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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO BIOMÉDICO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM
MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA APLICADAS (MIP/PPGMPA)
KARINA COSTA COELHO GONÇALVES
PERFIL SOROLÓGICO E DETECÇÃO MOLECULAR DE Toxoplasma
gondii EM GALINHAS (Gallus gallus domesticus) CRIADAS E ABATIDAS
NA REGIÃO DO TRIÂNGULO MINEIRO, MG, BRASIL.
Orientadora: Profª Drª Patrícia Riddell Millar Goulart
Co-orientadora: Profª Drª Daniela Leles
Niterói
2017
KARINA COSTA COELHO GONÇALVES
PERFIL SOROLÓGICO E DETECÇÃO MOLECULAR DE Toxoplasma
gondii EM GALINHAS (Gallus gallus domesticus) CRIADAS E ABATIDAS
NA REGIÃO DO TRIÂNGULO MINEIRO, MG, BRASIL.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação
Stricto sensu em Microbiologia e Parasitologia
Aplicadas, da Universidade Federal Fluminense, como
requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre.
Área de concentração: Parasitologia
Orientadora: Profª Drª Patrícia Riddell Millar Goulart
Co-orientadora: Profª Drª Daniela Leles
Niterói
2017
KARINA COSTA COELHO GONÇALVES
PERFIL SOROLÓGICO E DETECÇÃO MOLECULAR DE Toxoplasma gondii EM
GALINHAS (Gallus gallus domesticus) CRIADAS E ABATIDAS NA REGIÃO DO
TRIÂNGULO MINEIRO, MG, BRASIL.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação
Stricto sensu em Microbiologia e Parasitologia
Aplicadas, da Universidade Federal Fluminense, como
requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área
de concentração: Parasitologia
BANCA EXAMINADORA
Profª. Drª. Beatriz Brener de Figueiredo
Universidade Federal Fluminense (UFF)
Dr. Rodrigo Caldas Menezes
Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas (INI-Fiocruz)
Drª. Maria Regina Reis Amendoeira
Instituto Oswaldo Cruz (IOC-Fiocruz)
Profª. Drª. Adriana Pittella Sudré - Suplente
Universidade Federal Fluminense (UFF)
Niterói
2017
Dedico aos meus pais e avós
“É preciso força pra sonhar e perceber que a
estrada vai além do que se vê...”.
(Los Hermanos)
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Patrícia Riddell Millar Goulart, por aceitar estar ao meu lado durante a
minha formação acadêmica, me acolhendo desde a minha primeira iniciação à pesquisa e me
mostrando o mundo da Parasitologia pelo qual sou apaixonada. Obrigada por todos os
ensinamentos durante todos esses anos, por todo carinho, por toda paciência, compreensão e
confiança. Muito obrigada por tudo!
À minha co-orientadora, Daniela Leles, pela disponibilidade em me acompanhar em muitos
momentos nesta pesquisa, principalmente na parte prática, por toda contribuição para
melhoria deste trabalho, pelos momentos divertidos e conversas durante esse período, e por
tudo que me ensinou durante todos esses anos.
À Drª Maria Regina Reis Amendoeira pelo apoio fundamental na realização deste projeto.
À Drª Kênia de Fátima Carrijo pela colaboração com a coleta das amostras e dados dos
animais estudados, e por toda atenção e gentileza nas trocas de e-mails.
À Universidade Federal Fluminense por todos os bons momentos durante esses sete anos, por
todas as experiências, por todos os encontros e pela possibilidade de realizar este projeto.
Ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e Parasitologia Aplicadas e aos
professores que fazem parte deste programa por todo conhecimento compartilhado.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo auxílio
concedido.
Às professoras do Departamento de Parasitologia do Instituto Biomédico da UFF, Adriana
Pittella Sudré, Danuza Mattos, Beatriz Brener, por todos os momentos, ajuda e ensinamentos.
À equipe do Laboratório de Toxoplasmose e outras Protozooses do Instituto Oswaldo Cruz,
Ana Letícia Carvalho, Marcelo Vasconcellos, pela receptividade, por tudo que me ensinaram
e por permitirem momentos leves no laboratório em meio ao caos. Agradeço em especial ao
amigo Igor Falco, pelo carinho e por toda atenção, e à Pâmela Figueiredo por me ensinar as
técnicas com paciência e calma, por me receber com carinho, pelos momentos de
descontração e por me dar um abraço de urso quando precisei.
Aos meus pais, Lacy Gonçalves e Denize Gonçalves, por sempre estarem ao meu lado, me
incentivando, me apoiando em cada decisão. Por sempre me proporcionarem o melhor que
podiam me dar. Muito obrigada por tudo que fizeram por mim a vida inteira! Amo vocês!
Aos meus avós, Waldir Coelho e Lúcia Coelho, por serem os melhores avós que alguém
poderia ter e por todo amor. Por sempre me ajudarem e torcerem pelo meu sucesso. Amo
vocês!
Aos amigos Gabriela Góes, Clarissa Silveira, Taíssa Trancoso e Igor Falco por estarem
presentes nos momentos de desespero, me apoiando. Pelos bons momentos, pelas risadas, e
por fazerem essa fase passar de maneira mais leve. Adoro vocês!
À amiga Gabriela Góes pela parceria desde o início em todas as horas e momentos, pela
ajuda, por estar comigo em todos os momentos (bons e ruins) durante esses anos. Amizade da
vida! Amo você! Agradeço também à família Góes por me acolher no momento em que mais
precisei de ajuda durante o mestrado e por todo carinho de sempre. Vocês são minha família
em Niterói. Gratidão!
À banca examinadora pela disponibilidade de participar da avaliação deste trabalho e pela
colaboração para melhoria do mesmo.
A todos que participaram e contribuíram direta ou indiretamente desta etapa!
RESUMO
A toxoplasmose é uma zoonose de ampla distribuição mundial, causada pelo Toxoplasma
gondii, um protozoário coccídio intracelular obrigatório, que pode infectar o homem e outros
animais de sangue quente, sendo os felídeos os hospedeiros definitivos do parasito. O estudo
da prevalência de T. gondii em aves de produção é de grande importância para saúde coletiva,
devido à carne e ovos desses animais serem apontados como fontes de infecção para o
homem, além de serem esses animais considerados sentinelas da contaminação ambiental,
pelo seu hábito de ciscar no solo. Visto isso, este estudo tem como objetivos determinar a
frequência de anticorpos anti-T. gondii em soro de galinhas criadas e abatidas na região do
Triângulo Mineiro, Minas Gerais, detectar molecularmente o parasito nos tecidos (coração e
cérebro) em algumas das aves sorologicamente positivas, e averiguar variáveis de risco
associadas à infecção. Foram testados soros de 417 frangos, e foi observado que 37,65%
(157/417) das amostras testadas pelo método de RIFI, foram soropositivas apresentando
títulos maiores ou iguais a 1:16. Já pela técnica de HAI foi observada uma soropositividade de
75,06% (313/417). Calculado o índice Kappa verificou-se uma concordância fraca entre as
técnicas (0,087), sendo assim a técnica de RIFI foi considerada padrão-ouro neste estudo. Foi
verificada associação estatisticamente significativa entre a soropositividade e as variáveis:
idade (p<0,0001), município de procedência (p=0,0025), tipo de alimentação (p<0,0001),
fonte de água (p<0,0001) e criação em conjunto (p<0,0001). Não foi observada associação
estatística entre as variáveis: sexo, presença de gatos, presença de ratos e vermifugação. O
diagnóstico molecular apontou para a presença de DNA do parasito em duas amostras de
cérebro, de indivíduos diferentes, os quais pertenciam ao sistemas de criação intensivo e semi-
intensivo. O sequenciamento confirmou a presença de T. gondii, e as sequências recuperadas
apresentaram 100% de similaridade com amostras de diferentes localidades e extraídas de
diferentes espécies de animais depositadas no Genbank. Os resultados apontam para o fato de
que a carne desses animais abatidos pode estar atuando como fonte de transmissão deste
protozoário para o ser humano, e indicam contaminação ambiental na região estudada.
Palavras-chave: Toxoplasma gondii, galinhas domésticas, sorologia, diagnóstico molecular
ABSTRACT
Toxoplasmosis is a zoonosis of worldwide distribution, caused by Toxoplasma gondii, a
Protozoan intracellular coccid required, which can infect humans and other warm-blooded
animals, being the felids definitive hosts. The study of the prevalence of T. gondii in poultry
production is of great importance to public health, due to the meat and eggs of these animals
have been reported singled out as sources of infection for the humans, as well as these animals
are considered sentinels of environmental contamination, by their habit of picking up on the
ground. This study aims to determine the frequency of antibodies against T. gondii in serum
of domestic chickens raised and slaughtered in the region of the Triângulo Mineiro, Minas
Gerais, and to detect DNA of the parasite in tissues (heart and brain) of serologically positive
birds. Sera of 417 chickens were tested, and it was observed that 37.65% (157/417) of
samples tested by the IFAT positive, showing titles greater than or equal to 16.A
seropositivity of 75.06% (313/417) was found by IHAT. Kappa value of 0,087 calculated
there was a weak correlation between the techniques (0.087). Therefore, the IFAT was
considerate gold standard in this study. Statistically significant association was observed
between seropositivity and the variables: age (p < 0.0001), municipality of origin (p =
0.0025), type of feed (p < 0.0001), water supply (p < 0.0001) and creating together (p <
0.0001). Statistical Association was not observed among the variables: gender, presence of
cats, the presence of rats and worming. The molecular diagnosis pointed to the presence of
DNA of the parasite in two samples of brain of different individuals, which belonged to the
intensive and semi-intensive system. Sequencing confirmed the presence of the parasite, and
retrieved sequences presented 100% similarity to different localities and samples extracted
from different species of animals deposited in Genbank. The results point to the fact that the
meat of these slaughtered animals may be acting as a source of transmission of this protozoan
to the human, and indicate environmental contamination in the region studied.
Keywords: Toxoplasma gondii, domestic chickens, serology, molecular diagnosis
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 17
2. OBJETIVOS ................................................................................................................. 19
2.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 19
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................... 19
3. REVISÃO DA LITERATURA .................................................................................... 21
3.1. Toxoplasma gondii E A TOXOPLASMOSE ............................................................ 21
3.1.1. TAXONOMIA ............................................................................................................ 21
3.1.2. HISTÓRICO .............................................................................................................. 21
3.1.3. HOSPEDEIROS .......................................................................................................... 24
3.1.4. ESTÁGIOS EVOLUTIVOS E FORMAS INFECTANTES..................................................... 24
3.1.4.1. Taquizoítas .................................................................................................. 25
3.1.4.2. Bradizoítas ................................................................................................... 27
3.1.4.3. Oocistos (Esporozoítas)............................................................................... 28
3.1.5. CICLO BIOLÓGICO ................................................................................................... 30
3.1.6. EPIDEMIOLOGIA E MECANISMOS DE INFECÇÃO ....................................................... 32
3.1.7. CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS ............................................................................... 35
3.2. INFECÇÃO POR Toxoplasma gondii EM HUMANOS ........................................... 39
3.3. INFECÇÃO POR Toxoplasma gondii EM ANIMAIS DE PRODUÇÃO ................ 40
3.3.1. TOXOPLASMOSE: O PAPEL DAS GALINHAS DOMÉSTICAS NA INFECÇÃO .................... 42
3.4. A CRIAÇÃO DE GALINHAS NO BRASIL ............................................................ 47
3.5. DIAGNÓSTICO ........................................................................................................ 49
3.5.1. DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO .................................................................................... 49
3.5.2. DIAGNÓSTICO DIRETO ............................................................................................. 52
3.5.3. DIAGNÓSTICO MOLECULAR ..................................................................................... 52
3.6. PROFILAXIA ............................................................................................................ 54
4. MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................... 57
4.1. ÁREA DE ESTUDO ................................................................................................. 57
4.2. POPULAÇÃO ESTUDADA ..................................................................................... 58
4.3. COLETA DAS AMOSTRAS .................................................................................... 58
4.3.1. COLETA DAS AMOSTRAS DE SANGUE ....................................................................... 58
4.3.2. COLETA DAS AMOSTRAS DE TECIDO ........................................................................ 59
4.4. ANÁLISES LABORATORIAIS ............................................................................... 60
4.4.1. HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA (HAI) ....................................................................... 60
4.4.2. REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (RIFI) ............................................. 60
4.4.3. ENSAIO MOLECULAR .............................................................................................. 61
4.5. QUESTIONÁRIO EPIDEMIOLÓGICO .................................................................. 62
4.6. ANÁLISE DOS DADOS ........................................................................................... 62
4.7. ASPECTOS ÉTICOS ................................................................................................ 63
5. RESULTADOS ............................................................................................................ 64
5.1. DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO ............................................................................. 65
5.1.1. QUESTIONÁRIO EPIDEMIOLÓGICO ........................................................................... 70
5.2. DIAGNÓSTICO MOLECULAR .............................................................................. 72
6. DISCUSSÃO ................................................................................................................ 77
7. CONCLUSÕES ............................................................................................................ 87
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 89
9. APÊNDICES .............................................................................................................. 114
9.1. APÊNDICE A .......................................................................................................... 115
9.2. APÊNDICE B .......................................................................................................... 116
9.3. APÊNDICE C ...................................................................................................... 117
RESUMO APRESENTADO EM CONGRESSO ............................................................. 117
10. ANEXO ...................................................................................................................... 118
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Esquema da porção anterior de um taquizoíta de Toxoplasma gondii. ..................... 25
Figura 2: Representação esquemática da morfologia geral da forma taquizoíta de Toxoplasma
gondii. ....................................................................................................................................... 26
Figura 3: Endodiogenia de taquizoítas de Toxoplasma gondii. ................................................ 27
Figura 4: Comparação entre as morfologias de taquizoíta e bradizoíta de Toxoplasma gondii
.................................................................................................................................................. 28
Figura 5: Morfologia de esporozoíta e oocistos de Toxoplasma gondii. .................................. 29
Figura 6: Ciclo biológico de Toxoplasma gondii.. ................................................................... 30
Figura 7: Esquema representativo das formas de transmissão do parasito T. gondii para os
humanos. ................................................................................................................................... 33
Figura 8: Soroprevalência mundial da infecção por Toxoplasma gondii na espécie humana
. ................................................................................................................................................. 39
Figura 9: Mapa do Brasil com ampliação para o estado de Minas Gerais, com destaque em
verde a área de estudo (Triângulo Mineiro). ............................................................................ 57
Figura 10: Amplificações para alvo ITS1 de Toxoplasma gondii em cérebros dos frangos do
estudo.. ...................................................................................................................................... 73
Figura 11: Amplificações para alvo ITS1 de Toxoplasma gondii em cérebros dos frangos do
estudo.. ...................................................................................................................................... 73
Figura 12: Alinhamento de sequências nucleotídicas de fragmento da região ITS de T. gondii
. ................................................................................................................................................. 76
LISTA DE GRÁFICO
Gráfico 1: Número total de frangos analisados distribuídos de acordo com o sexo e o tipo de
criação ao qual foram destinados.............................................................................................. 64
Gráfico 2: Número total de frangos analisados distribuídos de acordo com a faixa etária e o
tipo de criação ao qual foram destinados. ................................................................................ 65
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Frequência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em galinhas de criação extensiva
de diferentes estados brasileiros por diferentes métodos de diagnóstico. ................................ 45
Tabela 2: Frequência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em galinhas de criação intensiva
de diferentes estados brasileiros por diferentes métodos de diagnóstico. ................................ 47
Tabela 3: Distribuição dos frangos criados e abatidos nos municípios de Araguari e
Uberlândia, Triângulo Mineiro (MG), no período de agosto de 2015 a janeiro de 2016, quanto
às técnicas sorológicas, sistemas de criação e frequência de anticorpos anti-T. gondii. .......... 66
Tabela 4: Ocorrência de anticorpos IgG anti- T. gondii identificada pela técnica de Reação de
Imunofluorescência Indireta, com os respectivos títulos, em soro de frangos criados e abatidos
nas cidades de Uberlândia e Araguari, Triângulo Mineiro (MG), no período de agosto de 2015
a janeiro de 2016....................................................................................................................... 67
Tabela 5: Ocorrência de anticorpos IgG anti- T. gondii identificada pela técnica de
Hemaglutinação Indireta, com os respectivos títulos, em soro de frangos criados e abatidos
nas cidades de Uberlândia e Araguari, Triângulo Mineiro (MG), no período de agosto de 2015
a janeiro de 2016....................................................................................................................... 67
Tabela 6: Comparação dos resultados da sorologia para identificação de anti- Toxoplasma
gondii em frangos, obtidos por meio da HAI e da RIFI, para cálculo de concordância por meio
do coeficiente Kappa. ............................................................................................................... 68
Tabela 7: Distribuição dos frangos criados e abatidos nos municípios de Araguari e
Uberlândia, Triângulo Mineiro, no período de agosto de 2015 a janeiro de 2016 de acordo
com o sexo e a frequência de anticorpos anti-T. gondii nas amostras estudadas. .................... 68
Tabela 8: Distribuição dos frangos criados e abatidos nos municípios de Araguari e
Uberlândia, Triângulo Mineiro, no período de agosto de 2015 a janeiro de 2016 de acordo
com a faixa etária e a frequência de anticorpos anti-T. gondii nas amostras estudadas. .......... 69
Tabela 9: Distribuição dos frangos criados e abatidos, no período de agosto de 2015 a janeiro
de 2016, de acordo com o município de procedência e a frequência de anticorpos anti-T.
gondii nas amostras estudadas. ................................................................................................. 70
Tabela 10: Distribuição dos frangos criados e abatidos nos municípios de Araguari e
Uberlândia, Triângulo Mineiro, no período de agosto de 2015 a janeiro de 2016 segundo
possíveis fatores de risco para infecção por Toxoplasma gondii. ............................................ 71
Tabela 11: Características dos indivíduos com amostras amplificadas na PCR para alvo ITS1
para Toxoplasma gondii. .......................................................................................................... 74
Tabela 12: Animais com os quais as sequências obtidas nesse estudo apresentaram 100% de
similaridade de acordo com a localização, número de acesso no Genbank e material isolado
para a realização do ensaio molecular. ..................................................................................... 75
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIDS - Acquired Immunodeficiency Syndrome
BPA – Boas Práticas Agrícolas
DNA - Desoxyribonucleic Acid
ELISA – Enzyme-linked Immunosorbent Assay
FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz/IOC – Instituto Oswaldo Cruz
FITC - Isotiocianato de Fluoresceína
HAI – Hemaglutinação Indireta
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IgA – Imunoglobulina A
IgE – Imunoglobulina E
IgG – Imunoglobulina G
IgM – Imunoglobulina M
IgY – Imunoglobulina Y
LabTOXO – Laboratório de Toxoplasmose e outras protozooses
MAT – Teste de Aglutinação Modificado
PBS – Tampão fosfato-salino
PCR – Polimerase Chain Reaction
PCR-RFLP – Polimerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorfism
RIFI – Reação de Imunofluorescência Indireta
SAG2 - Surface antigen 2 gene
ITS – Internal Transcribed Spacer
17
1. INTRODUÇÃO
A toxoplasmose é uma zoonose mundialmente distribuída, causada pelo protozoário
Toxoplasma gondii (SILVA et al., 2006), parasito intestinal de felídeos, hospedeiros
definitivos, e também pode acometer tanto populações humanas como outros animais de
sangue quente, os quais são os hospedeiros intermediários, incluindo as aves (GALLI et al.,
2008).
A infecção por T. gondii pode se disseminar entre os animais e humanos por variados
mecanismos de transmissão, dentre eles, a ingestão de oocistos em alimentos e água
contaminados, ou pela ingestão de carnes ou seus derivados crus ou mal cozidos contendo
cistos teciduais, e ainda pela transmissão congênita. Menos frequente se dá pelo contato direto
com secreções dos animais infectados, acidentes de trabalho, transfusão de sangue ou
transplante de órgãos (DUBEY, 2006). Apesar dos mecanismos de transmissão da
toxoplasmose serem conhecidos, não se pode determinar qual a principal via de infecção para
os seres humanos (AMENDOEIRA, COSTA & SPALDING, 1999).
Formas viáveis do T. gondii têm sido isoladas de uma grande variedade de carnes e
produtos cárneos e, estudos sorológicos no Brasil tem evidenciado ampla distribuição da
infecção entre animais de produção (MILLAR et al., 2008a). Em aves, a infecção é
normalmente inaparente ou latente, sendo a presença de sintomatologia pouco comum
(GONÇALVES et al., 2013). Segundo Hill & Dubey (2013), galinhas domésticas criadas
extensivamente são importantes na epidemiologia da toxoplasmose não só por representarem
fonte de infecção para os animas, incluindo gatos e seres humanos, que ingerem sua carne,
mas também por serem consideradas como um bom indicador da contaminação do solo por
oocistos de T. gondii. Sendo assim, são utilizadas como animais sentinelas, uma vez que elas
têm o hábito de ciscar e serem suscetíveis à infecção pelo protozoário.
18
Estudos moleculares de T. gondii isolados na Europa e América do Norte o
classificaram em três linhagens genéticas, designadas tipos I, II, III, sendo considerados
clonais e com baixa diversidade genética (SILVA et al., 2014). No entanto, estudo de isolados
da América do Sul, principalmente do Brasil, evidenciaram que T. gondii possui uma maior
variabilidade genética, e as cepas I e III são mais recorrentes e amplamente distribuídas,
enquanto que as cepas do tipo II são encontradas com menos frequência; contudo os alelos
identificados foram considerados alelos atípicos (BEZERRA et al., 2012; MONCADA &
MONTOYA, 2012).
A infecção pelo Toxoplasma gondii no Brasil é amplamente prevalente tanto no ser
humano quanto em animais, tendo sido observada elevada taxa de ocorrência clínica em seres
humanos. Apesar das aves constarem entre os hospedeiros sensíveis à infecção pelo T. gondii,
o papel da carne desses animais, bem como de seus ovos, na transmissão da toxoplasmose
ainda não está completamente esclarecido como uma via de transmissão importante.
Desta maneira, este estudo torna-se de grande importância, uma vez que busca
esclarecer o papel desses animais na região do Triângulo Mineiro, em Minas Gerais, como
possíveis fontes de infecção para seres humanos que se alimentem de sua carne e/ou ovos.
Outro fator relevante é a ausência de métodos diagnósticos que identifiquem o parasitismo
pelo T.gondii na linha de abate, o que faz do diagnóstico sorológico e molecular importantes
ferramentas para se detectar a ocorrência da infecção nos animais de produção. Tais medidas
seriam importantes para traçar medidas profiláticas adequadas para diminuir ou mesmo
eliminar a presença do protozoário nas propriedades de origem dos animais.
A região de estudo tem destaque na pecuária nacional, sendo importante no
abastecimento do mercado interno e também externo. Mesmo diante deste cenário, no que diz
respeito à infecção toxoplásmica nos animais de produção, existe carência de pesquisas. Foi
realizado na cidade de Uberlândia em 2016, um estudo em que os autores verificaram alto
percentual de soropositividade em galinhas de criação extensiva (LOPES et al., 2016), e
considerando que trabalhos na região acerca de infecção por Toxoplasma gondii em aves,
tanto caipiras como de criação intensiva, são raros, e a alta soropositivadade encontrada no
trabalho supracitado, mais estudos na região são necessários. Além disso, trabalhos em
humanos na região do Triângulo Mineiro também são escassos e os que foram realizados
apresentaram elevado percentual de soropositividade para T. gondii, como observado por
Segundo e colaboradores (2004), que encontraram uma frequência de 57,6% e 41,9% em
pacientes de hospitais público e privado, respectivamente, na cidade de Uberlândia.
19
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Determinar a frequência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em frangos criados, nos
sistemas extensivo, semi-intensivo e intensivo abatidos na região do Triângulo Mineiro,
Minas Gerais, identificar os possíveis fatores de risco associados à infecção nos animais, e
detectar molecularmente o parasito em tecidos de algumas aves soropositivas.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Verificar, por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e da
Hemaglutinação Indireta (HAI), a frequência de anticorpos IgG anti-Toxoplasma
gondii em galinhas domésticas criadas e abatidas na região do Triângulo Mineiro
(MG);
Avaliar a concordância das técnicas de imunodiagnóstico na detecção de anticorpos
anti-T. gondii;
Verificar a presença de DNA de T. gondii em amostras de tecidos (cérebro e coração)
de algumas galinhas soropositivas por meio da técnica de Reação em cadeia da
Polimerase (PCR);
20
Avaliar a associação de variáveis epidemiológicas com os resultados sorológicos e
moleculares obtidos, para detectar prováveis fontes de infecção bem como os
possíveis mecanismos envolvidos na transmissão de Toxoplasma gondii na população
estudada.
21
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1. Toxoplasma gondii E A TOXOPLASMOSE
3.1.1. TAXONOMIA
Segundo a classificação taxonômica proposta por Adl e colaboradores (2012), o
protozoário intracelular obrigatório Toxoplasma gondii (do grego toxon = arco; plasma =
molde) está classificado da seguinte maneira:
SUPERGRUPO: SAR (Adl et al., 2012)
INFRAREINO: Alveolata (Cavalier-Smith, 1991)
FILO: Apicomplexa (Levine, 1970)
CLASSE: Conoidasida (Levine, 1988)
SUBCLASSE: Coccidia (Leuckart, 1879)
ORDEM: Eucoccidiorida (Leuckart, 1879)
SUBORDEM: Eimeriorina (Leger, 1911)
FAMÍLIA: Sarcocystidae (Poche, 1913)
GÊNERO: Toxoplasma (Nicolle & Manceaux, 1909)
ESPÉCIE: Toxoplasma gondii (Nicolle & Manceaux, 1909)
3.1.2. HISTÓRICO
Toxoplasma gondii foi evidenciado pela primeira vez, em julho de 1908, em São
Paulo, Brasil, por Alfonso Splendore (1908) no coelho da espécie Oryctolagus cuniculus. Em
outubro do mesmo ano, Charles Nicolle e Luis Herbert Manceaux (1908) descreveram um
microrganismo, semelhante ao observado por Splendore, em células monocelulares do baço e
22
fígado do roedor Ctenodactylus gundi, no Instituo Pasteur de Tunis, Tunísia, Norte da África.
Coincidentemente, a infecção foi reconhecida primeiramente em animais de
laboratório, e ambos os grupos de pesquisadores pensaram inicialmente se tratar de um
parasito pertencente ao gênero Leishmania. No entanto, no ano seguinte, os autores Nicolle &
Manceaux (1909) reconheceram que se tratava de um novo parasito, introduzindo o gênero
Toxoplasma, nomeando a espécie Toxoplasma gondii.
A primeira descrição da toxoplasmose congênita em humanos foi realizada no ano de
1923, pelo oftalmologista Jankü, em uma criança de 11 meses de idade falecida na cidade de
Praga, Tchecoslováquia, com hidrocefalia e cegueira, cuja necropsia, em cortes do globo
ocular direito, evidenciou a presença de parasitos semelhantes a Toxoplasma gondii dispostos
em cistos oculares (JANKÜ, 1923). Em 1927, Carlos Bastos Magarinos Torres relatou o
primeiro caso no Brasil, na cidade do Rio de Janeiro, em que observou a partir de autopsia em
uma menina recém-nascida, lesões no sistema nervoso central, coração e músculo esquelético
e a presença do parasito intracelular (TORRES1, 1927 apud GUIMARÃES, 1943).
Em 1939, na cidade de Nova Iorque, Estados Unidos, Wolf, Cowen & Paige foram os
primeiros a identificar conclusivamente T. gondii como causa da toxoplasmose congênita, a
qual levou uma criança no primeiro mês de vida ao falecimento, demonstrando na autopsia o
parasito em lesões de encefalomielite e retinite. O parasito foi isolado de animais inoculados
com material da medula espinhal e córtex cerebral após necropsia da mesma, sendo assim,
esses autores realizaram a primeira transmissão experimental de toxoplasmose humana para
animais (WOLF, COWEN & PAIGE, 1939 a,b).
Os autores Pinkerton & Weinman, no ano de 1940, foram os primeiros a descrever
T. gondii como causa de toxoplasmose adquirida em um jovem adulto que morreu com
infecção concomitante com Bartonella e febre (PINKERTON & WEINMAN, 1940).
Somente após a introdução da técnica sorológica desenvolvida por Sabin & Feldman
(1948), “Dye Test”, que se tornou possível a realização de estudos clínicos e epidemiológicos
sobre a real incidência da infecção por Toxoplasma, demonstrando a prevalência mundial da
toxoplasmose e que a maioria dos indivíduos se apresenta assintomática após infecção.
Durante a década de 1960, foi relatada a importância epidemiológica da transmissão
da infecção por meio da ingestão de carne crua ou mal cozida, bem como o reconhecimento
1 TORRES, C.M. Morphologie d,um nouveau parasite de l’homme, Enxephalitozoon chaga, N. sp., observe dans um
cãs de meningo-encephalo-myelite congenitale avec myosite et myocardite. C. R. Soc. Biol. ,97:1787-1790, 1927.
23
da função epidemiológica do gato no ciclo evolutivo do parasito, demonstrando que esses
animais poderiam eliminá-lo nas fezes (DESMONTS et al., 19652 apud FERGUSON, 2009;
HUTCHINSON, 1965).
Em 1969, Frenkel, Dubey & Miller reconheceram que se tratava de um protozoário
coccídio, e descreveram por completo o ciclo biológico deste agente etiológico que tem por
hospedeiro definitivo os felídeos em geral, incluindo o gato doméstico, e como hospedeiros
intermediários, mamíferos e aves (FRENKEL, DUBEY & MILLER, 1970). O papel do
oocisto como estrutura infectante e forma de resistência do parasito foi descrito quase
simultaneamente por diferentes grupos de pesquisadores nos Estados Unidos, Reino Unido,
Alemanha e Holanda (HUTCHISON et al., 1969, 1970; FRENKEL, DUBEY & MILLER,
1970; SHEFFIELD & MELTON, 1970; OVERDULE, 1970; WITTE & PIEKARSKI, 1970;
WEILAND & KÜHN, 1970; HUTCHISON et al. , 1971).
A partir de 1981, com o surgimento da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
(SIDA), a toxoplasmose teve uma maior relevância em virtude da possibilidade de
reagudização, que pode ocorrer em indivíduos cronicamente infectados pelo protozoário.
Adicionalmente, a gravidade da forma reagudizada para estes pacientes, tornando-se uma
importante causa de morbidade e mortalidade (ISRAELKI et al., 1991).
Entre as décadas de 1980 e 1990 foram desenvolvidos métodos para reconhecimento
das diferenças genéticas entre isolados de T. gondii procedentes de seres humanos e animais
(DUBEY & JONES, 2008).
A toxoplasmose em galinha doméstica (Gallus gallus domesticus) foi descrita pela
primeira vez por Hepding (1939) na Alemanha. As principais lesões encontradas na ave foram
neurite do nervo ciático, retinocoroidite e encefalite, e o parasito foi encontrado no exame
histológico da retina (HEPDING3, 1939 apud DUBEY, 2010b). Sparapani (1950), na Itália,
descreveu uma doença em galinhas com evidências de ter sido ocasionada por T. gondii, e
Fankhauser (1951), na Suíça, relatou toxoplasmose em uma galinha que apresentava lesões
cerebrais e um grande número de parasitos nos tecidos. No entanto, a toxoplasmose realmente
comprovada foi primeiramente relatada por Erichsen & Harboe (1953) em um rebanho de 40
2 DESMONTES, G., Couvreur, J., Alison, F., Baudelot, J., Gerbaux, J., Lelong, M. Etude épidemiologique sur la
toxoplasmose de l’influence de La cuisson dês viandes de boucherie sur La fréquénce de l’infection humaine, Revue
Française dês Estudes Cliniques et Builigiques, 10, 952-958, 1965
3 HEPDING, L. Ueber Toxoplasmen (Toxoplasma gallinarum n sp.) in der retina eines huhne and uber deren
beziehung zur huhnerlahmung. Zeitschr. Infektkr.v.55, p.109-116, 1939.
24
galinhas da raça White Leghorn, na Noruega. Posteriormente, a toxoplasmose clínica em
frangos foi relatada no Brasil, por Nóbrega e colaboradores (1954; 1955).
3.1.3. HOSPEDEIROS
Toxoplasma gondii é um protozoário intracelular obrigatório heteroxênico facultativo
que tem a capacidade de infectar todas as células nucleadas, diversos tecidos, tendo
preferência por tecido nervoso e muscular esquelético, bem como uma grande variedade de
hospedeiros, que desempenham o papel de hospedeiros intermediários no ciclo evolutivo do
protozoário. Portanto, não apresentam especificidade na fase de reprodução assexuada,
podendo parasitar os vertebrados homeotérmicos, sendo estes, mamíferos domésticos,
silvestres ou marinhos, e aves (DUBEY, 2010a; ROBERT-GANGNEUX & DARDÉ, 2012;
DLUGONSKA, 2014).
No entanto, a reprodução sexuada do ciclo de vida de T. gondii ocorre somente no
epitélio intestinal de mamíferos pertencentes à família Felidae, que inclui gatos domésticos e
felídeos silvestres, promovendo a formação de oocistos não esporulados que serão eliminados
juntamente com as fezes desses animais (FRENKEL, DUBEY & MILLER, 1970; TENTER,
HECKEROTH & WEISS, 2000; DUBEY, 2010a,b).
3.1.4. ESTÁGIOS EVOLUTIVOS E FORMAS INFECTANTES
Existem três formas infectantes de Toxoplasma gondii: taquizoítas, bradizoítas e
esporozoítas. Os taquizoítas são formas invasivas que se dividem rapidamente, facilitando a
disseminação do parasito durante a fase aguda da infecção por via oral ou vertical. Os
bradizoítas se dividem lentamente, e são encontrados em cistos teciduais, proporcionando a
infecção por via oral em hospedeiros carnívoros, sobrevivendo em hospedeiros
imunocompetentes e mantendo a infecção crônica. E os esporozoítas, que são disseminados
no ambiente protegidos dentro de oocistos, capazes de causar infecção por via oral nos
hospedeiros (DUBEY, LINDSAY & SPEER, 1998; SIBLEY & AJIOKA, 2008; ROBERT-
GANGNEUX & DARDÉ, 2012). Todas as formas são haploides, enquanto que taquizoítas e
bradizoítas se dividem assexuadamente, e os esporozoítas são produtos de meiose (SIBLEY et
al., 2009).
25
3.1.4.1. Taquizoítas
O taquizoíta mede cerca de 2 a 4µm de largura e 4 a 8µm de comprimento
(MONTOYA & LIESENFELD, 2004), é uma célula polarizada, de forma arqueada, que
apresenta uma extremidade anterior afilada (conoidal) e uma extremidade posterior
arredondada. Na extremidade anterior estão localizados os anéis polares, o conóide, as
róptrias e os micronemas, estruturas que formam o complexo apical, envolvido na invasão
ativa e sobrevivência nas células do hospedeiro (HU et al., 2006; SOUZA et al., 2010)
(Figuras 1 e 2).
Figura 1: Esquema da porção anterior de um taquizoíta de Toxoplasma gondii. (Fonte: Adaptado de
Souza et al., 2010)
26
Figura 2: Representação esquemática da morfologia geral da forma taquizoíta de Toxoplasma gondii
(Fonte: Souza et al., 2010).
Essas estruturas se multiplicam rapidamente em uma ampla variedade de células
nucleadas dos hospedeiros durante a fase aguda da infecção. A invasão do parasito é dada
pela mobilidade à base de actina. À medida que os taquizoítas penetram nas células geram um
vacúolo parasitóforo derivado, principalmente, da invaginação da membrana plasmática da
célula hospedeira, em que ele é capaz de sobreviver e multiplicar (SIBLEY et al., 2007;
FURTADO et al., 2012).
No interior do vacúolo parasitóforo, os taquizoítas se dividem a cada 6-9 horas por um
processo denominado endodiogenia (Figura 3), em que as células filhas são formadas
internamente na célula mãe (MORRISSETTE & SIBLEY, 2002). Depois de repetidas
divisões dos taquizoítas, as células hospedeiras são rompidas. E essa ruptura promove a
disseminação, através da corrente sanguínea, das estruturas parasitárias que vão infectar novas
células e tecidos, incluindo o sistema nervoso central, tecido ocular, músculo esquelético e
cardíaco, e a placenta. A forma taquizoíta provoca uma forte resposta inflamatória, podendo
levar a quadros com manifestações clínicas, por conseguinte, promove intensa resposta imune
que controla a replicação do parasito, mas não elimina a infecção (MONTOYA &
LIESENFELD, 2004; SIBLEY et al., 2009). Os taquizoítas se diferenciam em bradizoítas sob
a pressão da resposta imune formando cistos (MONTOYA & LIESENFELD, 2004).
27
Figura 3: Endodiogenia de taquizoítas de Toxoplasma gondii.
Legenda: Diagramas de cortes longitudinais de T. gondii em vários estágios durante a multiplicação.
(A) Representação das estruturas celulares em interfase. As linhas pretas representam os conóides, as
linhas em verde claro representam o complexo de membrana interna, as róptrias estão representadas
em azul claro, micronemas em lilás, grânulos densos em azul, apicoplasto em rosa, mitocôndria em
vermelho, complexo de Golgi em amarelo escuro, núcleo em cinza e retículo endoplasmático rugoso
em amarelo. (B) Célula na metade de sua divisão. Em verde escuro está representado o
desenvolvimento do arcabouço do complexo de membrana interna das células-filhas que abrangem o
complexo de Golgi e o apicoplasto já divididos e o núcleo que começa a se dividir (mitocôndria e
outras organelas não demonstradas para maior clareza). (C) Complexos de membrana interna das
células-filhas crescem depois de estabelecer duas células completas, que estão prestes a emergir,
adquirindo a membrana plasmática da mãe e assim, formar dois novos parasitos (Fonte: Adaptado de
Nishi et al., 2008).
3.1.4.2. Bradizoítas
Os bradizoítas medem cerca de 7µm x 1,5µm e não diferem muito estruturalmente dos
taquizoítas, que possuem um núcleo situado mais centralmente, enquanto que os primeiros
tem seu núcleo próximo à extremidade posterior (Figura 4). Apesar das semelhanças
morfológicas e reprodutivas (ambas realizam endodiogenia) entre essas duas estruturas, os
bradizoítas apresentam características diferentes dos taquizoítas como a multiplicação lenta e
expressão de moléculas estágio-específicas, além de se apresentarem funcionalmente
diferentes (MONTOYA & LIESENFELD, 2004; HILL et al., 2005).
28
Figura 4: Comparação entre as morfologias de taquizoíta e bradizoíta de Toxoplasma gondii.
Legenda: Desenhos esquemáticos de um taquizoíta (esquerda) e um bradizoíta (direita) de T. gondii
(Fonte: Adaptado de DUBEY, LINDSAY & SPEER, 1998).
Bradizoítas são considerados a forma latente do parasito, e se encontram em cistos
teciduais, que podem permanecer em diversos tipos celulares sem causar danos ou reação
inflamatória durante a vida do hospedeiro, sendo a forma característica da infecção crônica
(DUBEY, LINDSAY & SPEER, 1998; FURTADO et al., 2012).
Contudo, a morte da célula hospedeira pode provocar o rompimento da parede do
cisto, resultando na liberação de bradizoítas. Estes são resistentes à pepsina-HCl e podem
sobreviver no meio ácido entre uma e duas horas, permitindo, desse modo, a sua transmissão
através da ingestão (ROBERT-GANGNEUX & DARDÉ, 2012).
3.1.4.3. Oocistos (Esporozoítas)
Os oocistos não esporulados possuem forma subesférica a esférica, e medem cerca de
10µm x 12µm de diâmetro (Figura 5A). Estes esporulam apenas no ambiente, após sua
eliminação nas fezes de felídeos infectados, e necessitam de condições ideais como umidade e
temperatura para que o processo de esporulação ocorra. Nos oocistos esporulados estão
presentes dois esporocistos com forma elipsoide, os quais, cada um contem quatro células
29
haploides denominadas esporozoítas (Figura 5B e 5C), que medem de 2µm x 6µm a 2µm x
8µm de tamanho (HILL et al., 2005).
A)
B) C)
Figura 5: Morfologia de esporozoíta e oocistos de Toxoplasma gondii.
Legenda: A) Desenho esquemático de um esporozoíta de T. gondii (Fonte: Adaptado de DUBEY,
LINDSAY & SPEER, 1998) B) Oocisto esporulado de T. gondii, em preparação úmida, observado em
microscopia de contraste de interferência diferencial. C) Oocisto não esporulado de T. gondii em
preparação úmida, observado em microscopia de contraste de interferência diferencial (Fonte: CDC,
2017).
Oocistos são formas de resistência ambiental e possuem a parede celular com uma
estrutura de múltiplas camadas, permitindo que o parasito fique protegido de danos mecânicos
e químicos. Viabilizando, assim, sua sobrevivência por longos períodos em ambientes com
condições ideias (ROBERT-GANGNEUX & DARDÉ, 2012).
30
Durante a infecção aguda, milhares de oocistos são eliminados nas fezes de felídeos.
Após a esporulação, que pode ocorrer entre 1 e 5 dias após a eliminação dos oocistos, estas
estruturas se tornam infectantes para seus hospedeiros (DUBEY, LAPPIN & THULLIEZ,
1995; HILL et al., 2005).
3.1.5. CICLO BIOLÓGICO
O ciclo biológico do Toxoplasma gondii apresenta duas fases: uma fase assexuada e
extraintestinal, que ocorre em hospedeiros intermediários, e uma fase sexuada e
enteroepitelial presente nos hospedeiros definitivos, que abrange qualquer espécie de felídeos
doméstico ou silvestre (HUTCHISON, 1965; DUBEY E FRENKEL, 1972) (Figura 6).
Figura 6: Ciclo biológico de Toxoplasma gondii. Biologia, infecção e replicação dos três estádios
infecciosos do parasito nos respectivos hospedeiros (Fonte: Adaptado de Robert-Gangneux & Dardé,
2012).
A reprodução sexuada do parasito ocorre no interior das células epiteliais do intestino
de felídeos, após a ingestão de formas infectantes como, cistos teciduais contendo bradizoítas,
presentes nos tecidos dos animais predados, ou oocistos esporulados presentes no ambiente.
Após a ingestão, a parede do cisto ou do oocisto é rompida e os bradizoítas ou esporozoítas
31
são liberados, respectivamente, invadindo ativamente as células enteroepiteliais e
multiplicando-se por um processo denominado esquizogonia, responsável pela formação de
merozoítas. Estes merozoítas rompem as células onde são formados e invadem novas células,
onde se diferenciam em gametas masculino e feminino pelo processo de gametogonia
(DUBEY, 2010a; JONES & DUBEY, 2010; 2012).
Após a fertilização dos gametas, ocorre a formação do zigoto que dará origem aos
oocistos no interior das células intestinais. Estes são liberados pela ruptura das células e
excretados juntamente as fezes dos gatos infectados em sua forma não esporulada, ou seja,
ainda não infectante. No ambiente, esta estrutura sofre transformações, ocorrendo o processo
de esporulação ou esporogonia, tornando-se potencialmente infectante. Esta transformação
ocorre sob condições ideais de temperatura, umidade, incidência solar e concentração de
oxigênio. Esse processo leva a formação do oocisto esporulado que irá apresentar dois
esporocistos, cada um contendo quatro esporozoítas haploides em seu interior (DUBEY,
1994; HILL et al., 2005). Os oocistos são excretados por apenas 1 ou 2 semanas, mas podem
permanecer viáveis por até 24 meses. A eliminação de oocistos ocorre normalmente em
animais jovens, durante a fase aguda da infecção, uma vez que desenvolvem imunidade após
a primo-infecção (DUBEY & BEATTIE, 1988; DUBEY, LAPPIN & THULLIEZ, 1995).
Estes oocistos esporulados estarão presentes no ambiente, contaminando o solo e água,
e podem permanecer viáveis por longos períodos de tempo, sendo uma forma importante de
infecção para hospedeiros intermediários e, eventualmente também para os hospedeiros
definitivos (TENTER, HECKEROTH & WEISS, 2000; TORREY & YOLKEN, 2013).
A fase assexuada ocorre nos hospedeiros intermediários, após a ingestão de formas
infectantes. Esses hospedeiros poderão adquirir o parasito e desenvolver a fase assexuada por
meio da ingestão de oocistos maduros contendo esporozoítas presentes no solo, água e/ou
alimentos; de taquizoítas eliminados no leite cru; ou de cistos teciduais encontrados em
vísceras e musculatura de animais infectados, quando cruas ou mal cozidas (DUQUE et al.,
2013). É importante ressaltar que as formas de taquizoítas que chegam ao estômago serão
destruídas, mas as que penetrarem na mucosa oral poderão evoluir do mesmo modo que os
cistos e oocistos (ROBERT-GANGNEUX & DARDÉ, 2012).
Cada forma infectante sofrerá intensa multiplicação, após rápida passagem pelo
epitélio intestinal, e penetrará em vários tipos de células do organismo, formando um vacúolo
citoplasmático (vacúolo parasitóforo) onde sofrerão divisões sucessivas por endodiogenia,
formando novos taquizoítas, os quais serão liberados a partir do rompimento da membrana
32
das células epiteliais, na linfa ou no sangue e invadirão novas células. Esta fase inicial da
infecção (fase proliferativa) caracteriza a fase aguda da doença, podendo provocar um quadro
polissintomático, cuja gravidade dependerá da quantidade de formas infectantes adquiridas,
cepas do parasito e da suscetibilidade do hospedeiro (GROSS et al., 2004; JONES &
DUBEY, 2010, 2012; ROBERT-GANGNEUX e DARDÉ, 2012; ROBERT-GANGNEUX,
2014). Durante esta fase, essas estruturas podem estimular intensa resposta inflamatória no
hospedeiro, o que pode fazer com que se diferenciem em bradizoítas, os quais ficam contidos
dentro de cistos teciduais. Os cistos teciduais podem surgir em 7 a 10 dias após a infecção e
podem permanecer durante toda a vida, e ocorrem preferencialmente no cérebro ou
musculatura (ROBERT-GANGNEUX & DARDÉ, 2012; SULLIVAN Jr & JEFFERS, 2012).
O rompimento dos cistos pode ocorrer, liberando os bradizoítas, podendo gerar em
imunocomprometidos, a conversão em taquizoítas e consequentemente, a reagudização da
infecção (TENTER, HECKEROTH & WEISS, 2000; HILL et al., 2005; DUBEY, 2008).
O período pré-patente (tempo para liberação de oocistos após a infecção inicial) e a
frequência de liberação de oocistos variam de acordo com o estágio evolutivo de T. gondii
ingerido pelo hospedeiro definitivo. Sendo assim, períodos pré-patentes após a ingestão de
cistos teciduais são de 3 a 10 dias e 18 dias ou mais depois de ingerir oocistos esporulados
(DUBEY & FRENKEL, 1972; 1976; DUBEY, 1996; 2001; 2005), e 13 dias ou mais após a
ingestão de taquizoítas (DUBEY, 1998). Menos de 30% dos gatos eliminam oocistos após a
ingestão de taquizoítas ou oocistos, ao passo que uma alta porcentagem dos gatos elimina
oocistos após a ingestão de cistos teciduais (DUBEY & FRENKEL, 1976; DUBEY, 1996).
3.1.6. EPIDEMIOLOGIA E MECANISMOS DE INFECÇÃO
Toxoplasma gondii é um dos parasitos mais comuns em todo o mundo, e diversos
fatores como idade, hábitos alimentares, culturais, e de higiene são responsáveis pela
variabilidade da frequência com que uma infecção por este coccídio ocorre nas diferentes
regiões do planeta em seres humanos (AMENDOEIRA, COSTA & SPALDING, 1999;
TENTER, HECKEROTH & WEISS, 2000).
O Brasil é um dos países em que há alta prevalência de T. gondii na população
humana e animal, podendo atingir níveis de infecção correspondentes a 100% em animais em
algumas regiões (OLIVEIRA et al., 2009).
33
Uma pequena parcela da população humana, principalmente adultos, ou animais que
sejam suscetíveis à infecção desenvolvem sinais clínicos decorrentes da infecção
toxoplásmica. Diversos fatores podem estar associados à gravidade da toxoplasmose nos
indivíduos imunocompetentes, como a cepa e a variabilidade genética do parasito e do
hospedeiro (PENA et al., 2011).
A chave da epidemiologia da toxoplasmose parece ser os felídeos, os quais são os
únicos hospedeiros que apresentam a forma de reprodução sexuada, liberando oocistos
juntamente às fezes, que vão contaminar o solo, tornando-se formas resistentes da infecção
após a esporulação (ARAÚJO et al., 1998). Ainda, acrescenta-se o fato de que esses animais
enterram suas fezes, ampliando as condições de sobrevivência do oocisto (FIALHO et al.,
2009).
A transmissão da toxoplasmose para o homem pode se dar, principalmente, de três
maneiras (Figura 7):
Figura 7: Esquema representativo das formas de transmissão do parasito T. gondii para os humanos.
(Fonte: Adaptado a partir de ESCH & PETERSEN (2013) e de ROBERT-GANGNEUX (2014)).
(1) ingestão de carne crua ou mal cozida contendo cistos de bradizoítas (GARCIA et
al., 2006). O hábito de consumir carne crua ou mal cozida torna o consumo de carnes e
produtos cárneos uma relevante via de transmissão, tanto para os humanos quanto para
animais domésticos carnívoros, que em algumas regiões são alimentados com sobras de carne
e vísceras cruas (TENTER, 2009). Um aspecto importante a ser considerado é que os cistos de
34
T. gondii não são visíveis a olho nu, logo não são observados na inspeção post mortem
realizada em frigoríficos, o que faz com que carnes mesmo contendo o protozoário sejam
liberadas para o consumo humano sem restrições (DUBEY et al., 1998; SILVA &
LANGONI, 2001).
(2) ingestão de oocistos esporulados provenientes de fezes de felídeos, por meio de
água ou alimentos contaminados (LAPPIN, 2004; CLEMENTINO et al., 2007). Outra fonte
de infecção para hospedeiros suscetívieis é a ingestão de moluscos bivalves filtradores, como
mexilhões, contendo oocistos esporulados (EISMERIN et al., 2010; PUTGNANI et al., 2011).
A infecção através da ingestão de oocistos é elevada em certas regiões apontando para um
papel importante dos gatos domésticos na disseminação do parasito entre seres humanos e
outros animais domésticos e selvagens, dado que a carga ambiental de oocistos pode ser muito
alta (TORREY & YOLKEN, 2013). A contaminação ambiental por estas estruturas apresenta
grande importância epidemiológica, já que oocistos podem permanecer viáveis no solo e na
água por períodos superiores a um ano, principalmente em regiões tropicais, que são quentes e
úmidas (GOMEZ-MARIN et al., 2011). Podem contaminar fontes e reservatórios de água de
abastecimento e, por serem resistentes aos métodos comumente utilizados para tratamento da
água, podem continuar viáveis (DUMÈTRE et al., 2008).
A transmissão por ingestão de água proveniente de reservatórios contaminados com
oocistos já foi associada a vários surtos de toxoplasmose em seres humanos em diferentes
regiões do mundo (ARAMINI et al., 1999; BAHIA-OLIVEIRA et al., 2003; MOURA et al.,
2006; BALASUNDARAM et al., 2010). A água e o solo contaminados podem proporcionar a
contaminação de frutas e vegetais com oocistos, de maneira que o consumo destes alimentos
crus e mal higienizados pode ser um importante fator de risco para a infecção por Toxoplasma
(BERGER et al., 2009; KNIEL et al., 2002; LIU et al., 2009).
(3) transmissão transplacentária de taquizoítas (TENTER, HECKEROTH & WEISS,
2000). A transmissão transplacentária ou congênita é uma das formas mais graves da
infecção. Ocorre quando o agente, na forma de taquizoíta coloniza os tecidos placentários
durante a disseminação do parasito na infecção aguda, conseguindo atravessar a barreira
placentária, em humanos e outros mamíferos como, por exemplo, ovinos e caprinos, podendo
gerar a ocorrência de abortamentos e natimortos, ou infecção do feto, ocasionando graves
consequências para o mesmo, dependendo do trimestre da gestação, e/ou para o recém-
nascido (REMINGTON & DESMONTS, 1990; DENKERS & GAZZINELLI, 1998;
FRENKEL, 2004; ROBERT-GANGNEUX, 2014). Todavia, a mulher imunocompetente que
35
adquiriu a infecção por T. gondii meses antes da concepção já possui imunidade protetora,
que vai prevenir a transmissão vertical para o feto. A exceção ocorre em mulheres
imunocomprometidas previamente infectadas, as quais podem transmitir o parasito para seus
fetos (WECHSLER et al., 1986).
A infecção ainda pode ser adquirida pela transfusão sanguínea, transplante de órgãos,
acidentes laboratoriais e ingestão de leite de caprinos contaminado com taquizoítas (HLL &
DUBEY, 2002; DUBEY, 2006). A transmissão através da transfusão de sangue e transplante
de órgãos ocorre de um doador soropositivo para um receptor soronegativo. Nesses casos, a
transmissão ocorre se o receptor apresentar resposta imunitária celular deficiente, podendo
estabelecer, dessa forma, uma infecção de caráter oportunista. Pode ocorrer também, a
reativação de infecção crônica no receptor após o transplante em decorrência da
imunossupressão causada pela medicação imunossupressora utilizada após cirurgia de
transplante. Cistos podem estar presentes em uma gama de órgãos e tecidos, no entanto
determinados órgãos são preferencialmente infectados como músculos e cérebro. Logo,
pacientes que recebem transplante de coração possuem maior risco de adquirir toxoplasmose
relacionada ao órgão (CAMARGO, 2001; ROBERT-GANGNEUX & DARDÉ, 2012). A
ingestão do leite de cabra não pasteurizado contaminado com taquizoítas é uma possível fonte
de infecção, e sugere que estas formas podem penetrar os tecidos de mucosa antes da
destruição pelas enzimas digestivas. (BONAMETTI et al., 1997; TENTER, HECKEROTH &
WEISS, 2000; JONES et al., 2009). Já o risco de infecção por leite de vaca é considerado
mínimo, assim como a ingestão de ovos de galinha crus (DUBEY, 1994; DUBEY, 2010b).
3.1.7. CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS
Estudos genotípicos com isolados de T. gondii de seres humanos e animais na Europa
e América do Norte demonstraram uma população clonal, a qual foi classificada em uma das
três linhagens clonais chamadas tipos I, II e III (DARDÉ et al., 1992, HOWE & SIBLEY,
1995; AJZENBERG et al., 2002). No entanto, estudos recentes relataram que isolados do
parasito no Brasil são biológica e geneticamente distintos dos tipos clonais I, II e III, e são
mais virulentos para camundongos (DUBEY et al., 2002; LEHMANN et al., 2006; DUBEY
et al., 2007a; PENA et al., 2008).
Estima-se que a origem destas linhagens clonais provém de um antepassado comum de
aproximadamente 10.000 anos atrás. E estas expandiram rapidamente acometendo uma
36
variedade de hospedeiros (SU et al., 2003). Isto corresponde ao mesmo período de tempo em
que ocorreu a domesticação de animais agrícolas, bem como a adoção de animais de
companhia como os gatos domésticos (DRISCOLL et al., 2007; SIBLEY et al., 2009).
Pena e colaboradores (2008) identificaram por PCR-RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism) genótipos em 125 isolados de galinhas, cães e gatos; quatro destes
isolados foram consideradas linhagens clonais comuns no Brasil, designados como tipos BrI,
BrII, BrIII e BrIV (Pena et al., 2011). Estes trabalhos relatam a presença de cepas com uma
elevada taxa de recombinação.
Lehmann e colaboradores (2006) determinaram a frequência de genótipos, avaliando
sete locus polimórficos a partir de amostras de galinhas (Gallus gallus) coletadas em diversas
regiões do mundo. Os resultados deste estudo sugerem que T. gondii possui quatro
populações, sendo duas restritas às Américas do Sul e Central (SA1 e SA2), uma população
presente na Europa, Ásia, África e América do Norte (RW), mas ausente das Américas do Sul
e Central e uma quarta população, de distribuição cosmopolita (WW). O cálculo das
distâncias genéticas entre os variados haplótipos analisados permitiu a formulação da hipótese
de que o parasito teria surgido na América do Sul, onde então estaria concentrado o maior
grau de variabilidade genética. Com isso, dois eventos migratórios distintos teriam originado
as populações RW (mais antiga) e WW (mais recente), tendo esta última sido levada a todo o
mundo através das navegações a partir do século XVI.
Sibley & Ajioka (2008) abordam diversos estudos sobre a origem da diversidade da
população de Toxoplasma gondii no mundo. Este trabalho aponta hipóteses para o surgimento
do parasito na América do Norte, o que diverge do trabalho de Lehmann e colaboradores
(2006). A primeira evidência elucidada é de que todas as sondas genéticas utilizadas pelos
autores mencionados acima, estavam baseadas na diversidade observada na América do
Norte. Além disso, alguns estudos de genotipagem se basearam em marcadores
microssatélites (LEHMANN et al. 2006), que são propensos à homoplasia e, portanto, são
menos confiáveis para genotipagem e análises filogenéticas. Como tal, muitos estudos
subestimam o nível de diversidade genética das cepas da América do Sul ou as classificam
erroneamente devido a utilização de marcadores inadequados, resultando em conclusões
incorretas. Como exemplo, a ideia de que alguns tipos clonais vistos na América do Norte
predominam na América do Sul, como as cepas de tipo I (DUBEY et al., 2002; DUBEY et al.,
2004; SANTOS et al., 2005; SILVA et al., 2005; MOURA et al., 2006), baseia-se em
37
marcadores que não captam completamente a diversidade genética da América do Sul e
inadequadamente as agrupam com as cepas clonais do tipo I.
A explicação mais simples é que as cepas norte e sul americanas divergiram de um
ancestral comum, adquirindo posteriormente mutações que se fixaram em seu respectivo
continente. Este padrão é surpreendentemente diferente do observado entre a América do
Norte e a Europa, onde as populações são homogêneas. Logo se pressupõe que as forças que
levaram à separação das cepas norte-americanas e sul-americanas, e que as mantém
separadas, são baseadas em uma estimativa do ancestral comum mais recente entre as cepas
norte e sul. As diferenças que definem cada região são tidas por uma estimativa de 1 a 2
milhões de anos para a sua ascendência comum (KHAN et al., 2007). Vários eventos na
biogeografia podem explicar a divergência de T. gondii entre a América do Norte e América
do Sul. Uma possível explicação foi o estabelecimento da reconexão da ponte de terra do
Panamá depois de uma separação de mais de 50 milhões anos, e quase ao mesmo tempo,
estima-se que membros da família dos felídeos, migraram da América do Norte para a
América do Sul e posteriormente foram submetidos a uma rápida especiação (MARCHALL
et al., 1982; JOHNSON et al., 2006; KHAN et al., 2007). Essa conclusão refuta a hipótese
anterior de que as cepas da América do Sul eram mais antigas do que aquelas encontradas na
América do Norte (SIBLEY & AJJIOKA, 2008).
A partir da evolução da RFLP-PCR, outros estudos mostraram que as cepas na
América do Sul são notadamente diferentes daquelas isoladas em hospedeiros da Europa ou
Estados Unidos (HOWE & SIBLEY, 1995; PENA et al. 2006). Tais estudos foram, na sua
maioria, realizados em cepas isoladas de animais domésticos e mostraram que as cepas
encontradas na América do Sul são mais virulentas (SANTOS et al., 2005; PENA et al. 2012).
Contudo, como mencionado anteriormente a maioria de isolados de Toxoplasma a
partir de animais e humanos são agrupados em três linhagens clonais por meio de técnicas
moleculares (AJZENBERG et al, 2002a;. AJZENBERG et al, 2002b.). As diferenças de
sequenciamento entre estas três linhagens são menos do que 1%, mas a sua virulência é muito
diferente. Em contraste ao tipo I, os tipos II e III são menos virulentos (SIBLEY &
BOOTHROYD, 1992). Encontrar a maior prevalência desses tipos no ambiente pode ajudar a
aumentar o conhecimento sobre o risco de infecção humana e manifestações relacionadas
(BOOTHROYD & GRIGG, 2002).
Segundo Howe & Sibley (1995), as cepas de T. gondii classificadas em tipo I estão
geralmente associadas a casos de toxoplasmose aguda em humanos. O genótipo tipo II ocorre
38
predominante em pacientes imunocomprometidos e em casos de toxoplasmose congênita e
ocular em humanos. Já as cepas do tipo III são mais frequentemente encontradas em animais.
A cepa padrão virulenta RH (SABIN, 1941) é classificada como tipo I e pode ser
considerada a mais patogênica. Dessa maneira, é utilizada com maior frequência em pesquisas
e diagnóstico, devido as suas características de rápida replicação, alta produtividade e
eficiência em romper as células do hospedeiro, facilitando o isolamento de um grande número
de taquizoítas. Outras cepas padrão, tais como a Me49 (tipo II) e VEG (tipo III) são
empregadas em estudos relacionados à infecção latente, já que são caracterizadas por uma
menor patogenicidade e pela formação de cistos (ROOS, et al., 1994).
Howe e colaboradores (1997) desenvolveram um sistema de tipagem de cepas de T.
gondii, fundamentado na análise de fragmentos de restrição do gene SAG2 (do inglês –
Surface Antigen 2 Gene) amplificados por Nested-PCR, o que permite uma diferenciação
entre os genótipos das três linhagens clonais, previamente descritos por Howe & Sibley
(1995). No Brasil, esse método foi utilizado para a análise de isolados de T. gondii em São
Paulo (DUBEY et al., 2002), Rio de Janeiro (DUBEY et al., 2003a) e Paraná (DUBEY et al.,
2003b), que mostrou ser predominantemente do tipo I. Ferreira e colaboradores (2006),
utilizando PCR-RFLP multilocus, demonstraram que as cepas recombinantes brasileiras
apresentavam genótipos com alelos típicos das cepas de tipo I, II, e III, na maioria dos loci.
Dubey e colaboradores (2012) organizaram 363 amostras de diferentes isolados de T.
gondii encontradas no Brasil até o referido ano, que foram tipadas utilizando-se 10
marcadores de PCR-RFLP. A partir destas amostras foram identificados 106 genótipos
originais, sendo cada um deles designado com um número de genótipo ToxoDB PCR-RFLP.
Os três genótipos mais comuns foram os números 6 (11,0%), 8 (6,3%) e 11 (5,5%), sendo
estes principais genótipos anteriormente designados por tipo BrI, BrIII e BrII,
respectivamente.
Lopes e colaboradores (2016), na cidade de Uberlândia, isolaram duas cepas,
utilizando os marcadores (SAG1, SAG2, new SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22–8, c29–2,
L358, PK1, Apico e CS3), e foram denominadas TgChBrUD1 (genótipo 11) e TgChBrUD2
(genótipo 6), provenientes do tecido cardíaco de galinhas de criação extensiva. Ambos
isolados demonstraram alta virulência em modelo murino e o isolado TgChBrUD1 foi capaz
de induzir cistos cerebrais.
39
3.2. INFECÇÃO POR Toxoplasma gondii EM HUMANOS
A toxoplasmose humana apresenta distribuição cosmopolita e estima-se que entre 30 e
90% da população que vive na América Central, América do Sul e Europa esteja infectada.
Enquanto que nos Estados Unidos este percentual varia entre 8 e 22% (HILL & DUBEY,
2016). Os índices de soropositividade variam entre os países, entre regiões de um mesmo país
e, até mesmo, entre diferentes comunidades vivendo em uma mesma região (MAENZ et al.,
2014; ROBERT-GAGNEUX & DARDÉ, 2012) e dependem de fatores climáticos,
socioeconômicos, culturais (FIALHO et al., 2009), região geográfica e hábito alimentar
(TENTER, HECKEROTH & WEISS, 2000) (Figura 8).
Figura 8: Soroprevalência mundial da infecção por Toxoplasma gondii na espécie humana. Mapa
representando a distribuição da infecção por T. gondii em humanos nos diferentes países de cada
continente a partir de estimativas das taxas de soroprevalência. Os países marcados com mais de uma
cor (áreas estriadas) apresentam grandes variações regionais nas taxas de soroprevalência. Fonte:
(Adaptado a partir de Maenz et al (2014) e de Robert-Gangneux (2014))
As infecções primárias dão origem a cistos teciduais semidormentes, que não são
eliminados após tratamento. Consequentemente, infecções crônicas predispõem os indivíduos
ao risco de reagudização da infecção. Na maioria dos casos, as infecções a longo prazo
permanecem clinicamente não sintomáticas. No entanto, vários estudos têm encontrado uma
associação entre soropositividade e distúrbios psiquiátricos atípicos em humanos (TORREY
et al., 2007).
40
Quando ocorre a primo-infecção, pouco antes ou durante a gravidez, pode ocorrer a
transmissão pela via transplacentária, acarretando um quadro de toxoplasmose congênita. A
toxoplasmose congênita pode levar a uma grande variedade de manifestações clínicas, que
vão desde lesões oculares, com desenvolvimento de retinocoroidite, até casos mais graves, em
que o bebê pode desenvolver hidrocefalia, convulsões e microcefalia, podendo acarretar a
morte fetal (WONG & REMINGTON, 1994; MCLEOD et al., 2009).
A toxoplasmose pode ser fatal em indivíduos imunocomprometidos, como pacientes com
SIDA. Nestes pacientes, a toxoplasmose na maioria das vezes ocorre como resultado da
reativação da infecção crônica, e o sistema nervoso central é o local mais comumente afetado pela
infecção (MONTOYA & LIESENFELD, 2004). Sendo assim, a neurotoxoplasmose é a
apresentação clínica mais comum da toxoplasmose entre as pessoas com SIDA (DUBEY &
JONES, 2008).
3.3. INFECÇÃO POR Toxoplasma gondii EM ANIMAIS DE PRODUÇÃO
Em animais de produção, a infecção toxoplásmica apresenta-se, na maioria dos casos,
assintomática. O surgimento de sintomas depende de diferentes fatores, como idade do
animal, espécie e virulência intrínseca da linhagem (TENTER, HECKEROTH & WEISS,
2000).
Dentre as diversas espécies animais, os caprinos, ovinos e suínos são mais sensíveis à
infecção pelo T. gondii quando comparados aos bovinos, equinos e aves, os quais raramente
apresentam sintomatologia (MILLAR et al., 2008a; GOULART, BRENER &
AMENDOEIRA, 2013)
Nos animais domésticos de produção, T. gondii pode causar sintomas como
hipertermia, prostração e anorexia, no entanto, os maiores problemas são de âmbito
reprodutivo, tais como aborto, repetição de cio, natimortalidade e natimorbidade (VIDOTTO
et al. 1987). A transmissão congênita é importante, tanto para a saúde coletiva quanto para a
sanidade animal e pode ocorrer quando fêmeas não infectadas contraem o parasito durante a
prenhez (DUBEY et al. 1994).
Ovinos e caprinos são, dentre os animais de produção, os mais sensíveis à infecção
pelo T. gondii (SILVA, 2009). O estudo da toxoplasmose entre esses animais é de grande
importância devido a potencial ocorrência de problemas reprodutivos e a possibilidade de
transmissão do agente para o ser humano, seja pelo consumo de carne ou leite de animais
41
infectados (SILVA et al., 2003). Há uma preocupação sobre a transmissão de T. gondii por
meio do leite de cabra in natura e seus subprodutos, bem como da carne e seus derivados,
quando estes são consumidos crus e/ou mal cozidos pelos humanos. O consumo de leite de
cabra não pasteurizado é um grande problema de saúde pública, pois cabras com infecção
aguda podem eliminar taquizoítas através de seu leite (SKINNER et al., 1990; VITOR et al.,
1991; GARCIA et al., 2012). Observa-se que para ambas as espécies, ovinos e caprinos, umas
das principais vias de infecção é a ingestão de água contaminada com oocistos esporulados
(MILLAR et al., 2008a).
Os suínos adquirem a infecção por Toxoplasma gondii, principalmente, pela ingestão
de água e ração contaminadas com oocistos esporulados presentes em fezes de felinos, pelo
consumo de carnes cruas contendo o protozoário, pela ingestão de animais infectados,
apresentando cistos teciduais, como roedores, pássaros e outros animais silvestres, ou pela via
transplacentária (DUBEY, 1995; MILLAR et al., 2008b; HIIL & DUBEY, 2013). A maioria
das infecções são subclínicas, no entanto, pode ocorrer doença clínica em neonatos e leitões
jovens, e aborto em fêmeas prenhas (MORENO et al., 2007). Entre os animais de produção, o
suíno é um dos mais frequentemente infectados, e sua carne é considerada a principal via de
transmissão para o ser humano nos Estados Unidos e, possivelmente também é em outros
países (GAMBLE, 1997; DUBEY et al., 2005). No Brasil, cistos teciduais têm sido
detectados com bastante frequência em cortes comerciais de suínos, órgãos e embutidos, de
animais naturalmente e experimentalmente infectados (MENDONÇA et al., 2004, DIAS et
al., 2005, FRAZÃO-TEIXEIRA et al., 2006, SOUSA et al., 2006, BERGER-SCHOCH et al.,
2010; FERNANDES et al., 2012). Segundo Dubey (2010a), os bovinos são naturalmente
resistentes à infecção, e há evidências de que algumas vacas se tornam soronegativas após
infecção aparentemente bem-sucedida. Desta maneira, o gado não é considerado um bom
hospedeiro para o parasito, visto que, embora possa ser infectado com sucesso com oocistos
de T. gondii, este é eliminado ou reduzido a níveis não detectáveis dentro de algumas semanas
(DUBEY, 1983; 1986), provavelmente devido à resistência inata (DUBEY et al., 2012).
No Brasil, o hábito recorrente de consumir carne crua ou mal cozida, e produtos
cárneos pode desempenhar um papel na importante transmissão de T. gondii tanto para os
humanos quanto para outros animais domésticos carnívoros, sendo importante na
epidemiologia deste protozoário (DUBEY & JONES, 2008; MILLAR et al., 2008b;
GOULART, BRENER & AMENDOEIRA, 2013). Ainda, os produtos cárneos, muitas vezes,
são feitos a partir da mistura da carne e de vísceras de diferentes espécies animais, tais como
42
linguiças e massa de quibe cru, que incluem carne de suínos e de outros animais, o que
também pode aumentar o risco de infecção por Toxoplasma gondii (KIJLSTRA &
JONGERT, 2008). Epidemiologicamente, dois pequenos surtos de toxoplasmose, que
ocorreram nos Estados Unidos, estavam ligados à ingestão de carne infectada de bovinos
(DUBEY & JONES, 2008).
Os equinos parecem ser uma das espécies mais resistentes no desenvolvimento clínico
da toxoplasmose (AL-KHALIDI e DUBEY, 1979). É observada, em geral, uma baixa
prevalência da toxoplasmose nesses animais, quando comparada com outras espécies
domésticas (GOULART, BRENER & AMENDOEIRA, 2013). Posto isso, Dubey e
colaboradores (1999) consideram que o risco de contrair a infecção através do consumo da
carne desses animais não teria uma importância epidemiológica significativa. No entanto, a
carne de equinos com presença de cistos teciduais, pode oferecer risco para os indivíduos que
a consomem crua ou mal cozida, sendo importante para a saúde coletiva em regiões onde é
comum a sua ingestão (VIDOTTO et al., 1997; GOULART, BRENER & AMENDOEIRA,
2013).
3.3.1. TOXOPLASMOSE: O PAPEL DAS GALINHAS DOMÉSTICAS NA INFECÇÃO
Dentre as aves domésticas de produção podemos citar galinhas, perus, patos,
marrecos, avestruzes e codornas, como hospedeiros intermediários de T. gondii confirmando
o caráter eurixeno do parasito (DUBEY et al., 1994; EL-MASSRY et al., 2000, DUBEY et
al., 2000; DUBEY et al., 2007).
Galinhas domésticas (Gallus gallus domesticus) são consideradas importantes
hospedeiros intermediários deste protozoário, e se infectam através da ingestão de oocistos
excretados nas fezes de felídeos infectados (RUIZ & FRENKEL, 1980). Estas aves, criadas
extensivamente, podem possuir grande exposição aos oocistos, sendo importantes na
epidemiologia da toxoplasmose. Isso porque, podem permanecer durante anos convivendo no
mesmo ambiente e ainda possuem o hábito de se alimentarem diretamente do solo. Galinhas
podem servir como fonte de infecção do parasito para felinos, assim como para os roedores,
que consomem a sua carne, e também para os humanos, nestes últimos, por meio da ingestão
da carne, produtos cárneos crus e/ou mal cozidos e ovos crus, e pela manipulação de carnes
cruas sem muita higiene. Além disso, a infecção em galinhas domésticas de criação extensiva
é considerada como um bom indicador da contaminação do solo por oocistos de T. gondii,
43
sendo as aves utilizadas como animais sentinelas, uma vez que elas têm o hábito de ciscar e,
serem suscetíveis à infecção pelo protozoário (LITERAK & HEJLICEK, 1993; DUBEY,
2002; HILL & DUBEY, 2013).
Essas aves dificilmente apresentam sinais clínicos relacionados à toxoplasmose,
seguindo um curso de infecção predominantemente subclínico e de baixa relevância para a
espécie (DUBEY, 2010b). Em infecções experimentais com a inoculação oral de oocistos de
T. gondii, as galinhas permaneceram assintomáticas ou desenvolveram sintomatologia leve
(BIANCIFIORI et. al, 1986; DUBEY et al., 1993; KANETO et al., 1997). No entanto, Dubey
e colaboradores (2007b) relataram um surto de toxoplasmose clínica em galinhas e gansos em
uma fazenda em Illinois, EUA, em que foram relatados sinais clínicos como alterações
neurológicas, manifestando-se como torcicolo, e incapacidade de permanecerem em pé.
T. gondii é detectado com maior frequência em galinhas caipiras do que em galinhas
criadas em sistema intensivo, uma vez que as primeiras estão mais expostas à contaminação
ambiental por oocistos (DUBEY et al., 2005; DUBEY, 2010a). Na avicultura familiar, onde
as galinhas são criadas de forma extensiva, há maior possibilidade desses animais adquirirem
a infecção por T. gondii pelo tipo de criação. Muitas vezes os frangos abatidos em fundo de
quintal ou instalações sem supervisão, tem suas vísceras descartadas indevidamente em
lugares sem condições adequadas, servindo de fonte de infecção para felídeos e outros
carnívoros (DUBEY et al. 2012).
Dubey (2010b) analisou a prevalência mundial da infecção por T. gondii em galinhas e
determinou sua importância epidemiológica na cadeia de transmissão do parasito para seres
humanos. A alta prevalência (até 100%) encontrada em galinhas criadas extensivamente e no
sistema orgânico em fazendas, as torna muito importantes na epidemiologia da infecção por
este protozoário, por serem fontes importantes de transmissão para indivíduos que venham a
se alimentar de sua carne e/ou de seus ovos.
Segundo Millar e colaboradores (2008b), de um modo geral, a transmissão de T.
gondii para o ser humano, a partir das criações de galinhas em escala industrial, parece ser de
pouca significância, devido ao tipo de manejo e sistema de criação que além de rápido, não
permite o contato com felinos e outras fontes de infecção. Esse sistema de criação contrasta
com a criação doméstica em pequena escala, do tipo extensiva, onde os animais estão sujeitos
ao contato com gatos, solo e água contaminados, convivendo durante anos nesse mesmo
ambiente. No entanto, mesmo que alguns estudos (ARAÚJO et al., 1989; MEIRELES et al.,
2003) relatem a inexistência ou mesmo um baixo percentual de aves infectadas pelo T. gondii
44
em animais criados de maneira intensiva (onde o manejo, o confinamento e medidas
adequadas de higiene diminuiriam, ou mesmo extinguiriam, o contato com as fontes de
infecção do parasito) não se pode ignorar os achados de Millar e colaboradores (2012) que
observaram um percentual de 7,8% de positividade em aves de corte e 14,26% em galinhas
poedeiras, criadas de forma intensiva, chamando a atenção para o risco de se contrair a
infecção toxoplásmica pela ingestão de carne de frango.
Anterior a realização de estudos experimentais que evidenciaram a presença de cistos
na musculatura cardíaca e esquelética dessas aves (DUBEY et al., 1993; KANETO et al.,
1997), esse tipo de alimento não era considerado uma fonte de infecção potencial significativa
na cadeia epidemiológica da toxoplasmose humana.
No Brasil, estudos sobre a soroprevalência de T. gondii demonstram que galinhas
criadas extensivamente possuem uma taxa de positividade alta para o protozoário, variando de
41% a 80% (DUBEY et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2009; BELTRAME et al., 2012;
FERNANDES et al., 2016). Vários estudos também relataram altas taxas de isolamento deste
protozoário a partir de tecidos de galinhas caipiras, demonstrando que essas aves podem
conter cistos viáveis, capazes de infectar seres humanos e animais (FEITOSA et al., 2016).
Segundo Dubey (2010b), quanto à detecção de T. gondii em ovos, há relatos
divergentes na literatura. Um determinado estudo descreve que taquizoítas podem ser isolados
de ovos in natura postos por galinhas submetidas à infecção experimental (JACOBS &
MELTON, 1966). Outros relatos revelaram níveis muito baixos ou ausência de organismos
viáveis em ovos de galinhas infectadas experimentalmente (BOCH et al., 1966;
BIANCIFIORI et al., 1986). Como é indefinido o papel dos ovos de galinhas in natura como
fonte de infecção relevante para humanos, segundo Dubey, pouco provável, este ainda requer
cautela ao consumir esse alimento (DUBEY, 2010b).
Gonçalves e colaboradores (2012), em estudo realizado com galinhas do tipo caipira,
em cinco cidades do Estado da Bahia encontraram 25% de positividade em 100 galinhas
analisadas pela técnica de RIFI. De acordo com Casartelli-Alves e colaboradores (2012), a
prevalência de galinhas positivas para anticorpos anti-T. gondii pela RIFI na região de Rio
Bonito, RJ, foi de 27,6% em 220 analisadas.
Santos, M. (2012), ao avaliar frangos de corte de granjas comerciais e galinhas
caipiras de pequenas propriedades rurais, no Rio Grande do Norte e Paraíba, detectou que
somente as galinhas caipiras se apresentavam positivas, com uma frequência do parasito de
até 40,4%. Em outro estudo Millar e colaboradores (2012) avaliaram 460 frangos de corte e
45
350 galinhas poedeiras, no Rio de Janeiro, totalizando 810 aves em sistema de criação livre e
confinado, e encontraram um coeficiente geral de positividade de 12,2% (56/460) para os
frangos e 33,1% (116/350) para as galinhas poedeiras. Os frangos de corte apresentaram
maior percentual de animais soropositivos criados em sistema extensivo (livre) (11,3%) que
os frangos do sistema de criação de confinamento, os quais foram 7,8% sororreagentes.
Enquanto que as galinhas poedeiras livres apresentaram uma positividade de 51,4%, em
comparação as aves criadas em confinamento (14,8%). A ocorrência de anticorpos anti- T.
gondii foi alta tanto nos frangos de corte como nos de postura, e as galinhas de criação
extensiva, criadas para produção de ovos provou ser o grupo mais exposto a infecção por T.
gondii.
No Brasil, outros estudos que identificam soropositividade para Toxoplasma gondii
em galinhas em diferentes regiões podem ser observados nas Tabelas 1 e 2.
Tabela 1: Frequência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em galinhas de criação extensiva de
diferentes estados brasileiros por diferentes métodos de diagnóstico.
Estado Número
Amostral
Método
Diagnóstico
Ponto de
corte Frequência Referência
Região Norte
Amazonas
17
HAI
1:16
41,2%
Ferraroni & Marzocchi
(1980)
Rondônia 50 MAT 1:5 66% Dubey et al. (2006)
Pará 34 MAT 1:10 58,8% Dubey et al. (2007a)
Região Nordeste
Bahia 200 RIFI 1:16 25% Costa et al. (2008)
Pernambuco
(Fernando de
Noronha)
50
MAT
1:5
84% Dubey et al. (2010)
Bahia 100 RIFI 1:16 25% Gonçalves et al. (2012)
Recife 212 RIFI 1:16 40,56% Fernandes et al. (2016)
Região Centro-Oeste
Mato Grosso
do Sul 195 MAT 1:25 22,8% Marques et al. (2009)
Mato Grosso
do Sul 40 MAT 1:5 67,5% Silveira (2009)
MAT: Teste de Aglutinação Modificado; HAI: Teste de Hemaglutinação Indireta; RIFI: Reação de
Imunofluorescência Indireta; Elisa: Ensaio Imunoenzimático; Ponto de corte: valor (igual ou acima) que determina a
positividade de um teste.
46
Tabela 1 (Continuação): Frequência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em galinhas de criação
extensiva de diferentes estados brasileiros por diferentes métodos de diagnóstico.
Região Sudeste
São Paulo 82 MAT 1:10 40,2% Dubey et al. (2002)
Rio de
Janeiro 198 MAT 1:10 65,1% da Silva et al. (2003)
Rio de
Janeiro 316 RIFI 1:16 47,8% Bonna et al. (2006)
Minas Gerais 28 RIFI 1:16 53,6% Brandão et al. (2006)
Rio de
Janeiro 88 RIFI 1:16 70,5% Boechat et al. (2011)
Espírito
Santo 510 HAI 1:5 40,4% Beltrame et al. (2012)
Rio de
Janeiro 220 RIFI 1:16 27,6%
Casartelli-Alves et al.
(2012)
Rio de
Janeiro
230
175 RIFI/ELISA 1:16 11,3%*
51,4%+
Millar et al. (2012)
Minas Gerais 108 MAT 1:16 71,3% Lopes et al. (2016)
Região Sul
Paraná 155 RIFI 1:16 10,3% Garcia et al. (2000)
Paraná 40 MAT 1:5 40% Dubey et al. (2003b)
Rio Grande
do Sul 50 MAT 1:10 38% Dubey et al. (2007b)
Santa
Catarina 128 HAI 1:64 17,1% Perdocini et al. (2010)
*frangos de corte; +galinhas poedeiras
MAT: Teste de Aglutinação Modificado; HAI: Teste de Hemaglutinação Indireta; RIFI: Reação de
Imunofluorescência Indireta; Elisa: Ensaio Imunoenzimático; Ponto de corte: valor (igual ou acima) que determina a
positividade de um teste.
47
Tabela 2: Frequência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em galinhas de criação intensiva de
diferentes estados brasileiros por diferentes métodos de diagnóstico.
Estado Número
Amostral
Método
Diagnóstico
Ponto de
corte Frequência Referência
Região Norte
Pará* 300 MAT 1:5 0,33% Barbosa (2007)
Região Nordeste
Bahia+ 200 RIFI 1:16 3% Costa et al. (2008)
Região Sudeste
São Paulo* 182 ELISA 1:100 0 Meireles et al. (2003)
Minas
Gerais* 50 RIFI 1:16 0 Brandão et al. (2006)
Rio de
Janeiro
230
175 RIFI/ELISA 1:16
7,8%*
14,8%+
Millar et al. (2012)
Região Sul
Rio Grande
do Sul* 500 HAI 1:64 2,8% Araújo et al. (1989)
Santa
Catarina* 41 HAI
Não
informado 4,8% Frigotto et al. (2011)
*frangos de corte; +galinhas poedeiras
MAT: Teste de Aglutinação Modificado; HAI: Teste de Hemaglutinação Indireta; RIFI: Reação de
Imunofluorescência Indireta; ELISA: Ensaio Imunoenzimático; Ponto de corte: valor (igual ou acima) que determina a
positividade de um teste.
3.4. A CRIAÇÃO DE GALINHAS NO BRASIL
A criação de aves para abate, no Brasil, surgiu na década de 1950, nos estados da
região Sudeste, com destaque para o estado de São Paulo, se dinamizou, sendo assim, a
produção aviária no país é uma das mais rentáveis (SILVEIRA et al., 2012).
Os sistemas de criação de aves consistem em três tipos, os quais são extensivo, semi-
intensivo e intensivo. O sistema extensivo é um sistema de criação tradicional, onde, de uma
forma geral, não existe nenhuma forma de controle. As aves são criadas soltas e alimentadas
em regime de pastejo ou pelo fornecimento de verde picado. Esse sistema tem como objetivos
principais o aproveitamento de espaços ociosos dentro da propriedade, além da obtenção de
carne e ovos de boa qualidade para consumo familiar, comercialização do excedente da
produção, a diversificação das atividades na propriedade rural e a produção e comercialização
de pintos de raça. As principais características desse sistema são: em geral, as aves de ambos
48
os sexos e idades variadas podem ser criadas soltas, em grupos de até 10 aves, muitas vezes
sem controle produtivo, nutricional ou sanitário (LAZIA, 2012).
O sistema semi-intensivo é o mais indicado para quem deseja ter um plantel saudável,
com controle sanitário, respeitando o espaço que a ave necessita para viver e desenvolver.
Esse tipo de criação requer maiores recursos em insumos e manejo, como programas de
vacinação, ração balanceada, piquetes, poleiros, entre outros, por ser voltada para a obtenção
de lucros, e também é o mais indicado para a criação de frangos e de galinhas caipiras. Sua
principal característica é a mescla da criação em galpão com a criação solta, utilizando-se para
isso piquetes Apesar da ave ter um pasto e uma área livre para circular, ele é delimitado e
permite total controle produtivo, nutricional e sanitário (LAZIA, 2012).
Já o sistema intensivo se assemelha à criação industrial, onde são fornecidas as
condições necessárias para o desenvolvimento das aves. Nele as aves são criadas em galpões
por todo o ciclo de produção, ou seja, em confinamento total, desde um dia de vida até o dia
do abate. Por isso, é essencial que o lote seja mantido saudável e a cama sempre em condições
adequadas. Deve-se evitar introduzir uma densidade maior do que a capacidade do galpão.
Equipamentos como bebedouros, comedouros e ventiladores devem ser em número suficiente
para atender às necessidades ideais de manejo. Além disso, deve-se realizar o controle de
pragas e de doenças bem como o programa de vacinação. Logo, estas são medidas que
garantem uma boa produtividade nesse sistema de criação (LAZIA, 2012).
Segundo dados do IBGE (2012), nos últimos 30 anos, o rebanho de aves aumentou
consideravelmente em todas as regiões brasileiras, com destaque para o Sul, Sudeste e Centro-
Oeste. No ano de 2013, essas regiões representaram 50,13%, 28,36% e 10,35%,
respectivamente, do rebanho nacional. Historicamente, o Sul é uma das regiões mais
tradicionais para a criação de aves no País, com grande presença de cooperativas no que se
refere à organização e apoio aos produtores. Por outro lado, granjas dessa região, assim como
do Sudeste, dependem fortemente de grãos provenientes do Centro-Oeste (ZEN et al., 2014).
De acordo com o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, nas últimas
três décadas, a avicultura brasileira tem apresentado altos índices de crescimento. O país se
tornou o terceiro produtor mundial e líder em exportação. Atualmente, a carne nacional chega
a 142 países. O mercado interno detém 70% da carne de frango produzida no Brasil. As
projeções mostram aumento no consumo interno, no período de 2008/2009 a 2018/2019, o
equivalente a 9,9 milhões de toneladas (BRASIL, 2016).
49
Segundo dados da Secretaria de Estado de Agricultura, Pecuária e Abastecimento
(SEAPA) de Minas Gerais (2016), o estado de Minas Gerais apresentou em 2014 um plantel
com 104,4 milhões de cabeças de aves, tendo participação de 9,5% no rebanho nacional. A
região do Triângulo Mineiro representou neste mesmo ano 23,8% do plantel da avicultura de
corte. Ainda no ano de 2014, o município de Uberlândia se apresentava em segundo lugar no
ranking dos principais municípios com maiores plantéis de Minas Gerais, concentrando 11,9
milhões de cabeças de aves.
No ano de 2015, foram abatidos no estado de Minas Gerais 328,1 milhões de cabeças
de frangos sob inspeção de órgãos federal, estadual e municipal. Grande parte da carne de
frango abatida no estado é exportada, e este número foi representado por 196 mil toneladas
em 2015. De acordo com a Associação Brasileira de Proteína Animal (ABPA), ainda no ano
de 2015, Minas Gerais representou 7,25% da produção do país, colocando o estado em 5º
lugar no ranking de estados produtores de aves (SEAPA, 2017).
3.5. DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO POR T. gondii
Classicamente, o diagnóstico da toxoplasmose é baseado na busca de anticorpos contra
o parasito, através de testes sorológicos para a pesquisa de diferentes classes de
imunoglobulinas anti-Toxoplasma, sejam elas IgG, IgM, IgA ou IgE, consistindo no principal
método laboratorial para o diagnóstico da infecção. Além disso, a presença dos anticorpos
para T. gondii no curso da infecção permite a análise de perfis sorológicos muito
característicos, seja de infecção recente, em fase aguda com detecção de IgM, ou de infecção
antiga em fase de latência ou crônica com detecção de IgG. A infecção pode também produzir
IgA, tanto nos casos de transmissão por via oral, como nos casos de toxoplasmose congênita
(CONTRERAS et al., 2000; MONTOYA, 2002; FOUDRINIER et al., 2003; MONTOYA &
LIESENFIELD, 2004). Recentes estudos encontraram correlação positiva entre os níveis de
IgA no soro e colostro na toxoplasmose congênita, e IgE em infecções ativas (OLIVEIRA et
al., 2015; DARD et al., 2016).
3.5.1. DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO
O sorodiagnóstico tem sido uma das mais completas e adequadas ferramentas para
diagnosticar a infecção por T. gondii tanto em humanos quanto nos animais, visto que são
mais rápidos e práticos (VAN DER PUIJE et al., 2000).
50
O primeiro teste disponível para detectar anticorpos específicos anti-T. gondii foi a
reação de Sabin-Feldman (dye test) (SABIN & FELDMAN, 1948). Este teste foi por muito
tempo o método sorológico clássico de diagnóstico da toxoplasmose (TENTER, 2009), e
ainda é considerado um teste de referência com altas taxas de sensibilidade e especificidade.
No entanto, seu uso se tornou restrito em decorrência da complexidade da técnica empregada
pelo uso obrigatório de T. gondii vivo, o que traz graves problemas de biossegurança. Além
de não ser possível diferenciar anticorpos IgM e IgG (REITER-OWONA et al., 1999;
REMINGTON et al., 2001).
Atualmente, outros testes são preferencialmente empregados para detectar anticorpos
específicos em amostras de soro tanto de humanos como animais, como as galinhas. Dentre os
métodos utilizados estão a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), Ensaio
Imunoenzimático (ELISA), Teste de Aglutinação Modificado (MAT), Hemaglutinação
Indireta (HAI), e Teste de Aglutinação em látex (LAT) (SUN et al., 2015).
Um estudo com galinhas revelou que o ELISA, seguido pela RIFI, foi o método mais
sensível e a HAI foi o método mais específico, enquanto que o MAT apresentou menor
sensibilidade comparado ao ELISA e a RIFI, sua especificidade foi maior do que ELISA e
RIFI, e semelhante à da HAI. A RIFI foi a segunda técnica mais sensível, porém a menos
específica, enquanto que a HAI foi avaliada como um método sensível e específico
(CASARTELLI-ALVES et al., 2014).
Um dos testes mais utilizados para o estudo epidemiológico da toxoplasmose, em
animais, é o teste de aglutinação modificada (MAT), por ser um teste de fácil execução,
específico e acurado, que detecta principalmente IgG, suprimindo a presença de IgM, devido
a inativação desta imunoglobulina, sendo esta específica ou inespecífica, por 2-
mercaptoetanol utilizado neste método (SILVA et al., 2007). Dentre os testes sorológicos
disponíveis, o MAT até o momento foi o teste que demonstrou os melhores resultados em
relação às diferentes espécies estudadas (DUBEY, 2010a). O MAT demonstrou ser um bom
método para diagnóstico da infecção toxoplásmica em galinhas, devido à sua alta
especificidade, sensibilidade e acurácia, e, pela sua importância para estudos epidemiológicos,
visto que, mesmo com detecção de baixos títulos, estes devem ser considerados indicativos de
uma possível exposição dessas aves ao Toxoplasma. Além de poder ser um método sorológico
eficaz como triagem para isolamento de T. gondii em tecidos de galinhas (YAN et al., 2010;
CASARTELLI-ALVES et al., 2014; DUBEY, LAURIN & KWOWK, 2016).
51
No método de hemaglutinação indireta (HAI), as hemácias das aves são revestidas
com antígenos completos do parasito e aglutinam na presença de anticorpos das classes IgG e
IgM. Embora seja um teste de baixo custo, este não é usualmente recomendado para
diagnósticos em rotinas laboratoriais visto que, diferentes preparações de antígenos podem
causar resultados distintos (REMINGTON et al., 2001) e ocasionalmente observam-se
resultados falso-positivos por interferência de anticorpos IgM “naturais”, aglutininas IgM
não-específicas, em geral de títulos baixos (CAMARGO et al., 1989).
O ensaio imunoenzimático (ELISA, do inglês – enzyme linked immunosorbent assay)
e a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) também são usualmente empregados no
diagnóstico da infecção toxoplásmica (DUBEY, 2010a). Segundo Madruga, Araújo & Soares
(2001), o ELISA quando comparado às demais técnicas, apresenta a vantagem de não possuir
subjetividade na leitura, visto que esta se baseia em medida colorimétrica, sendo a quantidade
de anticorpos diretamente proporcional à cor que é dada pelo desdobramento enzimático do
substrato utilizado.
No início da década de noventa, foi desenvolvido o teste ELISA – IgG para avidez,
que parece ser um marcador informativo de infecção aguda adquirida, utilizado
principalmente para diagnóstico da toxoplasmose em gestantes. Este método avalia a avidez
ou afinidade de ligação ao antígeno dos anticorpos IgG contra T. gondii, separando os de
baixa afinidade, produzidos numa fase inicial da infecção, dos anticorpos de alta afinidade
indicativos de infecção crônica (JOYNSON et al, 1990). Agentes desnaturantes de proteínas,
como a ureia, são usados para dissociar a ligação dos complexos antígenos-anticorpo, de
modo que apenas os anticorpos de maior avidez (maior afinidade) permanecem ligados ao
antígeno (HEDMAN et al., 1989).
A Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) utiliza antígenos íntegros, taquizoítas
mortos aderidos a uma lâmina de vidro, que posteriormente são incubados com diluições
seriadas dos soros a serem investigados. Segundo Fialho & Araújo (2002), a RIFI é uma
técnica específica e sensível, de fácil realização, com as desvantagens do alto custo do
microscópio de imunofluorescência e possuir interferências como luminosidade, objetivas do
microscópio, sensibilidade do conjugado e do antígeno, e subjetividade da leitura.
52
3.5.2. DIAGNÓSTICO POR BIOENSAIO
O isolamento de T. gondii por bioensaio em camundongos ou gatos a partir da
inoculação de tecidos de galinhas naturalmente infectadas, é descrito em vários países,
evidenciando a importância das mesmas na transmissão do parasito (DUBEY & SU, 2009).
O bioensaio é considerado padrão ouro para detectar a viabilidade do parasito e pode
ser realizado tanto em camundongos através da inoculação do material por via intraperitoneal,
subcutânea ou oral, quanto em gatos, pela administração oral e observação das fezes quanto à
presença de oocistos. O bioensaio em camundongos é a técnica mais utilizada para obtenção
de isolados devido ao menor custo quando comparado a outros procedimentos de isolamento,
sendo os órgãos mais frequentemente utilizados, o coração, o pulmão, o baço e o cérebro. E
também por este método ser modelo para avaliação da virulência de cepas, fornecendo
informações quanto às características biológicas da amostra de T. gondii (TENTER, 2009;
DUBEY, 2010a).
Para a detecção de cistos teciduais nos órgãos dos hospedeiros, o método de digestão
de tecidos e bioensaio em camundongos pode ser utilizado a fim de aumentar a taxa de
recuperação do parasito (DUBEY, 1998a; DUBEY et al., 1995). O isolamento de T. gondii
depende do número de camundongos inoculados, da quantidade de tecido utilizado no
bioensaio, da concentração de parasitos na amostra utilizada (DUBEY et al., 2006) e, ainda,
do genótipo do parasito (PENA et al., 2008). Outro fator a ser considerado é que um animal
apresenta a maior parte de seus tecidos livres de cistos do parasito, o que faz com que
ocorram inúmeros resultados negativos mesmo em animais parasitados (PENA et al., 2008).
T. gondii viáveis foram isolados de até 100% de galinhas caipiras, a partir de bioensaio
em camundongos (DUBEY, 2010). Em um experimento conduzido por Dubey e
colaboradores (2002b), os oocistos esporulados foram fornecidos a galinhas pela via oral, e
foi demonstrado que cepas virulentas podem formar cistos teciduais, porém, não causam
sinais clínicos de toxoplasmose em galinhas.
3.5.3. DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Dentre os métodos moleculares, a PCR consiste na técnica molecular mais utilizada na
detecção de T. gondii. O emprego da PCR para a identificação de T. gondii é importante,
principalmente, pela possibilidade de constatar a presença do DNA do parasito em produtos
53
de origem animal destinados ao consumo humano, tornando-se uma ferramenta relevante em
programas de monitoramento para segurança alimentar (ASPINALL et al., 2002). De acordo
com Yan e colaboradores (2010), a técnica da PCR é rápida, sensível e economicamente
viável para a detecção de DNA de Toxoplasma gondii em galinhas.
Diversos autores utilizam a técnica da PCR para detectar o DNA do parasito em vários
materiais biológicos, tais como humor aquoso, coração, cérebro, placenta, fígado, líquido
amniótico e sangue (ALFONSO et al., 2009). A vantagem desse método é a capacidade de
detectar o parasito, mesmo quando presente em pequenas quantidades (HURTADO et al.,
2001).
Nas últimas décadas, diversos alvos foram escolhidos e implementados para a
detecção de T. gondii. Em 1989, Burg e colaboradores, usaram o gene B1, que se repete em
35 cópias no genoma do parasito, como um alvo eficaz para a realização da PCR. Desde
então, a amplificação do gene B1 tem sido usada amplamente para detecção do protozoário, e
os resultados demonstraram a alta especificidade do gene e a característica de ser uma região
conservada em todas as cepas testadas (BURG et al., 1989; HO-YEN et al., 1992;
HOHLFELD et al., 1994; LIN et al., 2000; MEGANATHAN et al., 2010). Todavia, este gene
tem mostrado baixa especificidade, por poder amplificar outras sequências-alvo no DNA
humano (KOMPALIC-CRISTO et al., 2004).
Outro alvo usado é o gene P30, que se encontra representado por cópia única e
codifica para o principal antígeno de superfície do protozoário. Diversos pares de primers
foram igualmente propostos para amplificar fragmentos desse gene (WEISS et al. 1991). Na
literatura, protocolos que empregam PCR convencional (qualitativa) para a detecção de genes
em cópia única, como o gene P30, parecem menos sensíveis (BUCHINDER et al. 2003).
Homan e colaboradores (2000) identificaram uma sequência de 529pb do genoma de
T. gondii, denominada AF146527, que apresenta cerca de 200-300 cópias no DNA do
parasito. Muitos trabalhos mostram que reações de PCR utilizando este alvo são mais
sensíveis do que as reações que utilizam o gene B1, principalmente em reações de PCR em
tempo real (REISCHL et al., 2003; CASSAING et al., 2006; FALLAHI et al., 2014). Ainda
que este fragmento seja mais sensível que o gene B1, existe a possibilidade de algumas cepas
terem perdido total ou parte das unidades de repetição, o que pode comprometer a eficiência
da reação (WAHAB et al., 2010).
Além destes, outras sequências-alvo são empregadas na PCR para detecção do
parasito, como: 1) o gene codificante para o RNA da subunidade menor ribossômica, que se
54
encontra repetido em 110 cópias por genoma (18s rDNA ou ITS-1 - Internal Transcribed
Space 1); 2) os genes de cópia única codificantes para α e β tubulina; e 3) um aparente
segmento repetitivo de DNA não-codificante (TGR1E) (BASTIEN, 2002).
O alvo ITS- 1 é uma sequência utilizada com frequência como marcador celular em
estudos de diagnóstico de T. gondii, assim como na diferenciação de Apicomplexos como
Neospora caninum, Hammondia hammondi e Hammondia heydorni (MULLER et al., 1996;
ELLIS, 1998; ELLIS et al., 1998; MUGRIDGE et al., 1999; SREEKUMAR et al., 2003;
SREEKUMAR et al., 2005). Esta sequência encontra-se entre os genes que codificam as
unidades 18S e 5,8S, e são moléculas estruturais dos ribossomos. Nos eucariotos, estes genes
se apresentam em múltiplas cópias, as quais são altamente conservadas (HILLIS & DIXON,
1991), o que favorece o desenho de primers para hibridarem nessas regiões. Porém, a região
entre esses genes pode variar, facilitando a identificação inter e intraespecífica dos
organismos, o que faz com que esse alvo seja amplamente usado no diagnóstico molecular de
parasitoses. Análises de homologia entre sequências de ITS-1 demonstram que gêneros da
subfamília Toxoplasmatinae, como Toxoplasma, Neospora, Hammondia e Besnoitia são
fortemente relacionados evolutivamente. Contudo, o grau de homologia entre estas sequências
diminui quando comparado com sequências de cepas diferentes de um mesmo gênero
(PAYNE & ELLIS, 1996; ELLIS et al., 1998; MUGRIDGE et al., 1999).
É relevante destacar que a sensibilidade e a especificidade da PCR dependem da
seleção de primers específicos para o DNA alvo, tanto quanto da definição de protocolos
adequados para coleta, acondicionamento, extração e purificação do DNA (DUBEY, 2010a).
A caracterização genotípica de diferentes isolados de T. gondii em amostras de
humanos e de animais domésticos e silvestres tem sido obtida por métodos moleculares
(PENA et al., 2008). Em virtude do potencial zoonótico da toxoplasmose, a investigação de
genótipos provenientes de infecções em animais e de produtos de origem animal pode ser de
grande valor informativo. A identificação dos genótipos é muito importante para o
rastreamento epidemiológico do agente e a identificação de suas fontes de infecção ou vias de
transmissão (OWEN & TREES, 1999).
3.6. PROFILAXIA
A prevenção e o controle da infecção estão relacionados aos diversos mecanismos de
transmissão da protozoose. Gatos vivendo juntamente com a população humana em áreas
55
rurais ou urbanas podem funcionar como grandes disseminadores da parasitose, já que os
oocistos resistem às condições ambientais por vários meses, sendo encontrados em locais
onde a presença de gatos é frequente. Água e vegetais para consumo humano e animal são
passíveis de estarem contaminados por os oocistos, os quais são fontes de infecção também
para herbívoros e aves, originando cistos em sua carne que possivelmente infectarão o ser
humano, ao ser consumida crua ou mal cozida (COUTINHO & VERGARA, 2005). A
transmissão por meio de oocistos pode ser evitada adotando medidas como lavar bem os
alimentos que serão ingeridos crus, como frutas e outros vegetais que tiveram contato direto
com o solo, ingerir água tratada, filtrada ou fervida proveniente de fonte confiável, além de
evitar o consumo de água de fontes não confiáveis como lagos, rios e represas (JONES &
DUBEY, 2012; ROBERT-GANGNEUX, 2014).
Os gatos domésticos, como animais de companhia, mantidos no interior de
residências, evitando o contato com o meio externo, apresentam menor probabilidade que
ocorra infecção, devido à oferta de alimentação controlada, como ração ou alimentos que
sofreram tratamento térmico adequado (FRENKEL et al., 1991; DUBEY, 1996; TENTER;
HECKEROTH; WEISS, 2000).
A limpeza das caixas de areia desses animais deve ser realizada diariamente, e o
material fecal deve receber destino adequado para que não ocorra a esporulação dos oocistos.
Tal higienização não deve ser realizada por mulheres gestantes e indivíduos
imunocomprometidos, afim de que seja evitada a exposição a essa estrutura infectante
(FRENKEL, 1990). Não existem impedimentos para que pessoas imunocomprometidas e
mulheres em gestação possuam gatos, desde que todas as medidas básicas de prevenção
citadas sejam realizadas (DIAS & FREIRE, 2005).
Cistos de T. gondii podem permanecer viáveis por dias na carne à temperatura de
geladeira, entretanto tornam-se inviáveis ao congelamento à temperatura entre -15ºC e -20ºC,
num período de três dias ou ao tratamento a temperaturas superiores a 67°C, ou por 20
minutos a 60ºC, garantindo que o calor atinja de maneira igual todo o alimento (AMATO
NETO & MARCHI, 1999; DUBEY, 1996; FIALHO et al., 2009). O leite, principalmente o de
cabra, deve ser ingerido somente após pasteurização; as mãos devem ser lavadas após
manusear carnes cruas, pois sabão, água, álcool e desinfetantes químicos inativarão
bradizoítas e cistos teciduais remanescentes nas mãos após a manipulação destes alimentos
(FRENKEL, 1990; DUBEY, 2000).
56
O consumo de carne suína e de aves produzidas em sistemas orgânicos proporciona
maior risco de infecção, pois os animais são criados de forma extensiva, tendo acesso a
ambientes externos que podem conter oocistos dos parasitos (JONES & DUBEY, 2012).
Desse modo, ressalta-se, ainda, a importância do fornecimento de água adequado para esses
animais, pois diversos surtos vêm sendo relatados com essa fonte de infecção.
A toxoplasmose é uma zoonose importante com elevada prevalência, que pode ser
veiculada pelos alimentos após mudanças nas características dos produtos comercializados, no
entanto processos de conservação aplicados nas carnes dos animais de consumo humano são
capazes, muitas vezes, de impedir a transmissão da infecção, como o congelamento e a
injeção de salmoura em frangos, além do cozimento adequado de carnes (JONES & DUBEY,
2012).
Também é recomendada a implantação das Boas Práticas Agrícolas (BPA), um
conjunto de medidas que define práticas de higiene que podem ser adotadas nas propriedades
para evitar a ocorrência de infecções, incluindo as zoonóticas, como a toxoplasmose. Essas
propriedades costumam fazer parte de nichos seletos de mercado, como exportação à União
Europeia, agregando valor aos seus produtos e contribuindo para a melhoria dessas cadeias
produtivas (JONES & DUBEY, 2012; VALLE, 2011).
Para a prevenção da infecção por Toxoplasma gondii, deve-se evitar a presença de
felinos próximos às áreas de criação dos animais, alem do consumo de alimentos de origem
animal, crus ou mal cozidos. De igual importância, deve-se proteger caixas de areia públicas
para que gatos não defequem, evitando a presença do oocisto no ambiente em que crianças
brincam (BRASIL, 2010; REY, 2002). Luvas devem ser utilizadas quando houver a
necessidade de se trabalhar com terra ou areia, pois podem estar contaminadas com fezes de
gato (KAPPERUD et al., 1996).
57
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. ÁREA DE ESTUDO
O Triângulo Mineiro localiza-se na parte oeste do estado de Minas Gerais, nas
coordenadas geográficas de 17º55´05”a 20º26’35” de latitude Sul e 45º38’25”a 51º02´47” de
longitude Oeste (Figura 9).
Figura 9: Mapa do Brasil com ampliação para o estado de Minas Gerais, com destaque em verde a
área de estudo (Triângulo Mineiro) (Fonte: Bernardes & Ferreira, 2013).
58
A Mesorregião do Triângulo Mineiro/Alto Paranaíba se destaca por possuir quatro
grandes municípios que se sobressaem quanto aos aspectos agropecuários: Uberaba,
Uberlândia, Araguari e Ituiutaba. Esta região é responsável por uma importante produção
agropecuária e uma crescente migração de trabalhadores. É composta por 63 cidades e
municípios, que se subdividem em sete microrregiões, sendo elas: Araxá, Frutal, Ituiutaba,
Patos de Minas, Patrocínio, Uberaba e Uberlândia, onde em sua maioria, a economia é
baseada na agropecuária (CASTANHO et al., 2013).
4.2. POPULAÇÃO ESTUDADA
Trata-se de um estudo seccional para avaliar a frequência de anticorpos IgG anti- T.
gondii em galinhas criadas e abatidas em estabelecimentos da região do Triângulo Mineiro,
Minas Gerais, e também detectar molecularmente o parasito nos tecidos desses animais.
O número de amostras incluídas na pesquisa foi estimado por meio do cálculo
amostral realizado em calculadora “online” desenvolvida por Santos, G. (2012), com base na
população total da espécie na região estudada, de acordo com dados do IBGE (2014). O ponto
de referência consiste em uma prevalência esperada de 50% com um intervalo de confiança
de 95% e erro amostral de 5%. Portanto, estimou-se que para a espécie analisada o tamanho
da amostra seria de 385 animais, todavia o número de animais coletados e utilizados no
trabalho extrapolou o total mínimo considerado representativo.
Foram incluídas na pesquisa amostras de 417 aves e para a realização deste estudo
foram utilizadas amostras de soro de galinhas domésticas, com idades entre 27 dias e 120 dias
ou mais, provenientes dos sistemas de criação intensivo, semi-intensivo e extensivo,
pertencentes a propriedades localizadas nos municípios de Araguari e Uberlândia.
4.3. COLETA DAS AMOSTRAS
4.3.1. COLETA DAS AMOSTRAS DE SANGUE
Os animais liberados pelo serviço de inspeção sanitária após o exame ante mortem
foram levados à área de insensibilização e, no ato da sangria, cerca de 8 mL de sangue foram
coletados em frascos próprios sem anticoagulante e numerados. Posteriormente, o sangue
coletado foi deixado em repouso, à temperatura ambiente, para que ocorresse a retração do
coágulo. As amostras foram centrifugadas a 5.000 rpm por 3 minutos para obtenção do soro.
59
Os soros foram acondicionados em tubos estéreis, identificados e estocados à temperatura de -
20ºC até o momento da análise laboratorial para pesquisa de anticorpos IgG anti-T. gondii. O
procedimento de coleta das amostras de sangue foi realizado pela Drª Kênia de Fatima
Carrijo, médica veterinária, professora da Universidade Federal de Uberlândia e colaboradora
deste projeto. O período de coleta foi do mês de agosto de 2015 a janeiro de 2016.
As amostras aliquotadas em tubos estéreis foram armazenadas em caixas para
armazenamento de microtubos, as quais foram acomodadas em caixas isotérmicas contendo
gelo, e então, encaminhadas para o Departamento de Microbiologia e Parasitologia da
Universidade Federal Fluminense, e seguidamente, para o Laboratório de Toxoplasmose e
outras Protozooses, IOC, Fiocruz.
4.3.2. COLETA DAS AMOSTRAS DE TECIDO
Dentre os 417 animais cujos soros foram coletados para as análises sorológicas, foram
selecionados os 100 primeiros indivíduos para coleta de fragmentos de tecidos (coração e
cérebro) na linha de abate. Estas amostras foram identificadas de acordo com a codificação
prévia feita para sorologia, de modo que foi possível a correlação da amostra de soro com as
de tecido, sabendo que ambas pertenciam ao mesmo animal.
No momento da evisceração, as aves tiveram a cabeça inteira coletada, a qual foi
colocada em saco plástico individualmente e enumerada de acordo com as amostras de soro.
As cabeças foram armazenadas e resfriadas em caixas isotérmicas e encaminhadas para o
laboratório da Universidade Federal de Uberlândia para a obtenção das amostras teciduais.
As amostras do encéfalo então coletadas foram armazenadas em sacos plásticos
estéreis, devidamente identificados com sua respectiva numeração e sob a temperatura de -
20°C. As amostras de coração foram coletadas da mesma maneira na evisceração, e no
laboratório foi realizada apenas a troca de embalagem com a mesma numeração e
encaminhados para congelamento a -20°C.
A coleta dessas amostras também foi realizada pela Dra Kênia de Fátima Carrijo,
Médica Veterinária, professora da Universidade Federal de Uberlândia e colaboradora deste
projeto, e posteriormente encaminhadas para a Universidade Federal Fluminense para as
análises moleculares.
60
4.4. ANÁLISES LABORATORIAIS
As técnicas sorológicas foram realizadas no Laboratório de Toxoplasmose e outras
protozooses (LabTOXO), do Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, nos meses de junho e agosto
de 2016. As amostras de soro foram destinadas à pesquisa de anticorpos IgG anti –
Toxoplasma gondii por meio dos métodos de Hemaglutinação Indireta (HAI) e Reação de
Imunofluorescência Indireta (RIFI).
A técnica molecular foi realizada no Laboratório de Biologia Molecular de Parasitos,
do Instituto Biomédico, Universidade Federal Fluminense, no mês de julho de 2016. Das 100
aves selecionadas para coleta de tecidos (coração e cérebro) foram separadas aleatoriamente
25 galinhas positivas na técnica sorológica Hemaglutinação Indireta para serem testadas.
4.4.1. HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA (HAI)
O método de Hemaglutinação indireta (HAI) foi realizado por meio do Kit
TOXOTEST HAI (Wiener Lab., 2000), seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante.
Para a leitura da placa, as amostras de soro que apresentavam aglutinação semelhante
ao controle positivo foram consideradas positivas e as amostras em que não ocorreu
aglutinação do soro e, portanto, houve a formação de um botão vermelho depositado no
fundo, assim como no controle negativo, foram consideradas negativas. Foram consideradas
positivas as amostras com títulos maiores ou iguais a 1:16.
4.4.2. REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (RIFI)
O método de Reação de Imunofluorescência Indireta para detecção de anticorpos IgG
anti-T. gondii foi realizado como descrito anteriormente por Camargo (1964), seguindo o
protocolo implantado no LabTOXO, utilizando uma suspensão de taquizoítas de T. gondii
cepa RH, inativos a uma concentração de 1x107 taquizoítas/mL, como antígeno. Foi utilizado
conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC), da marca Sigma-Aldrich, anti-galinha
IgY (IgG) produzido em coelho. Os soros foram diluídos a 1:16, 1:64, 1:256, e quando a
última diluição se apresentou muito reagente, foram realizadas mais duas diluições para os
títulos 1:1024 e 1:4096 em PBS 1%. As lâminas foram examinadas sob um microscópio Y-FL
de epifluorescência (Nikon E400), com lâmpada de mercúrio, filtro ND16, com objetivas de
40x com ocular de 10x. Controles positivos e negativos e controle branco (PBS) foram
61
incluídos na leitura das lâminas. Os títulos iguais ou superiores a 1:16 foram definidos como
positivos.
4.4.3. ENSAIO MOLECULAR
Das 25 galinhas selecionadas aleatoriamente para este ensaio, foram usadas 25
amostras de cérebro e 25 amostras de coração correspondentes a mesma galinha, totalizando
50 amostras testadas, recebendo a codificação CE para cérebro e CO para coração. Os códigos
foram pareados com aqueles obtidos do diagnóstico sorológico para correta identificação de
cada animal. Os tecidos foram macerados a fim de homogeneizar a amostra e aumentar as
chances de detecção do parasito, caso houvesse algum cisto com bradizoítas presente nestes
tecidos. De cada amostra foram separados aproximadamente 250µg para extração do DNA
total.
O DNA total foi extraído com o uso do kit Pure Link Genomic DNA Kit (Invitrogen®)
usando-se o protocolo para tecidos segundo recomendações do fabricante. A eluição do DNA
foi feita em volume final de 50µL. Previamente a PCR para detecção de T. gondii foi
realizada uma PCR para avaliar se havia inibidores nas amostras. Para realização desta PCR,
colocou-se 1µL de DNA extraído de sangue de cão, que previamente já havia sido testado, e
sabia-se que não continha inibição, e foi misturado a 1µL do DNA extraído das galinhas do
estudo. O alvo utilizado nesta PCR amplifica um fragmento da região mitocondrial citocromo
b de cães. Se houvesse inibidores na amostra do estudo, extraídas dos frangos, elas
impediriam a amplificação do DNA extraído do hospedeiro cão e inibiriam a reação da PCR.
As condições dessa PCR foram realizadas segundo padronizado por Frias (2013).
Verificada a ausência de inibidores nas amostras, prosseguiu-se com a PCR para o
alvo nuclear ITS 1, com os primers Tg-NP1 (5’-GTGATAGTATCGAAAGGTAT-3’) e Tg-
NP2 (5’-ACTCTCTCTCAAATGTTCCT-3’), que amplificaram um fragmento de 227 pares
de bases da região ITS1 (Internal Transcribed spacer 1) de Toxoplasma gondii (HURTADO et
al. 2001).
A PCR foi feita em volume final de 50µL, utilizando Tampão TAE 1X; MgCl2 2mM;
0,2mM dNTPmix; 200ng de cada primer; 2,5u de Taq polimerase Platinum (Invitrogen®), e
5µl de DNA. As reações foram colocadas em termociclador programável com as seguintes
condições: 94ºC por 5’, seguida de 40 ciclos de [94ºC por 20’’, 55ºC por 20’’ e 72ºC 30’’],
extensão a 72ºC por 7’ segundo padronizado pelo nosso grupo de pesquisa (Leles et al.,
62
2016). Usaram-se como controle positivo, DNA de lavado peritoneal de camundongo (Cepa
RH), cedido pela Drª. Maria Regina Reis Amendoeira (LabTOXO – FIOCRUZ), e controle
negativo (água nuclease free). Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel
de agarose a 2% em tampão TAE 1X, acompanhadas de marcador molecular de 50pb
(Promega®), e posteriormente à amplificação, os géis foram corados com Brometo de Etídio
e amplificações visualizadas e fotodocumentadas (L-Pix, Loccus®). Na tentativa de aumentar
a sensibilidade da PCR para cinco amostras que apresentaram bandas fracas ou um pouco
acima da altura esperada, realizou-se uma segunda PCR aumentando-se o número de ciclos
para 45.
Os amplicons foram purificados de acordo com o protocolo do kit Illustra™ GFX™
PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare Life Sciences®). As amostras
foram preparadas para sequenciamento direto, de ambas as fitas, com o kit Big Dye
Terminator (Applied Biosystems®). O sequenciamento foi realizado no Laboratório
Multiusuários de Microbiologia e Parasitologia – Instituto Biomédico (UFF), onde está
alocado o Sequenciador ABI-Prism 3130 4 capilares. As sequências foram editadas e
analisadas com o auxílio do programa de Bioinformática Chormas v.2.1.1 e Bioedit v.7.1.9.
As sequências obtidas foram comparadas com aquelas depositadas no Genbank através da
ferramenta BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
4.5. QUESTIONÁRIO EPIDEMIOLÓGICO
Paralelamente à coleta, os proprietários das fazendas e/ou responsáveis técnicos dos
frigoríficos responderam a um questionário epidemiológico (Apêndice B), que contemplava
variáveis como: idade, sexo, procedência dos animais, tipo de alimentação, contato com gatos
e ratos, sistema de criação, vermifugação e fonte da água de abastecimento da propriedade.
4.6. ANÁLISE DOS DADOS
Os resultados sorológicos obtidos e as variáveis epidemiológicas foram analisados por
meio do programa estatístico GraphPad Prism 7. Para avaliação do nível de concordância
entre os testes sorológicos realizados nas amostras foi utilizado o índice de concordância
Kappa (K). Para verificar a associação entre duas variáveis categóricas, foi realizado o teste
de qui-quadrado (χ2) de Pearson. No caso da avaliação de tabelas formadas por duas linhas e
duas colunas foi empregado o teste exato de Fisher com nível de significância de 5%. Na
63
avaliação do impacto entre as variáveis, foram descritos os valores das razões de chances
(OR) com seus respectivos intervalos de confiança (IC) de 95%.
4.7. ASPECTOS ÉTICOS
Os proprietários das granjas e/ou responsáveis técnicos dos abatedouros que
concordaram com a participação no estudo foram informados sobre os objetivos da pesquisa e
esclarecidos sobre a manutenção do sigilo de sua identidade pessoal, assim como do
estabelecimento em que foram realizadas as coletas, tendo o direito de retirar a autorização a
qualquer momento. Em caso de autorização, foi assinado o Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (Apêndice A) que continha, de forma resumida, os procedimentos que foram
realizados no estudo e os eventuais transtornos decorrentes destes.
Este trabalho teve a aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais / Núcleo de
Animais de Laboratório (CEUA/NAL) da Universidade Federal Fluminense, sob o registro nº
320/13, em 21 de fevereiro de 2013 (Anexo 1).
64
5. RESULTADOS
Dentre os animais estudados, o número de fêmeas foi superior ao número de machos,
representando 67,15% (280/417) e 32,85% (137/417), respectivamente. Quanto ao tipo de
criação, 24,22 % (101/417) das aves são provenientes de sistema intensivo (granja), 4,32%
(18/417) de sistema semi-intensivo e 71,46% (298/417) de sistema extensivo (caipira).
O número absoluto de galinhas distribuídas de acordo com o sexo e sistema de criação
pode ser observado no Gráfico 1.
Gráfico 1: Número total de galinhas domésticas analisadas, distribuídas de acordo com o sexo e o tipo
de criação ao qual foram destinados.
0 50 100 150 200 250 300
Sistema Extensivo
Sistema Semi-Intensivo
Sistema Intensivo
111
7
19
187
11
82
Macho Fêmea
65
As aves foram divididas em faixas etárias, que compreendem as idades de 27 dias a 41
dias, 53 dias a 120 dias e, idade superior a 120 dias. O número total de aves, quanto à faixa
etária e sistema de criação, está representado no Gráfico 2.
Gráfico 2: Número total de galinhas domésticas analisadas, distribuídas de acordo com a faixa etária e
o tipo de criação ao qual foram destinados.
Em relação ao município de procedência, 95,68% (399/417) das amostras analisadas
neste estudo foram oriundas do município de Uberlândia e 4,32% (18/417) de Araguari.
Todos os frangos criados no sistema semi-intensivo foram provenientes do município de
Araguari, enquanto que as aves destinadas à criação extensiva e intensiva foram procedentes
do município de Uberlândia.
5.1. DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO
A análise sorológica das amostras pelo método de RIFI, com títulos maiores ou iguais
a 1:16, demonstrou uma positividade geral de anticorpos anti-T.gondii em 37,65% (157/417)
das aves e pela técnica de HAI foi observada 75,06% (313/417) das amostras positivas. A
Tabela 3 demonstra a positividade observada em cada sistema de criação a partir das técnicas
realizadas, assim como a positividade geral das aves do estudo.
0 50 100 150 200 250 300
Sistema Extensivo
Sistema Semi-Intensivo
Sistema Intensivo 55
10
18
46
288
27-41 dias 53-120 dias Mais de 120 dias
66
Tabela 3: Distribuição de galinhas domésticas criadas e abatidas nos municípios de Araguari e
Uberlândia, Triângulo Mineiro (MG), no período de agosto de 2015 a janeiro de 2016, quanto às
técnicas sorológicas, sistemas de criação e frequência de anticorpos anti-T. gondii.
Técnicas Sistema de criação Positivo Negativo Total
RIFI
Sistema Extensivo 142 (47,65%) 156 (52,35%) 298 (100%)
Sistema Semi-
Intensivo 1 (5,56%) 17 (94,44%) 18 (100%)
Sistema Intensivo 14 (13,86%) 87 (86,14%) 101 (100%)
Total 157 (37,65%) 260 (62,35%) 417 (100%)
HAI
Sistema Extensivo 200 (67,11%) 98 (32,89%) 298 (100%)
Sistema Semi-
Intensivo 18 (100%) 0 18 (100%)
Sistema Intensivo 95 (94,06%) 6 (5,94%) 101 (100%)
Total 313 (75,06%) 104 (24,94%) 417 (100%)
Com relação às amostras reagentes pelo método de RIFI, os títulos e os percentuais
detectados podem ser observados na tabela 4. Já na tabela 5 pode-se observar o mesmo para
técnica de HAI.
67
Tabela 4: Ocorrência de anticorpos IgG anti- T. gondii identificada pela técnica de Reação de
Imunofluorescência Indireta, com os respectivos títulos, em soro de galinhas domésticas criadas e
abatidas nas cidades de Uberlândia e Araguari, Triângulo Mineiro (MG), no período de agosto de
2015 a janeiro de 2016.
RIFI – Amostras Reagentes
Diluição % (n)
16 53,50% (84)
64 26,11% (41)
256 14,01% (22)
1024 5,10% (8)
4096 1,28% (2)
Tabela 5: Ocorrência de anticorpos IgG anti- T. gondii identificada pela técnica de Hemaglutinação
Indireta, com os respectivos títulos, em soro de galinhas domésticas criadas e abatidas nas cidades de
Uberlândia e Araguari, Triângulo Mineiro (MG), no período de agosto de 2015 a janeiro de 2016.
HAI – Amostras Reagentes
Título % (n)
16 43,77% (137)
32 41,21% (129)
64 15,02% (47)
Quando analisada a soropositividade em ambas as técnicas, observou-se que 30,69%
(128/417) dos animais apresentavam-se soropositivos, e 17,98% (75/417) foram negativos.
Desse modo, estimando-se o índice de concordância Kappa entre as técnicas sorológicas
empregadas nas amostras de soro dos animais estudados, encontrou-se um coeficiente de
concordância de 0,087, (Tabela 6) o que indica, segundo Landis e Koch (1977), uma fraca
concordância entre as técnicas.
68
Tabela 6: Comparação dos resultados da sorologia para identificação de anticorpos anti- Toxoplasma
gondii em galinhas domésticas, obtidos por meio da HAI e da RIFI, para cálculo de concordância por
meio do coeficiente Kappa.
HAI
RIFI
Total Positivo Negativo
Positivo 128 185 313
Negativo 29 75 104
Total 157 260 417
Número de concordância observada: 203 (48,68% das observações)
Número de concordância esperada ao acaso: 182,7 (43,81% das observações)
Kappa = 0,087
Erro padrão de kappa = 0,035
Intervalo de confiança de 95%: 0,018 – 0,156
Devido à fraca concordância observada entre as técnicas sorológicas empregadas, a
técnica de RIFI foi considerada como padrão ouro para o diagnóstico sorológico, e foram
utilizadas apenas as amostras reagentes nesta técnica para a análise dos dados.
A Tabela 7 indica o percentual geral de positividade de acordo com o sexo, sendo
possível observar que 61,15% (96/157) das aves positivas para a presença de anticorpos anti-
T. gondii na técnica de RIFI eram fêmeas e 38,85% (61/157) machos, não sendo observada
associação estatisticamente significativa entre a variável (sexo) e a positividade das amostras
(p=0,0526).
Tabela 7: Distribuição de galinhas domésticas criadas e abatidas nos municípios de Araguari e
Uberlândia, Triângulo Mineiro, no período de agosto de 2015 a janeiro de 2016 de acordo com o sexo
e a frequência de anticorpos anti-T. gondii nas amostras estudadas.
Fêmea Macho Total
Positivo 96 (61,15%) 61 (38,85%) 157 (100%)
Negativo 184 (70,77%) 76 (29,23%) 260 (100%)
Total 280 (67,15%) 137 (32,85%) 417 (100%)
O.R. (I.C. 95%) = 0,65 (0,4281 – 0,987)
Teste Exato de Fisher p=0,0526
69
As fêmeas provenientes de criação extensiva demonstraram um percentual de
soropositividade superior aos machos, independentemente do tipo de criação dos mesmos.
Verificou-se que 89,58% (86/96) das fêmeas positivas pertenciam ao sistema extensivo, e
10,42% (10/96) ao sistema intensivo. Nenhuma fêmea procedente do sistema semi-intensivo
apresentou-se positiva. Quanto aos machos positivos, 91,80% (56/61) eram do sistema
extensivo, enquanto que 6,56% (4/61) são do sistema intensivo e 1,64% (1/61) do sistema
semi-intensivo.
A soropositividade determinada a partir da idade e do tipo de criação que as galinhas
estavam destinadas evidenciou que os animais mais velhos, com idade superior a 120 dias, e
pertencentes ao sistema extensivo foram os mais acometidos pelo Toxoplasma gondii,
representando 86,62% (136/157) dos animais soropositivos pela Reação de
Imunofluorescência Indireta. As outras galinhas analisadas representaram 13,38% (21/157)
dos resultados positivos, dentre estes, 66,67% (14/21) das aves eram procedentes do sistema
intensivo de criação, incluídas nas faixas etárias de 27 a 41 dias e 53 a 120 dias, 28,57%
(6/21) de criação extensiva e 4,76% (1/21) de criação semi-intensiva, todos na faixa etária de
53 a 120 dias.
A Tabela 8 mostra a distribuição de galinhas domésticas com relação a faixa etária e
os resultados sorológicos obtidos, demonstrando associação estatisticamente significativa
(p<0,0001). A razão de chance de ocorrência de anticorpos específicos para T. gondii em frangos
com idade superior a 120 dias foi de 4,5731 vezes maior que em outras faixas etárias.
Tabela 8: Distribuição de galinhas domésticas criadas e abatidas nos municípios de Araguari e
Uberlândia, Triângulo Mineiro, no período de agosto de 2015 a janeiro de 2016 de acordo com a faixa
etária e a frequência de anticorpos anti-T. gondii nas amostras estudadas.
27 a 41 dias* 53 a 120 dias Mais de 120 dias Total
Positivo 9 (5,73%) 12 (7,64%) 136 (86,63%) 157 (100%)
Negativo 46 (17,69%) 62 (23,85%) 152 (58,46%) 260 (100%)
Total 55 (13,19%) 74 (17,75%) 288 (69,06%) 417(100%)
O.R.
(I.C. 95%)
0,9892
(0,3846 - 2,5444)
4,5731
(2,1582 – 9,6901)
Teste Qui-quadrado p<0,0001
*Categoria de referência utilizada para o cálculo de Odds Ratio (O.R.) com intervalo de confiança (I.C.) de 95%.
70
A Tabela 9 evidencia a frequência de animais soropositivos de cada município. Nota-
se um maior percentual de ocorrência para anticorpos anti- T. gondii (99,36%) em galinhas
domésticas provenientes do município de Uberlândia, com associação estatística significativa
entre a variável e a positividade das amostras (p=0,0025) e maior chance de soropositividade
(10,9136 vezes a mais) em relação ao município de Araguari.
Dos animais provenientes do município de Uberlândia, 47,65% (142/298) criados no
sistema extensivo foram positivos, enquanto que no sistema intensivo foi detectado apenas
13,86% (14/101) de positividade.
Tabela 9: Distribuição de galinhas domésticas criadas e abatidas, no período de agosto de 2015 a
janeiro de 2016, de acordo com o município de procedência e a frequência de anticorpos anti-T. gondii
nas amostras estudadas.
Uberlândia Araguari Total
Positivo 156 (99,36%) 1 (0,64%) 157 (100%)
Negativo 243 (93,46%) 17 (6,54%) 260 (100%)
Total 399 (95,68%) 18 (4,32%) 417 (100%)
O.R. (I.C. 95%) = 10,9136 (1,4379 – 82,8334)
Teste Exato de Fisher p= 0,0025
5.1.1. QUESTIONÁRIO EPIDEMIOLÓGICO
Analisando as variáveis epidemiológicas verificou-se que 75,78% (316/417) dos
frangos estudados se alimentavam de ração e pasto e pertenciam ao sistema extensivo e semi-
intensivo, enquanto que 24,22% (101/417) consumiam somente ração e eram procedentes do
sistema intensivo.
Quanto à fonte de água, 69,06% (288/417) dos frangos ingeriam água de fonte
desconhecida (os proprietários não informaram a fonte de água) e pertenciam ao tipo de
criação extensivo, 24,22% (101/417) de poço artesiano, sob o sistema de criação intensivo, e
6,72% (28/417) de nascente, criados no sistema semi-intensivo e extensivo. Em relação à
criação com outros animais, 69,06% (288/417) dos frangos eram criados com outros animais,
incluindo outras aves, cães e gatos, sob o sistema extensivo, 4,32% (18/417) também eram
71
criados em conjunto com outros animais, porém somente com outras espécies de aves e
pertenciam ao sistema semi-intensivo, e por fim, 26,62% (111/417) não participavam de
criação com outros animais e eram procedentes do sistema intensivo e sistema extensivo.
A Tabela 10 mostra a distribuição das aves positivas diante das variáveis
epidemiológicas, consideradas possíveis fatores de risco para a infecção por Toxoplasma
gondii, presentes no questionário epidemiológico.
Ao correlacionar os possíveis fatores de risco pertinentes à transmissão do parasito às
aves, percebe-se que dentre as galinhas positivas, 91,08% (143/157) são alimentados com
ração e pasto, e 86,62% (136/157) são criados com outros animais (outras aves, como pato,
gansos e marrecos, além de cães e gatos) e não apresentam informações quanto à fonte de
água consumida, todos apresentando significância estatística (p<0,0001).
Todas as galinhas domésticas utilizadas no presente estudo eram provenientes de
propriedades onde foi relatada a presença de gatos e ratos, e a não vermifugação periódica das
aves. No entanto, essas variáveis não apresentaram associação estatisticamente significativa,
com a sorologia positiva das amostras de frangos analisados (p>0,9999).
Tabela 10: Distribuição dos frangos criados e abatidos nos municípios de Araguari e Uberlândia,
Triângulo Mineiro, no período de agosto de 2015 a janeiro de 2016 segundo possíveis fatores de risco
para infecção por Toxoplasma gondii.
Variáveis
Epidemiológicas
Positivos
n (%)
Negativos
n (%)
Total
n (%) O.R. I.C. (95%) p valor
Alimentação
Ração
Ração/Pasto
Total
14 (13,86%)
143 (45,25%)
157 (37,65%)
87 (86,14%)
173 (54,75%)
260 (62,35%)
101 (100%)
316 (100%)
417 (100%)
0,1947
0,1062 – 0,357 <0,0001
Fonte de água
Poço Artesiano
Nascente
Sem informação*
Total
14 (13,86%)
7 (25%)
136 (47,22%)
157 (37,65%)
87 (86,14%)
21 (75%)
152 (52,78%)
260 (62,35%)
101 (100%)
28 (100%)
288 (100%)
417 (100%)
0,1799
0,3725
0,0977 – 0,331
0,1536 – 0,9037 <0,0001
*Categoria de referência utilizada para o cálculo de Odds Ratio (O.R.) com intervalo de confiança (I.C.) de 95%.
72
Tabela 10 (continuação): Distribuição dos frangos criados e abatidos nos municípios de Araguari e
Uberlândia, Triângulo Mineiro, no período de agosto de 2015 a janeiro de 2016 segundo possíveis
fatores de risco para infecção por Toxoplasma gondii.
Variáveis
Epidemiológicas
Positivos
n (%)
Negativos
n (%)
Total
n (%) O.R. I.C. (95%) p valor
Criação em
conjunto
Não
Sim
(Patos, marrecos e
gansos)
Sim (Patos,
marrecos, gansos,
cães e gatos)*
Total
20 (18,02%)
1 (5,56%)
136 (47,22%)
157 (37,65%)
91 (81,98%)
17 (94,44%)
152 (52,78%)
260 (62,35%)
111 (100%)
18 (100%)
288 (100%)
417 (100%)
0,2456
0,0657
0,1436 – 0,42
0,0086 – 0,5006
<0,0001
*Categoria de referência utilizada para o cálculo de Odds Ratio (O.R.) com intervalo de confiança (I.C.) de 95%.
5.2. DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Nenhuma amostra apresentou inibidores para a reação de PCR.
Para o alvo ITS1 de Toxoplasma gondii, duas amostras de cérebro (amostra CE37 e
CE87) amplificaram na altura esperada de 227pb, assim como o controle positivo, ressaltando
que não houve amplificação no controle negativo (Figuras 10 e 11).
Dentre as amostras em que foi realizada uma nova PCR com um número maior ciclos,
somente a amostra CE37 (que apresentou banda um pouco acima na primeira PCR)
amplificou na altura de 227 pb. As demais amostras, mesmo aumentando a quantidade de
DNA e o número de ciclos, não amplificaram na altura correta.
73
Figura 10: Amplificações para alvo ITS1 de Toxoplasma gondii em cérebros das galinhas domésticas
do estudo. Linha 1 a 10: DNA das amostras testadas; Linha 11: Controle positivo (lavado peritoneal de
camundongo/Cepa Rh); Linha 12: Controle negativo (água nuclease free); Linha 13: Marcador de peso
molecular de 50pb. O retângulo indica a amplificação de uma das amostras (CE37) na altura esperada
do controle positivo.
Figura 11: Amplificações para alvo ITS1 de Toxoplasma gondii em cérebros das galinhas domésticas
do estudo. Linha 1 a 13: DNA das amostras testadas; Linha 14: Controle negativo (água nuclease
free); Linha 15: Controle positivo (lavado peritoneal de camundongo/Cepa Rh). O retângulo indica a
amplificação de uma das amostras (CE87) na altura esperada do controle positivo.
.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
74
Ambas as amostras amplificadas para o alvo de T. gondii são provenientes de
indivíduos com características diferentes, detalhadas na tabela 11, abaixo:
Tabela 11: Características dos indivíduos com amostras amplificadas na PCR para alvo ITS1 para
Toxoplasma gondii.
Amostra: CE37 CE87
Sexo: Masculino Feminino
Idade: 120 dias 55 dias
Sistema de criação: Semi-intensivo Intensivo
Município de
procedência: Araguari Uberlândia
HAI: 16 32
RIFI: Negativo Negativo
As sequências obtidas, embora, de dois indivíduos diferentes foram idênticas entre si, e
apresentaram 100% de similaridade com diversas sequências de T. gondii (KX459518.1,
KM657806.1; JQ235841.1, JX456456.1, entre outras) disponibilizadas no Genbank (Figura
12, Tabela 12). A sequência desse estudo foi depositada no Genbank (Número de
acesso: KX853130).
75
Tabela 12: Animais com os quais as sequências obtidas nesse estudo apresentaram 100% de
similaridade de acordo com a localização, número de acesso no Genbank e material isolado para a
realização do ensaio molecular.
Hospedeiro Local Número de acesso Material isolado
Bisão Polônia KX459518 ----
Galinha Brasil JF810931-JF810959 Coração e cérebro
Bovino Portugal AY582110 ----
Gato Tailândia KX895868 Fezes
Gato Doméstico Estados Unidos KP999999 Amostra fecal
Lontra Europeia
(Lutra lutra) Noruega KM657806 Diafragma
Gato China JX456456 Sangue
Pardal doméstico
(Passer
domesticus)
Brasil GQ160468 Coração
Gado de corte Brasil FJ966048 Cérebro
Cabra Brasil FJ176233 Língua
Gato Alemanha EU025025 ----
Foca (Phoca
vitulina richardsi) Estados Unidos AF252408 ----
Ovelha China AJ628251 ----
76
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
KX459518 GTGATAGTATCGAAAGGTATTATTGCCTTCTTCATGTTGGATATCCTGCGCTGCTTCCAATATTGGAAGCCAGTGCAGGTATCCGGGGGTGCACAGCGAA
Cepa RH ....................................................................................................
CE87 ....................................................................................................
CE37 ....................................................................................................
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
KX459518 GGGGCTCAATTTCTGGAAATTCGTGTCTCTGTTGGGATACTGATTTCCAGGAGTTTCTTCAGTGTGCATTCTTTTTTCCCACACCGTTATTTCAAACAAC
Cepa RH ....................................................................................................
CE87 ....................................................................................................
CE37 ....................................................................................................
210 220
....|....|....|....|....|..
KX459518 AAATCTGAGGAACATTTGAGAGAGAGT
Cepa RH ...........................
CE87 ...........................
CE37 ...........................
Figura 12: Alinhamento de sequências nucleotídicas de fragmento da região ITS de T. gondii.
Legenda: KX459518 - Número de acesso da sequência do Genbank usada para comparação; Cepa RH - Amostra usada como controle positivo nas reações de
PCR; CE87 e CE37 - Amostras desse estudo.
77
6. DISCUSSÃO
Estudos sobre inquérito soroepidemiológico para averiguar a frequência de anticorpos
anti-T. gondii em aves de corte no Triângulo Mineiro, uma importante região produtora de
carne no país, são escassos. Contudo, recentemente foi realizada uma pesquisa no município
de Uberlândia, onde Lopes e colaboradores (2016) analisaram 108 amostras de galinhas
caipiras, utilizando o teste imunológico MAT como triagem para confirmar a soropositividade
do número amostral e posteriormente poder realizar a genotipagem da espécie de protozoário
na região. A soroprevalência geral encontrada foi de 71,3% com títulos variando de 16 a
4096.
No Brasil, o consumo de carne de aves pode oferecer risco de infecção, principalmente
se não houver cuidados sanitários na produção desses animais. Soma-se a este fato o perfil do
consumidor, que pode propiciar hábitos de risco, principalmente se a carne não estiver bem
cozida, como acontece, por exemplo, no preparo, de churrasco, onde a carne in natura ou
processada, na maioria das vezes não assa de forma adequada de maneira que possa eliminar
o parasito do tecido (DUBEY, 1994; SCHLINDWEIN & KASSOUF, 2006).
A prevalência de T. gondii em galinhas caipiras, no Brasil, varia entre 10,3% no Paraná
(GARCIA et al., 2000) e 100% em Alagoas (OLIVEIRA et al., 2009). Divergências entre as
taxas de infecção em regiões de um país e entre países distintos podem ser justificadas por
diferentes níveis de contaminação ambiental, pelas técnicas empregadas nas pesquisas, assim
como pelos sistemas de criação, pelo clima, entre outros fatores (MILLAR et al., 2012).
O presente estudo verificou a frequência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii na
população estudada, e observou uma positividade geral de 75,06% para as amostras testadas
na HAI e 37,65% para amostras testadas na RIFI. A concordância observada entre os
resultados obtidos com as técnicas de RIFI e HAI, utilizadas no presente estudo, foi
78
considerada fraca (Kappa = 0,087), de acordo com Landis & Koch (1977). Rocha e
colaboradores (2014) também encontraram uma concordância fraca ao compararem os
resultados entre as técnicas de HAI e RIFI (Kappa = 0,16) ao analisarem 260 galinhas
provenientes do estado da Bahia, observando que a frequência de animais soropositivos pela
HAI foi de 16,5% (43/260) e 53% (138/260) pela RIFI. No presente trabalho, a técnica de
HAI parece não representar de modo satisfatório a verdadeira condição da população
estudada, e pode ter revelado um grande número de resultados falso-positivos, em relação aos
resultados obtidos na técnica de RIFI, ao analisar as amostras testadas em ambas as técnicas.
Em contrapartida, outros estudos realizados com galinhas utilizando a HAI para diagnóstico
apresentaram bons resultados e o teste apresentou-se confiável, indicando boa sensibilidade e
especificidade, e com valores concordantes em ambos os estudos (BELTRAME et al., 2012;
CASARTELLI-ALVES et al., 2014). Segundo Casartelli-Alves e colaboradores (2014), tal
fato pode ser atribuído à utilização de kit comercial com a mesma marca daquele usado por
Beltrame e colaboradores (2012) para a realização da técnica. No presente estudo, o kit
utilizado foi de marca diferente da usada anteriormente pelos autores supracitados, podendo
apresentar alguma diferença nos reagentes e diluentes, ou reatividade do antígeno. Cabe
ressaltar que para muitas amostras o controle de heterofilia não funcionou, formando um
manto no poço. E ainda, algumas amostras que se mostraram positivas na HAI foram
consideradas negativas na RIFI, no entanto, estas apresentaram fluorescência polar, o que
pode indicar reação cruzada com outras espécies do filo Apicomplexa. Todavia, é necessário
que haja padronização dos kits utilizados no diagnóstico da toxoplasmose humana, como os
kits de Hemaglutinação Indireta, para utilização em estudos epidemiológicos em espécies
animais.
De acordo com Garcia e colaboradores (2000), divergências nas frequências de
positividades para T. gondii em galinhas podem estar associadas à níveis diferentes de
infectividade nos ambientes estudados ou às diferenças de sensibilidade entre as técnicas
empregadas no diagnóstico.
Fatores que podem ocasionar variação de resultados entre as técnicas são a grande
variabilidade de proteínas antigênicas utilizadas nos testes para detecção de anticorpos, seja
na quantidade de antígenos ou na procedência da cepa. Além de fatores como erros de
manipulação do operador, variação na sensibilidade dos reagentes devido a estocagem ou
transporte inadequados, diferença de qualidade entre os fabricantes dos kits comerciais ou
entre kits de diferentes lotes, entre outros, podem estar influenciando o resultado final da
79
metodologia, permitindo o encontro de resultados contraditórios ao serem comparadas as
técnicas (ALBUQUERQUE et al., 2012).
A importância do diagnóstico sorológico resulta na adoção de critérios específicos para
a escolha de um método eficiente, capaz de fornecer um diagnóstico correto e preciso.
Segundo Chiari (1981), uma técnica sorológica para ser utilizada em estudos epidemiológicos
precisa ser econômica, simples, sensível, específica e apresentar boa praticidade,
reprodutibilidade e concordância. Por essas razões, em relação à toxoplasmose animal, a RIFI
é uma das técnicas mais executadas no diagnóstico e em levantamentos sorológicos
(ESTEBAN-REDENDO & INNES, 1997; GARCIA et al., 1999; FIGUEIREDO et al., 2001;
MEIRELES et al., 2003; FIALHO & ARAÚJO, 2003; SAWADOGO et al.,2005).
A frequência de positividade encontrada nas aves pela RIFI neste estudo (37,65%) foi
considerada alta, levando em consideração que os animais eram provenientes de diferentes
sistemas de criação. Esta positividade foi superior à relatada por Garcia e colaboradores
(2000) que observaram 10,3% de soropositividade no Paraná em 155 amostras pela RIFI,
Millar e colaboradores (2012), observaram 17,2% de amostras reagentes para RIFI no Rio de
Janeiro em 810 amostras estudadas, e Gonçalves e colaboradores (2012), no estado da Bahia
que verificaram pela técnica de RIFI, 25% de positividade em um total de 100 soros
analisados. No entanto, outros autores apontam positividades maiores, como Bonna e
colaboradores (2006) que analisaram 316 aves, no estado do Rio de Janeiro, e observaram
47,56% das amostras reagentes pela RIFI, Brandão e colaboradores (2006) em Minas Gerais,
ao testarem 28 amostras pela RIFI, verificaram uma frequência de positividade de 53,6%.
A eficácia da reação de imunofluorescência indireta na detecção de anticorpos anti-
T.gondii nas aves já foi demonstrada por Garcia e colaboradores (2000), e confirmada por
diversos autores (BONNA et al., 2006; BRANDÃO et al., 2006; COSTA et al., 2008; MORÉ
et al., 2012; CASARTELLI-ALVES et al., 2014).
Os resultados da RIFI indicaram uma alta frequência de títulos baixos entre os frangos
de corte positivos, independente do tipo de criação e da idade. Sendo observado que 50,53%
(84/157) apresentaram título 16. Logo, os baixos títulos encontrados no presente estudo
sugerem que não houve tempo hábil para formação de títulos mais elevados indicativos de
infecção aguda, ou que estavam na fase crônica da infecção. Independente da fase da
infecção, esses resultados demonstram que existe a possibilidade de infecção do homem caso
a carne dessas aves seja consumida crua ou mal cozida, não diminuindo a importância desses
animais como fonte de infecção para outros hospedeiros. Para os títulos mais altos (1:1204 e
80
1:4096) foi observada uma baixa frequência 6,36% (10/157). E as aves que apresentaram
esses títulos possuíam mais de 120 dias e eram criadas no sistema extensivo.
A frequência verificada neste estudo pode estar associada ao fato de que a maioria das
aves analisadas pertence ao sistema extensivo de criação (caipiras) e, possuem mais de 120
dias. Logo, estas aves apresentam neste estudo alta frequência de positividade (86,63%) para
a infecção, sendo superior a criação intensiva e semi-intensiva, e às aves mais jovens.
É visto que galinhas de criação livre ciscam no solo para recolher alimento, enquanto
galinhas sob sistemas de manejo intensivo e semi-intensivo recebem cuidados sob melhores
condições de higiene e possuem nenhum acesso (intensivo) ou menor acesso (semi-intensivo)
ao ambiente contaminado, uma vez que eles são mantidos em confinamento
(GEBREMEDHIN et al., 2015).
Espera-se que a criação intensiva apresente medidas regulares de prevenção e controle
da infecção de galinhas por T. gondii, em comparação aos sistemas extensivos e semi-
intensivos, promovendo o menor contato das aves com possíveis fontes de infecção,
possibilitando, desta maneira, baixo ou nenhum percentual de galinhas infectadas. Em
criações extensivas, os frangos podem estar mais expostos à infecção devido ao possível
contato com felinos infectados, assim como solo e água contaminadas por oocistos, além de
passarem muito tempo em um mesmo ambiente, conferindo mais chances de se infectarem
com o parasito.
Quanto à idade, a presença de infecção predominante em aves mais velhas em relação
às aves mais jovens, as quais nesse estudo apresentavam idades entre 27 dias e 41 dias, em
parte é devida a um aumento no efeito cumulativo da exposição ao parasito por galinhas
adultas, isto é, com o aumento da idade das aves a probabilidade de encontrar oocistos de T.
gondii a partir do ambiente também aumenta (Dubey, 2010a). Outros estudos indicam o
aumento relativo na soroprevalência quanto à idade em galinhas em todo o mundo (TENTER,
HECKEROTH & WEISS, 2000; ALVARADO-ESQUIVEL et al., 2012).
Em relação ao sexo, observa-se que o número de fêmeas abatidas foi maior que o
número de machos. Não foi encontrada associação entre soropositividade para T. gondii e o
sexo dos frangos, corroborando os achados de Bonna e colaborades (2006), Feitosa e
colaboradores (2016) e outros estudos realizados entre cabras, ovelhas, búfalos, suínos e
animais selvagens (RAGOZO et al., 2009; CORREIA et al., 2015; BRASIL et al., 2015,
FEITOSA et al., 2014, PIMENTEL et al., 2009).
81
Ainda que o percentual se mostre reduzido, o resultado obtido neste trabalho mostra que
frangos de corte de criação intensiva podem ser considerados como uma fonte de infecção,
salientado que deve haver melhorias nas condições sanitárias das propriedades e no manejo
desses animais nos criadouros e abatedouros. Diferente do encontrado neste estudo, uma
baixa soropositividade para T. gondii em frangos de corte de criação intensiva já foi registrada
na literatura pela técnica de Hemaglutinação Indireta em frangos abatidos na cidade de Porto
Alegre, por Araújo e colaboradores (1989), que verificam uma ocorrência de 2,80%. Em outro
estudo realizado por Millar e colaboradores (2012) foi verificada pela técnica de Reação de
Imunofluorescência Indireta, uma positividade de 7,8% em frangos de corte criadas no
sistema intensivo no estado do Rio de Janeiro.
A pequena porcentagem de positividade detectada no sistema semi-intensivo pode estar
subestimando o real número de frangos possivelmente infectados no município de Araguari,
devido ao número amostral reduzido (18 amostras), o qual foi analisado sorologicamente e
quanto à presença de algumas possíveis fontes de infecção presentes na propriedade,
apontadas pelo proprietário no questionário epidemiológico. Algumas variáveis
epidemiológicas como fonte de água, alimentos e criação em conjunto demonstraram
associação estatística significativa ao resultado positivo. Diante da análise de poucas amostras
não foi possível avaliar a presença do Toxoplasma nas aves deste município,
consequentemente nas propriedades produtoras.
A soropositividade de galinhas de criação extensiva encontrada neste estudo corroborou
achados de outros autores no Brasil, que realizaram estudos com galinhas deste tipo de
criação, independentemente do teste sorológico utilizado. Fernandes e colaboradores (2016)
relataram uma taxa de soroprevalência de 40,6% (86/212) no estado de Pernambuco,
Beltrame e colaboradores (2012) averiguaram uma frequência de 38,8% (198/510) no Espírito
Santo e Camillo e colaboradores (2015) observaram um percentual de soropositividade de
74,4% (102/137) no Rio Grande do Sul. Os resultados obtidos confirmam, portanto, que este
agente está amplamente distribuído em todo o Brasil e indiretamente mostram que o solo este
comumente contaminado com oocistos de T. gondii.
Em todas as propriedades foi relatada a presença de gatos e ratos, no entanto, não foi
observada associação estatística significativa com os resultados, estando de acordo com os
dados encontrados por Casartelli-Alves e colaboradores (2015) ao realizarem trabalho nas
cidades de Rio Bonito e Maricá, no estado do Rio de Janeiro. É possível que a existência de
gatos nos sistemas de criação seja um método de controle de roedores. Contudo, cabe
82
salientar que os roedores podem ser uma importante via de infecção para os gatos, que podem
se infectar pela predação desses animais e consequente ingestão de cistos teciduais. Embora
os roedores também sejam considerados indicadores de contaminação ambiental, as galinhas
são mais importantes como sentinelas do ponto de vista epidemiológico, devido a sua
longevidade (Dubey, 2010a).
Segundo Dubey (2010a), tecidos de galinhas infectadas são uma eficiente fonte de
infecção para os gatos. A presença de felinos no ambiente mantém o ciclo do parasito, por
estes serem os hospedeiros definitivos, e é extremamente importante no que se refere à
infecção por T. gondii entre galinhas criadas em grande escala. Visto que quanto maior o
número de gatos infectados, maior é a eliminação de oocistos no ambiente, aumentando a
carga ambiental de contaminação por oocistos, os quais permanecem viáveis por um longo
período (WEIGEL et al., 1995). Esta correlação entre a soropositividade de galinnhas e
presença de gatos nas propriedades, como possível fator de risco para a infecção, foi relatada
por autores como Bonna e colaboradores (2006) entre suínos e frangos criados no Rio de
Janeiro, e Millar e colaboradores (2012) entre galinhas poedeiras criadas dentro de um
sistema semi-extensivo.
Não foi observada associação estatística em relação ao tipo de alimentação destinada
aos frangos no presente estudo e os índices de positividade. Corroborando os dados
encontrados por Feitosa e colaboradores (2016), que não encontraram associação estatística
significativa com o tipo de alimentação e a soropositividade ao analisarem 483 galinhas de 5
municípios no estado da Paraíba.
No entanto no presente estudo, observou-se que a proporção de frangos soropositivos
alimentados apenas com ração foi baixa (13,86%) em comparação aos frangos que se
alimentavam de ração e pasto (45,25%). Não se pode descartar a possibilidade de que esse
grau de positividade pode ter ocorrido pelo fato de que os animais que se alimentavam de
ração e pasto pertenciam aos sistemas extensivo e semi-intensivo, e podiam estar mais
expostos a oocistos no solo, já que esses animais são criados ou passam um tempo livres.
Além disso, a presença do gato nas propriedades, e possível livre circulação desses animais a
todos os ambientes, permite que estes tenham acesso aos locais de armazenamento das rações,
aumentando a oportunidade de defecação desses animais nos alimentos e possível eliminação
de oocistos por gatos infectados. Tal fato pode justificar a alimentação como um possível
fator de risco para frangos criados no sistema intensivo, visto que no presente estudo em todas
as propriedades foi relatada a presença de gatos. Ainda que não tenha como afirmar a
83
presença de gatos infectados, ou o número de gatos infectados liberando oocistos e a
proporção de contaminação do solo, pode-se admitir que o contato com o solo supostamente
contaminado é uma importante fonte de infecção para as galinhas do presente estudo.
Outra via de transmissão importante para a infecção por Toxoplasma gondii tanto para
humanos como para os animais, são as fontes de água sem tratamento, possivelmente
contaminadas por oocistos. A água é um importante meio de disseminação do T. gondii
devido à longa sobrevivência dos oocistos no ambiente, dessa maneira, pode ser considerada
um fator de risco tão importante quanto os alimentos (TENTER, HECKEROTH & WEISS,
2000; BAHIA-OLIVEIRA et al., 2003; CENCI-GOGA et al. 2013). Foi observado no
presente estudo associação estatisticamente significativa entre a fonte de água e os resultados
positivos. A maior parte dos animais infectados, a partir da avaliação desta variável, não teve
a origem da água consumida informada. Contudo, cabe ressaltar que esses animais
pertenciam ao sistema extensivo de criação, e que 25% dos animais que bebiam água
proveniente de nascente também estavam infectados. A associação significativa entre fonte de
água e galinhas soropositivas também foi verificado por Camillo e colaboradores (2015), ao
realizarem um estudo com 597 galinhas domésticas.
A associação entre a vulnerabilidade de contaminação de fontes de água naturais e a
soropositividade de animais, incluindo frangos, pode representar um tipo de “ciclo vicioso”
no qual os felinos infectados podem contaminar o solo com oocistos de T. gondii que, por
percolação, pode contaminar águas subterrâneas ou outras fontes de água. Galinhas e outras
aves podem adquirir infecção pelo parasito ao beber água contaminada e, em seguida, por
carnivorismo, felinos são por sua vez infectados (VIEIRA et al., 2015). Com esta
possibilidade, há pelo menos dois aspectos da contaminação ambiental, em primeiro lugar, os
oocistos permanecem viáveis em água doce e marinha por longos períodos (LINDSAY et al.,
2003). Em segundo lugar, os frangos livres (e aves em geral) que bebem água não filtrada de
poços e outras fontes de água naturais não tratadas (como lagos ou lagoas) podem se infectar
(CASARTELLI-ALVES et al., 2015).
No presente estudo, foi possível observar que 87,26% (137/157) dos animais
soropositivos eram criados com outros animais, no caso, outras aves, cães e gatos. É
importante destacar a associação significativa (p<0,0001) encontrada, porém quando avaliado
o intervalo de confiança, o mesmo não foi significativo. Araújo (2016), ao analisar a criação
de suínos em conjunto com outros animais (bovinos), encontrou p valor significativo para a
variável, no entanto, a criação em conjunto observada no estudo parece agir como fator de
84
proteção. Sendo uma possível justificativa, utilizado no estudo anteriormente citado, a adoção
de práticas adequadas de manejo nas propriedades, uma vez que todos os animais pertenciam
ao sistema intensivo, e não necessariamente o fato de espécies serem criadas conjuntamente.
Durante os últimos anos, tem ocorrido avanços significativos no desenvolvimento de
ferramentas para diagnóstico molecular. Foram descritos vários ensaios baseados em PCR,
direcionados a diferentes regiões do genoma desses protozoários. Uma vez que as regiões
ITS, as quais possuem variabilidade interespecífica, são menos conservadas do que os genes
de rRNA, a criação de iniciadores (primers) para detectar variações nesta região da sequência
de DNA é direta e o risco de reações cruzadas é inferior entre espécies diferentes (HOMAN et
al., 1997; NOWZARI et al., 2004; AIGNER et al., 2010).
Yan e colaboradores (2010) mostraram que T. gondii pode ser detectado através da
PCR, em tecidos de galinhas naturalmente infectadas a partir de 21 dias após a infecção. No
entanto, espera-se que os diagnósticos sorológicos, que tem o objetivo de detectar a presença
de anticorpos durante a fase aguda da infecção, sejam eficientes antes mesmo de observar a
presença do parasito nos tecidos. Contudo, a PCR com iniciadores específicos é muito precisa
para a detecção de DNA de T. gondii (SU et al., 2010).
Quanto à realização do diagnóstico molecular neste estudo, os órgãos de escolha para
extração do DNA e realização da PCR foram cérebro e coração. Yan e colaboradores (2010)
estudaram galinhas na China e relataram que os órgãos com maior quantidade de parasitas de
T. gondii, foram o coração e os pulmões, enquanto que Aigner e colaboradores (2010)
demonstraram a amplificação do DNA de T. gondii em amostras de cérebro e coração de
frangos no Paraná (Brasil). Em geral, este tipo de investigação utiliza o cérebro e o coração
para a análise molecular porque estes órgãos são os principais alvos de predilação do parasito.
Gonçalves e colaboradores (2012) obtiveram 13 amostras de cérebro e sete amostras de
coração de galinhas na Bahia (Brasil) e relataram que 8 amostras (de ambos os órgãos) foram
positivas por PCR, demonstrando maior predileção do patógeno para esses órgãos.
As duas aves positivas na PCR das 25 avaliadas apresentaram títulos iguais a 1:16 e
1:32 na técnica de HAI, e ambas foram negativas na técnica de RIFI. Adicionalmente, não
observou-se amplificação para o protozoário no coração desses mesmos animais que foram
positivos pelo diagnóstico molecular quando testado o cérebro. Uma possível explicação para
este fato pode ser o método utilizado para a maceração do tecido, visto que este é um músculo
resistente e denso, além deste órgão apresentar grande quantidade de gordura, sendo
necessária a remoção da mesma, dificultando dessa maneira a utilização de algumas partes do
85
órgão. Por mais que esse método visasse homogeneizar o tecido, o mesmo sucesso obtido na
maceração do cérebro não foi conseguido com o coração, ficando ainda alguns fragmentos, e
grande parte desse tecido não foi usada na extração, devido ao protocolo padronizado, que
preconiza a utilização de aproximadamente 250 microgramas do material. Ademais, não se
pode descartar o fato do protozoário não estar presente no coração. Contudo, esses resultados
reforçam a importância do emprego de diferentes abordagens diagnósticas, uma vez que o
diagnóstico molecular foi capaz de detectar o parasito em amostras negativas em uma das
técnicas sorológicas aplicadas. Ainda cabe ressaltar que em algumas amostras havia presença
de sangue, sendo possível que o DNA detectado na PCR tenha sido proveniente de
taquizoítas, e não de cistos teciduais formados nos órgãos analisados.
Desta maneira, ao analisar as duas amostras positivas na PCR e os resultados das
mesmas na RIFI, observou-se que estas se apresentaram negativas nesta técnica sorológica,
assim, como a maioria das amostras testadas na PCR. Isto sugere que os frangos negativos na
RIFI estavam na fase recente da infecção, e não houve tempo hábil para a formação de
anticorpos detectáveis, visto que a técnica de RIFI pesquisa a presença de anticorpos da classe
IgG, presentes no estágio crônico. Além disso, frangos com infecção recente não apresentam
cistos teciduais, apenas taquizoítas circulantes no sangue, sendo assim o DNA detectado nas
amostras de cérebro podem ser procedentes desta forma evolutiva.
Somente 5 amostras testadas na HAI e na RIFI foram positivas em ambas as técnicas, e
negativas na PCR. Sendo assim, ainda que possa ser avaliada a presença de anticorpos no
soro, a presença de DNA, proveniente de taquizoítas ou de cistos teciduais formados pelo T.
gondii, nas amostras analisadas não foi detectada, podendo ser explicado pelo fato destes
estarem localizados em outros tecidos que não os avaliados (AIGNER, 2008; TENTER, 2009;
DUBEY, 2010a).
Adicionalmente, embora o trecho da sequência analisado seja pequeno, e não se possa
afirmar o genótipo ao qual pertence o T. gondii detectado nas amostras, pode-se dizer que elas
são idênticas a várias outras sequências de T. gondii, provenientes de diferentes partes do
mundo, incluindo o Brasil, sugerindo que possa pertencer a uma linhagem de distribuição
cosmopolita.
Hill e colaboradores (2006) relataram resultados negativos ao comparar métodos
diagnósticos tanto em porcos experimentalmente quanto naturalmente infectados por T.
gondii, e também produtos de suínos de varejo. Os autores citaram diferentes razões para
amostras negativas de DNA, incluindo tamanho limitado da amostra de tecido e distribuição
86
aleatória de cistos teciduais. Geuthner e colaboradores (2014) também relataram uma
prevalência muito baixa de DNA de T. gondii no tecido muscular de frangos infectados
experimentalmente (2,1%), sugerindo que este protozoário não persiste por longos períodos
nesta espécie.
Embora não seja possível certificar a viabilidade do parasito utilizando a técnica de
PCR, os resultados apontam para o fato de que o consumo deste tipo de carne pode ser um
risco para o consumidor, particularmente se a carne ou as vísceras não estiverem cozidas
apropriadamente (MILLAR et al., 2012; FERNADES et al., 2016).
O diagnóstico específico de infecções por T. gondii em galinhas é importante e
necessário para melhor compreensão da epidemiologia, assim como, dos mecanismos e da
dinâmica de transmissão entre as diversas espécies hospedeiras, especialmente em seres
humanos, e é particularmente importante para o planejamento de programas eficazes de
prevenção e controle (HAMIDINEJAT et al., 2014).
87
7. CONCLUSÕES
Considerando a técnica de RIFI, a frequência de anticorpos anti-Toxoplasma
gondii observada nas galinhas domésticas do presente estudo indicou
contaminação ambiental na região estudada;
Foi observada uma baixa concordância entre as técnicas de RIFI e HAI no presente
estudo;
Resultados inconclusivos sobre a presença de anticorpos anti-Toxoplasma gondii
nas galinhas diagnosticadas pela HAI, no presente estudo, demonstram a
importância da padronização dos kits comerciais para o uso em estudos
epidemiológicos com animais;
Os frangos do sistema extensivo apresentaram o maior percentual de aves
soropositivas, reafirmando o papel destas, como animais sentinelas e bons
indicadores da contaminação ambiental por oocistos;
A frequência de anticorpos observada nos frangos de corte do sistema intensivo
indica possíveis falhas no manejo sanitário desses animais;
Foi detectada a presença de DNA do parasito em amostras de cérebro de galinhas
do sistema intensivo e do sistema semi-intensivo, sugerindo que possa ocorrer a
88
presença do parasito em outros órgãos do hospeiro. Desta maneira, apontando para
a possibilidade destes animais serem fonte de infecção do Toxoplasma gondii para
os humanos e outros animais;
A fonte de água e o tipo de alimento neste estudo podem ser considerados fontes
de risco para a infecção por Toxoplasma gondii na região do Triângulo Mineiro.
89
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADL, S. M; SIMPSON, A. G. B.; LANE, C. E.; LUKES, J.; BASS. D.; BOWSER, S. S.;
BROWN, M. W.; BURKI, F.; DUNTHORN, M.; HAMPL, V.; HEISS, A.; HOPPENRATH,
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Acesso em 14/09/2016.
114
9. APÊNDICES
115
9.1. APÊNDICE A
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Título do Projeto: “Pesquisa sorológica de anticorpos anti-T. gondii em animais de
produção na região do Triângulo Mineiro, MG, Brasil.”. Pesquisador responsável: Patrícia Riddell Millar Goulart.
Instituição do Pesquisador Responsável: Universidade Federal Fluminense
Telefones para contato: (21) 26292425 / 26292432
N°. ________________
Matadouro/Frigorífico:__________________________________________________
N° Do Registro:_________________________________________________________
A toxoplasmose é uma doença causada pelo protozoário Toxoplasma gondii, e pode
infectar muitos animais, inclusive o homem. Este projeto tem por objetivo estimar a
ocorrência da infecção por Toxoplasma gondii em animais de produção (bovinos,
suínos, equinos, frangos) provenientes da região do triângulo mineiro, Minas Gerais,
visando esclarecer o papel dessas espécies como fontes de infecção para o homem por
meio de sua carne, contribuindo assim para o estudo da cadeia epidemiológica da
toxoplasmose na região. Serão coletados 8mL de sangue de cada animal, durante a
sangria, no momento do abate, para realização de testes sorológicos, que darão
resultados se o animal está ou não infectado por Toxoplasma gondii, e irão fazer parte
do banco de soros de animais, podendo esses serem utilizado para futuras pesquisas.
Portanto, eu, ______________________________________________________ fui
informado (a) que este estudo é para obter mais conhecimentos sobre a toxoplasmose
em animais destinados ao abate na região do triângulo mineiro, no Estado de Minas
Gerais e afirmo que li, entendi e concordo voluntariamente que os procedimentos
descritos acima sejam realizados nos animais destinados ao abate neste estabelecimento.
Profissional responsável:_______________________________ RG________________
Testemunha: ________________________________________ RG________________
Assinante:______________________________________________________________
Telefone:___________________________________________
Data: _______/__________/_________
116
9.2. APÊNDICE B
QUESTIONÁRIO EPIDEMIOLÓGICO
1. Atividades pecuárias da propriedade:
a. somente avicultura b. avicultura e outra (s)
Quais:_______________________________________________
2. Tipo de manejo empregado na propriedade:
a. semi-intensivo
b. intensivo
3. Presença de roedores na propriedade:
a. SIM b. NÃO
4. Presença de gatos na propriedade:
a. SIM b. NÃO
5. No caso “a” da pergunta anterior, especificar quantos gatos:
a. de 1 a 5 b. de 6 a 10
c. mais de 10 d. muitos (não sabe)
6. Métodos de controle de roedores:
a. Ativos (produtos químicos, armadilhas, destruição de tocas)
b. Passivos (uso de gatos e/ou depósito de ração a prova de roedores)
c. Combinação de ambos os métodos
7. Os gatos têm acesso às aves?
a) SIM b. NÃO
8. E aos alimentos e a água que são servidos aos animais?
a) SIM b. NÃO
9. Qual o tempo médio para remoção de carcaças de animais mortos?
a) Até 6 horas b. de 7 a 12 horas
c. de 13 a 24 horas d. muitos de 24 horas
10. Existem casos de Toxoplasmose em humanos na propriedade?
a. SIM b. NÃO
11. No caso de “a” da pergunta anterior especifique quantos:
a) UM b. DOIS
c. TRÊS d. MAIS DE TRÊS
12. Alguma pessoa da propriedade conhece ou já ouviu falar de alguém que
tenha Toxoplasmose na região?
a) SIM b. NÃO
117
9.3. APÊNDICE C
RESUMO APRESENTADO EM CONGRESSO
Foi apresentado um resumo com resultados parciais referentes a essa pesquisa em
evento científico, submetidos e expostos no 52º Congresso da Sociedade Brasileira de
Medicina Tropical, com a temática “Doenças urbanas e mundiais”, na cidade de
Maceió, no estado de Alagoas, Brasil, de 21 a 24 de agosto de 2016.
Soroprevalência de Toxoplasma gondii em galinhas (Gallus gallus domesticus)
criadas e abatidas na região do Triângulo Mineiro, Minas Gerais, Brasil. Karina C. C. Gonçalves1; Kênia de F. Carrijo2; Maria Regina R. Amendoeira3;
Gabriela C. Góes1; Pâmela F. Pereira3; Guilherme M. B. Nunes2; Igor F. Arruda3;
Daniela Leles4; Patrícia R. Millar 3,4
¹Programa de Pós Graduação em Microbiologia e Parasitologia Aplicadas, Universidade Federal
Fluminense (UFF), 24210-130 Niterói, RJ, Brasil.; 2 Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade
Federal de Uberlândia – UFU, CEP 38400-902, Uberlândia, MG, Brasil; 3Laboratório de Toxoplasmose
e outras Protozooses, Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ; 21040-360 Rio de Janeiro, RJ, Brasil
4Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Instituto Biomédico, Universidade Federal
Fluminense(UFF), 24210-130 Niterói, RJ, Brasil.
A infecção pelo Toxoplasma gondii constitui importante zoonose, difundida em todo o
mundo, sendo provavelmente o protozoário mais recorrente em humanos e animais. A
prevalência de T. gondii em aves de produção é de grande importância para saúde coletiva,
devido à carne e ovos desses animais serem apontados como possíveis fontes de infecção
para o homem, além de serem consideradas sentinelas da contaminação ambiental por
oocistos, pelo seu hábito de ciscar no solo. O objetivo deste estudo foi determinar a
prevalência de anticorpos anti-T. gondii em galinhas criadas e abatidas na região do
Triângulo Mineiro, MG, uma região produtora importante e com poucos estudos acerca
deste parasito em animais de abate. Amostras de soro de 105 galinhas, 63 criadas no sistema
intensivo, 20 no sistema semi-intensivo e 22 no sistema extensivo foram obtidas de
propriedades de Uberlândia e Araguari, MG, e submetidas ao teste de Hemaglutinação
Indireta, sendo a positividade considerada para títulos maiores ou iguais a 16. Aves, frangos
de corte, com idade entre 27 a 120 dias, cuja carne e/ou produtos cárneos eram destinados
para abastecimento do mercado interno e externo. Uma soroprevalência geral de 97,14% foi
encontrada e os títulos de anticorpos variaram de 16 a 64. Os resultados apontam para o fato
de que, a carne e os ovos desses animais podem estar atuando como fonte de transmissão
deste protozoário para o homem, bem como pode ser considerada como marcador de
possível contaminação ambiental da região estudada. A fim de confirmar a presença do
T.gondii no tecido desses animais, foram coletados também coração e cérebro das aves e,
dentre as positivas de maior titulação, 25 foram selecionadas aleatoriamente, sendo extraído
o DNA, depois se prosseguirá com o diagnóstico molecular pela PCR (reação em cadeia de
polimerase) e sequenciamento nucleotídico. Palavras-chave: Toxoplasma gondii; Galinhas; Soroprevalência.
118
10. ANEXO
119