Métodos aplicados para -caroteno

Dra. Paz Robert C.

Universidad de ChileFacultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas

Dpto. Ciencia de los Alimentos y Tecnología QuímicaQuímica de Alimentos y Materias Grasas

Taller FAO, 2008

Estructura básica

• Tetraterpeno de 40 carbonos, simétrico y lineal formado a partir de 8 unidades isoprenoides de 5 C unidas de manera tal que el orden se invierte en el centro.

• Amplio sistema de doble enlace conjugado.

Análisis de Carotenoides

-carotenoProvitamina A

Provitamina ACarotenos principales

Composición completa

Dependiendo del grado de información deseado

Características espectrales

Caroteno Solvente max1%A1 cm

-caroteno Acetona (429) 452 478 -

cloroformo (435) 461 485 2396

etanol (425) 450 478 2620

hexano (425) 450 477 2592

Espectro de absorción de carotenoides son dependientes del solvente

1%A1cm usado en el cálculo de la concentración también varía marcadamente con el solvente

Carotenoides en solución obedecen la Ley de Lambert-Beer. Su absorbancia es directamente proporcional a la concentración.Britton, 1995; Rodriguez-Amaya. 2001

TRANS CAROTENO

EPOXICAROTENOSAPOCAROTENOS

COMPUESTOS DEBAJO PESO MOLECULAR

CIS-CAROTENOS

oxidaciónisomerización

oxidación

POSIBLE ESQUEMA DE DEGRADACIÓN DE CAROTENOS

Pérdida de color

Pérdida valor nutritivo

Pérdida de sabor

Moléculas altamente insaturadas

... Isomerización cis• causa leve pérdida de color, disminución

de 2 a 6 nm en la , aparición de un pick en la región UV

15-cis

13-cis

transLicopeno

Procedimiento Analítico

• Muestreo y preparación de la muestra• Extracción con acetona en frio• Transferencia (partición) a éter de petróleo,

hexano, eter etílico• Saponificación y lavado• Concentración en evaporador rotatorio

(<35°C)• Separación cromatográfica• Identificación y cuantificación.

Muestreo y preparación de la muestra.

1. Homogenización de la materia prima

2. Extracción con acetona en frío

Partición a éter de petróleo

Separación OCC FM: porcentajes crecientes de acetona en éter de petróleo

MgO : Celite (1:1)

Espectro de absorción UV/VIS, Rf, orden de elución cromatográfica reacciones específicas.

Fases Estacionarias-OCC

• Alúmina• Sílica• CaCO3

• Ca(OH)2

• MgO• ZnCO3

• Tierras silíceas (tierra de diatomeas, kieselguhr, hyflosupercel)

• Celulosa, almidón, dextran cross-linked (sephadex), Polietilen

• Mezclas de ellos

Rodriguea-Amaya, 2001

Criterios de identificación OCC

Espectro de absorción UV-Vis de acuerdo con el cromóforo sugerido

Propiedades cromatográficas concordantes en dos sistemas diferentes. Orden de salida OCC y Rf(TLC).

•Estructura fina del espectro (%III / II)*100

Britton, 1995

Espectro de absorción max

• zeinoxantina 421 445 474 • -criptoxantina 421 445 475

• Luteina 421 445 475

-criptoxantina (425) 449 476

zeaxantina (424) 449 476

Espectro de absorción max

Métodos Oficiales AOAC

• Carotenos en plantas frescas Ch-45 (941.15) /método espectrofotométrico.

• Carotenos y xantofilas en plantas secas y alimentos mezclados Ch-45 (970.64)/ método espectrofotométrico

• Carotenos y carotenoides en productos de macaroni Ch-32 (938.04)

• Carotenos y carotenoides en huevos Ch-32 (938.04)

Carotenos en plantas frescas

• Pigmentos solubles en grasa, extraídos y cromatografiados para remover clorofilas e hidroxicarotenos, los cuales son determinados espectrofotométricamente y expresados como beta-caroteno

MUESTRA

• Extracción• Acetona

/hexano (40+60)

COLUMNA

• Elución• acetona:hex

ano (1+9)

MgO:hyflosupersel (1:1)

Carotenos y xantofilas en plantas secas y alimentos mezclados

Muestra aguaHexano-acetona-etanol

absoluto-tolueno (10+7+6+7)

Saponificación en caliente

Saponificación en frío

Silica gel G+hyflosupersel (1:1)

Carotenos •Hexano:acetona (96+4), 436 nm

MHC•Hexano:acetona (90+10) 474 nm•Zeinoxantina, criptoxantina

DHC•Hexano:acetona (80+20) 474 nm•Luteina, zeaxantina

xantofilas •Hexano;acetona:metanol (80:10:10)•Violaxantina, neoxantina, otros

MgO:hyflosupersel (1:1)

Carotenos

• Hexano:acetona (90+10)

Total xantofilas

• Hexano;acetona:metanol (80:10:10)

Separación-HPLC

Fase inversa-Fases enlazadas RP-18 ó C18

RP-8 ó C8

C-30

Ntrilo, amino

Fase Inversa-HPLCColumnas enlazadas RP-18: Aplicable a carotenoides de todos los niveles de polaridad.Materiales RP son inertes, formación de artefactos es mínima.Se puede trabajar en elusión con gradiente

Separación-HPLC

Fase Normal• Sílice

compuestos son eluídos de acuerdo a su polaridad, útil para separación de xantofilas, los carotenos son pobremente resueltos• Alúmina, Ca(OH)2

Para algunas separaciones especiales. Presentan dificultades prácticas: tienen una vida corta y necesitan un control riguroso de humedad

Fase NormalCa(OH)2

AlúminaSílice

Criterios de identificación-HPLC

Tiempos de retención tr

Tiempo de retención relativo TRR = tr,i / tr,st

Adición a la muestra del componente supuesto: normalmente se agrega a la muestra, el supuesto componente i y se ve cual pico crece.

Correlaciones gráficas de estructura -retención

Criterios de identificación HPLC

Espectro de absorción UV-Vis de acuerdo con el cromóforo sugerido

Propiedades cromatográficas concordantes en dos sistemas diferentes.

Espectro de masas que confirme por lo menos la masa molecular.

CuantificaciónCurva de calibración

Comparación con muestras de concentración conocida

Cs/Cst = As/Ast

Standard Interno

Fi (Ci/Cst) = (Ast/Ai)

Características espectrales de carotenoides identificados

Fracción Fase movil Identificación Rf**

1 5% acetona (426) 448 476 B-Caroteno 0,98 (425) 450 4772 10% acetona (422) 444 472 Zeinoxantina 0,43 421 445 4753 20%acetona 450 Apocarotenal prob. 0,984 30-40% acetona (424) 442 468 Anteroxantina prob 0,19 (422) 445 4725 60% acetona (422) 442 472 Luteína 0,19 (421) 445 474

zeaxantina (424) 449 4766 100% acetona 432 458 488 Rubixantina 0,52 434 460 4907 10% agua-acetona 442 468 500 Licopeno 0,98 444 470 502

* Davies, 1976; Rodriguez-Amaya, 1999

** Placa de sílice, FM metanol 5% en benceno

Máx long de onda Máx long de ondaLiteratura*

Rosa mosqueta (Rosa Rubiginosa)

HPLC (Rosa Mosqueta)

Columna: RP-18 symmetry, 5u, 250 mmFase móvil: acetonitrilo: metanol: acetato de etilo (65: 20: 15)Flujo: 1ml/min

-caroteno

Licopeno

Rubixantina

Tomate Zanahoria

Identificación por Trr con patrones extraídos.