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Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

Campus de Araraquara

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas

Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos

“Micelas poliméricas contendo pontos quânticos a base de óxido de

Zinco com superfície modificada para futura aplicação em

diagnóstico e vetorização de fármacos”

Aluna: Nathalia Cristina Rissi

Orientadora: Profa. Dra. Leila A. Chiavacci Favorin

Araraquara-SP

2016

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

Campus de Araraquara

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas

Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos

“Micelas poliméricas contendo pontos quânticos a base de óxido de

Zinco com superfície modificada para futura aplicação em

diagnóstico e vetorização de fármacos”

Aluna: Nathalia Cristina Rissi

Orientadora: Profa. Dra. Leila A. Chiavacci Favorin

Araraquara-SP

2016

Tese apresentada ao programa de Pós- Graduação em

Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e

Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade

Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como

parte dos requisitos para obtenção do título de

Doutora em Ciências Farmacêuticas.

Lista de Abreviaturas

Pontos quânticos (PQs)

Nanopartículas (NPs)

Oxido de tri-n-octylphosphine (TOPO)

Trinoctylphosphine (TOP)

Oxido de zinco (ZnO)

Doxorrubicina (Dox)

3-(Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane (GPTMS)

Hexadecyltrimethoxysilane (HTMS)

Hidróxido de lítio (LiOH)

Luminescência (PL)

Excitação (PLE)

Emissão (PL)

Espectroscopia de Infravermelho (IV)

Difração de raios-X (DRX)

Espectroscopia de fotoelétrons induzidos por raios-X (XPS)

Região ultravioleta visível (UV-Vis)

Rendimento quântico (QY)

Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)

MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)

Fluorescein isothiocyanate (FITC)

Lista de Figuras

Figura 1. Processo luminescente dos PQs e seus diferentes níveis de Eg de

acordo com o tamanho dos nanocristais. Adaptado (Ioannou e Griffin, 2010)

........................................................................................... 28

Figura 2. Estrutura cristalina do tipo wurtzita do ZnO sem defeitos (a), dois

dos principais defeitos encontrados: vacâncias de oxigênio Vo (b) e as

vacâncias de zinco Vzn (c). Adaptado de (Janotti e Van De Walle, 2009) .... 29

Figura 3. Esquema de sistema ternóstico a base de PQ, recoberto por uma

camada de polímero contendo fármaco e as funcionalizações através

anticorpos e ácido fólico. ............................................................ 38

Figura 4. Esquema de um sistema teranóstico formado por micela polimérica

contendo os PQs e fármaco lipofílico e também as funcionalizações através

de anticorpos e do ácido fólico na superfície do sistema. ...................... 39

CAPÍTULO I

Figura I.1. Modelo estrutural dos PQs a base de Zno modificado pelo GPTMS

e HTMS (a) e pelo AO/HTMS (b). .................................................... 51

Figura I.2. Espectros de IV do ZnO modificado pelo GPTMS (a, b, c) e pelo

HTMS e AO/HTMS. ..................................................................... 52

Figura I.3. Espectros de absorção no UV-vis da suspensão coloidal de ZnO no

comprimento de onda limite de 355 nm ........................................... 53

Figura I.4. Espectros de absorção no UV-vis do ZnO modificado pelo GPTMS

(a, b, c) e modificado pelo HTMS e AO/HTMS (e) no comprimento de onda

limite de 360 nm. ..................................................................... 54

Figura I.5. Avaliação de possíveis modificações relacionadas ao pico

excitônico do ZnO por um período de 15 dias através da espectroscopia de

absorção no UV-vis das amostras 0,1 M HTMS_0,05 M LiOH (a); and 0,1 M

HTMS/AO_0,05 M LiOH (b).em clorofórmio ....................................... 57



absorção no UV-vis das amostras 0,1 M GPTMS_0,2 M LiOH (a1); 0,1 M

GPTMS_0,1 M LiOH (b1) ),1 M GPTMS_0,05 M LiOH (c1) em água. ............. 58




LiOH_0,2 M LiOH (b2) 0,2 M GPTMS_ 0,1 M LiOH (c2) em água. ............... 59




GPTMS_0,3 M LiOH (b3) e 0,3 M GPTMS_0,15 M LiOH (c3) em água. .......... 60

Figura I.9. Micrografias das amostras 0,1 M GPTMS_0,05 M LiOH (a), 0,2 M

GPTMS_0,1 M LiOH (b) e 0,3 M GPTMS_0,15 M LiOH (c) e o tamanho médio

das amostras entre 3,5- 4 nm (a1), (b1), (c1), respectivamente .............. 62

Figura I.10..Micrografias das amostras 0,1 M HTMS _0,05 M LiOH (d) e 0,1 M

HTMS/AO _0,05 M LiOH (e) e o tamanho médio das amostras de 4,5 nm (d1) e

(e1), respectivamente. ............................................................... 63

Figura I.11..DRX das amostras 0,1 M GPTMS_0,05 M LiOH, 0,2 M GPTMS_0,1

M LiOH, 0,3 M GPTMS_0,15 M LiOH (a) e das amostras 0,1 M HTMS_0,05 M

LiOH, 0,1 M HTMS/AO_0,05 M LiOH (b). ........................................... 64

Figura I.12..XPS dos fotoelétrons Zn 2p (a); O 1 s (b); C 1s (c) do ZnO puro.

........................................................................................... 66

Figura I.13..XPS dos fotoelétrons Zn 2p (a1); O 1 s (b1); C 1s (c1), Si 2p (d1)

da amostra 0,1 M GPTMS_0,05 M LiOH ............................................. 67

Figura I.14. XPS dos fotoelétrons Zn 2p (a2); O 1 s (b2); C 1s (c2), Si 2p (d2)

da amostra 0,2 M GPTMS_0,1 M LiOH. ............................................. 68


da amostra 0,3 M GPTMS_0,15 M LiOH. ............................................ 69


da amostra 0,1 M HTMS/AO_0,05 M LiOH. ......................................... 70


da amostra 0,1 M HTMS_0,05 M LiOH............................................... 71

Figura I.18. Espectros de excitação (PLE) e de emissão (PL) do ZnO

modificado pelo GPTMS (a, b, c) e modificado pelo HTMS e AO/HTMS (e). .. 74

Figura I.19. Simulação da estrutura cristalina de ZnO-QDs contendo defeitos

de superfície e defeitos intrínsecos (a) e a redução desses defeitos através

da passivação de superfície pelos organo-silanos (b). .......................... 76

CAPÍTULO II

Figura II.1. Estrutura molecular do pluronic P123, F127 e F68................83

Figura II.2. Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível (UV-Vis)

das micelas poliméricas formadas pelo Pluronic F68 (a, b) e Pluronic F127 (c,

d). ....................................................................................... 92

Figura II.3. Estudo de estabilidade por período um de 30 dias, utilizando a

técnica de espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível (UV-Vis)


d). ....................................................................................... 93

Figura II.4. Espectros de excitação (PLE) e emissão (PL) das micelas

formadas pelo Pluronic F68 (a, b) e pelo Pluronic F127 (c, d). ................ 95

Figura II.5. Distribuição do tamanho das micelas poliméricas; (a) Micela

Pluronic F68 HTMS_AO; (b) Micela Pluronic F68 HTMS, (c) Micela Pluronic

F127 HTMS_AO e (d) Micela Pluronic F127 HTMS. ................................ 98

Figura II. 6. Ensaio de citotoxicidade em células HaCaT (a, c) e em células

HepG2 (b, e) Nos gráficos o eixo y corresponde a porcentagem de células

vivas após contato com as amostras e o eixo x representa a porcentagem (%)

de micelas poliméricas utilizadas no ensaio de mtt. Os dados referem-se à

média de três experimentos independentes (Média ± erro padrão)..........104

Figura II. 7. Esquema de um citômetro de fluxo................................105

Figura II.8. Histogramas em citometria de fluxo da micela F127 HTMS (a) e

da micela F127 HTMS/AO. Nos gráficos o eixo y corresponde ao número de

células analisadas em função da dispersão lateral de luz (“side scatter” ou

SS), já o eixo x representa a dispersão da lluz a partir da fonte de excitação

no mesmo eixo que o feixe, ou seja, “forward scatter” ou FS................107

Figura II.9. Esquema que mostra os dois tipos de PQs hidrofóbicos presente

em nosso estudo (a), a localização dos PQs no núcleo hidrofóbico da micela

polimérica (b), excitação das micelas em 350 nm e emissão em 550 nm,

região do verde (c) e a quantificação através da luminescência das células

em que houve a internalização das micelas contendo os PQs(d).............108

Lista de Tabelas

CAPITULO I

Tabela I. 1- Nome das amostras representadas pela modificação dos PQs a

base de ZnO com o GPTMS, a quantidade de suspensão coloidal utilizada e a

razão de hidrólise entre o LiOH e o GPTMS................................... 44

Tabela I. 2 - Concentrações atômicas em porcentagem dos fotoelétrons Zn

2p, O 1s, C1s e Si 2p.............................................................. 69

Tabela I.3 - Valores de QY das amostras selecionadas...................... 76

CAPÍTULO II

Tabela II. 1 - Quantidades utilizadas de Pluronic P123/ Pluronic F127 e de

água.................................................................................. 83

Tabela II. 2– Identificação das amostras e do tipo de copolímero utilizado,

assim como o PQ hidrofóbico utilizado e a quantidade de cada

um.................................................................................... 83

Tabela II.3 - Valores de QY das amostras selecionadas..................... 90

Tabela II. 4 – Tamanho, índice de polidispersidade (pdi) e potencial zeta das

amostras selecionadas............................................................ 93

Tabela II. 5 – Estabilidade da amostra F68 HTMS/AO (3) .................. 94

Tabela II. 5 – Estabilidade da amostra F68 HTMS (3) ....................... 94

Tabela II. 5 – Estabilidade da amostra F127HTMS/AO (3) .................. 95

Tabela II. 5 – Estabilidade da amostra F127HTMS (3) ....................... 95

Resumo

Com os avanços obtidos nos últimos anos, é possível observar um interesse crescente no

desenvolvimento de sistemas multifuncionais direcionados ao diagnóstico e tratamento do câncer.

Estes sistemas também conhecidos como “teranósticos” têm se mostrado interessantes, pois

ampliam a capacidade de liberação sustentada de fármacos anticancerígenos em células

específicas, além de proporcionar um monitoramento ótico através da luminescência de pontos

quânticos (PQs). Diante deste contexto, o presente estudo teve como objetivo estabilizar as

nanopartículas (NPs) de ZnO em meio aquoso e orgânico. Com isso, a superfície dos PQs foi

modificada com o 3-(Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane (GPTMS) (i) e Hexadecyltrimethoxysilane

(HTMS) (ii). A ligação entre as NPs e as moléculas dos modificadores ocorreu através da reação de

hidrolise e condensação, utilizando como catalisador básico o hidróxido de lítio (LiOH). Esta reação

conduziu a formação de uma camada de siloxano ao redor das NPs,a qual se formou devido a forte

afinidade que os organo-silanos possuem com a superfície hidroxilada do ZnO, resultando nas

ligações covalentes do tipo ZnO-Si-O. Ainda com o objetivo de aumentar a estabilidade do ZnO e

consequentemente suas propriedades luminescentes foi sintetizado uma bicamada de Ácido Oleico

(AO) e HTMS (iii). As modificações na superfície do ZnO foram confirmadas pelas técnicas de

espectroscopia de Infravermelho (IV) e também pelo estudo da composição química e da

concentração atômica dos fotoelétrons presentes nas camadas superficiais dos PQs, através da

espectroscopia de fotoelétrons induzidos por raios-X (XPS). O comportamento ótico dos PQs foi feita

através da espectroscopia de absorção na região do UV-Vis. Com está técnica identificamos o

comprimento de onda limite associado ao pico excitônico do ZnO e como valor do comprimento de

onda limite (λ) foi possível calcular o tamanho médio das NPs e que foi de aproximadamente 3 nm.

Ainda através desta técnica realizamos um estudo de estabilidade avaliando possíveis modificações

associada ao pico excitônico do ZnO. O tamanho final das NPs foi analisado através da microscopia

de transmissão eletrônica (MET), apresentando um tamanho médio entre 3,5- 4nm para as amostras

modificadas pelo GPTMS e de 4,5 nm para as amostras modificadas pelo HTMS e pela bicamada de

AO/HTMS. Já os difratogramas mostraram a presença de uma estrutura cristalina do tipo wurtzite e

de modo geral, picos alargados e pouco definidos, característica já descrita na literatura para a

presença de pequenos cristalitos de ZnO . De acordo com a técnica de luminescência obtivemos

informações a respeito dos níveis de energia em que os elétrons se encontravam dentro do band

gap, como por exemplo, a intensidade luminescente, assim como as cores emitidas pelos PQs. Os

resultados mostraram a importância das modificações em relação à luminescência, sendo possível

visualizar um aumento na emissão luminescente na região do verde devido à preservação das

vacâncias de oxigênio e também pela diminuição dos defeitos de superfície. A incorporação dos PQs

hidrofóbicos nas micelas poliméricas foi realizada com sucesso. Este fato pode ser observado

através dos espectros de absorção no UV-vis e também pelos espectros de excitação (PLE) e de

emissão (PL). Já com a técnica de DLS avaliamos parâmetros relacionados ao tamanho, distribuição

e pdi das micelas e que foram qualificadas com o estudo de estabilidade. A avaliação do potencial

citotóxico das micelas, apresentou uma boa viabilidade celular para as linhagens de HaCat e HepG2

principalmente, para as micelas formadas pelo Pluronic F68. Já a quantificação das células em que

houve a internalização foi feita através da citometria de fluxo. Os resultados mostraram a

capacidade desta técnica em detectar o número de células fluorescentes. Apesar da baixa

porcentagem de internalização celular, os resultados representam de certa forma um potencial a

ser explorado em relação ao sistema, incluindo modificações na síntese dos PQs tornando-os mais

luminescentes, característica que diminui o limite de detecção e também a fixação de moléculas

sinalizadoras ao redor das micelas, facilitando assim sua internalização em células especificas de

determinados tipos de câncer.

Abstract

With the advances obtained in recent years, it is possible to observe a growing interest in the

development of multifunctional systems used, that can be used in the diagnosis and treatment of

cancer These systems also known as " theranostic " and have gained considerable attention due to

their capacity of release anticancer drugs into specific cells, besides to optical monitoring through

quantum dots (QDs). In this context, the present study was aimed to stabilize the nanoparticles

(NPs) of ZnO in water and organic medium. Thereby, QDs surface was modified with 3-

(Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane (GPTMS) (i) and Hexadecyltrimethoxysilane (HTMS) (ii). The

binding between the NPs with the modifiers occurred by hydrolysis and condensation reaction under

basic catalysis (LiOH) thus leading to the formation of siloxane layer. This effect occurred due to

strong connection between the silanes with hydroxylated surface of ZnO that resulting in ZnO-Si-O

covalent bond. In order to improve the stability of ZnO-QDs and consequently their

photoluminescence properties, was synthesized a coating bilayer by OA and HTMS (iii). The surface

modification was confirmed by FT IR and also by XPS technique. The optical behavior was performed

by absorption spectroscopy in the UV-Vis region. With this technique was possible to identify the

limit wavelength associated with excitonic peak of ZnO, and through the value of wavelength limit

(λ) was calculated the average size of NPs (≈ 3 nm). In addition, using absorption spectroscopy in

UV-vis, it was analyzed possible changes related to excitonic peak. The finale size of the NPs was

analyzed by transmission electron microscopy (TEM) that showed an average size about 3,5- 4nm for

the samples modified by GPTMS, and 4,5 nm by HTMS and AO/HTMS bilayer. The XRD patterns

indicate the presence of a wurtzite crystal structure. In general, the peaks in diffractograms are

poorly defined which indicates the presence of small crystallites, characteristic already described in

literature for ZnO NPs. According to photoluminescence results, it was possible to obtain relevant

information regarding the energy levels of electrons within in the band gap, such as

photoluminescence intensity and color emitted. The results of capped ZnO-QDs by organo-silanes

showed an increase of photoluminescence intensity in green region due to vacancies preservation,

such as the decrease of surface defects. The encapsulation of hydrophobic QDs into polymeric

micelles was successful. This fact can be observed by absorption spectroscopy in UV-vis and by

photoluminescence measurements. DLS was carried out to measure the hydrodynamic size

distribution and polydispersity index (pdi) of ZnO-QDs capped encapsulated. The cytotoxicity of the

micelles showed a great cellular viability for the HaCat and HepG2 cells, mainly for the micelles

formed by Pluronic F68. The cellular internalization was performed by flow cytometry. The results

demonstrated the ability of this technique to detect the number of fluorescent cells. Despite the

low percentage of cells internalized, these results representing a potential to be explored, such as

the synthesis of QDs making them more luminescent, feature that improve the detection and also by

fixing of targeting molecules around the micelles, thus facilitating their internalization in specific

cancer cells

Keywords

Quantum dots (QDs), ZnO; Photoluminescence; Organosilanes; Oleic Acid and Surface modification.

Sumário

INTRODUÇÃO...................................................................... 22

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................ 26

Pontos Quânticos ................................................................. 26

Pontos quânticos a base de ZnO ............................................... 27

Modificações na superfcie dos PQs............................................. 31

Passivação do tipo inorgânica “Core Shell”................................... 31

Passivação do tipo orgânica..................................................... 31

Micelas Poliméricas............................................................... 31

Sistemas Teranósticos ........................................................... 31

OBJETIVO.......................................................................... 39

CAPÍTULO I

I)1 MATERIAL e MÉTODOS...................................................... 41

I)1.1 Métodos...................................................................... 42

I)1.1.1 Precursor oxiacetato de zinco.......................................... 42

I)1.1.2 Suspensão coloidal de ZnO............................................. 42

I)1.1.3 Modificações da superfície dos PQs de ZnO através do 3-

(Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane (GPTMS) e do

Hexadecyltrimethoxysilane (HTMS)............................................. 42

I) 1.1.4 Modificações da superfície dos PQs de ZnO através do Ácido Oleico

(AO) seguido pelo Hexadecyltrimethoxysilane

(HTMS)............................................................................... 42

I)1.3 Caracterização físico-química do pó de ZnO puro e do pó de ZnO

modificado pelo GPTMS, HTMS e AO/HTMS ................................... 45

I)1.3.1 Luminescência (PL)....................................................... 45

I)1.3.2 Espectroscopia de Infravermelho (IV)................................. 45

I)1.3.4 Difração de raios-X (DRX)................................................ 45

I)1.3.5 Espectroscopia de fotoelétrons induzidos por raios-X

(XPS)................................................................................. 45

I)1.4 Caracterização físico-química do ZnO em suspensão coloidal, do ZnO

modificado pelo GPTMS em água e do ZnO modificado pelo HTMS e

AO/HTMS em clorofórmio)....................................................... 46

I)1.4.1 Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível

(UV-Vis) ............................................................................. 46

I)1.4.2 Estudo de estabilidade do ZnO modificado pelo GPTMS em água e

do ZnO modificado pelo HTMS e AO/HTMS em

clorofórmio......................................................................... 46

I)1.4.3 Rendimento quântico (quantum yield)................................ 46

I)1.4.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)........................ 46

I)2 RESULTADOS e DISCUSSÕES................................................ 47

I)2.1 Suspensão coloidal e modificações na superfície do

ZnO................................................................................... 47

I)2.2.Espectroscopia vibracional na região do Infravermelho

(IV)................................................................................... 49

I)2.3 Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível

(UV-Vis).............................................................................. 49

I)2.4 Estudo de estabilidade do ZnO modificado pelo GPTMS em água e do

ZnO modificado pelo HTMS e AO/HTMS em

clorofórmio......................................................................... 53

I)2.5 Microscopia de Transmissão Eletrônica (MET).......................... 58

I)2.6 Difração de raios-X (DRX).................................................. 60

I) 2.7 Espectroscopia de fotoelétrons induzidos por raios-X

(XPS)................................................................................. 62

I)2.8 Luminescência (PL).......................................................... 70

I)2.9 Rendimento quântico (quantum yield QY).............................. 74

I)3 CONCLUSÕES................................................................... 76

CAPÍTULO II

II) 1 MATERIAL e MÉTODOS .................................................... 79

II)1.1 Métodos..................................................................... 80

II)1.1.1 Obtenção das micelas poliméricas.................................... 80

II)1.2 Caracterização físico-química das Micelas Poliméricas contendo

os PQs hidrofóbicos................................................................ 80

II)1.2.1 Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível (UV-

Vis)................................................................................... 80

II)1.2.2 Estudo de estabilidade dos PQs hidrofóbicos incorporados nas

micelas poliméricas .............................................................. 81

II)1.2.3 Luminescência (PL)..................................................... 81

II)1.2.4 Rendimento quântico (quantum yield QY)......................... 81

II)1.2.5 Espalhamento dinâmico de luz (DLS) ............................... 81

II)1.2.6 Avaliação do potencial citotóxico das micelas poliméricas

contendo os PQs hidrofóbicos ................................................... 85

II) 1.2.7 Estudo da internalização celular das micelas poliméricas através

da citometria de fluxo............................................................. 86

I)2 RESULTADOS e DISCUSSÕES............................................... 82

II)2.1 Obtenção das micela poliméricas...................................... 82

II)2.1.1 Incorporação dos PQs hidrofóbicos nas micelas

polimérica........................................................................... 83

II)2.1.2 Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível (UV-

Vis)................................................................................... 85

II)2.1.3 Estudo de Estabilidade das micelas poliméricas contendo os PQs

através da técnica UV-vis........................................................ 86

II)2.1.4 Luminescência (PL)..................................................... 88

II)2.1.5 Rendimento quântico (quantum yield QY) ......................... 89

II)2.1.6 Espalhamento de luz dinâmico (DLS)................................. 90

II)1.2.6 Avaliação do potencial citotóxico das micelas poliméricas contendo

os PQs hidrofóbicos .............................................................. 102

1 II) 1.2.7 Estudo da internalização celular das micelas poliméricas através

da citometria de fluxo............................................................ 105

II)3 CONCLUSÕES.................................................................. 109

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................ 112

INTRODUÇÃO

Introdução ________________________________________________________________________________________22

Nathalia Cristina Rissi _____________________________________________________________________

INTRODUÇÃO

Com os avanços obtidos nos últimos anos, principalmente no campo

da nanotecnologia é possível observar um interesse crescente no

desenvolvimento de sistemas multifuncionais direcionados ao diagnóstico e

tratamento do câncer. Estes sistemas também conhecidos como

“teranósticos” têm se mostrado interessantes, pois ampliam a capacidade de

liberação sustentada de fármacos anticancerígenos em células específicas,

além de proporcionar um monitoramento ótico através da luminescência de

pontos quânticos (PQs) (Frasco e Chaniotakis, 2010; Wang et al., 2010; Zhao

et al., 2013; Zhang et al., 2014).

Os PQs são nanopartículas (NPs) com diâmetro entre 2-10 nm

formados a partir de cristais semicondutores e que possuem propriedades

luminescentes (Wang, Gao e Su, 2010). De acordo com o tamanho, os PQs

podem emitir radiação em baixos comprimentos de onda na região do azul

para NPs de tamanhos menores e também em altos comprimentos de onda na

região do vermelho para tamanhos maiores (Ghasemi, Peymani e Afifi, 2009).

O óxido de zinco (ZnO) é um exemplo de PQ bastante utilizado na

área química e biológica devido suas propriedades luminescentes e sua baixa

toxicidade (Wang, Gao e Su, 2010). O ZnO é um óxido semicondutor

biodegradável e um material luminescente não tão caro como os PQs

tradicionalmente utilizados a base de Cádmio (Cd) (Fu et al., 2007). Além

disso, como citado anteriormente o ZnO possui uma toxicidade menor em

comparação aos PQs habituais (Xiao et al., 2011) e uma maior

biocompatibilidade (Ding et al., 2011). No entanto, esses PQs são geralmente

instáveis em água e tendem a se agregarem, apresentando uma baixa

luminescência (Li et al., 2015). Por este motivo, algumas estratégias vêm

sendo estudados com o objetivo de modificar sua superfície para assim,

aumentar sua estabilidade em ambientes aquosos (Gulia e Kakkar, 2013). Os

estudos realizados por Moussodia et al. (2008) e Moussodia et al. (2010),

Introdução ________________________________________________________________________________________23


mostraram resultados positivos em relação ao ZnO modificado por

organosilanos. A partir dos resultados foi possivel observar especilamente,

através da internalização ceular em Staphylococcus aureus, o potencial

desses PQs em atuarem com sondas biologicas. De acordo com os autores, a

estabilidade em água, uma boa luminescencia e uma baixa citotoxicidade

favorecem o uso destes PQs em várias aplicações biomédicas.

Durante o processo de síntese dos PQs, a obtenção de partículas

muito pequenas favorece a formação de certos defeitos de superfície. Isto

ocorre porque alguns átomos presentes na superfície não possuem seus

orbitais totalmente preenchidos, formando as chamadas “dangling bons” ou

ligações soltas (Wang, Zhang e Zhang, 2014). Uma forma de reduzir estes

defeitos é através da passivação de superfície. A passivação de superfície é

um tipo de modificação realizada com o intuito de formar ligações entre os

átomos presentes na superfície dos PQs com outro material (Bera et al.,

2010).

Existem formas inorgânicas e orgânicas de se passivar a superfície

de um PQ, sendo as passivações do tipo inorgânica como, por exemplo, a

formação de core shell as mais utilizadas. Esse tipo de passivação é feita

através de um semicondutor (“core”) coberto por uma camada (“shell”) de

um semicondutor distinto, aumentando assim sua luminescência (Dabbousi et

al., 1997). Já as passivações do tipo orgânica são feitas geralmente com os

modificadores como, por exemplo, o óxido de trinoctylphosphine (TOPO), o

qual é muito utilizado na síntese de diversos PQs devido seu alto ponto de

ebulição. Usualmente, o TOPO é utilizado em combinação com outros

tensoativos ou co-solventes, tais como trinoctylphosphine (TOP),

hexadecilamina, ou o esteárico ácido, concedendo aos PQs uma

característica hidrofóbica. (Qu, Peng e Peng, 2001; Talapin et al., 2001).

Porém, existem algumas desvantagens no uso do TOPO e estão relacionadas

principalmente, com a sua toxicidade. Por este motivo, o ácido oleico (AO)

por ser menos tóxico e também mais barato vem sendo bastante explorado

Introdução ________________________________________________________________________________________24


como modificador na síntese de alguns PQs no lugar do tradicional

(Kumari et al., 2008).

Nos últimos anos, os organosilanes vêm ganhando destaque por

serem ótimos candidatos à passivação e estabilização do ZnO, pois suas

moléculas se ligam de forma covalente a superfície hidroxilada das NPs,

criando uma barreira de proteção do núcleo com a água (Jana, Earhart e

Ying, 2007; Jana et al., 2007; Wu et al., 2007; Aboulaich et al., 2012).

Outros relatos na literatura também descrevem modificações na

superfície utilizando como, por exemplo, o ácido glicólico, revestimento com

sílica, além da incorporação dos PQs em lipossomas e em micelas poliméricas

(Weissleder et al., 2005; Hezinger, Teßmar e Göpferich, 2008; Law et al.,

2008; Liu et al., 2011; Liu et al., 2012). Estudos têm demostrado que a

estabilidade dos PQs hidrofóbicos pode ser aumentada através da

encapsulação em polímeros anfifílicos. Este método permite que os PQs

sejam dispersos em meios aquosos, mantendo-os estáveis durante longos

períodos devido à proteção dos mesmos no interior da camada hidrofóbica

(Dubertret et al., 2002; Wu et al., 2003; Gao et al., 2004; Smith et al.,

2008).

A finalidade do uso de micelas formadas por copolímeros em bloco

na medicina é minimizar problemas relacionados com a solubilidade de

fármacos hidrofóbicos, toxicidade e farmacocinética inadequada. Os avanços

mais significativos foram feitos com a incorporação de agentes

anticancerígenos (Matsumura et al., 2004; Hamaguchi et al., 2005). Outra

estratégia para aumentar a seletividade de um vetor pelo seu alvo consiste

em fixar moléculas sinalizadoras às micelas poliméricas, mostrando-se

também eficazes no aumento da atividade anticancerígena (Sudimack e Lee,

2000; Bae et al., 2005; Mi, Liu e Feng, 2011). A capacidade em que as

micelas chegam ao tumor também favorece o uso de PQs hidrofóbicos como

marcadores biológicos em células tumorais, proporcionando a detecção das

Introdução ________________________________________________________________________________________25


mesmas de forma mais eficaz, contribuindo assim para o diagnóstico de

diversos tipos de tumores (Ding et al., 2011; Kumar et al., 2012; Liu et al.,

2012).

REVISÃO

BIBLIOGRÁFICA

Revisão Bibliográfica ___________________________________________________________________ 27

Nathalia Cristina Rissi

_________________________________________________________________

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Pontos Quânticos

Os PQs são NPs formadas a partir de cristais semicondutores

nanométricos que apresentam propriedades luminescentes (Ghasemi,

Peymani e Afifi, 2009). Os semicondutores dos grupos II - VI são os mais

utilizados, pois neste grupo é possível alterar propriedades de absorção em

função de alterações relacionada ao tamanho dos mesmos (Rossetti et al.,

2005; Prezhdo, 2009; Akimov, Neukirch e Prezhdo, 2013; Proshchenko e

Dahnovsky, 2015).

O processo luminescente dos PQs acontece pelo fato deles

possuírem uma banda de valência preenchida por elétrons e uma banda de

condução vazia separada por uma lacuna de energia denominada band gap.

De modo geral, as propriedades óticas dos PQs estão diretamente ligadas ao

confinamento quântico desses elétrons na banda de valência e da sua

transição para a banda de condução. A energia (Eg) necessária para que

ocorra a transição de uma banda para a outra está relacionada com o

tamanho das nanopartículas e consequentemente com as cores emitidas

(Samir et al., 2012). Por este motivo, o tamanho da partícula constitui um

dos aspectos mais estudados, uma vez que esse controle permite alterações

nas propriedades químicas e eletrônicas desses materiais (Trindade et al.,

2001). A Figura 1 mostra os diferentes níveis de Eg dos PQs em relação ao

tamanho dos nanocristais.



_________________________________________________________________

Figura 1 Processo luminescente dos PQs e seus diferentes níveis de Eg de

acordo com o tamanho dos nanocristais. Adaptado (Ioannou e Griffin, 2010).

Pontos quânticos a base de ZnO

Durante o processo de síntese o ZnO pode se cristalizar em três

formas alotrópicas distintas, o Sal gema, a Esfarelita e a Wurtzita. Porém, a

estrutura mais estável é a do tipo wurtzita, na qual o oxigênio e o zinco

exibem geometria tetraédrica de ZnO4 orientados em uma só direção, com

camadas ocupadas por átomos de zinco que se alteram com camadas



_________________________________________________________________

ocupadas por átomos de oxigênio (Özgür et al., 2005). Diferente do ZnO em

tamanhos maiores, o ZnO nanoparticulado possui propriedades luminescentes

devido a presença de certos tipos de defeitos encontrados em sua rede

cristalina. Estes defeitos ocorrem durante o processo de síntese e interferem

diretamente na fluorescência emitida, criando níveis intermediários de

energia dentro da banda proibida. Exemplos dos principais defeitos

encontrados nas nanoparticulas de ZnO são: o oxigênio intersticial e o zinco

intersticial e os dois principais: as vacâncias de oxigênio (Vo) e as vacâncias

de zinco (Vzn), conforme mostra a Figura 2.

A emissão na região do visível pelo ZnO são influenciadas por

vários parâmetros relacionados aos defeitos, ou seja, métodos diferentes de

síntese podem resultar em nanopartículas do mesmo tamanho, porém com

emissões em diferentes regiões. Este efeito foi estudado por alguns autores e

revela a importância do método empregado em relação ao tipo de defeito

formado na rede cristalina (Sahai e Goswami, 2014).



_________________________________________________________________

Figura 2 Estrutura cristalina do tipo wurtzita do ZnO sem defeitos (a), dois

dos principais defeitos encontrados: vacâncias de oxigênio Vo (b) e as

vacâncias de zinco Vzn (c). Adaptado de (Janotti e Van De Walle, 2009).

A utilização do processo “sol-gel” na preparação das NPs de ZnO

com efeito de confinamento quântico foi descrito de forma pioneira por

(Spanhel e Anderson, 1991). O termo sol é utilizado para definir a dispersão

de partículas coloidais (tamanho entre 1 e 1000nm) estabilizada por um

fluido, enquanto que o termo gel pode ser reconhecida como um sistema

formado pela estrutura rígida de partículas coloidais (gel coloidal) que

imobiliza a fase líquida nos interstícios De modo geral esta metodologia é

baseada na hidrólise e condensação de precursores (Brinker e Scherer, 1990;

2013). Segundo (Spanhel e Anderson, 1991) a obtenção dessas nanopartículas

por este método consiste em três etapas básicas: (1) preparação do

precursor; (2) hidrólise deste precursor para a formação da suspensão

coloidal e da (3) concentração da suspensão coloidal para formar o sol final.



_________________________________________________________________

Através dessas etapas foi possível observar por microscopia eletrônica de

transmissão, a presença de nanopartículas de ZnO de aproximadamente 3,5

nm e que após 5 dias dobraram de tamanho. Segundo os autores esse

crescimento foi favorecido pela concentração da suspensão originando

diversos cristais, os quais alteram a banda de emissão do material.

Como citado anteriormente, o processo de síntese empregado para

a obtenção desses PQs é de grande importância. Por este motivo, é

considerável destacar alguns trabalhos relacionados com a síntese dos

materiais a base de zinco. Como o caso do estudo realizado por (Tokumoto

et al., 1999), que avaliou o estudo cinético da formação das nanoparticulas

de ZnO a partir de um precursor oxi-acetato de zinco, mostrando que as

suspensões coloidais obtidas eram compostas por nanopartículas esféricas

com distribuição de tamanho em torno de 2nm, que aumentavam com o do

tempo de reação.

A obtenção de NPs de ZnO também foram obtidas através da

hidrólise e condensação do precursor de oxi-acetato de zinco pela adição da

base KOH. A formação e crescimento do ZnO ocorre em diferentes etapas: no

inicio o precursor é consumido originando a fase de óxido; em seguida ocorre

o estabelecimento de um regime de equilíbrio entre as partículas nucleadas

que crescem por coalescência ; na etapa final as partículas pequenas se

dissolvem e precipitam sobre as nanoparticulas maiores (Caetano et al.,

2011).

Com o intuito de aumentar a luminescência dos PQs a base de ZnO

foi realizado através do processo sol-gel a dopagem dos mesmos com os íons

de Mg 2+. Esses íons influenciaram fortemente no crescimento e no tamanho

final desses PQs. Além disso, a dopagem segundo os autores aumentaram o

band gap das NPs e consequentemente a sua luminescência na região do

visível, que foi maior em até seis vezes quando comparada a suspensão

coloidal de ZnO (Manaia et al., 2015).



_________________________________________________________________

Modificações na superfcie dos PQs

Passivação do tipo inorgânica “Core Shell”

De acordo com Vasudevan et. al., (2015), os PQs do tipo “core

shell” foram desenvolvidos para melhorar a eficiência luminescente de PQs

individuais. O uso de semicondutores distintos em relação ao núcleo favorece

o preenchimento de vazios presentes na estrutura dos PQs, proporcionando

assim uma melhoria no rendimento luminescente do material final (Reiss,

Protiere e Li, 2009). Existem dois tipos de core shell, o tipo I, o qual

apresenta um núcleo com uma energia menor que a energia do shell, como

por exemplo, o CdSe/ CdS, CdSe/ ZnS e InAs/ CdSe (core/shell) (Reiss,

Protiere e Li, 2009). E o tipo II, o qual apresenta um núcleo com uma energia

igual ou superior que a energia do shell, como por exemplo, o ZnTe/ CdSe,

CdTe/CdSe, CdS/ZnSe (core/shell) (Kim et al., 2003).

Estudos recentes revelam a importância do uso de core shell em

diversas aplicações biológicas, como o caso do estudo realizado por He et

al., (2016). Neste estudo os PQs formados pelos semicondutores

CdSeTe/CdS/C, mostraram uma baixa toxicidade e boa biocompatibilidade

devido à formação da camada final de carbono. Os testes foram realizados

através da internalização em células do tipo carcinoma cervical, indicando

excelentes propriedades óticas na região do infravermelho próximo e

também a viabilidade celular deste core shell.

O uso de PQs do tipo core shell na determinação da vitamina B6

também foi alvo do estudo realizado por (Koneswaran e Narayanaswamy,

2015), que teve como base a obtenção de um método simples e sensível para

determinação desta vitamina através da fluorescência da camada de L-

cisteina em torno dos PQs do tipo CdS/ZnS. O mecanismo utilizado foi



_________________________________________________________________

baseado na extinção da fluorescência dos PQs em relação à concentração de

vitamina B6.

O tipo de método empregado na obtenção dos core shell é de

grande importância, sendo tema do estudo realizado por (Chen, J. et al.,

2015), que apresentaram um método de síntese simples e econômico. A

técnica desenvolvida consistia na obtenção do core-shell do tipo CdTe/CdS

através de diferentes tempos de reação utilizando o método de micro-ondas,

o qual apresentou resultados positivos em relação a uniformidade de

tamanho, assim como uma elevada intensidade fluorescente. E através dos

ensaios biológicos foi possível observar uma baixa toxidade e boa

biocompatibilidade, facilitando o uso deste core shell como sonda biológica.

Já no estudo realizado por Aldeek et al., (2011), os PQs a base de

CdSe foram recobertos por uma camada de ZnO e utilizados com sucesso na

imagem do biofilme bacteriano (Shewanella oneidensis). Segundo os autores

o revestimento com o ZnO mostrou-se mais luminescente quando comparado

com o CdSe sozinho, apresentando um rendimento quântico de 24%. Os PQs

do tipo de CdTe/CdS também foram revestidos com o ZnO e apresentaram

em solução aquosa uma maior estabilidade, maior luminescência e uma

menor toxicidade. Este efeito ocorreu pela passivação da superfície através

da camada de ZnO, apresentando futuramente um grande potencial na

internalização celular.

Passivação do tipo orgânica

As passivações do tipo orgânica também vêm ganhando destaque,

através da utilização de ligantes capazes de diminuir os defeitos de

superfície. Segundo Carrillo-Carrión et al., (2009), o uso de ligantes

formados por grandes cadeias orgânicas tende a diminuir a luminescência,

porém aumentam os níveis de fotoestabilidade dos PQs em comparação com

ligantes formados por cadeias menores.



_________________________________________________________________

Como dito anteriormente as passivações do tipo orgânica são feitas

geralmente com o TOPO é utilizado em combinação com outros tensoativos

ou co-solventes, tais como o TOP, hexadecilamina, ou o esteárico ácido,

concedendo aos PQs uma característica hidrofóbica. (Qu, Peng e Peng, 2001;

Talapin et al., 2001). Segundo Hammer, Emrick e Barnes, (2007) as

características hidrofóbicas dos passivadores torna possível à dispersão dos

PQs hidrofóbicos em solventes orgânicos, podendo assim ser encapsulados

em micelas poliméricas, lipossomas entre outros sistemas. Este método

permite que os PQs hidrofóbicos sejam dispersos em meios aquosos,

mantendo-os estáveis durante longos períodos devido à proteção dos mesmos

no interior da camada hidrofóbica (Dubertret et al., 2002; Wu et al., 2003;

Gao et al., 2004; Smith et al., 2008).

O Ácido Oleico (AO) também vem sendo muito utilizado como

passivador na síntese de PQs no lugar do tradicional TOPO, devido sua baixa

toxicidade e também por ser mais barato e seguro. Um estudo realizado por

Kumari et al.,(2008), comparou o uso do TOPO e do AO na passivação de PQs

a base de CdSe, apresentando resultados satisfatórios para o AO em relação

a estabilidade estérica e fotoestabilidade desses PQs.

As passivações do tipo orgânica além de aumentar o rendimento

luminescente dos PQs também possuem o propósito de estabilizar as NPs em

água. Com isso, Li et al., (2015), utilizaram como passivador de superfície do

ZnO, o hidrofóbico hexadecyltrimethoxysilane (HTMS) juntamente com o

hidrofílico aminopropiltrietoxisilano (APS), formando assim uma bicamada

em torno das NPs. Segundo os autores a utilização de um passivador

hidrofóbico ao redor do núcleo e funcionalizado com outro de caráter

hidrofílico, permitiu que as NPs fossem estabilizadas em água e com uma

intensidade luminescente melhorada cerca de 10 vezes em relação ao ZnO

puro.



_________________________________________________________________

Um estudo realizado por Moghaddam et al., (2015), também

utilizou como passivador de superfície do ZnO um organosilano, no caso o

aminopropyltriethoxysilane (APTES). Os resultados mostram a capacidade

desse passivador na estabilização das NPs em água, além do aumento no

rendimento luminescente. A passivação além de diminuir os defeitos de

superfície através do revestimento, também preservou as vacâncias de

oxigênio presentes na estrutura do ZnO. Esse efeito ocorreu devido o meio

alcalino utilizado para a reação de hidrolise e condensação entre os

grupamentos do APTES com o ZnO, podendo ter gerado novos ânions de

oxigênio, os quais preencheram as vacâncias de oxigênio.

Os estudos realizados por Moussodia et al. (2008) e Moussodia et

al. (2010), mostraram resultados positivos em relação ao ZnO modificado por

organosilanos. A partir dos resultados foi possivel observar especilamente,

através da internalização ceular em Staphylococcus aureus, o potencial

desses PQs em atuarem com sondas biologicas. De acordo com os autores, a

estabilidade em água, uma boa luminescencia e uma baixa citotoxicidade

favorecem o uso destes PQs em várias aplicações biomédicas.

Micelas Poliméricas

As micelas poliméricas têm sido muito utilizadas nas indústrias

farmacêuticas para a incorporação de fármacos. Atualmente, os estudos

envolvendo a associação de moléculas farmacologicamente ativas com

membranas celulares têm encontrado sua principal aplicação no

planejamento de medicamentos e nos sistemas carregadores/liberadores,

através do encapsulamento de vetores transportadores de fármacos

específicos para liberação controlada nas regiões (tecidos e órgãos) a serem

tratadas (Qiu e Bae, 2006)

As micelas poliméricas são partículas dispersas em água de ordem

manométrica (10 – 100 nm), sendo preparadas a partir de polímeros



_________________________________________________________________

sintéticos, os quais contêm partes hidrofílicas e hidrofóbicas. A parte

hidrofílica geralmente é formada por unidades de óxido de etileno (POE) e

sua parte hidrofóbica formada por aminoácidos (Adams e Kwon, 2003). O

tipo de micela mais comumente utilizada é a de forma esférica. No entanto,

várias morfologias dependendo da característica do copolímero são

atingíveis, podendo então ocorrer uma transição entre micelas e vesículas

(Choucair e Eisenberg, 2003). Para a formação de micelas esféricas a parte

hidrofílica do polímero não deve sobrepor-se a porção hidrofóbica (Allen,

Maysinger e Eisenberg, 1999). As propriedades que definem as micelas

incluem a concentração micelar crítica (CMC), o número de agregação, o

tamanho e a forma. A maior força que dirige a micelização é o decréscimo

da energia livre do sistema devido à remoção dos fragmentos hidrofóbicos do

meio aquoso com a formação da micela. Em ambientes aquosos as micelas

são compostas por uma camada interna, constituída pelos blocos

hidrofóbicos dos copolímeros, estabilizados pela camada externa de blocos

hidrofílicos (Qiu e Bae, 2006).

A finalidade do uso de micelas formadas por copolímeros em bloco

na ciência é minimizar problemas relacionados com a solubilidade de

fármacos hidrofóbicos, toxicidade e farmacocinética inadequadas. Os

avanços mais significativos foram feitos com a incorporação de agentes

anticancerígenos. Outra estratégia para aumentar a seletividade de um vetor

pelo seu alvo consiste em fixar moléculas sinalizadoras às micelas

poliméricas, mostrando-se também eficazes no aumento da atividade

anticancerígena (Bae et al., 2005; Mi, Liu e Feng, 2011). As micelas

poliméricas e os pontos quânticos têm sido utilizados como sistemas de

entrega de fármacos, além de possuir a capacidade de imagem, tanto “in

vitro” como “in vivo” (Allen, Maysinger e Eisenberg, 1999).



_________________________________________________________________

Sistemas Teranósticos

Segundo Ho e Leong, (2010), a superfície dos PQs permite a

obtenção de sistemas multifuncionais direcionados ao diagnóstico e

tratamento de doenças. A versatilidade do uso dos PQs como sistemas

multifuncionais provém da possibilidade de conjugação com vários tipos de

moléculas em sua superfície. Estes sistemas, também são conhecidos como

“teranósticos”, sendo um termo utilizado para designar a combinação entre

terapia e diagnóstico.

Um exemplo de sucesso de sistema teranóstico a base de PQs no

tratamento do câncer de próstata foi realizado por Bagalkot et al., (2007).

Os resultados deste estudo apresentaram uma alta especificidade e

sensibilidade desses PQs funcionalizados com o aptâmero A10 RNA e com o

fármaco anticancerígeno, a Doxorrubicina (Dox), que foi intercalado junto à

haste do aptâmero

Segundo Chakravarthy et al., (2011) a capacidade de fornecer uma

terapia alvo para identificar e atacar especificamente certos tipos células

seria um grande avanço no tratamento farmacológico de doenças

pulmonares. Por este motivo, o estudo relatou a capacidade de PQs de

CdSe/CdS/ZnS conjugados com a Dox em alvejar os macrófagos alveolares,

células que desempenham um papel crucial na patogênese das lesões

pulmonares inflamatórias. Através das propriedades luminescentes do

complexo foi possível a confirmação visual da captação intracelular, bem

como a dissociação da Dox no núcleo, que é necessário para a ação do

fármaco.

PQs a base de ZnO também foram utilizados como sistemas

teranósticos através de sua encapsulação como o polímero de quitosana,

sendo assim possível veicular a Dox. Os resultados indicam uma nova geração

de PQs associados a fármacos anticancerígenos e encapsulados com



_________________________________________________________________

polímeros biocompatíveis na terapia e diagnóstico (Yuan, Hein e Misra,

2010).

A Figura 3 ilustra uma possível estrutura de um sistema teranóstico

a base de PQs formado por uma camada de polímero com a função de

proteger e veicular fármacos lipofílicos, e também as possíveis

funcionalizações através de anticorpos e do ácido fólico na superfície do PQ.

Já a Figura 4 ilustra um sistema teranóstico formado por uma micela

polimérica contendo os PQs e fármaco lipofílico e também das possíveis

funcionalizações através de anticorpos e do ácido fólico na superfície do

sistema.

Figura 3 Esquema de sistema teranóstico a base de PQ, recoberto por uma

camada de polímero contendo fármaco e as funcionalizações através

anticorpos e ácido fólico.



_________________________________________________________________

Figura 4 Esquema de um sistema teranóstico formado por micela polimérica

contendo os PQs e fármaco lipofílico e também as funcionalizações através

de anticorpos e do ácido fólico na superfície do sistema.

OBJETIVO

Objetivo __________________________________________________________________41


_____________________________________________________________________

OBJETIVO

Modificar a superfície dos PQs a base de ZnO, tornando-os

hidrofílicos através da ligação com o 3-(Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane

(GPTMS) e hidrofóbicos através da ligação com o Hexadecyltrimethoxysilane

(HTMS) e da bicamada formada entre o Ácido Oleico (AO) e o HTMS. O

objetivo das modificações está principalmente, relacionado com a

estabilização das NPs em ambientes aquosos, assim como a análise de suas

propriedades luminescentes e da toxicidade dos PQs hidrofóbicos, uma vez

que os mesmos serão incorporados em micelas poliméricas. As micelas, além

de permitir a veiculação dos PQs hidrofóbicos em sistemas biológicos,

também possuem o papel de direcioná-los às células tumorais, possibilitando

futuramente o uso deste sistema no diagnóstico do câncer.

CAPÍTULO I

Obtenção e caracterização dos PQs a base

de Zno em suspensão coloidal e do ZnO

modificado pelo GPTMS (i), HTMS (ii) e pela

bicamada de AO/HTMS (iii).

Capítulo I _______________________________________________________________________________________43


__________________________________________________________________________________

I) 1 MATERIAL E MÉTODOS

Materiais

•Acetato de zinco diidratado (Zn (CH3COO)2.2H2O) – Qhemis;

•Hidróxido de Lítio - Vetec Química Fina;

•Álcool Etílico absoluto PA – Synth;

•(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane (GPTMS) – Sigma;

•Rodamina 6G – Sigma.

Equipamentos

•Lavadora Ultra- Sônica Digital SoniClean 2 – Seers Medical;

•Centrífuga HITACHI HIMAC CR22GII;

•Espectrofotômetro Cary 60 UV-Vis;

•Espectrofotômetro no infravermelho Shimadzu® modelo IR Prestige-21;

•Fluorímetro SPEX F2121 e detector de germânio North Coast Scientific

Corporation;

•Microscópio Eletrônico de Transmissão (PHILIPS; modelo CM 200 SUPER

TWIN);

•Difração de Raios X - SIEMENS modelo D5000, DIFFRAC PLUS XRD Commee.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________44


__________________________________________________________________________________

I) 1.1 Métodos

I) 1.1.1 Precursor oxiacetato de zinco

O precursor que originará os PQs de ZnO foi preparado pelo método

proposto por (Spanhel e Anderson, 1991) a partir de uma dispersão etanólica

(0,1 mol. L-1) de acetato de zinco, Zn (CH3COO)2.2H2O mantida sob refluxo a

80°C durante 3 horas. Foi acoplado um sistema de destilação e uma saída

contendo cloreto de cálcio previamente seco e calcinado, de modo a evitar

contato da dispersão com a umidade exterior. Em seguida esta dispersão

precursora foi resfriada a temperatura ambiente e estocada em freezer a

temperatura próxima de -10°C.

I) 1.1.2 Suspensão coloidal de ZnO

Os PQs foram sintetizados através da reação hidrólise e

condensação (sol-gel), utilizando uma dispersão etanólica de hidróxido de

lítio (LiOH) á 0,5 M que foi adicionada ao precursor (descrito na etapa

anterior) sob agitação magnética a 40°C, seguindo o tempo de reação de 40

minutos e uma a razão de hidrólise r: [OH+]/[Zn2+] = 1,4 (Spanhel e

Anderson, 1991). Já a obtenção das NPs na forma de pó foi feita da

proporção de 1:4 de suspensão coloidal para heptano, precipitando assim as

NPs. Este precipitado foi separado do resto da suspensão através a

centrifugação por 10 minutos (10000 rpm) e seco á vácuo a temperatura

ambiente

Capítulo I _______________________________________________________________________________________45


__________________________________________________________________________________

I) 1.1.3 Modificações da superfície dos PQs de ZnO através do 3-

(Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane (GPTMS) e do

Hexadecyltrimethoxysilane (HTMS)

A superfície dos PQs foi modificada de forma individual e através

dos organosilanos, utilizando uma quantidade de 10 ml suspensão coloidal

contendo o GPTMS para os PQs hidrofílicos e o HTMS para os PQs hidrofóbicos

A concentração do catalisador básico (LiOH) utilizado para promover a

ligação entre os organo-silanos com o ZnO variou em função da quantidade

de GPTMS, conforme listado pela Tabela I. 1. Já a concentração de LiOH e

HTMS foi de 0,05 M e 0,1 M, respectivamente. Ambas as reações foram

realizadas separadamente em banho de ultrassom a temperatura ambiente e

durante 15 minutos e após este período observamos a formação de um

precipitado branco, que foi separado do resto da suspensão através da

centrifugação e logo em seguida seco a vácuo para obtenção dos PQs na

forma de pó.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________46


__________________________________________________________________________________

Tabela I. 1- Nome das amostras representadas pela modificação dos PQs a

base de ZnO com o GPTMS, a quantidade de suspensão coloidal utilizada e a

razão de hidrólise entre o LiOH e o GPTMS.

Nome amostra

Quantidade de suspensão

coloidal de ZnO (ml)

Razão de hidrólise

[LiOH]/[GPTMS] (Molar)

0,1 M GPTMS_0,2 M LiOH 10 0,2/ 0,1

0,1 M GPTMS_0,1 M LiOH 10 0,1/0,1

0,1 M GPTMS_0,05 M LiOH 10 0,05/0,1

0,2 M GPTMS_0,4 M LiOH 10 0,4/0,2

0,2 M GPTMS_0,2 M LiOH 10 0,2/0,2

0,2 M GPTMS_0,1 M LiOH 10 0,1/0,2

0,3 M GPTMS_0,6 M LiOH 10 0,6/0,3

0,3 M GPTMS_0,3 M LiOH 10 0,3/0,3

0,3 M GPTMS_0,15 M LiOH 10 0,15/0,3

I) 1.1.4 Modificações da superfície dos PQs de ZnO através do

Ácido Oleico (AO) seguido pelo Hexadecyltrimethoxysilane (HTMS)

A superfície dos PQs também foi revestida por uma bicamada

lipofílica, sendo formada primeiramente por uma camada de AO e por fim

por uma de HTMS Para tal modificação também foi utilizada 10 ml de

suspensão coloidal contendo 0,05 M de AO. A reação entre os PQs de ZnO

com o AO foi feita sob banho de ultrassom, durante 5 minutos a temperatura

de 60 oC. Logo em seguida foi adicionado o HTMS (0,1 M) e o LiOH (0,05 M),

os quais reagiram com as NPs revestidas pelo AO também sob banho de

Capítulo I _______________________________________________________________________________________47


__________________________________________________________________________________

ultrassom durante 15 minutos a temperatura ambiente. Após este período

também observamos a formação de um precipitado branco, que foi separado

do resto da suspensão através da centrifugação e logo em seguida seco a

vácuo para obtenção dos PQs na forma de pó.

I) 1.3 Caracterização físico-química do pó de ZnO puro e do pó de

ZnO modificado pelo GPTMS, HTMS e AO/HTMS

I) 1.3.1 Luminescência (PL)

Os espectros de excitação (PLE) e de emissão (PL) dos PQs foram

registados no fluorímetro SPEX F2121 com detector de germânio North Coast

Scientific Corporation com uma lâmpada de xénon (20 kW) como a fonte de

excitação

I) 1.3.2 Espectroscopia de Infravermelho (IV)

Os espectros de absorção no infravermelho médio de 4000 a 400

cm-1 foram obtidos em um espectrofotômetro Shimadzu Fourier Transform

Infrared Spectrophotometer, modelo IR Prestige-21 IR Affinity-1 FTIR-8400S

(Kyoto, Japan). Para a obtenção dos espectros confeccionaram-se pastilhas

de 200 mg de brometo de potássio (KBr) contendo as amostras na

concentração de 1%.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________48


__________________________________________________________________________________

I) 1.3.4 Difração de raios-X (DRX)

O DRX foram analisados pelo difratômetro Siemens D5000 CuK

utilizando radiação CuK, λ = 1.5418 Å, monocromatizada por cristal de

grafite. Os dados da intensidade de difração foram medidos em uma faixa 2θ

= 5 - 70°, com passo de 0.1° e tempo de exposição por passo de 3 s.

I) 1.3.5 Espectroscopia de fotoelétrons induzidos por raios-X

(XPS)

As análises foram realizadas utilizando o equipamento UNI-SPECS

UHV Surface Analysis System (LEFE - IQ/UNESP). Para excitação dos

fotoelétrons foi utilizada a radiação Mg Kα (hν = 1253,6 eV). Os espectros de

alta resolução foram medidos com uma energia de passagem do analisador

de 10 eV.

I) 1.4 Caracterização físico-química do ZnO em suspensão coloidal,

do ZnO modificado pelo GPTMS em água e do ZnO modificado pelo HTMS e

AO/HTMS em clorofórmio

I) 1.4.1 Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível

(UV-Vis)

Os espectros de absorção no UV-Vis foram coletados pelo

Espectrofotômetro Cary 60 UV-Vis utilizando uma sonda de imersão como probe, a

qual possui um caminho ótico de 2 mm. A faixa de comprimento de onda variou de

200 a 500 nm, sendo o tempo médio de leitura de 0,2 s e o intervalo de dados de 1

nm.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________49


__________________________________________________________________________________

I) 1.4.2 Estudo de estabilidade do ZnO modificado pelo GPTMS

em água e do ZnO modificado pelo HTMS e AO/HTMS em clorofórmio

O estudo de estabilidade também foi avaliado através técnica UV-vis,

os parâmetros utilizados estão descritos no item anterior.

I) 1.2.3 Rendimento quântico (quantum yield QY)

O QY relativo das amostras em estudo será comparado com uma

solução de rodamina 6G em etanol (QY = 95%), a qual é utilizada

frequentemente como referência para a emissão na região do verde. Para a

obtenção dos valores de QY foi necessário primeiramente nivelar as amostras

em uma mesma absorbância utilizando a técnica de UV-vis (item I.1.4.1) e

após esta etapa excita-las para a obtenção dos espectros de emissão (PL) (i

tem I. 1.3.1).

I) 1.4.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)

As micrografias foram obtidas através do Microscópio Eletrônico de

Transmissão (PHILIPS; modelo CM 200 SUPER TWIN) operado em 200 kV. As

amostras foram gotejadas em grades individuais de carbono.

I) 2 RESULTADOS e DISCUSSÕES

I) 2.1 Suspensão coloidal e modificações na superfície do ZnO

Nosso estudo começa pela obtenção dos PQs de ZnO,

primeiramente em suspensão coloidal. Esta suspensão foi obtida pelo

processo sol-gel através da adição do catalisador de LiOH no precursor de

acetato de zinco (Spanhel e Anderson, 1991). Após esta etapa, a superfície

dos PQs foi modificada com o GPTMS (i) e HTMS (ii) pela reação de hidrolise

Capítulo I _______________________________________________________________________________________50


__________________________________________________________________________________

e condensação, também utilizando como catalisador o LiOH. Esta reação

conduziu a formação de uma camada de siloxano ao redor das NPs, a qual se

formou devido a forte afinidade que os organo-silanos possuem com a

superfície hidroxilada do ZnO, resultando nas ligações covalentes do tipo

ZnO-Si-O (Jana, Earhart e Ying, 2007; Moussodia, Balan e Schneider, 2008;

Moussodia et al., 2010; Aboulaich et al., 2012; Li et al., 2015; Moghaddam et

al., 2015) (que será confirmada a seguir pelas técnicas de FT IR e XPS).

Ainda com o objetivo de aumentar a estabilidade do ZnO e

consequentemente suas propriedades luminescentes foi sintetizado uma

bicamada de AO e HTMS (iii). O revestimento das NPs com o AO aconteceu

através das ligações de hidrogênio entre a superfície hidroxilada do ZnO com

o grupo funcional carboxila presente no AO, formando assim uma primeira

camada de proteção às NPs. Após a adição do HTMS ao ZnO protegido pelo

AO foi possível sob catalise básica, a hidrolise do grupamento siloxano

presente no HTMS e a seguir com a reação de condensação a formação de

uma bicamada ao redor das NPs. Segundo Li et al., (2015) a organização de

uma bicamada ao redor dos PQs além de favorecer a proteção dos mesmas

contra a ação da água, também possui a propriedade de aumentar a

luminescência dos PQs.

Deve se ressaltar que durante o estudo as reações também foram

feitas em outras concentrações de HTMS e AO mais HTMS. No entanto,

conforme aumentava a concentração dos mesmos, era possível observar a

formação de um precipitado branco muito consistente, dificultando a

dispersão no clorofórmio e consequentemente a sua utilização.. .A Figura I.1

representa uma proposta de modelo estrutural do ZnO modificado pelos

organo-silanos e também pela modificação com o AO.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________51


__________________________________________________________________________________

Figura I.1 Modelo estrutural dos PQs a base de ZnO modificado pelo GPTMS e

HTMS (a) e pelo AO/HTMS (b).

I) 2.2 Espectroscopia vibracional na região do Infravermelho (IV)

A modificação da superfície dos PQs foi confirmada de forma

qualitativa através dos espectros de IV. Segundo Spanhel e Anderson, (1991),

a obtenção dos PQs de ZnO pelo processo sol-gel é algo bastante complexo.

Sabe-se que durante a reação os mesmos são obtidos na forma de cristais

puros. Entretanto, também há a formação de grupos acetatos e outros

subprodutos, podendo estar ligados ou adsorvidos na superfície dessas NPs.

Através da Figura I.2 observamos a presença de um amplo pico na escala de

≈ 3400 cm-1 característico do grupamento hidroxila (OH), no intervalo de

1400-1600 cm -1 constatamos a presença de picos referentes ao modo de

estiramento (simétrico e assimétrico) do grupo acetato (COO-). Já os picos

de vibração dentro da escala de 2942- 2857 cm-1 podem ser atribuídos aos

modos de alongamento (simétrico e assimétrico) do C-H do grupo CH2.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________52


__________________________________________________________________________________

(Jimenez-Gonzalez, Urueta e Suarez-Parra, 1998; Xiong, Pal e Serrano, 2007;

Sharma et al., 2012). Os picos entre 870 cm-1 são atribuídos às ligações de

Zn-O-Si e sugere que a superfície do ZnO foi modificada com sucesso pelo

organo-silanos (Aboulaich et al., 2012; Li et al., 2015) (Aboulaich et al.,

2012; Li et al., 2015).

Figura I.2 Espectros de IV do ZnO modificado pelo GPTMS (a, b, c) e pelo

HTMS e AO/HTMS.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________53


__________________________________________________________________________________

I) 2.3 Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível (UV-

Vis)

O comportamento ótico dos PQs de ZnO começa pela absorção na

região do UV-Vis. Com está técnica foi possível identificar o comprimento de

onda limite associado ao pico excitônico do ZnO (Yu et al., 2003). O método

utilizado foi aquele proposto por Nedelijkovic et al., (1993) (Nedelijkovic et

al., 1993), o qual utiliza a interseção da tangente do pico com o eixo do

comprimento de onda Conforme mostrado na Figura I.3 foi possível através

do espectro de absorção da suspensão coloidal identificar o pico excitônico

do ZnO no comprimento de onda próximo a 355 nm, característica típica de

NPs de PQs (Pesika et al., 2002)

Figura I.3 Espectros de absorção no UV-vis da suspensão coloidal de ZnO no

comprimento de onda limite de 355 nm.

Os espectros de absorção dos PQs modificados pelo GPTMS em água

e dos PQs modificados pelo HTMS e AO/HTMS em clorofórmio, na

concentração de 4 mg/ml também apresentaram picos excitônicos bem

Capítulo I _______________________________________________________________________________________54


__________________________________________________________________________________

definidos, porém no comprimento de onda próximo a 360 nm, conforme

mostra a seguir pela Figura I.4.

Figura I.4 Espectros de absorção no UV-vis do ZnO modificado pelo GPTMS

(a, b, c) e modificado pelo HTMS e AO/HTMS (e) no comprimento de onda

limite de 360 nm.

Com o valor do comprimento de onda limite (λ) encontrado e do

modelo proposto por Brus (1983) foi possível calcular o tamanho médio das

NPs. Este modelo se baseia na energia de confinamento do primeiro estado

eletrônico excitado, podendo ser aproximado pela Equação (I) para PQs.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________55


__________________________________________________________________________________

𝑬𝒈 = 𝑬𝒈𝒃𝒖𝒍𝒌 +

𝒉𝟐𝝅𝟐

𝟐𝒆𝒓𝟐 (

𝟏

𝒎𝒆 ∗ 𝒎𝟎

+𝟏

𝒎𝒉 ∗ 𝒎𝟎

) − 𝟏. 𝟖 𝒆𝟒𝝅𝜺𝜺𝟎 𝒓 ⁄

−𝟎. 𝟏𝟐𝟒𝒆𝟑

𝒉𝟐 (𝟒𝝅𝜺𝜺𝟎 )𝟐

(𝟏

𝒎𝒆 ∗ 𝒎𝟎

+𝟏

𝒎𝒉 ∗ 𝒎𝟎

) − 𝟏

Equação (I)

Sendo,

Eg = gap de energia da partícula (bulk) = 3,4 eV; h = h/2ᴨ, h= constante de

Plank = 6,62 x 10-34 J·s; r = raio da partícula; e = carga do elétron = 1,603 x

10-19 C; Ɛ0 = permissividade do espaço livre = 8,854 x 10-14 F; Ɛ =

permissividade relativa = 3,7; m0 = massa do elétron livre = 9,110 x 10-31 kg;

me *= massa efetiva do elétron = 0,24; mh *= massa efetiva do buraco =

0,45.

Assim, o tamanho médio das NPs em suspensão coloidal e após as

modificações foi de aproximadamente 2,3 e 3 nm, respectivamente.

I) 2.4 Estudo de estabilidade do ZnO modificado pelo GPTMS em água

e do ZnO modificado pelo HTMS e AO/HTMS em clorofórmio

Ainda pela espectroscopia de absorção na região do UV-Vis,

acompanhamos por um período de 15 dias possíveis alterações relacionadas

ao pico excitônico dos PQs na concentração de 4mg/ml. As Figuras I.5, 6,7 e

8mostram os espectros de absorção e através deles constatamos que a

absorbância e o tamanho da maioria dos PQs permaneceram intactos durante

o período analisado. Esta propriedade pode ser explicada pela capacidade

Capítulo I _______________________________________________________________________________________56


__________________________________________________________________________________

que a camada formada pelos modificadores tem em proteger e impedir a

agregação entre as NPs (Li et al., 2015). Este resultado corrobora com

aquele apresentado por Aboulaich e colaboradores (2009), em que suas NPs

modificadas pelo (poly)aminoalkoxysilane apresentaram em água uma

estabilidade tanto luminescente quanto de tamanho por um período de 14

dias.

No entanto, observamos um declínio do pico excitônico para a

amostra 0,3 M GPTMS_0,6 M LiOH (Figura I.8-a3). Segundo dados encontrados

na literatura a instabilidade em água desta amostra pode estar relacionada

com o excesso de LiOH em relação ao GPTMS. Este efeito pode ser observado

no estudo realizado por Innocenzi e colaboradores (2009), o qual mostra que

em condições altamente básicas, o GPTMS, sofre uma rápida hidrólise e

condensação em seus grupamentos, formando uma matriz composta pelas

ligações do tipo Si-O-Si (Innocenzi et al., 2009). A formação desta possível

matriz entre as moléculas do GPTMS no caso deste estudo pode ter diminuído

a camada de proteção em torno das NPs, tornando o núcleo da amostra 0,3 M

GPTMS_ 0,6 M LiOH mais vulnerável a ação deletéria da água.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________57


__________________________________________________________________________________

Figura I.5 Avaliação de possíveis modificações relacionadas ao pico


absorção no UV-vis das amostras 0,1 M HTMS_0,05 M LiOH (a); and 0,1 M

HTMS/AO_0,05 M LiOH (b).em clorofórmio

Capítulo I _______________________________________________________________________________________58


__________________________________________________________________________________

Figura I.6 Avaliação de possíveis modificações relacionadas ao pico



GPTMS_0,1 M LiOH (b1) ),1 M GPTMS_0,05 M LiOH (c1) em água.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________59


__________________________________________________________________________________




LiOH_0,2 M LiOH (b2) 0,2 M GPTMS_ 0,1 M LiOH (c2) em água.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________60


__________________________________________________________________________________




GPTMS_0,3 M LiOH (b3) e 0,3 M GPTMS_0,15 M LiOH (c3) em água.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________61


__________________________________________________________________________________

I) 2.5 Microscopia de Transmissão Eletrônica (MET)

A Figura I.9 (a, b ,c ) apresenta as micrografias de três amostras

contendo o GPTMS como modificador, assim como uma menor concentração

de LiOH. Já as Figuras I.10 (d, e) apresentam as micrografias do ZnO

modificado pelo HTMS e AO/HTMS. Os resultados mostram uma aparência

esférica das NPs independente do modificador utilizado. O tamanho médio

calculado a partir das micrografias apresentou um tamanho médio de 3,5 –

4nm pra a modificação com o GPTMS (Figura I 9 -a1, b1, c1) e de 4,5 nm para

as modificações com o HTMS e AO/HTMS (Figura I.10 –d1, e1),

respectivamente. Estes resultados representam o tamanho médio final das

NPs após as modificações, sendo diferente dos valores encontrados através

da equação de Brus (1983), a qual consegue somente identificar o tamanho

das NPs de ZnO em função do seu pico excitônico, conforme mostrado

anteriormente

Capítulo I _______________________________________________________________________________________62


__________________________________________________________________________________

Figura I.9. Micrografias das amostras 0,1 M GPTMS_0,05 M LiOH (a), 0,2 M

GPTMS_0,1 M LiOH (b) e 0,3 M GPTMS_0,15 M LiOH (c) e o tamanho médio

das amostras entre 3,5- 4 nm (a1), (b1), (c1), respectivamente.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________63


__________________________________________________________________________________

Figura I.10. Micrografias das amostras 0,1 M HTMS _0,05 M LiOH (d) e 0,1 M

HTMS/AO _0,05 M LiOH (e) e o tamanho médio das amostras de 4,5 nm (d1) e

(e1), respectivamente.

I) 2.6 Difração de raios-X (DRX)

Através da técnica de DRX identificamos picos correspondentes aos

planos difratores: (100), (002), (101), (102), (110), (103) e (200), indicando a

presença de uma estrutura cristalina do tipo wurtzite (Spanhel e Anderson,

1991; Aboulaich et al., 2012; Li et al., 2015). De modo geral, os

difratogramas representados pela Figura I.11 (a , b) apresentaram picos

alargados e pouco definidos, característica já descrita na literatura para a

presença de pequenos cristalitos de ZnO (Qian et al., 2011).

Capítulo I _______________________________________________________________________________________64


__________________________________________________________________________________

Entretanto, observamos que as amostras de ZnO modificado pelo

GPTMS apresentaram em relação ao ZnO puro picos um pouco mais intensos

e conforme a concentração de GPTMS foi sendo aumentada, também

identificamos a presença de novos picos junto a estrutura wurtzite. Este

resultado pode identificar o começo de uma possível nova fase cristalina

sendo formada devido à modificação com o GPTMS, podendo ser visualizada

pela Figura I.11-a. Já a Figura I.11-b mostra os difratogramas das amostras

de ZnO modificada pelo HTMS e AO/HTMS, os quais apresentaram em 22

graus um pico bem definido que segundo a literatura pode ser atribuído a

camada formada pelo HTMS (Li et al., 2015).

Figura I.11. DRX das amostras 0,1 M GPTMS_0,05 M LiOH, 0,2 M GPTMS_0,1 M

LiOH, 0,3 M GPTMS_0,15 M LiOH (a) e das amostras 0,1 M HTMS_0,05 M LiOH,

0,1 M HTMS/AO_0,05 M LiOH (b).

Capítulo I _______________________________________________________________________________________65


__________________________________________________________________________________

I) 2.7 Espectroscopia de fotoelétrons induzidos por raios-X (XPS)

O estudo da composição química, assim como a concentração

atômica dos fotoelétrons presentes nas camadas superficiais do ZnO puro,

ZnO modificado pelo GPTMS e modificado pelo HTMS e AO/HTMS foram feitas

pela técnica de espectroscopia de fotoelétrons de raios-X (XPS). Através da

técnica de XPS foi possível identificar os fotoelétrons Zn 2p, O 1s, C1s e Si

2p. O pico referente ao Zn 2p aparece em 1021 e 1023 eV, confirmando a

ligação existente entre o Zn2+ com um átomo de oxigênio (O) e entre o OH2,

respectivamente (Figuras I.12, 13, 14, 15, 16 e 17-a). A região O 1s também

possui uma componente distinta com a energia em 529,7 eV característico da

ligação do ZnO. O pico O 1s também foi deconvoluído em mais três

componentes, com a energia em aproximadamente 531, 532 e 533 eV,

característicos das ligações OH, C=O (531 eV), O-C, O-Si (532 eV) e O-C=O

(533 eV). O grupamento carbolina (C=O) e o grupo acetato (O-C=O) foram

provavelmente formados durante o processo sol-gel para obtenção da

suspensão coloidal de ZnO (Figuras I.12, 13, 14, 15, 16 e 17-b). A

deconvolução do pico de C 1s resultou em quatro componentes,

representados pela energia em aproximadamente 284,5, 286, 287 e 288,2

eV, característicos das ligações CH, C-O, C=O e O-C=O respectivamente

(Figuras I.12, 13, 14, 15, 16 e 17-c). Já a deconcolução do pico de Si 2p

resultou em uma componente com energia em 101,96 eV, característico da

ligação de ZnO-SiOx (Figuras I 13, 14, 15, 16 e 17-d). Os picos referentes ao

Zn 2p, O 1s e C 1s da amostra de ZnO puro também apresentaram as mesmas

energias de ligação e como já esperado não apresentou a energia de ligação

do ZnO-SiOx.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________66


__________________________________________________________________________________

Figura I.12. XPS dos fotoelétrons: Zn 2p (a); O 1 s (b); C 1s (c) do ZnO puro.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________67


__________________________________________________________________________________


da amostra 0,1 M GPTMS_0,05 M LiOH.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________68


__________________________________________________________________________________

Figura I.14.. XPS dos fotoelétrons Zn 2p (a2); O 1 s (b2); C 1s (c2), Si 2p (d2)


Capítulo I _______________________________________________________________________________________69


__________________________________________________________________________________



Capítulo I _______________________________________________________________________________________70


__________________________________________________________________________________


da amostra 0,1 M HTMS/AO_0,05 M LiOH.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________71


__________________________________________________________________________________


da amostra 0,1 M HTMS_0,05 M LiOH.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________72


__________________________________________________________________________________

A Tabela I.2 mostra as concentrações atômicas em porcentagem

dos fotoelétrons Zn 2p, O 1s, C1s e Si 2p das amostras citadas acima. Através

dos resultados observamos que as amostras contendo GPTMS e 0,05 – 0,15 M

apresentaram uma diminuição na concentração do fotoelétron Zn 2p,

conforme as quantidades foram sendo aumentadas, indicando possivelmente

um maior número de ligações com o GPTMS. A concentração do fotoelétron

O 1s também apresentou um aumento entre as amostras, que pode ter

ocorrido pela presença de átomos de oxigênio nas moléculas do GPTMS. Este

efeito também foi observado na porcentagem de Si 2p, que aumentou em

relação a maior concentração de GPTMS.

Através das concentrações atômicas dos PQs hidrofóbicos

verificamos que a porcentagem do fotoelétron Zn 2p (4%) foi bem menor

para a amostra contendo somente o HTMS. Este resultado sugere uma maior

organização do HTMS em torno das NPs, visto que a concentração do

fotoelétron C 1spara está amostra foi maior (76,8%). Já a concentração de Zn

2p (19,1%) para a amostra modificada pelo o AO juntamente com o

HTMS,reforça a teoria em que se baseia na formação de uma bicamada

Também observada através da menor concentração de Si 2p (1,7%) em

comparação com a amostra modificada somente pelo HTMS.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________73


__________________________________________________________________________________

Tabela I. 2 - Concentrações atômicas em porcentagem dos fotoelétrons Zn

2p, O 1s, C1s e Si 2p.

ZnO

(%)

0,1 M

GPTMS_

0,05 M

LiOH (%)

0,2 M

GPTMS_

0,1 M

LiOH (%)

0,3 M

GPTMS_

0,15 M

LiOH (%)

0,1 M

HTMS_

0,05 M

LiOH (%)

0,1 M

HTMS/AO_

0,05 M

LiOH (%)

Zn 2p 27,4 24,5 21,5 20,6 4 19,1

O 1s 46,5 40,9 42,5 42,6 13,4 22,5

C 1s 26,1 29,7 30,5 31,6 76,8 56,6

Si 2p _ 4,9 4,5 5,2 5,8 1,7

Zn/Si _ 5,0 4,6 3,9 0,7 11,2

I) 2.8 Luminescência (PL)

De acordo com a técnica de luminescência é possível obter

informações sobre os níveis de energia em que os elétrons se encontram

dentro do band gap, como por exemplo, a intensidade luminescente, assim

como as cores emitidas pelos PQs. A Figura I.18 mostra os espectros de

excitação (PLE) das amostras de ZnO modificado pelo GPTMS (a) e

modificado pelo HTMS e AO/HTMS (b). Com os espectros observamos a

presença picos de excitação em ≈ 365 nm seguidos dos picos de emissão (PL)

que apresentaram picos principais ≈ 550 nm, região de emissão da cor verde.

Já o pó do ZnO puro apresentou pico de excitação em ≈ 372 nm e de

emissão em ≈ 580 nm, região de emissão próxima ao amarelo. Através da

análise luminescente também observamos que a intensidade do pó de ZnO

puro foi bem menor em relação aos modificados

Capítulo I _______________________________________________________________________________________74


__________________________________________________________________________________

Figura I.18. Espectros de excitação (PLE) e de emissão (PL) do ZnO

modificado pelo GPTMS (a, b, c) e modificado pelo HTMS e AO/HTMS (e).

Capítulo I _______________________________________________________________________________________75


__________________________________________________________________________________

Os resultado mencionados acima indicam que a baixa intensidade

luminescente e o deslocamento da região do verde para o amarelo para o pó

de ZnO puro pode estar relacionado com prováveis mudanças nas vacâncias

de oxigênio (Vo) e também pelo aumento dos defeitos de superfície. Como

visto anteriormente, essas propriedades estão relacionadas com a

intensidade luminescente e com a emissão de cores pelos PQs. O resultado

negativo para o ZnO puro, provavelmente ocorreu durante o processo de

secagem para a obtenção do pó. Esse interessante fenômeno pode estar

ligado com a estabilidade que o ambiente coloidal proporciona as NPs, pois

neste ambiente a superfície das mesmas está rodeada pelos íons de OH- e as

Vo preenchidas pelos ânions de oxigênio.

O aumento na luminescência e a emissão na região no verde tanto

do ZnO modificado pelo GPTMS quanto pelo HTMS e AO/HTMS corroboram

com os resultados apresentados por Moghaddam et al., (2015), que

utilizaram o aminopropyltriethoxysilane (APTES) para estabilização do ZnO

em água. De acordo com o estudo, a estabilidade luminescente pode estar

relacionado com o meio alcalino utilizado para promover a reação de

hidrólise e condensação entre os grupamentos presentes no APTES com o

ZnO. Segundo os autores, a catálise básica pode ter gerado novos ânions de

oxigênio durante a reação, podendo assim ter preenchido as Vo.

Sendo assim, uma das melhores maneiras de diminuir os defeitos

presentes na estrutura cristalina dos PQs é através da chamada passivação

de superfície. Este processo tem como principal objetivo aumentar o

rendimento luminescente através da ligação entre os átomos presentes na

superfície dos PQs com outro tipo de material (Bera et al., 2010). A

passivação da superfície, geralmente é realizada pelo depósito de uma

camada de nivelamento de característica inorgânica ou orgânica. As

passivações do tipo inorgânica como, por exemplo, a formação de core shell

Capítulo I _______________________________________________________________________________________76


__________________________________________________________________________________

são as mais utilizadas. No entanto, a literatura também tem demostrado um

número considerável de passivações do tipo orgânica utilizando solventes

organometálicos como TOPO e o TOP (Qu, Peng e Peng, 2001; Talapin et al.,

2001). Estas moléculas se aderem à superfície dos PQs reduzindo o

espaçamento interpartículas, além de funcionarem como agentes de

proteção (Bera et al., 2010).

Nosso estudo também focou na passivação do tipo orgânica através

da modificação de superfície com o GPTMS, HTMS e AO/HTMS. A importância

no uso desses modificadores não só está relacionada com sua menor

toxicidade em comparação ao TOPO, mas também com sua capacidade de

formar ligações covalentes em torno do ZnO, aumentando ainda mais sua

estabilidade. A conservação das propriedades luminescentes do pó é de

grande importância, uma vez que está forma apresenta uma maior

estabilidade em relação às dispersões Com isso, os resultados aqui presentes

podem estar relacionados com a preservação das vacâncias e diminuição dos

defeitos de superfície presentes na estrutura cristalina do ZnO e será

representado a seguir pela Figura I.19.

Capítulo I _______________________________________________________________________________________77


__________________________________________________________________________________

Figura I.19. Simulação da estrutura cristalina de ZnO-QDs contendo defeitos

de superfície e os defeitos intrínseco (a), redução desses defeitos através da

passivação de superfície pelos organo-silanos (b)

I) 2.9 Rendimento quântico (quantum yield QY)

A razão do número de fótons emitidos pelo número de fótons

absorvidos foi analisada através do rendimento quântico das amostras de

ZnO modificado pelo GPTMS e modificado pelo HTMS e AO/HTMS em

comparação com a Rodamina 6G. Para realização desta analise foi necessário

primeiramente nivelar as amostras em uma mesma absorbância através da

espectroscopia de absorção no UV-vis. Após esta etapa através dos valores

relativos à intersecção das amostras com a rodamina 6G, sendo 344 nm para

as amostras de ZnO modificado e 340 nm para a suspensão coloidal foi

possível excita-las nos comprimentos de onda relativos e obter os espectros

de emissão (PL). De acordo, com o método descrito por

Capítulo I _______________________________________________________________________________________78


__________________________________________________________________________________

Demas e Crosby, (1971) e através da equação (II) foi possível calcular o QY

das amostras analisadas.

𝑸𝒀𝒙 = 𝑸𝒓[𝑨𝒙/ 𝑨𝒓 ] (𝒏𝒙

𝟐

𝒏𝒓 𝟐

)

Equação (II)

Sendo, QYr = 0,95 (rendimento quântico da rodamina 6G); Ax = área da

luminescência da amostra; Ar = área da luminescência da rodamina 6G; n2x

= índice de refração do solvente em que a amostra está dispersa; n2r =

índice de refração do solvente em que a rodamina 6G está dispersa.

De modo geral, os resultados de QY apresentados demonstrou que

os modificadores de superfície não interferiram quando comparado com a

suspensão coloidal de ZnO (10,2%). O aumento no QY entre as amostras de

ZnO modificado pode ser explicado através da redução dos defeitos

presentes na estrutura do ZnO. Esse efeito pode ser observado entre as

amostras modificadas pelo GPTMS, especialmente para a amostra of 0.3M

LiOH GPTMS_0,15 M, a qual apresentou um maior QY (10,8%) em relação as

amostras contendo uma menor quantidade do GPTMS. Já o melhor resultado

para as amostras de ZnO modificado pelo AO/HTMS pode ser explicado pela

formação de uma bicamada ao redor das NPs. Este resultado também foi

observado por Li et al., (2015), devido a formação de uma bicamada

formada pelo HTMS seguido pelo aminopropyltriethoxysilane (APS). De

acordo com este estudo o uso de um modificador hidrofóbico funcionalizado

com um modificador hidrofílico promoveu uma maior estabilidade do ZnO em

água, além de aumentar sua luminescência em aproximadamente 10 vezes

Capítulo I _______________________________________________________________________________________79


__________________________________________________________________________________

em comparação com o ZnO desprotegido. Os valores do QY referente à

suspensão coloidal de ZnO e ao ZnO modificado pelo GPTMS e pelo HTMS e

pela bicamada de AO/HTMS, e serão citados a seguir pela Tabela I.3.

Tabela I.3 - Valores de QY das amostras selecionadas.

Amostra

QY (%)

Suspensão coloidal de ZnO

10,2

0,1 M GPTMS_0,05 M LiOH

6,8


7,7


10,8

0,1 M HTMS/AO_0,05 M LiOH

11,3

0,1 M HTMS_0,05 M LiOH

7,2

I) 3 CONCLUSÕES

Através dos resultados apresentados neste capítulo concluímos a

importância das modificações de superfície, não só em relação à estabilidade

das NPs em ambiente aquoso e orgânico, mas também em relação às

propriedades luminescentes do ZnO. A importância das modificações em

relação à luminescência foi visualizada através da preservação das vacâncias

de oxigênio e também pela diminuição dos defeitos de superfície presentes

nas NPs, após serem submetidas ao processo de secagem para a obtenção do

pó. Os resultados negativos relacionados ao pó de ZnO puro, incluindo a

baixa intensidade luminescente e o deslocamento da região de emissão do

verde para o amarelo, pode ser explicado pelo fato do ambiente coloidal

Capítulo I _______________________________________________________________________________________80


__________________________________________________________________________________

proporcionar uma maior estabilidade as NPs, sendo afetado durante o

processo de secagem. Já as amostras na forma de pó do ZnO modificado pelo

GPTMS e pelo HTMS e pela bicamada formada entre AO/HTMS apresentaram

resultados positivos em relação a intensidade luminescente, assim como a

emissão na região do verde

Sendo assim, os resultados aqui apresentados apontam de certa

forma o potencial do ZnO modificado pelo GPTMS em atuar futuramente

como sondas luminescentes. Isto porque o GPTMS possui a capacidade de

tornar as NPs hidrofílicas e consequentemente estáveis em meios aquosos,

característica que representa um grande avanço na utilização dos mesmos

em diversas aplicações biológicas. Já o ZnO modificado pelo HTMS e pelo

AO/HTMS revela a capacidade desses PQs em serem incorporados em

sistemas anfifílicos, devido a capacidade desses modificadores em formarem

uma camada hidrofóbica de proteção as NPs. A incorporação desses PQs em

micelas poliméricas tem como finalidade auxiliar na aplicação biológica

desses PQs hidrofóbicos e será apresentada no próximo Capítulo.

Capítulo II

Incorporação dos PQs hidrofóbicos em

micelas poliméricas

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 82


____________________________________________________________________

II) 1 MATERIAL e MÈTODOS

Materiais

•Rhodamina 6G – Sigma Aldrich;

•Pluronic F127 – Sigma Aldrich;

•Pluronic F68 – Sigma Aldrich;

•Pluronic P123 – Sigma Aldrich;

•Água Mili-Q - Millipore Corporation;

•MTT - 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide.

Equipamentos

•Chapa aquecedora – IKA;

•Espectrofotômetro Cary 60 UV-Vis;

•Espectrofotômetro no infravermelho Shimadzu® modelo IR Prestige-21;

•Fluorímetro SPEX F2121 e detector de germânio North Coast Scientific

Corporation;

•ZetaTamanhor Nano-ZS - Malvern Instruments;

• Citometro de Fluxo - FACSDiva –BD Biosciences.

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 83


____________________________________________________________________

II) 1.1 Métodos

II) 1.1.1 Obtenção das micelas poliméricas

Primeiramente, foram obtidas as micelas poliméricas puras e forma

individual e através dos copolímeros em bloco, Pluronic F127; Pluronic F68 e

também da associação do Pluronic F127 com o Pluronic P123. A escolha da

quantidade de 0,6 g dos copolímeros em 30 ml de água foi baseada na

concentração micelar crítica (CMC) de cada um, sendo 2,8 x 10-6 M para o

Pluronic F127; 4,8 x 10-4 M para o Pluronic F68 e 4,4 x 10-6 M para o Pluronic

P123 (Kabanov, Batrakova e Miller, 2003). A técnica utilizada foi descrita por

Zhang, Yu e Eisenberg, (1996), a qual consiste na hidratação do filme

polimérico. Resumidamente, a quantidade de 0,6 g de cada copolímero foi

solubilizada em 10 ml de clorofórmio, sendo posteriormente evaporado,

formando assim o filme polimérico. A quantidade de 30 ml de água em

temperatura ambiente foi sendo adicionada aos poucos, permanecendo em

agitação a 700 rpm durante 30 minutos. A Figura II.1 mostra a estrutura

molecular dos copolímeros utilizados.

Figura II.1. Estrutura molecular do pluronic P123, F127 e F68.

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 84


____________________________________________________________________

II) 1.1.2 Incorporação dos PQs hidrofóbicos nas micelas

poliméricas

A incorporação dos PQs hidrofóbicos foi feita através da dispersão

de 0,03; 0,05 e 0,09g do pó seco em clorofórmio e adicionados junto à

quantidade de 0,6g dos copolímeros. A metodologia utilizada para a

obtenção dessas micelas é a mesma descrita no item anterior.

II) 1.2 Caracterização físico-química das Micelas Poliméricas

contendo os PQs hidrofóbicos

II) 1.2.1 Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível

(UV-Vis)

Os espectros de absorção no UV-Vis foram coletados pelo

Espectrofotômetro Cary 60 UV-Vis utilizando uma sonda de imersão como

probe , a qual possui um caminho ótico de 2 mm. A faixa de comprimento de

onda variou de 200 a 500 nm, sendo o tempo médio de leitura de 0,2 s e o

intervalo de dados de 1 nm.

II)1.2.2 Estudo de estabilidade dos PQs hidrofóbicos

incorporados nas micelas poliméricas

O estudo de estabilidade também foi avaliado através técnica UV-vis,

os parâmetros utilizados estão descritos no item anterior.

II) 1.2.3 Luminescência (PL)

As medidas de luminescência das micelas poliméricas contendo os

PQs hidrofóbicos foram realizadas no fluorímetro SPEX F2121 e detector de

germânio North Coast Scientific Corporation. A lâmpada de Xenônio de 450W

foi utilizada para excitação das amostras. Através das medidas foi possível

obter os espectros de excitação (PLE) e de emissão (PL).

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 85


____________________________________________________________________

II) 1.2.4 Rendimento quântico (quantum yield QY)

O QY relativo das amostras em estudo será comparado com uma

solução de rodamina 6G em etanol (QY = 95%), a qual é utilizada

frequentemente como referência para a emissão na região do verde. Para a

obtenção dos valores de QY foi necessário primeiramente nivelar as amostras

em uma mesma absorbância utilizando a técnica de UV-vis e após esta etapa

excita-las para a obtenção dos espectros de emissão (PL)

II) 1.2.5 Espalhamento dinâmico de luz (DLS)

O tamanho das micelas poliméricas pura e das micelas contendo os

PQs hidrofóbicos foram feitas através ZetaTamanhor Nano-ZS, Malvern

Instruments, para isso as amostras foram diluídas 10 x e submetidas por

alguns minutos no banho de ultrassom para melhor homogeneização. A

técnica consiste num feixe de laser atravessar a amostra, onde as micelas

espalham a luz de determinado modo onde se capta um sinal, o qual é

enviado e processado através do software que executa os cálculos de

tamanho médio e índice de polidispersidade (pdi).

II)1.2.6 Avaliação do potencial citotóxico das micelas

poliméricas contendo os PQs hidrofóbicos

O MTT é um método colorimétrico utilizado para medir a

viabilidade celular e a citotoxicidade. Neste ensaio, as células vivas são

capazes de reduzir o 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-

tetrazolium bromide (MTT), formando cristais insolúveis de formazana de

coloração violeta (Mosmann, 1983).

As células HaCaT e HepG2 (2x105 células/poço) foram cultivadas

em placas de 96 poços por 24 horas e tratadas com 100 µL das micelas

contendo os PQs hidrofóbicos em diferentes concentrações e por 24 horas. As

amostras foram removidas e colocou-se 10 µL do corante tetrazólico MTT em

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 86


____________________________________________________________________

cada poço. As placas foram incubadas por quatro horas em contato com MTT

a 5% CO2 e temperatura de 37°C. A atividade da desidrogenase mitocondrial

reduziu o MTT amarelo para um sal de formazana roxo insolúvel, o qual foi

solubilizado em isopropanol e sua absorbância foi lida a 540 nm no leitor de

placas. Neste método, as células que permaneceram vivas após o contato

com as amostras conseguem reduzir o sal MTT através da enzima presente na

mitocôndria (organela responsável pela respiração celular). Sendo assim,

através da quantificação do cristal de formazana de cor púrpura pela

espectroscopia de absorção UV-Visível foi possível quantificar a porcentagem

de células vivas. Como controle negativo foi utilizado o meio de cultura

DMEM e como controle positivo o Dimetilsulfóxido a 10%. Foram realizados

três experimentos independentes e as concentrações foram testadas em

triplicatas. A porcentagem de células mortas foi calculada em relação ao

controle negativo, representando a citotoxicidade de cada tratamento,

segundo proposto por Zhang et al., (2004) e, em seguida, foi determinada

também a porcentagem de células vivas.

II) 1.2.7 Estudo da internalização celular das micelas poliméricas

através da citometria de fluxo

A internalização celular das micelas poliméricas contendo os PQs

foi analisada por citometria de fluxo. A metodologia de cultivo da linhagem

de células HepG2, assim como o plaqueamento estão descritos no item

anterior. Para este ensaio as células tratadas com as micelas foram

incubadas durante um período de 24 horas e após este período, foram

lavadas com o tampão PBS e removidas da placa através da tripsina. A

suspensão de células foi então centrifugada e o sobrenadante descartado.

Uma nova suspensão celular foi obtida em PBS e analisada pelo citometro

(FACSDiva –BD Biosciences) com um laser de excitação de 488 nm e canal FL1

(530/30 nm, região de emissão do verde).

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 87


____________________________________________________________________

II) 2 RESULTADOS e DISCUSSÕES

II) 2.1 Obtenção das micelas poliméricas

As micelas poliméricas foram obtidas através da técnica descrita

por Zhang, Yu e Eisenberg, (1996), a qual consiste na hidratação do filme

polimérico. Através desta técnica constatamos que conforme a água foi

sendo adicionada sob agitação ao filme polimérico, a polaridade do meio

torna-se cada vez mais desfavorável à solubilização dos blocos hidrofóbicos e

quando a água chegou a uma determinada concentração estes blocos

associam-se, formando assim as micelas. A escolha no uso destes

copolímeros foi baseada em diversos estudos, os quais mostram a capacidade

dos mesmos em contribuir para a veiculação de fármacos lipofílicos, além de

atingirem com maior precisão diversas células cancerígenas (Wei et al.,

2009; Sahu et al., 2011; Zhang et al., 2011; Cai et al., 2015). A associação

entre o Pluronic F127/ Pluronic P123 foi feita nas concentrações de 10:0 e de

0:10 (p/p), conforme mostra a Tabela II. 1.

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 88


____________________________________________________________________

Tabela II. 1 - Quantidades utilizadas de Pluronic P123/ Pluronic F127 e de

água.

Quantidade

Pluronic P123 (g)

Quantidade

Pluonic F127 (g)

Quantidade de

Água (ml)

1

0,600

0

30

2 0,54 0,06 30

3 0,48 0,12 30

4 0,42 0,18 30

5 0,36 0,24 30

6 0,30 0,30 30

7 0,24 0,36 30

8 0,18 0,42 30

9 0,12 0,48 30

10 0,06 0,54 30

11 0 0,600 30

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 89


____________________________________________________________________

II) 2.1.1 Incorporação dos PQs hidrofóbicos nas micelas

poliméricas

Primeiramente, foram testadas individualmente as quantidades de

0,03 e 0,09 g dos PQs hidrofóbicos nas micelas listadas na Tabela II. 1. No

entanto, através dos resultados foi possível observar que conforme a

quantidade do Pluronic P123 aumentava independentemente da quantidade

dos PQs ocorria à formação de diversas partículas suspensas. As soluções

micelares contendo o Pluronic F127 associado ao Pluronic P123 foram

excitadas em uma lâmpada UV no comprimento de 365 nm e através das

mesmas foi possível visualmente observar a formação de pequenos pontos

suspensos de coloração verde, que podem ser os PQs com superfície

hidrofóbica. Provavelmente, o uso do Pluronic P123 revestiu as

nanopartículas de forma com que as mesmas ficassem suspensas. Este tipo

de resultado, no caso deste trabalho, dificultou a utilização das mesmas. Por

isso, optou-se pela utilização somente do Pluronic F127 e do Pluronic F68.

A incorporação dos PQs hidrofóbicos nas micelas formadas pelo

Pluronic F127 e F68 foram feitas nas quantidades de 0,03; 0,05; 0,09 e

0,20 g. As micelas contendo as três primeiras quantidades dos PQs

apresentaram um aspecto levemente turvo, as quais foram filtradas

facilmente em filtro de 0,45 μm. Ao contrário das micelas contendo a última

concentração, as quais exibiram um aspecto muito mais turvo e que após o

processo de filtração apresentaram sob a lâmpada UV uma emissão

luminescente quase que extinta. Este resultado indica que está quantidade

foi demasiada, não sendo possível a solubilização dos PQs na porção

hidrofóbica dos copolímeros, mantendo-se suspensos e posteriormente

retidos nos filtros. Desse modo, optou-se pela escolha das quantidades de

0,03; 0,05 e 0,09 g, mantendo fixa a quantidade de 0,06g dos copolímeros. A

Tabela II. 2 mostra o nome das amostras, o tipo do copolímero, assim como o

tipo de PQ hidrofóbico e a quantidade de cada um.

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 90


____________________________________________________________________

Tabela II. 2– Identificação das amostras e do tipo de copolímero utilizado,

assim como o PQ hidrofóbico utilizado e a quantidade de cada um.

Nome da Amostra Copolímero

utilizado

PQ hidrofóbico

utilizado

Quantidade de PQ

hidrofóbico

utilizada

F68 HTMS (1) Pluronic F68 ZnO HTMS 0,03 g



F68 HTMS/AO (1) Pluronic F68 ZnO HTMS/AO 0,03 g









Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 91


____________________________________________________________________

II) 2.1.2 Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível

(UV-Vis)

As dispersões do PQs hidrofóbicos incorporados nas micelas

poliméricas citadas na Tabela II. 2 foram analisadas pelo espectro de

absorção UV-Vis, apresentando um valor em ≈ 360 nm para todas as

amostras. Este resultado mostra que a incorporação dos PQs hidrofóbicos nas

micelas não afetou no tamanho dos mesmos e serão demonstrados a seguir

pela Figura II. 2 (a, b, c, d)

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 92


____________________________________________________________________

Figura II.2. Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível (UV-Vis)


d).

II) 2.1.3 Estudo de Estabilidade das micelas poliméricas

contendo os PQs através da técnica UV-vis

O estudo de estabilidade dos PQs hidrofóbicos incorporados nas

micelas poliméricas foi realizado através da técnica de espectroscopia de

absorção na região ultravioleta visível (UV-Vis). Com esta técnica foi possível

avaliar parâmetros relacionados ao pico excitônico das NPs de ZnO mesmo

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 93


____________________________________________________________________

incorporados nas micelas e serão mostrados a seguir pela Figura II. 3 (a, b, c,

d) e com os resultados observamos uma estabilidade tanto luminescente

quanto de tamanho desses PQs por um período de 30 dias.

Figura II.3. Estudo de estabilidade por período um de 30 dias, utilizando a

técnica de espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível (UV-Vis)


d).

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 94


____________________________________________________________________

II) 2.1.4 Luminescência (PL)

A caracterização luminescente das micelas poliméricas contendo os

PQs hidrofóbicos também foi feita pelos espectros de excitação (PLE) e de

emissão (PL). Os espectros de PLE para todas as amostras apresentaram picos

principais em ≈ 350 nm. Este resultado é diferente daqueles apresentados

para os pós dos PQs hidrofóbicos, os quais ficaram em ≈ 365 nm. Através do

valor de PL excitamos as amostras e obtivemos os espectros de PL, os quais

apresentaram um valor médio em ≈ 550 nm, região de emissão da cor verde.

Com os resultados confirmamos que a intensidade luminescente foi

aumentando conforme aumentou a quantidade de PQs e estão representadas

pela Figura II. 4 (a, b, c ,d).

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 95


____________________________________________________________________

Figura II.4. Espectros de excitação (PLE) e emissão (PL) das micelas

formadas pelo Pluronic F68 (a, b) e pelo Pluronic F127 (c, d).

II) 2.1.5 Rendimento quântico (quantum yield QY)

A razão do número de fótons emitidos pelo número de fótons

absorvidos foi analisada através do rendimento quântico das micelas em

comparação com a Rodamina 6G. Para realização desta analise foi necessário

primeiramente nivelar as amostras em uma mesma absorbância através da

espectroscopia de absorção no UV-vis. Após esta etapa através dos valores

relativos à intersecção das amostras com a rodamina 6G, que foi de 344 nm,

excitamos as amostras através do Fluorímetro SPEX F2121 e obtivemos os

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 96


____________________________________________________________________

espectros de emissão (PL). De acordo, com o método descrito por Demas e

Crosby e através da Equação (II) (descrita anteriormente) calculamos o QY

das amostras analisadas.

Com os resultados verificamos que as amostras contendo o PQ ZnO

HTMS/AO apresentaram um maior QY, assim como as micelas formadas pelo

Pluronic F127. Este resultado pode ter ocorrido pelo fato da região

hidrofóbica do Pluronic F68 ser menor (POE152-POP28-POE152) em relação

ao Pluronic F127 (POE106-POP70-POE106). Esta característica provavelmente

influenciou o processo de incorporação dos PQs na região hidrofóbica, ou

seja, o excesso dos PQs pode ter sido removido do restante da solução

micelar através do processo de filtração, proporcionando uma diminuição na

luminescência dos mesmos. A Tabela II. 3. Apresenta os valores de QY das

amostras selecionadas

Tabela II. 3 – Valores de QY das amostras selecionadas.

Amostra

QY (%)

F68 HTMS/AO (3)

F68 HTMS (3)

F127 HTMS/AO (3)

F127 HTMS (3)

6,9 %

5,5 %

8,9 %

6,3 %

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 97


____________________________________________________________________

II) 2.1.6 Espalhamento de luz dinâmico (DLS)

A técnica de DLS fornece diversas informações relacionadas à

variação do espalhamento de luz causado pelo movimento Browniano das

partículas em suspensão. Em geral, a luz espalhada com intensidades

diferentes é captada por um sinal e após isso ocorre o processamento dos

dados, os quais são enviados para um software que realiza os cálculos

fornecendo os valores de distribuição, tamanho médio e pdi. Conforme

mostrado a seguir pela Figura II. 5 (a, b, c, d) observamos que as micelas

formadas pelo Pluronic F68 apresentaram tamanhos menores quando

comparada as micelas formadas pelo Pluronic F127. Através dos gráficos de

distribuição de tamanho também constatamos a formação de sistemas

micelares relativamente homogêneo, pois há presença de outras populações

de partículas. Os valores de pdi mostram a formação de sistemas com uma

dispersão moderada, tendo em vista que o valor varia entre 0 a 1 e quanto

menor, mais monodispersa e, consequentemente, menos heterogênea é a

amostra (Malvern, 2004). Também foi possível avaliar o potencial Zeta das

micelas, os quais apresentaram valores negativos, mostrando que a

superfície dessas partículas está negativamente carregada em meio aquoso,

esses valores assim como os valores do tamanho e de pdi, serão listados a

seguir pela Tabela II. 4.

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 98


____________________________________________________________________

Figura II.5. Distribuição do tamanho das micelas poliméricas; (a) Micela

Pluronic F68 HTMS_AO; (b) Micela Pluronic F68 HTMS, (c) Micela Pluronic

F127 HTMS_AO e (d) Micela Pluronic F127 HTMS.

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 99


____________________________________________________________________

Tabela II. 4 – Tamanho, pdi e potencial zeta das amostras selecionadas.

Amostra

Tamanho (nm)

PDI Potencial Zeta (mV)

F68 HTMS/AO (3)

177,87(±) 2,3329

0,1433 (±) 0,0058 -12,43 (±) 3,22

F68 HTMS (3) 174,47 (±)1,1146 0,153 (±) 0,0167 -10,37 (±) 1,56

F127 HTMS/AO (3) 201,7 (±) 2,971 0,2317(±) 0,0085 -17,58 (±) 2,4

F127 HTMS (3) 249,47 (±)5,7343 0,1553 (±) 0,0052 - 15, 17 (±) 1,73

Ainda através da técnica de DLS estabelecemos um estudo de

estabilidade, verificando parâmetros relacionados ao tamanho e pdi das

micelas. Através dos resultados observamos que as mesmas apresentaram

durante o período de 30 dias, uma ótima estabilidade tanto de tamanho

quanto de pdi e os valores serão listados a seguir nas Tabelas II. 5; II. 6; II. 7

e II. 8. Este resultado facilita o uso dessas amostras em aplicações futuras

que serão mostradas ainda neste trabalho, como por exemplo, estudo da

internalização celular.

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 100


____________________________________________________________________

Tabela II. 5 – Estabilidade da amostra F68 HTMS/AO (3)

Amostra

Tamanho (nm)

PDI

F68 HTMS/AO (3) (dia 0)

177,87 (±) 2,3329

0,1433 (±) 0,0058

F68 HTMS/AO (3) (dia 1) 227,2 (±) 1,8991 0,153 (±) 0,0167

F68 HTMS/AO (3) (dia 7) 178,20 (±) 3,1496 0,173 (±) 0,023

F68 HTMS/AO (3) (dia 15) 176,8 (±) 2,1924 0,1483 (±) 0,0077

F68 HTMS/AO (3) (dia 30) 176,9 (±) 1,2083 0,1743 (±) 0,0133

Tabela II. 6 - Estabilidade da amostra F68 HTMS (3).

Amostra

Tamanho (nm)

PDI

F68 HTMS(3) (dia 0)

227,2 (±) 1,8991

0,153 (±) 0,0167

F68 HTMS(3) (dia 1) 223,23 (±) 1,5173 0,1693 (±) 0,0168

F68 HTMS(3) (dia 7) 229,31 (±) 2,197 0,1747 (±) 0,009

F68 HTMS(3) (dia 15) 226,37 (±) 0,661 0,1623 (±) 0,0041

F68 HTMS(3) (dia 30) 225,47 (±) 2,4984 0,1717 (±) 0,0088

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 101


____________________________________________________________________

Tabela II. 7 – Estabilidade da amostra F127 HTMS/AO (3).

Amostra

Tamanho (nm)

PDI

F127 HTMS/AO (3) (dia 0)

201,7 (±) 2,971

0,2317(±) 0,0085

F127 HTMS/AO (3) (dia 1) 195,7 (±) 1,4855 0,2533 (±) 0,0167

F127 HTMS/AO (3) (dia 7) 205,9 (±) 3,4881 0,2543 (±) 0,0038

F127 HTMS/AO (3) (dia 15) 199,27 (±) 2,2066 0,2431 (±) 0,009

F127 HTMS/AO (3) (dia 30) 192,91 (±) 1,8184 0,2303 (±) 0,0071

Tabela II. 8 – Estabilidade da amostra F127 HTMS (3).

Amostra

Tamanho (nm)

PDI

F127 HTMS (3) (dia 0) 249,47 (±) 5,7343

0,1553 (±) 0,0052

F127 HTMS (3) (dia 1) 247,11 (±) 2,0607 0,1573 (±) 0,0079

F127 HTMS (3) (dia 7) 249,77 (±) 4,7401 0,1507 (±) 0,0021

F127 HTMS (3) (dia 15) 247,77 (±) 1,3695 0,1447 (±) 0,0069

F127 HTMS (3) (dia 30) 246,63 (±) 3,628 0,1433 (±) 0,0129

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 102


____________________________________________________________________

II) 2.1.6 Avaliação do potencial citotóxico das micelas

poliméricas contendo os PQs hidrofóbicos

A avaliação citotóxica das micelas foi feita através do ensaio de

MTT. Para isso, cultivamos as linhagens celulares HaCat e HepG2. A primeira

é uma linhagem imortalizada de queratinócitos humanos com alto poder

proliferativo e vem sendo muito utilizada nos últimos anos como modelo

celular em diversos estudos, incluindo a citotoxicidade de PQs (Zheng et al.,

2011; Pathakoti et al., 2013; Ando et al., 2016) e de micelas poliméricas

(Pathakoti et al., 2013; Lee et al., 2015; Neuberg et al., 2015). As células

HaCat também são muito conhecidas por mimetizarem ambientes in vivo,

pois possuem uma alta capacidade de crescimento em meios de culturas

tradicionais, além de apresentarem um fenótipo próximo ao normal

(Boukamp et al., 1988; Deyrieux e Wilson, 2007; Pathakoti et al., 2013;

Tyagi et al., 2015). Já a linhagem de HepG2 são células de hepatoma

humano, metabolicamente ativas, usualmente empregadas em vários

estudos, por serem capazes de simular a função hepática de um organismo in

vitro.(Miret, De Groene e Klaffke, 2006). Um estudo realizado por Peng et

al., (2013) avaliou a citotoxicidade e a viabilidade celular dos PQs de

CdSe/ZnS através da linhagem HepG2. Os resultados demostraram que não

houve citotoxicidade desses PQs nas concentrações entre 10 – 100 nM e de

acordo com o MTT, a inexistência de toxicidade pode ser atribuída a

formação de uma camada de PEG em torno do shell de ZnS.

A Figura II.6 apresenta os gráficos de viabilidade celular do ensaio

de MTT para as linhagens de células HaCat (a, c) e HepG2 (b, e). Através dos

gráficos foi possível identificar o índice de citotoxicidade (IC50) que significa

a concentração em porcentagem das soluções micelares que induz 50% de

lise ou morte celular. Sendo assim, o IC50 referente à linhagem celular

HaCat foi de 20-26,6% para as soluções micelares formadas pelo Pluronic F68

e de 13,3-20% para as soluções micelares formadas pelo F127.

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 103


____________________________________________________________________

Já o IC50 referente à linhagem celular HepG2 foi de 20-26,6% para

a solução micelar F68 HTMS/AO; 13,3-20% para F68 HTMS e F127 HTMS/AO; e

6,6-13,3% para a solução micelar F127 HTMS. Através dos gráficos de

viabilidade celular referente à linhagem HepG2 também notamos que as

porcentagens inicias tanto das micelas formadas pelo Pluronic F68 quanto

F127, apresentaram um aumento na viabilidade celular, ou seja, a

quantidade de células presentes nos poços da microplaca tratados com as

soluções foi maior que o número de células presentes nos poços controle.

Este resultado pode estar relacionado com um aumento na atividade

metabólica desta linhagem de células.

No geral, também observamos que os resultados de citotoxicidade

das soluções micelares podem estar relacionados com o tamanho das

mesmas, tendo em vista que as micelas de tamanhos maiores apresentaram

uma atividade citotóxica em menores porcentagens.

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 104


____________________________________________________________________

Figura II. 6. Ensaio de citotoxicidade em células HaCaT (a, c) e em células

HepG2 (b, e) Nos gráficos o eixo y corresponde a porcentagem de células

vivas após contato com as amostras e o eixo x representa a porcentagem (%)

de micelas poliméricas utilizadas no ensaio de MTT. Os dados referem-se à

média de três experimentos independentes (Média ± erro padrão).

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 105


____________________________________________________________________

II) 2.1.7 Estudo da internalização celular das micelas poliméricas

através da citometria de fluxo

A citometria de fluxo vem sendo muito utilizada por se tratar de

uma técnica dinâmica em que as células passam por um sistema de excitação

e detecção. À medida que as células passam pelo sistema de fluxo é possível

excita-las através dos filtros e se estiverem marcadas com fluoróforos

emitem luz, podendo assim ser quantificadas (Ichinose, 1991), conforme

mostra a Figura II.7.

Figura II. 7. Esquema de um citômetro de fluxo.

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 106


____________________________________________________________________

Sendo assim, apresentamos aqui um método “in vitro” que visa à

quantificação da internalização celular das micelas poliméricas contendo os

PQs hidrofóbicos como marcador. A aplicação da citometria na detecção de

células marcadas por PQs é algo recente, estudos têm mostrado que essa

técnica vem ganhando destaque, principalmente quando comparada à

microscopia de fluorescência, que não consegue quantificar de forma precisa

o número de células fluorescentes (Gao e Nie, 2004; Hahn, Keng e Krauss,

2008; Lee, Kim e Park, 2010; Markovic et al., 2012; Duan et al., 2013; Chen,

G. et al., 2015; Huang et al., 2015) Segundo Hahn, Keng e Krauss, (2008),

existem alguns desvantagens no uso de corantes orgânicos ou de proteínas

fluorescentes na citometria de fluxo e que pode ser superadas através da

substituição destes fluoróforos por PQs. Isto porque os PQs possuem um

amplo espectro de absorção, não estando limitados a fontes de excitação

específica. Sendo assim, os resultados mostraram o potencial dos PQs de

CdSe/ZnS quando comparado com o tradicional isotiocianato de fluoresceína

(FITC), que é um marcador fluorescente verde. De acordo com os autores, os

PQs de CdSe/ZnS possuem uma maior intensidade luminescente,

proporcionando maior precisão na detecção de uma mistura de células

bacterianas, comprovando assim as vantagens dos uso PQs na citometria de

fluxo.

Resumidamente, a técnica de citometria baseia-se na contagem

total de células numa suspensão homogeneizada, em vez da contagem

manual sobre um microscópio de fluorescência. Em nosso estudo, o número

total de células contendo as micelas internalizadas foi estimado através da

fluorescência dos PQs. A porcentagem das micelas F127 HTMS/AO e F127

HTMS a ser utilizada foi determinada em função do IC50, sendo 6,6% para

ambas as amostras. Apesar dessas micelas apresentaram uma atividade

citotóxica em menores porcentagens, as mesmas possuem uma maior

luminescência em comparação com as micelas formadas pelo Pluronic F68.

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 107


____________________________________________________________________

Com isso, a Figura II.8 mostra os histogramas em citometria de fluxo da

micela F127 HTMS (a) e da micela F127 AO/HTMS (b).

Figura II.8. Histogramas em citometria de fluxo da micela F127 HTMS (a) e

da micela F127 HTMS/AO. Nos gráficos o eixo y corresponde ao número de

células analisadas em função da dispersão lateral de luz (“side scatter” ou

SS), já o eixo x representa a dispersão da luz a partir da fonte de excitação

no mesmo eixo que o feixe, ou seja, “forward scatter” ou FS.

Apesar da baixa porcentagem de internalização celular em

linhagens do tipo HepG2, sendo 2,16% para a micela F127 HTMS/AO e de

1,56% para a micela F127 HTMS. Estes resultados representam de certa

forma um potencial a ser explorado em relação ao sistema, incluindo

modificações na síntese dos PQs tornando-os mais luminescentes,

característica que diminui o limite de detecção e também a fixação de

moléculas sinalizadoras ao redor das micelas poliméricas, facilitando assim

sua internalização celular em células específicas. Com isso, a Figura II.9

resume um esquema da internalização celular das micelas poliméricas

contendo os PQs hidrofóbicos como marcador.

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 108


____________________________________________________________________

Figura II.9. Esquema da internalização celular das micelas poliméricas

contendo os PQs hidrofóbicos como marcador, sendo os PQs hidrofóbicos

presentes em nosso estudo (a), localização dos PQs no núcleo micelar (b),

excitação em 350 nm/ emissão em 550 nm, região do verde (c) e

internalização celular (d).

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 109


____________________________________________________________________

II) 3 CONCLUSÕES

Através dos resultados aqui apresentados, concluímos que a

incorporação dos PQs hidrofóbicos nas micelas poliméricas foi realizada com

sucesso. Este fato pode ser observado através dos espectros de absorção no

UV-vis e também pelos espectros de excitação (PLE) e de emissão (PL). Já

com a técnica de DLS avaliamos parâmetros relacionados ao tamanho,

distribuição e pdi das micelas e que foram qualificadas com o estudo de

estabilidade.

Através dos resultados também concluímos a importância do

tamanho da cadeia hidrofóbica dos copolímeros utilizados. Visto que, as

micelas formadas pelo Pluronic F127, por possuírem uma maior cadeia,

apresentaram um melhor rendimento quântico (QY) em relação às micelas

formadas pelo Pluornic F68. Está característica pode ter influenciado no

processo de incorporação dos PQs na região hidrofóbica, ou seja, o excesso

dos PQs não solubilizados nesta região pode ter sido removido do restante da

solução micelar através do processo de filtração, proporcionando uma

diminuição na luminescência dos mesmos.

A avaliação do potencial citotóxico das micelas, apresentou uma

boa viabilidade celular para as linhagens de HaCat e HepG2 principalmente,

para as micelas formadas pelo Pluronic F68. Este resultado pode estar

relacionado com o tamanho das mesmas, tendo em vista que as micelas de

tamanhos maiores apresentaram uma atividade citotóxica em menores

porcentagens. Já a quantificação das células em que houve a internalização

das micelas foi feita através da citometria de fluxo. Os resultados mostraram

a capacidade desta técnica em detectar o número de células fluorescentes.

Apesar da baixa porcentagem de internalização celular, os resultados

representam de certa forma um potencial a ser explorado em relação ao

sistema, incluindo modificações na síntese dos PQs tornando-os mais

luminescentes, característica que diminui o limite de detecção e também a

fixação de moléculas sinalizadoras ao redor das micelas, facilitando assim

Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 110


____________________________________________________________________

sua internalização em células especificas de determinados tipos de câncer.

Sendo assim, concluímos com os resultados encontrados neste Capítulo, o

potencial destes sistemas micelares em atuarem futuramente como agentes

diagnósticos e também no desenvolvimento futuro de sistemas teranósticos.

REFERÊNCIAS

BIBLIOGRÁFICAS

Referências Bibliográficas __________________________________________________________________________________112


_____________________________________________________________________________

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABOULAICH, A. et al. Physicochemical properties and cellular toxicity of

(poly) aminoalkoxysilanes-functionalized ZnO quantum dots.

Nanotechnology, v. 23, n. 33, p. 335101, 2012. ISSN 0957-4484.

ADAMS, M. L.; KWON, G. S. Relative aggregation state and hemolytic activity

of amphotericin B encapsulated by poly (ethylene oxide)-block–poly (N-

hexyl-l-aspartamide)-acyl conjugate micelles: effects of acyl chain length.

Journal of controlled release, v. 87, n. 1, p. 23-32, 2003. ISSN 0168-3659.

AKIMOV, A. V.; NEUKIRCH, A. J.; PREZHDO, O. V. Theoretical insights into

photoinduced charge transfer and catalysis at oxide interfaces. Chemical

reviews, v. 113, n. 6, p. 4496-4565, 2013. ISSN 0009-2665.

ALDEEK, F. et al. Enhanced photostability from CdSe (S)/ZnO core/shell

quantum dots and their use in biolabeling. European Journal of Inorganic

Chemistry, v. 2011, n. 6, p. 794-801, 2011. ISSN 1099-0682.

ALLEN, C.; MAYSINGER, D.; EISENBERG, A. Nano-engineering block copolymer

aggregates for drug delivery. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 16,

n. 1, p. 3-27, 1999. ISSN 0927-7765.

ANDO, M. et al. Cytotoxicity of CdSe-based quantum dots incorporated in

glass nanoparticles evaluated using human keratinocyte HaCaT cells.

Bioscience, biotechnology, and biochemistry, v. 80, n. 1, p. 210-213,

2016. ISSN 0916-8451.

BAE, Y. et al. Multifunctional polymeric micelles with folate-mediated

cancer cell targeting and pH-triggered drug releasing properties for active



_____________________________________________________________________________

intracellular drug delivery. Molecular BioSystems, v. 1, n. 3, p. 242-250,

2005.

BAGALKOT, V. et al. Quantum dot-aptamer conjugates for synchronous

cancer imaging, therapy, and sensing of drug delivery based on bi-

fluorescence resonance energy transfer. Nano letters, v. 7, n. 10, p. 3065-

3070, 2007. ISSN 1530-6984.

BERA, D. et al. Quantum dots and their multimodal applications: a review.

Materials, v. 3, n. 4, p. 2260-2345, 2010.

BOUKAMP, P. et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized

aneuploid human keratinocyte cell line. The Journal of cell biology, v. 106,

n. 3, p. 761-771, 1988. ISSN 0021-9525.

BRINKER, C. J.; SCHERER, G. W. Sol-gel science, 1990. The physics and

chemistry of sol–gel processing, 1990.

______. Sol-gel science: the physics and chemistry of sol-gel processing.

Academic press, 2013. ISBN 0080571034.

BRUS, L. E. A simple model for the ionization potential, electron affinity,

and aqueous redox potentials of small semiconductor crystallites. The

Journal of chemical physics, v. 79, n. 11, p. 5566-5571, 1983. ISSN 0021-

9606.

CAETANO, B. L. et al. In situ and simultaneous UV− vis/SAXS and UV−

vis/XAFS time-resolved monitoring of ZnO quantum dots formation and



_____________________________________________________________________________

growth. The Journal of Physical Chemistry C, v. 115, n. 11, p. 4404-4412,

2011. ISSN 1932-7447.

CAI, Y. et al. Synthesis, characterization and anti-cancer activity of Pluronic

F68–curcumin conjugate micelles. Drug delivery, p. 1-9, 2015. ISSN 1071-

7544.

CARRILLO-CARRIÓN, C. et al. Quantum dots luminescence enhancement due

to illumination with UV/Vis light. Chemical Communications, n. 35, p. 5214-

5226, 2009.

CHAKRAVARTHY, K. V. et al. Doxorubicin-conjugated quantum dots to target

alveolar macrophages and inflammation. Nanomedicine: Nanotechnology,

Biology and Medicine, v. 7, n. 1, p. 88-96, 2011. ISSN 1549-9634.

CHEN, G. et al. Transformation of Cell‐Derived Microparticles into Quantum‐

Dot‐Labeled Nanovectors for Antitumor siRNA Delivery. Angewandte Chemie

International Edition, v. 54, n. 3, p. 1036-1040, 2015. ISSN 1521-3773.

CHEN, J. et al. The synthesis and modification of CdTe/CdS core shell

quantum dots. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular

Spectroscopy, v. 151, p. 506-509, 2015. ISSN 1386-1425.

CHOUCAIR, A.; EISENBERG, A. Control of amphiphilic block copolymer

morphologies using solution conditions. The European Physical Journal E, v.

10, n. 1, p. 37-44, 2003. ISSN 1292-8941.



_____________________________________________________________________________

DABBOUSI, B. O. et al. (CdSe) ZnS core-shell quantum dots: synthesis and

characterization of a size series of highly luminescent nanocrystallites. The

Journal of Physical Chemistry B, v. 101, n. 46, p. 9463-9475, 1997. ISSN

1520-6106.

DEMAS, J. N.; CROSBY, G. A. Measurement of photoluminescence quantum

yields-Review. Journal of Physical Chemistry, v. 75, n. 8, p. 991, 1971.

ISSN 0022-3654.

DEYRIEUX, A. F.; WILSON, V. G. In vitro culture conditions to study

keratinocyte differentiation using the HaCaT cell line. Cytotechnology, v.

54, n. 2, p. 77-83, 2007. ISSN 0920-9069.

DING, H. et al. Non-invasive tumor detection in small animals using novel

functional Pluronic nanomicelles conjugated with anti-mesothelin antibody.

Nanoscale, v. 3, n. 4, p. 1813-1822, 2011.

DUAN, N. et al. A dual-color flow cytometry protocol for the simultaneous

detection of Vibrio parahaemolyticus and Salmonella typhimurium using

aptamer conjugated quantum dots as labels. Analytica chimica acta, v. 804,

p. 151-158, 2013. ISSN 0003-2670.

DUBERTRET, B. et al. In vivo imaging of quantum dots encapsulated in

phospholipid micelles. Science, v. 298, n. 5599, p. 1759-1762, 2002. ISSN

0036-8075.



_____________________________________________________________________________

FRASCO, M. F.; CHANIOTAKIS, N. Bioconjugated quantum dots as fluorescent

probes for bioanalytical applications. Analytical and bioanalytical

chemistry, v. 396, n. 1, p. 229-240, 2010. ISSN 1618-2642.

FU, Y.-S. et al. Stable aqueous dispersion of ZnO quantum dots with strong

blue emission via simple solution route. Journal of the American Chemical

Society, v. 129, n. 51, p. 16029-16033, 2007. ISSN 0002-7863.

GAO, X. et al. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor

quantum dots. Nature biotechnology, v. 22, n. 8, p. 969-976, 2004. ISSN

1087-0156.

GAO, X.; NIE, S. Quantum dot-encoded mesoporous beads with high

brightness and uniformity: rapid readout using flow cytometry. Analytical

chemistry, v. 76, n. 8, p. 2406-2410, 2004. ISSN 0003-2700.

GHASEMI, Y.; PEYMANI, P.; AFIFI, S. Quantum dot: magic nanoparticle for

imaging, detection and targeting. Acta Bio Medica Atenei Parmensis, v. 80,

n. 2, p. 156-165, 2009. ISSN 0392-4203.

GULIA, S.; KAKKAR, R. ZnO quantum dots for biomedical applications. Adv.

Mat. Lett, v. 4, n. 12, p. 876-887, 2013.

HAHN, M. A.; KENG, P. C.; KRAUSS, T. D. Flow cytometric analysis to detect

pathogens in bacterial cell mixtures using semiconductor quantum dots.

Analytical chemistry, v. 80, n. 3, p. 864-872, 2008. ISSN 0003-2700.



_____________________________________________________________________________

HAMAGUCHI, T. et al. NK105, a paclitaxel-incorporating micellar

nanoparticle formulation, can extend in vivo antitumour activity and reduce

the neurotoxicity of paclitaxel. British journal of cancer, v. 92, n. 7, p.

1240-1246, 2005. ISSN 0007-0920.

HAMMER, N. I.; EMRICK, T.; BARNES, M. D. Quantum dots coordinated with

conjugated organic ligands: new nanomaterials with novel photophysics.

Nanoscale Research Letters, v. 2, n. 6, p. 282-290, 2007. ISSN 1931-7573.

HE, L. et al. Highly luminescent and biocompatible near-infrared core–shell

CdSeTe/CdS/C quantum dots for probe labeling tumor cells. Talanta, v. 146,

p. 209-215, 2016. ISSN 0039-9140.

HEZINGER, A. F. E.; TEßMAR, J.; GÖPFERICH, A. Polymer coating of quantum

dots–a powerful tool toward diagnostics and sensorics. European Journal of

Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 68, n. 1, p. 138-152, 2008. ISSN

0939-6411.

HO, Y.-P.; LEONG, K. W. Quantum dot-based theranostics. Nanoscale, v. 2,

n. 1, p. 60-68, 2010.

HUANG, C.-L. et al. Application of paramagnetic graphene quantum dots as

a platform for simultaneous dual-modality bioimaging and tumor-targeted

drug delivery. Journal of Materials Chemistry B, v. 3, n. 4, p. 651-664,

2015.



_____________________________________________________________________________

ICHINOSE, N. Fluorometric analysis in biomedical chemistry: trends and

techniques including HPLC applications. Wiley-Interscience, 1991. ISBN

0471522589.

INNOCENZI, P. et al. Sol-gel reactions of 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane

in a highly basic aqueous solution. Dalton Transactions, n. 42, p. 9146-9152,

2009.

IOANNOU, D.; GRIFFIN, D. K. Nanotechnology and molecular cytogenetics:

the future has not yet arrived. Nano reviews, v. 1, 2010.

JANA, N. R.; EARHART, C.; YING, J. Y. Synthesis of water-soluble and

functionalized nanoparticles by silica coating. Chemistry of Materials, v. 19,

n. 21, p. 5074-5082, 2007. ISSN 0897-4756.

JANA, N. R. et al. Controlled photostability of luminescent nanocrystalline

ZnO solution for selective detection of aldehydes. Chemical

Communications, n. 14, p. 1406-1408, 2007.

JANOTTI, A.; VAN DE WALLE, C. G. Fundamentals of zinc oxide as a

semiconductor. Reports on Progress in Physics, v. 72, n. 12, p. 126501,

2009. ISSN 0034-4885.

JIMENEZ-GONZALEZ, A. E.; URUETA, J. A. S.; SUAREZ-PARRA, R. Optical and

electrical characteristics of aluminum-doped ZnO thin films prepared by

solgel technique. Journal of crystal growth, v. 192, n. 3, p. 430-438, 1998.

ISSN 0022-0248.



_____________________________________________________________________________

KABANOV, A. V.; BATRAKOVA, E. V.; MILLER, D. W. Pluronic® block

copolymers as modulators of drug efflux transporter activity in the blood–

brain barrier. Advanced drug delivery reviews, v. 55, n. 1, p. 151-164,

2003. ISSN 0169-409X.

KIM, S. et al. Type-II quantum dots: CdTe/CdSe (core/shell) and CdSe/ZnTe

(core/shell) heterostructures. Journal of the American Chemical Society,

v. 125, n. 38, p. 11466-11467, 2003. ISSN 0002-7863.

KONESWARAN, M.; NARAYANASWAMY, R. Ultrasensitive detection of vitamin

B6 using functionalised CdS/ZnS core–shell quantum dots. Sensors and

Actuators B: Chemical, v. 210, p. 811-816, 2015. ISSN 0925-4005.

KUMAR, R. et al. In vitro evaluation of theranostic polymeric micelles for

imaging and drug delivery in cancer. Theranostics, v. 2, n. 7, p. 714, 2012.

KUMARI, K. et al. Effect of surface passivating ligand on structural and

optoelectronic properties of polymer: CdSe quantum dot composites.

Journal of Physics D: Applied Physics, v. 41, n. 23, p. 235409, 2008. ISSN

0022-3727.

LAW, W.-C. et al. Optically and magnetically doped organically modified

silica nanoparticles as efficient magnetically guided biomarkers for two-

photon imaging of live cancer cells†. The Journal of Physical Chemistry C,

v. 112, n. 21, p. 7972-7977, 2008. ISSN 1932-7447.

LEE, H.; KIM, I.-K.; PARK, T. G. Intracellular trafficking and unpacking of

siRNA/quantum dot-PEI complexes modified with and without cell



_____________________________________________________________________________

penetrating peptide: confocal and flow cytometric FRET analysis.

Bioconjugate chemistry, v. 21, n. 2, p. 289-295, 2010. ISSN 1043-1802.

LEE, R.-S. et al. Passive targeting of thermosensitive diblock copolymer

micelles to the lungs: synthesis and characterization of poly (N-

isopropylacrylamide)-block-poly (ε-caprolactone). Journal of

nanobiotechnology, v. 13, n. 1, p. 42, 2015. ISSN 1477-3155.

LI, S. et al. ZnO Nanocomposites Modified by Hydrophobic and Hydrophilic

Silanes with Dramatically Enhanced Tunable Fluorescence and Aqueous

Ultrastability toward Biological Imaging Applications. Scientific reports, v.

5, 2015.

LIU, L. et al. Multimodal imaging probes based on Gd-DOTA conjugated

quantum dot nanomicelles. Analyst, v. 136, n. 9, p. 1881-1886, 2011.

______. Bioconjugated pluronic triblock-copolymer micelle-encapsulated

quantum dots for targeted imaging of cancer: in vitro and in vivo studies.

Theranostics, v. 2, n. 7, p. 705, 2012.

MANAIA, E. B. et al. Surface modified Mg-doped ZnO QDs for biological

imaging. European Journal of Nanomedicine, v. 7, n. 2, p. 109-120, 2015.

ISSN 1662-596X.

MARKOVIC, Z. M. et al. Graphene quantum dots as autophagy-inducing

photodynamic agents. Biomaterials, v. 33, n. 29, p. 7084-7092, 2012. ISSN

0142-9612.



_____________________________________________________________________________

MATSUMURA, Y. et al. Phase I clinical trial and pharmacokinetic evaluation

of NK911, a micelle-encapsulated doxorubicin. British journal of cancer, v.

91, n. 10, p. 1775-1781, 2004. ISSN 0007-0920.

MI, Y.; LIU, Y.; FENG, S.-S. Formulation of docetaxel by folic acid-conjugated

d-α-tocopheryl polyethylene glycol succinate 2000 (Vitamin E TPGS 2k)

micelles for targeted and synergistic chemotherapy. Biomaterials, v. 32, n.

16, p. 4058-4066, 2011. ISSN 0142-9612.

MIRET, S.; DE GROENE, E. M.; KLAFFKE, W. Comparison of in vitro assays of

cellular toxicity in the human hepatic cell line HepG2. Journal of

biomolecular screening, v. 11, n. 2, p. 184-193, 2006. ISSN 1087-0571.

MOGHADDAM, E. et al. Preparation of surface-modified ZnO quantum dots

through an ultrasound assisted sol–gel process. Applied Surface Science, v.

346, p. 111-114, 2015. ISSN 0169-4332.

MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:

application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of

immunological methods, v. 65, n. 1-2, p. 55-63, 1983. ISSN 0022-1759.

MOUSSODIA, R.-O. et al. Biocompatible and stable ZnO quantum dots

generated by functionalization with siloxane-core PAMAM dendrons. Journal

of Materials Chemistry, v. 20, n. 6, p. 1147-1155, 2010.

MOUSSODIA, R.-O.; BALAN, L.; SCHNEIDER, R. Synthesis and characterization

of water-soluble ZnO quantum dots prepared through PEG-siloxane coating.

New Journal of Chemistry, v. 32, n. 8, p. 1388-1393, 2008.



_____________________________________________________________________________

NEDELIJKOVIC, J. M. et al. Synthesis and optical properties of quantum-

sized metal sulfide particles in aqueous solution. Journal of chemical

education, v. 70, n. 4, p. 342, 1993. ISSN 0021-9584.

NEUBERG, P. et al. Photopolymerized micelles of diacetylene amphiphile:

physical characterization and cell delivery properties. Chemical

Communications, v. 51, n. 58, p. 11595-11598, 2015.

PATHAKOTI, K. et al. In vitro cytotoxicity of CdSe/ZnS quantum dots with

different surface coatings to human keratinocytes HaCaT cells. Journal of

Environmental Sciences, v. 25, n. 1, p. 163-171, 2013. ISSN 1001-0742.

PENG, L. et al. Cellular uptake, elimination and toxicity of CdSe/ZnS

quantum dots in HepG2 cells. Biomaterials, v. 34, n. 37, p. 9545-9558,

2013. ISSN 0142-9612.

PESIKA, N. S. et al. Quenching of growth of ZnO nanoparticles by adsorption

of octanethiol. The Journal of Physical Chemistry B, v. 106, n. 28, p. 6985-

6990, 2002. ISSN 1520-6106.

PREZHDO, O. V. Photoinduced dynamics in semiconductor quantum dots:

insights from time-domain ab initio studies. Accounts of chemical research,

v. 42, n. 12, p. 2005-2016, 2009. ISSN 0001-4842.

PROSHCHENKO, V.; DAHNOVSKY, Y. Long-lived emission in Mn doped CdS,

ZnS, and ZnSe diluted magnetic semiconductor quantum dots. Chemical

Physics, v. 461, p. 58-62, 2015. ISSN 0301-0104.



_____________________________________________________________________________

QIAN, L. et al. Stable and efficient quantum-dot light-emitting diodes based

on solution-processed multilayer structures. Nature photonics, v. 5, n. 9, p.

543-548, 2011. ISSN 1749-4885.

QIU, L. Y.; BAE, Y. H. Polymer architecture and drug delivery.

Pharmaceutical research, v. 23, n. 1, p. 1-30, 2006. ISSN 0724-8741.

QU, L.; PENG, Z. A.; PENG, X. Alternative routes toward high quality CdSe

nanocrystals. Nano Letters, v. 1, n. 6, p. 333-337, 2001. ISSN 1530-6984.

REISS, P.; PROTIERE, M.; LI, L. Core/shell semiconductor nanocrystals. small,

v. 5, n. 2, p. 154-168, 2009. ISSN 1613-6829.

ROSSETTI, R. et al. Size effects in the excited electronic states of small

colloidal CdS crystallites. SPIE milestone series, v. 180, p. 75-80, 2005.

ISSN 1050-0529.

SAHAI, A.; GOSWAMI, N. Probing the dominance of interstitial oxygen defects

in ZnO nanoparticles through structural and optical characterizations.

Ceramics International, v. 40, n. 9, p. 14569-14578, 2014. ISSN 0272-8842.

SAHU, A. et al. Encapsulation of curcumin in Pluronic block copolymer

micelles for drug delivery applications. Journal of biomaterials

applications, v. 25, n. 6, p. 619-639, 2011. ISSN 0885-3282.

SAMIR, T. M. et al. Quantum dots: heralding a brighter future for clinical

diagnostics. Nanomedicine, v. 7, n. 11, p. 1755-1769, 2012. ISSN 1743-5889.



_____________________________________________________________________________

SHARMA, A. et al. Effect of surface groups on the luminescence property of

ZnO nanoparticles synthesized by sol–gel route. Surface Science, v. 606, n.

3, p. L13-L17, 2012. ISSN 0039-6028.

SMITH, A. M. et al. Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and

cellular imaging. Advanced drug delivery reviews, v. 60, n. 11, p. 1226-

1240, 2008. ISSN 0169-409X.

SPANHEL, L.; ANDERSON, M. A. Semiconductor clusters in the sol-gel process:

quantized aggregation, gelation, and crystal growth in concentrated zinc

oxide colloids. Journal of the American Chemical Society, v. 113, n. 8, p.

2826-2833, 1991. ISSN 0002-7863.

SUDIMACK, J.; LEE, R. J. Targeted drug delivery via the folate receptor.

Advanced drug delivery reviews, v. 41, n. 2, p. 147-162, 2000. ISSN 0169-

409X.

TALAPIN, D. V. et al. Highly luminescent monodisperse CdSe and CdSe/ZnS

nanocrystals synthesized in a hexadecylamine-trioctylphosphine oxide-

trioctylphospine mixture. Nano letters, v. 1, n. 4, p. 207-211, 2001. ISSN

1530-6984.

TOKUMOTO, M. S. et al. SAXS study of the kinetics of formation of ZnO

colloidal suspensions. Journal of non-crystalline solids, v. 247, n. 1, p. 176-

182, 1999. ISSN 0022-3093.



_____________________________________________________________________________

TYAGI, N. et al. Development and characterization of a novel in vitro

progression model for UVB-induced skin carcinogenesis. Scientific reports, v.

5, 2015.

VASUDEVAN, D. et al. Core–shell quantum dots: Properties and applications.

Journal of Alloys and Compounds, v. 636, p. 395-404, 2015. ISSN 0925-

8388.

WANG, C.; GAO, X.; SU, X. In vitro and in vivo imaging with quantum dots.

Analytical and bioanalytical chemistry, v. 397, n. 4, p. 1397-1415, 2010.

ISSN 1618-2642.

WANG, L. et al. Water-soluble ZnO–Au nanocomposite-based probe for

enhanced protein detection in a SPR biosensor system. Journal of colloid

and interface science, v. 351, n. 2, p. 392-397, 2010. ISSN 0021-9797.

WANG, Y.; ZHANG, Y.; ZHANG, W. First-principles study of the halide-

passivation effects on the electronic structures of CdSe quantum dots. RSC

Advances, v. 4, n. 37, p. 19302-19309, 2014.

WEI, Z. et al. Paclitaxel-loaded Pluronic P123/F127 mixed polymeric

micelles: formulation, optimization and in vitro characterization.

International journal of pharmaceutics, v. 376, n. 1, p. 176-185, 2009.

ISSN 0378-5173.

WEISSLEDER, R. et al. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent

attachment of small molecules. Nature biotechnology, v. 23, n. 11, p. 1418-

1423, 2005. ISSN 1087-0156.



_____________________________________________________________________________

WU, X. et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other

cellular targets with semiconductor quantum dots. Nature biotechnology, v.

21, n. 1, p. 41-46, 2003. ISSN 1087-0156.

WU, Y. L. et al. Surface modification of ZnO nanocrystals. Applied Surface

Science, v. 253, n. 12, p. 5473-5479, 2007. ISSN 0169-4332.

XIAO, J. et al. Effect of ZnO# ZnS QDs heterojunctures on the stilbenes–

plasma proteins interactions. Molecular BioSystems, v. 7, n. 8, p. 2452-

2458, 2011.

XIONG, G.; PAL, U.; SERRANO, J. G. Correlations among size, defects, and

photoluminescence in ZnO nanoparticles. Journal of Applied Physics, v.

101, n. 2, p. 024317, 2007. ISSN 0021-8979.

YU, W. W. et al. Experimental determination of the extinction coefficient of

CdTe, CdSe, and CdS nanocrystals. Chemistry of Materials, v. 15, n. 14, p.

2854-2860, 2003. ISSN 0897-4756.

YUAN, Q.; HEIN, S.; MISRA, R. D. K. New generation of chitosan-encapsulated

ZnO quantum dots loaded with drug: synthesis, characterization and in vitro

drug delivery response. Acta biomaterialia, v. 6, n. 7, p. 2732-2739, 2010.

ISSN 1742-7061.

ZHANG, J. et al. Cd-doped ZnO quantum dots-based immunoassay for the

quantitative determination of bisphenol A. Chemosphere, v. 95, p. 105-110,

2014. ISSN 0045-6535.



_____________________________________________________________________________

ZHANG, L.; YU, K.; EISENBERG, A. Ion-induced morphological changes in"

crew-cut" aggregates of amphiphilic block copolymers. Science, v. 272, n.

5269, p. 1777, 1996. ISSN 0036-8075.

ZHANG, W. et al. Multifunctional Pluronic P123/F127 mixed polymeric

micelles loaded with paclitaxel for the treatment of multidrug resistant

tumors. Biomaterials, v. 32, n. 11, p. 2894-2906, 2011. ISSN 0142-9612.

ZHANG, Y. et al. Evodiamine induces tumor cell death through different

pathways: apoptosis and necrosis. Acta Pharmacol Sin, v. 25, n. 1, p. 83-89,

2004.

ZHAO, D. et al. Luminescent ZnO quantum dots for sensitive and selective

detection of dopamine. Talanta, v. 107, p. 133-139, 2013. ISSN 0039-9140.

ÖZGÜR, Ü. et al. A comprehensive review of ZnO materials and devices.

Journal of applied physics, v. 98, n. 4, p. 041301, 2005. ISSN 0021-8979.

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