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Universidade Federal de GoiásInstituto de Ciências BiológicasDepartamento de Morfologia

Disciplina: Biologia Celular

MÉTODOS DE ESTUDO DAS CÉLULAS

Profa. Mara Rubia Marques

2010

MICROSCOPIA

Microscópio é um instrumento que produz imagensampliadas de objetos de tal ordem pequenos que nãopodem ser vistos a olho nu.

Tipos de microscopia:

Microscopia de Luz - o espécime é atravessado por feixes de luz.

Microscopia Eletrônica - o espécime é atravessado por elétrons.

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PODER DE RESOLUÇÃO

0,2 µm

Menor distância entre duas partículas para que sejam vistas como unidades separadas.

3 nm

ML MET

PODER DE RESOLUÇÃO

Célula animal típica: 10 a 20 µm(1/5 da menor partícula visível a olho nu).

1 cm = 10-2 m1 mm = 10-3 m1µm = 10-6 m1 nm = 10-9 m1 Å = 10-10 m

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MICROSCÓPIO ELETRÔNICO

• Varredura • Transmissão

MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA

http://universoemequilibrio.blogspot.com/2009_02_01_archive.html

http://www.ufmt.br/bionet/conteudos/01.09.04/varredura.htm

É uma técnica que permite avisualização das superfícies deespécimes não seccionados. A amostraé fixada, dessecada e revestida com acamada fina de um metal pesado. Amicrografia obtida tem um aspectotridimensional.

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MICROSCÓPIO ELETRÔNICO

DE TRANSMISSÃO

MICROSCOPIA DELUZ

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1 – Condensadora

2 – Objetiva

3 – Ocular

4 – Fonte luminosa

5 – Platina

6 – Charriot

7 – Macro e micromanipuladores4

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MICROSCÓPIO DE LUZ MODERNO

Várias lentes na objetiva e na ocular

MODALIDADES DE OBSERVAÇÃO NA MICROSCOPIA DE LUZ

1. Campo claro 2. Campo escuro 3. Contraste de fase 4. Contraste interferencial 5. Polarização 6. Fluorescência 7. Microscópio invertido 8. Microscópio estereoscópico (lupa) 9. Confocal a laser

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Campo claro Campo Escuro

A luz atravessa o material analisado. Um sistema especial de condensadorfaz com que a luz fique de tal formainclinada que não atravessa omaterial. Apenas os feixes desviadospelo objeto são observados.

Contraste de fase Contraste Interdiferencial(Normarski)

Anéis na lente condensadora eobjetivas promovem retardo ópticono caminho do feixe luminoso.

Prismas ópticos no caminho da luzmodificam a fase de onda luminosa.

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Polarização

Côndilo mandibular e disco articular. Corante: Picrossírus

Dois filtros (polarizador e analisador) que selecionam apenas um plano de direção de vibração da luz: plano de luz polarizada (PPL).

Fluorescência

Células cancerosas coradas com Orange deacridina.

RNA – vermelhoDNA - amarelo

As substâncias absorvem a luz emum comprimento de onda eemitem luz com comprimentosmaiores.•Fonte luminosa: luz de mercúrio•Filtros: De excitação / barragem.

Componentes autofluorescentes:colageno, lignina, clorofila,elastina.Fluorocromos – permitem

localização de estruturas.

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Confocal a laser

Cortesia de M. F. Santos

Microscópio invertido

O microscópio invertido tem o sistema de iluminação acima do estágio e o sistema de lentesembaixo. Permitem a visualização através de espécimes espessos, como placas de cultivo decélulas, pela proximidade da lente ao fundo da placa.

Sans e Quevedo, 2007

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Microscópio estereoscópico

Observação de objetos opacos por onde a luz não passa, tais como: cristais, fósseis e moedas.

TIPOS DE PREPARO HISTOLÓGICOTIPOS DE PREPARO HISTOLÓGICO

Preparos a fresco (temporário) – vantagens / desvantagens

Preparos permanentes – vantagens / desvantagens.

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1. COLETA DO MATERIAL 2. FIXAÇÃO3. DESIDRATAÇÃO4. DIAFANIZAÇÃO5. INCLUSÃO/EMBEBIÇÃO6. MICROTOMIA7. COLORAÇÃO

TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE ESTUDO

TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE ESTUDO

http://www.icb.ufmg.br/mor/biocelch/metodos_estudo/Figura%202.jpg

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COLETACOLETA

Tipos de coleta: Biópsia cirúrgica

Biópsia endoscópica

Biópsia por agulha

Cirurgias amplas

Necrópsia

Tamanho do material: A amostra deve ser fragmentada a fim de permitir

a penetração do fixador por toda sua extensão. De 0,5 a 1 cm.

FIXAÇÃO FIXAÇÃO

A fim de conservar as células ou tecidos no estado em que se

encontravam em vida. O volume do fixador deve ser no mínimo 10X o

volume do material fixado.

Qualidades dos fixadores:

1. Alto poder de penetração

2. Manter as características do tecido e conservar os detalhes estruturais

da célula

3. Favorecer a observação das estruturas

4. Conservar ou aumentar a afinidade dos tecidos pelos corantes.

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FIXAÇÃOFIXAÇÃO

• Formol 10% – fixador mais comum na MO.

Tempo de fixação: conforme tamanho e natureza da peça. Em geral de

12 a 24 horas.

PROCESSAMENTO PROCESSAMENTO

Inclusão da amostra em um material que permita a realização de cortes

finos desta amostra. Geralmente em Parafina ou seus derivados.

- Desidratação ( Álcool)

- Diafanização (Xilol)

- Inclusão (parafina líquida a 58-600C)

ÁLCOOL

DESIDRATAÇÃO

XILOL

DIAFANIZAÇÃO

PARAFINA

INCLUSÃO

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MICROTOMIAMICROTOMIA

Micrótomo rotativo tipo Minot Espessura de 3 a 7 µm

CONFECÇÃO DE CORTES HISTOLÓGICOSCONFECÇÃO DE CORTES HISTOLÓGICOS

Distensão do corte em água fria

Distensão do corte em água quente ±400 C

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PROCESSAMENTO PARA COLORAÇÃOPROCESSAMENTO PARA COLORAÇÃO

1. DESPARAFINIZAÇÃO: Retirada da parafina do material

•Xilol I ... 20 min

• Xilol II ... 20 min

• Xilol III ... 20min

2. HIDRATAÇÃO

• Álcool a 100% I ... 1 min

• Álcool a 100% II ... 1 min

• Álcool a 100% III ... 1 min

• Álcool a 95% ... 1 min

• Álcool a 70% ... 1 min

• Álcool a 50% ... 1 min

• Dois banhos em água destilada de 05 min cada.

PROCESSAMENTO PARA COLORAÇÃOPROCESSAMENTO PARA COLORAÇÃO

3. COLORAÇÃO

Hematoxilina e eosina (HE) é o corante de rotina

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4. MONTAGEM DA LÂMINA

• Álcool a 95% ... 1 min

• Álcool a 100% I ... 1 min

• Álcool a 100% II ... 1 min

• Álcool a 100% III ... 1 min

• Xilol I ... 1 min

• Xilol II ... 1 min

• Xilol III ... 1 min – iniciar a montagem.

• Proteção por Lamínulas de vidro

• Meios de montagem: Bálsamo do canadá, Permount, Entelan

PROCESSAMENTO PARA COLORAÇÃOPROCESSAMENTO PARA COLORAÇÃO

CULTURA DE CÉLULAS

Forma de estudo das células mantendo-as isoladas, fora do

organismo de origem, sem perder suas características naturais.

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CULTURA DE CÉLULAS

Cultura primária – tecidos obtidos diretamente do animal e tratados com

enzimas (tripsina) que dissocia as células que serão cultivadas em placas com

meio de cultivo especial.

Cultura secundária – obtida de uma cultura primária tratada enzimaticamente e

cultivada em outra placa.

Linhagem celular – As células podem proliferar indefinidamente devido às

características cancerosas. Linhagens amplamente usadas:

HeLa – obtida a partir de carcinoma humano

L – embrião de rato

3T3 - embrião de rato

BHK – rim de Hamster reçém nascido

CHO – ovário de Hamster adulto

TIPOS DE CULTIVO CELULAR

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CITOQUÍMICA

Usada para identificar, in situ, diferentes compostos químicos das células.

Reações químicas ajudam a mostrar estruturas intracelulares com colorações

específicas. Podem ser usadas amostras frescas.

Colorações mais usadas:

Azul da prússia – identificação de ferro (ferritina/hemossiderina)

Peroxidase – detecção da enzima mieloperoxidase distinção entre células de

origem mielóide e linfóide.

Sudan Black B – revelação de lipídios

Ácido Reativo de Schiff (PAS) – evidenciação de carboidratos

Fosfatase alcalina – neutrófilos maduros, osso, fígado, rins, placenta. Ajuda a

determinar a atividade da célula.

Hemossiderina evidenciada por Azul da Prússia (Pearls)

Células tumorais (*Astrócitos).

http://anatpat.unicamp.br/nptganglioglioma7a.html

Células sanguíneas

Peroxidase evidenciada em neutrófilos

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Leucemia crônica

Lipídios evidenciados por Sudan Black

Glândulas intestinais

Carbohidratos evidenciados por PAS

Osso

Evidenciação de ions cálcio

Músculo esquelético

Evidenciação de mATPase

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http://fotos.sapo.pt/tw3PfHMLey2fi8BjuDAT

Raiz de cebola

Evidenciação DNA por Feulgen

Peciolo de Geranium dissectum

Fluorescência natural da clorofilawww.milcores.pt

Uso de anticorpos acoplados a marcadores visíveis ao microscópio.

• HIQ direta• HIQ indireta

Receptor de laminina

Desmina

IMUNOCITOQUÍMICA

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FRACIONAMENTO CELULAR E

MOLECULAR

Frações:

1. Nuclear – núcleos e citoesqueleto2. Mitocondrial – mitocôndrias, peroxissomos, lisossomos3. Microssômica – RE, CG, membranas4. Solúvel – ribossomos, macromoléculas, vírus

(ultracentrífuga analítica)

ULTRACENTRIFUGAÇÃO ANALÍTICA

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ELETROFORESE

Separação de moléculas por diferençade potencial.

Gel de AgaroseGel de Poliacrilamida

Visualização com brometo de etídio.

CROMATOGRAFIA

Método físico-químico de separação de proteínas.Baseia-se na migração diferencial dos componentes de uma mistura entre umafase fixa (papel filtro, resinas carregadas, líquido depositado num sólido inerte)e outra móvel (solvente).

Maior quantidade de proteínasMenor pureza

Tipos:Cromatografia de filtração por gelCromatografia de intercâmbio iônicoCromatografia de afinidade.