mecanismos de inmunorregulación en la esquistosomiasis murina · central dr. luis federico leloir,...

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Tesis Doctoral

Mecanismos de inmunorregulaciónMecanismos de inmunorregulaciónen la esquistosomiasis murinaen la esquistosomiasis murina

Rutitzky, Laura I.

2004

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasBiológicas de la Universidad de Buenos Aires

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Rutitzky, Laura I.. (2004). Mecanismos de inmunorregulación en la esquistosomiasis murina.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3705_Rutitzky

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Rutitzky, Laura I.. "Mecanismos de inmunorregulación en la esquistosomiasis murina". Tesisde Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2004.http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3705_Rutitzky

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http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3705_Rutitzky

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Universidad de Buenos AiresFacultad de Ciencias Exactas y Naturales

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“Mecanismos de inmunorregulación en laesquistosomiasis murina”

Autor: Lic. Laura I. Rutitzky

Director: Dr. Miguel J. Stadecker

m37o5vLugar de Trabajo:

Departamento de Patología, Tufts University School of Medicine, Boston,Massachusetts, Estados Unidos.

-2004

0 O O D 0‘

A mi mamá Elsa, a mis hermanas Mariana y Nora y a mi papáBernardo (1938-1980).

AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer principalmente al Dr. Miguel J. Stadecker por haberme dado laoportunidad de realizar esta tesis en su laboratorio y por haberme guiado y brindado suexperiencia a lo largo de estos casi seis años de trabajo en conjunto. También le quieroagradecer el excelente trato personal que tuvo conmigo que me ayudó a hacer este trabajoen EEUU. lejos de mi familia y de muchos de mis amigos.

A mis hermanas y mamá por haberme ayudado con las averiguaciones y los trámites y porsu apoyo en general para que yo pueda hacer este doctorado a la distancia.

A las Dras. Marta Finiasz y Susana Fink por haberme introducido en el mundo de lainmunología, por haber estado siempre cerca mío y por ayudarme con la escritura encastellano de esta tesis.

A los Dres. María Marta de Elizalde de Bracco y Martín Isturiz por los encuentros que mededicaron en cada una de mis visitas a Buenos Aires para darme sus consejos acerca de miproyecto de tesis.

A mis compañeros de laboratorio, los que están y los que ya se fueron: Héctor, I-Iiroko,Samantha, Gerardo, Eduardo, Jennifer, Jing y Jessica por su buena predisposición enayudarme con los gigantescos experimentos, por enseñarme muchas de las técnicas queutilicé para la tesis o simplemente por compartir el espacio y el trabajo de cada dia.

A Allen Parmelee por haberme enseñado a usar el citómetro de flujo, por su paciencia enresolver mis mil y una dificultades con ese aparato y las computadoras y por habermehecho el sorting de las células no apoptóticas.

A Archie Artz y a Ana Bonadio por facilitarme muchas de las dificultades que traía ladistancia.

A mis muy queridas amigas biólogas Paula, Alina, Cecilia, Valeria, Ana y Bárbara.

A Paula, otra vez, por su compañia, por su espíritu alentador y por la enorme ayuda en lacompaginación de esta tesis.

A mis otros muy queridos amigos Macario e Isabel que me acompañaron bien de cerca entodo lo que fue este proceso de vivir y hacer la tesis en EEUU.

Y por último, agradezco a los ratones BL/6 y CBA su participación protagónica en estatesis, sin la cual no hubiera podido hacer ni uno de los experimentos.

ÍNDICE

Resumen l

Summary 2

Publicaciones 3

Abreviaturas 4

CAPÍTULO l Introducción General

Epidemiología 5

Antecedentes históricos 7

El parásito que causa la esquistosomiasis 7

El ciclo de vida del esquistosoma 7

La enfermedad esquistosomiasis 9

El modelo murino de esquistosomiasis ll

El papel de los huevos del parásito 12

La respuesta inmune asociada con la esquistosomiasis 14Granulomas 18

Citoquinas 19

Apoptosis 20

Coestimulación 22

Tratamiento, control y desarrollo de una vacuna 23

Objetivos 26

Materiales y Métodos 27

CAPÍTULO ll Efecto de la inmunización de ratones BL/6 con SEA/CFA en el

desarrollo de la inmunopatología asociada con la esquistosomiasis.

Introducción 34

Resultados 36

Discusión 45

CAPÍTULO Ill Papel de la apoptosis de los linfocitos T CD4+de los granulomashepáticos en las cepas de ratones que desarrollan alta y bajapatología en esquistosomiasis.

Introducción

Resultados

Discusión

49

50

62

CAPÍTULO IV Efecto del bloqueo del mecanismo de coestimulaciónICOS-B7RP-l en el desarrollo de la inmunopatología asociadacon la esquistosomiasis

Introducción 66

Resultados 67

Discusión 73

DISCUSIÓN GENERAL Y CONCLUSIONES 76

BIBLIOGRAFÍA 83

RESUMEN

La esquistosomiasis continúa siendo una de las enfermedades parasitarias con mayorprevalencia en el mundo. En la esquistosomiasis causada por S. mansoni, los huevos de los gusanoshelmintos desencadenan un proceso de inflamación ganulomatosa hepática con desarrollo de fibrosisque esta mediado por linfocitos T CD4+ específicos para los antígenos del huevo (SEA). En elmodelo murino de la enfermedad, los ratones de la cepa CBA desarrollan alta patología caracterizadapor granulomas grandes y una pronunciada respuesta de linfocitos T hacia el SEA, mientras que losratones de la cepa BL/6 desarrollan baja patología con granulomas de tamaño significativamentemenor y una respuesta más atenuada de linfocitos T. En la fase aguda de la enfermedad en ambascepas se desarrolla una respuesta de citoquinas del tipo Thl. Sin embargo, en el transcurso de la fasecrónica se observa una respuesta combinada de citoquinas Thl/Th2 en los ratones de la cepa CBA,mientras que en los ratones de la cepa BL/6 la respuesta de citoquinas se polariza hacia una del tipo

Los experimentos que se describen a continuación se realizaron con el fin de investigarcómo el ambiente de citoquinas, la apoptosis de los linfocitos T CD4+ y los mecanismos decoestimulación influyen el desarrollo de la inmunopatologia inducida por los huevos en el modelomurino de la infección con esquistosoma y sus consecuencias en la enfermedad.

l. Se usó un modelo artificial de alta patología producido por la inmunización de ratonesBL/6 con SEA en adyuvante completo de Freund (CFA) para estudiar el papel de las respuestas decitoquinas del tipo Thl vs. Th2 en el desarrollo de la inmunopatologia. Los resultados mostraron quela inmunización con SEA/CFA indujo un cambio en la producción de citoquinas hacia un perfil Thlpor una población numéricamente estable de linfocitos T CD4' específicos para el SEA que secorrelacionó con una cxacerbación grave de la inmunopatologia y con la muerte prematura de losratones.

2. Se estudiaron el papel de la apoptosis de linfocitos T CD4" en el desarrollo de lainmunopatologia y el posible mecanismo inductor de este tipo de muerte celular comparando variosparámetros inmunológicos relacionados con los linfocitos T CD4+ entre las dos cepas de ratonespolares, CBA y BL/6. Los resultados demostraron que la apoptosis de linfocitos T CD4‘ de losgranulomas y de los ganglios linfáticos mesentéricos (GLM) fue más elevada en la cepa de bajapatología BL/6 que en la cepa de alta patología CBA como consecuencia de la falta de producción dela IL-2. El tratamiento in vivo de los ratones BL/6 con lL-2 recombinante resultó en un aumento dela patología hepática y una disminución de la apoptosis de linfocitos T CD4".

3. Finalmente, se examinó el papel del mecanismo ICOS-B7RP-l (coestimulador inducibleproteína-l relacionada a B7) en el desarrollo de la inmunopatologia por medio del tratamiento deratones BL/6 infectados con un anticuerpo monoclonal (AcMo) que bloquea a ICOS. Los resultadosmostraron que el sistema de coestimulación ICOS-B7RP-l ayuda principalmente a controlar laproducción de IFN-y por linfocitos T específicos para el SEA y así promover un ambiente decitoquinas Th2 que lleva a limitar el daño hepático en la cepa de baja patología BL/6.

Estos hallazgos contribuyen a nuestro conocimiento de los mecanismos que regulan larespuesta inmune en la esquistosomiasis murina. Ellos proveen nuevas evidencias de cómo loslinfocitos T CD4’ regulan Ia inmunopatologia, confirmando que el establecimiento de un ambientede citoquinas del tipo Th2 se correlaciona con la protección hacia esta infección por helmintos y quela apoptosis es un mecanismo para controlar los linfocitos T CD4" que median la inmunopatologia.Los resultados presentados en esta tesis podrían ser utilizados para diseñar c implementar estrategiasque resulten en un mejoramiento general de la inmunopatologia asociada con la enfermedad.

SUMMARY

Schistosomiasis continues to be one of the most prevalent parasitie infections in the world.In schistosomiasis mansoni, helminth parasite eggs preeipitate an intrahepatic granulomatous andfibrosing inflammatory process, which is mediated by, and dependent on, MHC class lI-restrictedCD4+ T helper lymphoeytes specific for schistosome egg antigens (SEA). ln the mouse model of thedisease, CBA mice develop high pathology characterized by large granulomas and strong eggantigen-speeifie T cell responses whereas C57BL/6 (BL/6) mice develop low pathology withsignificantly smaller granulomas and a more attenuated T cell response to the SEA. While in theacute phase of the disease both strains develop a Thl type cytokine response, during the chronicphase CBA miee exhibit a Thl/Th2 type response whereas BL/6 mice bias their cytokine response toa Th2 phenotype.

The following experiments were undertaken to further investigate how the prevailingcytokine environment, CD4+ T cell apoptosis and T cell costimulatory pathways influence thedevelopment of the egg-indueed immunopathology in the experimental murine schistosome infectionand the outcome of the disease:

l. An artificial model of high pathology by immunization of BL/ó mice with SEA incomplete Freund’s adjuvant (CFA) was used to study the role of Thl vs. Th2 cytokine responses inthe development of egg-induced immunopathology. The results showed that the immunization withSEA/CFA induced a Thl shift in the cytokine production by a numerically stable population of SEAspecifie CD4+ T cells that correlated with a severe exaeerbation of the immunopathology and deathof these otherwise low pathology mice.

2. The role of CD4+ T cell apoptosis in the egg-induced immunopathology, and the possibleunderlying mechanisms that account for this type of cell death, were studied by comparing severalimmune parameters related to CD4" T cells between the two polar strains of mice, CBA and BL/6.The results demonstrated that CD4+ T cell apoptosis of granuloma and mesenteric lymph node cellswas higher in the low pathology BL/6 strain than in the high pathology CBA strain as a result of lL-2deprivation. The in vivo treatment of BL/6 mice with recombinant lL-2 resulted in increased hepaticpathology and decreased CD4‘ T cell apoptosis.

3. Finally, the role of the lCOS-B7RP-l (inducible costimulatory molecule-B7-relatedprotein-l) costimulatory pathway on the development of egg-induced immunopathology wasexamined by treating infected BL/6 mice with a blocking mAb against lCOS. The results showedthat the ICOS-B7RP-l costimulatory pathway servcs primarily to control lFN-y production by SEAspecific T lymphocytes, thereby promoting a Th2 cytokine environment conducive to limited hepaticdamage in the low pathology BL/6 strain.

These findings contribute to our knowledge on the mechanisms that regulate the immuneresponse in murine schistosomiasis. They provide new insights on how CD4‘ T lymphoeytesregulate immunopathology; confirm that the establishment of a Th2 cytokine environment eorrelateswith host protection in this helminth infection and demonstrate that apoptosis represents a significantmeans of controlling the CD4‘ T cells that mediate the immunopathology. The results presented inthis thesis may serve to devise and implement strategies for amelioration of the immunopathology inthis disease.

PUBLICACIONES

Relacionadas con esta tesis:

- Apoptosís by neglect of CD4+ Th cells in granulomas: a novel effector mechanism

involved in the control of egg-induced immunopathology in murine schistosomiasis.

Rutitzky LI, Mirkin GA, Stadecker MJ. J. Immunol. 2003 Aug. 15; l7l(4):1859-67.

- Disruption of the ICOS-B7RP-l costimulatory pathway leads to enhanced hepatic

immunopathology and increased gamma interferon production by CD4 T cells in murine

schistosomiasis. Rutitzky LI, Ozkaynak E, Rottman JB, Stadecker MJ. Infect. Immun.

2003 Jul; 71(7):4040-4.

- Thl-polarizing immunization with egg antigens correlates with severe exacerbation of

immunopathology and death in schistosome infection. Rutitzky LI, Hernandez HJ,

Stadecker MJ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001 Nov 6; 98(23):l3243-8. Epub 2001 Oct

23.

No relacionadas con esta tesis:

Genetic analysis of the immunopathology in murine shcistosomiasis. Rutitzky LI,

Hernandez HJ, Yím YS, Ricklan DE, Finger E, Mohan C, Wakeland K, Stadecker MJ. J.

Immunol. 2004 (aceptado, en revisión).

- IL-lO is crucial for the transition from acute to chronic disease state during infection of

mice with Schistosoma mansoni. Sadler CH, Rutitzky LI, Stadecker MJ, Wilson RA.

Eur. J. Immunol. 2003 Apr; 33(4):880-8.

- Diminished immunopathology in Schistosoma mansoni infection following intranasal

administration of cholera toxin B-immunodominant peptide conjugate correlates with

enhanced transforrning growth factor-beta production by CD4 T cells. Hernandez HJ,

Rutitzky LI, Lebens M, Holmgren J, Stadecker MJ. Parasite Immunol. 2002 Aug;

24(8):423-7.

AcMo

BSA

CFA

CG

CGLM

CPA

CPM

i.v.

kb

kDa

KO

NaN;

PBS

s.c.

SEA

T. amb.

Th

WT

ABREVIATURAS

anticuerpo monoclonal

seroalbúmina bovina

adyuvante completo de Freund

células de granuloma

células de ganglio linfático mesentérico

célula presentadora de antígeno

cuentas por minuto

desvío estándar

enzyme-linked immuno sorbent assay

error estándar

ganglio linfático mesentérico

interferón gama

inmunoglobulina

interleuquina

intraperitoneal

intravenoso

kilobase

kilodalton

knock out

azida sódica

solución salina tarnponada con fosfato

subcutáneo

antígenos solubles del huevo

temperatura ambiente

T helper

factor de necrosis tumoral

wild type

CAPÍTULO I

Introducción General

Laura I. Rutitzkv Capítulo l

INTRODUCCIÓN GENERAL

EPIDEMIOLOGÍA:

La esquístosomiasis o bilharziasis en una enfermedad parasitaria crónica causada por

helmintos trematodos del género Schistosoma. Cinco de las especies de este género son

parásitos de humanos (S. mansoni, S. haematobium, S. japonicum, S. intercalatum y S.

mekongi) mientras que muchas otras afectan a distintos animales como aves y otros

mamíferos.

La esquístosomiasis es endémica en varios países tropicales y subtropicales de

África, América Central, América del Sur y Asia. Según el último censo de la Organización

Mundial de la Salud, afecta crónicamente a unas 200 millones de personas y se estima que

otras 650 millones están en peligro de contraer la infección (WHO 1993). Aproximadamente

la mitad de la morbilidad y de la mortalidad debida a la esquístosomiasis ocurre en África,

donde 100 millones de personas se encuentran infectadas, con una estimación de 280.000

muertes por año debido a infecciones con S. mansom' y S. haematobium (van der Werf,

Bosompem et al. 2003). La muerte se debe generalmente a complicaciones de un síndrome

de hipertensión portal con ascitis y hematemesis en el caso de infecciones intestinales por S.

mansom', y a cáncer de vejiga o a una deficiencia renal en el caso de infecciones del tracto

urinario por S. haematobium. Aunque la esquístosomiasis es prevenible y tratable, todavía

causa considerable morbilidad y mortalidad en regiones tropicales del mundo. A nivel

mundial, pocos individuos mueren por esquístosomiasis, comparativamente con otras

enfermedades, pero la enfermedad cobra una gran importancia ya que produce incapacidad

crónica (Bica, Harner et al. 2000; Pearce y MacDonald 2002).

Las malas condiciones sanitarias de los lugares donde la enfermedad es endémica

permite que los huevos excretados por las personas infectadas contaminen las aguas de

lagos, ríos, canales y arroyos donde habitan los caracoles hospedadores intermediarios. Los

avances en la agricultura y las represas, al mismo tiempo que incrementan la producción del

cultivo y el desarrollo del suministro del agua, también incrementan la exposición al agua

contaminada. Además, las fiJentes de agua estancada ofrecen un medio favorable para la

supervivencia de los caracoles hospedadores, un componente crítico para la diseminación

continua de la enfermedad.

Laura I. Rutitzkv Capitulo I

Los trabajadores adultos en áreas rurales, empleados en el comercio agrícola o de

pesca en agua dulce, están en un gran riesgo de contraer esquistosomiasis. Además, la

enfermedad afecta con mucha frecuencia a niños, causando deterioro en los patrones de

crecimiento y reduciendo su capacidad intelectual. Se reportó que en el Noreste de Brasil, la

capacidad de trabajo de la población rural se vio seriamente reducida debido a la debilidad y

letargo producidos por la enfermedad. Como muchos de los efectos adversos de la

esquistosomiasis aparecen varios años después de contraída la infección, la severidad de la

enfermedad puede no ser detectada y en muchos casos no se infiere una relación causal

hacia la misma.

Aproximadamente 75 países de áreas tropicales y subtropicales de África, Asia,

América del Sur y el Caribe tienen focos endémicos de esquistosomiasis (Figura 1). De las

diversas especies de esquistosoma las más importantes a nivel epidemiológico son: S.

mansoní (Arabia, África, América del Sur y Caribe), S. haematobíum (África y el Medio

Oriente) y S. japonicum (Japón, China y Filipinas) (Noble 1982; Smithers y Doenhoff

1982). Los países que no tienen esquistosomiasis, pero se encuentran cercanos a áreas

endémicas pueden tener focos endémicos menores no detectados (Butterworth, Dunne et al.

1996). Muchas de las especies de esquistosomas infectan a animales que sirven de

reservorios naturales y permiten que se mantenga una transmisión de la enfermedad en

forma constante (Mott, Nuttall et al. 1995).

FIGURA l: Distribución geográfica de la esquistosomiasis.

Laura l. Rutitzkv Capítulo l

ANTECEDENTES HISTÓRICOS:

La esquístosomiasis en una enfermedad ancestral cuyos primeros registros datan de

los egipcios, unos 4.000 años atrás (Smithers y Doenhoff 1982). Las pruebas de que la

esquístosomiasis existió en aquellos tiempos las otorgó Ruffer en 1910 quien identificó

huevos de esquistosomas en tejidos de momias que databan de entre 1.250-l.000 años AC

(Ruffer 1910). Más tarde, se observaron casos de infección con esquístosomiasis entre

miembros de la armada francesa instalada en Egipto entre 1799-1801 (Hoeppli 1973;

Adamson 1976; Cox 2002). Sin embargo, la primera identificación del parásito

esquistosoma en el hombre la hizo Theodor Bilharz en 1851, quien recuperó gusanos adultos

de las venas mesentéricas de un cadáver (Bilharz 1853; Cox 2002)

EL PARÁSITO QUE CAUSA LA ESQUISTOSOMIASIS:

Esquistosoma significa etimológicarnente “cuerpo hendido”. Son parásitos

pertenecientes al phylum Platíhelmintos, clase Trematode, orden Strigeatoida, familia

Schistosomatidae y género Schistosoma. Este mismo grupo monofilético incluye a otras

familias de gusanos parásitos encontrados en invertebrados inferiores.

EL CICLO DE VIDA DEL ESQUISTOSOMA:

Los gusanos del género Schistosoma se caracterizan por tener un ciclo de vida que

alterna entre formas de vida libre y formas parasitarias y entre un hospedador intermediario,

donde el parásito cumple con el ciclo de vida asexual, y un hospedador definitivo donde

cumple con el ciclo de vida sexual. Todos ellos tienen a un caracol de agua como

hospedador intermediario y a un vertebrado como hospedador definitivo.

La infección en humanos por S. mansoni se produce cuando las personas entran en

contacto con agua contaminada con las cercarias infectivas liberadas por los caracoles (paso

1, Figura 2). Las cercarias, con ayuda de su cola en forma de pinza y de la síntesis de

proteasas, penetran la piel (paso 2) (McKerrow, Pino-Heiss et al. 1985). Una vez dentro del

hospedador, pierden la cola y se transforman en esquistosómulas quienes están

especialmente adaptadas para vivir en el medioambiente salino del cuerpo humano (paso 3)

(Warren 1978). Al cabo de 2-3 días en la piel, las larvas entran en el torrente sanguíneo y

circulan hacia los pulmones donde sufren distintas transformaciones anatómicas, fisiológicas

Laura I. Rutitzkv Capítulo I

y bioquímicas que les facilitan la migración intravascular. Las larvas salen de los pulmones

y son transportadas por la sangre arterial hacia las venas mesentéricas donde se alojan y

maduran al estadío adulto; después de 4-6 semanas de producida la infección (pasos 4 y 5)

(Warren 1978; Boros 1986). Allí, las hembras y los machos se aparean y producen los

huevos que contienen al embrión llamado miracidio (paso 6). La hembra se ubica en la

hendidura del cuerpo del macho adulto, permaneciendo así durante el resto de sus vidas,

entre 5 y 10 años y produciendo alrededor de 300 huevos por día (Bica, Hamer et al. 2000).

Los huevos liberados por las hembras son transportados por la sangre y con ayuda de la

secreción de enzimas proteolíticas producidas por el miracidio y de los granulomas que

generan, atraviesan la pared de las venas, pasan a través de la lámina propia, el epitelio

intestinal y llegan hacia el lumen desde donde salen al exterior junto con las heces (paso 7)

(Von Lichtenberg, Smith et al. 1971; Pelley 1977).

FIGURA 2: Ciclo de vida del esquistosoma

o la cercanase Ilberadel caracol AI estadio infectlvo:m‘bgommi (estadiodevidalibre) Aon“ d d Midentrodelcaracol) A =“a b para ias" coM' ‘A/lyv

y luego de penetrar le piel la cercariaV Í v ' epierde lacola,convirtiéndoseen

A, ’ - ‘3. e ee-ubtoeómulaA,l M l.A/ ’V .

a J V oclrculaciónsanguíneaVo lalarvamirecidiov

Ingresa en el caracol .

A M / migrncónalsistemaportav E o! e hepático,dondemaduraalñ M z estadioadulto

4 , ""5

o Von hoc/ec\A enorina C 9N. -|V ‘ ¡4'Elhuevoecloslona ¡A A '\ C Vliberandoalmiracidio ' » ¡ k2 6

M i ' \ fi ¡e 'A. i V IE Losaduitos,aparendos,migranhacia:'- ' A las vénuies intestinales o metales (depositandoV A, ’ ‘ s‘ ”M\.'l Ar ’ huevosquecirculanhaciaelhigadoyeeliberan

s. maan si haomaloomm hacia el exterior con las heces o le orina)M l E c c elplexovenosodelavejigaM ' A,jFigura traducida del sitio htÍD.'//WWWrinrí ml!- “ J ’"TM’ ’“ ’ ’ ‘ ' ’ htm

Si las heces que contienen los huevos llegan al agua, los huevos eclosionan liberando a los

miracidíos quienes con ayuda de su cuerpo ciliado nadan en búsqueda del caracol específico

(pasos 8 y 9). Una vez dentro del caracol, cada miracidio madura a un esporozoito madre y

se localiza en el tracto digestivo, luego se divide asexualmente produciendo los esporozoitos

hijos quienes migran hacia las glándulas digestivas (hepatopáncreas) del caracol donde se

transforman en cercarias (paso 10). Ante estímulos de luz y temperatura adecuados, las

cercarias se liberan de los caracoles, nadan para encontrar su hospedador definitivo y así

perpetuar el ciclo (paso 1) (Warren 1978).

LA ENFERMEDAD ESQUISTOSOMIASIS:

Más del 50% de los huevos producidos es retenido en la microvasculatura hepática y

otros tejidos del hospedador donde desencadena una reacción inflamatoria granulomatosa

que con el tiempo lleva al desarrollo de fibrosis. Es por esto que la sintomatología clínica en

esquistosomiasis no se debe tanto a la presencia de los gusanos, sino a la respuesta inmune

montada contra los huevos que ellos producen (Boros y Warren 1970).

Una vez dentro del humano, S. mansoni y S. japonicum se alojan en las venas

mesentéricas inferiores y superiores cercanas a los intestinos, mientras que S. haemalobium

se localiza en las venas del plexo alrededor de la vejiga (Warren 1978).

De las especies de esquistosoma que infectan al humano, S. mansoni es la que está

mejor estudiada ya que su ciclo de vida se puede mantener fácilmente en el laboratorio, es la

especie más prevalente e infecta a un mayor número de personas en todo el mundo y causa

una enfermedad hepática que puede llevar a la muerte del paciente (Smithers y Doenhoff

1982)

La enfermedad causada por S. mansoni se presenta en dos fases bien diferenciadas:

una primera “fase aguda” que abarca las primeras 5-6 semanas de la infección y una “fase

crónica” que comienza a desarrollarse aproximadamente a partir de la 7ma. semana

(Andrade y Andrade 1970; Al Adnani 1985; Boros 1989). La fase aguda en humanos se

presenta generalmente en personas no-inmunes. Esta fase está caracterizada por fiebre alta,

denominada fiebre de Katayama, eosinofilia, diarrea y en algunos casos edema, urticaria,


linfoadenopatía y artralgia. Ocurre antes de la aparición de los huevos del parásito en las

heces del paciente y los síntomas que se presentan son generalmente transitorios y

desaparecen espontáneamente con el pasaje hacia la fase crónica (Ramos-Morales,

Sotomayor et al. 1968). Por el contrario, la fase crónica presenta distintas manifestaciones

clínicas de severidad variable (Andrade y Van Marck 1984; Boros 1989). La mayoría de los

individuos infectados desarrolla la enfermedad crónica de manera relativamente

asintomática denominada “intestinal”, la que está caracterizada por una baja carga

parasitaria y por la presencia de sangre en las heces, leve dolor abdominal y diarrea. Una

menor proporción de pacientes (5-lO%) desarrolla, en cambio, la forma crónica más severa

denominada “hepatoesplénica” que involucra seriamente al hígado y al bazo. Esta forma

hepatoesplénica, como su nombre lo indica, se caracteriza por desencadenar

hepatoesplenomegalia, fibrosis hepática y peri-portal, hipertensión portal con obstrucción,

hemorragia gastrointestinal, ascitis, varices esofágicas y comúnmente la muerte (Gigase

1982; Raia, Mies et al. 1985; De Cock 1986; Dunne y Pearce 1999).

Los estudios de campo en áreas endémicas, junto con los experimentos en modelos

animales, demostraron que la genética del hospedador, la intensidad de la infección, la

sensibilización intrauterina a antígenos del esquistosoma y la coinfección con otras

enfermedades, determinan el desarrollo de la respuesta inmune y así, la gravedad de la

enfermedad (Arap Siongok, Mahmoud et al. 1976; Cheever, Duvall et al. 1987; Marquet,

Abel et al. 1996; Secor, del Corral et al. 1996; Karanja, Colley et al. 1997; Halim, Garry et

al. 1999; Montesano, Colley et al. 1999).

En los humanos el diagnóstico de la enfermedad se hace usualmente por métodos

directos y/o inmunológicos. La detección microscópica de huevos en las heces (Técnica de

Kato-Katz, (Katz, Chaves et al. 1972)) o en la orina se realiza fácilmente ya que los huevos

de las especies de Schisrosoma son bien característicos. Sin embargo, este método tiene el

problema de que la excreción de los huevos tiene fluctuaciones diarias y que las infecciones

con baja carga parasitaria no son detectadas. También se realizan biopsias de mucosa rectal

que resultan ser más sensibles que la detección de huevos en las heces. Los métodos

inmunológicos que se aplican para el diagnóstico están dirigidos a detectar en el suero los

anticuerpos especificos contra los distintos estadios del parásito (Tsang y Wilkins 1991) o a

detectar antígenos del esquistosoma por medio de ensayos de ELISA (Deelder, Qian et al.


1994). En los individuos con la enfermedad avanzada, el grado de hepatoesplenomegalia y

la presencia de fibrosis en el hígado, diagnosticadas por ecografías, se utilizan para

determinar la gravedad de la enfermedad.

EL MODELO MURINO DE ESQUISTOSOMIASIS:

El modelo murino de esquistosomiasis fue descripto originalmente por Warren y

DeWitt en 1958 (Warren y Dewitt 1958). Estos investigadores observaron que los ratones

infectados con S. mansoní desarrollaban hepatomegalia, esplenomegalia, hipertensión portal

y várices esofágicas similares a las que se producen en los humanos. Años más tarde, estos

descubrimientos fueron confirmados por von Lichtenberg (von Lichtenberg 1962) y por

Cameron y Bhattacharyya (Cameron y Bhattacharyya 1965). La disponibilidad del modelo

murino posibilitó el estudio y el esclarecimiento de cómo los gusanos S. mansom' causan la

enfermedad.

Así como ocurre en los humanos, entre las diferentes cepas de ratones también hay

una notoria variación “clínica”. En el modelo murino de la enfermedad, el tamaño de los

granulomas hepáticos, fácilmente de medir sobre preparados de tejido teñidos con

hematoxilina y eosina, se usa como indicador de la severidad de la enfermedad. Así

entonces, las cepas CS7BL/6, l29/Sv (ambas H-Zb)y BALB/c (H-Zd) son las que desarrollan

la enfermedad más moderada con granulomas hepáticos de un tamaño pequeño, y las cepas

CBA/J y C3H/l-IeN (ambas H-Zk) las que desarrollan la forma más severa de la enfermedad,

típicamente con granulomas más grandes, significativa fibrosis y muerte más temprana

durante la infección (Cheever, Duvall et al. 1987) (Tabla I). En el ratón, esta variación en la

patología se correlaciona directamente con la magnitud de la respuesta inmune

desencadenada por los antígenos solubles del huevo de esquistosoma (SEA, del inglés

soluble egg-antigens). Así, los linfocitos de los ratones de las cepas que desarrollan

naturalmente la enfermedad más severa, CBA/J y C3H/HeN, proliferan significativamente

más en respuesta al SEA que las mismas células de las cepas con baja patología, C57BL/6,

129/Sv y BALB/c.

TABLA I: Resumen de las cepas de ratón utilizadas como modelos en la

esquistosomiasis murina experimental y sus correlatos “clínicos” e inmunológicos.

Alta patología Baja patología

Cepas CBA (H-2“) C57BL/6 (H-2")C3H (H-2") 129/SV (H-2")

BALB/c (H-2d)Inmunopatología en el granulomas grandes con granulomas chicos conhígado extendida inflamación hacia poca inflamación hacia

el parénquima el parénquimaMortalidad a causa de la Alta bajainfección

Proliferación de linfocitos T Alta bajaRespuesta de citoquinas Thl/Th2 Th2

EL PAPEL DE LOS HUEVOS DEL PARÁSITO:

Los estudios realizados en el modelo murino de la infección con esquistosoma dieron

evidencias directas de que el estadío de huevo del parásito es el que induce la patología. En

uno de los primeros estudios realizados para determinar la forma parasitaria responsable de

la enfermedad, se inyectaron a tres grupos de ratones por vía intravenosa (i.v.) con gusanos

vivos, con gusanos muertos o con extractos de gusanos vivos. Este estudio demostró que

sólo cuando había producción de huevos los animales desarrollaban granulomas,

hepatomegalia, esplenomegalia, hipertensión portal y várices esofágicas (Warren 1961). La

presencia de toxinas producidas por los gusanos adultos no se consideró como una causa

posible ya que la enfermedad no se manifestaba cuando los ratones eran infectados con

gusanos hembras o gusanos machos solamente o cuando estos recibieron inyecciones de

extractos de gusanos vivos (Boros y Warren 1970).

Mientras que estos estudios demostraron que los huevos del parásito son los

responsables de causar la enfermedad, ellos no identificaron los componentes que


estimulaban la reacción inflamatoria granulomatosa. Los primeros estudios enfocados hacia

determinar la fuente de los antígenos inmunogénicos del huevo que estimulan la respuesta

inflamatoria mediada por linfocitos T, los realizaron Boros y Warren (Boros y Warren 1970)

quienes utilizaron el modelo de granulomas en pulmón descripto por von Lichtenberg

(Peterson y Von Lichtenberg 1965). Este modelo tiene la ventaja de que genera granulomas

en forma sincronizada en un período de tiempo corto y permite delinear la dinámica de la

evolución e involución de las lesiones, excluyendo los cambios histopatológicos que ocurren

en el proceso granulomatoso en los animales infectados. Estos investigadores se basaron en

la teoría de que los antígenos que desencadenan una respuesta granulomatosa deberían

inducir una sensibilización inmunológica. Para esto contaron con tres grupos de ratones a los

que les inyectaron en forma intraperitoneal (i.p.): a) huevos intactos muertos por sucesivos

calentamientos y congelamientos, b) homogenatos de huevos, preparados por sonicación y

molido c) sobrenadantes que contenían sólo los fluidos de los huevos que habían sido

homogenizados. Luego, a estos tres grupos de ratones sensibilizados los inyectaron en forma

i.v. con huevos vivos de esquistosomas y observaron la formación de los granulomas en los

pulmones. Los resultados mostraron que los huevos intactos muertos, los homogenatos de

huevos y el sobrenadante que contenía a los fluidos fueron efectivos en sensibilizar a los

ratones para la formación de granulomas alrededor de los huevos inyectados, sugiriendo que

los antígenos solubles derivados de los huevos eran los responsables de la inducción de la

reacción granulomatosa. En este mismo trabajo se demostró que este material soluble que

contenía a los antígenos estaba presente en los fluidos liberados por la eclosión natural de

los huevos del parásito ya que las cáscaras y los miracidios aislados luego de la eclosión no

sensibilizaban a los ratones para formar granulomas (Boros y Warren 1970). Estos

resultados fueron confirmados por Hang et al. quienes demostraron que los huevos

depletados del fluido o de los embriones, tampoco eran eficientes en inducir la formación de

granulomas (Hang, Warren et al. 1974).

Más tarde, estudios bioquímicos del SEA mostraron que éste estaba compuesto por

proteínas, glucoproteínas y polisacáridos y que los inmunógenos que estimulaban la

formación de granulomas, la proliferación y producción de citoquinas de los linfocitos eran

principalmente las glucoproteínas (Pelley, Pelley et al. 1976; Boros, Tomford et al. 1977;

Brown, Remold et al. 1977; Carter y Colley 1978; Weiss, Aronstein et al. 1987; Ham,


Danko et al. 1989; Lukacs y Boros 1991). A pesar de que estos ensayos apuntaron a estudiar

el potencial patogénico de los antígenos, todavía no había una identificación precisa de cada

una de las moléculas componentes del SEA. Hoy se sabe que el SEA contiene al menos 30

componentes proteicos de pesos moleculares de entre < 25 a > 200 kDa y algunos de éstos

ya se han caracterizado bioquímica e inmunológicamente (Figura 3). Si bien es improbable

que todos estos componentes sean inmunogénicos, varios de ellos contribuirían a

sensibilizar al sistema inmune del hospedador para inducir la formación de los granulomas

(Stadecker, Hernandez et al. 2001).

FIGURA 3: Perfil de un gel de poliacrilamida (SBS-PAGE) de las proteínas del SEA teñidas con negroamido. Se muestran 30 bandas distinguibles. Cuatro de las bandas son antígenos que están caracterizadosbioquímica e inmunológicamente y se indican con sus respectivos nombres. Los estándares de pesosmoleculares están indicados a la izquierda. Frs. = fiacciones.

LA RESPUESTA INMUNE ASOCIADA CON LA ESQUISTOSOMIASIS:

Una primera infección con los esquistosomas ocurre, generalmente, sin una marcada

resistencia del sistema inmune del hospedador. De este modo, a lo largo de su desarrollo

14

Laura l. Rutitzky Capítulo l

desde la esquistosómula hasta el gusano adulto, los esquistosomas evitan la respuesta

inmune por varios mecanismos distintos como la inducción de moléculas anti-inflamatorias

(Ramaswamy, Kumar et al. 2000), la inhibición de la función de células linfoideas (Angeli,

Faveeuw et al. 2001) y cubriéndose en la superficie con antígenos del hospedador (Goldring,

Clegg et al. 1976; Simpson, Singer et al. 1983; Davies, Shoemaker et al. 1998; Loukas,

Jones et al. 2001). A pesar de estas primeras estrategias de evasión, el sistema inmune del

hospedador logra reaccionar contra los gusanos, pero falla en destruirlos.

Se demostró que mientras los huevos de los esquistosomas son los responsables de

causar la enfermedad, el principal factor en la inmunopatogénesis asociada con la

esquistosomiasis es la respuesta granulomatosa mediada por los linfocitos T del hospedador

(Boros y Warren 1970; Boros 1986). Como se mencionó anteriormente, la respuesta crónica

granulomatosa alrededor de los huevos del parásito junto con el desarrollo de fibrosis, son

las causas principales de la enfermedad hepatoesplénica, la más severa en los humanos

(Boros 1989).

El proceso de formación de los granulomas es una reacción celular de

hipersensibilidad retardada (DTH, del inglés delayed-type hypersensitivity). En uno de los

primeros estudios clásicos se demostró que los ratones previamente expuestos a huevos de

esquistosoma, mostraban una acelerada formación de granulomas que era específica y podía

ser transferida por leucocitos del hospedador, pero no por su suero

(Warren, Domingo et al. 1967). En la esquistosomiasis, este tipo de respuesta inmune está

mediada por linfocitos T CD4+ restringidos por el Complejo Mayor de Histocompatibilidad

(CMI-I) de clase II específicos para el SEA (Mathew y Boros 1986) y varios estudios

demostraron que los granulomas no se forman en ratones atímicos (Phillips, DiConza et al.

1977), o en ratones que no expresan las cadenas a y B del receptor T (Iacomini, Ricklan et

al. 1995), o ratones knock out (KO) para los genes del CMH de clase II o el gen 1 activador

de la recombinasa (Rag-l) (Hernandez, Wang et al. 1997) remarcando el papel fundamental

de los linfocitos T CD4+ en el desarrollo de la inmunopatología.

Una observación importante que surgió inicialmente del uso del modelo de la

enfermedad en el ratón, fue que la reacción granulomatosa a los huevos del parásito

disminuía en tamaño con el progreso de la infección. Conjuntamente con esta disminución,

se producía un mejoramiento en la patofisiología de la enfermedad. Este fenómeno fue


denominado desensibilización endógena o inmunomodulación (Andrade y Warren 1964;

Domingo y Warren 1968; Boros, Pelley et al. 1975; Colley 1975). A lo largo del tiempo se

postularon algunos mecanismos que explicarían este proceso que opera tanto en el ratón

como en el humano, como por ejemplo, la presencia de linfocitos T CD8+ supresores

(Phillips, Lin et al. 1991; Chensue, Warmington et al. 1993; Pedras-Vasconcelos y Pearce

1996), la regulación cruzada de citoquinas producidas por linfocitos del tipo Thl y Th2

(Pearce, Caspar et al. 1991; Malaquias, Falcao et al. 1997), el desarrollo de linfocitos anti

idiotípicos (Colley, Montesano et al. 1999), entre otros.

Hoy se sabe que en los individuos que desarrollan la enfermedad más grave, no se

produce la inmunomodulación del tamaño de los granulomas (Colley, Garcia et al. 1986).

Durante el curso de la infección el hospedador está expuesto constantemente a una

variedad amplia de antígenos liberados por los gusanos adultos y los huevos. En los

humanos la respuesta inmune de anticuerpos hacia S. mansoni es compleja y se describió

que algunos anticuerpos interfieren con la eliminación del parásito mientras que otros

participan en la resistencia a la re-infección (Dunne, Grabowska et al. 1988; Demeure, Rihet

et al. 1993; Naus, Kimani et al. 1999).

En general, los linfocitos Th CD4+ de ratones se pueden dividir en dos

subpoblaciones de acuerdo al tipo de citoquinas que producen. Los linfocitos productores de

interleuquina-2 (IL-2) e interferón-gama (IFN-y) se denominan linfocitos del tipo Thl y

aquéllos que producen IL-4, IL-5 e IL-lO, se denominan del tipo Th2 (Mossmann y

Coffman 1989).

En la esquistosomiasis, la primera respuesta inmune adaptativa que se induce está

polarizada hacia un perfil de citoquinas pro-inflamatorias Thl y se mantiene hasta el

momento en que empieza la producción de los huevos, alrededor de la 5ta. semana después

del inicio de la infección, momento en el cual comienza la formación de los granulomas. En

las siguientes dos semanas, el proceso de formación de los granulomas alcanza su pico

mientras que el perfil de citoquinas, bajo condiciones normales, carnbia hacia uno del tipo

Th2, anti-inflamatorio (Vella y Pearce 1992; Stadecker y Hernandez 1998) (Figura 4).


Esquistosómulas12"’I“’

Adultos WWIWyFIGURA 4: Desarrollo de la respuesta inmune durante la infección. En el transcurso de la

infección, la respuesta inmune progresa a través de dos fases. En las primeras 3-5 semanas (fase aguda),

durante las cuales el hospedador está expuesto a los parásitos inmaduros que migran por el cuerpo, la respuesta

dominante es del tipo Thl. A medida que los parásitos maduran, se aparean y comienzan a producir los huevos,

entre la 5ta. y 6ta. semana, la respuesta inmune cambia notoriamente hacia una respuesta del tipo T112.Esta

respuesta es inducida principalmente por los huevos del parásito. Durante la fase crónica de la enfermedad, la

respuesta Th2 es modulada y los granulomas que se forman alrededor de los huevos nuevos son de tamaño

menor (inmunomodulación). Figura traducida de Ia originalpresente en el artículo de Pearce E, J. y MacDonaIdA.S. Nat, Rev.

Immunal. 2002 Jul;2(7):499-511.

La IL-4 (Pearce, Cheever et al. 1996), algunos mecanismos coestimuladores como

B7-CD28 (Hemandez, Sharpe et al. 1999) y CD40-CD154 (MacDonald, Patton et al. 2002),

junto con un cambio en el mecanismo de activación de las células presentadoras de

antígenos (CPA), desde la vía clásica hacia la vía alternativa (Goerdt y Orfanos 1999) y la

presencia de los linfocitos B (Hernandez, Wang et al. 1997), todos, contribuyen a este pasaje

de Thl a Th2. La evolución de este pasaje está acompañada por la producción abundante de

anticuerpos IgG e IgE y por la inducción de respuestas de linfocitos T CD8+ (Phillips, Lin et

al. 1991; Chensue, Warmington et al. 1993; Pedras-Vasconcelos y Pearce 1996). El papel de

los linfocitos T 78 no parece importante en la respuesta inmune asociada a la enfermedad

(Iacomini, Ricklan et al. 1995).

Laura I. Rutitzky Capítulo I

-GRANULOMAS:

Los granulomas son lesiones formadas por una matriz de fibras de colágeno y

agregados inflamatorios compuestos principalmente por eosinófilos, macrófagos,

neutrófilos y linfocitos (Boros y Warren 1970). Como se mencionó anteriormente, la

formación de los granulomas hepáticos en la infección por S. mansoni es un proceso

mediado por linfocitos T CD4+restringidos por el CMH de clase II (Mathew y Boros

1986; Hernandez, Wang et al. 1997) (Figura 5). Los granulomas pueden ser

considerados como lesiones necesarias para proteger al hospedador ya que se

demostró que los ratones deficientes en moléculas CD4 son incapaces de formar

granulomas y mueren debido a los efectos tóxicos de ciertas proteínas del huevo

sobre los hepatocitos (Amiri, Locksley et al. 1992). Rodeando al huevo, el

granuloma esencialmente lo aísla del tejido hepático y permite que el hígado

continúe con su función normal. A largo plazo, cuando los huevos mueren y los

granulomas se resuelven, se desarrolla fibrosis del tejido (Boros 1989). Esto lleva al

incremento de la presión sanguínea portal y al desarrollo de várices esofágicas. La

causa más común de muerte debido a la esquistosomiasis es el sangrado de las

Varices.

BL/6 CMH clase I KO(No linf. T CD8+)

CMH clase II K0(No linf. T CD4“)

FIGURA 5: La formación de granulomas es dependiente de los linfocitos T CD4+.En la figura se observan

granulomas hepáticos alrededor de un huevo sobre secciones de tejido teñidas con hematoxilina y eosina. A, un

ratón BL/6 wild type (WT); B, un ratón BL/6 deficiente en linfocitos T CD8+donde no se observan diferencias

cualitativas ni cuantitativas respecto del WT y C, un ratón deficiente en linfocitos T CD4Jrdonde no se forman

los granulomas alrededor de los huevos.

-CITOQUTNAS:

Los esquistosomas, como otros helmintos (Gause, Urban et al. 2003),

inducen normalmente en el hospedador una característica respuesta crónica de

citoquinas del tipo Th2 que los hace un sistema modelo para el estudio del desarrollo

y la función de este tipo de respuesta inmune.

En trabajos realizados sobre la esquistosomiasis experimental, usando a los

ratones de la cepa BL/6, de baja patología, se estableció que durante el transcurso de

la fase aguda se presenta una primera respuesta inmune pro-inflamatoria del tipo

Thl , con producción de IL-12, IFN-y e lL-2 y a medida que la enfermedad pasa a la

fase crónica, esta respuesta Thl es reemplazada por una del tipo Th2, con producción

principalmente de IL-4 e IL-lO, que es importante para controlar el daño hepático

(Pearce, Caspar et al. 1991; Stadecker y Flores Villanueva 1994). Los eosinófilos

presentes en los granulomas son una fuente importante de IL-4 y ayudan a asegurar

la respuesta del tipo Th2 protectora (Rumbley, Sugaya et al. 1999).

A diferencia de los ratones BL/6, en las cepas que desarrollan alta patología,

CBA/J y C3H/HeN, la respuesta Th] desencadenada durante la fase aguda continúa a

lo largo del desarrollo de la respuesta Th2 característica de la fase crónica. Todavía

no se conocen las causas de este fenómeno, pero estarían relacionadas posiblemente

con el reconocimiento a antígenos diferentes que inducen preferentemente una fuerte

respuesta Thl restringida por H-2k (Hernandez, Edson et al. 1998). En estas cepas de

ratones el mecanismo de inmunomodulación no es tan evidente.

En el humano, la fase aguda de la enfermedad se caracteriza por la presencia

del factor de necrosis tumoral (TNF, del inglés tumor necrosis factor) en el plasma y

por la producción de niveles altos de TNF, IL-l e IL-6 por células de sangre

periférica estimuladas con antígenos del parásito (de Jesus, Silva et al. 2002).

Presumiblemente, en la progresión natural de la enfermedad, la respuesta Th2

específica a los antígenos del huevo, regula negativamente la producción y las

funciones efectoras de los mediadores pro-inflamatorios Thl. En especial, la

producción de la IL-lO en este período cumple un papel crucial (Flores Villanueva,

Chikunguwo et al. 1993; Montenegro, Miranda et al. 1999).


Los pacientes que desarrollan la forma severa hepatoesplénica de la

enfermedad en su fase crónica, muestran una respuesta de citoquinas del tipo Thl

con niveles bajos o indetectables de IL-lO, mientras que los pacientes que presentan

la forma leve intestinal de la esquistosomiasis desarrollan una respuesta de

citoquinas del tipo Th2 (Malaquias, Falcao et al. 1997; Mwatha, Kimani et al. 1998).

Se propuso un papel central para el TNF en el desarrollo de los granulomas

en base a que una dosis de TNF inyectada en ratones infectados que presentan severa

inmunodeficiencia combinada (SCID) es suficiente para inducir una lesión alrededor

de los huevos y evitar fallas en la función hepática (Amiri, Locksley et al. 1992). Un

posible mecanismo por el cual el TNF cumpliría con su función es la regulación

positiva de las moléculas de adhesión intracelular-1 (ICAM-l, del inglés intracelular

adhesión molecule-l), que media las interacciones entre células y su migración a

través del endotelio (Ritter y McKerrow 1996).

En la tabla II se muestra un resumen del papel de las citoquinas involucradas

en la inmunopatología de la esquistosomiasis.

TABLA II: Principales funciones de la citoquinas involucradas en la inmunopatología

de la esquistosomiasis.

Pro-inflamatorias

TNF-a Respuesta en la fase aguda TGF-BHepatotóxicas Pro-flbrótica

-APOPTOSIS:

La apoptosis o muerte celular programada, es un proceso fisiológico,

regulado genéticamente, por el cual se eliminan las células que no están cumpliendo

con su función específica o células innecesarias (Van Parijs, Biuckians et al. 1998;

20


Van Parijs, Peterson et al. 1998; Lenardo, Chan et al. 1999; Rathmell y Thompson

2002). Este mecanismo ya fue involucrado en la regulación de la respuesta inmune

de muchas enfermedades parasitarias como las causadas por otras especies de

helmintos (Kalinkovich, Weisman et al. 1998); leishmaniasis (Desbarats, Stone et al.

2000), filariasis (Jenson, O'Connor et al. 2002), malaria (Sanchez-Torres, Rodriguez

Ropon et al. 2001; Wipasa, Xu et al. 2001) y enfermedad de Chagas (Lopes, da

Veiga et al. 1995; Martins, Cardoso et al. 1998).

La célula apoptótica se caracteriza por perder volumen, tener la membrana

plasmática distorsionada, presentar condensamiento del núcleo con agregación de la

cromatina y producir la degradación del ADN en fragmentos nucleosomales por

medio de endonucleasas. Estos cambios ocurren después de una cascada de

señalización y pasos que son mediados por proteasas denominadas caspasas

(Cisteína-Aspartato-proteasas) que regulan proteínas pro- y anti-apoptóticas y que

pueden ser inducidas por dos mecanismos principales, uno activo o extrínseco y otro

pasivo o intrínseco (Lenardo, Chan et al. 1999; Tesciuba, Subudhi et al. 2001).

En los linfocitos T, los mecanismos de apoptosis activa son los que se

desencadenan generalmente a través de un receptor como por ejemplo, el sistema

compuesto por Pas/FasL, que son moléculas miembros de la familia del receptor del

TNF y su ligando TNF (TNFR/TNF). Hasta el momento no se conocen con precisión

los mecanismos moleculares que controlan la expresión de estos receptores

inductores de la apoptosis activa; algunos factores nucleares como el NFIT, NFKB y

la proteína-1 específica, entre otros, se asociaron a la activación de la expresión de

FasL (Kavurma y Khachigian 2003). Otra forma de apoptosis es la inducida por

linfocitos T CD8+ que cumple un papel fundamental en las infecciones virales. Estos

linfocitos citotóxicos, al igual que las células NK (natural killer), utilizan más de un

mecanismo para inducir apoptosis; entre ellos se encuentra el mediado por perforina

y granzima (Apasov y Sitkovsky 1993; Vaux y Strasser 1996).

En oposición a los mecanismos de apoptosis inducida por activación, está la

apoptosis pasiva que se desencadena por la falta de factores de crecimiento (Cohen,

Duke et al. 1992; van Neerven, Sparholt et al. 1998; Van Parijs, Biuckians et al.

1998; Lenardo, Chan et al. 1999; Rathmell y Thompson 2002). Esta forma de

2|


apoptosis parece ser independiente de la expresión de miembros de la familia

TNFR/TNF y puede ser inhibida por la IL-2 o por la expresión de miembros de la

familia de moléculas BCI-2 (Mogil, Radvanyi et al. 1995; Akbar, Borthwick et al.

1996; Van Parijs, Ibraghimov et al. 1996). Hasta el momento se identificaron más de

20 miembros de la familia Bcl-2, incluyendo proteínas que suprimen la apoptosis

(Bol-2, Bcl-XL, MCL-l, A1, Bcl-W y Bcl-G) y proteínas que promueven la

apoptosis (Bax, Bak, Bok, Bad, Bid, Bik y Biml) induciendo la liberación de

citocromo c de la mitocondria (Adams y Cory 1998).

-COESTIMULACIÓN:

Para ser activados apropiadamente, los linfocitos T necesitan recibir por lo

menos dos señales independientes, una antígeno-específica a través del receptor T y

otra segunda señal a trave's de las moléculas de coestimulación necesarias para

aumentar la producción de citoquinas, la proliferación, promover la supervivencia de

las células, inducir diferenciación hacia células efectoras o de memoria y permitir la

cooperación con otras celulas. Es por esto que la coestimulación es un mecanismo

que hace más que aumentar los eventos desencadenados a través del reconocimiento

antígeno-receptor; interactúa con señales antígeno específicas en forma sinérgica

para permitir la activación completa de los linfocitos. Así, las moléculas

coestimuladoras deben inducir una señal positiva y no solamente incrementar la

avidez del receptor T (como puede ser el caso de las moléculas de adhesión) o

aumentar el reclutamiento de enzimas tirosina quinasas al complejo del receptor T

(como es el caso de los co-receptores CD4 y CD8) (Frauwirth y Thompson 2002).

Los receptores de las moléculas de coestimulación se pueden subdividir en

dos clases en base a sus homologías en las secuencias de aminoácidos. La primera

clase incluye a CD28 y al coestimulador inducible (ICOS, del inglés inducible

costimulator). CD28 e ICOS tienen como ligandos a miembros de la familia de

moléculas B7. Los linfocitos T no activados expresan en forma constitutiva a CD28

y reciben la segunda señal a través de las moléculas B7-l y B7-2 presentes en células

presentadoras de antígeno (CPA) (Lenschow, Walunas et al. 1996). A diferencia de

los linfocitos T no activados, los linfocitos efectores utilizan un repertorio diferente


de moléculas de coestimulación para proveer la segunda señal. Entre éstas, está

ICOS que se induce en tejidos donde se desencadenan respuestas celulares del tipo

Thl como Th2 (Sperling y Bluestone 2001). La proteína-l relacionada a B7 (B7RP

l, del inglés B7-related protein-l, también denominada B7h o LICOS) es el ligando

de ICOS y se encuentra presente principalmente en CPA de órganos linfoides como

timo y bazo, pero también se lo encuentra en órganos no linfoides como riñón,

pulmón y testículo (Aicher, Hayden-Ledbetter et al. 2000).

Otros dos receptores, CTLA-4 (del inglés cytotoxic T-lymphocyte-associated

protein-4) y PD-l (del inglés programmed death-1), comparten una homología

estructural con esta clase y también se unen a moléculas que pertenecen a la familia

de las B7, pero las evidencias muestran que ambos receptores tienen efectos

inhibitorios y por esto no serían considerados como coestimuladores. Por el

contrario, estas proteínas podrían ser calificadas como reguladores negativos de la

coestimulación.

La segunda clase de receptores de coestimulación son miembros de la familia

del receptor del TNF. Ella incluye a CD40, OX-40, 4-lBB (CD137), CD3O y a

CD27. Los ligandos de estos receptores, CD40L (CD154), OX-4OL, 4-lBBL

(CD137L), CD30L y CD27L son miembros de la familia del TNF y se encuentran

unidos a membrana (Frauwirth y Thompson 2002).

TRATAMIENTO, CONTROL Y DESARROLLO DE UNA VACUNA:

Actualmente el helminticida más utilizado para tratar la esquistosomiasis es el

Praziquantel. Una única dosis oral de 40 mg/kg de Praziquantel es generalmente suficiente

para curar pacientes en un 60-90% y reducir la cantidad de huevos excretados en un 90

95%. A pesar del progreso que se logró con la quimioterapia, todavía hay una significativa

diseminación de la enfermedad, especialmente en el oeste africano (Capron, Capron et al.

2002). La quimioterapia, incluso cuando se aplica en forma masiva, tiene la limitación de

que no impide la re-infección, que ocurre normalmente en las áreas endémicas de la

enfermedad y la prevalencia alcanza rápidamente (6-8 meses) los niveles iniciales. Además,

se necesita de una infraestructura importante para que la droga que se suministra cubra

regularmente toda el área endémica, lo que hace que la quimioterapia sea un abordaje muy

23


costoso. Asimismo, aunque todavía no hay evidencias de especies de esquistosomas

resistentes al Praziquantel, en varios países se está reportando la presencia de una menor

susceptibilidad a la droga.

Resulta imposible erradicar completamente a la esquistosomiasis porque los

esquistosomas infectan a muchos animales que sirven de reservorios naturales y permiten la

continua transmisión del parásito (Mott, Nuttall et al. 1995). Algunas intervenciones

importantes para el control de la enfermedad son la reducción de la fecundidad del parásito,

la educación sanitaria, la provisión de agua limpia (Engels, Chitsulo et al. 2002) y el control

químico o biológico de los caracoles que actúan como intermediarios. Si bien un abordaje

multidisciplinario es lo más conveniente para reducir la transmisión, resulta muy costoso

para los países donde se presenta la enfermedad. La estrategia actual de control de la

Organización Mundial de la Salud está dirigida a reducir la morbilidad que causa la

enfermedad por medio de la terapia con drogas o el desarrollo de vacunas más que a

erradicar la enfermedad (WHO 1985).

El desarrollo de una vacuna que pueda prevenir la infección o proveer al menos una

inmunidad parcial resultaría, entonces, esencial para el control de esta importante

enfermedad parasitaria. La posibilidad de adquirir inmunidad está basada en el hecho de que

la prevalencia y la intensidad de la infección normalmente decrecen con la edad. Habría dos

posibilidades para una inmunointervención en esquistosomiasis, la primera es el clásico

abordaje de una vacuna con antígenos del patógeno como para preparar las defensas del

hospedador en el momento de la infección. Con esta idea se identificaron varios antígenos

del gusano y del huevo que dieron pruebas de una protección limitada ante la infección. Sólo

una de ellas está siendo probada en humanos (Bergquist 2002). El otro abordaje para una

inmunointervención sería lograr regular negativamente la excesiva inmunopatología

mediada por los linfocitos T CD4+. Este concepto se basa en la asunción de que la inducción

de tolerancia a una cantidad de antígenos resultaría en una disminución de la magnitud de la

respuesta inflamatoria. Actualmente existen varias estrategias para inducir tolerancia in vivo

hacia péptidos y proteínas usando por ejemplo péptidos análogos con propiedades

antagonistas a aquéllos inmunodominantes o usando agentes que previenen o inhiben la

activación de los linfocitos T, como es el caso de la IL-lO. Todavía es necesario investigar si

estas estrategias serán exitosas en la esquistosomiasis experimental o si se pueden

24


implementar en la esquistosomiasis humana, pero en cualquier caso, su realización

dependerá en parte de la identificación de los inmunógenos críticos de los antígenos del

huevo y de sus epítopes para los linfocitos T (Stadecker y Hernandez 2001).

Actualmente existe una vacuna experimental que se aplica a animales infectados de

laboratorio y consiste en cercarias atenuadas por radiación UV o gama (Reynolds y Ham

1992; Coulson 1997; Wilson, Coulson et al. 1999). Los resultados del uso de esta vacuna

son promisorios porque protege a los animales de contraer la infección, pero su aplicación

en humanos no es posible ya que las vacunas de parásitos atenuadas no son consideradas

seguras o prácticas dado que no hay ningún control de la localización del parásito una vez

dentro del cuerpo humano.

OBJETIVOS

Como objetivo principal de esta tesis se propone estudiar nuevos mecanismos de

inmunorregulación en esquistosomiasis en las cepas de ratón que desarrollan naturalmente

baja y alta patología. En particular, se tratará de definir el papel que cumple un ambiente

dominado por citoquinas del tipo Thl vs. uno dominado por citoquinas del tipo Th2 en el

desarrollo de la enfermedad. También se propone estudiar la función de la apoptosis de

linfocitos T CD4+ comparando dos cepas de ratones que desarrollan distinto grado de

inmunopatología. Asimismo, es igualmente importante ampliar el conocimiento de los

sistemas coestimuladores que influencian los mecanismos efectores de los linfocitos T CD4+

que median la enfermedad.

OBJETIVO l: Definir el papel que cumplen las respuestas de citoquinas del tipo Thl

vs. Th2 en el desarrollo de la inmunopatología asociada con la enfermedad.

OBJETIVO 2: Estudiar el papel que cumple la apoptosis de los linfocitos T CD4+en el

desarrollo de la inmunopatología asociada con la enfermedad.

OBJETIVO 3: Estudiar el papel que cumple el mecanismo de coestimulación ICOS

B7RP-l en la inmunopatogénesis de la enfermedad.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales e infección: Se usaron ratones hembras C57BL/6 (BL/6), 129/Sv y CBA/J (CBA).

Para el estudio del objetivo 2 se usaron también ratones hembras BL/6 o 129/Sv KO para

diferentes moléculas como: Fas, FasL y CMH de clase I. Los ratones fueron comprados en

The Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Se obtuvieron caracoles Biomphalaria

glabrata infectados con S. mansom’del Biomedical Research Institute (Baltimore, MD). Los

ratones fueron infectados con 80 cercarias de S. mansom' (cepa Puerto Rico) i.p.

Preparación del antígeno SEA: El extracto de antígenos solubles del huevo de S. mansoni se

compró en forma liofilizada en el Center for Tropical Diseases (University of Massachusetts

at Lowell, Lowell, MA). Se procedió a resuspenderlo, ultracentrifugarlo y a determinar la

concentración de proteína de la preparación con el uso del Kit BCA (Pierce, Rockford, lL).

El antígeno se usó a 20 pg/ml en los ensayos de producción de citoquinas in vitro y esa

concentración fue la máxima utilizada en los ensayos de proliferación de linfocitos T.

Preparación del AcMo anti-ICOS.

El AcMo de rata anti-ICOS 12A8 (lgGZb) es un anticuerpo que bloquea la interacción entre

ICOS y B7RP-l (Ozkaynak, Gao et al. 2001). La vida medía del AcMo 12A8 in vivo es de

15 horas, pasadas las 72 horas el título cae por debajo del umbral de detección. El AcMo de

rata YK9 (Millenium Pharmaceutical) es el isotipo que file utilizado como control. Los

AcMo se inyectaron por vía i.p., en dosis diarias de 100 pg en 0.5 ml de PBS. Los

tratamientos se realizaron en grupos de 10 ratones, comenzando cuatro semanas después de

la infección y continuando hasta la 7ma. semana.

Inmunizaciones y otros tratamientos in vivo (SEA-CFA -adyuvante completo de Freund-.

lL-2 hr -humana recombinante- y AcMo -anticuegpo monoclonal- anti-ICOS): Para el

estudio del objetivo l se probaron dos adyuvantes para emulsionar al SEA. Se usaron el

CFA y TiterMax. Se probaron inmunizaciones i.p. y subcutáneas (s.c.) con 50 ug/ml del

antígeno SEA emulsionado en el adyuvante o solubilizado en PBS como control. Otro grupo

de animales control recibió sólo el adyuvante. Se probaron protocolos de una y dos


inmunizaciones a lo largo de 7-8 semanas de infección. Para el estudio del objetivo 2 se

inyectó la lL-2 hr (Chiron Corporation, Emeryville, CA) i.p. en tres dosis diferentes (2.000

4.000, 20.000-40.000 o 200.000-400.000 IU/ratón) a tres grupos de ratones C57BL/6, en

días altemados comenzando en la 5ta. semana después de la infección y continuando hasta la

semana 8va. cuando se sacrificaron a los ratones tratados y controles no tratados. Para el

estudio del objetivo 3 se inyectó diariamente el AcMo anti-ICOS murino (12A8, lgGZb)

(Millennium Phannaceuticals, Inc. Cambridge, MA) en forma i.p. a una concentración de

lOOpg/ml, empezando en la 4ta. semana de infección y continuando hasta la semana 7ma.

cuando se sacrificaron a los ratones tratados y controles no tratados. Se usó como control de

isotipo el anticuerpo monoclonal YK9.

Preparación de las células: Para aislar las células de granulomas de los hígados de los

ratones infectados en los tiempos de infección indicados, se hizo la disección en forma

aséptica de 5 a 10 órganos que se juntaron por grupo y luego se homogeneizaron para

obtener una preparación de granulomas en suspensión. Después de varios lavados con PBS

los granulomas se resuspendieron en una solución de colagenasa a una concentración de

lmg/ml (Clostridium histolyticum blend collagenase "H", Sigma, St. Louis, MO) y se

realizó una incubación de l h a 37 °C con agitación suave. Las células de los granulomas

liberadas en el sobrenadante se colectaron y lavaron dos veces con medio de lavado (RPMI

1640 conteniendo 1 mM de aminoácidos no esenciales, 80 ug/ml de estreptomicina, 80

IU/ml de penicilina, lO mM de HEPES, 2 mM de glutamina, l mM de piruvato de sodio y 6

x 10'5M de B-mercaptoetanol). Luego se lisaron los glóbulos rojos con una solución de Tris

cloruro de amonio a pH 7.2 por 15 min. sobre hielo.

Se aislaron también las células de 5 a 10 ganglios linfáticos mesentéricos y bazos

combinados de cada uno de los grupos de animales infectados en los tiempos de infección

indicados. Los tejidos se disgregaron con el uso de fórceps. Se lisaron los glóbulos rojos y

las células se lavaron con el medio de lavado.

Los linfocitos T CD4+ fueron purificados de las suspensiones de células totales de 5 a 10

ganglios linfáticos mesentéricos por selección negativa mediada por complemento. Las

células se incubaron por 45 min. a 37 °C en una columna empacada con una malla de nylon.

Las células no-adherentes recuperadas por elusión de la columna se incubaron luego con los

28

Laura 1. Rutitzkv Capítulo I

anticuerpos monoclonales (AcMo) presentes en los sobrenadantes de cultivo de los

siguientes hibridomas: M5/114.15.2 (ATCC TIB 120) contra I-Ek/I-Ab/I-Ed/I-Aq en una

dilución 126.7;J l 1d.2 (ATCC TIB 183) contra HSA (del inglés heat stable antigen) en una

dilución 1:10 y 3.155 (ATCC TIB 211) contra CD8 en una dilución 1:30 por 25 min. a 4 °C.

Se realizó una segunda incubación en presencia de una solución que contenía 15 % de suero

de conejo como fuente de complemento durante 25 min. a 37 °C. Los tratamientos con los

AcMo y el complemento se repitieron una vez más y las células muertas fueron eliminadas

en un último paso por medio de un gradiente de densidad (lympholyte). La pureza de la

población de linfocitos T CD4+ se corroboró por citometría de flujo y fue usualmente de más

del 95%. Se contaron aquellas células que excluyeron al colorante Azul Trypan para llevar

las suspensiones celulares a las concentraciones necesarias.

Ensayos de proliferación celular: Se realizaron cultivos de las células totales de ganglio

linfáticos mesentérico durante 96 h a una concentración de 2.5x105 células/pozo en

presencia de SEA a 1.25, 5, y 20 ug/ml en un volumen final de 200 ul. Los pozos controles

incluyeron células cultivadas en ausencia de SEA, para conocer los niveles basales de

proliferación, y células cultivadas en presencia de IL-2 hr, para controlar la viabilidad de las

células. Durante las últimas 18 h de cultivo se agregó 3H-timidina a una concentración de

0.5 uCi/pozo y se midió su incorporación en las células en un contador de centelleo.

Para la proliferación de células de granulomas en un primer paso se procedió a incubar la

preparación celular por 45 min. a 37 °C en una columna empacada con una malla de nylon

para descartar las células adherentes. Luego de la elusión de la columna, las células no

adherentes se cultivaron a una concentración de 4 x 105 células/pozo junto con APC

irradiadas a una concentración también de 4 x 105células/pozo. El cultivo de las células no

adherentes de los granulomas se incubó de la misma manera que se mencionó para las

células totales de ganglios linfáticos mesentérico.

Para el caso de la proliferación de los linfocitos T CD4+ purificados, la incubación se realizó

con 1.5 x 105linfocitos T CD4+/pozo junto con 2.5 x 105APC/pozo previamente irradiadas.

Tratamiento in vitro con IL-2: Para realizar estos ensayos se aislaron células de granulomas

como se describió previamente. Primero las células se tiñeron con 7-AAD 20pg/ml (Sigma)

29


durante 20 minutos en hielo y luego se lavaron en PBS. Las células no apoptóticas (7-AAD

negativas) se seleccionaron en un instrumento MoFlo (Cytomation). Luego se

resuspendieron a una concentración de 2x106 células/ml y se cultivaron en medio

suplementado con la cantidad indicada de IL-2 murina recombinante (IL-2 rm, BD

PharMingen) y/o AcMo anti IL-2 murina (clon S4B6 BD, PharMingen), durante 48 h.

Después de este tiempo la apoptosis de la población de linfocitos T CD4+ se midió

utilizando el ensayo de TUNEL que se describe más adelante.

Determinación de citoguinas en sobrenadantes de cultivo: Las células de los granulomas

(células totales), de los ganglios linfáticos mesentéricos y de los bazos se cultivaron a una

concentración de 5 x lO6células/ml en presencia o ausencia de 20 ¡tg/ml de SEA en placas

de 48 pozos en un volumen final de l ml. Se cultivaron los linfocitos T CD4+ purificados de

ganglios linfáticos mesentéricos a una concentración de 1 x lO6células/ml junto con 4 x 106

células/ml de APC irradiadas. Se recolectaron los sobrenadantes de las células de

granulomas después de 36 h de cultivo y los de las células de ganglios linfáticos

mesentéricos y bazos, luego de 24 h y 48 h. En ellos se midieron las concentraciones de las

citoquinas IFN-y, IL-2, TNF-a, IL-l2 (p40), IL-4, IL-5, IL-lO e IL-l3 por ELISA. Todos los

anticuerpos específicos para las citoquinas, las citoquinas estándares y los protocolos se

obtuvieron de las compañías BD-PharMingen (San Diego, CA) y R&D (Minneapolis, MN).

Inducción de la producción de citoguinas intracelulares: Se incubaron las suspensiones

celulares de los granulomas a una concentración de 2 x lO6células/ml por 24-36 h a 37 °C

en presencia de 20 ug/ml de SEA seguido de una incubación de 5 h en presencia de 50

ng/ml de PMA (Sigma), 500 ng/ml ionomicina (Sigma) y 2 ug/ml de monensina (Sigma)

para re-estimular la producción de citoquinas e inhibir su secreción respectivamente.

Citometría de flujo: Los grupos de células de granulomas, ganglios linfáticos mesentéricos y

bazos se marcaron directamente ex vivo y después de distintos tiempos de cultivo a una

concentración de 2 x 106 células/ml con y sin SEA a 20 ug/ml. Las células se lavaron dos

veces con buffer de marcación (1X PBS/l%BSA/0.l%NaN3), se resuspendieron a una

concentración de 2 x 107 células/ml en buffer de bloqueo que contenía 0.3 mg/ml de IgG

30


total de rata y se incubaron por lO min. a 4 °C con el propósito de inhibir el pegado

inespecífico de los anticuerpos. Las alícuotas de 50 ul con 1 x 106células se incubaron por

30 min. a 4 °C con anticuerpos fluorescentes específicos para distintos marcadores

fenotípicos (CD3, CD4, CD8, Fas, FasL, CD25 y CD69). Para el análisis combinado de

apoptosis y citoquinas intracelulares se marcaron las células con PE anti-CD4 y 7-AAD y

luego de fijarlas durante l h a T amb. con una solución de paraforrnaldehído al 2% y

penneabilizarlas por 15 min. a T amb. con buffer saponina al 0.1% que contenía 300 ug/ml

de IgG total de rata, se procedió a la marcación intracitoplasmática con anticuerpos

biotinilados específicos para IFN-y, IL-2, IL-5 e IL-lO, diluidos 1/100 en el mismo buffer

saponina conteniendo la solución de bloqueo. Para visualizar la marca de citoquinas, se

realizó un siguiente paso de revelado incubando las células por 20 min. sobre hielo en la

solución permeabilizadora de saponina 0.1% que contenía estreptavidina-FITC a una

dilución 1/1000.

Detección de apoptosis por el ensayo de TUNEL (del inglés, Terminal deoxynucleotidyl

transferase (TdT)-mediated dUTP Nick End-Labeling): Para la detección de apoptosis de los

linfocitos T CD4+, primero se marcaron los grupos de las células de los ganglios y de los

granulomas con los AcMo anti-CD3 PerCP y anti-CD4 PE. Las células se fijaron luego

durante l h a T amb. con una solución de paraforrnaldehído al 4%, se perrneabilizaron con

una solución de detergente Tritón y se sometieron a la técnica de TUNEL (Gorczyca, Gong

et al. 1993). Se incubaron las células durante 1 h a 37 °C con una solución que contenía a la

enzima TdT y a los nucleótidos dUTP marcados con FITC (protocolo del kit In situ cell

death kit-Fluorescein, Roche, Indianapolis, IN). Luego de una hora de incubación las células

se lavaron con PBS 1X y se resuspendieron en una solución de paraforrnaldehído al 1% para

su análisis por citometría de flujo. El control negativo de este ensayo se realizó incubando a

las células con los nucleótidos dUTP marcados y sin la enzima TdT.

Análisis histopatológicos y morfometría de granulomas hepáticos: Se tomaron muestras de

los hígados de cada ratón perteneciente a cada grupo a los distintos tiempos de infección

indicados, se fijaron en buffer formalina al lO % y se procedió con el análisis

histopatológico de rutina. Se cortaron secciones de 5 um de espesor que se tiñeron con


hematoxilina y eosina. Los tejidos se analizaron en forma cualitativa y cuantitativa. La

cantidad de inflamación granulomatosa alrededor de los huevos del parásito en los hígados

se cuantificó con la ayuda del programa de computación Image-Pro Plus (Media

Cybemetics, Silver Spring, MD). Los granulomas se midieron sobre portaobjetos

codificados sin conocer el grupo de ratones al que pertenecían y sólo aquellos granulomas

que mostraban un huevo en posición central fueron cuantificados.

Cuantificación de enzimas hepáticas en suero: Se obtuvieron los sueros de ratones normales

e infectados durante 7 semanas por sangrado de uno de los ojos con posterior separación

por coagulación de la sangre. En las muestras de individuales de suero se cuantificaron los

niveles de las enzimas hepáticas aspartato aminotransferasa (AST) y alanina

aminotransferasa (ALT) por métodos colorimétricos.

Northern blot de los ARNm de ICOS y B7RP-1:

Las sondas utilizadas para detectar el ARN mensajero (ARNm) de ICOS y B7RP-l son las

mismas que han sido previamente descriptas por (Ozkaynak, Gao et al. 2001). El ARN total

se obtuvo por el método de guanidina-tiocianato-fenol-clorofonno (Chomczynski y Sacchi

1987), a partir de ce'lulas hepáticas de ratones control o infectados con S. mansom'. La

electroforesis se hizo en geles de agarosa-formaldehído (1,2%) sembrados con 25ug de

ARN de cada muestra, y con una cantidad necesaria de estándares de peso molecular entre

0.24 y 9.5 kb (Invitrogen). Una vez concluida la corrida electroforética, el ARN se transfirió

a una membrana Nytran-Supercharge (Schleicher & Schuel) en buffer CSS 20X (cloruro de

sodio 3M, citrato de sodio 0.3M) durante 16 horas. El ARN se ligó a la membrana

exponiéndola en un incubador de radiación ultravioleta Stratalinker (Stratagene). Las sondas

para ICOS y para B7RP-1 se marcaron con 32P-dCTPcon la preparación Prime-It lI

(Stratagene). La hibridación se llevó a cabo en un incubador con rotor a 68 °C, en botellas

con solución Express-Hyb (Clontech). Una vez terminada la hibridación, las membranas se

lavaron a T. amb. con buffer CSS 20X con SDS al 0.05%, y luego se lavaron dos veces más

a 50 °C en buffer CSS (diluido 12200)con SDS al 0.1%. La membrana se expuso a una

película autoradiográfica para detectar la señal del 32Pde las sondas. Antes de hibridar


nuevamente, la membrana se lavó a 95 °C con una solución de SDS al 5%, y luego se

expuso durante 10 minutos para confirmar la desaparición de la sonda precedente.

Análisis estadístico: Para determinar las diferencias estadísticamente significativas entre los

grupos de ratones, los datos se analizaron con los tests de ANOVA y Student’s t de dos

colas usando el programa de computación Prism versión 3.0. Diferencias entre los datos con

un p < 0.05 se consideraron significativas.

CAPÍTULO II

Efecto de la inmunización de ratones BL/6 conSEA/CFA en el desarrollo de la inmunopatología

asociada con la esquistosomiasis

INTRODUCCIÓN

Un factor importante que todavía no se ha esclarecido en el campo de la

esquistosomiasis es el papel que desempeñan las citoquinas provenientes de las

subpoblaciones de linfocitos Th CD4+ en la inmunopatología de la enfermedad. Se sabe que

los granulomas hepáticos pueden formarse tanto en un ambiente dominado por citoquinas

del tipo Thl como del tipo Th2. Estudios que abordaron este tema demostraron que clones

de linfocitos Thl eran capaces de mediar la formación de granulomas (Chikunguwo,

Kanazawa et al. 1991) y que los linfocitos Thl eran críticos en la fase aguda de la infección

donde se presenta una reacción pro-inflamatoria vigorosa caracterizada por la presencia de

IFN-y e IL-2. Por el contrario, la detección de citoquinas del tipo Th2 (IL-4 e IL-5) en

respuesta al SEA, durante el pico de la formación de granulomas después de 7-8 semanas de

infección, sugirió que estos linfocitos Th2 cumplen un papel patogénico (Pearce, Caspar et

al. 1991). Con el tiempo este concepto se reforzó aun más y se postuló que los linfocitos Thl

inhibían la patología y como consecuencia la estimulación de un fenotipo Thl podía ser

beneficiosa para mejorar y prevenir la enfermedad (Wynn, Eltoum et al. 1994; Wynn,

Cheever et al. 1995). El uso de ratones knock out (KO) para citoquinas no ha aportado

respuestas claras a esta controversia ya que actualmente existen en la literatura varios

artículos que proponen que los linfocitos Th2 son necesarios (Kaplan, Whitfield et al. 1998)

o no (Hernandez, Wang et al. 1997) para la formación de granulomas y que tanto el IFN-y

como la IL-4, influyen en forma positiva o negativa, o son esencialmente neutros en el

desarrollo de las lesiones hepáticas (Wynn, Eltoum et al. 1993; Wynn, Jankovic et al. 1995;

Akhiani, Lycke et al. 1996; Pearce, Cheever et al. 1996; Rezende, Oliveira et al. 1997).

Al analizar la producción de citoquinas por células de GLM de ratones infectados en

respuesta al SEA, se encontró una asociación entre un ambiente dominado por citoquinas

Thl y una inmunopatología aumentada. Del resultado de estos estudios se supo que en los

ratones de baja patología BL/6, la respuesta inicial en la fase aguda es del tipo Th] y que

con el tiempo es reemplazada por una del tipo Th2 (Stadecker y Hernandez 1998), mientras

que en la cepa CBA de alta patología, la respuesta Thl persiste durante el desarrollo de la

respuesta Th2 (Hernandez, Edson et al. 1998) en la fase crónica de la enfermedad.

Laura l. Rutitzkv Capítulo ll

Uno de los pocos estudios en humanos que encontró una correlación de la respuesta

inmune de pacientes con el grado de severidad de la enfermedad causada por S. mansoni en

la fase crónica, mostró que en los pacientes hepatoesplénicos la respuesta inmune era del

tipo Thl y presentaba altos niveles plasmáticos de los receptores de tipo I y II para el TNF,

mientras que los individuos que tenían la enfermedad intestinal, más moderada, pero igual

intensidad de infección (basada en la cantidad de huevos en las muestras de materia fecal)

mostraban una respuesta del tipo Th2 y bajos niveles plasmáticos del receptor soluble para

el TNF (Mwatha, Kimani et al. 1998).

Debido a esta diversidad de las respuestas de citoquinas asociadas a las diferentes

manifestaciones de la enfermedad en los humanos y en las distintas cepas de ratón,

actualmente existen puntos de vista antagónicos respecto del papel que desempeñan las dos

subpoblaciones de linfocitos Th CD4+ en la inmunopatología relacionada con la

esquistosomiasis. En esta controversia, algunos grupos de investigadores en

esquistosomiasis creemos que el mantenimiento de la respuesta pro-inflamatoria Thl es

responsable, en parte, de la mayor patología presente en las cepas de ratón que no se

polarizan completamente hacia un perfil Th2 durante la etapa crónica de la enfermedad.

Actualmente no se conocen con certeza las causas de esta respuesta inmune mixta, como

tampoco se saben los motivos de la variada patogénesis de la enfermedad entre las distintas

cepas de ratón o en los humanos, aunque se cree que éstas se deben no sólo al balance entre

las subpoblaciones de linfocitos Th] y Th2, sino también a la influencia de factores

genéticos del hospedador (Cheever, Duvall et al. 1987; Marquet, Abel et al. 1996; Secor, del

Corral et al. 1996), a la intensidad de la infección (Arap Siongok, Mahmoud et al. 1976), al

reconocimiento por parte de los linfocitos T CD4+ de un repertorio distinto de antígenos

presentes en los huevos del parásito (Hernandez, Trzyna et al. 1997) y a la sensibilización

intrauterina (Montesano, Colley et al. 1999).

Para definir mejor el papel de las citoquinas en la respuesta inmune e

inmunopatología, se inmunizaron ratones de la cepa BL/6 con SEA en CFA una vez antes y

otra vez durante la infección con S. mansoni el propósito de inducir una repuesta de

citoquinas del tipo Thl que se prolongue en el tiempo y se comparó la respuesta inmune y la

inmunopatología de estos ratones con la de los ratones BL/6 no inmunizados cuya respuesta

inicial Thl normalmente cambia a una Th2.

RESULTADOS

- Elección del adyuvante, cantidad de inyecciones y vía de inmunización.

En experimentos piloto se compararon dos adyuvantes distintos, CFA y TiterMax,

para emulsionar al SEA e inmunizar a los ratones de la cepa BL/6. El CFA fue más potente,

ya que indujo una respuesta de citoquinas Thl (por células de GLM estimuladas in vitro con

SEA) más elevada que el TiterMax. Se seleccionó la vía de inyección subcutánea (s.c.) dado

que la vía intraperitoneal (i.p.) causaba, a lo largo de las 7 semanas de infección, peritonitis

con adherencias inflamatorias que impedían la disección de los órganos al momento de

sacrificar a los animales y realizar los experimentos. Del mismo modo, se eligió aplicar dos

inyecciones, una antes y otra durante el transcurso de la infección.

- La inmunización con SEA/CFA exacerba severamente la inmunopatología inducida

por los huevos y aumenta la mortalidad de los ratones.

Los ratones de la cepa BL/6 se separaron en diferentes grupos para ser inmunizados

con SEA/CFA, SEA/PES (grupo SEA) o CFA/PBS (grupo CFA) con el propósito de

estudiar el efecto de estas inmunizaciones en la respuesta inmune y en la inmunopatología

durante la infección con S. mansoni. Llamativamente, en cada uno de los experimentos,

algunos de los ratones que pertenecían al grupo SEA/CFA murieron durante el transcurso de

la 7ma. semana de infección (Tabla I).

TABLA I: Mortalidad de los ratones a las 7 semanas de infección

Grupo de ratones Mortalidad"inmunizado SEA/CFA 12/33”

Buó inmunizado SEA 0/18inmunizado CFA 2/38control 0/24

CBA control 0/20

" número de ratones muertos/número de ratones infectados en cuatro experimentosb Significativamente diferente del grupo BL/6 control (p < 0.01)

Los hígados de los ratones que murieron antes de completar la 7ma. semana de

infección presentaron una marcada inflamación granulomatosa e infiltraciones en el

parénquima hepático, causando necrosis. Mostraron también una dilatación intestinal severa

36

Laura I. Rutitzkv Capítulo II

con hemorragia de la mucosa. Los pulmones de estos mismos ratones exhibieron

infiltraciones densas de células inflamatorias y una gran cantidad de huevos, posiblemente

debido a los “shunts” entre la circulación sistémica y la circulación portal.

Los higados de los ratones del grupo SEA/CFA que completaron las 7 semanas de

infección, también mostraron un sorprendente aumento del tamaño de los granulomas en

comparación con los higados de los ratones de los grupos controles inmunizados y no

inmunizados. Como se muestra en las Figuras 1 y 2, los granulomas de los ratones del grupo

SEA/CFA fueron aproximadamente el doble en tamaño que los granulomas de los ratones

BL/6 controles, y excedieron aun más el tamaño de los granulomas de los ratones de la cepa

CBA que naturalmente desarrollan alta patología. Por el contrario, los granulomas de los

ratones de los grupos controles SEA y CFA no se diferenciaron significativamente en su

tamaño con respecto a los de los ratones del grupo control, no inmunizado. Los granulomas

de los higados de los ratones del grupo SEA/CFA estaban compuestos por una población

mixta de células inflamatorias: eosinófilos, neutrófilos, macrófagos (algunos de ellos con

pigmentos derivados del parásito), y linfocitos, con una expandida matriz extracelular poco

colagenizada que rodeaba a los infiltrados celulares, pero que no parecía cualitativamente

distinta de la de los ratones de los grupos controles. Cabe destacar la presencia de

numerosos focos pequeños de células inflamatorias dispersos por todo el parénquima

hepático. Estos infiltrados intersticiales fueron mucho menos evidentes o fueron inexistentes

en todos los grupos controles.

FIGURA l: Histología hepática a las 7 semanas de infección.

A, se muestra una sección de hígado de un ratón BL/6 del grupo

inmunizado con SEA/CFA donde se observan granulomas

grandes e inflamación intersticial marcada en el parénquima

hepático (indicada con las flechas). En el inserto se muestran con

un aumento mayor los agregados de células inflamatorias. B, se

muestra una sección de hígado de un ratón BL/6 del grupo no

inmunizado control donde se observan granulomas más pequeños

con poca inflamación intersticial en el parénquima. El aumento

utilizado para tomar las fotografias de los paneles A y B fire de

40X; para el inserto fue de ZOOX.

37

Laura L Rutitzkv Capitulo lI

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FIGURA 2: Tamaño de los granulomas hepáticas a las 7 semanas de infección. Las barras representan

medias de las áreas de los granulomas i ES de un experimento representativo de tres. Los granulomas de los

ratones del grupo BL/6 SEA/CFA fueron significativamente más grandes que los granulomas de los ratones de

los grupos BL/6 controles inmunizados y no inmunizado (p < 0.01).

- La inmunización con SEA/CFA induce una respuesta alta de citoquinas Thl y una

respuesta baja de citoquinas Th2 en las células de granulomas hepáticos, ganglios

linfáticos mesentéricos y bazos.

La formación de los granulomas alrededor de los huevos es un proceso mediado por

linfocitos T CD4+, pero el tipo de citoquinas producidas por estas células en respuesta a una

estimulación antige’nicapuede variar considerablemente durante el transcurso de la infección

y en relación a la cepa de ratón utilizada. Luego de 7 semanas de infección, en los ratones de

la cepa BL/6 no tratados, el ambiente de citoquinas es típicamente del tipo Th2

(StadeckeryHernandeZ 1998).

Para estudiar cuál es el patrón de citoquinas que se correlaciona con el significativo

aumento de la inmunopatología de los ratones BL/6 inmunizados con SEA/CFA, se

estudiaron las citoquinas Thl IFN-y, IL-2, TNF-oc y IL-12 y las citoquinas Th2 IL-4, IL-S,

IL-lO e IL-l3 producidas por linfocitos provenientes de granulomas, de ganglios linfáticos

mesentéricos y de bazos.

Las citoquinas producidas por las células extraídas de los granulomas de los ratones

BL/6 inmunizados con SEA/CFA y estimuladas con SEA mostraron una llamativa


polarización hacia el fenotipo Thl. Así, los niveles de IFN-y, IL-2, TNF-oc e IL-12 fueron

marcadamente elevados en comparación con los niveles observados en todos los otros

grupos de ratones BL/6, con el IFN-y alcanzando los niveles altos usualmente presentes en

la cepa CBA, en la cual una respuesta Thl normalmente persiste junto con una respuesta

Th2 (Hernandez, Edson et al. 1998) (Figura 3). En cambio, los niveles de las citoquinas del

tipo Th2, IL-4, IL-5 e IL-10 producidas por las células de los granulomas de los ratones

BL/6 SEA/CFA, fueron significativamente menores que en los grupos BL/6 controles o

CBA control.

.BLI6 SEA/CFA films SEA BLIGCFA Claus control EEEICBAcontrol

IFN- y TNF- a IL- 12

IL- 4 lL- 5 IL- 10

Concentracióndecitoquina(ng/ml)

Grupo

FIGURA 3: Producción de citoquinas por las células de los granulomas estimuladas con SEA a las 7

semanas de infección. Las barras representan medias de determinaciones en triplicados de los niveles de cada

una de las citoquinas i DS. Los niveles de las citoquinas IFN-y, IL-2, TNF-(x e IL-12 en los ratones del grupo

BL/6 SEA/CFA fueron significativamente más altos que los de los ratones BL/6 controles (p < 0.01). Los

niveles de las citoquinas IL-4, IL-5 e IL-lO fueron significativamente más bajos en los ratones BL/6 SEA/CFA

que en los ratones BL/6 controles (p < 0.01). ND = no determinado. Se restaron los niveles de cada una de las

citoquinas provenientes de los cultivos sin estimulación antigénica.

39


El análisis de las citoquinas producidas por las células provenientes de GLM

estimuladas con SEA, también mostró una presencia importante de citoquinas Thl en el

grupo BL/6 SEA/CFA que fue similar a la observada en el grupo de ratones CBA control.

Por el contrario, las mismas células produjeron menos IL-4, IL-5, IL-lO e IL-l3 (Figura 4).

La producción de citoquinas por las células de los ratones BL/6 inmunizados sólo con SEA

o CFA no difirió significativamente de la producción por las células del grupo BL/6 control

no inmunizado.

BLI6SEA7% BLIGCFAEI BL/6control fica control

|L-10

Concentracióndecitoquína(ng/ml)

FIGURA 4: Producción de citoquinas por las células de los ganglios linfáticos mesentéricos estimuladas

con SEA a las 7 semanas de infección. Las barras representan medias de determinaciones en triplicados de

los niveles de cada una de las citoquinas i DS. Los niveles de las citoquinas IFN-y e IL-2 en los ratones del

grupo BL/6 SEA/CFA fueron significativamente más altos que los de los ratones BL/6 controles (p < 0.01).

Los niveles de las citoquinas IL-4, IL-5, IL-lO e IL-13 fueron significativamente más bajos en los ratones BL/6

SEA/CFA que en los ratones BL/6 controles (p < 0.05). Se restaron los niveles de cada una de las citoquinas

provenientes de los cultivos sin estimulación antigéníca.

40


También hubo un marcado aumento en la producción de IFN-y por linfocitos T CD4+

purificados de los GLM de los ratones del grupo BL/6 SEA/CFA, mientras que la IL-5

disminuyó significativamente con respecto a los grupos controles (Figura 5). Estos

resultados demuestran que el patrón de citoquinas alterado en el grupo BL/6 inmunizado con

SEA/CFA está originado en los linfocitos T CD4+específicos para el SEA.

.BLI6 SEA/CFA BLIG CFA I:]BLIG control

IFN- y IL- 5

(ng/ml)

Concentracióndecitoquina

FIGURA 5: Producción de citoquinas por los linfocitos T CD4)r purificados de los ganglios linfáticos

mesentéricos y estimulados con SEA a las 7 semanas de infección. Las barras representan medias de

determinaciones en triplicados de los niveles de las citoquinas d: DS. El nivel de la citoquina IFN-y fue

significativamente más alto y el nivel de la citoquina IL-5 fue significativamente más bajo en los ratones del

grupo BL/6 SEA/CFA que en los ratones BL/6 controles (p < 0.01). Se restaron los niveles de cada una de las

citoquinas provenientes de los cultivos sin estimulación antigénica.

41


Por último, se encontró el mismo cambio llamativo en el perfil de citoquinas del

grupo BL/6 inmunizado con SEA/CFA en las células del bazo, donde hubo un marcado

incremento en los niveles del IFN-y y de la IL-2 junto con una marcada disminución de los

niveles de la IL-5 y la IL-10 comparado con los ratones BL/6 controles (Figura 6). En los

ratones del grupo CBA control, tanto las citoquinas Thl como las Th2 resultaron elevadas,

como es característico de esa cepa a las 7 semanas de infección.

- BLI6SEA/CFA%Bus CFAI:] BLI6control fi CBAcontrol

IFN- r IL- 2

'L' 5 lL-10

Concentracióndecitoquina(ng/ml)

FIGURA 6: Producción de citoquinas por las células de los bazos estimuladas con SEA a las 7 semanas

de infección. Las barras representan medias de determinaciones en triplicados de los niveles de cada una de

las citoquinas i DS. Los niveles de las citoquinas IFN-y e IL-2 en los ratones del grupo BL/6 SEA/CFA fueron

significativamente más altos y los niveles de las citoquinas lL-5 e IL-lO fueron significativamente más bajos

que los de los ratones BL/6 controles (p < 0.01). Se restaron los niveles de cada una de las citoquinas

provenientes de los cultivos sin estimulación antigénica.

42


- En los ratones BL/6 inmunizados con SEA/CFA, los niveles de proliferación celular

en respuesta al SEA no difieren significativamente de los niveles de los grupos BL/6

controles.

Se estudió también si las células provenientes de los ratones del grupo inmunizado

con SEA/CFA proliferaban diferencialmente al ser estimulados con SEA, respecto de las

células de los ratones controles. Para esto se aislaron las células de los GLM de los ratones

y se cultivaron durante 96 h en presencia de distintas concentraciones de SEA.

En las últimas 12 h de cultivo se agregó timidita tritiada (3H) y se midió su

incorporación al ADN de las células por medio de un contador para radiación B. La Figura7

muestra que no hubo diferencias significativas entre los niveles de proliferación del grupo

BL/6 SEA/CFA con respecto a ninguno de los otros grupos de BL/6 controles, mientras que

las células de los ratones del grupo CBA control proliferaron significativamente más.

120000

H 100000' + BLI6SEA/CFA:cn... BusSEA

A 80000 É a e BLIS CFA¡o “te.5 g 60000 _ BU6 controlg n.g 9' 40000.. controlE

20000

0 u . . . .

0.005 0.0195 0.078 0.312 1.25 5 zo

SEA(ug/ml)

FIGURA 7: Respuesta proliferativa de las células de los ganglios linfáticos mesentéricos de ratones BL/6

SEA/CFA, BL/6 CFA, BL/6 SEA, BL/6 control y CBA control a las 7 semanas de infección. Los puntos de

las curvas representan la media en CPM zi:ES de determinaciones en triplicados para cada concentración del

SEA. Se restaron los niveles de proliferación de las células en los pozos que no contenían SEA. Las células de

los ratones del grupo CBA control proliferaron significativamente más que las células de los ratones de todos

los grupos BL/6 (p < 0.05).

43

Laura l. Rutitzky Capítulo ll

- En los ratones BL/6 inmunizados con SEA/CFA, la proporción de linfocitos T CD4+

entre las células de los granulomas permaneció constante, mientras que la proporción

de linfocitos T CD8+disminuyó con respecto a los grupos de ratones BL/6 controles.

Como las citoquinas que se producen en respuesta a la estimulación antige'nica, en

este caso al SEA, provienen básicamente de los linfocitos T, se examinó más detalladamente

las principales poblaciones linfocitarias para determinar posibles cambios cualitativos o

cuantitativos que puedan correlacionarse con las pronunciadas diferencias en la patología y

en la secreción de citoquinas, después de 36 h de cultivo con SEA. Estas poblaciones que

expresan el marcador CD3 comprenden a los linfocitos T CD4+, asociados directamente con

la inducción de inmunopatología y a los linfocitos T CD8+, que fileron propuestos

frecuentemente como células reguladoras en esquistosomiasis. El análisis de las poblaciones

de linfocitos en los granulomas reveló que no hay diferencias significativas en la proporción

de linfocitos T CD4+ entre los grupos de ratones BL/6 inmunizados con SEA/CFA y los

grupos BL/6 controles (Tabla II). Los ratones del grupo CBA control, sin embargo,

mostraron una proporción significativamente mayor de linfocitos T CD4+. Por el contrario,

la proporción de linfocitos T CD8+ en los granulomas de los ratones BL/6 inmunizados con

SEA/CFA fue significativamente menor que en los grupos BL/6 control. La proporción de

estos linfocitos fue también significativamente menor en los ratones de la cepa CBA. Con

respecto a los GLM, no hubo una diferencia significativa en la proporción de los linfocitos T

CD4+ entre el grupo experimental y los controles, mientras que esta población sí estaba

elevada en los GLM de los ratones CBA (Tabla II). Los linfocitos T CD8+ estuvieron

disminuidos también en los GLM de los ratones del grupo CBA control, pero esta

disminución no fue estadísticamente significativa. Por último, no se encontraron diferencias

entre los linfocitos T CD4+ y CD8+ en los bazos de todos los grupos de ratones (Tabla II). El

agregado de SEA a los cultivos celulares fue irrelevante ya que las proporciones de los

linfocitos T CD4+ y de los linfocitos T CD8+ en las poblaciones de células no estimuladas no

fueron significativamente diferentes de la que se muestran en la Tabla II (datos no

mostrados).

44

TABLA ll: Proporción de linfocitos T en los granulomas, ganglios linfáticos

mesentéricos y bazos de los ratones infectados durante 7 semanas.

Gmnulomm Gnnglios linfáticos mesentén‘eos BamsO O 4 Ó 6 4 O O Q Q O O

Grupo de món CD3 CD4 CD3 CDs CD3 CD4 CD3 CDs CD3 CD4 CD3 CDs

SEA/CFA 25.64 2 3.30 7.87 2 o.2¡ “’ 34.48 2 7.40 4|. ¡3 i 9.75 ¡4.04 2 3.86 ¡4.20 2 ¡.56

BUG SEA 21.26 :l: ¡.43 ND 3313 2 ¡.97 ND ND NDCFA 27.6] t 6.72 ¡6.28 a 0.74 40.33 a 3.73 ND 8.76 2 2.62 ¡0.95 2 0.73

control 24.22 t 3.40 ¡9.3¡ t 2.6| 39.36 :t 294 38.¡9 t 7. ¡9 ¡3.79 i 2.43 ¡7.02 e l.68

CBA control 42.53 2 5.62 "’ 5.30 t 2. ¡4 ‘" 53.82 2 ¡.00 ‘" 28. ¡4 e 7. ¡2 18.63 a: 3.99 ¡8.53 2 ¡.40

Se cultivaron con SEA las células totales de ganulonns, GLM y bazos durante 36 h y luego se tiñeron con los AcMo anti-CD3 y anti-CD4 o

anti-C03 y anti-CDS. Los porcentajes mostrados pertenecen a hs cálulas presentes en la región de linfoc'nosdefinida en base al tamañoy

la complejidad de las células.

' Significammente diferente del grupo BUó control (p < 0.05)ND = no detennimdo.

DISCUSIÓN

La inmunización con SEA/CFA de ratones BL/6 infectados con esquistosomiasis que

naturalmente desarrollan baja patología, indujo un marcado cambio del perfil de citoquinas

Th2 a un perfil Thl que correlacionó con una exacerbación significativa de la

inmunopatología en estos ratones. Una proporción importante de ratones BL/6 inmunizados

con SEA/CFA murió antes de completar la 7ma. semana de infección. Todos los ratones del

grupo BL/6 SEA/CFA tuvieron más patología hepática, caracterizada por el gran tamaño de

los granulomas alrededor de los huevos del parásito. Hubo también una notoria infiltración

de células inflamatorias mono y polinucleares independiente de los granulomas en el

parénquima. Este marcado incremento en patología no se observó en ninguno de los grupos

controles de ratones BL/6 y fue todavía mayor que en los ratones CBA que normalmente

desarrollan alta patología.

El aumento de la inmunopatología observado en los ratones BL/6 inmunizados con

SEA/CFA se correlacionó claramente con un cambio generalizado hacia un perfil de

citoquinas Thl. Las células de los granulomas, de los GLM y de los bazos estimuladas con

SEA produjeron citoquinas Thl, que contrastaron marcadamente con el perfil Th2 de los

45


grupos BL/6 controles no inmunizados o inmunizados sólo con SEA o CFA. Este mismo

patrón cambiado de citoquínas se encontró en cultivos de linfocitos T CD4+ purificados de

los GLM, sugiriendo que fueron estos linfocitos los responsables del perfil modificado de

secreción, dado que estas células son susceptibles a la presencia del antígeno.

No se encontró una diferencia significativa en la proporción de linfocitos T CD4+

presente en los granulomas, GLM o bazos de los ratones BL/6 inmunizados con SEA/CFA

con respecto a los ratones BL/6 de los grupos controles por lo que se infirió que la gran

diferencia en la magnitud de la inmunopatología se asocia con un cambio en la secreción de

citoquínas de una población numéricamente estable de linfocitos T CD4+ específicos para el

SEA. Esta idea se reforzó al no encontrar diferencias en los niveles de proliferación de las

células totales de GLM en respuesta al SEA entre los grupos BL/6 experimental y controles.

Sin embargo, hubo una reducción significativa en la proporción de linfocitos T CD8+ en los

granulomas de los ratones BL/6 inmunizados con SEA/CFA, que no pudo ser atribuida a un

desproporcionado aumento en la proporción de linfocitos T CD4+. Queda todavía sin

explicar si esta reducción en los linfocitos T CD8+ afecta la secreción de citoquínas de los

linfocitos T CD4+ o la formación de los granulomas en este modelo de inmunización, pero la

observación de esta disminución es consistente con la función reguladora que se le adjudicó

a los linfocitos T CD8+ en el proceso de inmunomodulación (Boros 1986; Phillips, Lin et al.

1991; Chensue, Warmington et al. 1993; Pedras-Vasconcelos y Pearce 1996).

El marcado aumento en la inmunopatología como consecuencia de la inmunización

con SEA/CFA en los ratones BL/6 revela algunas diferencias interesantes con la cepa CBA

que naturalmente desarrolla alta patología. En los ratones BL/6 inmunizados con SEA/CFA

las citoquínas Thl reemplazan al característico fenotipo Th2 de esta cepa a las 7 semanas de

infección, mientras que en la cepa CBA (y otra cepa H-Zk)los ratones muestran y mantienen

una aumentada y mezclada producción de citoquínas de los dos tipos, Thl y Th2

(Hernandez, Edson et al. 1998). Además, la exacerbada patología en los ratones BL/6

inmunizados con SEA/CFA no está asociada con un cambio en la proporción de linfocitos T

CD4+, mientras que en la cepa CBA, estas células son proporcionalmente el doble entre la

población de linfocitos T de los granulomas.

Los ratones CBA y los BL/6 SEA/CFA son así dos ejemplos de inmunopatología

severa en la esquistosomiasis experimental. La inmunopatología en los ratones CBA parece

46


estar basada en la presencia de un número elevado de linfocitos T CD4+ activados que está

determinado genéticamente, mientras que en los ratones BL/6 SEA/CFA la exacerbada

inmunopatología es producto de la inmunización con el antígeno específico en combinación

con un adyuvante potente, pero por ninguno de estos dos factores por sí solos, que conduce a

una inversión hacia un perfil de citoquinas Thl producidas por los linfocitos T CD4+.

Los linfocitos T son capaces de cambiar la polarización de citoquinas, sin embargo

todavía no se conocen con exactitud los factores que determinan un dado patrón de

expresión y secreción y es muy probable que se deba a varios mecanismos distintos

(Constant y Bottome 1997; Kelso 1999; Murphy, Ouyang et al. 2000). Es posible también

que las poblaciones de linfocitos T CD4+polarizadas induzcan a e interactúen con CPA que

presentan distintas formas de activación y distintas propiedades (Goerdt y Orfanos 1999;

Stadecker 1999). Más allá de estos aspectos, ambos modelos de alta patología tienen en

común la presencia del llamativo y más o menos dominante componente de citoquinas Thl.

En resumen, estos resultados indican que un ambiente dominante en citoquinas Thl

es compatible con, sino directamente asociado al desarrollo de la enfermedad severa y la

muerte. Aunque esta idea no sea consistente con la noción previa de que los linfocitos Thl

inhiben la patología en la esquistosomiasis (Wynn, Eltoum et al. 1994), los resultados

presentados aquí no niegan que sea posible el desarrollo de los granulomas en un ambiente

dominado por citoquinas Th2. De hecho, los fenotipos Thl o Th2 parecen estar asociados

con la inducción de formas particulares de inmunopatología. En un ambiente Thl, los

granulomas que se forman alrededor de los huevos de los esquistosomas están menos

circunscriptos, están generalmente acompañados por grandes modificaciones en el

parénquima hepático que los rodea; los hígados presentan infiltraciones inflamatorias en los

lóbulos con daño hepatocelular y necrosis; condiciones que pueden resultar en la muerte

prematura del animal infectado (Brunet, Finkelman et al. 1997; Hernandez, Sharpe et al.

1999). Por el contrario, un ambiente Th2 induce a la formación de granulomas mejor

conformados, más fibróticos (Chiaramonte, Donaldson et al. 1999; Fallon, Richardson et al.

2000) con poco daño hepatocelular a su alrededor lo que lleva a una supervivencia más larga

del animal infectado. Este concepto está de acuerdo con estudios recientes realizados en

individuos infectados con esquistosomiasis, en los que pacientes con la forma

hepatoesplénica, más severa de la enfermedad, mostraron un ambiente polarizado hacia un

47

Laura I. Rutitzkv Capítulo ll

perfil de citoquinas Thl (Mwatha, Kimani et al. 1998), mientras que en los pacientes con la

enfermedad menos severa, la forma intestinal, se observó un ambiente dominante en

citoquinas Th2, anti-inflamatorias (Araujo, de Jesus et al. 1996; Malaquias, Falcao et al.

1997). Entre las citoquinas Th2, la IL-lO cumple un papel regulador de la función in vitro de

linfocitos T CD4+ específicos para el SEA provocando una inhibición de la secreción de

citoquinas pro-inflamatorias y regulando negativamente la expresión de las moléculas B7 en

las CPA. Del mismo modo, la IL-lO suprime in vivo la patología en el modelo murino de la

enfermedad ya que el tratamiento con la proteína de fusión IL-lO-Ig inhibe la formación de

los granulomas en los ratones infectados (Flores Villanueva, Reiser et al. 1994; Flores

Víllanueva, Zheng et al. 1996; Bosshardt, Freeman et al. 1997; Falcao, Malaquias et al.

1998). La IL-lO también fue asociada con el desarrollo de la enfermedad menos grave,

intestinal, en la esquistosomiasis humana (Malaquias, Falcao et al. 1997; Correa-Oliveira,

Malaquias et al. 1998; Montenegro, Miranda et al. 1999).

En conclusión, estos resultados obtenidos de los experimentos realizados con ratones

infectados de la cepa BL/6 de baja patología, describen una forma específica de

inmunización que lleva a una significativa exacerbación de las manifestaciones

inmunopatológicas de la enfermedad y a la muerte de los ratones, en un contexto

caracterizado por una inversión en la secreción de citoquinas hacia un perfil Thl. Estos

resultados implican que las estrategias para promover un fenotipo Th2 podrían resultar en

una mejoría general de la inmunopatología asociada con la forma severa de la

esquistosomiasis y aclaran la controversia a la que se hizo mención en la introducción de

este capítulo respecto del papel que cumplen las subpoblaciones Thl y Th2 de linfocitos T

CD4+en la inmunopatología de la esquistosomiasis murina.

CAPÍTULO III

Papel de la apoptosis de los linfocitos T CD4+ de losgranulomas hepáticos en las cepas de ratones que

desarrollan alta y baja patología en esquistosomiasis

INTRODUCCIÓN

Las cepas de ratones BL/6 y CBA representan dos ejemplos polares de

inmunopatología en la esquistosomiasis experimental. Hasta el momento no se conocen

muchas de las razones por las cuales estas cepas de ratones desarrollan distintos tipos de

inmunopatología cuando son sometidas a la misma carga parasitaria. Así como diferentes

patrones de citoquinas (Stadecker y Hernandez 1998) o diferentes respuestas a antígenos del

huevo (Hernandez, Edson et al. 1998) cumplen un papel decisivo en dirigir la respuesta

inflamatoria granulomatosa, los posibles mecanismos efectores que se utilizan para llevar a

cabo esto todavía no han sido esclarecidos. Uno de estos posibles mecanismos es la

apoptosis de los linfocitos T CD4+ que median la inmunopatología asociada con la

enfermedad.

La apoptosis o muerte celular programada, generalmente dependiente de los niveles

locales de la citoquina IL-2, puede ocurrir tanto en forma activa, a través de señales

iniciadas por un receptor de membrana (muerte inducida por activación, o muerte por

instrucción) o en forma pasiva, a través de la pérdida de señales de transducción debido a la

falta de factores de crecimiento que promueven la supervivencia de las células (Van Parijs,

Biuckians et al. 1998; Van Parijs, Peterson et al. 1998; Lenardo, Chan et al. 1999; Rathmell

y Thompson 2002). Como ejemplos, en el proceso de selección tímica o luego de la

expansión clonal inducida por el antígeno, la apoptosis cumple un papel importante en

remover los linfocitos T. En el primer caso se produce apoptosis por mecanismos pasivos y

en el segundo caso, por mecanismos activos.

Ha sido demostrado que muchos patógenos son capaces de desarrollar mecanismos

que promueven la muerte de ce'lulas linfoides (Lopes, da Veiga et al. 1995; Kalinkovich,

Weisman et al. 1998; Martins, Cardoso et al. 1998; Desbarats, Stone et al. 2000; Sanchez

Torres, Rodriguez-Ropon et al. 2001; Wipasa, Xu et al. 2001; Jenson, O'Connor et al. 2002).

En esquistosomiasis, también se postuló la presencia de apoptosis en linfocitos (Rumbley,

Zekavat et al. 1998; Lundy, Lerman et al. 2001). Esta idea fue más tarde reforzada por la

observación de que los linfocitos T de pacientes con esquistosomiasis intestinal son más

susceptibles a apoptosis que los linfocitos T de pacientes con la forma hepatoesplénica grave

(Carneiro-Santos, Martins-Filho et al. 2000). Como mecanismos, se propusieron a las

49

Laura I. Rutitzkv Capítulo III

citoquinas IL-4 e IL-lO (Estaquier, Marguerite et al. 1997; Lundy y Boros 2002) y al sistema

Fas/FasL (Lundy, Lerman et al. 2001; Rumbley, Sugaya et al. 2001) como inductores de la

apoptosis de los linfocitos T.

Debido a la disparidad en las manifestaciones de la enfermedad entre las distintas

cepas de ratón, podría pensarse que la apoptosis de linfocitos T CD4+, si fuera relevante para

el desarrollo de la inmunopatología, variaría de acuerdo al background genético del

hospedador. Por esto la comparación de la apoptosis de linfocitos provenientes de

granulomas de ratones que desarrollan alta y baja patología y el conocimiento del

mecanismo apoptótico por el cual esos linfocitos mueren, podrían aportar interesantes

resultados.

RESULTADOS

- Los ratones infectados de las cepas BL/6 y CBA presentan diferencias en la

inmunopatología y en algunos parámetros inmunológicos de los linfocitos T.

Como se mencionó en la introducción general, el tamaño de los granulomas se usa

comúnmente como un indicador de la severidad de la enfermedad en los ratones infectados

con esquistosomas (Cheever, Duval] et al. 1987). A partir de los datos de varios

experimentos, se confirmó que 8 semanas después de la infección, en el momento del pico

de la respuesta inmune, los granulomas hepáticos de los ratones de la cepa BL/6 son

significativamente menores que los granulomas hepáticos de los ratones de la cepa CBA

(Figura 1A). El análisis por citometría de flujo de las células que componen los granulomas

mostró que existe una menor proporción de linfocitos T CD4+ en los ratones BL/6 que en los

ratones CBA (Figura 1B). También se observó que la proliferación celular en respuesta al

SEA, luego de realizar la necesaria depleción de las células inhibitorias adherentes de los

granulomas (Flores Villanueva, Harris et al. 1994), estaba marcadamente disminuida en las

células provenientes de cepa BL/6 (Figura 1C). En cambio, en las células de los GLM de las

dos cepas de ratones, se observó una proporción similar de linfocitos T CD4+ (Figura 1D),

pero la cepa BL/6 también mostró niveles significativamente más bajos de proliferación

celular comparados con los de la cepa CBA (Figura IE).

50

WO...

Laura I. Rutítzky Capítulo Ill

Para explicar la diferencia en el tamaño de los granulomas, el menor porcentaje de

linfocitos T CD4+ en los granulomas y la desproporcionada disminución en la respuesta

proliferativa de las células de los ratones infectados BL/6, se investigó la apoptosis de los

linfocitos T CD4+ como un posible mecanismo que opere diferencialmente en cada una de

estas dos cepas estudiadas.

>

Tambodogranulams

(wn‘x10‘)

o sus cu

CG BL/6 CG CBA

:oooo+ CGBUG

E -o—CG CBA«l a zooooi 1'3 i

És. moon

0.1115 0.31: 1.25 5 zo

SF-Mvalrrl)

1zoooo+CGLM BUG

E —°—CGLM CBA

8 a ¡nooo5 fi“ sia.e, ¿moB

E

o

un ¡uu 1.25 s 20

SEMIIB'WÜ

FIGURA l: Tamaño de los granulomas hepáticos y parámetros inmunológicos de los linfocitos T en los ratones BL/6y CBA a las 8 semanas de infección. A, Tamaño de los granulomas hepáticos. Las barras representan las medias de lasáreas i ES de 75 a 100 granulomas/grupo, cada grupo estuvo conformado por 5-10 ratones. Los granulomas de los ratonesBL/ó fueron significativamente más chicos que los de los ratones CBA (p < 0.001). B, Proporción de linfocitos CD3+CD4+en los granulomas ex vivo. Los resultados mostrados son porcentajes de linfocitos CD3+CD4+ en la región de linfocitos,definida en base al tamaño y a la complejidad de las células. Los ratones BL/6 tienen menor proporción de linfocitos TCD4+ que los ratones CBA. C, Proliferación de las células no-adherentes de los granulomas. Los resultados mostrados estánexpresados como la media de CPM de determinaciones en triplicados d:ES. La respuesta proliferativa de las células de losratones BL/6 fue significativamente más baja que la de los ratones CBA (p < 0.01). D, Proporción de linfocitos CD3‘“CD4+en los GLM vivo. Los resultados mostrados son porcentajes de linfocitos CD3+CD4+ en la región de linfocitos, definida enbase al tamaño y la complejidad de las células. E, Proliferación de las células totales de los GLM. Los resultados estánexpresados como la media de CPM de determinaciones en triplicados i ES. La respuesta proliferativa de las células de losratones BL/6 fue significativamente más baja que la de los ratones CBA (p < 0.001). CG = células de granulomas. CGLM =células de ganglios linfáticos mesentéricos.

51

Laura I. Rutitzkv Capítulo Ill

- La apoptosis de los linfocitos T CD4+es significativamente más alta en los ratones

infectados BL/6, de baja patología.

A través del análisis de los niveles de apoptosis por medio de la técnica de TUNEL

(del inglés Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP Nick End

Labeling), se encontró que los linfocitos T CD4+ de granulomas de la cepa BL/6 presentan

significativamente más apoptosis que las mismas células de los ratones CBA. Esta diferencia

en apoptosis fue consistente durante la 7ma. y 9na. semana de infección, las cuales están

caracterizadas por presentar el pico en el proceso de formación de los granulomas y,

permaneció hasta la semana 11era., durante la fase temprana de inmunomodulación (Figura

2A). El porcentaje de linfocitos T CD4+ apoptóticos en las células provenientes de los

granulomas incrementó aun más después de un cultivo de 36 h (Figura 2C). La detección de

la apoptosis tanto ex vivo (Figura 2B) como después del cultivo de 36 h en presencia (Figura

2D) o ausencia de SEA en células aisladas de los GLM de ratones infectados, también

mostró un mayor porcentaje de linfocitos T CD4+ apoptóticos en la cepa BL/6, aunque la

diferencia no fue tan pronunciada como en las células de los granulomas. Cabe destacar que

la estimulación antigénica in vitro no tuvo influencia en los resultados ya que los niveles de

apoptosis de linfocitos T CD4+ de los granulomas o de los GLM fueron esencialmente los

mismos en presencia o ausencia de SEA en todas las semanas de infección estudiados (datos

no mostrados).

- BUG E CBA FIGURA2: Porcentajede linfocitosT CD4+apoptóticos en granulomas y en GLM deratones BL/6 y CBA infectados. Los linfocitosCD3+CD4+ provenientes de los granulomas (A)o de los GLM (B) de los ratones BL/6 muestranex vivo niveles de apoptosis significativamente

Ex vivo más altos que las mismas células de los ratonesCBA en todos los tiempos de infecciónestudiados (p < 0.05). Los linfocitos CD3+CD4+provenientes de los granulomas (C) o de losGLM (D) de los ratones BL/6 muestran, despuésde 36 h de cultivo en presencia de SEA, nivelesde apoptosis significativamente más altos quelas mismas células de los ratones CBA en todoslos tiempos estudiados (todos los p < 0.05). Las

so 50 35h de cum“, barras representan medias de porcentajes delinfocitos T CD3+CD4+ apoptóticos i ES de

Células de granulomas Células de GLM

%decélulasapoptóticasCDs+CD4+

40 40

lo 3° entre 2 y ll experimentos realizados en formaindependiente para cada tiempo de infección y

2° 2° cada condición.

10 10

0 O

7 s 9 11 7 a

Semanas después de la infección

- La apoptosis de los linfocitos T CD4+de la cepa BL/6 no está mediada por Fas y FasL.

Como paso siguiente se estudió el mecanismo que induce la apoptosis de los

linfocitos T CD4+ de los granulomas de los ratones BL/6.

La apoptosis inducida por activación de las células es un mecanismo que puede

involucrar distintos receptores de membrana. En el caso de los linfocitos T CD4+ periféricos,

este mecanismo está generalmente inducido por el receptor Fas (CD95, APO/l), que es un

miembro de la familia de receptores de TNF (Lenardo, Chan et al. 1999). El hecho de no

haber encontrado diferencias en los niveles de apoptosis entre las células que habían sido

cultivadas con o sin SEA, junto con la baja expresión de los marcadores de activación CD25

(Nelson y Willerford 1998; Papiemik, de Moraes et al. 1998) y CD69 (Ziegler, Ramsdell et

al. 1994) por parte de los linfocitos T CD4+ de los granulomas y de los GLM de la cepa

BL/6 (Tabla I) comparado con la cepa CBA, sugirió que la apoptosis observada en esta cepa

no era debido a la activación de estas células. Sin embargo, se estudió formalmente el

mecanismo Fas/FasL especialmente porque ya había sido implicado en la apoptosis de

linfocitos T CD4+ de bazos de ratones infectados con esquistosomiasis (Lundy, Lerman et

al. 2001; Lundy y Boros 2002). El análisis de las células de los granulomas por citometría de

flujo después de 36 h de cultivo en presencia de SEA mostró un porcentaje

significativamente menor en la expresión de Fas en los linfocitos CD3+CD4+ de la cepa

BL/6. La expresión de FasL fue también significativamente menor en las células de los

granulomas de la cepa BL/6 comparado con la cepa CBA que presenta baja apoptosis

(Figura 3A). El estudio de la apoptosis en células de granulomas aisladas de ratones BL/6

infectados y deficientes en Fas (BL/6 Ipr) o FasL (BL/6 gld) mostró que no hubo diferencias

significativas respecto de los BL/6 WT control (Figura 3B). El tamaño de los granulomas

hepáticos entre estos tres grupos tampoco difirió significativamente luego de 8 semanas de

infección (Figura 3C). Claramente, estos resultados indican que Fas y FasL no controlan la

apoptosis de los linfocitos T CD4+ de los granulomas de ratones de la cepa BL/6 y tampoco

intervienen en la formación de los granulomas hepáticos.

53

MCU...CC..."'C‘

Laura l. Rutitzkv Capítulo III

TABLA I: Expresión ex vivo de los marcadores de activación CD25 y CD69 en los linfocitos T CD4+de

los ratones BL/6 y CBA infectados durante 8 semanas.

Células de los granulomas

CBA BL/6 CBABL/6

Células de los GLM

CD25 (%) 12.68 á: 2.31

CD69 (%) 54.6 :l:0.36a 79.2 i 1.7

18.05 i 0.47 11.28 i 1.37 12.5 i 0.68

25.9i 3.62 35.75i 3.98

Los resultados son medias de porcentajes i DS de 2-3 experimentos independientes.Los porcentajes son en base a las células presentes en al región de linfocitos.aSignificativamente diferente del grupo CBA (p < 0.05).

A

70 - CGBUG5° * :1 CGCBA

É 50

¡,3 4oO

g 303a 20

*10

0CD3+CD4+Fas+ FasL+

B

BLIGWT BL/6 Ipr Bus gId

i

gi w gg 3 ¿il 25.00 % g«3 i z

al mitL

I VApoptOSIs

C15 - susWT

_ BLI6Ipr¡zi BLI6gld

.n o

Tamañodegranulomas

(¡imzx10‘)

0|

FIGURA 3: Expresión de Fas y FasL en losgranulomas de los ratones BL/6 y CBA infectadosdurante 8 semanas y el papel de Fas y FasL en laapoptosis de los linfocitos T CD4+ y en lainmunopatología hepática de ratones BL/6 WT,BL/6 lpr y BL/6 gld infectados durante 8 semanas.A, Los linfocitos T CD3‘LCD4Jrde los granulomas delos ratones BL/6 expresan significativamente menosFas que las mismas células de los ratones CBA. Lascélulas totales de los granulomas de los ratones BL/óexpresan significativamente menos FasL que lascélulas totales de los granulomas de los ratones CBA(ambos p < 0.01). Las barras representan las mediasde porcentajes i ES de 3-6 experimentosindependientes. B, Los histogramas muestranporcentajes de apoptosis de linfocitos CD3+CD4+ delos granulomas en cada uno de los grupos de ratonesinfectados durante 8 semanas. Los niveles deapoptosis no difieren significativamente entre los tresgrupos. La línea punteada indica el control negativode la técnica de TUNEL sin la enzima TdT como seindica en Materiales y Métodos. C, Tamaño de losgranulomas hepáticos en los mismos tres grupos deratones BL/6. Las barras representan medias deltamaño de los granulomas hepáticos en cada uno delos grupos de ratones. Las diferencias entre los gruposno fueron estadísticamente significativas. CG =células de granulomas.

54

- La apoptosis de los linfocitos T CD4+de la cepa BL/6 no está mediada por linfocitos T

CD8+.

Los linfocitos T CD8+ han sido involucrados en la modulación negativa de la

respuesta inmune e inmunopatología en la esquistosomiasis murina (Phillips, Lin et al. 1991;

Chensue, Warmington et al. 1993; Pedras-Vasconcelos y Pearce 1996). Por lo tanto, se

consideró la posibilidad de que estas células puedan ejercer su función promoviendo la

apoptosis de los linfocitos T CD4+ patogénicos. Esta consideración se basó en que los

granulomas de la cepa BL/6 presentan una mayor proporción de linfocitos T CD8+ que los

granulomas de la cepa CBA (Figura 4A). Sin embargo, la deplecíón de linfocitos T CD8+

no tuvo efecto en los niveles de apoptosis de los linfocitos T CD4+ después de que las

células hayan sido cultivadas durante 36 h. Este resultado se obtuvo tanto en células

provenientes de la cepa BL/6 como provenientes de la cepa CBA (Figura 4B).

Para estudiar in vivo la función de los linfocitos T CD8+ en la apoptosis de linfocitos

T CD4+, se infectaron ratones de la cepa BL/6 KO para el gen [32microglobulina (Bzm), que

no expresan las moléculas del CMH de clase I en sus células y por consiguiente no

desarrollan linfocitos T CD8+. En este caso, se observó que los ratones deficientes en las

moléculas del CMH de clase I infectados después de 8 semanas con S. mansoni mostraron

los mismos niveles de apoptosis en los linfocitos T CD4+ aislados de los granulomas que las

mismas células aisladas de los ratones BL/6 WT después de haber sido cultivadas durante 36

h en presencia de SEA. Ambos grupos BL/6 mostraron significativamente más apoptosis

que el grupo CBA (Figura 4C). En este caso tampoco hubo diferencia en el tamaño de los

granulomas entre el grupo BL/6 deficiente en linfocitos CD8+, y el grupo BL/6 WT control.

Estos resultados demuestran claramente que los linfocitos T CD8+ no regulan la apoptosis de

los linfocitos T CD4+ y tampoco intervienen en la formación de los granulomas hepáticos de

los ratones de la cepa BL/6.

Laura I. Rutitzky Capítulo lll

A CG BL/6 CG CBA

FIGURA 4: Linfocitos T CD8+ en losgranulomas de los ratones BL/6 y CBA y supapel en la apoptosis de los linfocitos TCD4+ in vitro e in vivo en ratones infectadosdurante 8 semanas. A, Proporción delinfocitos T CD3+CD8+ en los granulomas.Los resultados mostrados son porcentajes de

"ïg‘fi'""“ïV'mgy de linfocitos CD3+CD8+ en la región de“WDS” linfocitos, definida en base al tamaño y

complejidad de las células. Los ratones BL/6B tienen mayor proporción de linfocitos T

CD3+CD8+ que los ratones CBA. B, Lascélulas de los granulomas de los ratones BL/6

Anti-CDS-'>Anti-C03->

w -CG totalesBUS y CBA se depletaron (depl.) o no de linfocitos

ao fágll'egecgiaBus T CD8.+ y cultivadas durante 36 h ence depl.decoaCBA presenc1a de SEA. Los resultados muestran el

porcentaje de linfocitos T CD4+ apoptóticosen cada grupo celular. La apoptosis delinfocitos T CD4+ no fue afectada por la

° depleción de linfocitos T CD8+ en ninguna delas dos cepas de ratones. C, La apoptosis delinfocitos T CD4+ de los granulomas después

c de 36 h de cultivo con SEA de los dos gruposde ratones BL/6 no fue significativamente

%decélulasapoptóticas

coa+cn4+

N a

r, -ce sus . . . .g 25 WCG BusKoparaCM“dm] distinta entre ellos y ambas Idifirleronrá; ¡o :¡cc CBA s1gn1ficat1vamente de la apoptOSIS de losÉs 15 linfocitos T CD4+ de los ratones CBA (p <2 ri 0.01 .És 1o )0

.3oo

- Las células de los granulomas y de los ganglios linfáticos mesentéricos de la cepa BL/6

producen niveles significativamente más bajos de las citoquinas Thl IL-2 e IFN-y que

las mismas células de la cepa CBA.

La disponibilidad de factores de crecimiento es indispensable para mantener la

Viabilidad de las células; en el caso de los linfocitos T, las citoquinas son esenciales para

promover la expresión de moléculas anti-apoptóticas como Bcl-2 y Bcl-X (Rathmell y

Thompson 2002). Dado que los resultados anteriores parecen excluir a la activación como

56

Laura I. Rutitzkv Capítulo lll

mecanismo inductor de la apoptosis en los linfocitos T CD4+ de los granulomas de los

ratones BL/6, se investigó si la causa no podía estar relacionada a una insuficiente

producción de citoquinas. Para ello, se estudió la respuesta de citoquinas al SEA de las

células aisladas de los granulomas y de los GLM de ratones BL/6 y CBA infectados durante

8 semanas, utilizando la técnica de ELISA para medir la concentración de las citoquinas en

sobrenadantes de cultivo. Los resultados mostraron que tanto las células de los granulomas

como las de los GLM de los ratones BL/6 estimuladas con SEA entre 24 y 48 h, produjeron

significativamente menos IL-2 e IFN-y que las mismas células de los ratones CBA. La

producción de IL-5 e IL-lO no difirió significativamente entre las dos cepas en ninguna de

las dos poblaciones celulares estudiadas (Figura 5).

A- CGBLIGEICG CBAfi nN

ao ¡_|

CIIN.E:15'g 0.60

g É. 0.5c a 0.429 co y 0.3N.‘s 0.25o 0.1

5 o oo ’ lL-2 [FN-y IL-5 lL-10

- CGLMBLIGB I::| CGLMCBA

I’ll']N

¿o ¡__..|

Concentracióndecitoquinas

(ng/ml)

°.0.o.°.0N¡A¿hIllm

oo oa

lL-2 IFN-‘y L-5 |L-10

FIGURA 5: Producción de citoquinas por las células de los granulomas y de los GLM de los ratonesBL/6 y CBA a las 8 semanas de infección. A, los resultados muestran los niveles de citoquinasproducidos por las células de los granulomas en respuesta a la estimulación con SEA después de 36 h decultivo. Cada barra representa la media de determinaciones en triplicados i ES. Los niveles de IL-2 eIFN-y fueron significativamente menores en el grupo BL/6 que en el grupo CBA (p < 0.05), los niveles deIL-5 e IL-lO no fueron significativamente distintos entre los dos grupos. B, los resultados muestran losniveles de citoquinas producidos por las células de los GLM en respuesta a la estimulación con SEAdespués de 24 h (para la IL-Z) o de 48 h de cultivo (para le IFN-y, la IL-S y la IL-lO). Cada barrarepresenta la media de determinaciones en triplicados 2+:ES. Se restaron los niveles de las citoquinas encultivos no estimulados con el antígeno. Los niveles de IL-2 e IFN-y fueron significativamente menoresen el grupo BL/6 que en el grupo CBA (p < 0.01), los niveles de lL-5 e IL-lO no fueronsignificativamente distintos entre las dos cepas. CG = células de granulomas. CGLM = células de ganglioslinfáticos mesente’ricos.

Laura l. Rutitzkv Capítulo lll

- La apoptosis de los linfocitos T CD4+ productores de citoquinas es mayor en las

células de los granulomas de los ratones BL/6.

La producción de las cuatro citoquinas, IL-2, IFN-y, IL-S e IL-lO se estudió con

mayor detalle, a nivel intracitoplasmático, por medio de citometría de flujo para analizar

cómo el ambiente afecta la viabilidad de las células que conforman la lesión granulomatosa.

Este estudio se llevó a cabo cultivando las células de los granulomas en presencia de SEA

durante 24-36 h seguido de una re-estimulación de 5 h con PMA y ionomicina, y monensina

que inhibe la secreción celular. Las células luego se tiñeron con el colorante para detectar al

ADN dañado 7-AAD, el AcMo anti-CD4 y los AcMo específicos para las distintas

citoquinas. Los datos en la Tabla II muestran que hubo un mayor porcentaje de linfocitos T

CD4+Thl y Th2 apoptóticos en los granulomas de los ratones BL/6 que, junto con el menor

porcentaje de linfocitos T CD4+ (Figura 1B), se correlacionó bien con la marcada

disminución de los niveles de citoquinas en los sobrenadantes de cultivo (Figura 5A). Es

importante destacar que la mayor diferencia en la producción de citoquinas entre los

linfocitos T CD4+ apoptóticos y viables, entre los ratones BL/6 y CBA, se observó en las

células productoras de IL-2, ya que un 77% de los linfocitos T CD4+ que producían IL-2

eran apoptóticos en la cepa BL/6 mientras que sólo el 37% de ellos resultó apoptótico en la

cepa CBA.

TABLA Il: Porcentajes de linfocitos T CD4+viables y apoptóticos productores de citoquinas en los

granulomas hepáticos de los ratones BL/ó y CBA infectados durante 8 semanas.

BL/6 CBA

% Vlables °o Apoptóticos % Viablcs % ApoptóticosIL-2 23.08 76.92 62.24 36.76

lFN-y 42.43 57.57 62.07 37.93lL-S 36.36 63.64 61.4 38.4

lb- |0 40.27 59.73 52.76 47.24

- El agregado in vitro de IL-2 recombinante previene la apoptosis de los linfocitos T

CD4+de los granulomas hepáticos de la cepa BL/6.

Los niveles bajos de la citoquina IL-2 y la viabilidad disminuida de los linfocitos T

CD4+ de los ratones BL/6 tienen una importancia especial ya que la IL-2 y una de sus

citoquinas asociadas, la IL-lS, son los principales factores de crecimiento para los linfocitos

58

Laura I. Rutitzkv Capítulo III

T (Waldmann, Tagaya et al. 1998). Para estudiar si hubo un efecto directo entre la gran

proporción de linfocitos T CD4+ apoptóticos y los bajos niveles de IL-2, se agregó en forma

exógena IL-2 rm a cultivos de células de granulomas, las cuales previamente habían sido

seleccionadas por ser no apoptóticas en base a la marcación negativa para el colorante 7—

AAD. Las células utilizadas se aislaron de los granulomas hepáticos de ratones de la cepa

BL/6 infectados durante 8 semanas. Se hizo un cultivo de 48 h en ausencia o presencia de

diferentes concentraciones de mr IL-2 y se midieron, por medio de la te’cnicade TUNEL, los

niveles de apoptosis en los linfocitos T CD4+. Como se muestra en la Figura 6, la presencia

de lL-2 rrn redujo hasta un 45% el porcentaje de apoptosis en los linfocitos T CD4+. Esta

disminución de apoptosis en presencia de IL-2 rm fue revertida con el agregado de un AcMo

neutralizante de la actividad de la IL-2. Cabe destacar que el agregado de IL-2 rm no

modificó el número total de ce'lulas recuperadas después de las 48 h de cultivo, demostrando

que la disminución en apoptosis no fue causada por un aumento de la cantidad de células

debido a la proliferación en respuesta a la IL-2. La reducción de apoptosis por acción de la

IL-2 rm fue más significativa que la que se observó por el efecto del agregado de IL-15 rm.

Se probó también el agregado de IL-4 rm, ya que esta citoquina es un importante factor de

crecimiento para linfocitos Th2 (Murphy y Reiner 2002), pero no tuvo ninguna

consecuencia sobre la apoptosis (Figura 7). Varios intentos de rescatar a los linfocitos T

CD4+ de la cepa BL/6 de la apoptosis utilizando sobrenadantes de cultivo provenientes de

células de la cepa CBA fracasaron, posiblemente debido a que la concentración final o la

estabilidad en solución de los factores de crecimiento no fue suficiente como para ejercer un

efecto biológico (datos no mostrados).

FIGURA 6: Efecto del agregado de IL-245 rm in vitro en la apoptosis de los linfocitos4o T CD4+ de los granulomas de los ratones35 BL/6 infectados durante 8 semanas. Las

barras representan medias de porcentajes delinfocitos T CD4+ apoptóticos i DS dedeterminaciones en duplicados de unexperimento representativo de tres. Elporcentaje de linfocitos T CD4+ apoptóticosdisminuyó significativamente en presencia de50 U/ml y 100 U/ml de IL-2 rm (ambos p <

- 50 100 100 100 |L-2 rm (Ulml) 0.05)

¿ANNM 0010010


C03+CD4+

001

- - - 100 400 AcMo anti IL-2 (ng/ml)

59

Laura I. Rutitzky Capítulo III

%decélulasapOptóticas

CD3+CD4+

20

IL-15 rm (ng/ml)


c03+co4+

10020

lL-4 rm (ng/ml)

FIGURA 7: Efecto del agregado de lL-15 rm e IL-4 rm in vitro en la apoptosis de los linfocitos T CD4+de los granulomas de los ratones BL/6 infectados durante 8 semanas. A, La adición de IL-15 rm in vitroinhibe la apoptosis de los linfocitos T CD4+ de los granulomas de los ratones BL/6 infectados. Las barrasrepresentan medias de porcentajes de linfocitos T CD4+apoptóticos i DS de determinaciones por duplicado deun experimento representativo de tres. El porcentaje de linfocitos T CD4+ apoptóticos disminuyósignificativamente con el agregado de 100 ng/ml de IL-15 rm (p < 0.05). B, La adición de IL-4 rm in vitro noinhibe la apoptosis de los linfocitos T CD4+ de los granulomas de los ratones BL/6 infectados. Las barrasrepresentan medias de porcentajes de linfocitos T CD4+apoptóticos i DS de determinaciones en duplicados deun experimento representativo de tres. El porcentaje de linfocitos T CD4+ apoptóticos no varió con el agregadode concentraciones distintas de IL-4 rm.

- La administración in vivo de IL-2 recombinante reduce significativamente la

apoptosis de los linfocitos T CD4+y exacerba la inmunopatología en los ratones BL/6.

Para estudiar si la IL-2 desempeña un papel regulador en la apoptosis de los

linfocitos T CD4+ in vivo, se inyectaron cantidades crecientes de IL-2 rh por vía i.p. en

ratones BL/6 durante la 5ta. y 8va. semana de infección. A las 8 semanas se sacrificaron los

ratones y se midió la apoptosis de los linfocitos T CD4+ por medio de la técnica de TUNEL.

Como se muestra en la Figura 8A, la proporción de linfocitos T CD4+ que se encontraban

apoptóticos ex vivo fue significativamente menor tanto en los granulomas como en los GLM

60

Laura I. Rutitzkv Capítulo Ill

del grupo de animales BL/6 tratados con la IL-2 rh. Llamativamente, esta disminución en los

niveles de apoptosis estuvo acompañada por un significativo agrandamiento del tamaño de

los granulomas hepáticos en el grupo BL/6 tratado con IL-2 rh (Figura 8B). Estos resultados

demuestran claramente que la IL-2, per se, puede prevenir el desarrollo de apoptosis en

linfocitos T CD4+ lo cual conlleva a una exacerbación de la inflamación granulomatosa en

los hígados de los ratones infectados de la cepa BL/6.

A

3 7.g - Notratado"og 6 mTratado con IL-29.3 5(B a) 4II)

L; 8a o 30o 2'U

.\° 1

occ; CGLM

15g - Notratadog m Tratado con IL-2É B10N v5, ><a, N

z: 5 5¡CtuE(B¡_

0

FIGURA 8: Efecto del tratamiento in vivode ratones infectados BL/6 con IL-2 recombinante humana enla apoptosis de linfocitos T CD4+ de granulomas y en la inmunopatología hepática. A, Los resultadosmuestran porcentajes de linfocitos T CD4+ apoptóticos de granulomas y de los GLM, ex vivo, en grupos deratones BL/6 tratados o no con IL-2 rh. El porcentaje de linfocitos T CD4+ apoptóticos disminuyósignificativamente en los ratones tratados con IL-2. Las barras representan medias de porcentajes de linfocitosT CD4+apoptóticos de determinaciones en duplicados de un experimento representativo de dos realizados (p <0.01). B, Se evaluó el tamaño de los granulomas hepáticos en los mismos dos grupos de ratones. Losgranulomas del grupo BL/6 tratado con IL-2 rh fueron significativamente más grandes que los granulomas delgrupo BL/ó no tratado a las 8 semanas de infección (p < 0.001). Las barras representan medias de las áreas de70-90 granulomas medidos por grupo i ES.

61

DISCUSIÓN

En este capítulo se examinó la apoptosis de los linfocitos T CD4+ presentes en los

granulomas de los higados de ratones infectados con S. mansoni como un mecanismo

efector que explique las diferencias en la respuesta inmune y en la inflamación

granulomatosa entren las cepas BL/6, de baja patología, y CBA, de alta patología. Los

resultados muestran una mayor proporción de linfocitos T CD4+ apoptóticos en los

granulomas y en los GLM de los ratones BL/6 que de los ratones CBA infectados. Estos

resultados indican que la magnitud de la inmunopatología mediada por los linfocitos T CD4+

se correlaciona inversamente con los niveles de apoptosis de estas mismas células. La falta

de efecto de la estimulación antigénica sobre los niveles de apoptosis junto con la menor

expresión del receptor Fas, del receptor de alta afinidad para la IL-2, CD25, como asi

también del marcador de activación temprana CD69, sugirieron que la apoptosis de los

linfocitos T CD4+ observada en los ratones BL/6 no era inducida por la activación de las

células. De hecho, el mecanismo efector de la muerte celular inducida por activación más

probable, el que involucra a Fas y a FasL, se excluyó formalmente al demostrar que los

niveles de apoptosis de los linfocitos T CD4+ y la inmunopatología de los ratones BL/6

deficientes en Fas (lpr) o en FasL (gld) eran similares a los de los ratones BL/6 WT contro].

El mecanismo de apoptosis por activación que involucra al TNF (Lenardo, Chan et

al. 1999) no se tomó en consideración en este estudio ya que no se detectó TNF-or en

sobrenadantes de cultivo de las células de granulomas de ratones de la cepa BL/6 (Figura 3

del capítulo II de esta tesis).

También se estudió en detalle el papel de los linfocitos T CD8+ como posibles

inductores de la apoptosis de linfocitos T CD4+ debido a que se encontró que estas células

estaban significativamente aumentadas en los granulomas de los ratones BL/6 comparado

con los de los ratones CBA. Además, los linfocitos T CD8+ han sido involucrados en el

proceso de inmunomodulación de la patología en esquistosomiasis (Boros 1986; Phillips,

Lin et al. 1991; Chensue, Warmington et al. 1993; Pedras-Vasconcelos y Pearce 1996). La

apoptosis de los linfocitos T CD4+ fue similar en poblaciones celulares de granulomas

depletadas de linfocitos T CD8+ y en aquellas no depletadas después de 36 h de cultivo,

como así también en granulomas de los ratones BL/6 deficientes en linfocitos T CD8+

62


comparado con los granulomas de ratones los BL/6 WT controles. Estos resultados

permitieron descartar al mecanismo de apoptosis mediado por linfocitos T CD8+ como

inductores de la apoptosis de los linfocitos T CD4+ in vitro e in vivo. Además, los linfocitos

T CD8+ tampoco modificaron los niveles de inmunopatologia hepática como se había

demostrado en estudios previos (Hernandez, Wang et al. 1997) ya que el tamaño de los

granulomas fue igual en los ratones BL/6 deficientes en linfocitos T CD8+ que en los ratones

BL/6 WT control.

La producción llamativamente baja de IL-2 por las células de los granulomas y de

los GLM de los ratones BL/6 sugirió que la apoptosis de los linfocitos T CD4+ podía

deberse a la falta de esta citoquina dado que la IL-2 representa el factor de crecimiento más

importante para los linfocitos T (Taniguchi y Minami 1993; Waldmann, Tagaya et al. 1998).

Esta hipótesis se puso a prueba y se corroboró al demostrar que el agregado exógeno de lL-2

recombinante revirtió significativamente la apoptosis de los linfocitos T CD4+ de los

granulomas de los ratones BL/6 tanto in vitro como in vivo. La reversión in vitro file más

significativa con el agregado de IL-2 que con el de lL-lS y la IL-4 no produjo ningún efecto

sobre la apoptosis de los linfocitos T CD4+. Fue más importante todavia demostrar que la

disminución en apoptosis luego del tratamiento in vivo de los animales con la IL-2 rh se

correlacionó con un agrandamiento del tamaño de los granulomas hepáticos. Este resultado

podría interpretarse como que el tratamiento con IL-2 rh incrementó la supervivencia de los

linfocitos T CD4+ que son las células que median la inmunopatologia de la enfermedad

produciendo un incremento de la patología de los animales tratados. Es importante destacar

que había sido demostrado que inyecciones de IL-2 rh o del anticuerpo anti-IL-2 en

animales infectados con esquistosomiasis exacerbaban o mejoraban respectivamente la

inmunopatología en ratones de las cepas CBA y C3H de alta patología (Mathew, Ragheb et

al. 1990; Cheever, Finkelman et al. 1992), pero es estos trabajos, la apoptosis no había sido

estudiada.

Como se mencionó, la apoptosis de los linfocitos T cumple un papel importante en el

control de la patología asociada con otras enfermedades parasitarias (Lopes, da Veiga et al.

1995; Kalinkovich, Weisman et al. 1998; Martins, Cardoso et al. 1998; Desbarats, Stone et

al. 2000; Sanchez-Torres, Rodriguez-Ropon et al. 2001; Wipasa, Xu et al. 2001; Jenson,

O'Connor et al. 2002). En esquistosomiasis, la apoptosis de linfocitos T de granulomas de la

63


cepa BL/6 la describió por primera vez Rumbley et al. (Rumbley, Zekavat et al. 1998). Estos

autores postularon más tarde que la apoptosis era inducida por el SEA y que estaba mediada

por el receptor Fas, aunque en esa investigación se necesitó de una muy alta concentración

de antígeno para alcanzar un efecto relativamente modesto sobre la apoptosis in vitro

(Rumbley, Sugaya et al. 2001; Lundy y Boros 2002). Lundy y Boros (Lundy y Boros 2002)

reportaron de modo similar que Fas mediaba la apoptosis de linfocitos T CD4+ aislados de

los bazos de ratones infectados, que esta apoptosis estaba mediada por linfocitos B-la que

expresaban a CD5 y a FasL y que ejercían su efecto induciendo la producción de IL-4 e IL

lO por parte de los linfocitos T CD4+ estimulados con SEA. Sin embargo, este mecanismo

de apoptosis no se pudo demostrar en los linfocitos T CD4+ de los granulomas. Este último

estudio se hizo en ratones infectados de la cepa CBA de alta patología en la que, si la

apoptosis cumpliera alguna función in vivo, no parecería tener ningún efecto protector para

el hospedador. Finalmente, para explicar el cambio gradual hacia un perfíl de citoquinas Th2

en los ratones de la cepa BL/6, Estaquier et al. (Estaquier, Marguerite et al. 1997) sugirieron

que los linfocitos productores de citoquinas Thl, eran depletados por el mecanismo de

apoptosis inducida por activación y que este mecanismo involucraba a la IL-lO. De los

resultados obtenidos con la tinción combinada de apoptosis con citoquinas

intracitoplasmáticas se observa que hubo una mayor proporción de linfocitos T CD4+

apoptóticos productores de IL-2 en los ratones BL/6, pero también los linfocitos T CD4+

productores de IFN-y, IL-S e IL-lO presentaron más apoptosis en los ratones BL/6 que en los

CBA (Tabla II).

En resumen, este estudio deja abierta la posibilidad de que exista más de un

mecanismo de apoptosis y también sugiere que las diferentes cepas de ratones pueden

presentar apoptosis a través de diferentes mecanismos. Un estudio reciente realizado por

Cameiro-Santos et al. (Cameiro-Santos, Martins-Filho et al. 2000) en esquistosomiasis

humana tiene una importancia particular ya que demostró que en los pacientes con

esquistosomiasis intestinal, la forma moderada de la enfermedad, los linfocitos T presentan

más apoptpsis que en los pacientes con la enfermedad hepatoesplénica, más severa. Este

estudio le aporta una relevancia especial a la apoptosis como un posible mecanismo

regulador de la severidad de la enfermedad in vivo.

64

Laura l. Rutitzkv Capítqu lll

De este y otros estudios se desprende que la apoptosís, tanto en forma pasiva (por la

falta de lL-2) como activa, puede ser un mecanismo efector útil para remover linfocitos T

CD4+ patogénicos, aunque es poco probable que este mecanismo sea el único que cumpla

con esta función. Muy probablemente, los niveles de inmunopatología están determinados

genéticamente y deben ser el producto de la disponibilidad, del estado de activación y de la

función de los linfocitos T CD4+ específicos para los antígenos del huevo del parásito. Así,

en la cepa de baja patología, que debe comenzar con un repertorio numéricamente menor, la

regulación negativa de los linfocitos T CD4+puede alcanzarse combinando niveles elevados

de muerte de linfocitos T CD4+, como quedó demostrado con los resultados de este capítulo,

y con tolerancia periférica de estas mismas células por medio de anergia (Stadecker y Flores

Villanueva 1994) o supresión activa (Phillips, Lin et al. 1991; Chensue, Warmington et al.

1993; Pedras-Vasconcelos y Pearce 1996), mecanismos que posiblemente están presentes en

un ambiente dominado por citoquinas anti-inflamatorias y CPA activadas por la vía

alternativa (GoerdtyOrfanos 1999; Stadecker 1999). Por el contrario, la patología alta puede

ser el resultado de un repertorio numéricamente mayor de linfocitos T CD4+ específicos para

el SEA, bajos niveles de apoptosís, ausencia de tolerancia periférica y un ambiente marcado

por citoquinas pro-inflamatorias y CPA activadas por la vía clásica (Stadecker 1999).

El diseño e implementación de estrategias que induzcan y mantengan la modulación

negativa de los linfocitos T CD4+ patogénicos tendrá una importancia especial en aquellos

individuos que sufren de, o son propensos a, contraer la enfermedad más severa.

CAPÍTULO IV

Efecto del bloqueo del mecanismo de coestimulaciónICOS-B7RP-1 en el desarrollo de la inmunopatología

asociada con la esquistosomiasis

Laura I. Rutitzkv Capítulo IV

INTRODUCCIÓN

La inmunopatología en esquistosomiasis es dependiente de linfocitos T CD4+

específicos para los antígenos del huevo. En general, los linfocitos que sólo reciben

estimulación a través de su receptor T (TCR) fallan en montar una respuesta adecuada ya

que no producen citoquínas, no proliferan y generalmente mueren por apoptosis o se

vuelven anérgicos a una estimulación subsiguiente. Para ser activados apropiadamente los

linfocitos necesitan recibir también la señal a través de las moléculas de coestimulación.

CD28 es la molécula coestimuladora clave para la activación de linfocitos T naïve o en

reposo (Lenschow, Walunas et al. 1996; Frauwirth y Thompson 2002), pero ella no realiza

todas las funciones coestimuladoras ya que la producción de citoquínas efectoras como el

IFN-y o la IL-4 por linfocitos puede ser estimulada a niveles normales por CPA que no

expresan a B7-1 o a B7-2 (Whitmire y Ahmed 2000).

La expresión del coestimulador inducible (ICOS) está aumentada en linfocitos Thl y

Th2 durante la fase inicial de diferenciación y sus niveles de expresión permanecen elevados

en los linfocitos Th2 y decrecen en los linfocitos Th] (McAdam, Chang et al. 2000; Sperling

y Bluestone 2001). La expresión de B7RP-l (del inglés B7-related protein-1), el ligando de

ICOS, también parece aumentar en respuesta a estímulos inflamatorios como IFN-y o TNF

ot (Aicher, Hayden-Ledbetter et al. 2000) mientras que, ante los mismos estímulos no se

induce la expresión de B7-l o B7-2. La interacción entre ICOS y B7RP-l puede aumentar la

producción de ciertas citoquínas aunque parece no tener un efecto mayor sobre la

proliferación celular.

El papel que cumple el sistema coestimulador CD28-B7 en la esquistosomiasis

murina ya fue estudiado. Sus funciones principales son coestimular la proliferación y el

cambio a la expresión de citoquínas hacia un perfil Th2, dado que ratones de la cepa 129/Sv

deficientes en B7-l y B7-2 infectados con S. mansoni muestran una profunda inhibición de

la proliferación de sus linfocitos junto con una ausencia de producción de citoquínas del tipo

Th2 en respuesta al SEA a las 7-8 semanas de infección (Hernandez, Sharpe et al. 1999).

Otro estudio reciente investigó el papel del mecanismo coestimulador CD40-CD154 en

contexto con el modelo murino de esquistosomiasis (MacDonald, Patton et al. 2002). Este

estudio describió una morbilidad alta y una mortalidad incrementada que se asociaron con

66

Laura l. Rutítzky Capítulo IV

un profundo impedimento de expresar las citoquinas de tipo Th2 en los ratones KO que no

expresan CD154.

En este capítulo, se propone estudiar el papel del mecanismo coestimulador ICOS

B7RP-1 en la inmunopatología asociada con la enfermedad. La hipótesis es que en el

modelo murino de esquistosomiasis, la interacción entre ICOS y B7RP-l favorecería al

pasaje de la respuesta inicial de citoquinas del tipo Thl hacia la respuesta del tipo Th2, con

lo que el bloqueo de este sistema, tendría efectos en el desarrollo de la inmunopatología

asociada con la enfermedad.

RESULTADOS

- Estudio de la inducción de los ARNm de ICOS y B7RP-l en células de hígados de

ratones BL/6 durante el transcurso de la enfermedad.

Primero, para determinar si el mecanismo ICOS-B7RP-l participaba en la infección

con esquistosomiasis, se estudió la expresión de estas dos moléculas a 0, 2, 4, 5, 6 y 7

semanas después de la infección. Para ello, se extrajo el ARN total de los hígados de ratones

normales o infectados durante distintos tiempos y se analizó la expresión de los genes por

medio de Northern blots. Como se observa en la Figura l, ambos mensajeros fueron

expresados constitutivamente a niveles bajos en animales no infectados, la expresión de

ICOS y su ligando B7RP-l comenzó a aumentar a partir de la 2da. semana de infección y

los dos mensajeros fueron progresivamente regulados positivamente alcanzando un pico de

expresión a la 6ta. semana y decreciendo luego de las 7 semanas de infección. La sonda para

ICOS reveló dos bandas discretas, una de 3.6 kb y otra de 1.7 kb (Mages, Hutloff et al.

2000), mientras que la sonda para B7RP-l mostró una única banda de 2.9 kb. Al realizar la

densitometría de las bandas se obtuvo que los ARNm de ICOS y B7RP-l estaban 4 veces

íncrementados en las células de los hígados de los ratones infectados durante 6 semanas

respecto de los animales no infectados.

67


0 2 4 5 6 7 Semanas después de la infección

_ 3.6 kb

ICOS_ 1.7 kb

B7RP-l 2.9 kb

GAPDH

FIGURA l: Análisis por Northern blot para detectar la expresión de los ARNm de ICOS y B7RP-l en

hígados de ratones infectados con esquistosomiasis. Los Northern blots se realizaron con ARN de los

hígados de ratones BL6 infectados a 2, 4, 5, 6, y 7 semanas como así también de ratones no infectados

controles. El control de carga se realizó con la sonda del ADNc del gen GADPH. Se usaron muestras de ARN

de dos ratones para cada tiempo.

- El bloqueo del mecanismo coestimulador ICOS-B7RP-l exacerba la patología

hepática.

Los resultados anteriores demuestran que ICOS y B7RP-1 son regulados

positivamente durante el curso de la infección. Para poder estudiar el efecto de este

mecanismo en el desarrollo de la respuesta inmune e inmunopatología, se trataron

diariamente durante la máxima expresión de ambas moléculas (entre la 4ta. y la 7ma.

semana), ratones de la cepa BL/6 con inyecciones de un AcMo que bloquea la interacción

entre ICOS y su ligando B7RP-1. Otro grupo de ratones BL/6 infectado fue tratado con un

AcMo control del mismo isotipo que el AcMo anti-ICOS. Un tercer grupo de ratones BL/6

infectados se dejó como control sin tratar. En la 7ma. semana después de la infección se

sacrificaron los animales, se tomaron las muestras de los hígados y se realizó la

histopatología de los tejidos de los tres grupos de ratones. Los ratones pertenecientes al

68

4.4.4.-—.4.


grupo BL/6 tratado con el AcMo anti-ICOS presentaron granulomas prominentes e

infiltrados difusos de células inflamatorias con focos de necrosis dispersos por todo el lóbulo

hepático (Figura 2A y 2B); estos infiltrados celulares junto con la necrosis de hepatocitos

fueron mínimos o ausentes en el grupo BL/6 no tratado (Figura 2C) y en el grupo tratado

con el anticuerpo control (dato no mostrado).

FIGURA 2: Histopatología hepática a las 7 semanas de infección. A, se muestra una sección de hígado

perteneciente a un ratón BL/6 infectado y tratado con el AcMo anti-ICOS donde se observan granulomas con

uno o más huevos y una inflamación del parénquima pronunciada (indicada por las flechas) y focos de

dilatación sinusoidal (más claros en 1a porción central superior de la foto). B, se muestra una sección del

mismo hígado que en el panel A, donde se observa un área de necrosis debido a la infiltración de células

inflamatorias. C, se muestra una sección de hígado perteneciente a un ratón del grupo BL/6 no tratado donde se

observan granulomas más definidos sin daño del parénquima Los granulomas son más grandes en el panel A.

El aumento utilizado para tomar las fotografias de los paneles A y C fue de lOOXy el del panel B fue de 400X.

69

Laura l. Rutitzkv Capítulo IV

La magnitud del daño hepatocelular correlacionó bien con los niveles en suero de las

enzimas hepáticas AST y ALT, que estuvieron elevadas significativamente en el grupo de

ratones que recibió el tratamiento anti-ICOS (Figura 3). Cuando los preparados de hígado se

sometieron al análisis morfométrico de los granulomas, se observó que en el grupo tratado

con el AcMo anti-ICOS los granulomas eran significativamente más grandes que los del

grupo tratado con el AcMo control y el grupo no tratado control (Figura 4), sin embargo, la

composición celular (típicamente de eosinófilos, neutrófilos, macrófagos y linfocitos) entre

el grupo experimental y los grupos controles no fue diferente.

- AcMoanti-ICOS- AcMocontrol:1 Notratado

.L OO

AST(IU/L) ALT(IU/L) 50

Grupo

FIGURA 3: Niveles séricos de las enzimas hepáticas a las 7 semanas de infección. Se obtuvo suero de los

ratones pertenecientes a cada grupo infectados y se midieron los niveles de las enzimas AST y ALT por

métodos colorimétricos. Las barras representan los niveles medios de las enzimas en suero de cuatro

ratones/grupo :b ES, expresados en unidades íntemacionales/litro (IU/L). Los niveles de AST y ALT son

significativamente más altos en e] grupo tratado con el AcMo anti-ICOS que en los grupos controles tratados y

no tratados (p < 0.05). Se restaron los niveles de las enzimas en sueros de ratones BL/6 normales, no

infectados.

70


- AcMoanti-ICOS- AcMocontrolI: Notratado18

16141210

8

642

0Grupo

Tamañodegranulomas(pm2x10‘4)

FIGURA 4: Tamaño de los granulomas hepáticas a las 7 semanas de infección. Las barras representan la

media de las áreas de inflamación granulomatosa i ES. Estas áreas fueron significativamente más grandes en

el grupo tratado con el AcMo anti-ICOS en comparación con las áreas de los granulomas de los ratones del

grupo tratado con el AcMo control de isotipo (p < 0.01) o el grupo no tratado (p < 0.05).

- El bloqueo de ICOS-B7RP-1 induce un incremento en la producción de IFN-y en las

células de los granulomas y los ganglios linfáticos mesentéricos.

El estudio del efecto del bloqueo de ICOS en la secreción de citoquinas por

linfocitos estimulados con SEA fue particularmente interesante, considerando que los

ratones BL/6 normalmente muestran una respuesta polarizada hacia un perfil Th2 alrededor

de la 7ma. semana de infección (Stadecker y Hernandez 1998). Los resultados revelaron que

las células de los granulomas, de los GLM y los linfocitos T CD4+ purificados de los GLM

del grupo tratado con el AcMo anti-ICOS produjeron significativamente más IFN-y que los

otros dos grupos. En comparación, el tratamiento con el AcMo anti-ICOS sólo indujo

cambios menores en la secreción de la IL-4 e IL-10 por las mismas poblaciones celulares

(Figura 5). De estas dos citoquinas Th2, sólo la concentración de IL-lO estuvo reducida

significativamente en los sobrenadantes de cultivo de las células de los granulomas, pero no

en los sobrenadantes de cultivo de las células totales de GLM ni de linfocitos T CD4+ de los

ratones que recibieron el tratamiento con el AcMo anti-ICOS. La producción de la IL-4 no

se modificó en las células de los granulomas y aumentó en las dos poblaciones celulares de

71


los GLM del grupo tratado con el AcMo anti- ICOS. En resumen, estos patrones de

citoquinas demuestran un cambio hacia un perfil pro-inflamatorio Thl particularmente si se

compara con las variaciones menores de las citoquinas Th2, IL-4 e IL-lO. Cabe destacar,

especialmente, la disminución en la producción de IL-lO por las células de los granulomas.

.AcMo anti-ICOS -AcMo control El Notratado

IFN-Iy lL-4 lL-10

0.02 ** 0.075" 0.25

Células degranulomas

0.4 **

Células deGLM (totales)

Células deGLM (linf. T CD4+)

Concentracióndecitoquinas(ng/ml)

Grupo

FIGURA 5: Producción de citoquinas por las células de los granulomas y de los ganglios linfáticos

mesentéricos estimuladas con SEA a las 7 semanas de infección. Las barras representan medias de

determinaciones en triplicados de los niveles de cada citoquina i ES en cada una de las poblaciones celulares

pertenecientes a los tres grupos de ratones. Las diferencias estadísticamente significativas entre el grupo AcMo

anti-ICOS y el grupo AcMo control se indican con uno (p < 0.01) o dos (p < 0.001) asteriscos. GLM =

ganglios linfáticos mesentéricos.

72

DISCUSIÓN

Se precisan diferentes sistemas coestimuladores para proveer a los linfocitos T con

las señales necesarias para que éstos se activen, se expandan clonalmente y produzcan las

citoquinas necesarias para montar la respuesta inmune. En este capítulo se estudió el papel

del mecanismo ICOS-B7RP-l sobre la inmunopatología durante la esquistosomiasis murina

Tanto ICOS como B7RP-l fueron regulados positivamente en las células de los hígados de

los ratones después de la 4ta. semana de infección. Esta inducción observada de ICOS y

B7RP-l en los hígados podría provenir respectivamente de los linfocitos T activados y de

las CPA que van siendo reclutadas al sitio donde se produce la inflamación. Para bloquear la

interacción entre ICOS y B7RP-l se trataron diariamente ratones BL/6 con un AcMo anti

ICOS. Este bloqueo tuvo un efecto notable en la patología hepática como quedó manifestado

por el aumento del tamaño de los granulomas y la presencia de inflamación en el

parénquima con necrosis hepatocelular, consecuencias que fueron acompañadas por un

brusco incremento de los niveles en suero de las enzimas hepáticas AST y ATL. Estos

cambios se correlacionaron con un marcado aumento de la producción de IFN-y por las

células de los granulomas y de los GLM. Este aumento significativo del IFN-y después del

bloqueo de ICOS en contexto con una inmunopatología hepática exacerbada, fue una clara

indicación de un ambiente pro-inflamatorio, ya que las citoquinas anti-inflamatorias IL-4 e

IL-lO mostraron un cambio relativamente menor con el tratamiento. En particular, la

pequeña pero significativa reducción en los niveles de IL-lO, específicamente localizada en

el lugar de las lesiones granulomatosas, podría ser un factor importante en la exacerbación

de la inmunopatología hepática y estaría de acuerdo con observaciones previas que vinculan

a esta citoquina anti-inflamatoria con la regulación negativa de la inflamación

granulomatosa en esquistosomiasis (Flores Villanueva, Reiser et al. 1994; Flores

Villanueva, Zheng et al. 1996; Sadler, Rutitzky et al. 2003).

Como se mencionó, en los ratones de la cepa de baja patología BL/6 infectados con

S. mansoni se presenta una primera respuesta al SEA de citoquinas por-inflamatorias del

tipo Thl que rápidamente cambia hacia una anti-inflamatoria del tipo Th2 (Pearce, Caspar et

al. 1991; Stadecker y Flores Villanueva 1994). Los resultados obtenidos en respuesta al

tratamiento con el AcMo anti-ICOS apoyan la noción de que el bloqueo de lCOS-B7RP-l

73

Laura l. Rutitzkv Capítulo lV

interfiere con esta transición normal y que esto trae aparejado un neto incremento de la

patología hepática. Un aumento en la inmunopatología en contexto con una prominente

respuesta del tipo Thl ocurre normalmente en los ratones de la cepa CBA que naturalmente

desarrollan alta patología (Cheever, Duvall et al. 1987), como así también en ratones

deficientes en las moléculas B7-1 y B7-2 (Hernandez, Sharpe et al. 1999) o en ratones

deficientes en las citoquinas anti-inflamatorias IL-4 (Pearce, Cheever et al. 1996) e IL-lO

(Sadler, Rutitzky et al. 2003) o las dos (Hoffmann, Cheever et al. 2000). Una relativa

dominancia Thl incluyendo al TNF-a y al óxido nítrico (Pearce, Cheever et al. 1996),

combinada posiblemente con una mayor dispersión de los productos nocivos de los huevos

del parásito, podrían explicar la incrementada inflamación y el daño hepático presentes en

los ratones tratados con el AcMo anti-ICOS.

Otros estudios mostraron que a pesar de que ICOS es expresado tanto en linfocitos

Thl como en Th2, su expresión persiste en niveles altos en linfocitos Th2 (McAdam, Chang

et al. 2000). Cabe destacar que la disrupción del mecanismo ICOS-B7RP-l fue beneficiosa

cuando se trataron enfermedades en donde una respuesta Th2 es dominante como ser el caso

del asma (Gonzalo, Tian et al. 2001; Tesciuba, Subudhi et al. 2001). Además, el bloqueo de

ICOS-B7RP-1 aumentó la expresión de IFN-y y exacerbó los síntomas en el modelo de la

encéfalomielitis alérgica, una enfermedad mediada por linfocitos Thl (Rottman, Smith et al.

2001). Todos estos estudios coinciden con éste en cuanto muestran que el mecanismo ICOS

B7RP-l favorece un perfil Th2 y/o inhibe a los linfocitos Thl, pero, sin embargo, otros

estudios encontraron que ICOS-B7RP-l regula tanto respuestas Thl como Th2 (Kopf, Coyle

et al. 2000; Ozkaynak, Gao et al. 2001; Greenwald, McAdam et al. 2002). Parece ser,

entonces, que el efecto final de este mecanismo coestimulador depende del modelo en

estudio.

En resumen, estos resultados demuestran que el mecanismo de coestimulación

ICOS-B7RP-l funciona principalmente para limitar la producción de IPN-y y siendo así un

elemento importante en la transición hacia un perfil de citoquinas Th2 característico de una

infección con esquistosoma en ratones de la cepa BL/6. De hecho, varios mecanismos de

coestimulación para linfocitos T parecen contribuir con este propósito, tanto disminuyendo

la producción de citoquinas pro-inflamatorias del tipo Thl o aumentando la producción de

citoquinas anti-inflamatorias del tipo Th2, o ambas funciones. De esta manera, en

74

Laura l. Rutitzkv Capítulo IV

esquistosomiasis, la coestimulación hacia una polarización Th2 parece ser crítica para

disminuir la respuesta inmunopatológica aguda del hospedador y así tener un efecto

beneficioso en su supervivencia. Próximos estudios permitirán establecer si una

coestimulación inapropiada está asociada con un mayor riesgo de contraer la forma grave de

la enfermedad y si la manipulación de las moléculas de coestimulación puede ser usada para

controlar la respuesta inmune mediada por los linfocitos T CD4+.

DISCUSIÓN GENERAL YCONCLUSIONES

Laura l. Rutitzkv Discusión General y (‘

DISCUSIÓN GENERAL Y CONCLUSIONES

La esquistosomiasis continúa siendo un problema grave de salud pública en muchos

países tropicales y subtropicales del mundo, a pesar de la disponibilidad de drogas para

tratar la enfermedad y de los grandes progresos que se hicieron en sanidad y educación. Una

inmunoterapia efectiva es, por lo tanto, un abordaje teóricamente ideal para reducir el

impacto devastador de la esquistosomiasis, tanto a nivel individual como poblacional. Para

poder desarrollar vacunas u otras terapias inmunológicas, es aún necesario ampliar nuestros

conocimientos de la respuesta inmune a este parásito.

Es evidente que, para esta coevolución exitosa que lleva miles de años entre los

esquistosomas y sus hospedadores, la reacción inmunopatológica contra los huevos tiene

que haber cumplido un papel ventajoso tanto para el parásito como para el hospedador. Para

el hospedador, la inmunopatología es en la mayoría de los casos limitada y posiblemente

beneficiosa ya que protege de los productos nocivos liberados por los huevos y de los

mediadores inflamatorios, pero en una minoría de los casos, esta reacción puede ser dañina y

hasta mortal. Para el parásito, sin embargo, la inmunopatología es esencial ya que le facilita

la migración de los huevos a través de la pared del intestino para así salir al exterior y

perpetuar la especie. Pruebas claras de esto son que en ratones infectados con S. mansoni

tratados con inmunosupresores como corticoides, se retrasa la maduración de los parásitos

(Coker 1957) o que los individuos que tienen una cantidad disminuida de linfocitos T CD4+,

presentan una reducción de huevos del parásito en sus heces (Karanja, Colley et al. 1997).

Es así como en la esquistosomiasis, la supervivencia del hospedador depende de la

habilidad en montar una apropiada y balanceada respuesta de linfocitos T que sea capaz de

orquestar el desarrollo de los granulomas, prevenir los efectos debilitantes de la enfermedad

en su fase aguda y minimizar la morbilidad grave que ocurre en la fase crónica. Más del

90% de los individuos infectados en las áreas endémicas parecen cumplir con los requisitos

necesarios para llevar una enfermedad relativamente tolerable. Por el contrario, el 5-10%

restante de las personas infectadas fracasa en montar una respuesta inmune adecuada para

sobrevivir a la enfermedad.

El objetivo principal de esta tesis fue estudiar nuevos mecanismos de

inmunorregulación en la esquistosomiasis murina que puedan explicar cómo se lleva a cabo

76

Laura l. Rutitzkv Discusión Genera] y (‘ '

la respuesta inmune en las cepas de ratones que, como ocurre en los humanos, desarrollan

naturalmente baja y alta patología. Dado que la inmunopatología de la enfermedad está

mediada por linfocitos T CD4+, se quiso estudiar más en detalle determinadas funciones

inmunológicas de estas células que caractericen y diferencien a cada una de las formas

polares de la enfermedad.

Si bien estaba descripto que los ratones de la cepa de baja patología BL/6 presentan

en las primeras semanas de la infección una respuesta hacia el SEA de citoquinas del tipo

Thl y que luego con el transcurso de la enfermedad esta respuesta cambia hacia un perfil

Th2 (Vella y Pearce 1992; Stadecker y Hemandez 1998; Pearce y MacDonald 2002), hasta

el presente había dudas sobre el papel que cumplían cada uno de estos grupos de citoquinas

en la generación de la inmunopatología. A cada uno de estos grupos se le había atribuido a

la vez un papel patogénico o anti-patogénico de acuerdo al grupo de investigadores que

interpretaba los resultados. Como se mencionó en la introducción del capítulo II esta

controversia existió por años en el campo de la esquistosomiasis y no había un consenso

entre los grupos de investigadores acerca de qué tipo de respuesta se debía inducir al

considerar inmunointervenciones para tratar la enfermedad. Esta vez se decidió inducir una

respuesta Thl prolongada en el tiempo y estudiar los efectos de esta intervención en la

inmunopatología por medio de una inmunización, sin manipulaciones genéticas, en los

ratones que normalmente cambian su perfil de citoquinas hacia uno Th2. La idea de realizar

un tratamiento in vivo en los ratones infectados se basó en que muchos de los resultados que

se habían obtenido del uso de ratones deficientes para citoquinas o sus receptores, aportaron

conclusiones contradictorias.

Las cepas de ratones BL/6 y CBA representan dos modelos polares de

inmunopatología en la esquistosomiasis murina experimental y muchas de las diferencias se

deben a factores genéticos intrínsecos de cada cepa (Cheever, Duvall et al. 1987). Sin

embargo, todavía no se conocen con exactitud los mecanismos inmunes que llevan a esta

marcada diferencia. En el campo de la esquistosomiasis, al día de hoy, no hay suficientes

estudios que comparen las respuestas inmunes de las cepas de ratones que desarrollan las

formas polares de la enfermedad. La hipótesis de que la apoptosis de los linfocitos T CD4+

podía cumplir un papel importante en el control de la patología surgió de las observaciones

de que los ratones BL/6 que desarrollan la forma leve de la enfermedad presentan

Laura l. Rutitzkv Dicmrción General y F

granulomas hepáticos de tamaño menor que los ratones CBA que desarrollan la enfermedad

grave; que los niveles de proliferación de sus linfocitos en respuesta a los antígenos del

huevo son significativamente más bajos y que la proporción de linfocitos T CD4+ en los

granulomas de estos mismos ratones es significativamente menor. Estos tres hallazgos

podían ser explicados por una mayor proporción de linfocitos T CD4+ que mueren por

apoptosis en la cepa BL/6 comparada con la cepa CBA.

Respecto de los mecanismos coestimuladores que operan entre los linfocitos T CD4+

y las células presentadoras de antígenos en esquistosomiasis, se conocía el papel de CD28

B7 (Hemandez, Sharpe et al. 1999) y CD40-CD154 (MacDonald, Patton et al. 2002), pero

todavía no se había estudiado uno de los últimos mecanismo descriptos en la literatura

compuesto por ICOS y su ligando B7RP-l (Mages, Hutloff et al. 2000; McAdam, Chang et

al. 2000). La hipótesis de que este mecanismo operaría ayudando en la transición normal de

la respuesta inicial de citoquinas del tipo Thl hacia la respuesta Th2 se basó en los

resultados obtenidos de los estudios previos de CD28-B7 y CD40-CD154 ya que ambos

cumplen con esta función, como así también del papel de ICOS-B7RP-l en otras

enfermedades mediadas por citoquinas Thl (Rottman, Smith et al. 2001) o Th2 (Gonzalo,

Tian et al. 2001; Tesciuba, Subudhi et al. 2001). Así entonces, para el estudio de ICOS

B7RP-l se eligió a la cepa BL/6 ya que naturalmente su respuesta de citoquinas se polariza

hacia un perfil Th2 y se estudió el efecto del bloqueo de la interacción entre ICOS y B7RP-l

en la inmunopatología asociada con la esquistosomiasis.

A continuación se resumen las conclusiones más sobresalientes de los resultados

obtenidos en esta tesis.

- Sobre el papel de las respuestas de citoquinas ThI vs. Th2 en el desarrollo de Ia

inmunopatología dela enfermedad:

o Los ratones BL/6 infectados con esquistosomiasis e inmunizados con SEA/CFA

desarrollan una patología hepática severa y mueren prematuramente.

78

Laura l. Rutítzky Discusión General y (‘ '

- La inmunización con SEA/CFA induce un cambio de citoquinas en granulomas,

GLM y bazos hacia un perfil Thl. Este cambio se produce sin una alteración en la

proporción de linfocitos T CD4+, lo que sugiere una variación en el perfil de secreción

de citoquinas.

- Estos resultados demuestran que un ambiente dominado por citoquinas del tipo

Thl con reducidos niveles de citoquinas del tipo Th2, exacerba la gravedad de la

enfermedad.

o Estos hallazgos concuerdan con estudios realizados en humanos, en los que las

citoquinas Thl predominan en la forma hepatoesplénica (más severa), mientras que las

citoquinas Th2 son dominantes en la forma intestinal (leve) de la enfermedad.

- Sobre el papel de Ia apoptosis de los linfocitos T CD4+en el desarrollo de la

inmunopatología de la enfermedad:

Los ratones BL/6 desarrollan granulomas hepáticos más pequeños, una respuesta

proliferativa reducida hacia los antígenos solubles del huevo y una menor proporción

de linfocitos T CD4+en los granulomas en comparación con los ratones CBA.

- La proporción de linfocitos T CD4+que mueren por apoptosis en los granulomas

de los ratones BL/6 es significativamente más elevada que la proporción de los

linfocitos T CD4+ de los granulomas de los ratones CBA.

- La apoptosis de los linfocitos T CD4+en los granulomas no está mediada por Fas

FasL o por linfocitos T CD8+,sino que se produce por una importante disminución de

los niveles de IL-2, el principal factor de crecimiento para los linfocitos T.

La apoptosis de los linfocitos T CD4+ de los granulomas cumple un papel

protector importante en el control de la inmunopatología inducida por los huevos del

parásito en los ratones que desarrollan la forma leve de la esquistosomiasis.

Laura l. Rutitzkv Discusión General y (‘ '

- Sobre el papel del mecanismo de coestimulación ICOS-B 7RP-I en el desarrollo

dela inmunopatología de la enfermedad:

' La expresión de ICOS y B7RP-l aumenta durante la infección con esquistosoma

en las células del hígado de los ratones.

- El mecanismo coestimulatorio ICOS-B7RP-l en la esquistosomiasis ayuda a

limitar la producción de IFN-y y de esta manera cumple un papel importante

facilitando la transición hacia un perfil Th2 durante la fase crónica de la enfermedad.

- El bloqueo de ICOS interfiere con la transición normal hacia un perfil Th2 y esto

se correlaciona con un daño hepático mayor manifestado por un incremento del

tamaño de los granulomas, más inflamación del parénquima y un aumento

significativo en la producción de las enzimas hepáticas AST y ALT.

En vista de los resultados obtenidos en esta tesis, las diferencias entre las cepas de

baja y alta patología en la esquistosomiasis murina experimental parecen deberse a

mecanismos inmunológicos diversos, ya que tanto la presencia de niveles elevados de

citoquinas del tipo Th] como los niveles bajos de apoptosis de linfocitos T CD4+ son

aspectos que también fueron asociados con la forma más severa de la enfermedad en

humanos (Mwatha, Kimani et al. 1998; Carneiro-Santos, Martíns-Filho et al. 2000). Todavía

queda por esclarecer si disfunciones en los mecanismos de coestimulación conducen, de la

misma manera, al desarrollo de la forma clínica grave de la enfermedad en humanos.

A continuación presento el esquema diseñado en el laboratorio del Dr. Miguel

Stadecker donde vamos incluyendo los nuevos descubrimientos hechos por nuestro y otros

laboratorios sobre los mecanismos de inmunorregulación en la esquistosomiasis. En él

resalto mis tres contribuciones.

80

Laura I. Rutitzkv níemeión General v F '

Mecanismos de inmunopatología en la esquistosomiasis

Citoquim‘ Fulldón Citoqulna FunciónIL-12

Pro' IL-101L" inflamatoria ‘nfi' .

a TGEB inflamatorias

N0 .argmasa‘r >

anti

ILZ activación de linf. T Inflamatorlaexpansión clonal

IFNW activación de CPAanti-fibrófim pro-fibrótica

Diagrama esquemático de la respuesta inmune e inmunopatología durante la infección con S. mansoni. El primercontacto de los gusanos y sus huevos con el hospedador induce una respuesta de citoquinas del tipo Thl que estácaracterizada por la presencia de las citoquinas lL-12, IL-l, TNF-a producidas por las CPA activadas por la vía clásica ypor las citoquinas del tipo Thl lL-2 e [FN-y producidas por los linfocitos T CD4+. Esta respuesta de citoquinas cambiarápidamente hacia una del tipo Th2, que está caracterizada, de manera similar, por la presencia de ciertas citoquinasproducidas por CPA activadas por la vía alternativa, entre ellas IL-lO y TGF-B y por la citoquinas del tipo Th2 IL-4, IL-5IL-lO e lL-l3 producidas por los linfocitos T CD4+.Los fenotipos opuestos de las CPA cumplirían un papel importante enla inducción y la transición Thl —>ThZ y así determinarían la naturaleza de la inmunopatología resultante causada por lainfección. El recuadro central superior describe a los factores que facilitan el pasaje Thl —->Th2 y que promueven unarespuesta inmunopatológica controlada y beneficiosa para el hospedador. En cambio, las condiciones descriptas en elrecuadro central inferior impiden el pasaje Thl ——>Th2 y conducen al desarrollo de una inmunopatología más severa y a lamuerte del hospedador.

81

Laura I. Rutitzkv Discusión General y F ‘

En resumen, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis aportan nuevos

conocimientos sobre las fimciones de los linfocitos T CD4+ que regulan la inmunopatología

en la esquistosomiasis murina experimental. De esta manera, los mecanismos descriptos

aquí podrán ser evaluados para diseñar estrategias moduladoras que resulten en un

mejoramiento general de la patología asociada con la enfermedad.

MLM!) A, ‘ MIGUELJ STADECKER,MD, PHDLOTVDJC \l Professmof Pathology

Tuhs Univ. School of Medicine136 Harrison AvenueBoston, MA 02111

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