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Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPALaboratório Nacional Agropecuário - LANAGRO/MGDivisão Técnica Laboratorial - DLAB / Laboratório de Controle de Qualidade e Segurança Alimentar - LACQSA/BHMétodo de Ensaio – MET

Código: MET/LACQSA/BH/007 - V.2Fase: VigenteAprovado em: 15/06/2018

Determinação de zearalenona por purificação em fase sólida e cromatografia líquida de alta eficiência com detector de fluorescência

Aprovado por: Eugênia Azevedo VargasNilson César Castanheira Guimarães

Verificado por: Wagner de Souza

Elaborado/Revisado por: Leila Rodrigues Caldeira

1.0 Objetivos e alcanceO MET/LACQSA/BH/007 objetiva descrever os procedimentos analíticos a serem utilizados na determinação de

zearalenona em produtos de origem vegetal e no registro dos dados relacionados às análises, para que estes

sejam corretamente seguidos.

1.1 Abreviações

As abreviações das micotoxinas estão conforme DS/LACQSA/BH/024.

CLAE = cromatografia líquida de alta eficiência

DPR = RSD =CV =desvio padrão relativo

LD = limite de detecção

LQ = limite de quantificação

MC = material crítico

p.a. = para análise

p.a.r. = para análise de resíduos

PBS = solução tampão fosfato salina

R % = recuperação percentual

r2 = coeficiente de correlação

Rf = fator de retenção

Rt = tempo de retenção

U = incerteza expandida

2.0 FundamentosEsta metodologia fundamenta-se na extração de ZON das amostras pela solução de acetonitrila: água (84:16,

v/v); purificação do extrato por cromatografia em coluna, empregando purificação em coluna, separação,

detecção e quantificação por CLAE-fluorescência.

2.1 Características do método

Este método foi desenvolvido, validado e otimizado pelo LACQSA, com base nos estudos publicados por

CHANG & DE VRIES (1984), ROMER (1994), SILVA e VARGAS (2001). Este método foi publicado no Diário

Oficial da União (DOU, 2000) como método oficial do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento.

Impresso por: Wagner de Souza Página 1/23Cópia não controlada







Este método foi revalidado utilizando os dados de análises de controles intralaboratoriais e de ensaios de

proficiência realizados no período de 2002 a 2012. Os dados utilizados estão disponíveis nos documentos

Análise Crítica AC025-2012 (elaborada em 01/06/2012), plano de estudo PE078 e seu respectivo Relatório e no

PE089 e seu respectivo relatório, visando uma avaliação contínua do procedimento. Os parâmetros

determinados no processo de revalidação são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1: Parâmetros de desempenho do método obtidos no processo de revalidação utilizando dados de controles

analisados no período de fevereiro de 2002 a maio de 2012

Parâmetros de Desempenho Critério/requisito Valor obtido Aprovação

Ensaio de proficiência e análise de MR

Z-score aceitáveis

Resultados encontrados para materiais de referência do FAPAS e outros ensaios de proficiência dentro da

faixa de aceitabilidade.

Dados de recuperação de controles intralaboratorial dentro dos critérios de aceitabilidade

Sim

Veracidade Ensaios de recuperação

Critérios de aceitabilidade segundo DE/LACQSA/BH/029.

Nível (g/kg) Recuperação (%)

≤50 60 a 120

>50 70 a 120

Valores obtidos dentro dos critérios de aceitabilidade para recuperação

Faixa µg/kg Recuperação (%)

4,53 a 1490,49 Entre 79 e 110

Sim

Precisão

(repetibilidade)Valores obtidos menores que 0,66 (dois terços) do

valor de DPRr (RSD) Sim

Precisão intermediaria

Equação de Horwitz CRSD log5,01

Horwiitz 2

9/ 10 kgµgCc

Critérios de aceitabilidade segundo DE/LACQSA/BH/029

Nível (g/kg) DPRr DPRR

≤50 µg/kg ≤40 % ≤50 %

Entre 1 e 10 µg/kg ≤25 % ≤40 %

Valores obtidos menores que os previstos pela equação de Horwitz e menores que 22%.

Faixa µg/kg CV = RSD %

4,53 a 1490,49 6 a 22 %

Sim

Horrat Precisão adequada evidenciada por Horrat <1 Reprodutibilidade adequada evidenciada por Horrat < 1 Sim

Seletividade

Especificidade

Ausência de interferentes no tempo de retenção (Rt) de ZON - não faz uso de coluna de

imunoafinidadeAusência de interferentes no tempo de zearalenona Sim

Faixa ótima de 4,53 a 1490,49 µg\kg Sim








trabalho

Faixa da curva de calibração

Curva de calibração: aproximadamente

na faixa 0,020a 2,5µg/mL equivalente a faixa 9,6 a 1200µg/kg na amostraSim

LD (g/kg) - 4,5 µg/kg Sim

LQ (g/kg) - 9,0± 3,7 µg/kg Sim.

U (g/kg) - LQ ± U : 9,0± 3,7 µg/kg Sim

2.2 Aplicabilidade

O método é aplicável à determinação de zearalenona para os grupos de matrizes apresentados no

DS/LACQSA/BH/004.

3.0 Reagentes, padrões, materiais e insumosVidrarias e outros materiais de uso na rotina necessário à análise deverão ser solicitados à Unidade de Preparo

de Material pelo preenchimento do formulário FOR/LACQSA/BH/025.

Quando for identificada a necessidade da aquisição de materiais indisponíveis em estoque, seguir

procedimentos descritos na IS/LACQSA/BH/005.

3.1 Vidrarias em geral

Nota 1: As vidrarias identificadas como MC deverão ser calibradas e/ou terem desempenho satisfatório na verificação

de desempenho segundo procedimento específico do LACQSA.

conjunto (aparato) para filtração a vácuo com reservatório e base do funil com filtro poroso para

membrana filtrante de 47 mm de diâmetro, com rolha para conexão ao kitasato;

béqueres de 50, 100, 600 e 1000 mL ou equivalentes;

frascos de vidro com capacidade para aproximadamente 1 L, tipo Mason ou equivalente;

frascos de vidro borossilicato, âmbar ou transparente, capacidade de 1000, 2000 e 5000 mL, com

tampas, para armazenamento das fases móveis dos cromatógrafos;

frascos para padrão, de vidro silanizado, âmbar com tampa sólida de rosca revestida com PTFE,

capacidade de 2 e 4 mL;

frasco de vidro borossilicato, para padrão, transparente, reutilizável, com fundo duplo, fundo interno

cônico capacidade de 5 mL;








frascos para injetor automático para cromatógrafo líquido, compatível com o rack do auto injetor do

equipamento a ser utilizado, com tampa snap-cap ou equivalente;

kitasatos de borossilicato de 500 e 1000 mL;

provetas de borossilicato de 100 e 200 mL;

seringas de vidro de 3 mL, tipo luer;

pipetas de Pasteur;

pipetas graduadas de 2,5 mL ou micropipeta capaz de medir 2,5mL;

tubos de ensaio de 5-15 mL ou tubo de centrífuga de polipropileno de 15 mL com respectiva tampa.

3.2 Colunas e unidades filtrantes

colunas Romer MycosepTM 224 ou 226;

filtro iso disc de 0,45 m de porosidade;

membrana de fibra de vidro com 55 mm de diâmetro, 1 µm, tipo Whatman GF/B ou equivalente (MC);

membrana filtrante HA em éster de celulose, de 0,45 µm de poro, 47 mm de diâmetro, branca, lisa, para

filtração de água;

membrana filtrante de poliamida; Porosidade: 0,45 µm de poro, 47 mm de diâmetro, branca, lisa para

filtração de solventes orgânicos;

papel de filtro qualitativo pregueado com 24 cm de diâmetro, ou equivalente, para filtração rápida.

3.3 Padrões e materiais de referência

materiais de referência certificados e padrão analítico de zearalenona (MC).

3.4 Materiais de suporte

adaptadores para tubos de 1, 3 e 6 mL, tipo Bond – elut, Varian ou equivalente;

barra magnética;

barrilhete de polipropileno, capacidade de 5 litros;

bastão, em vidro borossilicato;

bulbos conta-gotas;

cuba para recolher materiais limpos e utilizados;

dispensete (dispensador);








espátulas;

fita parafinada ou parafilme;

gás hélio, 5.0 analítico;

gás nitrogênio, industrial ou ar comprimido seco;

garra com 3 hastes;

garra para conexão das partes do aparato de filtração;

grades para tubos;

hélice de aço inoxidável;

papel toalha ou guardanapo;

pêra de borracha ou pipetador automático ou equivalente;

pinça dupla;

papel alumínio;

pissetas;

ponteiras para micropipetas automáticas para as faixas de volumes de 20 a 100, 50 a 250, 100 a 1000 e

200 a 1000, 500 a 5000, 500 a 2500 e 1000 a 10000 µL.

3.5 Material para quantificação por CLAE

coluna Shimpack CLC-ODS (M) 250 x 4,6 mm, partículas de 5 m ou equivalente que apresente perfil

característico para o sinal de ZON e que atenda ao perfil cromatográfico previsto neste MET (MC);

pré-coluna ODS com partículas de 5 m ou equivalente, compatível com a coluna (MC);

frascos para injetor automático para cromatógrafo líquido de 1 ou 2 mL com tampa snap-cap ou

equivalente.

3.6 Reagentes, solventes e soluções

3.6.1 Reagentes e solventes

acetonitrila grau p.a.r. ou HPLC (MC);

ácido acético glacial p.a, ou ácido acético grau HPLC ou p.a.r.;

água tipo I é recomendada. Em caso da não disponibilidade de água tipo I usar tipo II ou água

deionizada, filtrada em membrana de 0,45 m;








benzeno p.a.r ou HPLC;

celite p.a.;

metanol grau HPLC ou p.a.r. (MC).

3.6.2 Soluções

acetonitrila p.a.: água (84:16, v/v);

metanol: água (70:30, v/v) ou (80:20, v/v);

metanol: acetonitrila: água: ácido acético (35:35:29:1, v/v/v/v);

soluções padrão trabalho de zearalenona em benzeno.

4.0 Equipamentos

Utilizar os equipamentos conforme os procedimentos descritos nas suas respectivas instruções de trabalho (IT),

na PLN/LACQSA/BH/001, no DS/LACQSA/BH/003 e no POP/LACQSA/BH/002, considerando a adequação dos

instrumentos aos requisitos e especificações necessárias à adequada execução deste MET.

4.1 Equipamentos críticos

balança de 2 casas decimais, com resolução 0,01g, calibrada;

balança de 4 casas decimais, com resolução 0,0001g, calibrada;

cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector de fluorescência;

micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 100 a 1000µL ou 200 a 1000µL, com

menor divisão de escala de 2 µL;

micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 1000 a 10000µL com menor divisão de

escala de 2 µL;

micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 50 a 250µL ou 20 a 100µL ou 10 a

100µL com menor divisão de escala de 0,2 µL;

micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 500 a 5000µL com menor divisão de

escala de 2 µL;

termômetro ou termopar calibrados.

4.2 Equipamentos de suporte








agitador de tubos;

aparelho de ultrassom;

banho de aquecimento com agitação com controle da temperatura 40 °C ±10%;

capelas de exaustão;

cronômetro temporizador digital;

freezer – capacidade de atingir temperaturas ≤ -15 °C;

geladeira – capacidade de atingir temperaturas de 2 a 8 °C;

homogeneizador de amostras com capacidade de atingir 800 rpm;

sistema de filtração a vácuo.

5.0 Precauções analíticasManter a área de análise sempre limpa e organizada conforme determina o POP/LACQSA/BH/003.

Zearalenona é uma micotoxina estrogênica que apresenta ação hiperestrogênica e promotora de crescimento.

Seus padrões sólidos e suas respectivas soluções devem ser manipulados como substâncias tóxicas. Os

padrões sólidos devem ser manipulados com extremo cuidado, devido à sua natureza eletrostática e à sua

tendência de se dispersar em local de trabalho.

Todo o procedimento analítico deve ser realizado em local apropriado, com precauções particulares como

utilização de equipamentos de proteção individual (luvas, guarda-pó, máscaras, sempre que necessário, e

sapatos fechados), evitando qualquer contato de padrões com a pele e/ou os olhos. Em caso de contato com a

pele, lavar com solução de hipoclorito de sódio 1%, sabão e água em abundância e procurar assistência médica.

Utilizar vidraria limpa, livre de detergente e resíduos e descontaminar o material utilizado ao final da análise,

conforme o IP/LACQSA/BH/001.

Toda vidraria utilizada para acondicionamento/armazenamento dos extratos finais das amostras, assim como

das soluções padrões, incluindo “vials” novos utilizados nos cromatógrafos, deve ser tratada com ácido sulfúrico

2 mol/L, de acordo com os procedimentos descritos na IP/LACQSA/BH/001.

Em casos de derrames acidentais de soluções padrões, descontaminar a área com solução de hipoclorito de

sódio a 1%, deixar em contato por 10 minutos e adicionar solução de acetona a 5%.

A manipulação de solventes e/ou reagentes, bem como de resíduos, das análises deve ser realizada com








cuidado, considerando a natureza de cada um, a ficha de informação de segurança de produtos químicos

(FISPQ) e o POP/LACQSA/BH/004.

A instalação de colunas cromatográficas deve ser feita utilizando um fluxo de 0,01 mL/min da fase móvel, para

evitar a entrada de bolhas de ar nos detectores. Observa-se a saída de bolhas na saída da coluna e somente ao

cessar a saída das bolhas e que a coluna pode ser conectada ao detector.

Visando aumentar a vida útil das colunas cromatográficas de fase reversa (C18), pode-se usar pré-colunas de

C18. Ao término das análises, lavar e armazenar a coluna em solventes orgânicos como metanol ou acetonitrila.

Quando se observar anomalias referentes à simetria do sinal cromatográfico, separação e alteração de pressão,

avaliar a possibilidade da troca inicial da pré-coluna. Se não, avaliar outros parâmetros cromatográficos. Se

necessário, trocar a coluna. A manutenção do desempenho da coluna deve ser observada levando-se em

consideração os parâmetros de resolução de pico, número de pratos teóricos e tempo de retenção.

6.0 ProcedimentosO analista deve verificar quais amostras deverão ser analisadas, inclusive aquelas para fins de controle de

qualidade intralaboratorial conforme o POP/LACQSA/BH/009, em acordo com o Responsável.

As amostras devem ser solicitadas à URPA pelo preenchimento do FOR/LACQSA/BH/024. Estas serão

entregues acompanhadas dos respectivos formulários de acompanhamento de amostras FOR/LACQSA/BH/012.

O FOR/LACQSA/BH/010 deverá ser preenchido com os dados pertinentes. Caso sejam anexados registros da

técnica de detecção ou folhas adicionais, estas deverão ser rubricadas e numeradas ao final da análise de forma

que cada folha seja identificada com o número total de folhas e número da folha.

No caso de realização de controle de reagente seguir procedimentos descritos na IS/LACQSA/BH/002.

O FOR/LACQSA/BH/054 deverá ser preenchido com todas as características de identificação da coluna

cromatográfica (tipo de coluna, marca, lote, número, comprimento, diâmetro interno e tamanho da partícula)

empregada e, a cada análise, com informações referentes à data da utilização, nome do analista, metodologia

utilizada e número de injeções. O formulário deverá ser arquivado na pasta do cromatógrafo no qual a coluna foi

instalada.

6.1 Preparo de soluções








Os volumes e massas propostos para preparo das soluções reagentes podem ser ajustados para atender as

necessidades das análises respeitando as devidas proporções.

As soluções utilizadas como fases móveis nos cromatógrafos podem ter as proporções preparadas utilizando as

bombas ou linhas dos equipamentos.

Antes de serem transferidas para os cromatógrafos as fases móveis devem ser desgaseificadas em ultrassom

por 10 a 15 minutos para retiradas de bolhas de ar adsorvidas nas soluções.

- Acetonitrila: água (84:16, v/v)

Adicionar 160 mL de água tipo I em 840 mL de acetonitrila p. a. e homogeneizar.

- Metanol: água (70:30, v/v)

Adicionar 300 mL de água tipo I em 700 mL de metanol grau HPLC e homogeneizar.

- Metanol: água (80:20, v/v)

Adicionar 200 mL de água tipo I em 800 mL de metanol grau HPLC e homogeneizar.

- Água: ácido acético (29:1, v/v)

Adicionar 10 mL de ácido acético HPLC ou p.a.r a 290 mL de água tipo I, homogeneizar e filtrar em membrana

de 0,45 m.

- Metanol: acetonitrila: água: ácido acético (35:35:29:1, v/v/v/v)

Adicionar 300 mL da solução água: ácido acético (29:1, v/v) à mistura de 350 mL de metanol grau HPLC e 350

mL de acetonitrila grau HPLC e homogeneizar.

6.1.1 Preparo da solução padrão de zearalenona

As soluções padrão de zearalenona (estoque, intermediária e trabalho) devem ser preparadas conforme

procedimentos descritos no IP/LACQSA/BH/003.

Durante a manipulação das soluções padrões:

- Retirar os frascos do freezer para ambientação da temperatura, coloque-os em suportes adequados e em

ambiente protegidos da luz.








- Homogeneizar a solução padrão antes da retirada da alíquota desejada.

- Ao abrir o frasco de solução padrão para retirada da alíquota desejada, fazê-lo sempre em capela, com a

guilhotina abaixada, porém com a exaustão desligada.

- Após a retirada da alíquota desejada da solução padrão, selar imediatamente o frasco e retorná-lo para

armazenamento no freezer.

6.1.2 Preparo da curva de calibração

Os cálculos utilizados no preparo das soluções para a curva de calibração devem ser realizados utilizando a

PLN/LACQSA/BH/018, a qual deve ser impressa para que registros e informações, referentes aos

procedimentos de preparo das soluções padrão, sejam inseridos nos campos apropriados.

Utilizando a solução trabalho de ZON (T ZON) preparar uma curva padrão de calibração em metanol: água (2:3,

v/v), com no mínimo 5 concentrações diferentes, sendo estas aproximadamente iguais àquelas apresentadas na

Tabela 3.

Tabela 3: Faixas de concentrações aproximadas de ZON para curva de calibração (µg/mL)

Padrão Concentração de ZON

µg/mL

Contaminação equivalente na amostra

µg/kg

P1 2,50 1200

P2 1,80 864

P3 1,00 480

P4 0,50 240

P5 0,25 120

P6 0,157 75

P7 0,078 37,6

P8 0,039 18,8

P9 0,02 9,6

- Pipetar utilizando micropipeta um volume conhecido da solução trabalho e transferir para um frasco apropriado

para o preparo da primeira solução da curva de calibração (P1).

- Evaporar o padrão sob fluxo de N2 ou ar comprimido seco, cuidando para que o solvente não seque








completamente, deixando gotículas no fundo do frasco.

- Dissolver o resíduo do padrão com a fase móvel com a mesma fase móvel a ser utilizada na análise: que pode

ser metanol: água (70:30 ou 80:20 v/v), com agitação por aproximadamente 5 minutos em agitador de tubos,

seguido de um minuto no ultrassom.

Antes da injeção dos padrões proceder à avaliação da adequação das condições instrumentais. A aprovação de

P1 é feita conforme instruções contidas na IT/LACQSA/BH/001 para o preenchimento e avaliação da

PLN/LACQSA/BH/061.

Os demais padrões da curva de calibração (no mínimo 5 concentrações diferentes) serão preparados

preferencialmente após aprovação de P1 pela diluição do mesmo com solução de metanol: acetonitrila: água:

ácido acético (35:35:29:1 v/v/v/v) (Tabela 3). Todas as soluções preparadas devem ser cuidadosamente

homogeneizadas. Fazer a injeção em triplicata ou duplicata de todas as soluções preparadas de forma aleatória

e avaliar a aceitabilidade da curva conforme a IT/LACQSA/BH/001.

A curva de calibração aprovada (as soluções) tem o prazo de validade de um mês para uso nas análises da

rotina. Se no período de um mês houver necessidade de preparar uma nova solução padrão trabalho deve-se

preparar também uma nova curva de calibração.

Durante o prazo de validade de 1 mês, caso não se prepare nova curva analítica, a curva já preparada pode ser

usada e deve ser avaliada a cada análise, segundo os critérios descritos na IT/LACQSA/BH/001, à exceção da

aprovação de P1, a qual é feito quando de seu preparo.

As curvas de calibração de micotoxinas feitas a partir de Materiais de Referência Certificados não serão

descartadas mensalmente, desde que sejam avaliadas para demonstração de que as mesmas se mantém

estáveis. O procedimento de avaliação das curvas está descrito na IT/LACQSA/BH/001.

6.2 Determinação de zearalenona

As etapas para a análise de zearalenona estão descritas de forma resumida no Fluxograma 6.6.

6.2.1 Extração

- Pesar 25 g da amostra, à temperatura ambiente em frasco de vidro.

- Adicionar 100 mL da solução de acetonitrila: água (84:16, v/v).








- Homogeneizar por 5 minutos, em velocidade alta (aproximadamente 800 – 1000 rpm).

- Adicionar aproximadamente 3 g de celite, homogeneizar por agitação manual e deixar decantar. Esta massa

pode ser medida utilizando um medidor aferido e marcado para retirada da quantidade aproximada de 3 g de

Celite (Teste Número 10 de 01/04/2013).

- Filtrar o extrato através de papel de filtro qualitativo pregueado e em seguida filtrar através de membrana de

fibra de vidro Whatman GF/B 1 µm ou equivalente utilizando o conjunto para filtração à vácuo e recolher o

filtrado.

6.2.2 Purificação

- Transferir aproximadamente 5 mL do extrato filtrado para o tubo da coluna de Romer MycosepTM 224 ou 226,

utilizando pipeta automática ou pipeta volumétrica de 5 mL.

- Pressionar a coluna lentamente para o interior do tubo com a extremidade de borracha para baixo. O extrato

purificado é obtido na parte superior do tubo.

- Caso se observe que o extrato purificado apresente evidências de impurezas ou turvo realizar o procedimento:

transferir o extrato purificado para uma seringa de 3 mL, adaptada ao filtro iso disc de 0,45 m ou equivalente e

filtrar.

- Retirar quantitativamente 2,5 mL do extrato purificado e transferir para um tubo de polipropileno de 15 mL ou

outro tubo de ensaio com capacidade de 5 a 15 mL.

- Evaporar até secura, sob atmosfera de nitrogênio ou ar comprimido seco, em banho de aquecimento com

agitação, a aproximadamente 40°C.

- Caso não seja possível a evaporação imediata do extrato purificado, o mesmo deve ser armazenado em

freezer para evaporação posterior.

6.2.3 Separação, detecção e quantificação por CLAE

- Retomar os resíduos obtidos na purificação com 300 L ou com 400 µL (quando o auto-injetor do CLAE estiver

configurado para utilização de racks com vials para volumes maiores) de metanol: água (70:30 ou 80:20, v/v) e

em seguida homogeneizar utilizando agitador de tubos.

Nota 2: Verificar o solvente do frasco de lavagem do auto injetor que deve ser preferencialmente a fase móvel ou








solvente de composição e polaridade similar.

- Injetar no CLAE soluções padrão para curva de calibração e amostras nas condições cromatográficas

especificadas para determinação de ZON.

coluna C18, 250 mm de comprimento, partículas de 5 m e 4,6 mm de diâmetro interno;

pré coluna de C18;

detector de fluorescência com comprimento de onda de excitação em 280 nm e de emissão em 465 nm;

fase-móvel metanol: água (70:30, v/v) ou (80:20, v/v) com fluxo de 0,8 mL/min ou 0,5 mL/min,

respectivamente;

volume de injeção de 20 L.

Nota 3: nestas condições (obtidos sob condições de validação do método), o tempo de retenção é de

aproximadamente 12 – 13 minutos utilizando a fase móvel metanol: água (70:30, v/v) e 14 - 15 minutos para a

proporção 80:20, v/v.

- Armazenar os extratos brutos e os purificados, em freezer.

- Com base na curva padrão de calibração, calcular as concentrações de zearalenona presente nas amostras.

- Caso a leitura das amostras não esteja inserida na faixa ótima de trabalho da curva, diluir o extrato

quantitativamente e injetar o extrato diluído.








Figura 1: Cromatograma de padrão de zearalenona determinado por CLAE

6.2.5 Confirmação

Reinjetar no CLAE os extratos das amostras suspeitas de contaminação (aquelas que apresentam sinal no Rf de

zearalenona, mas que gera alguma dúvida), nas condições especificadas para determinação de ZON,

substituindo a fase móvel por metanol: acetonitrila: água: ácido acético (35:35:29:1, v/v/v/v). Haverá diminuição

no tempo de retenção de ZON. Caso a dúvida persista realizar co-cromatografia pela adição de padrão ao

extrato e reinjeção para verificação de aumento do sinal.

6.2.6 Fluxograma








7.0 Resultados7.1 Cálculos

Os níveis de contaminação das amostras deverão ser expressos em µg/kg, conforme legislação vigente.








Os cálculos da contaminação de zearalenona, nas amostras analisadas deverão ser realizados utilizando a

planilha PLN/LACQSA/BH/006 a qual considerou a Equação 1 para análises por CLAE.

Equação 1

EPEA

RSECLAEZEA VgM

VVµgCC

)()(

Em que:

CCLAE= Concentração de zearalenona determinada pelo CLAE (µg/mL)

VSE=Volume de solução usada na extração da amostra (mL)

VR = Volume da solução usada para retomar o extrato evaporado (µL)

MA= Massa da amostra usada na extração (g)

VEPE = Volume do extrato purificado usado na evaporação (mL)

7.2 Reportagem de resultados

Registrar diariamente os dados referentes ao controle intralaboratorial com amostras artificialmente

contaminadas, naturalmente contaminadas ou com material de referência nas planilhas PLN/LACQSA/BH/014 e

PLN/LACQSA/BH/015. Em caso de amostras cegas, preencher a PLN/LACQSA/BH/011.

Os resultados determinados para as amostras brancas e fortificadas deverão ser registrados no formulário

FOR/LACQSA/BH/114 e devolvidos à URPA juntamente com os resultados das amostras analisadas.

Os resultados das amostras analisadas somente poderão ser liberados se os resultados do controle

intralaboratorial atenderem aos critérios de aceitabilidade em termos de recuperação e/ou desvio padrão

conforme determinado na tabela 1.

A reportagem de resultados deve seguir as instruções contidas no DS/LACQSA/BH/022. Esse documento de

suporte também trata dos casos em que é necessário realizar reanálise.

Considerar como NQ (não quantificado) resultados inferiores ao limite de quantificação do método, conforme

apresentado na Tabela 1.








Após a verificação e liberação dos resultados das amostras analisadas, os mesmos deverão ser registrados no

FOR/LACQSA/BH/012 e, após verificação, deverá ser encaminhado à URPA.

8.0 ResponsabilidadesAs funções, atribuições e responsabilidades estão definidas na PLN/LACQSA/BH/020 e no DS/LACQSA/BH/005.

9.0 ReferênciasCHANG, H. L., and De VRIES, J. W. Short liquid chromatographic method for determination of zearalenone and

alpha-zearalenone. Journal of the Association of Official Analytical Chemists, v. 67, 741-744, 1984.

DOU – Diário Oficial da União. Instrução Normativa n° 9, 24/03/2000, publicado em 30/03/2000.

Memorando elaborado dia 05/08/2013: 027-13: Assunto: Avaliação dos critérios de avaliação de P1. Ação de

melhoria – 00398/2012 (Auditoria interna) Trabalho não conforme 00035/2013

ROMER Labs. Inc., Mycotoxin Control Consultants. Quantitative method for DON, aflatoxin B1 and zearalenone.

Method # MY8402, version 94.2, 1994.

SILVA, C. M. G. and VARGAS, E. A. A survey of zearalenone in corn using Romer mycosep TM 224 column and

high performance liquid chromatography. Food Additives and Contaminants, v.18, n.1, p. 39-45, 2001.

10.0 Documentos referenciadosDE/LACQSA/BH/029-Regulamento Nº 401 da Comissão Europeia, de 23 de fevereiro de 2006IP/LACQSA/BH/001-Descontaminação e preparo de materialIP/LACQSA/BH/003-Preparo e padronização de soluções padrões de micotoxinasIS/LACQSA/BH/002-Preparo e controle de lotes de insumos (reagentes, solventes e soluções)IS/LACQSA/BH/005- Aquisição de Serviços e SuprimentosIT/LACQSA/BH/001-Uso das planilhas de rotina para emissão de resultados de análisePOP/LACQSA/BH/002-Controle de equipamentosPOP/LACQSA/BH/003-Acomodações e condições ambientaisPOP/LACQSA/BH/004-Gerenciamento de resíduos no laboratórioPOP/LACQSA/BH/009-Garantia da Validade dos Resultados

11.0 Anexos referenciadosDS/LACQSA/BH/003-Requisitos para calibração, qualificação e verificação de equipamentosDS/LACQSA/BH/004-Escopo representativo do LACQSA - Laboratório de Controle de Qualidade e Segurança AlimentarDS/LACQSA/BH/005-Descrição de FunçãoDS/LACQSA/BH/022-Reportagem de resultadosDS/LACQSA/BH/024-Abreviação de analitos e parâmetrosFOR/LACQSA/BH/010-Acompanhamento de análises de micotoxinas








FOR/LACQSA/BH/012-Reportagem de resultados analíticos de micotoxinasFOR/LACQSA/BH/024-Comunicado de recebimento e solicitação de amostrasFOR/LACQSA/BH/025-Solicitação de material ao preparoFOR/LACQSA/BH/054-Controle de sistemas cromatográficos e colunasFOR/LACQSA/BH/114-Reportagem de resultados analíticos - Amostra controlePLN/LACQSA/BH/001-Plano de equipamentosPLN/LACQSA/BH/006-Resultado analítico Zearalenona - Incerteza de mediçãoPLN/LACQSA/BH/011- Controle Intralaboratorial - Amostra cegoPLN/LACQSA/BH/014-Carta de Controle - Amostras naturalmente contaminadasPLN/LACQSA/BH/015-Carta de Controle - Amostras fortificadasPLN/LACQSA/BH/018-Curvas de Calibração para Micotoxinas - ModelosPLN/LACQSA/BH/020-Matriz de competênciaPLN/LACQSA/BH/061-Avaliação da Curva de Calibração para Micotoxinas

12.0 Informações de registroAcompanhamento de análises de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/010)Avaliação da Curva de Calibração (PLN/LACQSA/BH/061)Carta de controle - amostras fortificadas (PLN/LACQSA/BH/015)Carta de controle - amostras naturalmente contaminadas (PLN/LACQSA/BH/014)Comunicado de recebimento e solicitação de amostras (FOR/LACQSA/BH/024)Controle de colunas cromatográficas - CLAE (FOR/LACQSA/BH/054)Curvas de Calibração para Micotoxinas - Modelos (PLN/LACQSA/BH/018)Matriz de competência (PLN/LACQSA/BH/020)Plano de equipamentos (PLN/LACQSA/BH/001)Reportagem de resultados analíticos - Amostra controle (FOR/LACQSA/BH/114)Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/012)Resultado analítico Zearalenona - incerteza de medição (PLN/LACQSA/BH/006)Solicitação de material ao preparo (FOR/LACQSA/BH/025)

13.0 Arquivos anexadosAC025-2012 (01/06/2012)

AC067-2012 (10/07/2013)

AC068-2012 (10/07/2013)

Memorando elaborado dia 22/08/2013: 030-13: Assunto: Conclusões do Plano Estudo PE089 “Revalidação dos

limites de quantificação dos métodos de análise das micotoxinas AFBG, DON, OTA e ZON”

PE078 “Validação de limites de quantificação dos métodos de análise de micotoxinas”.

PE089 “Revalidação dos limites de quantificação dos métodos de análise das micotoxinas AFBG, DON, OTA e

ZON” (15/10/2012).








Relatório do PE078 - “Validação de limites de quantificação (LQ) e definição dos critérios de aceitabilidade da

Curva de Calibração para os métodos analíticos para micotoxinas”.

Relatório do PE089 “Revalidação dos limites de quantificação dos métodos de análise das micotoxinas AFBG,

DON, OTA e ZON” (26/06/2013).

14.0 Controle de alteraçõesItem Alteração

-Ao longo de todo o MET, foram retirados os nomes dos procedimentos e mantidas apenas as referências às

suas siglas.

1.1- Inseridos “MC”, “p.a.”, “p.a.r”. e retiradas siglas não presentes no documento.

- Inserido: As abreviações das micotoxinas estão conforme DS/LACQSA/BH/024.

2.1

- Retirado: “Na validação foram determinadas as seguintes características do método: limite de detecção do

equipamento, do método e de quantificação, linearidade, veracidade (em termos de recuperação, R%),

precisão, repetibilidade e precisão intermediária (em termos de desvio padrão relativo, DPR%), obtidas por

ensaios com amostras fortificadas com solução padrão de ZON e com amostras naturalmente

contaminadas”.

2.2 - Alteração da escrita fazendo menção ao DS/LACQSA/BH/004.

3.0

- Resumido a escrita do texto referente aos procedimentos de solicitação e aquisição de materiais.

- Retirado: “O material crítico (cuja qualidade afeta o resultado analítico) está identificado pelas iniciais MC”.

O significado de MC já está descrito em 1.1.

- Retirado: “Toda vidraria utilizada para acondicionamento/armazenamento dos extratos finais das amostras,

assim como das soluções padrão, incluindo “vials” novos utilizados nos cromatógrafos, deve ser tratada em

ácido sulfúrico 2M, de acordo com os procedimentos descritos no IP/LACQSA/BH/001” (informação

repetida).

3.1 - Inserida Nota 1.

3.6

- Retirado: “que deverá estar de acordo com os critérios de aceitabilidade do MET, conforme Tabela 1.

Avaliar também a existência de interferentes. A avaliação feita deve ser registrada no FOR/LACQSA/BH/005.

As soluções deverão ser descartadas, mesmo dentro do prazo de validade, quando observadas alterações

indicativas de deterioração (como turbidez, separação de fases, alteração de cor, etc.)”. Essas informações

já estão contidas na IS/LACQSA/BH/002 referenciada nesse MET

4.0 - Retirado: “considerando a adequação dos instrumentos aos requisitos e especificações necessárias a








adequada execução deste MET.

Verificar a avaliação de desempenho e/ou calibração externa dos equipamentos, antes do início da análise.

Para micropipetas, balanças, banho de agitação, proceder à verificação diária e registrar nos devidos

formulários e planilhas”. Essas informações já estão disponíveis em outros documentos citados.

- Inserido: “Utilizar os equipamentos conforme os procedimentos descritos nas suas respectivas instruções

de trabalho (IT), no plano de equipamentos anual, no DS/LACQSA/BH/003 e no POP/LACQSA/BH/002,

considerando a adequação dos instrumentos aos requisitos e especificações necessárias à adequada

execução deste MET”.

- Trocado plano de equipamentos por PLN/LACQSA/BH/001.

5.0

- Inserção das informações: “Manter a área de análise sempre limpa e organizada conforme determina o

POP/LACQSA/BH/003”.

“Toda vidraria utilizada para acondicionamento/armazenamento dos extratos finais das amostras, assim

como das soluções padrões, incluindo “vials” novos utilizados nos cromatógrafos, deve ser tratada com ácido

sulfúrico 2 mol/L, de acordo com os procedimentos descritos na IP/LACQSA/BH/001”.

“A instalação de colunas cromatográficas deve ser feita utilizando um fluxo de 0,01 mL/min da fase móvel,

para evitar a entrada de bolhas de ar nos detectores. Observa-se a saída de bolhas na saída da coluna e

somente ao cessar a saída das bolhas e que a coluna pode ser conectada ao detector.

Visando aumentar a vida útil das colunas cromatográficas de fase reversa (C18), pode-se usar pré-colunas

de C18. Ao término das análises, lavar e armazenar a coluna em solventes orgânicos como metanol ou

acetonitrila. Quando se observar anomalias referentes à simetria do sinal cromatográfico, separação e

alteração de pressão, avaliar a possibilidade da troca inicial da pré-coluna. Se não, avaliar outros parâmetros

cromatográficos. Se necessário, trocar a coluna. A manutenção do desempenho da coluna deve ser

observada levando-se em consideração os parâmetros de resolução de pico, número de pratos teóricos e

tempo de retenção”.

- Alteração da escrita:

“Em casos de derrames acidentais de soluções padrões, descontaminar a área com solução de hipoclorito

de sódio a 1%, deixar em contato por 10 minutos e adicionar solução de acetona a 5%.

“bem como resíduos”.

- Retirado: “...produzida principalmente por fungo do gênero Fusarium, ocorrendo naturalmente em milho e

cereais pré ou pós-colheita (KUIPER-GOODMAN, 1987; MILANO & LOPEZ 1991; PITTET 1998)”.

6.0 - Retirado: “Na medição de massas, volumes finais de extratos de amostras, soluções padrão ou qualquer








medida que impacte significativamente a incerteza de medição deve ser usados vidrarias e equipamentos de

medições calibradas. Devem ser utilizados equipamentos cujos valores das resoluções estejam de acordo

com a especificação.

A vidraria e o material utilizados nas análises deverão ser identificados, na medida do possível, evitando a

troca de frascos de reagentes e amostras”.

“Ao final da análise:

Os resíduos de analise (sólidos e líquidos) devem ser coletados em recipientes adequados,

devidamente identificados para coleta de resíduos e devem ser manipulados conforme

POP/LACQSA/BH/004.

Coletar o material utilizado, separando os que serão lavados pelo próprio analista (materiais

pequenos e ou frágeis) e encaminhar o restante para a Unidade de Preparo de Material (UPM). Organizar as

soluções e materiais utilizados na análise.

Manter a área de análise sempre limpa e organizada conforme determina o POP/LACQSA/BH/003”.

- Inseridos:

“O FOR/LACQSA/BH/054 deverá ser preenchido com todas as características de identificação da coluna

cromatográfica (tipo de coluna, marca, lote, número, comprimento, diâmetro interno e tamanho da partícula)

empregada e, a cada análise, com informações referentes à data da utilização, nome do analista,

metodologia utilizada e número de injeções. O formulário deverá ser arquivado na pasta do cromatógrafo no

qual a coluna foi instalada”.

“No caso de realização de controle de reagente seguir os procedimentos descritos na IS/LACQSA/BH/002”.

- Retirado: “Os solventes e reagentes devem ser monitorados conforme IS/LACQSA/BH/002” (informação

repetida).

6.1

- Retirado: “Etiquetar as soluções preparadas utilizando rótulo próprio, preenchendo adequadamente os

campos com os dados do solvente/solução, data do preparo, nome do analista, validade e lote, conforme

validado no Formulário FOR/LACQSA/BH/005 “Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de

micotoxinas””.

6.1.1

- Retirado: “Utilizar frascos tratados com ácido sulfúrico ou silanizados de volume adequado para preparo

das soluções padrão. Os frascos devem ser âmbar ou devem ser protegidos contra a luz fluorescente e

solar. Após o preparo, a solução trabalho deve ser selada com parafilm e armazenada em freezer a

Temperatura < - 15°C. Durante a manipulação das soluções padrões”.

“Os cálculos utilizados no preparo deverão ser realizados utilizando a PLA 013 ”Preparo de Soluções Padrão








Trabalho de Micotoxinas”, a qual deve ser impressa para que registros e informações, referentes aos

procedimentos de preparo das soluções padrão, sejam inseridos nos campos apropriados”.

- Retirada: “Nota 2: Observar a temperatura de recomendação de armazenamento de padrão fornecido pelo

fabricante no certificado do padrão”.

6.1.2

- Troca do nome do item de “Solução padrão para a curva de calibração – CLAE” para “Preparo da curva de

calibração – CLAE”.

- Inserção das informações:

“Antes da injeção dos padrões proceder à avaliação da adequação das condições instrumentais. A

aprovação de P1 é feita conforme instruções contidas na IT/LACQSA/BH/001 para o preenchimento e

avaliação da PLN/LACQSA/BH/061.

Os demais padrões da curva de calibração (no mínimo 5 concentrações diferentes) serão preparados

preferencialmente após aprovação de P1 pela diluição do mesmo (Tabela 3). Todas as soluções preparadas

devem ser cuidadosamente homogeneizadas. Fazer a injeção em triplicata ou duplicata de todas as

soluções preparadas de forma aleatória e avaliar a aceitabilidade da curva conforme a IT/LACQSA/BH/001.

A curva de calibração aprovada (as soluções) tem o prazo de validade de um mês para uso nas análises da

rotina. Se no período de um mês houver necessidade de preparar uma nova solução padrão trabalho deve-

se preparar também uma nova curva de calibração.

Durante o prazo de validade de 1 mês, caso não se prepare nova curva analítica, a curva já preparada pode

ser usada e deve ser avaliada a cada análise, segundo os critérios descritos na IT/LACQSA/BH/001, à

exceção da aprovação de P1, a qual é feito quando de seu preparo.

As curvas de calibração de micotoxinas feitas a partir de Materiais de Referência Certificados não serão

descartadas mensalmente, desde que sejam avaliadas para demonstração de que as mesmas se mantém

estáveis. O procedimento de avaliação das curvas está descrito na IT/LACQSA/BH/001”.

6.1.2.1

- Excluído o item de “Aprovação da primeira solução (P1) da curva de calibração” para “Preparo da curva de

calibração”. As informações desse item foram transferidas para o item 6.1.1 e as que já estão contidas na

PLN/LACQSA/BH/061 foram retiradas do MET, pois ele já referencia a planilha.

6.1.2.2

- Excluído o item de “Critério para aceitabilidade e aprovação e da curva de calibração – procedimento para

o dia do preparo das soluções da curva de calibração”. As informações desse item foram transferidas para o

item 6.1.1 e as que já estão contidas na PLN/LACQSA/BH/061 foram retiradas do MET, pois ele já referencia

a planilha.

6.1.2.3 - Excluído o item de “Critério para aceitabilidade e aprovação e da curva de calibração (rotina analítica)”. As








informações desse item foram transferidas para o item 6.1.1 e as que já estão contidas na

PLN/LACQSA/BH/061 foram retiradas do MET, pois ele já referencia a planilha.

6.2.3- Inserção da nota: “Nota 2: Verificar o solvente do frasco de lavagem do auto injetor que deve ser

preferencialmente a fase móvel ou solvente de composição e polaridade similar”.

6.2.4 - Excluído o item 6.2.4, que trata dos procedimentos para uso de colunas cromatográficas.

7.1

- Retirado: “Alterações nos procedimentos descritos neste MET poderão ser efetuadas, desde que não

comprometam o resultado da análise, devidamente autorizadas pelo Responsável e registradas na ficha de

acompanhamento de análise”. Informação repetida.

7.2

- Item totalmente reformulado para inserir referência ao DS/LACQSA/BH/022 e evitar trazer informações que

já se encontram nesse documento de suporte.

- Substituído o FOR/LACQSA/BH/032 pela PLN/LACQSA/BH/011.

7.3 - Item retirado.

9.0 - Atualização das referências.



12.0 - Informações de Registro atualizada para inclusão de documentos e exclusão de documentos obsoletos.

13.0 - Inserido os arquivos anexados.


ministério da agricultura, pecuária e abastecimento - mapa ... fileministério da agricultura,...

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