microscopia confocal, 2008a. c. cassola1/56 fluorescência 1. energia radiante = radiação...
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Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 1/56
Fluorescência
• 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética– Natureza da radiação eletromagnética– Espectro eletromagnético.– Natureza dual: onda/partícula
• 2. Fluorescência.– Interação radiação eletromagnética-matéria.– Luminescência: fluorescência e fosforescência.– Fluorescência: Diagrama de Jablonski.– Fluoróforos.
Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 2/56
Energia Radiante – Radiação eletromagnética.
skm
smc
c
000.300459.792.299
Velocidade da onda
Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 3/56
Espectro da radiação eletromagnética
Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 4/56
Espectro da radiação eletromagnética
Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 5/56
Natureza dualística - onda
Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 6/56
Natureza dualística - partícula
JhE
Hzcm
sJh
azulazulfóton
azulazul
azul
19,
14
9
34
1007,4*
10*143,6
10488
1062606896,6
Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 7/56
Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 8/56
Interação radiação EM-matéria: reflexão
Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 9/56
Interação radiação EM-matéria: refração
Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 10/56
Interação radiação EM-matéria: difração
Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 11/56
Microscopia Confocal: Teoria e técnica
• 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética– Natureza da radiação eletromagnética– Espectro eletromagnético.– Natureza dual: onda/partícula
• 2. Fluorescência.– Interação radiação eletromagnética-matéria.– Luminescência: fluorescência e fosforescência.– Fluorescência: Diagrama de Jablonski.– Fluoróforos.
• 3. Microscopia de transmissão• 4. Microscopia de fluorescência “wide-field”• 5. Microscopia confocal • 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão.
Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 12/56
Luminescência – Fluorescência e fosforescência
Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 13/56
Luminescência – Fluorescência e fosforescência
Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 14/56
Fluoróforos de interesse em Biologia
Fluoresceína
Rodamina
Quinina
Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 15/56
Laser x HBO
Laser é um instrumento óptico-eletrônico que emite radiação coerente, em um feixe estreito, de baixa divergência, em um comprimento de onda definido (monocromático)
Espectro do He-Ne laser
Espectro da HBO (mercury-vapor high pressure arc lamp)
Laser (Light Amplification by Stimulated Emission Radiation)
Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 16/56
Laser x HBO
Laser é um instrumento óptico-eletrônico que emite radiação coerente, em um feixe estreito, de baixa divergência, em um comprimento de onda definido (monocromático)
Espectro do He-Ne laser
Espectro da HBO (mercury-vapor high pressure arc lamp)
Laser (Light Amplification by Stimulated Emission Radiation)
Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 17/56
Microscopia Confocal: Teoria e técnica
• 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética– Natureza da radiação eletromagnética– Espectro eletromagnético.– Natureza dual: onda/partícula
• 2. Fluorescência.– Interação radiação eletromagnética-matéria.– Luminescência: fluorescência e fosforescência.– Fluorescência: Diagrama de Jablonski.– Fluoróforos.
• 3. Microscopia de transmissão• 4. Microscopia de fluorescência “wide-field”• 5. Microscopia confocal • 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão.
BCECF – pH indicator
BCECF images
Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 19/56
Fluorescence images
Questões
Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 20/56
1 Examine um eletródio de vidro para pH. Identifique o eletródio sensível e o de referência. Discuta este eletródio de referência (não-polarizabilidade). Depois meça as diferenças de potencial elétrico que o eletródio desenvolve em duas soluções, de pH 4.05 e 6.86. Construa a curva de calibração par o sistema. Meça a voltagem em uma solução de pH a determinar. Determine a concentração de H+ nesta solução.
2. Considere duas soluções de KCl, de 100 mM e 10 mM. Suponha estas soluções em compartimentos separados por uma membrana seletiva, permeável apenas ao cátion. Qual será a diferença de potencial elétrico entre os dois compartimentos (Temperatura de 25⁰C). Aventure-se em considerações da interferência da capacitância de membrana sobre o desenvolvimento da diferença de potencial elétrico.
3. Suponha uma molécula que absorvesse fótons de uma dada energia (ħν) e emitisse radiação, relaxando ao estado basal, após alguns picosegundos (10-12s). Esta molécula poderia ser utilizada como fluorescente?
4. Discuta a estimativas de razão de fluorescência. Porque os indicadores que permitem medidas de razão são mais convenientes nas medidas intracelulares.