MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DE CARBOIDRATOS ?· A determinação do teor de umidade foi feita empregando…

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<ul><li><p>Quim. Nova, Vol. 34, No. 4, 689-694, 2011</p><p>Not</p><p>a T</p><p>cni</p><p>ca</p><p>*e-mail: snixdorf@uel.br</p><p>MTODO PARA DETERMINAO DE CARBOIDRATOS EMPREGADO NA TRIAGEM DE ADULTERAES EM CAF </p><p>Elis Daiane Pauli, Valderi Cristiano e Suzana Lucy Nixdorf*Departamento de Qumica, Centro de Cincias Exatas, Universidade Estadual de Londrina, CP 6001, 86051-970 Londrina PR, Brasil</p><p>Recebido em 7/5/10; aceito em 22/9/10; publicado na web em 7/1/11</p><p>METHOD FOR DETERMINATION OF CARBOHYDRATES EMPLOYED IN THE SELECTION OF ADULTERATIONS IN COFFEE. The objective in this work was to validate a chromatography method for the determination of total carbohydrates in soluble coffee, using a HPLC-UV-VIS with postcolumn derivatization system, in order to verify adulterant additions. The validated method was accurate and robust. Adulteration could be observed by increasing xylose and glucose levels in samples with addition of coffee husks and starchy products while decreasing of galactose and mannose characteristic carbohydrates presenting in high concentration in soluble coffees produced by arabica and robusta coffee beans.</p><p>Keywords: adulterants; carbohydrates; HPLC-UV-VIS.</p><p>INTRODUO</p><p>O caf uma das bebidas mais populares consumidas no mundo1 conhecida por ser smbolo de hospitalidade, estimulante e, mais re-centemente, pelos efeitos benficos sade atribudos a componentes bioativos.2 No comrcio internacional, um dos produtos bsicos mais valiosos, ou seja, a segunda maior commodity no mundo, permane-cendo atrs somente do petrleo.3,4 O Brasil por sua vez, o maior produtor mundial de caf, sendo responsvel por aproximadamente 30% do mercado internacional.5</p><p>O elevado valor comercial do caf o torna atrativo para aes fraudulentas. Por fraude, considera-se a mistura, intencional ou no, de materiais estranhos ao produto, normalmente de baixo custo, que alteram a sua qualidade e causam danos ao consumidor, especialmen-te, os de ordem econmica.6 As misturas so os produtos adicionados ao caf para fraud-lo, enquanto impurezas so substncias resultantes do mau beneficiamento do produto, como cascas, paus, torres, que em grandes quantidades pressupem fraude intencional.7 No caso do Brasil os produtos mais acrescentados ao caf torrado e modo so cascas, paus, milho, cevada, triguilho, acar mascavo e soja.6,7</p><p>De acordo com Bernal et al.8 e Garcia et al.,9 a determinao individual de carboidratos tem importncia significativa no somente por prover informao composicional das amostras, mas tambm, por auxiliar na identificao de adulterantes. Nos ltimos anos tm sido feitas diversas pesquisas relacionadas ao perfil dos carboidratos especialmente de cafs solveis, devido enorme gama destes tipos de produtos comercialmente disponveis, necessitando de mtodos analticos para classific-los, monitorar a presena de componentes diferentes do caf e definir os limites de um produto no adulterado.10</p><p>Os carboidratos podem, segundo Bernal et al.,8 ser determinados utilizando-se cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC - High Performance Liquid Chromatography) com combinaes apropriadas da fase estacionria e do sistema da deteco. Pelo fato dos car-boidratos no apresentarem ligaes conjugadas, no podem ser diretamente detectados por espectroscopia no ultravioleta visvel (UV-</p><p>VIS) requerendo, assim, derivatizaes capazes de gerar subprodutos fotometricamente ativos. A aplicao do reagente (4Aminobenzoil)hidrazida na derivatizao ps-coluna em matrizes complexas tem como objetivos: a simplificao no preparo das amostras, no reque-rendo desproteinizao; o aumento da especificidade, com reduo de interferentes; e o aumento na sensibilidade, elevando em 10 vezes os nveis de deteco comparativamente ao ndice de refrao,11 por produzir nions cromforos amarelos,12 detectados aps separao em coluna catinica. </p><p>J a cromatografia de troca aninica acoplada com deteco eletroqumica por amperometria pulsada (HPAE-PAD - High Perfor-mance Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection) tem sido a tcnica adotada internacionalmente para anlise de carboidratos em caf solvel, cujo mtodo normalizado o ISO 11292,13 por exigir pouco preparo da amostra, apresentar resoluo e sensibilidade sem necessitar de derivatizaes.14</p><p>Contudo, grandes variaes nos teores dos carboidratos so observadas de acordo com a utilizao dos diferentes sistemas ins-trumentais, condies de processo e analticas, a exemplo do estudo realizado por Blanc et al.15 com caf arbica torrado empregado na produo de caf solvel utilizando HPLC-UV-VIS ps-coluna, que mostra teores que variam em % (m/m) de: 1,29-2,00 para glicose; 0,08-0,14 para xilose; 3,19-20,93 para galactose; 1,03-6,29 para ara-binose; 5,91-19,50 para manose, dependendo das condies de tempo de extrao - 30 a 240 min e temperatura - 150 a 190 oC. Redgwell et al.16 encontraram a composio de monossacardeos por HPAE-PAD, aps hidrlise com 72% H2SO4 por 3 h temperatura ambiente e 2 h a 110 C com 1 M de H2SO4, de acordo com o grau de torra leve, mdia e escura, e o tipo de caf utilizado em %(m/m) de: glicose de 6,10-8,01; xilose de 1,10-3,65; galactose de 5,50-12,10; arabinose de 0,74-4,29 e manose de 15,97-24,89.</p><p> Segundo descrito por Arya e Rao,10 as elevadas temperaturas no processo de caf solvel levam hidrlise das fraes de polis-sacardeos, gerando elevados teores dos monossacardeos arabinose, galactose e manose. O caf solvel puro caracterizado pelos altos valores de galactose e manose total.17 Assim, dependendo do perfil dos carboidratos estes podem ser separados em 2 grupos: os com </p></li><li><p>Pauli et al.690 Quim. Nova</p><p>altos teores de xilose e glicose adulterados com cascas e, os com altas concentraes de glicose total e baixos de xilose, adulterados com materiais constitudos de amido, carboidrato de alto peso molecular.10 Segundo Prodolliet e Hischenhuber,17 a autenticidade do caf solvel pode ser comprovada pelos limites mximos aceitveis de xilose, manitol e glicose total nas concentraes de 0,40; 0,30 e 2,10%, respectivamente. Estes limites foram considerados para o estabele-cimento do Cdigo de Prticas para a Indstria de Caf Solvel no Reino Unido, que considera alm destes um teor mximo aceitvel para a frutose livre de 0,60%. Para a Associao dos Pases Fabri-cantes de Caf Solvel da Comunidade Europeia (AFCASOLE),18 a autenticidade do caf solvel pode ser comprovada pelos limites mximos aceitveis de frutose livre, xilose total e glicose total nas concentraes de 0,60; 0,40 e 2,10%, respectivamente.</p><p>O objetivo do presente trabalho foi validar uma metodologia no normalizada, para ser aplicada com credibilidade e de forma adequa-da em rotina,19,20 seguindo parmetros do INMETRO,21 empregada para a determinao de carboidratos por HPLC-UV-VIS com reao ps-coluna, para fins de triagem de autenticidade da qualidade de cafs solveis, baseada no perfil e teores limites estabelecidos pela AFCASOLE.18 </p><p>PARTE EXPERIMENTAL</p><p>Preparo das amostras</p><p>A validao do mtodo foi feita utilizando uma amostra de caf solvel comercial 100% arbica preparada seguindo os parmetros descritos na norma ISO 11292,13 adaptada para a etapa de extrao e hidrlise. A determinao do teor de umidade foi feita empregando Karl Fisher.22 Para a extrao pesou-se 0,2000 0,001 g de amos-tra em base seca e transferiu-se para um erlenmeyer de 250 mL, adicionou-se amostra 10,0 mL de soluo de cido clordrico 0,6 mol L-1. A amostra foi hidrolisada em autoclave por 120 min presso de @ 1 Kgf a 121 C. A amostra resfriada temperatura ambiente foi transferida para um balo volumtrico de 100,00 mL e completou-se o volume com gua ultrapura Milli-Q(Millipore, MA, EUA). Pipetou-se 10,00 mL de amostra, que foi neutralizada com o uso de 1,00 0,01 g de resina aninica regenerada com NaOH, filtrada em papel faixa branca, passada em cartucho Sep-Pak C18 (Waters, Milford, EUA) pr-condicionado com metanol e gua, e em membrana 0,22 m (GVWP 02500 Millipore, MA, EUA), descartando-se as pri-meiras gotas e levando ao sistema cromatogrfico para anlise. Este foi o procedimento considerado padro utilizado para a anlise das amostras de cafs solveis, puros e adulterados, todas de procedncia comercial adquiridas de diferentes pases.</p><p>Padres</p><p>Os padres empregados foram procedentes da Merck (Darmstadt, Alemanha): D(-) Manitol, D(-) Arabinose, D(+) Galactose, D(+) Glicose, D(+) Xilose, D(+) Manose, D(-) Frutose, com 99,90; 99,90; 98,00; 99,50; 99,00; 99,50; 99,45 e 99,90% de pureza, respectivamente. Para a quantificao dos carboidratos nas amostras, preparou-se uma soluo padro com concentraes similares s encontradas nas amostras de caf solvel. Os padres de carboidra-tos foram pesados: 0,030 0,001 g de glicose, 0,020 0,001 g de xilose, 0,110 0,001 g de galactose, 0,040 0,001 g de arabinose e 0,060 0,001 g de manose, transferidos para um balo volumtrico de 100,00 mL 0,50 mL e o volume foi completado com gua ul-trapura. Sonicou-se a soluo por 5 min em banho ultrassnico. O padro foi armazenado em geladeira a ~4 C. Esta soluo estoque foi diluda para a obteno do padro analtico de 25%(v/v) o qual </p><p>foi injetado a cada dia utilizado para a quantificao. A partir dessa soluo padro estoque foram feitas diluies para o levantamento das curvas analticas, que possibilitaram a determinao da linearidade na faixa dinmica de trabalho e do limite de quantificao empregados nas anlises cromatogrficas.</p><p>Fases mveis</p><p>Adotou-se a gua ultrapura (Milli-Q) como fase mvel eluente por apresentar a melhor resoluo cromatogrfica, filtrada em membrana 0,45 m de ster de celulose (Millipore, Billerica, MA), submetida a vcuo e sonicao em banho ultrassnico simultaneamente para desgaseificao por 5 min. Para o sistema ps-coluna a derivatizao empregou como fase mvel uma mistura de duas solues, a primeira contendo 1,250 g de (4Aminobenzoil)-hidrazida (ABH) (4-amino-benzoyl)hydrazide, C7H9N3O, 95%, Acrs Organics), em 50,0 mL, adicionando-se 1,00 mL de cido clordrico 37% (Merck, Alemanha, Darmstadt), dissolvendo-se em banho ultrassnico e completando-se o volume com gua ultrapura; e a segunda com 4,80 g de hidrxido de sdio (Merck, Alemanha, Darmstadt), em escamas, e 0,730 g de cloreto de sdio (Merck, Alemanha, Darmstadt) em 100,0 mL de gua ultrapura. A soluo foi dissolvida em banho ultrassnico, filtrada em membrana 0,45 m de ster de celulose (Millipore, Billerica, MA) e mantida resfriada at o momento de uso. Apesar do exato mecanismo de reao baseado na elucidao da estrutura dos produtos derivados no ter sido reportada por Lever,23 o qual props que a reao dos carboidratos redutores com certos tipos de hidrazidas de cidos aro-mticos, em meio fortemente bsico, produzia a colorao amarela; nem por Vrtn et al.,12 que otimizou sua aplicao como reagente de deteco sem, contudo, estudar suas caractersticas espectrais e cin-ticas; segundo Honda,24 esta colorao atribuda devido formao com carboidratos de espcies aninicas cromforas de hidrazonas. Lever23 mostrou que o ABH apresentou a melhor combinao entre a fase estacionria/fase mvel eluente gua versus reagente ps-coluna, apresentando maior especificidade e relao sinal-rudo em 410 nm. A utilizao do agente cromognico ABH na derivatizao ps-coluna demonstrou ser aplicvel a todos os carboidratos redutores, de forma mais rpida (3 min), apresentado maior sensibilidade (4,3x 10-11 mols de sacarose), comparado a outros derivatizantes utilizados, como o BCA (bicinconinato dissdico) que provoca distoro de picos e entu-pimento; o HCF (hexaferrocianato de potssio) que apresenta alto nvel de rudo e interferentes, o TTB (azul de tetrazlio) solvel somente em NaOH etanlico, o que causa alterao gradual da cor, provocando aumento de linha de base, e exige altas vazes de eluente; e o CAA (2-cianoacetamida) limitado a amostras que contenham cetoses,12 alm de outras desvantagens, como a corroso de equipamentos utilizando meio de cido forte para converso a furfural, seguida da condensao com reagentes cromforos descrita por Honda.24</p><p>Sistema instrumental </p><p>O sistema instrumental utilizado consistiu em um cromatgra-fo lquido de alta eficincia composto de dois frascos mbar para armazenagem da fase mvel eluente e ps-coluna; duas bombas de alta presso Waters 515 (Milford, MA, EUA); um injetor automtico Waters 717 Plus; uma pr-coluna SP 1010 P (6 x 50 mm; Shodex; NY, EUA); uma coluna de troca inica Aminex HPX-87P (7,8 x 300 mm na forma inica Pb2+, Biorad, CA, EUA); um tee misturador; um forno termostatizado para coluna, acoplado com um controlador de temperatura mdulo II Waters; um reator ps-coluna CRX 390 (Picke-ring Laboratories, Mountain View, CA, EUA) contendo uma bobina de reao de PTFE no interior do reator de temperatura controlada; regulador de pulso (pulse dampener) e restritor de presso de 100 psi </p></li><li><p>Mtodo para determinao de carboidratos 691Vol. 34, No. 4</p><p>(back pressure) conectado na sada do detector; um detector UV-VIS Waters 2487; e o software Empower Build 1154, para aquisio e tratamento de dados por um microcomputador. </p><p>Parmetros analticos empregados para as anlises cromatogrficas </p><p>A validao da metodologia no normalizada, para a anlise de car-boidratos em caf solvel utilizando a tcnica HPLC-UV-VIS ps-coluna, empregou os parmetros de extrao e anlise apresentados nas Tabelas 1 e 2 denominado de procedimento padro, pela adoo e adaptao das condies de reao ps-coluna, descritas por Femia e Weinberger.11 e estudos de desempenho dependentes do instrumental feitos para otimi-zao do ABH por Vrtn et al.,12 aplicando os princpios de Lever.23 As variaes apresentadas foram efetuadas para avaliao da robustez, considerando os testes de aplicabilidade prtica12 e os fatores crticos de anlise e suas potencialidades descritos na reviso de Honda,24 como controle da vazo e da temperatura do reator ps-coluna. </p><p> RESULTADOS E DISCUSSO </p><p>Validao</p><p>A validao do mtodo foi feita considerando os parmetros de linearidade na faixa de trabalho, seletividade, especificidade, sensibilidade, exatido, preciso e preciso intermediria, limite de </p><p>deteco, limite de quantificao e robustez para as condies padro.A Tabela 3 apresenta as Equaes das regresses lineares utili-</p><p>zadas na faixa dinmica de trabalho para a glicose, xilose, galactose, arabinose e manose, demonstrando sua linearidade, com coeficientes de correlao superiores a 0,99. Pela inclinao das retas observa-se que o carboidrato mais sensvel entre os cinco analisados foi a glicose. </p><p>O limite de deteco calculado para a galactose foi de 0,07% (m/m), considerando-se trs vezes a relao sinal/rudo.20 O limite de quantificao considerando-se o ponto de concentrao mais baixo da curva de calibrao foi de 0,13 % (m/m) para xilose.21 </p><p>A faixa linear de trabalho do mtodo analtico, calculada de acor-do com o INMETRO21 no intervalo entre os nveis inferior e superior da curva de calibrao, foi dada pelos valores apresentados na Tabela 3, com o menor de 2,6 g mL-1 ou 0,13 % (m/m) para xilose e maior de 481,2 g mL-1 ou 24,06 % (m/m) para galactose. </p><p>A preciso foi determinada pela repetitividade de 7 injees su-cessivas de amostras de caf solvel comercial 100% arbica extradas pelo procedimento padro, obtendo-se os coeficientes de variao de 4,95; 9,10; 1,94; 2,87 e 1,22% (m/m) para glicose, xilose, galactose, arabinose e manose, respectivamente. A preciso intermediria, calculada a partir da injeo em 9 dias diferentes de uma amostra de caf solvel comercial 100% arbica, apresentou coeficientes de variao de 6,43; 10,06; 4,07; 6,90 e 5,83% (m/m) para glicose, xilose, galactose, arabinose e manose, respectivamente, inferiores a 15%, valor adotado como referncia de acordo com a Resoluo n 899, de 29/5/2003, da Anvisa.25 </p><p>Tabela 1. Condies e parmetros analticos empregados na extrao dos carboidratos em amostra de caf solvel comercial 100% arbica e suas respectivas variaes</p><p>Condies de extrao Parmetros adotados(procedimento padro)</p><p>Variaes</p><p>Concentrao de cido clordrico de hidrlise (mol L-1) 0,6 0,4 0,8 </p><p>Equipamento de hidrlise autoclave vertical Banho-maria termosttico</p><p>Temperatura de hidrlise (C) 121 100</p><p>Tempo de hidrlise (h) 2 1 </p><p>Massa da amostra em base seca 0,200 g 20% e no considerando umidade</p><p>pH final da amostra neutralizada (pH = 7,0) pH = 1,5 e pH = 3,5</p><p>Cartucho Sep Pak C-18(Waters) empregado no empregando</p><p>Tabela 2. Condies cromatogrficas adotadas para a anlise dos carboidratos em amostra de caf solvel comercial 100% arbica e suas respectivas variaes</p><p>Condies de anlise Parmetros de anlise(procedimento padro)</p><p>Variaes</p><p>Volume de injeo (L) 20,0 15,0 25,0 </p><p>Vazo da fase mvel eluente da coluna - gua ultrapura (Milli-Q) Bomba 1 (mL min-1) 0,5 0,4 0,6 </p><p>Vazo da fase mvel ps-coluna NaOH + ABH Bomba 2 (mL min-1) 0,6 0,5 0,7 </p><p>Temperatura da coluna (forno) (C) 85 83 87</p><p>Temperatura do reator ps-coluna (C) 100 95 105</p><p>Tabela 3. Parmetros utilizados para a verificao da linearidade na faixa dinmica de trabalho, utilizados para o levantamento das curvas de calibrao feitas a partir da mistura de padres dos cinco carboidratos injetados em triplicata </p><p>Carboidratos Concentrao de carboidratos em % (m/m) Regresso r Faixa dinmica(g mL-1)</p><p>Glicose 0,19 0,75 0,94 1,88 3,75 5,63 6,56 y = 300485,67 x - 8391,58 0,9996 3,8 - 131,2</p><p>Xilose 0,13 0,50 0,63 1,25 2,50 3,75 4,38 y = 33124,06 x - 8356,88 0,9999 2,6 - 87,6</p><p>Galactose 0,69 2,75 3,44 6,88 13,75 20,63 24,06 y = 190629,97 x - 6309,10 0,9993 13,8 - 481,2</p><p>Arabinose 0,25 1,00 1,25 2,50 5,00 7,50 8,75 y = 246050,89 x + 4451,33 0,9993 5,0 - 175,0</p><p>Manose 0,38 1,50 1,88 3,75 7,50 11,25 13,13 y = 233222,94 x - 3525,05 0,9996 7,6 - 262,6</p></li><li><p>Pauli et al.692 Quim. Nova</p><p>A especificidade foi avaliada pela anlise individual de cada car-boidrato verificando seu tempo de reteno, os quais no apresentaram nenhum outro pico alm do carboidrato injetado.</p><p>A exatido foi calculada pela recuperao, feita a partir da adio dos padres amostra analisada, calculada pela Equao e apresen-tada na Tabela 4, permanecendo entre os limites de 70,00 a 120,00% previstos para que um mtodo seja considerado exato.21</p><p> rec(%) = (C1 - C2) x 100 C3</p><p>onde: rec = recuperao; C1 = concentrao determinada na amostra com adio de padro; C2 = concentrao determinada na amostra original sem adio de padro; C3 = concentrao adicionada.</p><p>A seletividade foi verificada pela ausncia de resposta no tempo de reteno de cada um dos carboidratos comparando-se com o padro analtico de 25% (v/v), permanecendo em linha de base para a anlise da gua ultrapura e do cido clordrico 0,6 mol L-1 quando </p><p>submetidos ao procedimento padro de extrao, concluindo-se que os reagentes utilizados para a hidrlise no interferiram na amostra.</p><p>O mtodo foi considerado robusto considerando os resultados das variaes descritas nas Tabelas 1 e 2 para os valores de Fcalculado &lt; Ftabelado para o Teste F, num intervalo de confiana de 95%, das varincias entre as matrizes de dados, seguido do Teste t presumindo varincias equiva-lentes para as variaes de concentrao de cido clordrico da hidrlise ( 0,2 mol L-1); massa em peso seco ( 20%(m/m)); pH final da amostra (1,5 e 3,5); limpeza empregando cartuchos de extrao em fase slida; vazes das bombas das fases mveis da coluna cromatogrfica ( 0,1 mL min-1) e do sistema ps-coluna ( 0,1 mL min-1); e temperatura do forno da coluna ( 2 oC). Estes resultados concordam com os de Vrtn et al.,12 que verificaram que as curvas para os sacardeos se mostraram insensveis a pequenas variaes de vazo.</p><p>Houve diferena nos valores empregando equipamentos distintos, autoclave vertical (Phoenix modelo AV18) e banho termosttico (Fanaem modelo 146) e tempo de hidrlise (1 e 2 h). Portanto, os teores dependem das condies de hidrlise que afetam os resultados, o que c

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