Microarrays

Joana Guerreiro 40237

Patrícia Marques 40232

Vanda Paixão 41026

Prof. Luka Clarke

Biologia Molecular 2013/2014

Índice

•História

•Microarrays

•Como funciona

•Sondas

•Design Experimental

•Bioinformática

•Análise de dados

•Aplicações

História As ferramentas necessárias para estudar o RNA estão disponíveis há anos, como Northern

blots, RT-PCR , ESTs, e SAGE .

O primeiro microarray surgiu na década de 80 e evoluiu da técnica de Southern blotting e Northern blotting.

1995 Traçou-se o prefil de

expressao génica pela primera vez.

1997 Inseriu-se o genoma completo da Saccharomyces cerevisiae num microarray.

2004 Conseguiu inserir-se o

genoma humano inteiro num microarray.

Uma quantificação rápida e rentável do transcriptoma tornou-se possível devido ao desenvolvimento de microarrays de expressão génica.

Microarrays

• Modo como o transcriptoma é implantado nos diferentes tipos de tecidos e

células;

• Modo como a expressão génica muda ao longo dos diferentes estados de desenvolvimento e fenótipos de doenças;

• Como a expressão génica varia entre espécies e dentro de uma.

Os microarrays baseiam-se na capacidade de cadeias complementares de DNA se hibridarem uma em torno da outra numa solução com elevada especificidade.

Os resultados da expressão génica por microarrays forneceram informação bastante relevante:

Microarrays

Tipos de Microarrays

Microarrays de elevada densidade (GeneChip arrays) - Perfect Match - PM e MisMatch – MM - Sondas: oligonucleótidos 25pb (fotolitografia) - Usados para efeitos comerciais

Microarrays de baixa densidade (spotted DNA microarrays) -1.000 a 10.000 spots por cm2 - Estudo de parte do genoma - Sondas: cDNA, mRNA ou oligonucleótidos 50-80pb

Microarrays Suportes

Lâminas de plástico Chips Lâminas de vidro + resistente às elevadas temperaturas de hibridação + não-poroso + tem autofluorescência baixa + boa geometria + passivo na fabricação de arrays de elevada densidade - superfície planar tem uma capacidade de carga baixa - a ligação ao DNA não é eficiente quimicamente. Materiais porosos: Nitrocelulose, Nylon e Acrilamida + imobilização de maiores quantidades de alvos + maior área de superfície -> mais sensível

Como funciona um microarray?

mRNA Transcriptase reverso cDNA

Colocado na lâmina de microarray Hibridíza!

Análise com o scanner.

Gene muito activo.

Muita produção de mRNA

Maior fluorescência

Gene pouco activo.

Menor produção de

mRNA

Menor fluorescência

E se não se observa fluorescência?

Gene Inactivo

Sondas

Sondas

cDNA Oligonucleótidos

Pré-sintetizada In situ

Sonda de cDNA

Sondas

Sequências conhecidas de cDNA’s são depositados nos poços do microarray e

utilizadas como sondas .

Sintetizados antes de serem colocadas no microarray.

Sonda de Oligonucleótidos

Sondas

Há dois tipos

Longos

(60 bases)

Curtos

(25 bases)

Sequências de oligonucleótidos são

concebidas para representar um gene ou um transcripto

de interesse.

Longos

• Tão sensíveis e quase tão específicas como as sondas cDNA.

• Produzidos pela Agilent.

Curtos

• Menos sensíveis mas menos dispendiosos.

• Produzidos pela Affymetrix.

Sonda de Oligonucleótidos

Curtos

Sondas

O processo de manufactura da Affymetrix restringe o tamanho das sondas a 20-25 nucleótidos.

Para cada gene há 16 sondas com aproximadamente 25 nucleótidos.

As sondas complementares chamam-se ‘Perfect Match’ (PM) e são emparelhadas com sondas ‘MisMatch’ (MM).

O resultado obtido para um dado gene é a média entre os sinais PM e MM.

Vantagens e Desvantagens

cDNA Oligonucleótidos

Vantagens

Desvantagens

• Não é necessário conhecer previamente a sequência;

• Elevada especificidade;

• Isolamento e purificação prévia;

• As sequências mais longas podem ter hibridação cruzada com outros genes ;

• Não é necessário isolar nem purificar o DNA;

• Menos reactivos com as sequências das amostras a utilizar ;

• Necessário conhecer as sequências previamente;

• Menor especificidade;

• Demora mais tempo;

Desing Experimental Comparação entre duas amostras

Hipótese

Preparação do material genético da amostra

Escolha do Mircroarray

Marcadores

Purificação, hibridação e lavagem

RESULTADOS

Preparação do material genético da amostra

•Extração do mRNA

• Purificação

• Transcrição Reversa e ampliação por PCR (RT-PCR) cDNA

Escolha do Microarray

• Densidade de DNA

• Preço

• Número de replicados •Tipo de DNA que vai hibridizado

Marcadores

Marcação directa:

Ligação das sondas

durante a transcrição

reversa. Cy3 e Cy5 os

mais utilizados.

Marcação indirecta:

O mRNA é trancripto

reversamente na

presença de

aminoalil-dNTPS que

serão marcados com

NHS fluorescente.

Purificação, hibridação e Lavagem I

Purificação, hibridação e Lavagem II

HIBRIDIZAÇÃO

•Temperaturas elevadas (42ºC- 60ºC)

•Concentração salina e ph da solução – tampão adequado

•12h-20h

•Agentes desnaturantes

•Formamida (diminuitemperatura de anealing)

•PEG (aumenta a velocidade de anealing)

LAVAGEM

•Eliminação das moléculas de cDNA que não

hibridizaram (em condições de estringencia

Controlos

REFERÊNCIA Uma aliquiota de RNA de referência é hibridizada com cada array. A intensidade da amostra é medida relativamente à intensidade do RNA de referência.

DESIGN DE BLOCOS A amostra é hibridizada com marcadores diferentes de modo a eliminar interferências provocadas por cada marcador

Recursos bioinformáticos

Dificuldade na troca de data sobre microarrays

•Fabricantes •Protocolos •Métodos de análise

•Bases de dados: GeneNet, Ecocyc, aMAZE

•Gridding – atribuição de coordenadas aos spots

•Normalização

•Analises estatísticas

Bio

info

rmática

Analise de Dados

Segmentação do spot

Verifica-se se o pixel pertence à região do sinal ou ao background

Segmentação de círculo fixo Segmentação por variação de

intensidade

Spots de igual diâmetro e circulares.

Spots marcados

devido à intensidade.

Analise de Dados

Quantificação da intensidade

Correcção do background de modo a remover erros.

Determinada-se as intensidades do background e do foreground. O sinal do spot é determinado através da subtracção do sinal do background.

Analise de Dados

genes expressos nas células saudáveis

genes expressos nas células doentes

Amarelo: genes expressos nas duas

células.

Preto: genes não expressos nos casos

estudados.

Analise de Dados

Normalização

Os erros sistemáticos podem afectar a determinação dos níveis de expressão

génica.

Efectuam-se transformações dos dados para corrigir essas

fontes de erro.

Método Two-colors arrays :

Determinação da quantidade de genes do canal vermelho que estão sobre ou sub-expressos comparativamente ao canal verde.

Rjk ajustamento do background do sinal vermelho Gjk ajustamento do background do sinal verde Cjk factor de normalização

Aplicações

Transcritoma

O que é? Conjunto de todos os genes que estão a ser expressos,

num dado instante e numa dada célula. A sua caracterização passa por identificar RNAs e determinar as suas abundancias relativas. • Os genes mais expressos vão ter mais transcritos convertidos a

cDNA marcado ; • cDNA mais abundantes vão se ligar mais às sondas que aqueles de

genes menos expressos; • Os genes que são expressos ao mesmo nível terão quantidades

equivalentes de transcrito ligados às sondas.

Aplicações

Crucial sequenciar fragmentos (RT-PCR tem uma taxa de erro associada) • Caso particular: SNPs (Sondas são especificas) • SNPs: sequências de DNA que diferem apenas num nucleótido

entre pares de cromossomas ou diferentes espécies; • Baaj Y. et al, 2008: sondas em hairloop – maior especificidade Podem ser detectadas determinadas doenças, ainda antes dos primeiros sintomas pela detecção de um marcador genético ou de uma mutação.

Detecção de mutações e SNP’s

Polimorfismo de um nucleótido Conservados ao longo da evolução Podem ser usados como marcadores de genótipos

Bibliografia

http://bib.oxfordjournals.org/content/4/4/361.full.pdf

http://www.genome.gov/10000533

www.affymetrix.com

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15952881

http://discover.nci.nih.gov/microarrayAnalysis/Experimental.Design.jsp

http://linus.nci.nih.gov/techreport/BiotechniquesSimon.pdf

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/microarray/