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  • MESTRADO INTEGRADO EM ENGENHARIA BIOMDICA

    FACULDADE DE CINCIAS E TECNOLOGIA UNIVERSIDADE DE COIMBRA

    Identificao das Vias de Sinalizao Anti-apoptticas

    em Clulas Estaminais Cancergenas de Osteossarcoma

    Cludia Borges Gonalves

    2012

    Dissertao apresentada Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade de Coimbra para obteno do grau de Mestre em Engenharia Biomdica, realizada sob a orientao da Doutora Clia Maria Freitas Gomes do Instituto Biomdico de Investigao de Luz e Imagem (IBILI)

  • Esta cpia da tese fornecida na condio de que quem a consulta reconhece que os direitos de

    autor so pertena do autor da tese e que nenhuma citao ou informao obtida a partir dela

    pode ser publicada sem a referncia apropriada.

    This copy of the thesis has been supplied on condition that anyone who consults it is understood

    to recognize that its copyright rests with its author and that no quotation from the thesis and no

    information derived from it may be published without proper acknowledgement.

  • Aos meus pais

    Aos meus irmos

  • Este projecto foi desenvolvido na seguinte instituio:

    Farmacologia e Teraputica Experimental, Instituto Biomdico de Investigao de Luz e

    Imagem (IBILI), Faculdade de Medicina, Universidade de Coimbra, Coimbra

  • Aprender a nica coisa de que a mente nunca se cansa, nunca tem medo e nunca se arrepende

    Leonardo da Vinci

  • Aos meus pais

    Aos meus irmos

  • vii

    Agradecimentos

    Doutora Clia Gomes, orientadora deste projecto, e mais que isso, a minha Professora, os

    meus sinceros agradecimentos por todo o conhecimento transmitido, pelo apoio, pela confiana,

    pela imensa pacincia e pelo incentivo demonstrados ao longo deste ano, e especialmente um

    grande obrigada pelos puxes de orelhas que me fizeram crescer, ir mais alm e me tornar mais

    perspicaz neste mundo que a investigao.

    Ao Professor Doutor Miguel Morgado, coordenador da disciplina de Projecto de Mestrado, e

    coordenador do curso de Engenharia Biomdica, os meus sinceros agradecimentos pelo interesse

    apresentado durante este projecto, pela disponibilidade sempre demonstrada e pelo envolvimento

    no percurso acadmico de todos os alunos de Engenharia Biomdica.

    Ao Engenheiro Francisco Caramelo, pela disponibilidade, pela ateno e pelas sugestes na

    anlise estatstica.

    Ao Professor Doutor Carlos Alberto Fontes Ribeiro, do servio de Farmacologia e Teraputica

    Experimental, os meus agradecimentos pelo recebimento nestas instalaes. E a todo o staff deste

    servio um muito obrigada pelo carinho e simpatia demonstrados.

    Patrcia, minha companheira da salinha e dos cafs, por toda a pacincia e incentivo,

    pelo carinho e pela amizade, e por todos os momentos que vivemos juntas no decorrer deste

    projecto que sem dvida me foram essenciais. Magui por toda a alegria e entusiasmo, por toda a

    ajuda e opinies, e por me ter salvado tantas vezes ao deixar-me raptar-lhe o carto.

    Aos meus amigos de curso, em especial Licas, Mnica, Raquel, Daniela, Carla,

    Vanessa e Cntia, que sempre estiveram l quando precisei, e que me deram todo o carinho,

    amizade, compreenso e apoio neste percurso feito por todas ns. Ao meu afilhado, Hugo, pelos

    lanches e pelo incentivo, e mais importante que isso pela amizade. minha afilhada, Telma, com a

    qual iniciei esta jornada pelo IBILI, pela amizade e pelo apoio.

    Aos amigos que fiz ao longo deste percurso acadmico, em especial Carla, pelo apoio, pelas

    conversas, pela amizade, pelos conselhos, e por todos os sorrisos contagiantes.

    Aos meus amigos de infncia, em especial Liliana, Sofia, ao Pedro, Fernanda, Ticha, ao

    Jlio, e Joana, que por mais que a Faculdade nos tenha afastado sempre estiveram l para me

    apoiar, para me dar um ombro amigo e para cultivar esta amizade que sei que vai ser para a vida, um

    grande obrigada pela fora e pelo carinho.

    minha famlia, em especial aos meus Pais e aos meus Irmos, por todos os sacrifcios, pelo

    apoio, pelo amor e pelo porto de abrigo. Sem vocs no teria chegado to longe! Um muito obrigada

    por sempre acreditarem no meu potencial!

    Ao Diogo que me aturou nos piores momentos, mas que sempre teve uma palavra

    animadora para me consolar. Obrigada por todo o amor, pela pacincia e pelo apoio incondicional ao

    longo deste percurso to importante da minha vida.

  • ix

    ndice

    Agradecimentos ........................................................................................................................vii

    Lista de Figuras .......................................................................................................................... xi

    Lista de Tabelas ......................................................................................................................... xii

    Lista de Abreviaturas ............................................................................................................... xiii

    Resumo ..................................................................................................................................... xv

    Abstract ................................................................................................................................... xvii

    1. Introduo ........................................................................................................................... 1

    1.1 Osteossarcoma .............................................................................................................. 1

    1.1.1 Etiologia e Factores de Risco ......................................................................... 1

    1.1.2 Clulas de origem do OS ................................................................................ 2

    1.1.3 Tratamento do OS .......................................................................................... 4

    1.2 Teoria das Clulas Estaminais Cancergenas ................................................................ 5

    1.2.1 Identificao de CSCs ..................................................................................... 7

    1.3 Implicaes Teraputicas das CSCs ............................................................................... 9

    1.3.1 Apoptose ...................................................................................................... 12

    1.3.1.1. Apoptose e cancro ...................................................................... 15

    1.4 Objectivos .................................................................................................................... 16

    2. Materiais e Mtodos ......................................................................................................... 17

    2.1 Cultura Celular ............................................................................................................. 17

    2.1.1 Ensaios de Viabilidade Celular ..................................................................... 17

    2.2 Mtodo de formao de esferas ................................................................................. 17

    2.3 Estudos de Citotoxicidade com DOX ........................................................................... 18

    2.3.1 Preparao das clulas MNNG/HOS e das CSCs para os estudos de

    citotoxicidade com DOX........................................................................................ 19

    2.3.2 Estudos de Viabilidade Celular Ensaio colorimtrico de MTT .................. 19

    2.3.3 Estudos de Proliferao Celular Ensaio colorimtrico de BrdU ................ 20

    2.3.4 Ensaio de TUNEL para medio da apoptose .............................................. 21

    2.4 Anlise da expresso de protenas por Western blot ................................................. 22

    2.4.1 Expresso de protenas anti- e pr-apoptticas da famlia da Bcl-2 e da

    caspase- 3 ............................................................................................................. 22

    2.4.1.1 Preparao de extractos celulares ............................................... 22

  • x

    2.4.1.2 Electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sdio

    (SDS-PAGE) e Electrotransferncia ........................................................... 23

    2.4.1.3 Immunoblotting e Quantificao ................................................. 23

    2.5 Anlise Estatstica ......................................................................................................... 24

    3. Resultados .......................................................................................................................... 25

    3.1 Isolamento de CSCs a partir da linha celular humana de OS MNNG/HOS ................... 25

    3.2 Sensibilidade das clulas MNNG/HOS e das CSCs DOX ............................................. 26

    3.2.1 Efeito da DOX na Viabilidade e na Proliferao Celulares ........................... 26

    3.2.2 Deteco da apoptose .................................................................................. 29

    3.3 Expresso de protenas pr- e anti-apoptticas .......................................................... 31

    3.3.1 Anlise da razo entre as protenas anti- e pr-apoptticas ....................... 34

    3.4 Expresso da caspase-3 ................................................................................................ 35

    4. Discusso .....................................................................................

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