mestrado em odontologia -...
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MESTRADO EM ODONTOLOGIA
LEANDRO AMADEU ROTH
EXPRESSÃO GÊNICA DAS INTEGRINAS α2, β1, αv E β6 EM MUCOSA PERI-IMPLANTAR ASSOCIADA A
CICATRIZADORES COM DIFERENTES TOPOGRAFIAS: ESTUDO EM HUMANOS.
Guarulhos
2014
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LEANDRO AMADEU ROTH
EXPRESSÃO GÊNICA DAS INTEGRINAS α2, β1, αv E β6 EM MUCOSA PERI-IMPLANTAR ASSOCIADA A
CICATRIZADORES COM DIFERENTES TOPOGRAFIAS: ESTUDO EM HUMANOS.
ORIENTADORA: Profa. Dra. Marta Ferreira Bastos
CO- ORIENTADOR: Prof. Dr. Jamil Awad Shibli
Guarulhos
2014
Dissertação apresentada à Universidade Guarulhos para obtenção do título de Mestre em Odontologia Área de Concentração: Implantodontia
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Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Fernando Gay da Fonseca
R845e
Roth, Leandro Amadeu
Expressão gênica das integrinas α2, β1, αv E β6 em mucosa peri-implantar associada a cicatrizadores com diferentes topografias: estudo em humanos. / Leandro Amadeu Roth. -- 2014.
49 f.; 31 cm.
Orientador(a): Profª. Drª. Marta Ferreira Bastos
Dissertação (Mestrado em Odontologia) – Centro de Pós-Graduação, Pesquisa e Extensão, Universidade Guarulhos, Guarulhos, SP, 2014.
1. Integrinas. 2. Implantes Dentários. 3. Cicatrizadores. 4. Mucosa Peri-implantar. 5. Expressão gênica. 6. PCR em tempo real. I. Título. II. Universidade Guarulhos.
CDD. 617
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“A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas pensar o que ninguém ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê.”
(Arthur Schopenhauer)
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Aos meus maravilhosos pais, Fernando e Irene, que me ensinaram o valor da
honestidade, da perseverança e do conhecimento, dedico mais esta conquista em minha vida....
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AGRADECIMENTOS Agradeço, primeiramente, a Deus, por iluminar-me o caminho para esta realização,
e, também, aos meus pais, por lutarem e sonharem comigo sempre que busquei
alcançar algo novo.
Ao meu filho João Victor, por entender minhas ausências; espero ser-lhe, um dia,
um pai como os meus.
Aos meus irmãos Giovani, Silvia e Junior, pela companhia e apoio nos momentos
difíceis.
A minha namorada Luciana, agradeço pelo amor e carinho, pelo incentivo na busca
do conhecimento, pelo conforto nos momentos de lamentação seguido de palavras
que me ajudaram a perseverar.
A minha Orientadora Prof. Dra. Marta Bastos, por acreditar em meu potencial, pelos
ensinamentos sabia e humildemente transmitidos e, sobretudo, pela paciência, pois,
com destreza, soube tranquilizar-me nas horas de ansiedade.
Ao meu Co-orientador Prof. Dr. Jamil Shibli, um grande exemplo de profissional e
uma referência para qualquer pesquisador.
Aos meus colegas de Mestrado, obrigado pela convivência! Que ela estenda-se ao
longo dos anos.
Aos meus amigos, pela amizade sincera, que superou nosso pouco tempo de
convivência durante esta jornada, saindo dela ainda mais robustecida.
Aos professores do Mestrado acadêmico em Odontologia: Profa. Dra. Luciene
Cristina de Figueiredo, Profa. Dra. Alessandra Cassoni Ferreira, Profa. Dra Magda
Feres, Prof. Dr. José Augusto, Profa. Dra. Poliana Duarte, Prof. Dr. André Figueiredo
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Reis; Prof. Dr. Leandro Chambrone; em especial, ao Prof. Dr. Marcelo de Faveri,
pelo material, gentilmente, cedido para esta pesquisa.
Aos pacientes, pois sem eles não seria possível realizar este trabalho.
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RESUMO
Para a preservação do osso marginal e um bom prognóstico dos implantes orais, existe a necessidade da formação de uma barreira tecidual efetiva e estável, capaz de proteger biologicamente as estruturas peri-implantares. Neste contexto, a estabilidade da interface implante-mucosa peri-implantar são de fundamental importância e sugere-se que esta interação pode ser influenciada pela constituição química do material e topografia de superfície dos implantes e conexões. As integrinas desempenham um importante papel em todos os processos baseados no desenvolvimento e manutenção de interações célula-célula e célula-matriz. Porém, poucos estudos avaliaram o efeito das modificações nas superfícies de pilares protéticos e implantes com o objetivo de criar uma superfície ideal melhorando a adesão em nível molecular por meio da expressão de integrinas. Portanto, o presente estudo avaliou a influência de diferentes topografias de superfícies dos pilares de cicatrização sobre os níveis de expressão gênica das integrinas α2, β1, αv e β6 na mucosa peri-implantar. Foram incluídos no estudo, treze adultos saudáveis (mulheres, n=8 e homens, n=5) com idade variando de 26 a 50 anos, que se adequaram aos critérios de inclusão e exclusão do estudo. Os participantes, de acordo com o número de implantes necessários, foram consecutivamente alocados a um dos quatro grupos experimentais: grupo RR (superfície totalmente rugosa); grupo PR (parte superior polida + parte inferior rugosa); grupo RP (parte superior rugosa + parte inferior polida); grupo PP (superfície totalmente polida). Um total de 40 amostras de mucosa peri-implantar ao redor dos pilares de cicatrização foram coletadas (n=10/grupo), trinta dias após a instalação dos implantes para avaliação da expressão genica por PCR em tempo real. Foi possível observar um maior nível de expressão gênica da subunidade β1 de integrina nos tecidos peri-implantares de indivíduos que receberam cicatrizadores com superfície totalmente rugosa (RR) em comparação aos demais grupos (p<0,05). Não houve diferença entre os cicatrizadores com diferentes topografias de superfície nos níveis de expressão gênica das subunidades α2, αv e β6 nos tecidos peri-implantares (p>0,05). Logo, pode-se concluir que uma superfície totalmente tratada pode influenciar uma maior expressão da subunidade β1 em trinta dias após a instalação. Palavras-chave: integrinas, implantes dentários, cicatrizadores, mucosa peri-implantar, expressão gênica, PCR em tempo real.
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ABSTRACT
An effective and stable barrier that could biologically protect the peri-implantar structures, necessary to preserve the marginal bone and keep a long-term survival for dental implants. In this context, the stability of implant-soft tissues interactions is particularly important and has been described that this process may be influenced by chemical constituents and topography surface of the implants and connections. Integrins perform a important role in all biologic process based on development and maintaining of cell interactions, however a few number of studies evaluated the effect of modifications on abutments/implants surfaces, in the improvement in molecular levels of the adhesion through of the integrins expression. Therefore, present study evaluated the influence of different topographic surfaces of abutments on the gene expression levels for α2-, β1-, αv- and β6- subunits integrins in the perimplantar mucosa. They were included in this study, thirteen healthy adults (female, n=8 and male, n=5) with age between 26 to 50 years, which had been adjusted for inclusion and exclusion criteria. The participants, according with the number of implants necessary, were consecutively distributed to one of the four experimental groups: group RR (totally rough surface); group MR (upper machined + treatment, lower rough); group RM (upper rough surface + lower machined + treatment); group MM (totally machined, no treatment). A total of 40 samples of perimplantar mucosa around the abutments were collected (n=10/group) 30 days after the implants placement, and subsequently the gene expression was evaluated by Real time PCR. It was possible to observe a greater level of gene expression of the β1-subunit integrin for individuals that received RR abutments (group 1) when compared with other groups (p < 0.05). Concomitantly, there were no differences in gene expression levels for α2, αv and β6-subunits integrins in perimplantar mucosa that received abutments with different topographic surfaces. Therefore, it is possible to conclude that topographic surfaces of the abutments may influence the quality of the perimplantar mucosa in the initial stages of healing process.
Key words: integrins, dental implants, abutments, perimplantar mucosa, gene expression, Real time PCR.
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LISTA DE ABREVIATURAS
EJ Epitélio juncional
HD Hemidesmossomos
LBI Lâmina basal interna
LBE Lâmina basal interna
MAC Molécula de adesão celular
LM Laminina
MMP Metaloproteinases de Matriz
TGF-β1 Fator de crescimento transformador β1
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
FGF Fator de crescimento de fibroblastos
EGF Fator de crescimento epidermal
TN-C Tenascina-C
EPI Epitélio peri-implantar
JCE Junção cemento esmalte
MEC Matriz extra celular
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 11 1.1. Coágulo e Inflamação 12 1.2. Re-epitelialização e formação do tecido de granulação 12 1.3. Características Biológicas do Epitélio Juncional 14 1.4. Integrinas 17 1.5. Superfícies 24
2. PROPOSIÇÃO 27 3. MATERIAL E MÉTODOS 28
3.1. População de estudo 28 3.2. Desenho experimental 28 3.3. Avaliação da expressão Gênica. 31 3.4. Análise estatística 33
4. RESULTADOS 35 5. DISCUSSÃO 37 6. CONCLUSÃO 41 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 43 ANEXO 1 49 ANEXO 2 50
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1 INTRODUÇÃO
Implantes dentais são parte da rotina de reabilitações orais. A
instalação de implantes dentais no osso alveolar desencadeia uma série de
processos envolvidos no reparo do tecido ósseo e mucosa oral. Os implantes
dentais quando instalados podem ser cobertos completamente por tecido mucoso ou
estar conectados à cavidade bucal com o cicatrizador, o que promove uma alteração
no processo de cicatrização da ferida cirúrgica, quer seja no tecido mucoso quer
seja no tecido ósseo (Rompen et al., 2006; Vilar et al., 2012).
Nos casos em que o implante é colocado com um parafuso de
cobertura e completamente coberto com o tecido mucoso com fechamento primário
(fechamento, sutura, cicatrização por primeira intenção), o tecido mucoso irá
cicatrizar rapidamente com a formação mínima de tecido de granulação, porém
quando imediatamente é instalado um cicatrizador ou pilar protético permanente e
restauração, a resposta de cicatrização do tecido mucoso será diferente daquele
associado com a cobertura do implante. Nesse caso, forma-se um coágulo
sanguíneo entre o cicatrizador/pilar protético e o tecido mucoso (Vilar et al., 2012).
Vários estudos têm avaliado o impacto de diferentes topografias de
implantes sobre o tecido ósseo peri-implantar (Shibli et al., 2006; Grassi et al., 2007;
Coelho et al., 2008; Shibli et al., 2010) mas pouco ainda tem sido avaliado sobre o
tecido mucoso peri-implantar (Zitzmann et al., 2002; Wennerberg et al., 2003;
Piattelli et al., 2011; Schwarz et al., 2013). A reparação de ferimentos ósseos ao
redor de implantes dentais é um mecanismo de reparo coordenado e
sequencialmente organizado. Os principais responsáveis neste processo são as
células, as quais se comunicam umas com as outras por trocas moleculares via
receptores específicos na superfície celular. Os diferentes tipos celulares aparecem
em uma sequência cronológica em 4 fases envolvidas na cicatrização de ferimentos,
um conceito originado de observações científicas da cicatrização de tecidos moles e,
que, pode ser transferido para a reparação do tecido ósseo ao redor do implante
dental: hemostasia, fase inflamatória, fase proliferativa e finalmente a fase de
remodelação (Therheyden et al., 2012).
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1.1 Coágulo e inflamação
A cicatrização de ferimentos de tecidos moles na cavidade oral segue
com os mesmos princípios de outras áreas do corpo, como a pele. A reação de
cicatrização no local da osteotomia é iniciada por formação de coágulo nas
proximidades das roscas que inicialmente sela o ferimento. Esse coágulo é infiltrado
por células inflamatórias, como os neutrófilos e macrófagos. Macrófagos são
considerados as células especializadas em reparar ferimentos e recentes evidencias
sugerem que as populações de macrófagos no ferimento mudam ao longo do tempo
e, que células com diferentes fenótipos orquestram diferentes fases de cicatrização
(Brancato; Albina, 2011). Entre as citocinas e outros fatores regulatórios liberados
pelos macrófagos, encontram-se o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF),
o fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e o fator de crescimento transformador
β-1 (TGF β-1) (Oakley; Larjava, 2012; Turabelidze; DiPietro, 2012; Fredman; Serhan,
2012).
Além disso, o coágulo de fibrina-fibronectina fornece uma matriz
provisória utilizadas pelos fibroblastos e células epiteliais para migrar para o espaço
que restringe a ferida cirúrgica. Dessa forma, as células progenitoras de fibroblastos
invadem a matriz provisória e depositam tecido de granulação que se torna
vascularizado pela migração de células endoteliais (Vilar et al., 2012).
1.2 Re-epitelialização e formação do tecido de granulação
Durante a cicatrização, as células do tecido epitelial migram em direção
ao implante/pilar protético, achatam-se ao longo da superfície e criam um epitélio
peri-implantar com funções similares ao epitélio juncional. Contudo, a adesão deste
epitélio ao implante não parece ser semelhante a adesão do epitélio juncional ao
dente (Larjava et al., 2011).
Vinte e quatro horas após início do processo de cicatrização, células
epiteliais da margem da ferida dissolvem suas adesões hemidesmossomais e
exibem os primeiros sinais de migração. Em 48 horas, o processo de proliferação
tem início, e células epiteliais migram através da matriz provisória de fibrina-
fibronectina até entrarem em contato com as células vindas do outro lado da lesão.
Esta migração é um processo complexo, que depende de receptores de matriz tipo-
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integrinas localizados na superfície das células migratórias para facilitar a
penetração ao longo da matriz extracelular (Koivisto et al., 2012)
A matriz extracelular é composta por proteínas presentes na matriz
provisória e aquelas sintetizadas pelas células, incluindo laminina-332 (LM-332),
fibronectina e tenascina C. A adesão das células à matriz deve ser um processo
bem coordenado, pois uma forte adesão prejudicaria a migração e uma fraca adesão
não promoveria força suficiente para o movimento migratório. Quando células
epiteliais encontram esta resistência ótima de adesão, sua migração pode ser
estimulada por diversas citocinas e fatores de crescimento, como o fator de
crescimento epidermal (EGF), TGF-β1, entre outros (Koivisto et al., 2012)
A re-epitelialização é também dependente de enzimas proteolíticas,
incluindo plasmina e metaloproteinases de matriz (MMPs). Essas enzimas suportam
a migração celular em diversos níveis por atuarem na quebra da matriz provisória,
que consequentemente promove a perda de adesão das células epiteliais, e também
por ativarem fatores de crescimento como TGF-β1 e EGF. A atividade das MMPs
necessita ser bem controlada pois sua atividade descontrolada está associada a
processos crônicos caracterizados por falha na re-epitelialização (Koivisto et al.,
2012).
A formação do tecido de granulação inicia simultaneamente com a re-
epitelialização; contudo, a maturação do tecido conjuntivo leva muito mais tempo e
pode continuar por meses e anos. O tecido de granulação tem por função substituir
a matriz provisória e fornecer suporte para formação do tecido conjuntivo. Pequenos
ferimentos com fechamento primário cicatrizam ligeiramente, com rápida re-
epitelialização e formação de pequena quantidade de tecido de granulação. Porém,
feridas abertas apresentam lento fechamento epitelial e maior formação de tecido de
granulação.
O tecido de granulação é formado por células inflamatórias, como
neutrófilos e macrófagos, que secretam diversos fatores capazes de ativar e recrutar
fibroblastos residentes na margem do ferimento, células mesênquimais progenitoras
e células tipo fibroblastos circulantes. Estas células migram para a matriz provisória,
juntamente com células formadoras de novos vasos sanguíneos, formam o tecido de
granulação e, subsequentemente, transformam-no em tecido conjuntivo.
Semelhante à migração de células epiteliais, a migração de fibroblastos também
depende da indução de certas integrinas e da produção de nova matriz composta
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por fibronectina, Tenascina-C, hialurona, colágeno tipo III, além da expressão de
várias enzimas degradantes da matriz. Os fibroblastos apicais depositam fibras
colágenas que correm paralelamente à superfície do implante sem inserção em sua
superfície. Isto pode ser explicado pela falta de formação do cemento radicular na
interface implante-tecido conjuntivo (Vilar et al., 2012).
Quando uma quantidade suficiente de colágeno é produzida no tecido
de granulação, ocorre a contração do ferimento, reduzindo a área de superfície e
aumentando a velocidade do fechamento da lesão. Essa contração é mediada por
diferentes miofibroblastos que usam os receptores de integrinas para retrair a matriz.
Os miofibroblastos originam-se de fibroblastos locais residentes e/ou de outras
células progenitoras na presença de determinadas moléculas de matriz e fatores de
crescimento incluindo fibronectina e TGF-β1 (Koivisto et al., 2012).
Após a retração da ferida, ocorre a remodelação do tecido de
granulação. Durante este processo, fibroblastos degradam, remodelam e
reorganizam a matriz extracelular. Sinais mecâno-sensoriais alterados do tecido de
remodelação, irão reduzir a atividade extracelular, promovendo a queda na produção
de matriz e a apoptose dos miofibroblastos. O final desta cicatrização em algumas
partes da mucosa oral (gengiva e palato) resulta na formação de um novo tecido
livre de cicatriz e com características histológicas similares ao tecido conjuntivo
normal (Koivisto et al., 2012).
A angiogênese está fortemente associada à formação do tecido de
granulação durante a cicatrização do ferimento. Traumas aos tecidos iniciam o
processo de angiogênese na rede de capilar. Para a migração, as células endoteliais
destacam se da membrana basal e usam seus receptores de integrinas para a
movimentação celular. Esse processo é similar à re-epitelialização, mas envolve
diferentes integrinas. Plaquetas, células inflamatórias, especialmente macrófagos, e
fibroblastos residentes liberam fatores angiogênicos, como VEGF que apresenta
papel crucial na promoção da angiogênese (Koivisto et al., 2012).
1.3 Características Biológicas do Epitélio Juncional
A gengiva, localizada ao redor de cada dente é estruturada para resistir
às forças da mastigação. A gengiva atua como um compartimento e tem a função de
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proteger o tecido ósseo da cavidade oral. Em geral, a gengiva é composta por um
tecido conjuntivo e pelo epitélio gengival que pode ser classificado em: epitélio oral,
epitélio sulcular e epitélio juncional (EJ) (Figura 1) (Shimono et al., 2003). O epitélio
juncional ocupa um papel fundamental na defesa do hospedeiro contra a invasão
bacteriana das doença periodontais, que são caracterizadas pela presença de uma
inflamação crônica induzida pela invasão de produtos de bactérias patogênicas
presentes na placa sub-gengival (Tsukamoto et al.,2012).
O EJ forma uma fina estrutura não queratinizada, localizada entre a
junção cemento esmalte (JCE) e o assoalho do sulco gengival. A inserção do EJ é
realizada por hemidesmossomos (HD) e pela lâmina basal interna (LBI). As células
basais do EJ inserem-se no tecido conjuntivo por HD e pela matriz extra celular
(MEC) na lâmina basal externa (LBE). Os componentes da LBI e da LBE são
análogos porem não são absolutamente idênticas. Devido a esta localização entre o
tecido mole e duro, o EJ apresenta um papel de proteção contra injurias físicas e
bacterianas. As junções intercelulares são livres no EJ que contém apenas poucos
hemidesmossomos, junções aderentes, “gap” juncionais, portanto, permitem que
células e o exsudato inflamatório fluam através do sulco gengival (Bosshardt; Lang,
2005, Masaoka et al., 2008) (Figura 2 e 3).
Figura 1: Gengiva humana saudável vista por microscopia óptica. ABC: crista óssea alveolar; AEFC: fibras extrínsecas do cemento acelular; CEJ: junção cemento-esmalte; CT: tecido conjuntivo gengival; D: dentina; ES: espaço esmalte; GM: margem gengival, JE: epitélio juncional; OGE: epitélio gengival oral, OSE: epitélio sulcular oral, PL, ligamento periodontal. (Bosshardt;Lang, 2005)
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O EJ é derivado do epitélio do esmalte, os ameloblastos deixam uma fina
membrana na superfície do esmalte quando finalizam a formação das matrizes do
esmalte, resultando em um epitélio reduzido do esmalte. Ultra-estruturalmente o EJ
é caracterizado pela presença de células epiteliais atróficas, organelas pobremente
desenvolvidas e amplo espaço intercelular. O espaço intercelular pode incluir um
número variado de neutrófilos transmigrantes e leucócitos mononucleares. Testes
sugerem que o espaço intercelular amplo no EJ é devido ao pequeno número de HD
no tecido estas características morfológicas suportam fortemente a noção que o EJ
é altamente permeável (Shimono et al., 2003; Bosshardt;Lang, 2005).
No epitélio peri-implantar (EPI), a lâmina basal e os HD estão presentes
na região média e apical da interface implante-EPI, porém estão ausentes na porção
mais externa (Figura 4). O EPI adere-se à superfície do implante através da LBI (LBI
compreende as camadas lâmina lúcida e lâmina densa) e HD que se assemelham
muito ao mecanismo pelo qual as células do EJ conectam-se ao dente natural, um
Figure 2. Fotomicrografia obtida por microscopia eletrônica de varredura mostrando a redução gradual, no sentido apical, do epitélio juncional (JE) em um dente de porco com uma gengiva clinicamente saudável. CEJ, junção cemento-esmalte; CT, tecido conjuntivo gengival; D, dentina; ES, espaço esmalte (Fonte: Bosshardt;Lang, 2005)
Figura 3. Fotomicrografia confocal do epitélio juncional de rato (JE) mostrando a localização de laminina-5. Imunorreatividade linear pode ser detectada no limite entre o esmalte (E) e JE, correspondente à lâmina basal interna (IBL). Abreviatura: EBL, lâmina basal externa. (Bosshardt;Lang, 2005)
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mecanismo sustentado pela expressão de LM-332 e integrina α6β4 (Kinumatsu et
al., 2008, Atsuta et al., 2013).
O epitélio juncional ao redor dos implantes se origina a partir de células
epiteliais da mucosa oral, resultado de um processo cicatricial, ao contrário do
epitélio de juncional que se origina ao redor dos dentes a partir do epitélio reduzido
do esmalte (Shimono et al., 2003; Bosshardt; Lang, 2005). Desta forma, na literatura
existe o questionamento se as características estruturais e funcionais destes dois
epitélios juncionais são idênticas ou não. Diferenças são observadas a respeito do
posicionamento da porção mais apical do EJ, o qual em dentes se apresenta no
nível da junção cemento esmalte, e em implantes, posiciona-se a uma distancia
variável da margem gengival. Outra diferença entre EJ e EPI está na ausência da
camada de cemento e das fibras de Sharpey. Consequentemente, os feixes de
fibras colágenas no dente (fibras dento-gengivais, dento-periodontais e circulares)
estão inseridas perpendicularmente à superfície do dente, enquanto que em
implantes, uma densa rede de fibras colágenas esta presente, estendendo se da
crista óssea alveolar paralelamente à superfície do implante (Rompen et al., 2006;
Piattelli et al., 2011).
O tecido conjuntivo localizado sob o EPI consiste de colágeno tipo I e III,
enquanto o tecido conjuntivo supra-crestal é composto principalmente por colágeno
tipo I. Um estudo ultra-estrutural e imunohistoquímico da interface do implante
Figura 4: Comparação da adesão epitelial à superfície do dente (A) e a superfície do implante dentário (B). Epitélio se adere ao implante por um epitélio peri-implantar longo em comparação com o dente. A lâmina basal interna (IBL) contendo laminina 332 (LM332) pode estar presente apenas no terço apical da interface implante epitélio juncional. JE: epitélio juncional, CT: Tecido conjuntivo (Larjava et al., 2011)
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revelou que o EPI se associa ao implante via hemidesmossomos (Shimono et al.,
2003, Piattelli et al., 2011).
A dimensão do complexo dento-gengival (distância da gengiva marginal
ao osso) tem sido relatada como sendo levemente maior para implantes orais (2,85-
3,8 mm) do que a dimensão correspondente ao complexo ao redor do dente (2,72-
3,25 mm), independente do fato dos implantes estarem submersos (Larjava et al.,
2011). Tem se relatado que o espaço biológico do dente natural é em torno de 2
mm, composto por 1 mm de inserção epitelial mediada pelo EJ e 1 mm de inserção
de tecido conjuntivo gengival. Diversos estudos relataram que o EPI possui
aproximadamente 2 mm de extensão (Rompen et al., 2006; Piattelli et al., 2011).
Assim o aumento na dimensão do complexo dento-gengival ao redor de implantes
orais é devido ao aumento do comprimento do EPI, sugerindo que superfícies
convencionais de implantes não podem deter a formação da “inserção epitelial
longa” (Larjava et al., 2011).
Alguns estudos relatam que apenas o terço inferior do EPI adere-se ao
implante (Figura 4). A expressão de LM-332 entre o EPI e a superfície do implante
parece estar limitada apenas à parte mais inferior do EPI (Larjava et al 2011).
1.4 Integrinas
As Integrinas desempenham um importante papel em todos os processos
baseados no desenvolvimento e manutenção de interações célula-célula e célula-
matriz. Isto inclui a adesão de células basais do epitélio a membrana basal, adesão
de células epiteliais umas as outras, e também proliferação, diferenciação, apoptose,
migração e cicatrização de ferimentos (Larjava et al., 2011, Koivisto et al., 2012,). Nos últimos 20 anos, os receptores de adesão celular da família das
integrinas têm sido identificados em todos os vertebrados. Integrinas pertencem a
uma família de moléculas de adesão celular (MAC), expressas por numerosos tipos
celulares e que atuam como receptor de superfície para diferentes componentes da
MEC. Cada integrina é um heterodímero constituído em uma subunidade α e uma
subunidade β independentes (Figura 5). Cada subunidade possui um domínio
extracelular (N-terminal), um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático
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(C-Terminal), conforme ilustrado na Figura 6A (Graber et al., 1999; Hynes, 2002;
Hynes, 2004; Luo et al., 2007).
Após interação do ligante com as diferentes subunidades de integrinas, o
domínio citoplasmático interagem com membros do citoesqueleto por múltiplas e
complexas interações. As ligações das integrinas ao citoesqueleto, desencadeiam
uma grande variedade de eventos de transdução de sinais em um processo de via
dupla que regula a expressão gênica, que servem para modular diferentes aspectos
do comportamento celular, incluindo proliferação, sobrevivência/apoptose,
morfologia, polaridade, mobilidade e diferenciação (Figura 6B) (Hynes, 2002).
Portanto, integrinas são receptores de adesão celular que se ligam às
proteínas da MEC, como fibronectina e colágeno. Dentro da célula, o domínio
citoplasmático das integrinas associa-se a proteínas do citoesqueleto e assim
medeiam a informação da MEC para dentro da célula, desencadeando um processo
Figura 5: Família de receptores de integrina em vertebrados (Fonte: Hynes, 2002).
Figura 6: Estrutura das integrinas (A) Domínios extracelulares, transmembranosos e citoplasmáticos. (B): Estado de ativação e diferentes conformações das integrinas (Fonte: Larjava et. al., 2011)
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que regula a expressão gênica, proliferação e migração celular (Hynes, 2002, Hynes
2004).
Integrinas são expressas por vários tipos celulares, como: células
epiteliais, fibroblastos, osteócitos, células endoteliais, leucócitos, linfócitos e
plaquetas. Estudos imunohistoquímicos mostraram que 5 integrinas, subunidades
α2, α3, α6, β1 e β4, são sempre expressas por todas as células epiteliais,
independente do tecido estar saudável, inflamado ou em processo de cicatrização
(Hormia et al., 1990; Graber et al., 1999).
Queratinócitos basais presentes em epitélios saudáveis expressam
principalmente as integrinas α3β1, α2β1, α9β1 e α6β4, que atuam tanto na
ancoragem das células à membrana basal, como na manutenção da proliferação
epitelial normal e dos padrões de diferenciação. Durante a cicatrização, os
queratinócitos precisam ajustar seus receptores de integrinas para se aderir e migrar
sobre as proteínas da matriz do ferimento. Assim, uma exposição às moléculas
presentes na nova matriz e a influência de fatores de crescimento e citocinas
presentes no ambiente do ferimento, promovem uma mudança no nível de
expressão e/ou distribuição das integrinas dos queratinócitos existentes assim
induzindo uma matriz nova de receptores, mais notavelmente os 3 receptores de
fibronectina: α5β1, αvβ1 e αvβ6 (Larjava et al., 1993, Larjava et al., 1996, Larjava et
al., 2011; Koivisto et al., 2012). Os diferentes tipos de integrinas expressas por
queratinócitos presentes em tecidos durante processo de cicatrização foram
resumidas na quadro 1.
A Integrina α2β1 tem sido descrita como o principal receptor de colágeno
tipo I, IV, VI e laminina. A ligação desta integrina com colágeno é de alta afinidade o
que, portanto, torna improvável sua atuação no processo de migração celular. No
entanto, esta interação pode induzir a expressão de MMP-1 em queratinócitos,
produzindo uma desnaturação localizada na matriz de colágeno. No tecido em
cicatrização, a maior parte da cadeia de LM-332 produzida por queratinócitos
apresenta-se na forma não processada, que pode servir como ligante para a
integrina α2β1 para mediar migração de queratinócitos (Larjava, 1993; Gräber,
1999).
Estudos in vivo e in vitro têm demonstrado a presença de α2, α3, β1 na
região de contato intercelular das células epiteliais de camadas basais e também de
21
algumas camadas supra-basais. À medida que aumenta a diferenciação para as
camadas mais externas do epitélio, as células epiteliais param de expressar
integrinas. Larjava et al. (1993), em experimentos in vitro, dissociaram os contatos
intercelulares entre as colônias de células epiteliais usando anticorpos contra β1,
porém não foi observado perda do contato desta células com a MEC, sugerindo que
a função principal desta é a de uma molécula de adesão.
Interessantemente, o EJ saudável parece expressar integrinas que estão
presentes em queratinócitos na mucosa oral e pele durante a re-epitelialização de
ferimentos incluindo a expressão de αVβ6. Isto sugere que as células do EJ
permanecem constantemente em estado ativo similar ao que ocorre durante a
cicatrização, conforme ilustra a quadro 2 (Larjava, 2011).
A integrina αvβ6 é uma exclusiva proteína de adesão epitelial que está
ausente na maioria das partes da epiderme normal e mucosa oral saudáveis, porém
é peculiarmente expressa no EJ e epitélio oral da papila gengival. Estudos in vitro
demonstraram que a αvβ6 liga-se a MEC por interação com fibronectina, tenascina,
vitronectina e TGF-β1 latente (Koivisto et al., 1999). Outros estudos têm sugerido
que a principal função da integrina αvβ6 in vivo pode não estar relacionada somente
à adesão celular, mas também com sua habilidade de ativar TGF-β1 latente. A
primeira evidencia desta função vem de estudos que mostraram que a inativação do
gene β6, resulta em uma alteração na resposta inflamatória na pele e pulmão,
associada à sinalização alterada de TGF-β1, cuja função característica é a de
imunoregulação (Wahl et al., 2004, Li et al., 2006). Assim tem sido sugerido que a
ativação de TGF-β1 mediada por integrinas possa regular a função anti-inflamatória
em muitos tecidos, incluindo os tecidos moles da cavidade oral e pode ter um papel
protetor nos tecido periodontais (Ghannad et al., 2008). Durante a doença
periodontal, a proliferação aumentada de queratinócitos no EJ pode também
contribuir para a formação de bolsa, uma vez que a expressão reduzida de αvβ6
resultaria em uma menor ativação de TGF-β1 e, consequentemente, proliferação
aumentada de células do EJ. Pouco sabe se sobre a expressão de integrinas no
EPI, portanto é possível hipotetizar que um menor nível de adesão poderia contribuir
para a formação de lesões inflamatórias e perda óssea ao redor dos implantes
(Larjava et al., 2011).
22
Integrina Ligantes
Epiteliais Funções Envolvimento em re-epitelialização em modelos
animais Referências
α2β1 Colágeno (tipo I e III com alta avidez, LM-332, MMP-1
Regula expressão e localização de MMP-1: medeia a migração de Queratinócitos no colágeno fibrilar e LM-332: pode ajudar o sistema imune epitelial inato.
Re-epitelialização normal em ratos knockout para integrinas α2; aumenta a neoangiogenese.
Pilcher et al., 1997. Zweers et al., 2007.
α3β1 LM-332, outras Lamininas, (Colágeno, fibronectina)
Liga-se ao LM-332 recém depositada: regula a manutenção da membrana basal; mantém a adesão de queratinócitos durante a migração; promove a sobrevivência de queratinócitos; regula a polarização celular; atrasa a migração de queratinócitos; controla a angiogênese e medeia as repostas de TGF-β1
Migração de queratinócitos é levemente acelerada ou não afetada com a proliferação normal em queratinócitos em ratos knockout para integrina-alvo α3; re-epitelialização é retardada em integrinas α3 nula de enxertos em pele de ratos.
Carter et al., 1991 Mitchell et al., 2009
α5β1 Fibronectina Promove migração de queratinócitos; medeia a sinalização de crescimento celular e suprime a apoptose.
Não testada (fenótipo embrionário letal) Cavani et al., 1993 Bata-Csorgo et al., 1998
α9β1 Tenascina C; Fibronectina
Pode regular a migração celular em TN-C e FN; controla proliferação de queratinócitos
Migração reduzida de queratinócitos, epitélio de migração mais fino e fechamento da ferida atrasada em queratinócitos-alvo em ratos knockout para integrina alfa 9.
Palmer et al., 1993 Singh et al., 2009
α6β4 LM-332 e outras LMs
Promove adesão, mobilidade e proliferação de queratinócitos, pode regular a sinalização de HGF
Supressão do domínio intracelular sinalizador integrina β4 causa desaceleração a re-epitelialização do ferimento e reduzida migração de queratinócitos.
Larjava et al., 1993 Trusolino et al., 2001 Nikolopoulos et al., 2005
αvβ1 FN, VN, TGF-β1
Medeia adesão celular para fibronectina, pode ajudar sequestrar um grupo de TGF-beta1 inativos na estreita proximidade das células
- Larjava et al., 2004 Munger et al., 1998 Munger et al., 1999
αvβ5 VN, TGF-B1 Pode mediar a migração de queratinócitos em VN
Re-epitelialização normal em ratos knockout para integrinas β5
Munger et al., 1998 Juhasz et al., 1993 Huang et al., 2000
αvβ6
FN, TN-C, VN
Regula inflamação e proliferação de
Re-epitelialização normal em ratos knockout
Larjava et al., 2003
23
TGF-β1 latente
queratinócitos; contribui para a organização da membrana basal e remodelação do tecido de granulação; ativador de TGF-B1 e TGF-B3; induz a expressão MMP-9
para integrins β6; rápido avanço epitelial e proliferação de queratinócitos mais robustos em ratos knockout depois de tratamento com glicocorticoides; ratos com super-expressão de integrinas β6 são susceptíveis a ferimentos crônicos não cicatrizados
Munger et al., 1999 Haapasalmi et al., 1996 Breuss et al., 1995 Xie et al., 2009
αvβ8 LM-111, colágeno tipo IV, FN, TGF-β1
- - Steep et al., 1999 Cmabier et al., 2000
Quadro 1: Integrinas dos Queratinócitos presentes na re-epitelialização.(LM: Laminina; MMP: Matriz Metaloproteínase; TGF-β1: Fator de crescimento transformador β-1; TN-C; Tenascin-C; FN: Fibronectina; VN: Vitronectina.
24
A Componentes da Lâmina Basal
LBE LBI B Integrinas EJ EG EGC
LM111 √ - α2β1 √ √ √ LM332 √ √ α3β1 √ √ √ LM511 √ - α5β1 √* - √ Colágeno Tipo-IV √ - α9β1 ? √ √ Colágeno tipo-VIII ? √ α6β4 √ √ √ Perlacan √ - αvβ1 ? - √ Versican ? √ αvβ6 √ - √ Tenascin-C √ √* Quadro 2: (A) Composição molecular da LBE e LBI do EJ. (B) Expressão de integrinas no EJ, Epitélio Gengival Queratinizado (EG), e epitélio gengival em cicatrização (EGC). √Molécula presente; √*Expressão variável; - Não presente; ? Não relatada; LBE: Lâmina Basal externa; LBI, Lâmina Basal Interna; EJ: Epitélio juncional; EG, Epitélio Gengival; EGC: Epitélio Gengival em Cicatrização (Fonte: Larjava et al., 2011)
1.5 Superfícies de Implantes
Os implantes dentários em função ultrapassam a mucosa e entram em
contato com a cavidade oral, estabelecendo assim uma conexão transmucosa entre
o ambiente externo e as partes internas do organismo. Para evitar penetração
bacteriana, a formação de uma barreira efetiva e estável, capaz de proteger
biologicamente as estruturas peri-implantares, é de suprema importância. Essa é
uma parte crítica do processo de integração dos tecido moles, e pode ser
influenciada pela constituição química do material, topografia de superfície e tipos de
conexões. A qualidade e a estabilidade da interface implante-tecido mole são de
extrema importância para a preservação do osso marginal e para um bom
prognóstico dos implantes orais (Rompem et al., 2006; Rompen, 2012). Ziztmann
et al. (2002) realizaram um estudo em cães com o objetivo de avaliar algumas
reações da mucosa peri-implantar frente ao acúmulo de placa sobre pilares
protéticos com superfícies rugosa e polida. Após 6 meses de acúmulo de biofilme
bacteriano, foi observado o estabelecimento de lesões inflamatórias no tecido
conjuntivo da mucosa peri-implantar. No entanto, a localização, o tamanho e a
composição das lesões não foram diferentes para as superfícies polidas e rugosas,
o que sugere que as diferentes características de superfície de contato de titânio não
influenciaram na formação da placa e no estabelecimento de lesões de células
inflamatórias na mucosa peri-implantar. Wennerberg (2003) realizou estudo em
humanos e encontrou diferenças na quantidade de placa acumulada entre os
25
indivíduos que fizeram parte do estudo, porém não foi observada quanto à
rugosidade de superfície em relação à quantidade de placa e ao número de células
inflamatórias após 4 semanas de instalação dos implantes.
As características de superfície dos pilares protéticos podem ter um papel
relevante no acúmulo de biofilme bacteriano e subsequente desenvolvimento de
uma doença peri-implantar. De fato, superfícies usadas na porção transmucosa do
pilar deveriam ajudar na redução da adesão bacteriana, diminuindo a formação de
placa e a inflamação dos tecidos peri-implantares. Por outro lado, a microtextura de
superfície poderia também ajudar na integração dos tecidos moles. Sabe-se que a
topografia de superfície pode influenciar na orientação e proliferação das células na
superfície de titânio. Portanto, a topografia de um pilar poderia minimizar a adesão
bacteriana e permitir uma melhor inserção epitelial e conjuntiva (Nevins et al., 2010;
Degidi, 2012, Mangano et al., 2014).
Atualmente, existe um grande número de processos de tratamento para
alterar a topografia da superfície dos implantes de titânio. Superfícies hidrofílicas
facilitam a integração de tecidos moles e duros mais do que a microtopografia
(Schwarz et al., 2007). Estas superfícies de titânio hidrofílicas são caracterizadas por
uma nanoestrutura e melhorias na superfície de energia livre de TiO2. Estudo mais
recente demonstrou que superfícies modificadas melhoraram a reatividade de
fibronectina e a proliferação celular, e consequentemente estabeleceram uma maior
ligação de fibras colágenas durante os primeiros estágios de cicatrização (Schwarz
et al., 2013).
Recentemente, um novo processo de confecção de implantes vem sendo
utilizado, o sistema Direct Laser Metal Forming (DLMF, Leader-Novaxa, Cinisello
Balsamo, MI, Italy). Neste caso, o procedimento de formação de metal ocorre por
meio da incidência de um feixe de laser de alta potência direcionado para uma
camada de pó metálico (titânio em pó), e programado para fundir partículas de
acordo com arquivos CAD (Computer Assistence Design), gerando uma camada fina
de metal. A aposição de camadas subsequentes determina o formato 3D desejado
com a necessidade de mínimos ajustes pós-processamento. Com o DLMF, é
possível fabricar implantes dentários com diferentes formas e micro-características
de superfície, diretamente dos modelos CAD (Shibli et al., 2010) (Figura 8).
26
As modificações nas superfícies de pilares e implantes tem como objetivo
criar uma superfície ideal a qual poderia modular o comportamento celular do
epitélio peri-implantar, além de oferecer uma barreira mecânica ao tecido conjuntivo,
melhorando a adesão em nível molecular do epitélio juncional, via atuação das
integrinas.
No entanto, até o momento, não foram encontrados estudos clínicos e
moleculares sobre o efeito de diferentes topografias de superfície no prognóstico do
implante. Resultados de estudos in vitro e in vivo sugerem que a rugosidade e
textura da superfície podem ter um impacto sobre os eventos iniciais da cicatrização,
influenciando a inserção, orientação, proliferação e o metabolismo das células
epiteliais e do tecido conjuntivo (Rompen et al., 2006).
Figura 8: Fotomicrografia da superfície DMLF. (Barr = 500um) (Shibli et al., 2010)
27
2.PROPOSIÇÃO
O objetivo do presente estudo foi avaliar a influência de diferentes
topografias de superfície de cicatrizadores sobre os níveis de expressão
gênica das integrinas α2, β1, αv e β6 nos tecidos peri-implantares.
28
3.MATERIAL E MÉTODOS
3.1 População de estudo
Participaram deste estudo um total de 13 pacientes, 5 homens e 8
mulheres. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética da
Universidade de Guarulhos (ANEXO 1) e os pacientes assinaram um termo
de consentimento livre e esclarecido (ANEXO 2). Além disso, todos os
pacientes concordaram em participar de um programa de controle pós-
operatório.
Os critérios de inclusão utilizados neste estudo foram higiene
bucal controlada, ausência de lesões na cavidade bucal, rebordo ósseo
residual suficiente para a instalação de um implante dentário de 3,75 mm de
diâmetro e uma ampla faixa de tecido queratinizado.
Os critérios de exclusão eram volume ósseo insuficiente,
qualidade óssea tipo 4, alto grau de bruxismo, fumantes, consumo excessivo
de álcool, radioterapia, quimioterapia, doenças hepáticas, doenças
sanguíneas, doenças renais, imunodeprimidos, uso corticoesteróides,
gestantes e lactantes, doenças inflamatórias e autoimunes da cavidade oral
e pobre higiene oral.
3.2 Desenho experimental
Todos pacientes receberam implantes de hexágono interno
(Conect AR CONEXÃO, São Paulo, Brasil) de 3.75 mm de diâmetro e
diferentes comprimentos (entre 10 e 13mm), instalados nas regiões
posteriores da maxila e mandíbula Os implantes foram instalados de acordo
com a técnica preconizada pelo fabricante. Após a instalação dos implantes
e conferência de torque (mínimo de 20 N), os implantes receberam
imediatamente seus respectivos cicatrizadores provendo assim, condições
clínicas para implantes de estágio único. Foram utilizados os cicatrizadores
experimentais (TIXOS, LEADER, Cinisello Balsamo, MI, Itália), com média
de rugosidade (Ra=66.8 +- 6.56 um), rugosidade média de 10 pontos
29
(Rz=358.3+-101.87) e (Rq=77.55 +- 11.09 um) parâmetros típicos de altura.
Estes cicatrizadores possuíam 4 mm de diâmetro e 4 mm de altura com
quatro tipos de topografias diferentes: grupo RR (superfície totalmente
rugosa); grupo PR ( parte superior polida + parte inferior rugosa); grupo RP,
(parte superior rugosa + parte inferior polida); grupo PP, (superfície
totalmente polida), conforme ilustrado na Figura 9.
Após instalação dos cicatrizadores e conferência de adaptação à
plataforma dos implantes por meio de radiografias periapicais, o tecido
mucoso foi suturado ao redor dos cicatrizadores com fio de nylon 5.0. Foram
instalados um total de 40 implantes dentários, sendo que os cicatrizadores
foram inseridos consecutivamente , resultando 40 cicatrizadores
(n=10/grupo). Todos os pacientes foram submetidos a sessões de higiene
oral e incluídos em um programa de manutenção de avaliação e orientação
de higiene oral semanal.
Após período de cicatrização de 30 dias, uma biópsia da mucosa
peri-implantar foi realizada com um bisturi 15c ao redor dos cicatrizadores .
As dimensões médias da biópsias peri-implantares foram de 2,0 mm de
espessura por 3,0 mm em altura.
Imagens ilustrativas do processo de instalação de
implantes/cicatrizadores, após 30 dias de cicatrização e coleta das amostras
de mucosa peri-implantar estão representadas nas figuras 10 e 11.
Grupo RR
Grupo PR
Grupo RP
Grupo PP
30
Figura 10: Imagens ilustrativas da área de instalação dos implantes e pilares de cicatrização
(A) e da radiografia (B). Em C e D, imagens ilustrativas dos implantes e pilares de
cicatrização instalados e radiografia da área, respectivamente.
Figura 11: Imagens ilustrativas 7 (A) e 30 (B) dias após a instalação dos implantes e pilares
de cicatrização. Em C imagens ilustrativa do momento da remoção da mucosa peri-implantar
(vista oclusal) e amostra de mucosa peri-implantar removida (D).
31
3.3 Avaliação da expressão Gênica.
3.3.1 Extração do RNA
Imediatamente as amostras de tecido mucoso peri-implantar foram
acondicionados em uma solução de RNAlater® (Ambion Inc., Austin, TX,
EUA), para evitar a degradação do RNA. As amostras permaneceram
incubadas a 4oC durante 24 horas e em seguida foram armazenadas a -20oC
até o momento da extração. Primeiramente, a solução de RNA later foi
aspirada e o tecido foi acondicionado em nitrogênio líquido para trituração. A
amostra triturada foi então colocada no reagente TRIZOL (Gibco BRL, Life
Technologies, Rockville, MD, EUA), homogeneizada durante 30 segundos e
incubada por 5 minutos à temperatura ambiente. Após esse período, foi
adicionado clorofórmio (Sigma, St. Louis, MO, EUA), as amostras foram
agitadas em vórtex e centrifugadas a 11500 rpm por 15 minutos em uma
temperatura de 4oC. A porção aquosa foi transferida para outro tubo, no qual
foi adicionado isopropanol, agitado, incubado por 20 minutos a uma
temperatura de – 20oC e centrifugado da mesma forma como descrito acima.
As amostras de RNA foram subsequentemente resuspensas em
aproximadamente 50 µL, de água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) e
armazenadas a –70oC. Finalmente, a concentração de RNA foi determinada
por meio de um espectrofotômetro. Em seguida, 1 µg do RNA total foi
avaliado quanto a sua qualidade por meio de eletroforese em gel de agarose
1%.
3.3.2 Tratamento com DNAse
As amostras de RNA total foram tratadas para a eliminação de
qualquer resíduo de DNA com DNAse (DNA-free TM, Ambion Inc., Austin, TX,
EUA), conforme recomendação do fabricante. Nos tubos contendo o RNA
total extraído foi adicionada a solução tampão e a DNAse turbo, baseado na
concentração de RNA previamente avaliada. Após agitação e centrifugação,
as amostras permaneceram incubadas a 37oC durante 30 minutos.
Finalmente, foi acrescentado o inativador e a solução foi agitada e
centrifugada. O RNA total foi novamente quantificado por meio de um
32
espectrofotômetro.
3.3.3 Transcrição reversa
Um total de 2 µg da amostra de RNA total livre de DNA foi
utilizado para a síntese do cDNA. As reações foram realizadas para um
volume final de 30 µL utilizando o kit First-Strand cDNA Synthesis (Roche
Diagnostic Co., Indianápolis, IN, EUA), seguindo as recomendações do
fabricante. Inicialmente, as amostras foram incubadas por 10 minutos a 25oC
e, em seguida, por 60 minutos a 42oC. Concluída a segunda etapa de
incubação, as amostras foram incubadas por 5 minutos a 95oC e então por 5
minutos a 4oC para resfriamento. Os reagentes utilizados e suas respectivas
concentrações foram: solução tampão (1x), MgCl2 (5mM),
desoxinucleotídeos (1mM), primers randomizados (3,2µg), inibidor de RNAse
(50U), e trancriptase reversa AMV (20U).
3.3.4 Análise da expressão gênica por Real-time PCR (RT-PCR)
3.3.4.1 Desenho dos Primers
Os primers para GAPDH (glycerin-aldehyd-3-phosphat-
dehydrogenase, gene de referência), α2, β1, αv e β6 foram desenhados com
o auxílio de um programa desenvolvido especificamente para elaboração de
primers para o LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Alemanha). Todos os primers foram verificados quanto a sua especificidade
por meio da análise da curva de Melting utilizando-se sempre controles
positivos e negativos. No Quadro 3 podem ser observadas a sequência dos
primers, o perfil das reações e a tamanho dos amplicons.
3.3.4.2 Otimização das reações
A eficiência das reações para cada gene foi otimizada anteriormente ao
início das reações propriamente ditas. Concentrações variando de 2,5 a 5 M
33
de cada par de primers foram utilizadas para se determinar em quais
condições a reação apresentava a melhor eficiência, conforme sugestões do
fabricante do equipamento, escolheu-se a de 5 µM. Gene Sequencia (5’ – 3’) Perfil de Amplificação
[temperatura (°C)/ tempo (s)]
Tamanho do Amplicon
(bp)
α2 F: AGCCTATTCGAGCTGCC 95/10; 56/5; 72/10 290
R: CAGTGTTGTATGCACTTTCCC
β1 F: GTAACAATGGAGAGTGCGTC 95/10; 54/10; 72/10 300
R: GCTCTGCACTGAACACATTC
αv
β6
F: CACCAACTCCACATTGGTTAC 95/10; 56/7; 72/10
95/10; 56/7; 72/10
289
295
R: CTGCAGTTAAGTTTCTGAGTTTCC
F: GTACTGCAACTGCACCAC
R: GCAGCTCCGTTTAGAGTTAC
GAPDH F: CTGAGTACGTCGTGGAGTC 95/10; 56/5; 72/7 250
R: TGATGATCTTGAGGCTGTTGTC
Quadro 3: Porcentagem de resíduos de guanina (G) e citosina (C) e a temperatura de
Melting (TM) dos primers. (GADPH = glycerin-aldehyd-3-phosphat-dehydrogenase)
3.3.4.3 Reações de RT-PCR
As reações de RT-PCR foram realizadas com o sistema
LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), utilizando o
kit FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim, Alemanha). O perfil das reações foi determinado seguindo o
protocolo sugerido pelo fabricante do equipamento. Para cada uma das
análises, água foi utilizada como controle negativo, e o produto das reações
foi quantificado utilizando-se o programa do próprio fabricante (LightCycler
Relative Quantification Software - Roche Diagnostics GmbH). Os níveis de
expressão do gene GAPDH foram utilizados como referência (housekeeping)
para a normalização dos valores.
34
3.4 Análise estatística A análise estatística foi realizada pelo programa Prism 6.0 (GraphPad
Software Inc., San Diego, CA, EUA). Inicialmente, os dados foram analisados
quanto a normalidade pelo teste de Shapiro-Wilk e quando detectada
ausência de normalidade dos valores, foram utilizados métodos estatísticos
não paramétricos. As diferenças na frequência dos gêneros foram
avaliadas pelo teste exato de Fisher. A idade dos indivíduos incluídos no
estudo foi avaliado por ANOVA. Todos os dados demográficos foram
apresentados como média e desvio padrão, exceto gênero. As comparações
na expressão gênica das integrinas α2, β1, αv e β6 foram realizadas por
Kruskal Wallis e as comparações das diferenças significativas entre pares
de grupos foram realizada pelo teste de Dunn. Os resultados foram
expressos em mediana e valor mínimo e máximo
Para todas as análises, o nível de significância foi estabelecido em 5%
(p<0,05).
35
4. RESULTADOS
Todos os indivíduos incluídos no estudo apresentavam sinais clínicos de
saúde periodontal, respeitando os critérios de inclusão e exclusão. Inicialmente foi
obtido um total de 40 amostras divididas para os quatro grupos experimentais
(n=10/grupo). Durante os processos de extração de RNA foram excluídas duas
amostras (pertencentes aos grupos 1 e 4) que não apresentavam qualidade
necessária para prosseguir nas análises. Na etapa do PCR em Tempo Real (RT-
PCR), outras duas amostras não apresentaram expressão do gene de referência
(GAPDH) e também foram excluídas das demais análises (pertencentes aos grupos
2 e 3), totalizando 9 amostras para cada grupo.
A população de estudo foi composta por 13 indivíduos, dos quais 5 eram
homens e 8 mulheres, com idade média de 38 anos. Não foi observada diferenças
significativas dentre os grupos estudados para idade ou sexo (p>0,05).(Quadro 4)
Pacientes Idade No.
Cicatrizadores Grupo
RR Grupo
PR Grupo
RP Grupo
PP P1 41 3 X X X P2 33,2 3 X X X P3 33,9 6 X XX XX X P4 41,8 3 X X X P5 32,1 3 X X X P6 31,1 1 X P7 35,5 4 X XX X P8 46,7 3 X X X P9 45,11 4 X X X X
P10 45,8 1 X P11 50,11 4 X X X X P12 26,8 4 X X XX P13 50,6 1 X
38,75+-0,83 40 10 10 10 10
Os resultados de expressão gênica das subunidades α2, β1, αv, β6 de integrinas em relação ao gene de referencia GAPDH estão apresentados na Figura 12.
Não foram detectadas diferenças significativas entre os níveis de
expressão gênica para as subunidades α2, αv e β6 de integrinas para os grupos RR
(totalmente rugoso), grupo PR (parte superior polida + parte inferior rugosa), grupo
RP (parte superior rugosa + parte inferior polida) e grupo PP (totalmente polido)
(p<0,05).
Quadro 4: Relação do número de cicatrizadores instalados em cada paciente.
X: amostras perdidas.
36
O grupo RR (totalmente rugoso) apresentou maiores níveis de expressão
gênica da subunidade β1 quando comparados aos grupo PR (parte superior polida +
parte inferior rugosa, p= 0,006), RP (parte superior rugosa + parte inferior polida,
p=0,031) e PP (totalmente polido, p= 0,01).
Figura 12: Níveis de expressão gênica das integrinas α2 (A), β1 (B), αv (C), β6 (D) em relação a
expressão do gene de referencia (GAPDH: glycerin-aldehyd-3-phosphat-dehydrogenase).
* Representa significância estatística pelo método não paramétrico de Kruskall Wallis e Dunn
(p<0,05).
RR PR RP PP RR PR RP PP
RR PR RP PP RR PR RP PP
37
5. DISCUSSÃO
No presente estudo foi avaliada a influência da topografia de superfície
dos pilares de cicatrização, fabricados nos sistema DLMF, por meio da avaliação da
expressão gênica das subunidades de integrinas α2, β1, αv e β6. Os resultados
mostraram que as diferentes superfícies testadas não promoveram diferenças na
expressão gênica das subunidades de α2, αv e β6. Porém, para a subunidade β1 de
integrina foi observada uma maior expressão nos tecidos coletados dos indivíduos
que receberam cicatrizadores do grupo RR (totalmente rugoso) em relação aos
demais grupos Esta observação ratifica o estudo de Schwarz et al., (2007), realizado
em cães, no qual por meio de teste histomorfométricos e imunohistoquímicos, foi
demonstrado que superfícies hidrofílicas influenciaram a integração de tecidos moles
e duros. Mais recentemente, Schwarz et al. (2013) realizaram estudo em humanos e
observaram que superfícies hidrofílicas melhoraram a adesão dos tecidos peri-
implantares, conferidos através de exames histológicos em contato epitelial e
contato do tecido conjuntivo subepitelial à superfície do pilar.
Integrinas formam uma família de receptores celulares fundamentais na
adesão celular, na regulação da função dos queratinócitos, na cicatrização e na
sinalização intracelular inicial em resposta aos componentes da matriz extracelular
(Larjava et al., 1993; Häkkinen, 2004). A interação entre integrinas e os
componentes da ECM desempenha um papel central em todos os processos que
formam a base para a re-epitelialização de ferimentos, como também na
regeneração do epitélio juncional (Gräber et al., 1999). Astuta et al. (2005)
propuseram o termo epitélio peri-implantar (EPI) para distinguir o epitélio juncional
ao redor de implantes dentais daquele localizado ao redor do dente. Neste estudo
realizado em ratos, os autores demonstraram que na porção apical do EPI é o local
de adesão das células epiteliais à superfície do implante. O epitélio juncional é
derivado do epitélio reduzido do esmalte, enquanto que o epitélio juncional do peri-
implante é resultado de um processo cicatricial do epitélio oral da mucosa oral
(Shimono et al, 2003; Bosshardt; Lang 2005).
Surpreendentemente, até o presente momento, não foram encontrados
estudos que avaliassem a adesão epitelial por meio da análise da expressão gênica
para estas integrinas em tecidos peri-implantares, o que impediu uma comparação
direta dos dados obtidos no presente estudo com os disponíveis na literatura.
38
Por outro lado, a grande maioria dos estudos em tecido gengival humano
analisam a presença das integrinas em tecidos gengivais utilizando a metodologia
de imunohistoquimica ou imunofluorescência (Hormia et al., 1990; Larjava et al.,
1990; Larjava et al 1993; Haapasalmi et al., 1995). Hormia et al. (1990) relataram
que a subunidade de integrina β1 foi expressa na membrana de células basais do
epitélio gengival, ao longo do epitélio juncional, e em células do tecido conjuntivo,
incluindo células endoteliais, sendo que a maioria dos eventos de adesividade
celular à matriz extracelular são mediados pelas integrinas β1 (Del Castilho et al.,
1996) e, que, além da função de adesão, a subunidade β1 das integrinas também
apresenta um importante papel na manutenção da interação célula-célula (Larjava,
1991). Dessa forma, o aumento da expressão da subunidade de integrina β1
observada para o grupo de indivíduos que receberam cicatrizadores com superfície
totalmente tratada, sugere que este tipo de pilar pode favorecer a migração e
adesão do epitélio e assim beneficiar o processo de cicatrização e melhorar e/ou
aumentar a adesão do epitélio juncional à superfície do titânio. Embora, o presente
estudo tenha avaliado a expressão de integrinas na mucosa peri-implantar trinta dias
após a instalação de cicatrizadores com diferentes topografias de superfície e,
sabendo-se que estes pilares, em situações clínicas, são utilizados
temporariamente, o modelo experimental utilizado no presente estudo simulou o
comportamento da mucosa peri-implantar aos pilares protéticos, conforme realizado
em estudos prévios (Wennerbreg et al., 2003; Degidi et al., 2005; Degidi et al., 2012;
Schwarz et al., 2013)
Além disto, é importante ressaltar que a subunidade β1 das integrinas
tem a capacidade de interagir com múltiplas diferentes subunidades de integrinas.
Embora, no presente estudo não tenha sido detectado aumento nos níveis de
expressão da subunidade α2 de integrina, é possível que outras subunidades α
possam ter seus níveis de expressão, tais como: α1, α10 e α11 que se ligam a
colágeno; α3, α6 e α7, que se ligam a laminina, um importante componente do EPI;
e principalmente α5, αv e α8, que atuam como receptores RGD (Arg-Gly-Asp) e
constituem um dos principais sistemas de adesão celular (Hormia et al 1990,
Ruoslahti, 1996; Hynes, 2002). Novos estudos, avaliando os níveis de expressão de
outras integrinas são necessários para uma melhor compreensão dos mecanismos
envolvidos na re-epitelialização pós-implante.
39
No presente estudo não foram observadas diferenças nos níveis de
expressão das subunidades αv e β6 para os indivíduos que receberam
cicatrizadores de diferentes topografias. Porém, não foram encontrados estudos
avaliando a presença das integrinas em tecido peri-implantares o que impede uma
comparação com resultados obtidos. Interessantemente, Larjava et al. (2011) sugere
que a principal função da αvβ6 in vivo pode não estar diretamente relacionada à
adesão epitelial, mas à habilidade desta integrina em ativar o TGFβ-1 latente. Essa
citocina faz parte de uma família de polipeptídeos que apresentam diversas funções
regulatórias no reparo tecidual e no sistema imune. Estudos avaliando a integrina
αvβ6 e sua atividade no periodonto, sugerem uma associação da atividade desta
integrina na doença periodontal e relacionada com TGFβ-1 (Koivisto et al 1999;
Häkkinen et al., 2004; Ghannad et al., 2008). Koivisto et al. (1999) demonstraram
que a adição de TGF-β-1 à cultura de queratinócitos promoveu o aumento especifico
da expressão de αvβ6, enquanto os níveis de outras integrinas como α5β1 e αvβ1,
permaneceram inalterados. Häkkinen et al. (2004) demonstraram o envolvimento da
integrina αvβ6 no processo de cicatrização de feridas na epiderme de camundongos.
Nesse mesmo estudo, os autores utilizaram linhagens de camundongos
transgênicos e demonstraram que a expressão aumentada de αvβ6 estava
fortemente associada a um processo anormal de cicatrização e o aparecimento de
lesões crônicas. Uma vez que o processo inflamatório faz parte da etapa inicial do
processo de cicatrização, é possível sugerir que uma alteração dos níveis de αvβ6,
em virtude de sua capacidade de interação com TGFβ-1 poderia interferir na etapas
seguintes do processo de reparo. Ghannad et al., (2008), em estudo utilizando
humanos e animais concluíram que integrina αvβ6 é expressa no epitélio de
vedação da gengiva para o dente e desempenha um papel central na proteção
contra a doença periodontal por meio da ativação de TGF -β1 .
Poucos estudos têm investigado os efeitos das diferentes topografias de
superfícies de implantes no processo inflamatório ou na natureza das células
infiltradas no tecido peri-implantar. Porém a busca por uma superfície de implante
ótima, que diminua a adesão bacteriana e melhore a adesão do tecido mucoso
permanece (Degidi et al., 2012). Segundo An et al. (2012), superfícies hidrofílicas
melhoram a proliferação das células epiteliais em relação às superfícies polidas. No
entanto, existem relatos que estas superfícies também são determinantes para a
40
adesão bacteriana e, como já é de amplo conhecimento, que a sobrevivência dos
implantes dentais a longo prazo depende, em parte, do controle da infecção
bacteriana na região peri-implantar (Quirynen et al., 2002; Degidi et al., 2012).
Mais recentemente e contrário aos demais estudos relatados, Atsuta et al.
(2013) avaliaram a influência da superfície rugosa e maquinada na adesão,
migração e proliferação de células do EPI em ratos durante 4 semanas. Os autores
observaram em experimentos in vitro, uma menor expressão de proteínas em
células do epitélio oral de rato cultivadas em discos com superfície rugosa,
adicionalmente a adesão celular, migração e proliferação em discos com superfícies
rugosas foram menores. Deste modo, concluíram que superfícies lisas são as
melhores escolhas para integração em processo de cicatrização epitelial.
41
6. CONCLUSÃO
Houve aumento da expressão da subunidade β1 de integrina nos tecidos peri-
implantares ao redor de pilares de cicatrização totalmente tratados, em comparação
com superfícies parcialmente tratadas e não tratadas.
42
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ANEXO 1
50
ANEXO 2
51