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MÉTODOS ANALÍTICOS NA DETERMINAÇÃO DE

POLIFENÓIS EM FRUTOS

Edgar Pinto1,2

1 Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, Porto, Portugal

2 Escola Superior de Saúde do Instituto Politécnico do Porto, Porto, Portugal

1. INTRODUÇÃO

As plantas produzem um vasto número de metabolitos durante o seu ciclo de vida. Estes

metabolitos podem ser divididos em primários e secundários. Os metabolitos primários

são aqueles que têm um papel vital e estão normalmente associados à fotossíntese,

respiração, crescimento e desenvolvimento da planta. Neste grupo incluem-se os hidratos

de carbono, lípidos, nucleótidos, aminoácidos e vários outros ácidos orgânicos. Os

metabolitos secundários não são essenciais ao crescimento e desenvolvimento das

plantas, mas estão frequentemente envolvidos na adaptação destas às condições

ambientais (Nascimento e Fett-Neto, 2010).

Os polifenóis são uma das principais famílias de metabolitos secundários nas plantas.

Esta família inclui um vasto número de compostos de distinta estrutura química e

reatividade, variando entre compostos de estrutura simples como os ácidos fenólicos, até

estruturas altamente polimerizadas como os taninos condensados. Até ao momento, estão

descritos cerca de 8000 polifenóis, sendo os grupos mais representativos desta grande

família os ácidos fenólicos, os flavonóides, os estilbenos e as ligninas (Manach et al.,

2004; Pandey e Rizvi, 2009).

Nos últimos anos vários métodos têm sido propostos para extrair e quantificar os

polifenóis nas mais diversas matrizes. Nesta comunicação serão revistos os principais

métodos de determinação dos polifenóis em frutos. Os passos mais importantes

(preparação da amostra, extração, identificação e quantificação dos polifenóis) serão alvo

de discussão. As novas tendências nesta área de investigação serão também abordadas.

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2. POLIFENÓIS

Os polifenóis (também denominados compostos fenólicos) são um grupo de metabolitos

secundários das plantas que atuam principalmente na defesa destas contra fatores de stress

biótico e abiótico (Ramakrishna e Ravishankar, 2011). Até ao momento, mais de 8000

compostos foram já identificados em várias espécies de plantas. Todos os polifenóis

presentes nas plantas têm uma origem comum, isto é, todos derivam da fenilalanina, ou

do seu precursor, o ácido chiquímico. Os polifenóis ocorrem principalmente na sua forma

conjugada, com um ou mais açucares ligados a grupos hidroxilo (Manach et al., 2004;

Fraser e Chapple, 2011).

Os polifenóis podem ser classificados em diferentes classes de acordo com dois critérios:

(1) o número de anéis fenol existentes na sua estrutura e (2) os elementos que ligam esses

anéis. Como já referido, as principais classes de polifenóis são os ácidos fenólicos, os

flavonóides, os estilbenos e as ligninas (Figura 1). Além destes, podem também estar

presentes nas plantas polifenóis de estrutura mais complexa, onde se incluem os taninos

hidrolisáveis e condensáveis (Manach et al., 2004; Pandey e Rizvi, 2009).

Os ácidos fenólicos são uma classe de compostos que estão amplamente presentes no

reino vegetal. Dividem-se em ácidos hidroxibenzóicos e ácidos hidroxicinâmicos de

acordo a sua estrutura química. Os ácidos hidroxibenzóicos são compostos de estrutura

C6-C1. São exemplos os ácidos gálico, protocatecuico e vanílico. Os ácidos

hidroxicinâmicos têm uma estrutura C6-C3. São exemplos os ácidos cafeico, p-cumárico

e ferúlico. Os ácidos fenólicos raramente estão presentes nas plantas na forma livre,

encontrando-se geralmente ligados por ligações éster, éter ou acetal a componentes

estruturais da planta (celulose, proteínas, lignina), a outros polifenóis (ex. flavonóides)

ou a outras moléculas (ex. glucose, ácidos orgânicos) (Pandey e Rizvi, 2009; Ignat et al.,

2011).

Os flavonóides constituem a maior e mais diversa classe de polifenóis nas plantas. Estes

compostos desempenham um papel importante em vários processos fisiológicos da

planta, tais como pigmentação e proteção contra a radiação UV (Perez-Jimenez et al.,

2010; Ramakrishna e Ravishankar, 2011).

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Figura 1 – Principais grupos de polifenóis encontrados nas plantas

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Os flavonóides são compostos caracterizados pela sua estrutura C6-C3-C6 em que um anel

heterocíclico pirânico (C) une dois anéis fenólicos (A e B) (Figura 2). As modificações

estruturais do anel central C estão na origem das diferentes famílias de compostos,

incluindo, como já referido, os flavonóis, as flavanonas, as flavonas, os flavanóis, as

antocianinas e as isoflavonas (Valls et al., 2009).

Figura 2 – Estrutura básica de um flavonóide

Os flavonóis e os flavanóis encontram-se amplamente distribuídos na natureza. Os

flavonóis incluem uma grande diversidade de compostos, muito devido à modificação

enzimática da sua estrutura, isto é, alguns grupos hidroxilo são frequentemente metilados,

acetilados, prenilados ou sulfurados, dando origem a compostos com propriedades

biológicas bastante distintas. Estes compostos estão maioritariamente presentes nas

plantas na forma glicosilada (Fraser e Chapple, 2011).

Os flavanóis podem estar presentes nos frutos como monómeros, oligómeros e mesmo na

forma de polímeros. Apresentam elevados graus de hidroxilação dos anéis A e B e a

terceira posição do anel heterocíclico C está normalmente ligada a um grupo hidroxilo, o

qual, por sua vez, pode estar esterificado com ácido gálico. Os monómeros flavanóis mais

comuns são a catequina, a epicatequina, a catequina galato e a epicatequina galato (Valls

et al., 2009). Os oligómeros dos flavanóis, denominados proantocianidinas, são

classificados em procianidinas e prodelfinidinas, consoante a sua origem.

Proantocianidinas altamente polimerizadas são conhecidas por taninos condensados e são

o segundo grupo de polifenóis mais abundante na natureza (Monagas et al., 2010).

As flavonas compreendem um grupo de compostos com várias substituições nos anéis A

e B da estrutura básica dos flavonóides, um grupo carbonil em C4 e uma dupla ligação

em C2-C3 do anel C. Nos frutos, principalmente nos citrinos, estes compostos estão

maioritariamente presentes na forma glicosilada (Gattuso et al., 2007). Nestes frutos estão

também presente flavonas polimetoxiladas, constituindo um grupo muito importante de

flavonóides (Zhang et al., 2012).

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As isoflavonas diferem dos outros flavonóides em termos de estrutura química,

especificamente na posição do anel B, que se encontra ligado ao C3 do anel C ao contrário

dos restantes flavonóides onde a ligação é feita ao C2 do anel C (Figura 1). As isoflavonas

mais conhecidas são as que se encontram presentes na soja: a genisteína e a daidzeína

(Valls et al., 2009).

As flavanonas são compostos muito semelhantes às flavonas em termos estruturais. As

duas principais diferenças são a ausência da ligação dupla C2-C3 e a presença de um centro

quiral em C2 no anel C. Nos frutos, as flavanonas encontram-se principalmente na sua

forma glicosilada. Os citrinos apresentam uma elevada diversidade deste grupo de

compostos (Khan et al., 2014).

As antocianinas são compostos formados pela ligação de uma aglicona (a antocianidina),

responsável pela cor da planta, a um ou mais O-glicosídeos. A valores de pH inferior a 3

as antocianinas apresentam-se na forma catiónica (cor vermelha) enquanto a valores de

pH superiores a 6 se apresentam na sua forma quinonoidal (cor azul). As principais

diferenças entre as antocianinas são: (1) o número de grupos hidroxilo na sua estrutura;

(2) a natureza e o número de açúcares que entram na sua composição; (3) o tipo de ligação

(ex., alifática ou aromática) do açúcar à aglicona e (4) a posição destas ligações. As

diferentes antocianidinas e os diferentes tipos de glicosilação dão origem a um elevado

número de estruturas, tendo sido já identificadas cerca de 500 antocianinas em plantas

(Castaneda-Ovando et al., 2009).

3. MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DE POLIFENÓIS EM FRUTOS

3.1 Preparação da amostra

A preparação da amostra é considerada um passo crucial em qualquer tipo de análise,

podendo ter um grande impacto no resultado final. Devido à sua natureza sólida, os frutos

têm de sofrer um processo prévio de trituração, homogeneização e tamisação, que

normalmente é precedido de secagem (ao ar, em estufa ou utilizando um liofilizador)

(Perez-Jimenez et al., 2008). O processo de secagem tem elevada importância, uma vez

que, dependendo do tipo de secagem, o teor de polifenóis pode variar. A secagem com

temperaturas elevadas ou por longos períodos de tempo deve ser evitada porque leva a

uma diminuição do teor de polifenóis. Quando não é possível analisar as amostras

imediatamente, o pré-tratamento mais indicado é a liofilização. Se o laboratório não

possuir um liofilizador, a melhor opção é a secagem a uma temperatura inferior a 50-60

°C (Garau et al., 2007; Madrau et al., 2009). No que diz respeito à trituração, o

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aquecimento da amostra durante este processo e a sua exposição a uma atmosfera

oxidante devem ser minimizadas para evitar a perda dos polifenóis mais lábeis (Perez-

Jimenez et al., 2008). Quanto à tamisação, a redução do tamanho das partículas é

desejável e traduz-se num teor mais elevado de polifenóis no extrato final em comparação

com amostras não tamisadas, devido à maior eficiência do processo extrativo (Khoddami

et al., 2013).

3.2 Extração dos polifenóis

A extração dos polifenóis dos frutos é um passo chave no processo analítico. Vários

métodos de extração têm sido propostos, sendo a maioria baseados no uso de misturas de

solventes orgânicos e inorgânicos. Além do tipo de solvente, outros parâmetros (ex.

tempo de extração, temperatura, rácio amostra-solvente, número de extrações) precisam

de ser otimizados para aumentar a eficiência da extração.

Os agentes de extracção normalmente utilizados são misturas de água com solventes

orgânicos, tais como metanol, etanol e acetona (Ignat et al., 2011; Khoddami et al., 2013).

Devido à grande diversidade de polifenóis nos frutos, o uso de um único solvente torna-

se praticamente impossível caso o objetivo seja a análise de múltiplos polifenóis de

estruturas diversificadas. Neste sentido, vários estudos têm vindo a demonstrar que

extrações sequenciais com solventes de diferente polaridade resultam numa maior

eficiência na extração dos polifenóis (Ignat et al., 2011; De Melo et al., 2014). O tempo

e a temperatura de extração são também parâmetros muito importantes. Normalmente,

um aumento do tempo e da temperatura de extração aumentam a eficiência do processo;

contudo, alguns polifenóis podem ser degradados ou sofrer reações indesejáveis (ex.

oxidação) quando o tempo de extração e a temperatura são demasiado elevados (Perez-

Jimenez et al., 2008). Por fim, o rácio solvente-amostra deve também ser otimizado de

forma a aumentar a eficiência da extração. O aumento deste rácio geralmente promove a

extração dos polifenóis, contudo rácios muito elevados são indesejados devido ao efeito

de diluição e ao acrescido gasto de solvente associado ao processo (Khoddami et al.,

2013).

Os procedimentos de extração de polifenóis dos frutos mais convencionais compreendem

a simples agitação da amostra com um solvente (ou uma mistura de solventes) adequado.

Apesar deste processo de extração poder ser bastante eficiente, muitas vezes o resíduo

remanescente mantém um elevado teor de polifenóis, que estão geralmente ligados a

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proteínas, à parede celular ou à fibra do fruto. Neste caso, pode-se recorrer a uma hidrólise

ácida ou alcalina para extrair estes compostos da matriz (Perez-Jimenez et al., 2008).

Neste grupo dos procedimentos de extração mais convencionais pode ainda incluir-se a

extração em refluxo e a extração Soxhlet. As vantagens destas técnicas são a simplicidade

e o facto de utilizarem material de baixo custo. Contudo, também apresentam várias

desvantagens: requerem volumes elevados de solventes orgânicos tóxicos, considerados

poluentes ambientais; requerem tempos de extração muito longos; são pouco seletivas

(extraem interferentes indesejados); e promovem a degradação de alguns compostos de

interesse, devido a fatores inerentes ao processo, tais como temperaturas elevadas,

exposição ao ar e à luz, entre outros (Ignat et al., 2011; Khoddami et al., 2013;

Kontogianni, 2014).

O aparecimento do Soxetec (modificação do método Soxhlet) permitiu reduzir o volume

de solventes orgânicos utilizados assim como o tempo de extração (Kontogianni, 2014).

Apesar destas melhorias, nos últimos anos têm sido propostas várias outras técnicas para

tornar o processo de extração dos polifenóis ainda mais eficiente, rápido, simples e amigo

do ambiente. Surgiram assim a extração assistida por ultrassons (UAE), a extração

assistida por micro-ondas (MAE), a extração com fluidos supercríticos (SFE) e a extração

por líquido pressurizado (PLE).

3.2.1. Extração assistida por ultrassons (UAE)

O uso de ultrassons, som de frequência entre os 20 kHz e os 10 MHz, é reconhecido por

facilitar a extração de compostos orgânicos e inorgânicos de várias matrizes sólidas

usando solventes líquidos. O processo de sonicação refere-se à produção de ondas sonoras

capazes de provocar cavitação; esta cavitação é que é responsável pelo rompimento da

parede das células, libertando assim os seus conteúdos intracelulares. A eficiência da

UAE não é apenas afetada pelo tempo de sonicação mas também pela temperatura, tipo

de solvente utilizado, frequência dos ultrassons e sua distribuição (Picó, 2013).

Atualmente estão disponíveis dois sistemas para realizar este tipo de extração: (1) sonda

de ultrassons e (2) banho de ultrassons. A sonda de ultrassons está constantemente em

contato com a amostra, e apesar de ser uma fonte energética superior ao banho de

ultrassons (o que permite uma extração mais rápida dos compostos de interesse),

apresenta várias desvantagens. De destacar são o risco de contaminação cruzada (a sonda

é normalmente mergulhada na amostra) e de degradação de compostos de interesse. O

banho de ultrassons, mais comumente utilizado nos laboratórios, é uma ferramenta de

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baixa potência. Estes sistemas funcionam apenas numa frequência fixa (normalmente 40

kHz) e com uma fonte de irradiação de energia que varia entre os 1-5 W/cm2. A sua

grande vantagem é que permite realizar a extração de várias amostras simultaneamente,

com elevada reprodutibilidade (Khoddami et al., 2013). A escolha do sistema de extração

mais adequado irá depender da aplicação em questão.

De qualquer modo, a UAE é um dos procedimentos de extração mais simples, rápido e

que requer instrumentação de mais baixo custo. Comparada com os procedimentos de

extração convencionais, a UAE permite a extração de polifenóis de frutos de uma forma

mais rápida e eficiente. Vários estudos têm demonstrado a aplicabilidade desta técnica no

caso específico da extração de polifenóis de frutos (Carrera et al., 2012; D'alessandro et

al., 2012; Morelli e Prado, 2012; Singanusong et al., 2015; Altemimi et al., 2016).

3.2.2. Extração assistida por micro-ondas (MAE)

As micro-ondas são ondas eletromagnéticas com frequências que variam entre os 0.3 e os

300 GHz. Ao contrário do aquecimento convencional, o aquecimento por micro-ondas

resulta da rotação do dipolo (das moléculas) e da condução iónica (migração de iões).

Para que o mecanismo de aquecimento seja eficaz, as moléculas de interesse e o solvente

utilizado na extração têm de possuir um momento dipolar. Durante a extração o solvente

é aquecido assim como a água presente no interior das células vegetais; este aquecimento

gera uma pressão na parede celular que leva à sua rutura e consequente libertação do

conteúdo intracelular (Tatke e Jaiswal, 2011; Delazar et al., 2012).

Um dos aspetos mais importantes na MAE é a escolha do solvente a utilizar. Os

parâmetros mais importantes a ter em conta são o seu ponto de ebulição, constante

dielétrica e fator de dissipação. Os solventes polares são muito utilizados precisamente

devido à sua elevada constante dielétrica e ao facto de absorverem facilmente as micro-

ondas. O fator de dissipação diz respeito à capacidade do solvente libertar a energia

absorvida sob a forma de calor (Khoddami et al., 2013).

Estão disponíveis dois tipos de sistemas de MAE: (1) vaso aberto e (2) vaso fechado. Os

sistemas de vaso aberto são mais seguros e baratos e permitem a utilização de quantidades

superiores de amostra e de solventes. Contudo, requerem maiores tempos de extração. Os

sistemas de vaso fechado são sistemas de alta pressão que permitem que se atinjam

temperaturas superiores ao ponto de ebulição do solvente, resultando em tempos de

extração mais curtos e uma elevada eficiência da extração (Delazar et al., 2012).

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As vantagens da MAE em relação aos procedimentos de extração convencionais são o

reduzido volume de solvente utilizado, o reduzido tempo de extração e a elevada

eficiência de extração. Várias aplicações da MAE na extração de polifenóis de frutos

estão descritas na literatura (Simsek et al., 2012; Zou et al., 2012; Krishnaswamy et al.,

2013; Karabegovic et al., 2014).

3.2.3. Extração com fluidos supercríticos (SFE)

A extração com fluidos supercríticos (SFE) é também reconhecida como uma alternativa

viável aos procedimentos convencionais na extração de polifenóis. O uso da SFE permite

reduzir o consumo de solventes tóxicos, aumentar a seletividade e reduzir o tempo de

extracção, sem comprometer a eficiência do processo. Além destes aspetos, a utilização

da SFE permite evitar a degradação de compostos de interesse, uma vez que a matriz não

é exposta à luz ou ao ar. A sua grande desvantagem é sem dúvida o elevado investimento

inicial em instrumentação que é necessário (De Melo et al., 2014).

Para que a extração ocorra é necessário que as condições de temperatura e pressão do

sistema sejam otimizados de forma a obter um fluido supercrítico. Este fluido possui as

propriedades desejadas para a extracção, baixa viscosidade e elevada difusibilidade,

conseguindo assim penetrar os tecidos de forma mais eficiente (Ignat et al., 2011).

Os solventes normalmente utilizados em SFE são o dióxido de carbono (CO2), metano,

etano, propano e etanol. O CO2 é o solvente de eleição uma vez que é estável, apresenta

baixa toxicidade, não é inflamável, é barato e não produz tensão superficial. Além disso,

o CO2 forma um fluido supercrítico a uma temperatura relativamente baixa (± 31 °C),

tornando-o o solvente ideal para a extração de compostos termolábeis. A principal

desvantagem do CO2 é o seu caráter apolar, o que o torna inapropriado para a extração

dos polifenóis mais polares. Contudo, esta limitação pode ser contornada com a adição

de solventes polares como o etanol ou o metanol (Khoddami et al., 2013).

Além das vantagens já mencionadas, a SFE apresenta elevada versatilidade (as condições

de temperatura e pressão podem ser ajustadas para extrair os compostos de interesse) e

permite uma extração teoricamente completa da amostra, uma vez que existe uma

contínua exposição a solvente novo. Apesar do seu custo elevado, esta técnica tem vindo

a ser crescentemente utilizada, incluindo na extração de polifenóis de frutos (Liu et al.,

2010; Akay et al., 2011; Ghafoor et al., 2012; Liu et al., 2013; Maran et al., 2014).

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3.2.4. Extração liquida pressurizada (PLE)

A extração liquida pressurizada (PLE), também conhecida por extração acelerada por

solvente (ACE), é um tipo de extração que se baseia no uso de solventes a elevada pressão

e temperatura (Carabias-Martinez et al., 2005). A PLE pode ser utilizada em modo

estático ou dinâmico, ou numa combinação de ambos. A diferença prende-se com o facto

de no modo dinâmico o solvente ser continuamente adicionado à amostra, ao contrário

do modo estático onde a quantidade de solvente é mantida constante (Mustafa e Turner,

2011).

Tal como na SFE, vários parâmetros necessitam de ser otimizados e, mais uma vez, a

pressão e temperatura são considerados os mais importantes. A escolha do solvente de

extração é também um parâmetro crucial, devendo-se escolher um solvente capaz de

solubilizar os compostos de interesse e que, ao mesmo tempo, minimize a coextração de

outros componentes da matriz (Skalicka-Wozniak e Glowniak, 2012).

As vantagens da PLE em relação aos procedimentos de extração convencionais são

também muito semelhantes às da SFE e incluem a rapidez, facilidade e seletividade do

processo de extracção, bem como o reduzido consumo de solventes e a elevada eficiência

do processo. A principal desvantagem é o custo da instrumentação (Carabias-Martinez et

al., 2005; Mustafa e Turner, 2011).

A PLE tem vindo a ser utilizada na extração de polifenóis de frutos (Lee e Kim, 2010;

Veggi et al., 2011; Santos et al., 2012; Skalicka-Wozniak e Glowniak, 2012).

3.3. Quantificação dos polifenóis

Apesar do elevado número de publicações que tratam da quantificação de polifenóis, a

sua determinação permanece um desafio para os químicos analíticos, e estão

constantemente a surgir novos trabalhos de investigação direcionados para a otimização

e validação de metodologias analíticas para determinação de polifenóis. Os métodos

espectrofotométricos continuam a ser muito utilizados devido sobretudo à sua

simplicidade e rapidez. Contudo, a utilização da cromatografia líquida de alta eficiência

(HPLC) acoplada a vários tipos de detetores é assumida como a técnica ideal para a

identificação e quantificação destes compostos (Valls et al., 2009; Ignat et al., 2011;

Khoddami et al., 2013).

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3.3.1. Métodos espectrofotométricos

A espectrofotometria é uma das técnicas analíticas mais simples para quantificar o teor

de polifenóis. O método de Folin-Ciocalteu (F-C) é reconhecido pela sua simplicidade,

rapidez e baixo custo, e é comumente usado para a determinação do teor de polifenóis

nos frutos (Khoddami et al., 2013). O método baseia-se na oxidação dos polifenóis e na

consequente redução do reagente F-C (mistura de fosfomolibdato e fosfotungstato),

resultando a formação de um complexo de cor azul proporcional à concentração de

polifenois. A reação entre os polifenóis e o reagente F-C ocorre a um pH alcalino (≈ 10).

Nestas condições alcalinas, ocorre a desprotonação dos grupos hidroxilo da molécula dos

polifenóis e a consequente libertação de eletrões que, por sua vez, levarão à redução do

reagente F-C. A cor azul formada tem um máximo de absorção a 760 nm (Singleton et

al., 1999; Huang et al., 2005). A grande desvantagem deste método é o elevado número

de interferentes (o ácido ascórbico é um dos principais) (Everette et al., 2010). Algumas

modificações têm sido propostas para aumentar a seletividade do método, contudo o

método original continua a ser o mais utilizado nos trabalhos publicados nesta área

(Sanchez-Rangel et al., 2013).

Vários métodos espectrofotométricos foram também desenvolvidos para a determinação

de algumas classes e grupos específicos de polifenóis. Para a determinação dos

flavonóides é utilizado um método baseado na formação do complexo alumínio-

flavonóides. Neste método, uma solução de cloreto de alumínio (AlCl3) é adicionada à

amostra, dando-se a formação de um complexo com um máximo de absorvência entre os

405-430 nm. Este método, inicialmente proposto por Christ e Müller (1960), tem sofrido

várias alterações ao longo dos anos, sendo a principal a inclusão do nitrito de sódio

(Barnum, 1977). Apesar desta modificação, mantêm várias limitações, uma vez que não

permite determinar todos os compostos que pertencem à classe dos flavonóides (Pekal e

Pyrzynska, 2014).

Para a quantificação das antocianinas o método mais simples é a medição direta da

absorvência do extrato a um comprimento de onda entre os 490 e os 550 nm. Contudo,

este método também quantifica outros compostos, o que leva à sobrestimação do teor de

antocianinas. Desta forma, o uso do método de diferenciação por pH para a quantificação

dos monómeros de antocianinas é considerado o mais adequado (Wrolstad et al., 2005).

A determinação das proantocianidinas também pode ser feita através de métodos

espectrofotométricos. O método da vanilina é o mais conhecido e compreende a reação

das proantocianidinas com a vanilina com a consequente formação de complexos de cor

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vermelha (Bate-Smith, 1975). O método de Harbertson et al. (2003), que se baseia na

precipitação das proantocianidinas com a albumina de soro bovino (BSA), é também uma

alternativa para a determinação dos monómeros de antocianinas e de outros pigmentos

poliméricos. A substituição da BSA pela metilcelulose permitiu ultrapassar algumas

limitações do método (Sarneckis et al., 2006). A determinação das proantocianidinas é

também muitas vezes realizada pelo método butanol-HCl. Este baseia-se na clivagem das

ligações interflavonóides da estrutura das proantocianidinas em meio ácido seguida de

reações de auto-oxidação que convertem os flavanóis em antocianidinas (Schofield et al.,

2001).

Os métodos espectrofotométricos são métodos simples, económicos e rápidos para a

determinação de polifenóis em frutos, contudo, fornecem unicamente uma estimativa do

teor total destes compostos. Além disso, estes métodos apresentam várias limitações de

onde se destaca a reduzida especificidade (Ignat et al., 2011; Khoddami et al., 2013).

3.3.2. Métodos cromatográficos

A complexidade da matriz frutos e a existência de vários tipos de polifenóis que podem

estar presentes simultaneamente levou ao desenvolvimento de técnicas separativas

capazes de dar resposta em termos qualitativos e quantitativos. Neste contexto, destaca-

se a utilização de várias técnicas separativas, tais como a cromatografia líquida de alta

eficiência (HPLC), a cromatografia gasosa (GC), a cromatografia contracorrente (CCC),

entre outras. Aqui será unicamente referida a cromatografia líquida, devido ao facto de

ser considerada a técnica de eleição para a análise de polifenóis em frutos.

3.3.2.1. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)

Do leque de técnicas separativas atualmente disponíveis, a cromatografia líquida de alta

eficiência (HPLC) é sem dúvida a técnica de eleição para a separação e quantificação de

polifenóis em frutos. As condições cromatográficas de um método típico para a

determinação de polifenóis em frutos compreendem uma coluna de fase reversa, um

detetor de UV-Vis ou de díodos (DAD) e um sistema binário de solventes (ex. solvente

A – H2O acidificada; solvente B – solvente orgânico polar). Estes sistemas oferecem

diversas vantagens relativamente aos métodos espectrofotométricos, de onde se destaca a

capacidade de analisar simultaneamente polifenóis de diferentes classes e grupos, bem

como os seus produtos de degradação (Kontogianni, 2014). Os polifenóis absorvem

radiação eletromagnética de diferentes comprimentos de onda. Por exemplo, os

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flavonóides têm duas bandas características: a primeira tem um máximo de absorção entre

os 240 e os 285 nm (corresponde ao anel A); a segunda tem um máximo entre os 300 e

os 550 nm (corresponde ao anel C). Desta forma, é possível selecionar comprimentos de

onda específicos para a quantificação dos diversos polifenóis (Khoddami et al., 2013).

Existem vários tipos de detetores de UV-Vis: os que monitorizam apenas um

comprimento de onda, os que monitorizam vários comprimentos de onda e o DAD. O

sistema HPLC-DAD é considerado o mais adequado para a quantificação de polifenóis

em frutos (Kontogianni, 2014).

A utilização de um espectrómetro de massa (MS) acoplado a um sistema de HPLC

permite obter mais informação ao nível estrutural e facilita a identificação dos polifenóis

presentes nos frutos. Nestes sistemas, as moléculas são ionizadas, e eventualmente

fragmentadas, sendo separadas pela sua relação massa-carga (Valls et al., 2009). Existem

diferentes fontes de ionização, sendo as mais comumente utilizadas na análise dos

polifenóis a ionização por eletrospray (ESI), a ionização química a pressão atmosférica

(APCI) e a ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI). A deteção dos

compostos pode ser realizada em modo positivo ou negativo, sendo este último o mais

utilizado na análise dos polifenóis. Dentro do leque de opções dos analisadores de massa

podemos encontrar os sistemas de quadrupolo simples (MS), de triplo quadrupolo

(MS/MS), ion trap (MSn), time-of-flight (TOF), entre outros (Ignat et al., 2011;

Khoddami et al., 2013). A grande diversidade de sistemas permite aplicações específicas;

os sistemas MS e MS/MS são aplicados principalmente para identificação e quantificação

de compostos de estrutura conhecida; por outro lado, os sistemas de alta resolução (ex.

TOF, TOF-MS, ion trap-MS) são destinados para a identificação de compostos

desconhecidos e sua elucidação estrutural (Monagas et al., 2010).

Recentemente, a introdução de novas colunas cromatográficas de tamanho de partícula

reduzido (sub-2 µm) permitiu melhorar as separações cromatográficas. Estes “novos”

sistemas (UHPLC e UPLC) apresentam maior sensibilidade e resolução de picos assim

como tempos de análise mais curtos comparativamente aos sistemas convencionais de

HPLC (Kontogianni, 2014).

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4. CONSIDERAÇÕES FINAIS

A caracterização dos polifenóis em frutos é uma tarefa difícil de realizar devido ao

elevado número de compostos potencialmente presentes na matriz e à sua inerente

complexidade. A identificação e determinação destes compostos envolve um conjunto de

passos que vão desde o tratamento da amostra até à quantificação propriamente dita.

Atualmente estão disponíveis vários métodos para a extração dos polifenóis dos frutos

que se caracterizam pela sua rapidez, baixo consumo de solventes, seletividade e

eficiência. No que diz respeito à identificação e quantificação dos polifenóis, o uso da

cromatografia líquida acoplada a um detetor de díodos (HPLC-DAD) permanece como a

técnica standard para a análise de polifenóis de estrutura conhecida. Contudo, o uso da

espectrometria de massa tem vindo a ganhar relevo neste campo através do uso dos

sistemas MS/MS, populares pela sua elevada sensibilidade e especificidade. Para a

identificação e elucidação estrutural de polifenóis de estrutura desconhecida, o uso de

espectrómetros de massa de alta resolução e de sistemas híbridos é o golden standard,

devido à sua capacidade para realizar múltiplas fragmentações das moléculas de interesse

e para a determinação exata da massa dos compostos originais ou dos seus produtos de

degradação.

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