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Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPALaboratório Nacional Agropecuário - LANAGRO/MGDivisão Técnica Laboratorial - DLAB / Laboratório de Controle de Qualidade e Segurança Alimentar - LACQSA/BHMétodo de Ensaio – MET

Código: MET/LACQSA/BH/002 - V.1Fase: VigenteAprovado em: 24/06/2014

Determinação de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 por partição e cromatografia em camada delgada

Aprovado por: Eugênia Azevedo VargasNilson César Castanheira Guimarães

Verificado por: Roseane Brandão de Brito

Elaborado/Revisado por: Eliene Alves dos Santos

1.0 Objetivos e alcanceO MET “Determinação de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 por partição e cromatografia em camada delgada” objetiva

descrever os procedimentos analíticos a serem utilizados na determinação de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 e no

registro dos dados relacionados às análises.

1.1 AbreviaçõesAFLAB1 = aflatoxina B1

AFLAB2 = aflatoxina B2

AFLAG1 = aflatoxina G1

AFLAG2 = aflatoxina G2

AFLATotal = aflatoxina total

CCD = cromatografia em camada delgada

DPR = desvio padrão relativo

Rf = fator de retenção

R = recuperação

LD = limite de detecção

2.0 FundamentosEsta metodologia fundamenta-se na extração das aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 por solvente orgânico (metanol) e

solução de cloreto de potássio a 4%; purificação do extrato por precipitação com clarificantes (sulfato de amônio

ou sulfato de cobre); utilização de agente filtrante (celite); partição líquido-líquido utilizando solvente orgânico

hexano ou isooctano (desengorduramento) e extração com clorofórmio; separação dos componentes do extrato

purificado por cromatografia em camada delgada; detecção e quantificação das aflatoxinas por análise visual.

2.1 Características do métodoEste método foi validado e otimizado pelo LACQSA, baseado nos estudos publicados por Soares et al. 1989,

Prado et al. 1993, e nos dados do controle intra e interlaboratorial obtidos entre 1995 e 2001. Foi publicado no

Diário Oficial da União (DOU 2000) como método do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Na

validação, foram determinadas as seguintes características do método: limite de detecção em placa e do

método, linearidade, exatidão (em termos de recuperação, R%), precisão (em termos de desvio padrão relativo,

Impresso por: Wagner de Souza Página 1/32Cópia não controlada







DPR%) obtidas por ensaios com amostras artificial e naturalmente contaminadas e amostras certificadas

adquiridas do FAPAS – Food Analysis Performance Assessment Scheme.

2.2 AplicabilidadeEste método validado é aplicável à determinação de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 em amêndoas em geral

(castanha-do-brasil, pistache e outros); amendoim; arroz; cevada; coco; feijão; frutas secas; milho; ração; sorgo;

trigo e ingredientes de ração (farelos de algodão, de amendoim, de arroz, de babaçu, de cacau, de coco, de

colza, de dendê, de girassol, de linhaça, de mamona, de mandioca, de milho, de soja e de trigo; levedura;

farinha de crisálidas; aveia; feno; bagaço de cana e radícula de malte).

3.0 Reagentes, padrões, materiais e insumosO material crítico (cuja qualidade afeta o resultado analítico) está identificado pelas iniciais MC.

Os reagentes, solventes e materiais necessários à análise deverão ser solicitados pelo preenchimento do

FOR/LACQSA/BH/021 “Solicitação de material de consumo”. As quantidades das soluções necessárias para as

análises deverão ser verificadas.

Vidrarias e outros materiais de uso na rotina necessários à análise deverão ser solicitados à Unidade de Preparo

de Material pelo preenchimento do FOR/LACQSA/BH/025 “Solicitação de material ao preparo”.

Toda vidraria utilizada para acondicionamento/armazenamento dos extratos finais das amostras, assim como

das soluções padrões, deve ser tratada com ácido sulfúrico 2 mol/L, de acordo com os procedimentos descritos

na IP/LACQSA/BH/001 “Descontaminação e preparo de material”.

Quando for identificada a necessidade da aquisição de materiais indisponíveis em estoque, deve-se observar os

procedimentos descritos no DS/LACQSA/BH/011 “Aquisição de materiais de consumo” para solicitação dos

mesmos. A especificação detalhada dos materiais, reagentes e solventes necessários à realização dos

procedimentos descritos neste MET, em particular os materiais críticos (MC), encontra-se registrada na

PLN/DLAB/PL/007 “Lista de materiais de consumo por procedimento”.

3.1 Vidraria em geral








bastões de vidro;

béqueres de 10, 100, 300 e 600 mL;

frasco de vidro com capacidade para 1 L, tipo Mason ou equivalente;

funis de separação plástico de 500 mL, tipo Nalgene ou equivalente;

funis de haste curta com 14 cm de diâmetro;

kitasato de 500 mL ou 1000 mL;

pipetas de Pasteur;

pipetas volumétricas e graduadas de 10 mL;

provetas graduadas de 10, 50, 250 e 500 mL.

3.2 Colunas e unidades filttrantes

papel de filtro com 24 cm de diâmetro, qualitativo.

3.3 Padrões e materiais de referência

materiais de referência certificados e padrões analíticos de AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1 E AFLAG2 (MC).

3.4 Materiais de suporte

bulbos conta-gotas;

espátula;

grades para tubos;

garra em anel para funil;

papel alumínio;

parafilme;

pêra de borracha;

pissetas;

ponteiras para micropipetas automáticas;

tubos de polipropileno de 15 e 50 mL com tampa de rosca.








3.5 Material para quantificação por cromatografia em camada delgada

cromatoplaca de vidro ou alumínio para CCD (10 ou 20 x 20 cm com 250 m sílica gel ou 20 x 20 cm com canal e camada pré adsorvente) - MC;

cubas cromatográficas 10 x 20 cm e 20 x 20 cm;

microsseringas de 10 L, Hamilton ou equivalente.

3.6 Reagentes, solventes e soluções

Os reagentes, solventes e materiais devem ser avaliados e validados segundo a IS/LACQSA/BH/002 “Preparo e

controle de lotes de insumos” e deverão estar de acordo com os critérios de aceitabilidade definidos no item 7.2

deste MET. Avaliar também a existência de interferentes. A avaliação feita deve ser registrada no

FOR/LACQSA/BH/005 “Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de micotoxinas”.

A quantidade das soluções necessárias para as análises deverão ser verificadas. Preparar as soluções,

seguindo os procedimentos descritos neste MET.

As soluções deverão ser descartadas, mesmo dentro do prazo de validade, quando observadas alterações

indicativas de deterioração (como turbidez, separação de fases, alteração de cor, etc.).

3.6.1 Reagentes e solventes

acetato de etila grau p.a.r. ou HPLC;

acetona grau p.a.r. ou HPLC;

acetonitrila grau p.a.r. ou HPLC;

ácido fórmico 88% grau p.a.;

ácido trifluoroacético p.a., 98% puro;

ácido sulfúrico grau p.a.;

benzeno p.a. ou p.a.r;

celite comercial;

cloreto de potássio grau p.a.;

clorofórmio grau p.a. e p.a.r. ou HPLC;








éter etílico anidro grau p.a.r. ou HPLC (obs.: éter etílico anidro estabilizado com butilato de hidroxi-tolueno e teor de água inferior a 0,1%);

etanol grau p.a. ou p.a.r.;

hexano grau p.a. ou p.a.r.;

isooctano grau p.a. ou p.a..r;

metanol grau p.a. e p.a.r. ou HPLC;

sulfato de amônio anidro grau p.a.;

sulfato de cobre anidro grau p.a.;

terbutil-metil-éter, > 88 % grau p.a. ou HPLC;

tolueno grau p.a.r. ou HPLC.

3.6.2 Soluções

solução de ácido sulfúrico a 20%;

solução de cloreto de potássio a 4%;

solução de sulfato de amônio a 30%;

solução de sulfato de cobre a 10%.

3.6.3 Reagentes e soluções para cromatografia em camada delgada

éter etílico anidro grau p.a.r. ou HPLC (obs.: éter etílico anidro estabilizado com butilato de hidroxi-tolueno e teor de água inferior a 0,1%);

solução de clorofórmio:acetona (9:1, v/v);

solução de éter:metanol:água (96:3:1, v/v);

solução de terbutil-metil-éter:metanol:água (96:3:1, v/v/v);

solução de tolueno:acetonitrila (9:1, v/v);

solução de tolueno:clorofórmio:acetato de etila:ácido fórmico (7:5:5:2, v/v/v/v).

4.0 EquipamentosUtilizar os equipamentos conforme os procedimentos descritos nas suas respectivas instruções de trabalho (IT),

no plano de equipamentos anual, no DS/LACQSA/BH/003 “Requisitos para calibração, qualificação e verificação








de equipamentos” e no POP/LACQSA/BH/002 “Controle de equipamentos”, considerando a adequação dos

instrumentos aos requisitos e especificações necessárias à adequada execução deste MET.

Verificar o desempenho e/ou calibração externa dos equipamentos, antes do início da análise. Para

micropipetas, balanças, banho de agitação, proceder à verificação diária e registrar nos devidos formulários e

planilhas.

4.1 Equipamentos críticos

balança;

cromatovisor com luz UV 365 nm;

micropipetas automáticas.

4.2 Equipamentos de suporte

agitador para funis de separação;

agitador de tubos;

banho de aquecimento com agitação;

capelas de exaustão;

freezer;

geladeira;

homogeneizador de amostras;

termoplaca.

5.0 Precauções analíticasAflatoxinas apresentam toxicidade aguda e crônica, com potencial carcinogênico e genotóxico, relacionada a

casos de câncer hepático em humanos (IARC, 1993). Seus padrões sólidos e suas respectivas soluções devem

ser manipulados como substâncias tóxicas. Os padrões sólidos devem ser manipulados com extremo cuidado,

devido à sua tendência de dispersar-se. Todo o procedimento analítico deve ser realizado em local apropriado,

com precauções particulares como utilização de equipamentos de proteção individual, evitando qualquer contato

de padrões com a pele e/ou os olhos. Em caso de contato com a pele, lavar com solução de hipoclorito de sódio

1%, sabão e água em abundância e procurar assistência médica.








Utilizar vidraria limpa, livre de detergente e resíduos e descontaminar o material utilizado ao final da análise,

conforme a IP/LACQSA/BH/001 “Descontaminação e preparo de material”. Para o armazenamento de extratos e

soluções padrões, utilizar vidraria lavada com solução de ácido sulfúrico 2 mol/L para evitar a adsorção de

aflatoxinas.

Em casos de derrames acidentais de soluções padrões, descontaminar a área com solução de hipoclorito de

sódio a 1 %, deixar em contato por 10 minutos e adicionar solução de acetona a 5%. Resíduos de soluções

padrões a serem descartados devem ser descontaminados com solução de hipoclorito de sódio a 1%. Após

contato de 2 horas, adicionar quantidade de acetona correspondente a 5% do volume. Após contato de 30

minutos, enxaguar completamente em água corrente e deionizada.

A manipulação de solventes e/ou reagentes utilizados nas análises deve ser realizada com cuidado,

considerando a natureza de cada um (SHOEMAKER, 1998):

Acetonitrila – é um líquido tóxico. Evitar contato com a pele e os olhos. Manuseá-lo sob exaustão.

Metanol – é um líquido inflamável e tóxico. Evitar contato com os olhos. Evitar respirar vapores deste reagente.

Manuseá-lo sob exaustão. Pode reagir “vigorosamente” com:

- mistura de hidróxido de sódio (NaOH) e clorofórmio (CHCl3);

- mistura de hidróxido de potássio (KOH) e clorofórmio (CHCl3) ou ácido perclórico (HClO4).

Clorofórmio – pode ser prejudicial se inalado. Forma fosgene se aquecido (temperatura de decomposição).

Pode reagir explosivamente com alumínio, lítio, magnésio, sódio, potássio, disilano, hidróxido de sódio, N2O4.

É considerado como um agente ‘produtor’ de tumor. Manuseá-lo sob exaustão.

Éter etílico – extremamente inflamável. Pode reagir explosivamente quando em contato com cloro, ozônio,

LiAlH4 ou agentes oxidantes fortes. Evitar eletricidade estática. Manuseá-lo sob exaustão.

Hexano e isoctano – líquido altamente inflamável. Manuseá-lo sob exaustão.

Acetona – líquido altamente inflamável. Forma peróxidos explosivos com agentes oxidantes. Manuseá-lo sob

exaustão.

Ácido sulfúrico – sempre adicionar ácido à água. Usar luvas grossas e protetor facial. Não misturá-lo com

ácido clorídrico. Manuseá-lo sob exaustão.








Tolueno - líquido inflamável e apresenta risco de fogo. O seu limite de explosão no ar é de 1,27 a 7%. É tóxico

se ingerido, inalado e/ou absorvido pela pele.

6.0 ProcedimentosO analista deve verificar quais amostras deverão ser analisadas, inclusive aquelas para fins de controle de

qualidade intralaboratorial conforme o POP/LACQSA/BH/009 “Garantia da qualidade analítica”, em acordo com

o responsável pelo processo.

As amostras devem ser solicitadas à URPA pelo preenchimento do FOR/LACQSA/BH/024 “Comunicado de

recebimento e solicitação de amostras”. Estas serão entregues acompanhadas dos respectivos formulários de

acompanhamento de amostras FOR/LACQSA/BH/012 “Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas”.

O FOR/LACQSA/BH/010 “Acompanhamento de análises de micotoxinas” deverá ser preenchido com os dados

pertinentes. Caso sejam anexados registros da técnica de detecção ou folhas adicionais, estas deverão ser

rubricadas e numeradas ao final da análise de forma que cada folha seja identificada com o número total de

folhas e número da folha.

Utilizar, preferencialmente, equipamentos e materiais listados neste MET, sendo que outros podem ser utilizados

desde que sua aplicabilidade tenha sido comprovada e o seu uso devidamente registrado nos formulários de

análise. Na medição de massas, volumes finais de extratos de amostras, soluções padrão ou qualquer medida

que impacte significativamente a incerteza de medição deve ser usados vidrarias e equipamentos de medições

calibradas. Devem ser utilizados equipamentos cujos valores das resoluções estejam de acordo com a

especificação.

A vidraria e o material utilizados nas análises deverão ser identificados, na medida do possível, evitando a troca

de frascos de reagentes e amostras.

Ao final da análise:

Os resíduos de análise (sólidos e líquidos) devem ser coletados em recipientes adequados, devidamente

identificados para coleta de resíduos e devem ser manipulados conforme POP/LACQSA/BH/004

“Gerenciamento de resíduos no laboratório”.








Coletar o material utilizado, separando os que serão lavados pelo próprio analista (materiais pequenos e

ou frágeis) e encaminhar o restante para a Unidade de Preparo de Material (UPM). Organizar as

soluções e materiais utilizados na análise.

Manter a área de análise sempre limpa e organizada conforme determina o POP/LACQSA/BH/003

“Ambiente e Segurança”.

6.1 Preparo de soluçõesOs volumes e massas propostos para preparo das soluções reagentes podem ser ajustados para atender as

necessidades das análises, respeitando as devidas proporções

Etiquetar as soluções preparadas utilizando rótulo próprio, preenchendo adequadamente os campos com os

dados do solvente/solução, data do preparo, nome do analista, validade e lote, conforme validado no

FOR/LACQSA/BH/005 “Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de micotoxinas”.

Tolueno:acetonitrila (9:1, v/v)- adicionar 10 mL de acetonitrila p.a.r. ou HPLC em 90 mL de tolueno p.a.r. ou HPLC e homogeneizar.

Solução de tolueno:clorofórmio:acetato de etila:ácido fórmico (7:5:5:2, v/v/v/v)- adicionar 50 mL de clorofórmio p.a.r ou HPLC, 50 mL de acetato de etila p.a.r ou HPLC e 20 mL ácido

fórmico 88% p.a. a 70 mL de tolueno p.a.r. ou HPLC e homogeneizar.

Clorofórmio:acetona (9:1, v/v)- adicionar 10 mL de acetona p.a.r. ou HPLC em 90 mL de clorofórmio p.a.r. ou HPLC e homogeneizar.

Terbutil-metil-éter:metanol:água (96:3:1, v/v/v)- adicionar 3 mL de metanol p.a.r. ou HPLC em 96 mL de terbutil-metil-éter 98% e homogeneizar

lentamente. A esta solução adicionar 1 mL de água deionizada e homogeneizar.

Éter:metanol:água (96:3:1, v/v)- adicionar 1 mL de água deionizada em 3 mL de metanol p.a.r. ou HPLC e homogeneizar. A esta solução

adicionar 96 mL de éter etílico anidro p.a.r. ou HPLC e homogeneizar lentamente.

Solução de cloreto de potássio a 4%- pesar exatamente 40 g de cloreto de potássio p.a. e transferir quantitativamente para um balão

volumétrico de 1000 mL, completar o volume com água deionizada e homogeneizar.








Solução de sulfato de amônio a 30%- pesar exatamente 300 g de sulfato de amônio p.a. e transferir quantitativamente para um balão

volumétrico de 1000 mL, completar o volume e homogeneizar.

Solução de sulfato de cobre a 10%- pesar exatamente 100 g de sulfato de cobre p.a. e transferir quantitativamente para um balão volumétrico

de 1000 mL, completar o volume com água deionizada e homogeneizar.

Solução de ácido sulfúrico 20%- medir 20 mL de ácido sulfúrico p.a. e transferir lentamente para um balão volumétrico de 100 mL,

contendo aproximadamente 50 mL de água deionizada sob resfriamento (Nota 1), completar o volume do

balão com água deionizada e homogeneizar.

Nota 1: Ao preparar soluções contendo ácido, este deve ser sempre adicionado à água de forma lenta sob resfriamento.

6.1.1 Preparo da solução padrão de aflatoxinasSolução trabalhoA solução trabalho "pool" (TP) de AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2 (1:0,5:1:0,5, m/m/m/m) deve ser

preparada conforme a IP/LACQSA/BH/003 “Preparo e padronização de soluções padrões de micotoxinas”.

Durante a manipulação das soluções padrões:

- Retirar os frascos do freezer para ambientação da temperatura, colocá-los em suportes adequados e em

ambiente protegidos da luz;

- Homogeneizar a solução padrão antes da retirada da alíquota desejada;

- Ao abrir o frasco de solução padrão para retirada da alíquota desejada, fazê-lo sempre em capela, com a

guilhotina abaixada, porém com a exaustão desligada.

- Após a retirada da alíquota desejada da solução padrão, selar imediatamente o frasco e retorná-lo para

armazenamento no freezer.

Os cálculos utilizados no preparo deverão ser realizados utilizando a PLN/LACQSA/BH/013 “Preparo de solução

padrão trabalho de micotoxinas”, a qual deve ser impressa para que registros e informações, referentes aos

procedimentos de preparo das soluções padrões sejam inseridos nos campos apropriados.·








Utilizar frascos tratados com ácido sulfúrico ou silanizados, de volume adequado para preparo das soluções

padrões. Os frascos devem ser âmbar ou devem ser protegidos contra a luz fluorescente e solar. Após o

preparo, a solução trabalho deve ser selada com parafilm e armazenada em freezer a temperatura ≤ -15 °C.

Curva de calibração para CCD

Utilizando a solução trabalho "pool" (TP) de AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2, preparar uma curva padrão de

calibração em tolueno:acetonitrila (9:1, v/v) com, no mínimo, cinco concentrações diferentes aproximadamente

iguais àquelas apresentadas na Tabela 1. Os cálculos utilizados no preparo das soluções para a curva de

calibração devem ser realizados utilizando a PLN/LACQSA/BH/018 ”Curvas de calibração para micotoxinas -

Modelos”, a qual deve ser impressa para que registros e informações referentes aos procedimentos de preparo

das soluções padrões sejam inseridos nos campos apropriados. Deverá ser arquivada juntamente na pasta de

preparo de soluções para curva de calibração, podendo, também, uma cópia das planilhas ser apensada aos

registros de acompanhamento de análise ou de testes. Rotular adequadamente as soluções preparadas

(solução, toxina, analista e data).

Tabela 1. Faixas de concentrações aproximadas de AFLA BG para curva de calibração (µg/mL)

Solução preparada AFLAB1 AFLAB2 AFLAG1 AFLAG2

P1 0,020 0,011 0,021 0,012

P2 0,060 0,034 0,062 0,036

P3 0,100 0,056 0,104 0,060

P4 0,153 0,086 0,158 0,092

P5 0,200 0,113 0,208 0,121

Em situações especiais, a curva para quantificação por CCD pode ser obtida pela aplicação de volumes

diferentes (por exemplo 2, 4, 6, 8 e 10 µL) da solução trabalho “pool” de afla BG.

6.2 Determinação de aflatoxinas

As etapas para a análise de Afla B1, Afla B2, Afla G1 e Afla G2 estão descritas de forma resumida no Fluxograma

1.

6.2.1 Extração








- pesar 50 g de amostra (ou 100 g no caso de amostras preparadas em pasta e 25 g no caso de feno) à

temperatura ambiente;

- adicionar 30 mL de solução de cloreto de potássio a 4% e agitar manualmente;

- adicionar 270 mL de metanol e homogeneizar por 5 minutos a velocidade alta (aproximadamente 800 rpm);

- filtrar em papel de filtro qualitativo pregueado, recolhendo os primeiros 150 mL do filtrado;

- transferir essa alíquota de filtrado para um béquer.

6.2.2 Purificação

- adicionar ao béquer contendo a alíquota de 150 mL de extrato, aos poucos e sob agitação com bastão de

vidro, 150 mL de solução de sulfato de amônio 30% ou solução de sulfato de cobre 10%, conforme a matriz que

estiver sendo analisada (ver Nota 2);

Nota 2: - solução de sulfato de amônio a 30% quando a matriz for arroz; cevada; coco; cevada, levedura; milho; ração; sorgo; trigo e ingredientes de ração (farelos de algodão, de arroz, de cacau, de coco, de colza, de dendê, de linhaça, de mandioca, de milho e de trigo; aveia e feno),

- solução de sulfato de cobre a 10% quando a matriz for amêndoas em geral (castanha-do-brasil, pistache e outros); amendoim; feijão; frutas secas; ingredientes de ração (farelos de amendoim, de babaçu, de girassol, de mamona e de soja; farinha de crisálidas; bagaço de cana e radícula de malte).

- após repouso suficiente para ocorrer precipitação (por no mínimo 5 minutos), adicionar, utilizando um béquer,

50 mL de celite agitando com o auxílio de um bastão de vidro;

- após repouso suficiente para ocorrer decantação (por no mínimo 5 minutos), filtrar em papel de filtro qualitativo

pregueado e recolher 150 mL do filtrado;

- transferir os 150 mL obtidos para um funil de separação de 500 mL (no caso de uso de sulfato de cobre, se faz

necessária a adição de 150 mL de água deionizada ao funil de separação, previamente à adição do extrato de

amostra);

- adicionar 50 mL de isooctano ou hexano, exceto quando a matriz for arroz, frutas secas, ingredientes de ração,

milho, feijão ou trigo; e agitar em agitador de funis de separação na velocidade alta ou manualmente durante 1

minuto (ver Nota 3);








Nota 3: O movimento realizado pelo agitador e a inclinação do mesmo dentro do equipamento deve ser tal que produza uma agitação vigorosa do líquido contido no interior do funil.

- deixar que as camadas se separem e aspirar a camada superior ou transferir a camada inferior para outro funil

de separação;

- adicionar mais 50 mL de isooctano ou hexano, agitar por 1 minuto e aspirar a camada superior ou transferir a

camada inferior para outro funil (ver Notas 4 e 5);

Nota 4: Em caso de matrizes que contenham elevado teor de gordura, a etapa de partição com isooctano ou hexano pode ser realizada três vezes.

- adicionar 10 mL de clorofórmio ao funil, agitar em agitador de funis de separação, em velocidade alta ou

manualmente por 2 minutos (ver Nota 3). Deixar que as camadas se separem e recolher a camada inferior

(clorofórmica) em tubo de 50 mL com tampa (ver Nota 5);

- adicionar mais 10 mL de clorofórmio e repetir o procedimento anterior, recolhendo a camada inferior

(clorofórmica) no mesmo tubo (ver Nota 5);

Nota 5: Se em alguma das etapas de partição houver formação de emulsão, proceder da seguinte forma:

escoar lentamente gotas de etanol (3-5 gotas) pelas paredes do funil de separação tanto na partição com hexano quanto com clorofórmio;

partição com hexano ou isooctano: manter o funil, sob refrigeração, por no mínimo 15 minutos. Se a emulsão não se desfizer, adicionar uma alíquota de água (até 100 mL) e agitar manualmente. Se ainda a emulsão não se desfizer totalmente, transferir a camada inferior para outro funil, evitando o risco de perda ao aspirar a camada superior;

partição com clorofórmio: manter o funil, sob refrigeração, por no mínimo 15 minutos. Recolher a fase inferior. Se ainda a emulsão não se desfizer totalmente, recolher toda a fase inferior e aspirar o sobrenadante da fase recolhida. Se não for possível a aspiração, introduzir a pipeta até o fundo do tubo e retirar a alíquota necessária;

utilizar outros procedimentos que se fizerem necessários sob orientação do Responsável.

- homogeneizar o extrato e transferir 10 mL com pipeta graduada para tubo de 15 mL com tampa (ver Nota 6);

Nota 6: Os frascos nos quais serão acondicionados os extratos de amostras devem ser âmbar ou estar protegidos da luz e devidamente identificados com etiqueta da cor correspondente à micotoxina em questão (azul para aflatoxinas), com as letras “EP”, seguidas do código da amostra, da abreviação da toxina analisada (AFLA BG), data de início da análise e nome do analista. Na ausência da etiqueta azul, pode-se utilizar a etiqueta na cor branca.

- medir o volume restante no tubo com o auxílio de pipeta graduada de 10 mL e anotar na ficha de

acompanhamento de análise o volume total de clorofórmio recolhido para cada amostra;

- evaporar os 10 mL do extrato até secura, sob atmosfera de nitrogênio ou de ar comprimido purificado, em

banho de aquecimento com agitação, a aproximadamente 40 °C (consultar a IT do instrumento). Nessa etapa,








após redução do volume do extrato para aproximadamente 1 mL, lavar as paredes do tubo com

aproximadamente 1 mL de clorofórmio, utilizando uma pipeta de Pasteur.

6.2.3 Separação, detecção e quantificação

- dissolver os extratos evaporados obtidos na etapa de purificação com 200 L de tolueno:acetonitrila (9:1, v/v) e

homogeneizar, utilizando agitador de tubos;

- aplicar os extratos purificados das amostras em placas cromatográficas de sílica gel 60 de vidro ou de

alumínio, bidimensionais (ver Nota 7 e Figuras 1 a 5).

- para marcar as placas, utilizar lápis macio, fazendo marcações suaves para evitar danos à sílica.

Nota 7:

- Quando necessário, dessecar as placas de vidro na faixa de temperatura de 110-120 °C por 20 minutos.

- para matrizes como castanha-do-brasil sem casca, amêndoas em geral, amendoim, arroz e coco a análise unidimensional pode ser realizada.

- Se o extrato estiver limpo, ou seja, não apresentar interferentes na região do Rf da toxina, os extratos diluídos (quando necessário) podem ser analisados utilizando placas unidimensionais.

- para matrizes como castanha-do-brasil com casca, feijão, feno; frutas secas; ingredientes de ração, milho; ração; sorgo e trigo a análise bidimensional é a mais indicada.

- para matrizes mais complexas, como polpa cítrica: aplicar o extrato em placa bidimensional 20x20 cm. A placa deve ser eluída em clorofórmio: acetona (9:1, v/v) e éter: metanol: água (96:3:1, v/v/v). Previamente, a placa deve ser eluída em éter anidro nas duas direções. A co-cromatografia deve ser realizada simultaneamente.

Análise unidimensional

- placa unidimensional (ver Figuras 1 e 2);

- aplicar em placa cromatográfica, com microsseringas, 5 L de extrato de amostra (10 L em caso de análise de

castanha-do-brasil) (ver Nota 8) e curva de solução trabalho em “pool” (com 5 pontos no mínimo – Tabela 1);

- armazenar os extratos purificados em freezer;

- secar a placa à temperatura ambiente por 5 minutos, sob exaustão;

- eluir em éter anidro por 4 cm, previamente a eluição em fase móvel (ver Nota 8);









- eluir a placa em éter:metanol:água (96:3:1, v/v/v) ou terbutil-metil-éter: metanol: água (96:3:1, v/v/v);

- secar a placa sob exaustão ou sobre termoplaca (aproximadamente 40°C) ou em estufa (aproximadamente 40

°C);

Nota 8: A placa deve estar suficientemente seca e protegida de luz fluorescente ou luz do sol para evitar degradação das aflatoxinas.

- realizar a análise visual por observação da placa sob luz UV de 365 nm, comparando a intensidade de

fluorescência apresentada pelas amostras (com Rf semelhante aos padrões) com o padrão (ver Nota 11).

Nota 9:

- A leitura visual deve, sempre que possível ser realizada por três analistas treinados e o resultado emitido como média das leituras.

- No caso de leituras menores que a menor concentração ou para amostras que apresentarem uma das leituras ND e, as outras menores ou iguais ao padrão de menor concentração, fazer a média utilizando o valor da concentração do menor padrão e o zero para leituras ND e reportar o resultado como menor que o valor da média.

Análise bidimensional

- placa bidimensional (ver Figuras 3 a 5);

- aplicar em placa cromatográfica, com microsseringas, 5 L de extrato de amostra (10 L em caso de análise de

castanha-do-brasil) e curva padrão em “pool” (Tabela 1);

- eluir a placa, na primeira direção, em éter:metanol:água (96:3:1, v/v/v) ou terbutil metil éter:metanol:água

(96:3:1, v/v/v) (ver Nota 9);

Nota 10: Deve ser adicionado à cuba cromatográfica um volume de 20 mL de fase móvel. Para cuba de canal, o volume deve ser de 10 mL em cada canal.


- eluir a placa em clorofórmio: acetona (9:1, v/v) (saturado por no mínimo 20 minutos) na segunda direção;

- secar a placa sob exaustão ou sobre termoplaca (aproximadamente 40 °C) ou em estufa (aproximadamente 40 °C).

- realizar a análise visual por observação da placa sob luz UV de 365 nm, comparando a intensidade de

fluorescência das manchas das amostras (com Rf semelhante aos padrões) com as do padrão (ver Notas 9 e

11);








- em caso de amostras com fluorescência acima do maior ponto de padrão, diluir a amostra e reaplicar.

Nota 11: Em caso de interferentes na região do Rf das toxinas, dificultando ou impedindo a análise:

eluir a placa em éter anidro;

aplicar a placa novamente e eluir em fase móvel (unidimensional) ou em dupla de fase móvel (bidimensional) diferente da utilizada anteriormente;

observar atentamente, pois algumas matrizes contaminadas contendo grande número de interferentes podem apresentar as toxinas com o Rf deslocado;

em caso de placa unidimensional, reaplicar o extrato em placa bidimensional, para separá-los.

6.2.4 Confirmação

As amostras com resultado positivo, que apresentarem manchas suspeitas deverão ter seus resultados

confirmados.

Confirmação por derivatização com ácido sulfúrico 20%:

- após visualização no cromatovisor, borrifar a placa com a mancha suspeita com solução de ácido sulfúrico

a 20%;

- secar a placa sob exaustão por 10 a 15 minutos;

- fazer leitura no cromatovisor. Caso a mancha suspeita não mude de cor para amarelo, não se trata de

aflatoxina. Caso a mancha mude de cor para amarelo, utilizar um dos procedimentos abaixo como técnica final

de confirmação das aflatoxinas.

Confirmação por co-cromatografia (placa uni ou bidimensional, Figura 1 ou 4):

- aplicar um ponto com 5 µL do extrato da amostra e um ponto com 5 µL do padrão;

- aplicar sobre o extrato da amostra 5 µL do padrão;

- eluir a placa utilizando fase móvel diferente daquela utilizada anteriormente (ou dupla de fase móveis

diferentes no caso de placa bidimensional como, por exemplo, tolueno:clorofórmio:acetato de etila:ácido fórmico

(7:5:5:2, v/v/v/v) em substituição à fase móvel clorofómio:acetona (9:1, v/v)) (ver Nota 11);

- secar a placa sob exaustão;








- verificar, por observação da placa sob luz UV de 365 nm, a superposição ou deslocamento dos Rfs

referentes às aflatoxinas presentes na amostra e no padrão.

Confirmação por derivatização com ácido trifluoroacético (Figura 6):

- em placa bidimensional, aplicar uma alíquota de 5 µL do extrato da amostra do lado esquerdo da placa a

1,5 cm da base e uma alíquota de 5 µL do padrão do lado direito da placa a 1,5 cm da base;

- eluir a placa na primeira direção utilizando CHCl3:acetona (9:1, v/v);

- secar a placa sob exaustão ou sobre termoplaca (aproximadamente 40 °C) ou em estufa

(aproximadamente 40 °C);

- marcar cuidadosamente com um lápis a mancha (suposta) da aflatoxina na amostra;

- girar a placa de 90 graus e aplicar 5 µL de AFLAB1 à 1,0 e 2,5 cm da borda direita;

- adicionar 5 µL de ácido trifluoroacético sobre a mancha da amostra (suposta aflatoxina) e sobre o ponto de

padrão;

- aquecer a placa por 10 minutos a aproximadamente 40 °C sobre termoplaca ou em estufa;

- deixar a placa esfriar e eluir na segunda direção, utilizando a fase móvel éter:metanol:água (96:3:1, v/v/v);

- secar a placa por 5 minutos sob exaustão;

- verificar no cromatovisor a presença da fluorescência azul relativa ao extrato da amostra e ao ponto de

padrão derivatizado com o ácido trifluoroacético com o Rf abaixo do de AFLAB1 (aflatoxina B2A).

- a identificação da AFLAB1 na amostra é confirmada quando o valor do Rf derivatizado coincidir com o Rf

da aflatoxina do padrão derivatizado.

A derivatização com ácido trifluoroacético para confirmação de AFLAG1 em amostras suspeitas pode ser feita

utilizando o mesmo procedimento acima descrito seguido da aplicação de padrão de AFLAG1 (para obtenção de

aflatoxina G2A após derivatização) ao invés de AFLAB1.








Fluxograma 1. Metodologia para análise de Afla BG








Figura 1. Esquema de aplicação para placa unidimensional 10x10 cm ou 10x20 cm sem canal.

Figura 2. Esquema de aplicação para placa unidimensional com canal.








Figura 3. Esquema de aplicação para placa bidimensional 10x10 cm.








Figura 6. Esquema de derivatização de placa utilizando TFA.








7.0 Resultados7.1 Cálculos

Os níveis de contaminação das amostras deverão ser expressos em µg/kg, conforme legislação vigente.

Os cálculos da contaminação de aflatoxinas nas amostras analisadas deverão ser realizados utilizando a

PLN/LACQSA/BH/009 “Resultado de aflatoxina BG por CCD - Incerteza”, a qual considerou a equação 1.

Na realização dos cálculos, considerar todos os algarismos significativos que somente serão arredondados na

emissão do resultado final, utilizando a mesma regra de arredondamento realizado pelo EXCEL.

Caso seja necessário o uso de outra regra de arredondamento, seja devido ao cumprimento de requisitos ou por

solicitação do cliente, deverá ser explicitada no certificado de análise ou em documento de acordo entre as

partes como na análise critica de pedidos, propostas e contratos.

Alterações nos procedimentos descritos neste MET poderão ser efetuadas, desde que não comprometam o

resultado da análise, devidamente autorizadas pelo Responsável e registradas no formulário de análise.

Aflatoxina (g/kg) =

(equação 1)

Sendo:

C (g/mL): concentração do padrão;

m1 (g): massa da amostra extraída (ver Nota 12);

V1 (mL): volume de solvente extração;

V2 (mL): volume da alíquota do primeiro filtrado;

V3 (mL): volume da alíquota do primeiro filtrado mais o volume de solução clarificante;

V4 (mL): volume da alíquota do segundo filtrado;

V5 (mL): volume total de extrato clorofórmico recolhido;

V6 (mL): volume do extrato clorofórmico evaporado;

V7 (µL): volume de retomada do extrato clorofórmico evaporado – extrato final;

V8 (µL): volume de extrato final aplicado em cromatoplaca;

V1 x V3 x V5 x V7 x V9 x C

(m1 x V2 x V4 x V6 x V8)








V9 (L): volume do padrão da toxina aplicado à placa, equivalente por comparação à fluorescência da amostra.

Nota 12: Considerar para fins de cálculos de contaminação:

As informações referentes ao preparo da amostra – seco ou pasta – ver exemplos 1 e 2:

- Exemplo 1: amostras de castanha sem casca em pasta na proporção (1:1, m/v), M1 = 50 g e V1 = 350 mL (dos 100 g da amostra de castanha pesada 50 g é referente à amêndoa e 50 g é referente à água).

- Exemplo 2: amostras de castanha com casca em pasta, M1 = 25 g e V1 = 350 mL (dos 100 g da amostra pesada 25 g é referente à amêndoa e 25 g é referente à casca e 50 é referente à água).

Nota 13: Alterações nos procedimentos descritos neste MET poderão ser efetuadas desde que não comprometam o resultado da análise, devidamente autorizadas pelo Responsável e registradas no formulário de acompanhamento de análise.

Nota 14: Caso sejam feitas diluições no extrato final da amostra, o fator de diluição deverá ser considerado nos cálculos.

7.2 Reportagem de resultados

Nota 15: Limite de detecção

Considerando-se as variações do método para as diferentes matrizes analisadas, em relação ao preparo de amostra, massa pesada de amostra, o volume de clorofórmio recolhido e o volume do extrato aplicação em placa, o limite de detecção para as aflatoxinas pode ser alterado, devendo, no entanto, ser considerado o item 7.0 para fins de reportagem de resultados.

- Declarar se o resultado é corrigido ou não pela recuperação do controle.

- Declarar os valores em porcentagem da recuperação obtida pelos controles.

- Declarar a incerteza expandida estimada com probabilidade de abrangência 95%.

- Reportar o fator de abrangência K.

A expressão do resultado e da incerteza de medição deve ser (y ± U: Resultado ± Incerteza). Quando expressa

em tabela ou Quadro a incerteza deve ser reportada sem o sinal ±.

Sendo: y = resultado = mensurando e U = incerteza expandida com 95% de probabilidade de abrangência.

Importante:








y= corrigido pela recuperação quando aplicável

y= corrigido pelo erro sistemático a princípio somente para procedimentos analíticos quando o erro sistemático

impactar significativamente os resultados.

A incerteza expandida de medição declarada é baseada em uma incerteza padrão multiplicada pelo fator de

abrangência K, com uma probabilidade de abrangência de aproximadamente 95%. Podendo reportar também o

K calculado pelas planilhas que sempre é calculado com uma probabilidade de abrangência de

aproximadamente 95%.

A incerteza é estimada pontualmente por amostra, respeitando a faixa de trabalho de cada método. Quando a

concentração do analito exceder a faixa de trabalho a amostra deve ser diluída de forma que sua concentração

fique dentro da faixa de trabalho validada pelo laboratório para cada um dos seus métodos.

A incerteza é reportada na mesma unidade do mensurando (do analito) de acordo com a unidade da legislação

vigente ou limite crítico estabelecido pelo Laboratório.

A incerteza será reportada com dois (2) algarismos significativos, conforme o proposto pelo GUM, 2012.

O número de algarismos significativos da incerteza poderá ser maior que dois para atender o valor e a unidade

da legislação quando justificável.

A unidade da reportagem de resultado poderá ser modificada, quando necessário ou quando o cliente assim

exigir. Logo a unidade poderá ser modificada para continuar atendendo a premissa de a incerteza ser

representada por dois (2) algarismos significativos.

Os cálculos dos resultados analíticos e da incerteza de medição analítica, realizados em planilhas específicas

pelo Excel, serão efetuados considerando todos os algarismos significativos e não serão arredondados até a

emissão do resultado final. Ao final, quando o resultado for reportado, será utilizada a mesma regra de

arredondamento realizado pelo Excel.

Os limites de detecção e quantificação serão representados nas mesmas condições descritas acima.

Considerar como NQ (não quantificado) resultados inferiores ao limite de quantificação do método: 0,60 ± 0,070

g/kg (AFLAB1); 0,30 ± 0,14 g/kg (AFLAB2); 0,40 ± 0,12 g/kg (AFLAG1); 0,30 ± 0,18 g/kg (AFLAG2); 1,60 ±

0,27 g/kg (AFLATotal).

Os critérios adotados para a aceitabilidade de um resultado analítico são:








- recuperação para AFLAB1 ou AFLATotal entre 50 e 120% para amostras com níveis de contaminação

menores que 1 µg/kg, entre 70-110% para níveis de contaminação entre 1-10 µg/kg e entre 80-110% para

níveis acima de 10 g/kg (POP/LACQSA/BH/009 “Garantia da qualidade analítica”).

Valores de recuperação fora desta faixa poderão ser aceitos, desde que atendam pelo menos ao critério de z-

score, a critério do Responsável, devidamente justificado no formulário de acompanhamento de análise.

A amostra que apresentar resultado maior que o limite da legislação (considerando o destino da amostra) deve

ser reanalisada para confirmação. Caso os resultados dêem diferentes (considerando a incerteza) repetir a

análise e avaliar o processo do preparo da amostra.

Registrar diariamente os dados referentes ao controle intralaboratorial com amostras artificialmente

contaminadas, naturalmente contaminadas ou com material de referência nas planilhas PLN/LACQSA/BH/014

”Carta de controle - Amostras naturalmente contaminadas” e PLN/LACQSA/BH/015 “Carta de controle -

Amostras fortificadas”.

Os resultados determinados para as amostras brancas e fortificadas deverão ser registrados no formulário

FOR/LACQSA/BH/114 “Reportagem de resultados analíticos – Amostra controle” e devolvidos à URPA

juntamente com os resultados das amostras analisadas.

Em caso de amostras cegas, preencher o FOR/LACQSA/BH/032 “Controle intralaboratorial - Análise de

amostras cegas para micotoxinas” e remetê-la ao Responsável.

Os resultados das amostras analisadas somente poderão ser liberados se os resultados do controle

intralaboratorial atenderem aos critérios de aceitabilidade em termos de recuperação e/ou desvio padrão.

Após a verificação e liberação dos resultados das amostras analisadas, os mesmos deverão ser registrados no

FOR/LACQSA/BH/012 “Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas” que deverá ter todos os campos

não utilizados fechados e após verificação deverão ser encaminhadas à URPA.

8.0 ResponsabilidadesAs atribuições e responsabilidades estão definidas no DS/LACQSA/BH/001 “Atribuições e Responsabilidades” e

no DS/LACQSA/BH/005 “Descrição de Função”.

9.0 Referências








DOU, Diário Oficial da União, 2000, Instrução Normativa SDA, no. 09, 24/03/2000, seção 1, publicado em 30/03/2000, 35-42.

IARC (1993) IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans, v. 56, Some naturally occurring substances: food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins, Lyon, pp. 145-156.

PRADO, G., LEITE, M. P. M. B., NICACIO, M. A. S., 1993. Estudo comparativo de métodos analíticos para a quantificação de aflatoxinas em ração animal. Bol. SBCTA, v.27, n.1, 9-13.

SHOEMAKER, D. and TORCHIA, M., 1998, Appendix B: Laboratory Safety, AOAC, CD-Rom.

SOARES, V.L.M., RODRIGUEZ-AMAYA, D. B. 1989, Survey of aflatoxins, ochratoxin A, zearalenone, and sterigmatocysitine in some Brazilian foods by using a multi-toxin thin-layer chromatographic method. J. Assoc. Off. Anal. Chem., v.72, n.1, p. 22-26.

10.0 Documentos referenciadosIP/LACQSA/BH/001-Descontaminação e preparo de materialIP/LACQSA/BH/003-Preparo e padronização de soluções padrões de micotoxinasIS/LACQSA/BH/002-Preparo e controle de lotes de insumos (reagentes, solventes e soluções)POP/LACQSA/BH/002-Controle de equipamentosPOP/LACQSA/BH/003-Acomodações e condições ambientaisPOP/LACQSA/BH/004-Gerenciamento de resíduos no laboratórioPOP/LACQSA/BH/009-Garantia da Validade dos Resultados

11.0 Anexos referenciadosDS/LACQSA/BH/003-Requisitos para calibração, qualificação e verificação de equipamentosDS/LACQSA/BH/005-Descrição de FunçãoDS/LACQSA/BH/011-Aquisição de materiais de consumoFOR/LACQSA/BH/005-Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de micotoxinasFOR/LACQSA/BH/010-Acompanhamento de análises de micotoxinasFOR/LACQSA/BH/012-Reportagem de resultados analíticos de micotoxinasFOR/LACQSA/BH/021-Solicitação Interna de AquisiçãoFOR/LACQSA/BH/024-Comunicado de recebimento e solicitação de amostrasFOR/LACQSA/BH/025-Solicitação de material ao preparoFOR/LACQSA/BH/114-Reportagem de resultados analíticos - Amostra controlePLN/DLAB/PL/007-Lista de Materiais de Consumo por ProcedimentoPLN/LACQSA/BH/009-Resultado de Aflatoxina BG por CCD PLN/LACQSA/BH/013-Preparo de Solução Padrão Trabalho de MicotoxinasPLN/LACQSA/BH/014-Carta de Controle - Amostras naturalmente contaminadasPLN/LACQSA/BH/015-Carta de Controle - Amostras fortificadasPLN/LACQSA/BH/018-Curvas de Calibração para Micotoxinas - Modelos

12.0 Informações de registroAcompanhamento de análises de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/010)Carta de controle - amostras fortificadas (PLN/LACQSA/BH/015)Carta de controle - amostras naturalmente contaminadas (PLN/LACQSA/BH/014)








Comunicado de recebimento e solicitação de amostras (FOR/LACQSA/BH/024)Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/005)Controle Intralaboratorial - Análise de amostras cegas para micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/032)Curvas de Calibração para Micotoxinas - Modelos (PLN/LACQSA/BH/018)Lista de Materiais de Consumo por Procedimento (PLN/DLAB/PL/007)Preparo de Solução Padrão Trabalho de Micotoxinas (PLN/LACQSA/BH/013)Reportagem de resultados analíticos - Amostra controle (FOR/LACQSA/BH/114)Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/012)Resultado de aflatoxina BG por CCD - Incerteza (PLN/LACQSA/BH/009)Solicitação de material ao preparo (FOR/LACQSA/BH/025)Solicitação Interna de Aquisição (FOR/LACQSA/BH/021)

13.0 Arquivos anexadosNão aplicável.

14.0 Controle de alteraçõesEste MET teve origem no POP 043 “Determinação de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 por partição e cromatografia em

camada delgada/visual/densitometria”, conforme sistema de gestão da qualidade do LACQSA/BH em vigor na época

e histórico a seguir.

Revisão Data Responsável Descrição

00 28.10.2000 Luciana C.

01 11.09.2001 Luciana C.Ver na FO 030, anexada ao POP 043, os registros anteriores.

02 20.08.2002Luciana C.

Eliene A. S.








03 16.02.2007 Eliene A. S.

Item 3.6.1, retirado: “faixa de 800 a 1000 rpm” e acrescentado “aproximadamente 800 rpm”.

Retirado “proveta de 250 mL”.

Retirado: “entre 0,24 a 84 ng de AFLAB1, 0,08 a 28 ng de AFLAB2, 0,14 a 49 ng de AFLAG1 e AFLAG2 quando forem utilizadas placas com canal. Para placas sem canal, as menores massas podem ser 0,1; 0,04; 0,06 e 0,04 ng para AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2, respectivamente” e acrescentado (Tabela 1).

Nota 4: substituído “deve” por “pode”.

Retirado “sendo que as menores massas podem ser 0,1; 0,04; 0,06 e 0,04 ng para AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2, respectivamente” inserido (Tabela 1). Inserido nota 8.

Inversão da ordem da nota 8 e 9 e renomeado para 9 e 11.

No item Placa uni e bi foi retirado: “secar a placa à temperatura ambiente por 5 minutos, sob exaustão”; e substituído por “secar a placa sob exaustão ou sobre placa aquecedora (aproximadamente 40oC) ou em estufa (aproximadamente 40oC)”.

Substituído no item 3.7: “Os cálculos podem ser realizados no programa Excel desde que a fórmula tenha sido validada ou utilizando as seguintes fórmulas (ver Nota 13)” por “Os cálculos devem ser realizados utilizando as seguintes Fórmulas 1 e (ver Nota 13) ou utilizando o programa Excel devidamente programada com as fórmulas 1, desde que a planilha tenha sido validada”:

Enumeradas as fórmulas no item 3.7 e mudança na posição das mesmas com retirada das duas informações referentes às formulas.

Alterações na nota 11, renomeada para 12 e inserido o termo exemplo e o texto: Informações referentes ao preparo da amostra – seco ou pasta – ver exemplos 1 e 2.

Substituído M por m nas fórmulas.

Nota 14 Alteração do texto:

“Considerando-se as variações do método para as diferentes matrizes analisadas, em relação ao preparo de amostra, massa pesada de amostra e ao volume de aplicação do extrato em placa, o limite de detecção para as aflatoxinas foi calculado obtendo-se os seguintes valores”.

Para:

Considerando-se as variações do método para as diferentes matrizes analisadas, em relação ao preparo de amostra, massa pesada de amostra, o volume de clorofórmio recolhido e ao volume do extrato aplicação em placa, o limite de detecção para as aflatoxinas pode ser alterado, devendo, no entanto, ser considerado o item 3.8 para fins de reportagem de resultados.








Revisão Data Responsável Descrição

03 16.02.2007 Eliene A. S.

Retirado:

0,3 g/kg para AFLAB1, 0,1 g/kg para AFLAB2 e AFLAG2 e 0,2 g/kg para AFLAG1, o volume de extrato aplicado em placa for de 10 L;

0,4 g/kg para AFB1, 0,2 g/kg para AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2, quando a amostra analisada for pasta e o volume de extrato aplicado em placa for de 10 L;

0,8 g/kg para AFLAB1, 0,3 g/kg para AFLAB2 e AFLAG2 e 0,5 g/kg para AFLAG2, quando a amostra analisada for pasta e o volume de extrato aplicado em placa for de 5 L.

04 25.02.2008 Eliene A. S.

Substituído Coordenador Técnico por Responsável pelas análises.

Inseridas capelas de exaustão em “Equipamentos” e retirados nos de registro dos equipamentos.

Inserido parágrafo em “Procedimentos”: A vidraria e o material a serem utilizados deverão ser identificados, na medida do possível, evitando a troca de frascos de reagentes e amostras.

Item “Preparo de soluções reagentes”: Inserido o preparo conforme POP 036 e a necessidade de ajustar os volumes e massas para o preparo das soluções reagentes para as análises.

Definido etiqueta de cor branca para aflatoxinas na ausência da cor azul.

Inserido fluxograma 1.

05 01.06.2010 Eliene A. S. Substituído FO 009 por FO 221 - Acompanhamento de preparo de soluções padrão

para curva de calibração;

Inserido condições especiais de aplicação de curvas com volumes diferentes

Controle de alterações do MET/LACQSA/BH/002 V.1Versão Data Responsável Descrição

01 19.02.2014 Fernando D. M.

- MET inserido no sistema Docnix, módulo Maxdoc.

- Fluxograma e figuras retirados do item “Anexos” e inseridos ao final do item “Procedimentos”.

- Inseridos no item 7.2 os valores de LQ de acordo com o DS/LACQSA/BH/006.

- Excluídos procedimentos para análise densitométrica.


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