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UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
DEPARTAMENTO ACADÊMICO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
CHAIANE RENATA GRIGOLO
MEIOS DE CULTIVO E CONCENTRAÇÕES DE BAP NA EMBRIOCULTURA
DO PESSEGUEIRO ‘BRS KAMPAI’
DISSERTAÇÃO
PATO BRANCO
2020
UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
DEPARTAMENTO ACADÊMICO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
CHAIANE RENATA GRIGOLO
MEIOS DE CULTIVO E CONCENTRAÇÕES DE BAP NA
EMBRIOCULTURA DO PESSEGUEIRO ‘BRS KAMPAI’
DISSERTAÇÃO
PATO BRANCO
2020
CHAIANE RENATA GRIGOLO
MEIOS DE CULTIVO E CONCENTRAÇÕES DE BAP NA
EMBRIOCULTURA DO PESSEGUEIRO ‘BRS KAMPAI’
Dissertação apresentada ao Programa dePós-Graduação em Agronomia daUniversidade Tecnológica Federal do Paraná,Câmpus Pato Branco, como requisito parcialà obtenção do título de Mestre em Agronomia- Área de Concentração: Produção Vegetal.
Orientador: Prof. Dr. Idemir Citadin
Coorientadora: Profª. Drª. Marisa de CaciaOliveira
PATO BRANCO
2020
Ficha Catalográfica elaborada porRosana da Silva CRB-9/1745Biblioteca da UTFPR Campus Pato Branco
G857m Grigolo, Chaiane Renata
Meios de cultivo e concentrações de BAP na embriocultura do pessegueiro ‘BRS Kampai’ / Chaiane Renata Grigolo. -- 2020.
59 f. : il. ; 30 cm.
Orientador: Prof. Dr. Idemir CitadinCoorientador: Profa. Dra. Marisa de Cacia OliveiraDissertação (Mestrado) - Universidade Tecnológica Federal do
Paraná. Programa de Pós-Graduação em Agronomia. Pato Branco, PR,2020.
Bibliografia: f. 47-51
1. Prunus persica. 2. Germinação. 3. Botânica - Embriologia. I. Citadin, Idemir, orient. II. Oliveira, Marisa de Cacia, coorient. III. Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Programa de Pós-Graduação em Agronomia. IV. Título.
CDD 22. ed. 630
TERMO DE APROVAÇÃO
Título da Dissertação n.° 202
MEIOS DE CULTIVO E CONCENTRAÇÕES DE BAP NA EMBRIOCULTURA DOPESSEGUEIRO “BRS KAMPAI”
Por
CHAIANE RENATA GRIGOLO
Dissertação apresentada às treze horas e trinta minutos do dia vinte e um defevereiro de dois mil e vinte, como requisito parcial para obtenção do título deMESTRA EM AGRONOMIA, Linha de Pesquisa – Horticultura, Programa de Pós-Graduação em Agronomia (Área de Concentração: Produção Vegetal), UniversidadeTecnológica Federal do Paraná, Câmpus Pato Branco. A candidata foi arguida pelaBanca Examinadora composta pelos membros abaixo designados. Apósdeliberação, a Banca Examinadora considerou o trabalho APROVADO.
Banca examinadora:
Dr. Rodrigo Cezar FranzonEmbrapa Clima Temperado/Pelotas
(à distância, por videoconferência)
Dr. Américo Wagner JúniorUTFPR/Dois Vizinhos
Dr. Idemir Citadin UTFPR/Pato Branco
Orientador
Dr. Alcir José Modolo Coordenador do PPGAG
O Termo de Aprovação, devidamente assinado, encontra-se arquivado na Coordenação do PPGAG.
Ministério da Educação Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Câmpus Pato Branco Diretoria de Pesquisa e Pós-Graduação
Programa de Pós-Graduação em Agronomia
“ À Nossa Senhora de Aparecida pela graça da conquista”
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus pela oportunidade de viver este momento, por ter me
dado saúde e coragem para enfrentar minhas dificuldades e por nunca me permitir
desistir.
À Nossa Senhora Aparecida pelas graças alcançadas, por atender minhas
preces, iluminar meu caminho e me proteger.
Aos meus pais Renato e Tânia, especialmente a minha mãe, por todos os
sacrifícios e dedicação para que eu tivesse a oportunidade de estudar. Pelas
orações, pelas palavras de conforto, por segurar minha mão nos momentos de
tristeza e por me dar apoio e força para chegar até aqui.
Ao meu namorado Cristiano André Piovezana, melhor amigo e companheiro,
por todo carinho, paciência, dedicação, força nos momentos de cansaço e angústia,
e pela ajuda desde o início.
Ao meu orientador professor Dr. Idemir Citadin, por ter acreditado em mim e
me permitido a honra de trabalhar contigo. Agradeço por todos os conselhos, pela
amizade, pelo tempo dedicado a me orientar e ajuda prestada.
À minha coorientadora professora Dra. Marisa de Cacia Oliveira pela
dedicação, companheirismo e fundamental ajuda na realização deste trabalho.
Ao grupo de pesquisa Fruticultura de Clima Temperado por toda ajuda e
contribuições na realização do experimento.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
pelo auxílio financeiro para o desenvolvimento deste trabalho.
À Universidade Tecnológica Federal do Paraná-Câmpus Pato Branco pelo
fornecimento da estrutura física e equipamentos.
Ao Programa de Pós-graduação em Agronomia da Universidade Tecnológica
Federal do Paraná, por todo suporte e ensino.
A todos que não tiveram seus nomes citados, mas que contribuíram, direta ou
indiretamente, para que esse trabalho fosse realizado.
“Nas grandes batalhas da vida, o primeiro passo para a vitória é o
desejo de vencer.”
Mahatma Gandhi
RESUMO
GRIGOLO, Chaiane Renata. Meios de cultivo e concentrações de BAP naembriocultura do pessegueiro ‘BRS Kampai’. 61 f. Dissertação (Mestrado emAgronomia) – Programa de Pós-Graduação em Agronomia (Área de Concentração:Produção vegetal), Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR). PatoBranco, 2020.
As cultivares de pêssego com maturação precoce apresentam dificuldades noprocesso de germinação natural das sementes. Para solucionar esse problema, acultura de embriões in vitro pode ser considerada uma alternativa na qual assementes encontram condições para completar a germinação e desenvolvimento demaneira satisfatória. Diferentes protocolos e meios de cultura foram testados paraatender às necessidades nutricionais do embrião, mas estes ainda apresentamproblemas e precisam ser otimizados. O objetivo do trabalho foi testar a adição deBAP ao meio de cultura, a fim de aumentar a porcentagem de germinação deembriões e mudas viáveis de pessegueiro 'BRS Kampai', evitando possíveisanomalias no processo. O experimento foi conduzido no Laboratório de Cultura deTecidos da Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Câmpus Pato Branco. Assementes submetidas à cultura embrionária são provenientes de plantas mantidasna UTFPR, em Pato Branco. Os meios de cultura testados foram MS e WPM comcinco concentrações (0, 1, 2, 3 e 4 mg L-1) de 6-benzilaminopurina (BAP). Avaliou-sea germinação, desenvolvimento in vitro, comprimento do caule, sobrevivência,plântulas viáveis e formação de rosetas. Considerando as condições sob as quais oexperimento foi conduzido, concluiu-se que o meio de cultura MS com a adição de 1mg L-1 de BAP permitiu uma maior porcentagem de germinação e plântulas viáveispara 'BRS Kampai'.
Palavras-chave: Prunus persica. Germinação. Botânica. Embriologia.
ABSTRACT
GRIGOLO, Chaiane Renata. Culture media and BAP concentrations in theembrioculture of peach 'BRS Kampai'. 61 f. Dissertation (Masters in Agronomy) -Graduate Program in Agronomy (Concentration Area: Crop), Federal University ofTechnology - Paraná (UTFPR). Pato Branco, 2020.
Early-ripening Peach cultivars present difficulties in the process of naturalgermination of seeds. In order to solve this problem, the culture of embryos in vitrocan be considered an alternative in which the seeds find conditions to complete thegermination and development in a satisfactory way. Different protocols and culturemedia have been tested to meet the nutritional needs of the embryo, but these stillhave problems and need to be optimized. The objective of the work was to test theaddition of BAP to the culture medium, in order to increase the germinationpercentage of embryos and viable seedlings of 'BRS Kampai' peach, avoidingpossible anomalies in the process. The experiment was conducted at the TissueCulture Laboratory of the Federal Technological University of Paraná, Campus PatoBranco. The seeds submitted to embryonic culture come from plants maintained atUTFPR, in Pato Branco. The culture media tested were MS and WPM with fiveconcentrations (0, 1, 2, 3 and 4 mg L-1) of 6-benzylaminopurine (BAP). Germination,in vitro development, stem length, survival, viable seedlings, and rosette formationwere evaluated. Considering the conditions under which the experiment wasconducted, it was concluded that the culture medium MS with the addition of 1 mg L -1
of BAP allowed a higher percentage of germination and viable seedlings for 'BRSKampai'.
Keywords: Prunus persica. Germination. Botany. Embryology.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1- Planta do pessegueiro ‘BRS Kampai’ mantida no pomar experimental da UTFPR, CâmpusPato Branco (A) e estádio de maturação de colheita dos frutos (B).UTFPR, Câmpus PatoBranco, 2020..................................................................................................................... 25
Figura 2- Corte da polpa e endocarpo (C e D), extração da semente (E) e retirada do tegumento (F).UTFPR, Câmpus Pato Branco, 2020................................................................................26
Figura 3- Tubos de ensaio contendo embriões do pessegueiro ‘BRS Kampai’ fechados com papelalumínio, vedados e identificados (G), alocados em caixas de papel (H) e armazenadosem câmara tipo B.O.D. UTFPR, Câmpus Pato Branco, 2020...........................................27
Figura 4 – Tubos contendo embriões do pessegueiro ‘BRS Kampai’ mantidos no escuro por dois dias(J) e sete dias expostos à luz. UTFPR, Câmpus Pato Branco, 2020................................28
Figura 5 – Escala de notas de germinação (L) proposta por Reis et al. (2012) e germinação normal(M) utilizadas para embriões do pessegueiro ‘BRS Kampai’ aos dois e nove dias apóssaída do frio. UTFPR, Câmpus Pato Branco, 2020..........................................................29
Figura 6 – Retirada dos embriões dos tubos (N), lavagem em água corrente (O) e disposição empapéis toalha umedecidos (P). UTFPR, Câmpus Pato Branco, 2020...............................30
Figura 7 – Transplantio das plântulas do pessegueiro ‘BRS Kampai’ em tubetes (Q), colocação dasbandejas em câmara tipo Fitotron (R) e aplicação de solução nutritiva (S). UTFPR,Câmpus Pato Branco, 2020..............................................................................................31
Figura 8 – Plântulas viáveis (T) e enrosetamento foliar do pessegueiro ‘BRS Kampai’. UTFPR,Câmpus Pato Branco, 2020..............................................................................................31
Figura 9- Nota de germinação aos dois dias após saída do frio dos embriões do pessegueiro ‘BRSKampai’ em relação do tipo de meio de cultura e concentração de BAP. UTFPR, CâmpusPato Branco, 2020............................................................................................................33
Figura 10- Nota de germinação aos nove dias após a retirada do frio dos embriões do pessegueiro‘BRS Kampai’ em relação do tipo de meio de cultura e concentração de BAP. UTFPR,Câmpus Pato Branco, 2020..............................................................................................34
Figura 11 – Sobrevivência de plântulas de pessegueiro ‘BRS Kampai’ aos 60 dias após o plantio emsementeira em meio de cultura MS (A) e WPM (B) em função de cinco concentrações deBAP (0, 1, 2, 3 e 4 mg L-1). UTFPR Câmpus Pato Branco, 2020.....................................40
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Germinação normal dos embriões de pessegueiro ‘BRS Kampai’ em função de cincoconcentrações de BAP (0, 1, 2, 3 e 4 mg L-1) e dois meios de cultura (MS e WPM). MS –meio de cultivo Murashige-Skoog (Murashige;Skoog, 1962). WPM – Wood Plant Media(Lloyd et al., 1980). UTFPR Câmpus Pato Branco, 2020.................................................35
Tabela 2 – Médias e postos médios do teste de comparações múltiplas de médias de Friedman (α=0,05) para as variáveis comprimento de radícula principal e de caulículo de plântulas dopessegueiro ‘BRS Kampai’ com relação ao tipo de meio de cultura. UTFPR Câmpus PatoBranco, 2020..................................................................................................................... 37
Tabela 3 – Médias e postos médios do teste de comparações múltiplas de médias de Friedman (α=0,05) para a variável comprimento da radícula principal de pessegueiro ‘BRS Kampai’com relação à concentração de BAP. UTFPR Câmpus Pato Branco, 2020......................38
Tabela 4 – Médias e postos médios do teste de comparações múltiplas de médias de Friedman (α=0,05) para a variável comprimento do caulículo de pessegueiro ‘BRS Kampai’ comrelação à concentração de BAP. UTFPR Câmpus Pato Branco, 2020.............................39
Tabela 5 – Médias e postos médios do teste de comparações múltiplas de médias de Friedman (α=0,05) para as variáveis plântulas viáveis e rosetas do pessegueiro ‘BRS Kampai’ aos 60dias após o plantio em sementeira com relação à concentração de BAP. UTFPR, CâmpusPato Branco, 2020............................................................................................................42
Tabela 6 – Comprimento de caule de pessegueiro ‘BRS Kampai’ após 60 dias em câmara tipoFitotron, em relação ao tipo de meio de cultura e concentração de BAP. UTFPR CâmpusPato Branco, 2020............................................................................................................43
LISTA DE SIGLAS E ACRÔNIMOS
AIA Ácido Indolacético AIB Ácido IndolbutíricoANA Ácido Naftaleno AcéticoB.O.D Biochemical Oxygen DemandBAP 6-benzilaminopurina CV Coeficiente de variaçãoEMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuáriaGA3 GiberelinaIAC Instituto Agronômico de CampinasIBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística MS Murashige e SkoogPR Estado do ParanáRS Rio Grande do SulSEAB Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento UTFPR Universidade Tecnológica Federal do ParanáWPM Wood Plant Medium
LISTA DE ABREVIATURAS
mg L-1 Miligramas por litroµM Micromolar
g L-1 Gramas por litrocm Comprimento
LISTA DE SÍMBOLOS
% Porcentagemº Grauº C Graus celsius
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................15
2 REVISÃO DE LITERATURA...................................................................................17
2.1 Origem e melhoramento genético de pessegueiro...............................................17
2.2 A cultivar ‘BRS Kampai’.........................................................................................18
2.3 Embriocultura........................................................................................................19
2.3.1 Enrosetamento foliar..........................................................................................21
2.3.2 Uso de reguladores de crescimento..................................................................22
3 MATERIAL E MÉTODOS.........................................................................................25
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO...............................................................................33
5 CONCLUSÕES........................................................................................................45
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS.....................................................................................46
REFERÊNCIAS...........................................................................................................47
ANEXO A – Composição básica dos meios de cultura MS (Murashige e Skoog, 1962) e WPM (Wood Plant Medium (Lloyd e Mc Cown, 1981)..................................53
ANEXO B– Percentual de plântulas do pessegueiro ‘BRS Kampai’ transplantadas para cada tratamento..................................................................................................54
ANEXO C– Quadros das análises de variância para cada variável resposta............55
151 INTRODUÇÃO
Sementes de cultivares de pessegueiro de maturação precoce, como
‘BRS Kampai’, não germinam em decorrência da condição de imaturidade do
embrião (SHARMA et al., 1996; SUNDOURI, 2014), devido ao acelerado
crescimento e amadurecimento dos frutos que não permite tempo hábil para que o
embrião alcance o tamanho ideal e amadureça fisiologicamente (RAMMING et al.,
2003). O rápido endurecimento do caroço reduz o acúmulo de matéria orgânica na
semente, acarretando em anormalidade no desenvolvimento embrionário, impedindo
que ocorra germinação em condições naturais. Esse fenômeno dificulta a formação
de seedlings em volume suficiente, prejudicando a continuidade dos programas de
melhoramento genético para pessegueiro (BARBOSA et al., 1985).
A ‘BRS Kampai’ (RASEIRA et al., 2010) é uma cultivar lançada pelo
Programa de Melhoramento Genético de frutas de caroço da Embrapa Clima
Temperado, em Pelotas, que vem sendo amplamente cultivada e tem se mostrado
com ampla adaptabilidade e estabilidade produtiva. Tais características a tornam
uma forte candidata à planta mãe em programas de melhoramento genético do
pessegueiro. No entanto, a precocidade do ciclo de maturação dos frutos acarreta
em baixa germinação dos embriões, cujo resgate e complementação de maturação
em meios de cultivos adequados se torna prática obrigatória.
Como o uso para fins reprodutivos é dificultado pela baixa ou nula
germinabilidade de sementes, faz-se necessário o resgate in vitro de embriões
(GERCHEVA; ZHIVONDOV, 2002, SUNDOURI, 2014). A cultura de embriões
fornece condições ideais para que o embrião zigótico imaturo complete seu ciclo de
desenvolvimento em meio asséptico (SCORZA et al., 1992; DEVI et al., 2017).
No cultivo in vitro de espécies vegetais, o tipo de meio e concentração
de reguladores de crescimento, especialmente citocininas, são fatores
determinantes para alcançar resultados favoráveis (SILVEIRA et al., 2001). Assim,
trabalha-se com a hipótese de que é possível a otimização dos meios de cultivo
utilizados na embriocultura do pessegueiro associados à concentração adequada de
16BAP, que resulte na obtenção de maiores percentuais de germinação normal dos
embriões e plântulas viáveis, reduzindo a ocorrência de anomalias.
Desta forma, o presente trabalho buscou estabelecer qual o meio de
cultura e a concentração de BAP que possibilitam a maior taxa de plântulas normais,
ou seja, que apresentem parte aérea e sistema radicular equivalentes e bem
desenvolvidas. Com a obtenção de tais informações espera-se que seja possível
aumentar a eficiência dos programas de melhoramento genético no que diz respeito,
ao desenvolvimento de novas cultivares de pessegueiro de maturação precoce e
baixa exigência de frio para o cultivo em regiões onde predomina a condição de
inverno ameno.
Diante deste contexto, o objetivo principal do trabalho foi testar a
adição de BAP aos meios de cultura visando aumentar a obtenção do percentual de
germinação dos embriões e de plântulas viáveis de pessegueiro ‘BRS Kampai’,
evitando as anomalias do processo.
172 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Origem e melhoramento genético de pessegueiro
Pertencente à família Rosaceae, o pessegueiro (Prunus persica L.)
desperta atenção especial por seus frutos frescos e processados, possuindo grande
aceitação pelo consumidor (CHENG et al, 2015). A fruteira possui larga
adaptabilidade climática, sendo cultivada, inclusive, em regiões subtropicais do
mundo, como o Brasil, devido ao intenso trabalho via melhoramento genético para a
criação de cultivares de baixa necessidade de frio (RASEIRA et al., 2006; KUMAR et
al., 2015).
O Brasil ocupa a 12ª posição no ranking mundial de produção de
pêssego, sendo que os maiores polos brasileiros de produção e comercialização da
fruta estão concentrados nos estados do Rio Grande do Sul e São Paulo, seguidos
por Santa Catarina, Paraná e Minas Gerais (INSTITUTO BRASILEIRO DE
GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA, 2019). No Paraná, 966,0 hectares são destinados ao
cultivo da fruta com uma produção estimada de 11,3 mil toneladas (SECRETARIA
DA AGRICULTURA E DO ABASTECIMENTO, 2017).
Nativo da China e cultivado a 4000 anos (DEVI et al., 2017), o
pessegueiro encontra-se entre as dez fruteiras mais importantes cultivadas no
mundo. No Brasil, o cultivo teve início com a chegada dos colonizadores europeus,
que introduziram as primeiras mudas da espécie no país, em 1532, por Martim
Afonso de Souza na Capitania de São Vicente, no atual estado de São Paulo.
(RASEIRA et al, 2018).
Foi no Rio Grande do Sul (RS) que o plantio de pessegueiros teve a
maior expansão comercial, principalmente para fins industriais. Na região Sul,
especialmente no RS, o cultivo da fruteira passou a ter importância comercial a partir
da década de 1960, onde, até então, mais de 80% da fruta consumida provinha da
importação (FRANZON; RASEIRA, 2014).
Como o pessegueiro é classificado como fruteira de clima temperado,
18um dos principais entraves para seu cultivo no Brasil era a carência de genótipos
adaptados às condições climáticas subtropical-tropicais das principais regiões
produtoras do País (BAUCHROWITZ et al, 2018). Partindo deste entrave, surgem as
primeiras pesquisas de melhoramento genético de pessegueiro no Brasil, em 1940,
com o Instituto Agronômico de Campinas e, mais tarde, na Estação Fitotécnica de
Taquari. Posteriormente, esse programa foi transferido para a Embrapa Clima
Temperado, sendo estes órgãos responsáveis pelo desenvolvimento da grande
maioria das cultivares de pessegueiro cultivadas no Brasil (RASEIRA et al, 2018).
2.2 A cultivar ‘BRS Kampai’
Visando a diversificação de cultivares de pessegueiro para
disponibilizar aos produtores e, dessa maneira, atender às mudanças e
necessidades do mercado, a Embrapa Clima Temperado, por meio dos Programa de
Melhoramento de Fruteiras de Caroços, vem buscando a criação de novas cultivares
(SCARANARI et al., 2009). Pensando no consumo de pêssegos in natura, o
interesse por cultivares de pessegueiro que produzam frutas de baixa acidez tem
apresentado alta nos últimos anos (EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA
AGROPECUÁRIA, 2010). Levando em consideração essa demanda gerada pelos
produtores e pensando em atendê-la, em 2009, a cultivar ‘BRS Kampai’ foi lançada
(SCARANARI et al., 2009).
A ‘BRS Kampai’ foi originada a partir do cruzamento entre as cultivares
Chimarrita e Flordaprince (EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA
AGROPECUÁRIA, 2010). Inicialmente a planta foi identificada como Cascata 834,
sendo avaliada e comparada a outras cultivares de mesmo período de maturação ou
semelhantes ao mesmo (RASEIRA et al., 2010).
A cultivar ‘BRS Kampai’ surge como uma ótima alternativa para o
plantio em regiões subtropicais, como o Sudoeste do Paraná, uma vez que
apresenta baixa necessidade em frio hibernal (200 horas), aliado a boa aparência
dos frutos, apresentando melhor sabor em relação aos parentais (RASEIRA et al.,
2014).
Nas condições de cultivo do Sudoeste do Paraná, a ‘BRS Kampai’
19demonstra maior adaptabilidade e estabilidade da produção de frutos (CITADIN et
al., 2014), assim como para a brotação e frutificação, sendo considerado como o
genótipo melhor adaptado para a região (SCARIOTTO et al., 2013), podendo ser
utilizada como planta mãe em cruzamentos dirigidos nos programas de
melhoramento da cultura.
A ‘BRS Kampai’ apresenta maturação precoce e boa qualidade dos
frutos em comparação a outras cultivares, possuindo sabor adocicado com leve
acidez, com teor de sólidos solúveis variando entre 11 e 13 ºBrix. (RASEIRA et al.,
2010; GONÇALVES et al., 2014; RASEIRA et al., 2014), características estas
atrativas ao consumidor, favorecendo a aceitação da fruta e impulsionando o plantio
da cultivar em escala comercial.
2.3 Embriocultura
Um dos focos do melhoramento genético de pessegueiro é aumentar a
disponibilidade de cultivares de maturação precoce e de baixa necessidade de frio
(RASEIRA et al.,2010, SUNDOURI, 2014), visando a colheita dos frutos em épocas
de menor oferta para aproveitar, assim, as oportunidades na janela de mercado e
obter lucratividade (BARBOSA et al., 1985).
Entretanto, o desenvolvimento de cultivares de maturação precoce,
como no caso da ‘BRS Kampai’, desencadeou em problemas na germinação natural
das sementes, uma vez que a maturação dos frutos ocorre antes da maturação do
embrião, sendo um gargalo para a obtenção de material para a continuidade dos
programas de melhoramento para a cultura (EMERSHAD et al, 1994).
Para tal problema, técnicas de cultivo in vitro, como a embriocultura,
passaram a ser empregadas, devido a capacidade destas em fornecer condições
para a germinação dos embriões e possibilitar a obtenção de plantas em condições
normais de desenvolvimento, surgindo como solução para essa dificuldade
(BARBOSA et al, 1990).
20O primeiro cultivo de embriões bem-sucedido de fruteiras em meio
artificial foi alcançado por Tukey (1933) em cerejeira. Blake (1939) foi o primeiro
pesquisador a utilizar essa técnica em programa de melhoramento de pessegueiro.
A embriocultura é uma das técnicas pioneiras de cultivo in vitro
aplicada na resolução de problemas práticos, tornando-se grande aliada dos
pesquisadores (DUNWELL, 1986). Além disso, permite melhoria na eficiência na
seleção de genótipos dentro de programas de melhoramento genético, como é o
caso de Prunus (MARTÍNEZ-GÓMES et al, 2005).
Essa técnica é extremamente importante por permitir o resgate de
diversos híbridos com características desejáveis em fruteiras de ciclo de maturação
precoce (BARBOSA et al, 1990). Caso não fosse possível tal uso, cultivares de ciclo
curto não poderiam servir como mães em cruzamentos entre genótipos, uma vez
que a germinação das sementes seria muito baixa (BRIDGEN, 1994; KUDEN et al,
1999; INFANTER; GONZALEZ, 2002) ou nula.
Material com característica genética de precocidade na maturação dos
frutos tende a não acumular reservas cotiledonares em quantidade adequada para
manutenção das necessidades dos embriões. Assim, quando as sementes são
retiradas dos frutos e mantidas no ambiente, sofrem desidratação e perdem seu
poder germinativo rapidamente (BARBOSA et al, 1984). Para isso, há necessidade
do emprego de meios de cultura artificiais que darão suporte ao desenvolvimento
embrionário e obtenção de plântulas viáveis de pessegueiro (LIU et al, 2007).
O cultivo de embriões em pessegueiro justifica-se pelo fato de que o
acelerado endurecimento do caroço reduz o teor de matéria orgânica na amêndoa e,
consequentemente, o embrião torna-se menos vigoroso e não germina em
condições naturais (BARBOSA et al, 1990). Assim, tal procedimento possibilita o
resgate desses embriões imaturos, fornecendo condições para seu uso como mães
nos cruzamentos entre genótipos e também obtenção de plantas para a
continuidade dos programas de melhoramento de espécies fruteiras (BRIDGEN,
1994).
Para a formação de uma planta vigorosa, o embrião imaturo deve ser
mantido sob condições estéreis em um meio nutritivo asséptico. Porém, para a
eficiência da embriocultura, é necessário cuidados rigorosos no manuseio do
embrião para evitar ferimentos, além da elaboração de um meio de cultivo que seja
21capaz de sustentar o seu crescimento e desenvolvimento (BRIDGEN, 1994; RIZZO
et al., 1998).
O meio de cultivo atua como suporte físico para o embrião, fornecendo
nutrientes fundamentais para que este sobreviva e complete seu ciclo. Diversos
meios nutritivos têm sido utilizados no resgate in vitro de embriões de Prunus, sendo
que a maioria se baseia no meio de Murashige-Skoog - MS (Murashige;Skoog,
1962) (GERCHEVA; ZHIVONDOV, 2002; LIU et al., 2007; REIS et al., 2012;
SUNDOURI et al., 2014; MANSVELT et al., 2015; DEVI et al., 2017). Outro meio
comumente utilizado é o Wood Plant Media- WPM (Lloyd et al., 1980) (RAMMING et
al., 2003; RASEIRA; EINHARDT, 2010; NASCIMENTO et al., 2017). Contudo, a
eficiência de cada composição varia entre espécies e cultivares, sendo necessários
ajustes nos protocolos para otimizá-los.
2.3.1 Enrosetamento foliar
Embora a técnica da embriocultura tenha se mostrado bastante
eficiente para espécies do gênero Prunus, é comum perdas de plântulas por
ocorrência de anomalias fisiológicas ou morfológicas, tais como vitrificação, seca
apical, nanismo e formação de roseta, decorrentes de situações envolvendo
estresses (BARBOSA, 2006; RADMANN, 2009).
O enrosetamento afeta a gema terminal e a morfologia foliar, causando
assimetria e retorcimento devido à redução de seu crescimento, resultando em
plântulas anormais (FLEMION; BEARDOW, 1964). Esse distúrbio surge em
decorrência dos inibidores de crescimento localizados nos meristemas apicais dos
embriões (BARBOSA et al., 1989) e sua formação é dependente da cultivar (REIS et
al., 2012), da temperatura e duração da estratificação (SEELEY et al., 1998; BYRNE
et al., 2000), sendo uma das principais fontes de perda de mudas em estufa ou
transplante no campo (TOPP et al., 2008).
A composição do meio de cultivo é capaz de reduzir a ocorrência de
rosetas (REIS et al., 2012). Além disso, a adição de reguladores de crescimento ao
22meio, especialmente, citocininas promove menores sintomas dessa anomalia nas
plântulas de pessegueiro (BARBOSA et al., 1989), sendo necessário o estudo da
associação mais adequada entre meio de cultivo e concentração de citocinina para a
obtenção de plântulas completamente normais.
2.3.2 Uso de reguladores de crescimento
Fitormônios são definidos como substâncias orgânicas naturais
presentes em pequenas quantidades com ocorrência em locais específicos das
plantas. Tais substâncias exercem funções de controle do crescimento e
desenvolvimento vegetal, bloqueando ou promovendo a ocorrência de processos
fisiológicos e bioquímicos essenciais do metabolismo vegetal. Quando são criadas,
em laboratório, substâncias com similaridades aos fitormônios, estas são chamadas
de reguladores de crescimento (TAIZ; ZEIGER, 2004).
A suplementação do meio de cultivo com reguladores de crescimento
favorece a reprodução dos processos que ocorrem de maneira natural na planta.
Assim, utilizando tais substâncias de forma combinada, o crescimento e
desenvolvimento do explante é beneficiado (SANTOS et al., 2009).
Essas substâncias são essenciais para o desenvolvimento dos
explantes e estão intimamente relacionadas com a divisão celular e o crescimento
do meristema (REIS et al., 2008). Auxinas e citocininas são as classes de
reguladores de crescimento mais utilizadas no sistema de cultivo in vitro (SILVEIRA
et al., 2001). Das auxinas sintéticas o Ácido Indolacético (AIA), o Ácido Indolbutírico
(AIB) e Ácido Naftaleno Acético (ANA) são as mais comumente empregadas na
cultura in vitro, com função de estimular o início da divisão celular (EMPRESA
BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA, 1999). As citocininas, agem
induzindo a quebra da dominância apical e proliferação de gemas axilares,
promovendo o desenvolvimento da parte aérea. O tipo de citocinina e sua
concentração interferem no êxito do cultivo de espécies vegetais in vitro
(GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). A citocinina mais utilizada para tal fim é o BAP
(6-benzilaminopurina) (VILLA et al., 2006), devido à eficiência na multiplicação de
23partes aéreas (HU; WANG, 1983).
Como suplemento ao meio de cultivo, as auxinas são responsáveis
pelo controle do crescimento e elongação celular (PASQUAL, 2001). Além disso,
essa classe é a única que favorece o aumento da formação de primórdios
radiculares, contribuindo para o enraizamento eficiente do material vegetal (TAIZ e
ZEIGER, 2004; SOUZA et al, 2007).
As citocininas têm papel de induzir a quebra da dominância apical e
promover a multiplicação de gemas axilares, permitindo que haja grande número de
brotações que contribuem para o desenvolvimento da parte aérea do material
micropropagado (MOURA et al, 2012).
A associação entre um meio de cultura e concentração de reguladores
de crescimento estimula a germinação de embriões de prunoideas (LIU et al., 2007).
Entretanto, a combinação correta e o balanço entre as concentrações dos
reguladores de crescimento é necessário e imprescindível para que haja condições
ao crescimento e a morfogênese in vitro (GEORGE; SHERRINGTON, 1984).
Sem a presença de citocinina no meio de cultivo não ocorre divisão
celular. Em altas concentrações de auxina em relação a citocinina, o material vegetal
emite apenas raízes, enquanto que em altos níveis de citocinina em relação a auxina
promovem desenvolvimento da parte aérea. Um balanço entre os dois reguladores
favorece a formação de calos. Na germinação de sementes, a citocinina atua na
preparação da camada de aleurona para receber giberelina (GA) do embrião,
alterando a permeabilidade da membrana, facilitando assim, o transporte de GA e
nutrientes, além de estimular a síntese de enzimas como a α-amilase em algumas
espécies vegetais, como cereais e feijão, permitindo a germinação de sementes de
baixa viabilidade. (ZUFFELATTO-RIBAS, 2017).
Sabendo que a decisão correta sobre concentração e combinação de
auxinas e citocininas no meio nutritivo é um fator de suma importância que
determina o sucesso da regeneração de plantas (PAN et al, 1998), nos últimos anos,
trabalhos vêm sendo realizados com diversas espécies de Prunus, visando a
otimização dos protocolo de propagação in vitro, através do uso de reguladores de
crescimento para germinação de embriões (BARBOSA et al., 1989; LIU et al., 2007;
DEVI et al., 2017).
Para esse estudo, a escolha das concentrações de BAP e AIB foi
24baseada no trabalho de Liu et al. (2007), partindo da informação de que a máxima
germinação dos embriões de pessegueiro ocorreu com a concentração de 4 mg L -1
de BAP+ 0,5 mg L-1 de AIB.
A escolha dos meios de cultivo foi baseada no trabalho de Reis et al.
(2012), onde o meio MS proporcionou maior germinação e desenvolvimento dos
embriões para genótipos de pessegueiro, enquanto que o meio WPM apresentou
desempenho insatisfatório para ambas as variáveis. Dessa forma, foi decidido que
esses dois meios seriam testados para o resgate dos embriões do pessegueiro ‘BRS
Kampai’ para observar o comportamento destes para essa cultivar.
253 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido no Laboratório de Cultura de Tecidos da
Universidade Tecnológica Federal do Paraná – Câmpus Pato Branco. Foram
utilizadas sementes do genótipo ‘BRS Kampai’, com período de floração à
frutificação de 95 dias. Os frutos obtidos por polinização livre foram colhidos de
plantas mantidas na área experimental da UTFPR, em Pato Branco (Figura 1A) no
início da maturação, quando a cor de fundo passou de verde para creme (Figura
1B). Imediatamente, os frutos foram transferidos para o laboratório e mergulhados
em 10 litros de água contendo 10 mL de detergente líquido por 1 minuto com,
posterior, tratamento em solução de hipoclorito de sódio por 10 minutos e, na
sequência, em solução de álcool a 70% por 5 minutos para desinfestação (REIS et
al., 2012).
Figura 1- Planta do pessegueiro ‘BRS Kampai’ mantida no pomar experimental da UTFPR, CâmpusPato Branco (A) e estádio de maturação de colheita dos frutos (B).UTFPR, Câmpus PatoBranco, 2020.
Fonte: (A) André Varago. (B) Autor.
Em câmara de fluxo laminar, com todas as condições de assepsia, foi
realizado o corte da polpa e do endocarpo (Figura 2 C, D), delicadamente para evitar
lesionar o embrião, com uma tesoura de poda, previamente flambada. Com uma
pinça, também flambada, as sementes foram extraídas (Figura 2E).
Cuidadosamente, ao retirar a semente, foi retirado seu tegumento (Figura 2F), com
imediato plantio em tubos de ensaio esterilizados, de forma individual, em contato
com diferentes meios de cultivo e concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP).
A B
26Figura 2- Corte da polpa e endocarpo (C e D), extração da semente (E) e retirada do tegumento (F).
UTFPR, Câmpus Pato Branco, 2020.
Fonte: Autor
Os meio utilizados foram MS – Murashige-Skoog (MURASHIGE;
SKOOG, 1962) e WPM – Wood Plant Media (LLOYD et al., 1980), ambos
suplementados com 30 g L-1 de sacarose, 0,5 mg L-1 de ácido indolbutírico (AIB), e 9
g L-1 de ágar com pH ajustado para 5,8 (Anexo A). A concentração de BAP variou
conforme o tratamento de 0, 1, 2, 3 ou 4 mg L-1 (LIU et al., 2007).
O delineamento experimental foi blocos casualizados, em fatorial 2x5
(meio de cultivo x concentração de BAP), com quatro repetições, sendo a parcela
representada por 15 embriões.
Posteriormente, os tubos de ensaio foram fechados com papel
alumínio, vedados, identificados (Figura 3G), colocados em caixa de papel (Figura
273H) e dispostos em câmara tipo B.O.D. em temperatura constante de 5 ± 1 °C no
escuro por sessenta dias para a estratificação (Figura 3I).
Figura 3- Tubos de ensaio contendo embriões do pessegueiro ‘BRS Kampai’ fechados com papelalumínio, vedados e identificados (G), alocados em caixas de papel (H) e armazenadosem câmara tipo B.O.D. UTFPR, Câmpus Pato Branco, 2020.
Fonte: Autor
Após esse período, os tubos foram mantidos por dois dias a 24 ± 1°C
ainda no escuro (Figura 4J) e sete dias expostos à luz a 2.000 lux de intensidade
(Figura 4K) para clorofilação, também a 24 ± 1°C com fotoperíodo de 16 horas
(REIS et al.,2012).
28Figura 4 – Tubos contendo embriões do pessegueiro ‘BRS Kampai’ mantidos no escuro por dois dias(J) e sete dias expostos à luz. UTFPR, Câmpus Pato Branco, 2020.
Fonte: Autor
As sementes foram avaliadas quanto ao início da germinação,
seguindo a escala de notas (REIS et al., 2012): 1 - ausência de germinação; 2 -
germinação anormal com somente cotilédones abertos; 3 - germinação anormal com
somente emissão de radícula; 4 - germinação anormal com somente emissão de
caulículo; 5 - germinação normal com caulículo e radícula aos dois e nove dias após
saída do frio (Figura 5 L). Também, foi determinado o percentual de germinação
normal, levando em consideração somente os embriões que obtiveram nota 5 na
segunda contagem (Figura 5 M).
29Figura 5 – Escala de notas de germinação (L) proposta por Reis et al. (2012) e germinação normal
(M) utilizadas para embriões do pessegueiro ‘BRS Kampai’ aos dois e nove dias apóssaída do frio. UTFPR, Câmpus Pato Branco, 2020.
Fonte: Autor
Para a avaliação do desenvolvimento dos embriões, após nove dias de
exposição em câmara de crescimento, as plântulas foram retiradas,
cuidadosamente, dos tubos de ensaio (Figura 6N), lavadas em água corrente para
remover os resíduos do meio de cultura aderido às raízes (Figura 6O) e colocadas
em bandejas plásticas com papéis toalha umedecidos em água destilada, para evitar
desidratação (Figura 6P). Mediram-se os comprimentos de caulículo e de raiz
principal, utilizando uma régua milimetrada (REIS et al, 2012).
30Figura 6 – Retirada dos embriões dos tubos (N), lavagem em água corrente (O) e disposição em
papéis toalha umedecidos (P). UTFPR, Câmpus Pato Branco, 2020.
Fonte: Autor
Após as medições do caulículo e raiz principal, todas as plântulas,
mesmo aquelas em condição de anormalidade, foram transferidas para tubetes
contendo substrato comercial esterilizado (Figura 7Q), e colocadas em câmara de
crescimento tipo Fitotron para a aclimatização (Figura 7R), com temperatura de 24
ºC e umidade de 95%. Semanalmente, foi realizada a aplicação da solução nutritiva
(Figura 7S) proposta por Hoagland e Arnon (1938).
31Figura 7 – Transplantio das plântulas do pessegueiro ‘BRS Kampai’ em tubetes (Q), colocação das
bandejas em câmara tipo Fitotron (R) e aplicação de solução nutritiva (S). UTFPR,Câmpus Pato Branco, 2020.
Fonte: Autor
Aos 30 dias após plantio em sementeira, avaliou-se o percentual de
sobrevivência das plântulas. Aos 60 dias após o plantio, foram realizadas as
avaliações das porcentagens de sobrevivência, de plântulas viáveis (Figura 8T) e
enrosetamento foliar (Figura 8U), bem como o comprimento de caule.
Figura 8 – Plântulas viáveis (T) e enrosetamento foliar do pessegueiro ‘BRS Kampai’. UTFPR,Câmpus Pato Branco, 2020.
Fonte: Autor
32Para o cálculo dos percentuais de sobrevivência das plântulas, foi
considerado o número inicial de plântulas transplantadas (Anexo B). Para os
percentuais de plântulas viáveis e rosetas, foi considerado o número final de
sobreviventes após 60 dias após o transplantio.
Os dados foram, inicialmente, submetidos ao teste de Shapiro-Wilk
para verificação da normalidade dos erros e ao teste de Oneillmathews para verificar
a homogeneidade das variâncias. As variáveis significativas pelo teste F foram
submetidas ao teste de comparação de média de Tukey. As variáveis comprimento
da radícula principal e caulículo, plântulas viáveis e enrosetamento foliar, não
atenderam aos pressupostos matemáticos mesmo após transformação, foram
submetidas ao teste de Friedman (p = 0.05). Todas as análises estatísticas foram
realizadas em linguagem R. As figuras foram confeccionadas pelo programa
SigmaPlot 12.5 e LibreOffice Calc.
334 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para a germinação dos embriões, avaliados através da atribuição de
notas em duas avaliações, não houve interação significativa entre os tipos de meio
de cultura e a concentração de BAP. Também não há diferença entre as
concentrações de BAP, apenas para os tipos de meio de cultivo. Na primeira
avaliação, realizada aos dois dias após saída do frio, ambos os meios de cultivo
apresentavam maiores percentuais de notas 2, indicando que os embriões
apresentavam germinação anormal com apenas cotilédones abertos, sendo que em
meio WPM essa condição mostrou-se superior em relação ao meio MS (Figura 9).
Figura 9- Nota de germinação aos dois dias após saída do frio dos embriões do pessegueiro ‘BRSKampai’ em relação do tipo de meio de cultura e concentração de BAP. UTFPR, CâmpusPato Branco, 2020.
Médias seguidas por letras distintas, na coluna, diferem entre si pelo teste de Tukey (p ≤ 0,05).ns Não
significativo. 1) Ausência de germinação; 2) Germinação anormal apenas com cotilédones abertos; 3)
Germinação anormal apenas com emissão de radícula; 4) Germinação anormal apenas com emissão
de caulículo e 5) Germinação normal apresentando caulículo e radícula. MS – meio de cultivo
Murashige-Skoog (Murashige;Skoog, 1962). WPM – Wood Plant Media (Lloyd et al., 1980).
Na segunda avaliação, realizada aos nove dias após a saída dos
embriões do frio, verificou-se que o meio MS apresentava o maior percentual de
1 2 3 4 50
10
20
30
40
50
60
70
80
MSWPM
Nota
Ger
min
ação
(%
)
a
b
a
b
a
b
a
bnsns
34notas 5, indicando que os embriões apresentavam germinação normal com
presença de radícula e caulículo bem desenvolvidos, enquanto que o meio WPM
apresentava, assim como na primeira avaliação, predomínio de embriões apenas
com cotilédones abertos (Figura 10). Não contatou-se ausência de germinação das
sementes nesta avaliação.
Figura 10- Nota de germinação aos nove dias após a retirada do frio dos embriões do pessegueiro‘BRS Kampai’ em relação do tipo de meio de cultura e concentração de BAP. UTFPR,Câmpus Pato Branco, 2020.
Médias seguidas por letras distintas, na coluna, diferem entre si pelo teste de Tukey (p ≤ 0,05). nsNãosignificativo. 1) Ausência de germinação; 2) Germinação anormal apenas com cotilédones abertos; 3)Germinação anormal apenas com emissão de radícula; 4) Germinação anormal apenas com emissãode caulículo e 5) Germinação normal apresentando caulículo e radícula. MS – meio de cultivoMurashige-Skoog (Murashige;Skoog, 1962). WPM – Wood Plant Media (Lloyd et al., 1980).
Para o percentual de germinação normal, considerando-se apenas
embriões que obtiveram nota 5 na segunda avaliação, houve interação significativa
entre os tipos de meio e concentração de BAP, ou seja, o comportamento dos meios
de cultivo em relação à germinação normal dos embriões modifica-se ao adicionar
ou não BAP (Tabela 1). O meio MS apresentou maior percentual de embriões em
condição normal de germinação em todos os tratamentos, independentemente da
concentração de BAP, em relação ao meio WPM. Em meio MS, a adição de 1 mg L-1
de BAP resultou no maior percentual de embriões em condições normais de
desenvolvimento, não diferindo, porém, da ausência do regulador no meio. Quando
a
b
a
bns
2 3 4 50
10
20
30
40
50
60
70
MSWPM
Nota
Ger
min
ação
(%
)
ns
ns
ns
35adicionou-se concentrações mais altas de BAP (2, 3 e 4 mg L -1), houve declínio da
germinação normal dos embriões. Em meio WPM, a ausência de BAP no meio
permitiu o maior percentual de embriões com germinação normal, enquanto que, nos
tratamentos em que houve a adição do regulador a germinação normal foi nula,
demonstrando claramente que a adição de BAP ao meio WPM prejudicou o
desenvolvimento dos embriões.
Tabela 1 – Germinação normal dos embriões de pessegueiro ‘BRS Kampai’ em função de cincoconcentrações de BAP (0, 1, 2, 3 e 4 mg L-1) e dois meios de cultura (MS e WPM). MS –meio de cultivo Murashige-Skoog (Murashige;Skoog, 1962). WPM – Wood Plant Media(Lloyd et al., 1980). UTFPR Câmpus Pato Branco, 2020.
Tipo de meioConcentração de BAP (mg L-1)
0 1 2 3 4
MS** 63,34 Aab* 78,33 Aa 55,55 Ab 55,56 Ab 44,45 Ab
WPM*** 43,33 Ba 0,00 Bb 0,00 Bb 0,00 Bb 0,00 Bb
CV (%) 30,52*Médias seguidas por letras diferentes maiúsculas, na coluna, e minúsculas, na linha, diferem
significativamente pelo teste de Tukey (p ≤ 0,05). **MS – meio de cultivo Murashige-Skoog
(Murashige;Skoog, 1962). ***WPM – Wood Plant Media (Lloyd et al., 1980).
Nota-se que o meio MS foi eficiente para a germinação de embriões de
‘BRS Kampai’ neste estudo, resultados que corroboram com vários outros trabalhos
(GERCHEVA; ZHIVONDOV, 2002; LIU et al., 2007; REIS et al., 2012) os quais
obtiveram os melhores percentuais de germinação dos embriões quando foi
empregado esse tipo de meio.
No presente estudo, o uso do meio MS com adição de 1 mg L-1 de
BAP apresentou a melhor porcentagem de germinação de embriões em condições
normais, enquanto que as concentrações mais altas de BAP (2, 3 e 4 mg L -1)
prejudicaram. Resultados semelhantes foram encontrados no resgate de embriões
da ameixeira ‘Brumosa’, sendo que os melhores resultados para a germinação e
desenvolvimento dos embriões foram alcançados quando 3,11 µM (0,70 mg L -1) de
BAP foram adicionados ao meio de cultura (GERCHEVA; ZHIVONDOV, 2002). A
maior porcentagem de germinação foi obtida quando utilizado o meio MS
suplementado com 0,5 mg L-1 de BAP (KUDEN et al., 1999). Da mesma forma,
concentrações mais altas de BAP induziram maior quantidade de embriões anormais
36para a macieira ‘Golden Delicious’ do que em baixas concentrações. Entretanto,
esses resultados discordam dos observados para a produção de híbridos
intraespecíficos do pessegueiro ‘Zhonghuashoutao’ cruzado com a ameixeira
‘Morettini’, uma vez que concentrações mais altas de BAP (4,0 mg L-1) promoveram
90% de germinação dos embriões (LIU et al., 2007).
O cultivo em meio WPM com o acréscimo de BAP em qualquer
concentração prejudicou a germinação normal dos embriões, sendo que o melhor
tratamento foi na ausência de BAP. Essa redução pode ser decorrente de que a
adição de reguladores de crescimento vegetal pode não ter sido benéfica, devido
aos teores indeterminados de hormônios endógenos contidos no embrião (COSTA;
ALOUFA, 2007).
Em ambos os meios de cultivo, as altas concentrações de BAP
mostraram-se prejudiciais para a germinação normal dos embriões. O balanço, a
interação e a concentração endógena de fitohormônios do explante determinam o
processo morfogenético in vitro. Embora auxinas e citocininas sejam normalmente
requeridas para o crescimento ou morfogênese, as auxinas podem inibir o acúmulo
de citocininas, enquanto as citocininas podem inibir pelo menos alguma ação das
auxinas (MONFORT et al., 2012). Nesse caso, a adição de BAP restringiu a
atividade das auxinas. O que pode explicar a nulidade de germinação normal
quando BAP foi adicionado ao meio WPM foi a não formação de raízes, mostrando
que esse regulador apresenta efeito negativo para esse fator. A redução da
produção de raízes como a adição de BAP normalmente ocorre porque esse
regulador inibe ou retarda a formação do sistema radicular (MONFORT et al.,2012),
evitando, também, os efeitos benéficos das auxinas sobre a iniciação radicular
(BEN-JAACOV et al., 1991), sendo que a indução ou a inibição da formação
radicular dependerão do balanço e da interação entre as substâncias de crescimento
endógenas e exógenas (MONFORT et al., 2012).
Para o desenvolvimento de radícula principal e de caulículo, o meio MS
permitiu as maiores médias para ambas as variáveis (Tabela 2). Esses resultados
são semelhantes aos encontrados para a seleção de pessegueiro ‘Conserva 1129’,
quando o meio WPM resultou em menor desenvolvimento radicular e de caulículo,
sugerindo que para aumentar a resposta no desenvolvimento dos embriões
37cultivados nesse tipo de substrato, seja realizado um cultivo prévio em outros meios
(REIS et al., 2012).
Tabela 2 – Médias e postos médios do teste de comparações múltiplas de médias de Friedman (α=0,05) para as variáveis comprimento de radícula principal e de caulículo de plântulas dopessegueiro ‘BRS Kampai’ com relação ao tipo de meio de cultura. UTFPR Câmpus PatoBranco, 2020.
Tipo de meioRadícula principal Caulículo
Médias (cm) Postos Médias (cm) Postos
MS** 1,30 8,00 a* 2,26 8,00 a
WPM*** 0,11 4,00 b 0,36 4,00 b*Médias não seguidas por mesma letra, na vertical, diferem entre si pelo teste de Friedman (α= 0,05).**MS – meio de cultivo Murashige-Skoog (Murashige e Skoog, 1962). ***WPM – Wood Plant Media(Lloyd et al., 1980).
Em relação à concentração de BAP, o uso de meio MS com acréscimo
de 1 mg L-1 de BAP possibilitou maior desenvolvimento da radícula principal,
enquanto que para a utilização desse regulador de crescimento em concentrações
entre 1 a 4 mg L-1 no meio WPM foi prejudicial (Tabela 3). O número de raízes de
pessegueiro diminuiu em 50% quando foram adicionados BAP e GA3 ao meio
(RIZZO et al., 1998). Para alfavaca, as concentrações de BAP mostraram ter efeito
negativo para a formação de raízes (MONFORT et al., 2012) A diminuição da
produção de raízes com a adição de BAP normalmente ocorre porque esse
regulador inibe ou atrasa a formação de raízes (BEN-JAACOV et al., 1991).
38Tabela 3 – Médias e postos médios do teste de comparações múltiplas de médias de Friedman (α=
0,05) para a variável comprimento da radícula principal de pessegueiro ‘BRS Kampai’com relação à concentração de BAP. UTFPR Câmpus Pato Branco, 2020.
Concentração de BAP(mg L-1)
Radícula principal
MS** WPM***
Médias (cm) Postos Médias (cm) Postos
0 1,77 16,00 b* 0,42 20,00 a
1 3,04 20,00 a 0,05 11,50 c
2 0,60 8,00 d 0,00 4,00 d
3 0,35 4,00 e 0,04 9,50 c
4 0,76 12,00 c 0,07 15,00 b*Médias seguidas por letras distintas, na vertical, diferem entre si pelo teste de Friedman (α= 0,05).**MS – meio de cultivo Murashige-Skoog (Murashige;Skoog, 1962). ***WPM – Wood Plant Media(Lloyd et al., 1980).
Para o desenvolvimento de caulículo, em meio MS, o uso de 4 mg L -1
de BAP permitiu o maior comprimento das plântulas, não diferindo de 1 mg L -1
enquanto que em meio WPM a ausência de BAP favoreceu o melhor
desenvolvimento de caulículo (Tabela 4). Para o crescimento de alfavaca em meio
de cultivo, o maior comprimento das plântulas ocorreu na ausência de BAP, sendo
que o acréscimo da citocinina ao meio de cultura fez com que o comprimento das
plântulas tendesse a diminuir (MONFORT et al., 2012). A adição de cinetina e ácido
indolacético no meio de cultura não aumentaram o desenvolvimento do embrião de
pessegueiro, sugerindo que o uso de reguladores de crescimento exógeno não foi
eficiente no cultivo de embriões das seleções de pessegueiro ‘Goldprince’, ‘P51-2’ e
‘B611505’ (PINTO et al., 1994). As contradições expressas acima evidenciam que a
eficiência do uso de reguladores de crescimento com efeito citocinínico depende da
espécie, da cultivar e do meio utilizado, sendo sempre necessários testes para
ajustes de protocolo e definições de concentrações a serem utilizadas, dependendo
de cada caso.
39
Tabela 4 – Médias e postos médios do teste de comparações múltiplas de médias de Friedman (α=0,05) para a variável comprimento do caulículo de pessegueiro ‘BRS Kampai’ comrelação à concentração de BAP. UTFPR Câmpus Pato Branco, 2020.
Concentração de BAP(mg L-1)
Comprimento do caulículo
MS** WPM***
Médias (cm) Postos Médias (cm) Postos
0 2,37 13,00 b* 0,49 19,00 a
1 2,53 16,00 ab 0,45 15,00 ab
2 1,81 8,00 c 0,29 9,00 c
3 1,63 4,00 d 0,37 13,00 bc
4 2,95 19,00 a 0,22 4,00 d*Médias seguidas por letras distintas, na vertical, diferem entre si pelo teste de Friedman (α= 0,05).**MS – meio de cultivo Murashig-Skoog (Murashige; Skoog, 1962). ***WPM – Wood Plant Media(Lloyd et al., 1980).
A maior elongação do caulículo verificada em meio MS acrescido com
BAP pode ser decorrente do estímulo ao aumento da multiplicação celular.
Concentrações altas de BAP (4,0 mg L-1) promoveram efeito positivo no estímulo no
desenvolvimento de pessegueiro, conferindo comprimento médio de 1,85 cm em
comparação com as concentrações menores (LIU et al., 2007). A melhor taxa de
desenvolvimento de embriões de pessegueiro em meio MS contendo BAP foi obtida
com a utilização de 5µM (1,13 mg L-1) e 10µM (2,27 mg L-1), porém quando
concentrações de 15µM (3,4 mg L-1) e 20µM (4,5 mg L-1) de BAP foram acrescidas
ao meio, o crescimento das plântulas foi maior, entretanto, com reduzido
aproveitamento, devido à presença dos sintomas indesejáveis de vitrificação
(BARBOSA et al., 1989).
Nesse trabalho, o meio WPM não foi eficiente tanto para a germinação
dos embriões quanto para o desenvolvimento das plântulas de pessegueiro ‘BRS
Kampai’ em comparação com os resultados obtidos com o uso do meio MS.
Trabalhos testando diferentes meios de cultura para germinação de sementes de
pessegueiro e cerejeira também obtiveram resultados insatisfatórios com a
utilização do meio WPM (REIS et al., 2012; FERMINO JUNIOR; SCHERWINSKI-
PEREIRA, 2012). O que pode explicar a ineficiência deste meio para o resgate de
embriões de pessegueiro é a baixa concentração de sais em comparação ao meio
40MS, especialmente de NO3
- e NH4+ (VILLA et al., 2006). Entretanto, o meio WPM foi
superior aos meios MS e Knops, apresentando maior germinação in vitro e
desenvolvimento de plantas de embriões de pessegueiro imaturos (RIZZO et al.,
1998), assim como proporcionou melhor desenvolvimento da parte aérea (RASEIRA
et al., 1998).
Em relação ao percentual de sobrevivência das plântulas aos 30 dias
após o plantio em sementeira, não houve interação significativa entre tipo de meio e
concentração de BAP. Não houve, também, efeito significativo tanto para o fator
meio de cultivo quanto para concentração de BAP.
Em relação ao percentual de sobrevivência das plântulas aos 60 dias
após o plantio em sementeira, não houve interação significativa entre tipo de meio e
concentração de BAP. Para o fator meio não houve diferença significativa,
entretanto, para as concentrações de BAP a diferença foi significativa. Para ambos
os meios de cultura, o comportamento da sobrevivência das plântulas é
representado por uma equação linear decrescente, indicando que o aumento da
concentração de BAP no meio provoca redução na sobrevivência das plântulas de
pessegueiro aos 60 dias após o transplante (Figura 11 A,B).
Figura 11 – Sobrevivência de plântulas de pessegueiro ‘BRS Kampai’ aos 60 dias após o plantio emsementeira em meio de cultura MS (A) e WPM (B) em função de cinco concentrações deBAP (0, 1, 2, 3 e 4 mg L-1). UTFPR Câmpus Pato Branco, 2020.
41Nesse experimento, o percentual de sobrevivência das plântulas de
pessegueiro aos 60 dias após o plantio em sementeira sofreu acentuado declínio em
comparação aos 30 dias. Ambos os meios de cultura utilizados apresentaram
percentual de sobrevivência mediano, porém, quando não houve a adição de BAP, a
sobrevivência foi maior em relação aos tratamentos em que foram adicionadas
concentrações de BAP, no quais o percentual de plântulas sobreviventes reduziu
gradativamente. A evidência de que a presença de BAP prejudicou a sobrevivência
aos 60 dias após o transplante conduz a hipótese de uma suposta fitotoxicidade
induzida pelas dosagens elevadas do regulador de crescimento. Seria oportuno, em
experimentos futuros, testar doses menores, entre zero e 1 mg L -1 de BAP, pois para
essa maior dosagem há respostas positivas na obtenção de plântulas normais em
meio MS (Tabela 1).
Quanto ao percentual de plântulas viáveis e rosetas, não houve
diferença significativa entre os meios de cultivo. Em relação à concentração de BAP,
foi observado que a ausência do regulador ou uso do regulador em concentração
superior a 3 mg L-1 em meio MS, provocou redução no percentual de plântulas
viáveis e, por consequência, aumento da ocorrência de enrosetamento foliar em
relação às demais concentrações (Tabela 5). Em meio WPM, foi observado que o
uso de concentrações de 1 e 2 mg L-1 de BAP possibilitou maior percentual de
plântulas viáveis e menor ocorrência de rosetas.
42Tabela 5 – Médias e postos médios do teste de comparações múltiplas de médias de Friedman (α=
0,05) para as variáveis plântulas viáveis e rosetas do pessegueiro ‘BRS Kampai’ aos 60dias após o plantio em sementeira com relação à concentração de BAP. UTFPR, CâmpusPato Branco, 2020.
MS**
Concentração de BAP(mg L-1)
Plântulas viáveis Rosetas
Médias (%) Postos Médias (%) Postos
0 86,70 6,00 b* 13,30 18,00 b
1 100,00 13,50 a 0,00 10,50 a
2 100,00 13,50 a 0,00 10,50 a
3 86,70 6,00 b 13,30 18,00 b
4 86,70 6,00 b 13,30 18,00 b
WPM***
Concentração de BAP(mg L-1)
Plântulas viáveis Rosetas
Médias (%) Postos Médias (%) Postos
0 73,23 13,00 b 26,77 11,00 b
1 92,26 18,50 a 7,74 5,00 c
2 90,87 16,50 ab 9,13 8,00 cb
3 47,50 7,50 c 52,50 16,50 a
4 33,33 4,50 c 66,67 19,50 a*Médias seguidas por letras distintas, na vertical, diferem entre si pelo teste de Friedman (α= 0,05).**MS – meio de cultivo Murashige-Skoog (Murashige;Skoog, 1962). ***WPM – Wood Plant Media(Lloyd et al., 1980).
O uso de BAP em baixas concentrações possibilitou incrementos no
percentual de plântulas em condições de desenvolvimento, reduzindo e/ou anulando
a presença de enrosetamento foliar, enquanto que nos tratamentos sem adição de
BAP ao meio, aumentou a ocorrência da anomalia. Esse resultado concorda com
Reis et al. (2012), uma vez que plântulas de pessegueiro cultivadas em meio MS e
WPM sem adição de reguladores de crescimento, apresentaram 11,42% e 24,99%
de rosetas, respectivamente.
A exposição prolongada ao BAP nas concentrações de 3 e 4 mg L -1
podem ter causado a formação de rosetas (ANDRADE, 2011). Concentrações
maiores de BAP (3,4 mg L-1 e 4,5 mg L-1) promoveram sintomas de enrosetamento
foliar em plântulas de pessegueiro e nectarineira precoces (BARBOSA et al., 1989).
43Além da influência do BAP, a ocorrência de rosetas nas mudas de
pessegueiro pode ter sido favorecida pela associação a outros fatores, dentre os
quais, estão a temperatura, duração da estratificação e resposta da cultivar. Nos
subtrópicos, as sementes de pessegueiro são colhidas no final da primavera,
estratificadas e germinadas no verão, quando as temperaturas máximas geralmente
são superiores a 30 ºC, o que se assemelha às condições desse experimento, sendo
que o enrosetamento de mudas pode ser um grande problema nessas condições
(TOPP et al, 2008). A formação de rosetas também é dependente da cultivar e
constatou-se que é alto em sementes de genótipos com período de desenvolvimento
de fruto inferior a 110 dias, como no caso do ‘BRS Kampai’ com ciclo de 95 dias,
reduzindo rapidamente com o aumento do com período de desenvolvimento de fruto
(BACON; BYRNE, 1995).
Quanto ao crescimento de caule, observou-se que não houve interação
entre os dois fatores estudados. Para concentração de BAP, não houve diferença
significativa. Entretanto, o tipo de meio de cultura apresentou significância, tendo o
meio MS possibilitado o maior crescimento de caule em relação ao meio WPM
(Tabela 6). O meio MS possibilitou o maior crescimento de caule dos genótipos de
pessegueiro ‘Conserva 1129’ e ‘Conserva 844’ (REIS et al., 2012).
Tabela 6 – Comprimento de caule de pessegueiro ‘BRS Kampai’ após 60 dias em câmara tipoFitotron, em relação ao tipo de meio de cultura e concentração de BAP. UTFPR CâmpusPato Branco, 2020.
Tipos de meio Caule (cm)
MS** 2,99 a*
WPM*** 1,55 b
CV (%) 35,71*Médias seguidas por letras distintas diferem significativamente pelo teste de Tukey (p ≤ 0,05). ** MS– meio de cultivo Murashige-Skoog (Murashige;Skoog, 1962). ***WPM – Wood Plant Media (Lloyd etal., 1980).
Os resultados obtidos no presente trabalho indicam que o genótipo
‘BRS Kampai’ apresenta alguma dificuldade no complemento da maturação e na
germinação das sementes e seja dependente de um meio de cultura que forneça
maior concentração de sais, como o MS, suplementado com níveis baixos de auxina
e citocinina. Algumas cultivares podem possuir biossíntese diferencial de hormônios
44endógenos e/ou eficiência diferente na maneira de absorver e metabolizar os
compostos presentes no meio de cultura (PARFITT; ALMEHDI, 1986). Dessa forma,
a obtenção de resultados favoráveis é dependente de diversos fatores,
principalmente, relacionados ao comportamento de cada genótipo em decorrência
da interação existente entre o genótipo e o meio de cultura empregado (CABETAS et
al., 1997).
455 CONCLUSÕES
Levando em consideração as condições em que o experimento foi
conduzido, recomenda-se a utilização do meio MS com suplementação de 1 mg L -1
de BAP para a embriocultura do pessegueiro ‘BRS Kampai’. O meio WPM, com ou
sem adição de BAP, não foi eficiente, não sendo indicado para o resgate de
embriões dessa cultivar.
466 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A embriocultura é uma técnica que possibilita a seleção de
características importantes das cultivares de pessegueiro dentro dos programas de
melhoramento genético, sendo uma ferramenta importante para o resgate de
embriões de cultivares de maturação precoce dos frutos e obtenção de novos
genótipos com essa característica.
Como existem divergências sobre os melhores meios de cultivo para o
resgate de embriões de pessegueiro, e, como no caso desse trabalho, em que o
meio WPM mostrou-se ineficiente, faz-se necessário investir em um novo
experimento testando a resposta de diferentes cultivares de pessegueiro com
período de desenvolvimento dos frutos semelhante ao ‘BRS Kampai’ em meio WPM,
com o objetivo de comparar o desempenho desse meio no resgate dos embriões.
Sugere-se também testar concentrações menores de BAP entre zero e 1 mg L-1.
Assim será possível verificar se há alguma dificuldade associada às
sementes de ‘BRS Kampai’ que reduzem a eficiência no resgate de embriões
quando submetidos a esse meio de cultivo ou se WPM é, de fato, um meio menos
eficiente no resgate de embriões de pessegueiro.
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52
ANEXOS
53ANEXO A – Composição básica dos meios de cultura MS (Murashige e Skoog,
1962) e WPM (Wood Plant Medium (Lloyd e Mc Cown, 1981).
Fonte: Embrapa (2008).
54ANEXO B– Percentual de plântulas do pessegueiro ‘BRS Kampai’ transplantadas
para cada tratamento.
Tratamento Plântulas transplantadas (%)
MS + 0 mg L-1 BAP 96,66
MS + 1 mg L-1 BAP 95,00
MS + 2 mg L-1 BAP 91,67
MS + 3 mg L-1 BAP 98,33
MS + 4 mg L-1 BAP 98,33
WPM + 0 mg L-1 BAP 98,33
WPM + 1 mg L-1 BAP 100,00
WPM + 2 mg L-1 BAP 98,33
WPM + 3 mg L-1 BAP 95,00
WPM + 4 mg L-1 BAP 93,33
55ANEXO C– Quadros das análises de variância para cada variável resposta.
ANOVA Sobrevivência aos 30 dias após transplantio
ANOVA Sobrevivência aos 60 dias após transplantio
ANOVA Comprimento do caule
56ANOVA Germinação normal
ANOVA Germinação Primeira Avaliação
ANOVA Germinação Segunda Avaliação
Análises não-paramétricasComprimento da radícula principal
57Meio MS
Meio WPM
Comprimento do caulículo
58Meio MS
Meio WPM
Plântulas viáveisMeio MS
59
Meio WPM