de suspensão de cada isolado em cada pocinho contendo as diferentes fontes de carbonos
(Figura 3). As placas foram incubadas a 28°C por 10 dias. Durante esse período foi observada a
mudança de cor do meio de verde-oliva para amarelo em função de sua acidificação pelo
crescimento bacteriano (LOPES; ROSSATO, 2013)
Figura 3 - Determinação de biovares de acordo com a capacidade do isolado em oxidar diferentes fontes de carbono.
Fontes de carbono diluídas e filtradas (A). Adição das fontes de carbono ao meio básico (B). Adição de suspensão
bacteriana em cada poço (C). Resultados para Biovar 1( D), Biovar 2 (E) e Biovar 3 (F).
Fonte: CAMPOS, K.R.A.
4.5 Identificação Molecular
4.5.1 Extração de DNA bacteriano
Para a extração de DNA, alíquotas de 1,5 mL de cultura bacteriana foram centrifugadas e
os precipitados foram ressuspendidos com 567 μL de TE pH 8,0, 30 μL de SDS 20% e 3 μL de
proteinase k 20 mg/mL. A mistura foi incubada por 1 hora a 37 °C. Em seguida, foram
adicionados 100 μL de NaCl 5 M e 80 μL de CTAB 10%, a mistura foi então incubada a 65 °C.
Após a extração com clorofórmio e isopropanol, o DNA foi ressuspendido em 90 μL de TE e 10
μL de RNase (AUSUBEL et al., 2003). A quantificação do DNA de cada amostra foi realizada
utilizando-se o padrão de peso molecular Low DNA massladder (Invitrogen) e o programa
LabImage 1D L340 (Loccus Biotecnologia) e o DNA diluído para a concentração de 10ng µL-¹.
4.5.2 PCR para confirmação da espécie e classificação em filotipo
A confirmação da espécie foi realizada através da amplificação por PCR de um fragmento
de 280pb utilizando os primers 759/760 (Tabela 1) específicos para a espécie (OPINA et al.,
1997). Foi realizado PCR multiplex para a identificação de filotipo utilizando um conjunto de 5
primers específicos para cada filotipo (Nmult: 21:1F, Nmult: 21:2F, Nmult: 22:Inf, Nmult:23:AF,
23 Nmult: 22:RR) (Tabela 1) (FEGAN; PRIOR, 2005). Os produtos da amplificação foram
detectados por eletroforese de 5μl de cada amostra, em gel de agarose 0,8%, preparado com
tampão Tris-Borato EDTA (TBE) 0,5x e 2 μL de Gel red durante 1hora a 120 volts. O marcador
utilizado para estimar o tamanho dos fragmentos amplificados foi Plus DNA Ladder 1 kb.
Posteriormente, as bandas formadas foram fotodocumentadas.
Tabela 1- Iniciadores (primers) utilizados na identificação da espécie e do filotipo de Ralstonia solanacearum.
PCR Primers Referência
Espécie P.759 Opina et al., 1997
P.760 Opina et al., 1997
21:1F Fegan e Prior, 2005
Multiplex 21:2F Fegan e Prior, 2005
23:AF Fegan e Prior, 2005
22:inF Fegan e Prior, 2005
22:RR Fegan e Prior, 2005
Fonte: LOPES; ROSSATO (2013)
4.6. Obtenção das plantas medicinais
As plantas utilizadas para a obtenção dos extratos foram coletadas no Horto de Plantas
Medicinais da Embrapa Amazônia Oriental (Tabela 2), acondicionadas em sacos plásticos e
levadas para o laboratório de Fitopatologia da Embrapa Amazônia Oriental. Todas as espécies
utilizadas neste trabalho foram identificadas pelo laboratório de Botânica da Embrapa Amazônia
Oriental e as exsicatas encontram-se no Herbário IAN da mesma Instituição.
Tabela 2- Nomes populares, científicos e famílias botânicas das plantas medicinais utilizadas neste estudo,
Nomes populares Nome científico Família
Eucalipto Eucalyptus globulusLabill Myrtaceae
Vinagreira Hibiscus sabdariffa L. Malvaceae
Capim Santo Cymbopogon citratus Gramíneae
Noni Morinda citrifolia L. Rubiaceae
Nim Azadirachta indica A. Juss Meliaceae
Coramina Pedilanthus tithymaloides Port. Euphorbiaceae
Manjericão Ocimum basilicum L. Labiataceae
Boldo do Reino Plectranthus barbatus Andrews Asteraceae
Gengibre Zingiber officinale Rosc. Zingiberaceae
Fonte: LAMEIRA; PINTO, (2008); PLANTAMED, (2014).
24 4.7 Preparo dos extratos alcoólicos de plantas medicinais
Para o preparo dos extratos, foi realizada a assepsia do material vegetal em água corrente,
imersão em álcool (70%) por 1 minuto e solução NaClO (1%) durante 2 minutos, e retirada
residual do cloro com água destilada estéril. Em seguida, ocorreu a secagem do material em estufa
com circulação de ar forçado a 40°C até peso constante, sendo em seguida triturados em moinho
elétrico até ficarem em formato de pó.
Para o ensaio experimental foram pesados 0,5g para 5 mL de álcool etílico comercial 70%
(10 g.100 mL-1), estes foram mantidos sob agitação constante em “shaker” a 200 rpm por 20
minutos, seguido de repouso por 24 h a 4°C e então centrifugados a 7.000 rpm por 10 minutos. Os
extratos foram filtrados em gaze previamente esterilizada, sendo usados logo após sua obtenção
(AMORIM et al., 2011 modificado).
4.8 Preparo da suspensão bacteriana de Ralstonia solanacearum
O isolado foi cultivado em meio de cultura 523 de Kado e Heskett (1970), pelo método de
estrias paralelas, e incubado em BOD por 48 horas a 28 ºC. Para a obtenção da suspensão
bacteriana, foram utilizadas quatro placas de Petri contendo crescimento bacteriano as quais foram
adicionadas 10 mL de água destilada autoclavada para o teste in vitro e, 10 mL de água de torneira
para o ensaio em casa de vegetação. As colônias foram removidas das placas com o auxílio de uma
alça de Drigalski esterilizada e em seguida a solução foi levada ao agitador para homogeneização.
Posteriormente, a suspensão bacteriana foi ajustada à Abs540 = 0,1 em espectrofotômetro (108
UFC/mL).
4.9 Efeito in vitro de extratos alcoólicos sobre Ralstonia solanacearum
O experimento foi conduzido no laboratório de Fitopatologia da Embrapa Amazônia
Oriental, Belém-PA. Após a obtenção dos extratos, estes foram filtrados em membrana Millipore
com 0,22 μM de diâmetro de poro. Posteriormente, houve a incorporação dos tratamentos ao meio
de cultura 523 Kado e Heskett (1970), na concentração de 1% e a distribuição do meio em placas
de Petri. Para a testemunha, foi utilizado meio de cultura sem adição de extratos.
Após a solidificação do meio de cultura contendo os tratamentos, foram depositadas em
cada placa 100 μL da suspensão bacteriana (0,1 UA/mL) diluídas em solução salina estéril (NaCl
0,85%) a 10-6
UFC/mL e espalhadas com alça de Drigalski esterilizada. As placas foram
incubadas em BOD a 28°C por 48 horas. Após o período de incubação, a avaliação foi realizada
com base no número de colônias por placa.
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com 10 tratamentos e 5
repetições (1 placa por repetição). Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e a
comparação das médias pelo teste de Scott e Knott (1974) a 5% de probabilidade, utilizando-se do
programa estatístico SISVAR (FERREIRA, 2000).
25 4.10 Efeito dos extratos vegetais sobre a severidade da murcha bacteriana em tomateiro em
casa de vegetação
O experimento foi conduzido em casa de vegetação na Embrapa Amazônia Oriental.
Sementes de tomateiro da cultivar Carolina foram semeadas em vasos de 3 L contendo uma
mistura com terra preta, esterco de gado, calcário dolomítico e NPK (10-28-20).
Os extratos vegetais foram diluídos a 1% com água de torneira e como tratamento controle,
as plantas foram pulverizadas com água de torneira. Os tratamentos foram aplicados 25 dias após a
semeadura, através de pulverização foliar até o ponto de escorrimento. A inoculação do patógeno
foi realizada 7dias após a aplicação dos tratamentos (SILVA, 2015). Foram utilizadas 200 plantas
de tomateiro, com 32 dias de idade. A inoculação foi realizada pelo método de corte da raiz com
tesoura e imersão das raízes por 5 minutos em suspensão bacteriana, calibrada para 108UFC/mL.
Posteriormente, ocorreu o transplantio para vaso de 2L. O delineamento experimental utilizado foi
em blocos casualizados com 10 tratamentos e 4 repetições (5 planta por repetição). As avaliações
foram efetuadas nos dias 3, 5, 7,12e 14 dias após a inoculação (DAI), atribuindo-se uma escala de
notas variando entre 0 e 5 para avaliar a severidade da doença, sendo: 0 = plantas sadias; 1=
plantas com uma folha murcha; 2 = plantas com duas folhas murchas; 3 = plantas com três folhas
murchas; 4 = plantas com todas as folhas murchas, exceto o ápice; 5 = plantas com todas as folhas
murchas ou mortas (MORGADO et al., 1992). Para o cálculo da severidade aplicou-se o índice de
Mckinney (1923). Os valores de índices obtidos foram utilizados para calcular área abaixo da
curva de progresso da doença (AACPD) para cada isolado. Os dados foram submetidos à análise
de variância e as médias foram comparadas pelo teste Scott-Knott a 5% de probabilidade.
26 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Crescimento bacteriano em meio de Kelman
Para o teste em meio Kelman (1954), após 48h de incubação a 28°C, foram obtidas
colônias apresentando aparência fluida e esbranquiçada, de forma pouco definida, contendo o
centro avermelhado. O isolado avaliado de planta de tomateiro apresentou colônia típica de R.
solanacearum de acordo com os resultados encontrados por Lopes e Rossato (2013).
5.2 Teste de patogenicidade
No teste de patogenicidade, as plantas inoculadas apresentaram sintomas típicos de murcha
bacteriana, com o início de seu aparecimento aos três dias após a inoculação. Ocorrendo aos cinco
dias, murcha generalizada, morte, acompanhado de escurecimento dos vasos localizados na região
do caule das plantas inoculadas com o isolado RS22, e aos14 dias observou-se a murcha total com
posterior morte de todas as plantas (Figura 4).
Figura 4 - Reação de mudas de tomate aos 5 dias após a inoculação de Ralstonia solancearum.
Fonte: CAMPOS, K.R.A.
5.3 Identificação de Biovares
O isolado estudado foi identificado como biovar 1, estando de acordo com os resultados
encontrados por Costa et al. (2007), que analisaram 70 isolados de diferentes hospedeiros,
tomateiro, pimenta, pimentão, berinjela, jiló, carirú, pepino e chicória, provenientes de diversos
estados do norte do Brasil e verificaram predominância do biovar 1em tomateiro 1 ( Figura 5).
27
Figura 5 – Identificação do biovar 1, de acordo com a capacidade do isolado em oxidar diferentes fontes de carbono.
Fonte: CAMPOS, K.R.A.
5.4 Identificação Molecular
5.4.1 PCR para confirmação da espécie e classificação em filotipo
O isolado bacteriano avaliado quando submetido a PCR com os primers 759 / 760 (OPINA
et al.,1997) amplificou um fragmento de 280 pb, específico para as espécies do complexo R.
solanacearum.
Dessa forma, este estudo confirma a identidade do isolado obtido de plantas de tomateiro
proveniente do município de Altamira, PA, como pertencente ao complexo R. solanacearum. Para
o estudo do filotipo, houve a amplificação de banda de 372 pb para o isolado estudado, permitindo
sua identificação como pertencente ao filotipo II. Os resultados deste estudo estão de acordo com o
observado por Pinheiro et al. (2011) no qual foram avaliados 33 isolados de diferentes regiões do
país, sendo que 27 foram caracterizados como filotipo II, entre os quais estão isolados
provenientes dos estados do Pará e Amazonas infectando Musa sp.
Santiago, Lopes e Mizubuti et al. (2012) também caracterizaram 120 isolados de R.
solanacearum de 19 estados brasileiros em diferentes hospedeiros e classificaram em filotipo II
(95,8%) e filotipo I (4,2% todos do norte do Brasil).
28
Figura 6- Gel de eletroforese indicando a espécie e o filotipo de Ralstonia solanacearum. Setas à esquerda indicam
o tamanho dos fragmentos amplificados. Identificação da espécie (1). Determinação do filotipo (2)
Fonte: CAMPOS, K.R.A.
5.5 Efeito in vitro de extratos vegetais sobre Ralstonia solanacearum
Quanto ao efeito dos extratos vegetais sobre R. solanacearum, com exceção do extrato de
gengibre, todos os demais extratos diferiram significativamente da testemunha, sendo que o
extrato de eucalipto apresentou atividade antimicrobiana de 100%, inibindo completamente a
bactéria, seguido dos extratos de vinagreira e capim santo, os quais proporcionaram inibição de
90,46% e 85,5%, diferindo-se dos demais extratos (Tabela 3; Figura 7). Os extratos de boldo do
reino, manjericão, coramina, nim e noni não diferiram entre si e promoveram inibição da bactéria
entre 61,45% e 74,81%.
Tabela 3- Efeito in vitro de extratos vegetais sobre o crescimento de Ralstonia solanacearum. EMBRAPA. Belém.
2018.
Extratos vegetais 1UFC Porcentagem de Inibição (%)
Eucalipto 0,00 c2 100
Vinagreira 6,25 c 90,46
Capim Santo 9,50 c 85,5
Noni 16,50 b 74,81
Nim 17,00 b 74,05
Coramina 17,00 b 74,05
Manjericão 20,50 b 68,7
Boldo do Reino 25,25 b 61,45
Gengibre 62,00 a 5,34
Testemunha 65,95 a 0 1UFC= Unidades Formadoras de Colônias.2Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Scott-Knott
a 5% de probabilidade. CV = 32,57%
Estudos revelam a atividade antimicrobiana de extratos vegetais e seu potencial de
utilização como medida de controle alternativo de R. solanacearum. Sunder et al. ( 2011)
relataram a atuação de extratos vegetais obtidos de folhas e frutos de Morinda citrifolia (noni)
29 sobre R. solanacearum, demonstrando o potencial desta espécie como fonte de compostos
antibacterianos naturais, em relação aos antibióticos utilizados para comparação.
Posteriormente, Oboo et al. (2014) investigaram o potencial de óleos essenciais extraídos
de plantas no crescimento de R. solanacearum em diferentes temperaturas, 24C°, 28C° e32C°, e
observaram que dentre as espécies testadas, o extrato de manjericão (Ocimum suave) inibiu o
crescimento bacteriano do patógeno em todas as temperaturas, estando de acordo com o
encontrado neste estudo, no qual o extrato promoveu redução da bactéria de 68,7% quando
incubado à 28C°.
Figura 7 - Efeito dos diferentes extratos vegetais sobre Ralstonia solanacearum
Fonte: CAMPOS, K.R.A.
Já Owoseni e Sangoyomi (2014) estudando os extratos de alfavacão (Ocimum
gratissimum), gengibre (Zingiber officinale), capim-santo (Cymbopogon citratus), nim
(Azadirachta indica) com diferentes solventes (metanol, etanol, clorofórmio) sobre o crescimento
de R. solanacearum, observaram que extrato de clorofórmio de alfavacão proporcionou uma zona
de inibição de 13mm sobre o crescimento do patógeno; os extratos de metanol e clorofórmio de
gengibre foram bem ativos promovendo a maior zona de inibição do patógeno de 15 mm;
enquanto que para nim nenhum dos extratos inibiram o crescimento de R. solanacearum.
Enquanto que Kumar et al. (2017) verificaram que muitos extratos de plantas medicinais possuem
efeito sobre R. solanacearum. Além disso, observou que extratos alcoólicos são mais eficazes
30 quando comparados com extratos aquosos, pois os alcoólicos liberam maior quantidade de
fitoquimícos aprimorando seu efeito sobre o patógeno.
5.6. Efeito dos extratos vegetais sobre a severidade da murcha bacteriana, em plantas de
tomateiro cultivadas em casa de vegetação.
Com exceção dos extratos de boldo do reino e manjericão, todos os demais extratos
vegetais apresentaram diferença significativa em relação à testemunha, destacando-se o extrato de
eucalipto, o qual reduziu a severidade da doença em 96,28% obtendo maior percentual de controle
da bacteriose em casa de vegetação (Tabela 4), assim como no ensaio in vitro, o qual inibiu
totalmente o crescimento do patógeno (Tabela 3). Os extratos de noni, coramina, vinagreira, capim
santo, gengibre e nim, apresentaram percentuais de redução da severidade da doença entre 51,09%
e 89,33% demonstrando o potencial de utilização destes extratos no controle alternativo da murcha
bacteriana.
Tabela 4 - Efeito de extratos vegetais sobre a severidade de murcha bacteriana em tomateiro (Solanum lycopersicum).
EMBRAPA. Belém. 2018
Extratos vegetais AACPD1
Controle (%)
Eucalipto 0,15 b2 96,28
Nim 0,43 b 89,33
Gengibre 0,85 b 78,91
Capim Santo 1,13 b 71,96
Vinagreira 1,23 b 69,48
Coramina 1,76 b 56,33
Noni 1,81 b 51,09
Manjericão 2,78 a 31,02
Boldo do Reino 3,64 a 9,68
Testemunha 4,03 a 0 1AACPD = Área abaixo da curva de progresso da doença.
2Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo
teste Scott-Knott a 5% de probabilidade. CV = 50,86%.
Observou-se neste estudo um retardamento no aparecimento de sintomas como, a murcha
das folhas e morte das plantas pulverizadas com os extratos. Além disso, os resultados deste estudo
demonstram a importância de estudos futuros sobre o perfil químico das substâncias que compõe
os extratos utilizados e destacados neste trabalho com maior potencial de uso para o
desenvolvimento de uma possível alternativa de controle da murcha bacteriana em tomateiro.
31
Figura 9. Efeito dos extratos vegetais na severidade de murcha bacteriana (Ralstonia solanacearum). Testemunha e
extrato de eucalipto 5 dias após a inoculação (A). Testemunha e extrato de eucalipto aos 14 dias após a inoculação (B).
Todos os tratamentos em bloco (C). Todos os tratamentos aos 14 dias após a inoculação (D).
Fonte: CAMPOS, K.R.A.
Vários fatores têm efeito direto sobre a eficiência dos extratos testados in vivo. Extratos
vegetais podem ser degradados por luz ou calor (POTENZA, 2004), o intervalo de sete dias entre a
aplicação dos tratamentos e a inoculação do patógeno pode ter influenciado na eficiência destes
extratos. Contudo pode ser citada a ação de extratos de plantas medicinais para outras bactérias de
interesse econômico. Amorim et al. (2011) obteve a redução em 50% da incidência do moko da
bananeira, através do óleo e do extrato de gengibre. Din et al. (2016) determinaram em ensaios in
vitro e in vivo a atividade de diferentes extratos de plantas medicinais. Os autores obtiveram bons
resultados utilizando extrato aquoso e em pó em diferentes quantidades de solos com melhor,
resultado para o extrato em pó no controle de murcha bacteriana do tomateiro.
32
6. CONCLUSÃO
A murcha bacteriana em plantas de tomateiro causada por Ralstonia solanacearum, biovar
1 Filotipo II está presente no município de Altamira, PA.
Os extratos de eucalipto, vinagreira, capim santo, noni, nim, coramina, manjericão e boldo
do reino inibiram o crescimento de R. solanacearum.
Os extratos de eucalipto, nim, gengibre, capim santo, viangreira, coramina, e noni
reduziram a severidade da murcha bacteriana em casa de vegetação.
Assim, este estudo evidencia a capacidade de extratos vegetais em atuar na redução da
severidade da murcha bacteriana em tomateiro e no retardamento dos sintomas em casa de
vegetação, mostrando-se promissores para serem inseridos em programas de manejo integrado de
doenças.
33
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