mecanismos de aÇÃo da suramina na...

i

DRIELEN DE OLIVEIRA MOREIRA

"MECANISMOS DE AÇÃO DA SURAMINA NA

CARDIOMIOPATIA DO CAMUNDONGO MDX"

Campinas, 2015

iv

Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia

Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972

Moreira, Drielen de Oliveira, 1985-

M813m MorMecanismos de ação da suramina na cardiomiopatia do camundongo mdx /

Drielen de Oliveira Moreira. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.

MorOrientador: Maria Julia Marques.

MorTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.

Mor1. Receptores purinergicos. 2. Cálcio. 3. Distrofia muscular de Duchenne. 4.

Coração. 5. Suramina. I. Marques, Maria Julia,1961-. II. Universidade Estadual de

Campinas. Instituto de Biologia. III. Título. Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Action mechanisms of suramin on cardiomyopathy in the mdx mice Palavras-chave em inglês: Receptors, Purinergic

Calcium Muscular dystrophy, Duchenne

Heart Suramin Área de concentração: Anatomia Titulação: Doutora em Biologia Celular e Estrutural Banca examinadora: Maria Julia Marques [Orientador]

Francis Lopes Pacagnelli Candida Luiza Tonizza de Carvalho

Robson Francisco de Carvalho

Marcelo Rodrigues da Cunha Data de defesa: 11-02-2015 Programa de Pós-Graduação: Biologia Celular e Estrutural

vii

RESUMO

A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma doença muscular progressiva que causa

falência respiratória e cardíaca resultando em morte por volta da terceira década de vida. A

ausência da distrofina na DMD e no camundongo mdx, modelo experimental da doença,

leva a instabilidade do sarcolema e aumento do influxo de cálcio seguido de mionecrose e

fibrose. Receptores purinérgicos estão envolvidos na patogênese das distrofinopatias. A

ativação destes receptores por ATP deflagra vias de sinalização secundárias que promovem

a entrada de cálcio e ativam a formação de fibrose. No presente estudo, verificamos se a

suramina, droga anti-fibrótica e antagonista de receptores purinérgicos, modifica o cálcio e

proteínas a ele relacionadas, bem como afeta metaloproteinases e seus inibidores teciduais,

no coração e no músculo diafragma de camundongos mdx, na fase mais tardia da doença

(11 meses de idade). Análise de Western blotting revelou níveis elevados do receptor

purinérgico P2Y2 em ambos os músculos estudados. A terapia com suramina diminui o

nível deste receptor significativamente. Concomitantemente, observamos redução dos

níveis do canal de cálcio ativado por estiramento (TRPC1) e do cálcio total, o que no

músculo cardíaco pode explicar a redução da mionecrose (diminuição da creatina quinase

cardíaca no plasma e da troponina I no miocárdio). A atividade e o nível da

metaloproteinase-9 (MMP-9), principal envolvida na remodelação da matriz extracelular e

formação de fibrose, estavam elevados no coração distrófico em relação ao coração normal.

A suramina promoveu aumento adicional da atividade da MMP-9 e dos níveis do seu

inibidor tecidual, a TIMP-1. A suramina preveniu a redução da beta-distroglicana,

componente do complexo distrofina-proteínas que encontra-se reduzido no coração

distrófico. De maneira geral, a suramina promoveu efeitos semelhantes no diafragma

distrófico, no que se refere ao cálcio total, TRPC1, MMP-9 e TIMP-1. Estes dados sugerem

que, tanto no coração quanto no diafragma distróficos, o receptor purinérgico P2Y2

desempenha papel importante em vias de sinalização relacionadas ao cálcio (através do

TRPC1) e da modulação da matriz extracelular (através da MMP-9 e TIMP-1). A suramina,

por ser utilizada em outras doenças humanas, com doses e efeitos colaterais já estabelecidos

em humanos, tem potencial para a terapia da cardiomiopatia na DMD, merecendo atenção

em estudos clínicos desta doença.

Palavras-chaves: receptores purinérgicos, cálcio, Distrofia Muscular de Duchenne,

coração, suramina.

ix

ABSTRACT

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a progressive muscle-wasting disease that causes

respiratory and cardiac failure and results in death at about 30 years of age. The lack of

dystrophin in mdx mice, the experimental model of DMD, causes sarcolemmal breakdown

and increased calcium influx followed by myonecrosis and fibrosis. Purinergic receptors

are involved in the pathogenesis of dystrophinopathies. Activation of these receptors by

ATP triggers secondary signaling pathways that promote calcium entry and activates the

formation of fibrosis. In the present study, we investigated if suramin, an anti-fibrotic drug

and an antagonist of purinergic receptors, modifies total calcium and calcium related-

proteins and affects metalloproteinases and their tissue inhibitors in the heart and

diaphragm muscle of dystrophic mice, in the later stage of the disease (11 months of age).

Western blotting analysis indicated increased levels of P2Y2 purinergic receptor in the both

muscles studied, which were significantly decreased by suramin. Concomitantly, suramin

lead to a reduction in total calcium and in the levels of the stretch-activated calcium

channel TRPC1, which may explain the reduction of cardiac necrosis (decreases heart

creatine kinase in plasma and troponin I in the myocardium). The activity and level of

metalloproteinase-9 (MMP-9), the main involved in remodeling of the extracellular matrix

and formation of fibrosis, were elevated in the dystrophic heart compared to normal heart.

Suramin promoted further increase in MMP-9 activity and in the levels of MMP-9 inhibitor

TIMP-1. Suramin prevented the reduction of beta-dystroglycan, one of the main

components of the dystrophin-protein complex usually reduced in dystrophic heart. In

general, suramin promoted similar effects in the dystrophic diaphragm, with respect to total

calcium, TRPC1, MMP-9 and TIMP-1. These data suggest that P2Y2 purinergic receptor

plays an important role in signaling pathways involved in calcium regulation (via TRPC1)

and modulation of extracellular matrix (via MMP-9 and TIMP-1), in cardiac and

respiratory dystrophic muscles. Suramin may be a potential alternative to treat dystrophic

cardiomyopathy deserving attention in clinical trials.

Keywords: purinergic receptors, calcium, Duchenne muscular dystrophy, heart, suramin.

xi

SUMÁRIO

RESUMO ......................................................................................................................... vii

ABSTRACT ...................................................................................................................... ix

LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................... xxiii

1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 1

1.1 Distrofia Muscular de Duchenne ............................................................................... 1

1.2 O camundongo mdx .................................................................................................... 4

1.3 Cálcio e a patogênese da DMD ................................................................................... 4

1.4 Cardiomiopatia na DMD e no camundongo mdx .................................................... 7

1.5 Receptores purinérgicos .............................................................................................. 9

1.6 Metaloproteinases de matriz e inibidores teciduais endógenos ............................ 13

1.7 Biomarcadores do dano cardíaco na DMD ............................................................. 15

1.7.1 Creatina quinase cardíaca e Troponina cardíaca .................................................. 15

1.8 Suramina .................................................................................................................... 17

2 OBJETIVOS ................................................................................................................. 19

2.1 Objetivos gerais ......................................................................................................... 19

2.1.1 Objetivos específicos ................................................................................................ 19

3 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 20

3.1 Animais ....................................................................................................................... 20

3.2 Protocolo experimental e tratamento com suramina ............................................. 20

3.3 Determinação da Creatina quinase cardíaca (CK-MB) ........................................ 21

3.4 Mensuração do cálcio total ....................................................................................... 22

3.5 Western blotting ........................................................................................................ 23

3.6 Zimografia ................................................................................................................. 24

3.6.1 Preparação do extrato total ..................................................................................... 25

3.6.2 Eletroforese .............................................................................................................. 25

3.7 Análise estatística ...................................................................................................... 26

4 RESULTADOS ............................................................................................................. 26

4.1 Quantificação dos níveis do receptor purinérgico P2Y2 nos músculos cardíaco e

diafragma distróficos ...................................................................................................... 26

xii

4.2 Quantificação do cálcio total e níveis de TRPC1 nos músculos cardíaco e


4.3 Quantificação dos níveis de CSQ-C e CSQ-E ......................................................... 29

4.4 Determinação da CK-MB e quantificação dos níveis de cTn-I ............................. 30

4.5 Quantificação dos níveis de b-distroglicana nos músculos cardíaco e diafragma

distróficos ......................................................................................................................... 32

4.6 Quantificação dos níveis de MMP-9 e TIMP-1 nos músculos cardíaco e diafragma

distróficos ......................................................................................................................... 33


distróficos ................................................................................................................. ........ 35

4.8 Análise zimográfica da atividade das MMP-9 e MMP-2 nos músculos cardíaco e


4.9 Apresentação numérica dos resultados ................................................................... 40

4.9.1 Western blotting ....................................................................................................... 40

4.9.2 Cálcio total ............................................................................................................... 41

4.9.3 CK-MB ..................................................................................................................... 41

4.9.4 Zimografia ............................................................................................................... 42

5 DISCUSSÃO ................................................................................................................. 42

5.1 Suramina diminui os níveis do receptor purinérgico P2Y2 nos músculos cardíaco e


5.2 Suramina diminui o Ca2+

total e os níveis de TRPC1 nos músculos cardíaco e

diafragma distróficos ....................................................................................................... 45

5.3 Suramina não altera os níveis de CSQ-C e restaura os níveis de CSQ-E

............................................................................................................................................. 47

5.4 Suramina diminui a mionecrose no músculo cardíaco distrófico

............................................................................................................................................. 48

5.5 Suramina auxilia na manutenção da estrutura do complexo distrofina-

glicoproteínas no músculo cardíaco distrófico impedindo a redução dos níveis de

b_DG ................................................................................................................................. 49

xiii

5.6 Efeitos da suramina na atividade da MMP-9 e MMP-2 e níveis das MMP-9, MMP-

2, TIMP-1 e TIMP-2 nos músculos cardíaco e diafragma distróficos

............................................................................................................................................. 51

CONCLUSÃO ................................................................................................................. 54

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 55

ANEXO ............................................................................................................................ 83

xv

DEDICO

AOS MEUS PAIS, GUILHERME E ELIANA

“Não existem palavras que expressem tamanho amor e gratidão que tenho por vocês. A

realização de mais essa etapa em minha vida, de mais uma conquista profissional só é

possível porque vocês estão todo tempo ao meu lado, me apoiando, me dando forças para

seguir em frente. Vocês são minha maior riqueza, os amo incondicionalmente e serei

eternamente grata por sonharem junto comigo e principalmente por me ajudarem a tornar

este sonho uma realidade”.

À MINHA IRMÃ, KERULINE

“Pela alegria plena, amor, cumplicidade, parceria, troca de experiências, apoio e amizade

sincera.”

AO MEU NAMORADO, CHARLES

“Encontrar um amor verdadeiro é raro no mundo de hoje... Encontrar um homem que a

ame, apoie, admire e acima de tudo respeite e entenda seus momentos de ausência é uma

benção de Deus. Obrigada por fazer parte da minha vida, por ser quem você é e por nunca

ter desistido de nós.

AO MEU CACHORRO, LUCKY

“Por me proporcionar deliciosos momentos de alegria e diversão. Por me receber sempre

com muita festa a cada volta para casa. Meu anjinho de quatro patas.”

xvii

Agradecimento especial

À Professora Dra. Maria Julia Marques por acreditar na realização de mais este trabalho,

pelo respeito, confiança, colaboração, amizade e incentivo. Pelos conhecimentos passados e

por ter me guiado na vida acadêmica, visando aprimoramento didático e científico.

xix

AGRADECIMENTOS

A Deus pela dádiva da vida, saúde e família que me concedeu. Por me proteger, abençoar e

me oferecer oportunidades para realização dos meus sonhos e objetivos. Por me amparar e

auxiliar na superação de obstáculos e dificuldades. Por me dar a força necessária para

seguir em frente mesmo quando houve a vontade de desistir.

A toda minha família pelo incentivo e apoio durante a realização deste trabalho.

Ao Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural pelo

comprometimento e excelência na formação profissional de seus alunos.

Ao Prof. Dr. Humberto Santo Neto pela colaboração e pelas importantes considerações

para a realização deste trabalho.

Aos Professores do Departamento de Anatomia Prof. Dr. José Ângelo Camilli, Profa.

Dra. Valéria Helena Alves Cagnon Quitete, Profa. Dra. Evanisi Teresa Palomari,

Prof. Dr. José Meciano, Prof. Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira e Prof. Dr.

Marco Cesar Somazz pelos ensinamentos diários da vida acadêmica e pessoal.

Aos Professores Dr. Edson Pimentel, Dr. Marcondes Cavalcante Franca Júnior e Dra.

Elaine Minatel pelas importantes considerações no exame de qualificação.

À Profa. Dra. Elaine Minatel pela colaboração, parceria, amizade e ensinamentos durante

este trabalho e ao longo destes anos.

À Sra. Liliam Alves Senne Panagio pela atenção e auxílio durante todo o doutorado.

Aos funcionários do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, Sr. Norivaldo

Celestino, Sr. Marco Aurélio Ribeiro de Paula, Sr. Paulo Afonso Bernardes, Sr. Paulo

Francisco dos Santos, Sr. Toni Donizeti dos Santos, Sra. Marlene Lima Francisco,

xx

Srta. Stella Maris Fick de Ferraz, Srta. Érika da Silva Campos pela contribuição

durante minha formação.

Ao Comitê de Ética em Experimental Animal (CEEA) no nome da Profa. Dra. Ana

Maria Aparecida Guaraldo e das funcionárias do Biotério Central da UNICAMP

(CEMIB) no nome de Érika T.P.S. Martins e Regina Maria P.S.M. Vinagre pelo

auxílio na aquisição e atenção ao cuidado dos animais de laboratório.

Aos amigos e colegas de laboratório Adriana Fogagnolo Maurício, Aline Macedo, Ana

Paula Tiemi Taniguti, Cintia Yuri Matsumura, Daniela Mizobuti, Fernanda dos

Santos Rapucci Moraes, Isabel Cristina Chagas Barbin, Ivan Pires, Juliana Pedrosa,

Juliano Alves Pereira, Luana Marcela N. da Silva, Luiz Henrique Rapucci Moraes,

Rafael Mancio, Samara Camaçari de Carvalho, Túlio Hermes e Viviane Perim pela

importante contribuição para a realização deste trabalho e pela amizade e convívio nestes

anos.

À todos os amigos e colegas que mesmo distantes nunca me abandonaram e sempre me

incentivaram e apoiaram a todo momento.

À FUNCAMP pelo auxílio financeiro concedido durante o Programa Estágio Docente

(PED).

À CAPES e a FAPESP (2012/03498-7) pela concessão de bolsa e financiamento do

projeto, o que tornou possível a execução e finalização deste trabalho.

xxi

“Se um dia tiver que escolher entre o mundo e o amor... Lembre-se:

Se escolher o mundo ficará sem o amor, mas se escolher o amor,

com ele conquistará o mundo.”

Albert Einsten

xxiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ADP – Adenosina difosfato

ATP – Adenosina trifosfato

b-DG – β distroglicana

Ca2+

– Cálcio

CaM - Calmodulina

CDG – Complexo distrofina-glicoproteínas

[Ca2+]i – Concentração de cálcio intracelular citoplasmática

CK – Creatina quinase

CK-MB – Creatina quinase cardíaca

CSQ – Calsequestrina

CSQ-E – Calsequestrina esquelética

CSQ-C – Calsequestrina cardíaca

cTGF – Fator de crescimento do tecido conjuntivo

cTn-I – Troponina cardíaca I

DMD – Distrofia Muscular de Duchenne

DHPRS – Canal voltage-dependente dihidropiridina

ECG – Eletrocardiograma

EGF – Fator de crescimento epidermal

EROs – Espécies reativas de oxigênio

FDA – Food and Drug Administration

FGF – Fator de crescimento fibroblástico

GAPDH – Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

ICP-EOS – Espectômetro de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente

(inductively coupled plasma optical emission spectrometry)

IL-6 – Interleucina 6

IL-1β – Interleucina 1β

Mdx – “x chromossome-linked muscular dystrophy”

MEC – Matriz extracelular

xxiv

MMPs – Metaloproteinases

MMP-2 – Metaloproteinase 2

MMP-9 – Metaloproteinase 9

Na+ - Sódio

PBS - Tampão fosfato salina (phosphate buffered saline)

PDGF – Fator de crescimento derivado de plaquetas

PKA – Proteína quinase A

PKC – Proteína quinase C

PKD – Proteína quinase D

RyRs – Receptor de rianodina

SAC - Canais ativados por estiramento (Stretch-activated channels)

Sal – Salina

SERCA – Bomba Ca2+-ATPase do retículo sarcoplasmático

Ser 23 – resíduo de serina 23

Ser 24 – resíduo de serina 24

Sur – Suramina

TGF-β1 – fator de crescimento transformador beta-1

TIMPs – Inibidores teciduais endógenos de metaloproteinases

TIMP-1 – Inibidor tecidual endógeno 1

TIMP-2 – Inibidor tecidual endógeno 2

Tm – Tropomiosina

TnC – Troponina C

TnI – Troponina I

TnT – Troponina T

TRPC1 – Canal potencial receptor transiente, subfamília C, membro1

(transient receptor potential cation, subfamily C, member 1)

UDP – Uridina difosfato

U/L – Unidades internacionais

UTP – Uridina trifosfato

VEGF – Fator de crescimento endotelial vascular

1

1 INTRODUÇÃO

1.1 Distrofia Muscular de Duchenne

A distrofia muscular de Duchenne (DMD; Online Mendelian Inheritance in Man

[OMIM] referência 310200), descrita em 1861 por Gillaume Benjamin Amand Duchenne, é

uma doença recessiva ligada ao cromossomo X que afeta uma em cada 3500 crianças

nascidas vivas do sexo masculino (ENGEL et al., 1994).

Os primeiros sinais clínicos da DMD, geralmente observados por volta de 2-5 anos

de idade, são caracterizados por dificuldade para correr, subir e descer escadas,

instabilidade da marcha, pseudo-hipertrofia do tríceps sural e sinal positivo de Gowers, no

qual a criança por fraqueza dos músculos extensores de quadril e joelhos fixa cada

segmento dos membros em extensão, como se ascendesse sobre si mesma. Lordose,

escoliose, encurtamento do tendão de Aquiles e a fraqueza muscular progressiva levam ao

uso de cadeira de rodas em torno de 9-12 anos de idade. Em estágios posteriores, o

comprometimento da musculatura respiratória leva à diminuição da capacidade pulmonar e

complicações cardiorrespiratórias começam a aparecer levando o paciente a óbito por volta

de 30 anos de idade (ENGEL et al., 1994; BIGGAR, 2006, VERMA et al., 2010).

O comprometimento muscular na DMD é causado por mutação no gene da

distrofina, proteína do sarcolema que tem inúmeras associações com outras proteínas do

citoesqueleto, constituindo o complexo distrofina-glicoproteínas da membrana das fibras

musculares esqueléticas, cardíacas e lisas (CDG; BERNASCONI et al., 1995; Figura 1). O

CDG confere estabilidade ao sarcolema durante a contração e relaxamento da fibra

muscular (ENGEL et al., 1994), sendo constituído pelas distroglicanas, sintrofinas,

sarcoglicanas e distrobrevinas (para revisão ver RANDO, 2001; figura 1).

2

Figura 1: Organização molecular do complexo distrofina-glicoproteínas representando a α-

e β distroglicanas; α-, β-, γ-, δ - sarcoglicanas; α-, β1-sintrofinas; distrobrevina e a

distrofina. A distrofina exerce papel importante na estabilização do sarcolema conectando

actina citoesquelética à cadeia da laminina-2 localizada na lâmina basal via complexo de

glicoproteínas. Fonte: Laboratório de Biologia Estrutural da Junção Neuromuscular, 2011.

A ausência da distrofina leva a instabilidade do sarcolema e a redução dos níveis das

demais proteínas do CDG, interrompendo a ligação do citoesqueleto da fibra com a matriz

extracelular (ERVASTI, 1990). Ainda, na falta da distrofina ocorre entrada de grandes

quantidades de íons cálcio, levando à ativação de proteases, degeneração muscular,

subsequente invasão de células inflamatórias, culminando com a fibrose intersticial nos

músculos esqueléticos e cardíaco (BERTORINI et al., 1982; MARIOL e SÉGALAT, 2001;

WHITEHEAD et al., 2006) (Figura 2).

Os mecanismos responsáveis pelo aumento do cálcio (Ca2+

) na fibra distrófica ainda

não são completamente elucidados, mas canais de cálcio strech-activated (SACs) parecem

estar envolvidos (FRANCO-OBREGON Jr e LANSMAN, 1994; ALLEN et al., 2010;

MATSUMURA et al., 2011) assim como a presença de microrupturas do sarcolema

resultantes da força contrátil dos sarcômeros (GROUNDS et al., 2005; MARQUES et al.,

3

2008) e a ativação de proteases cálcio-dependentes, tornando as fibras musculares mais

susceptíveis a necrose (BATCHELOR e WINDER, 2006) (Figura 2).

Os SACs são canais mecanosensíveis permeáveis ao Ca2+

que aumentam a

concentração intracelular citoplasmática [Ca2+

]i (YEUNG et al., 2006), levando a ativação

exagerada de proteases endógenas, como a calpaína, resultando em necrose da fibra

muscular. Assim sendo, o cálcio desempenha papel central na patogênese da mionecrose na

DMD (MARIOL e SÉGALAT, 2001; GAILLY, 2002).

Figura 2: Representação esquemática da via através da qual a ausência da distrofina leva

ao influxo de cálcio, fibrose e consequente perda funcional. Ca2+

: cálcio; [Ca2+

]i:

concentração de cálcio intracelular; CDG: complexo distrofina-glicoproteínas; CK: creatina

quinase. Adaptado de KASPAR et al., 2010.

4

1.2 O camundongo mdx

O camundongo mdx foi descoberto em 1984 em uma colônia de camundongos

C57BL/10 ScSn, recebendo a denominação C57BL/10 mdx: “x chromossome-linked

muscular dystrophy”. Eles foram identificados por apresentarem níveis elevados das

enzimas creatina quinase e piruvatoquinase, decorrente da degeneração muscular

característica de distrofia muscular (BULFIELD et al., 1984).

A patologia muscular é pronunciada no mdx entre duas e oito semanas de idade, um

período caracterizado pela presença de focos de necrose, fibras recém-regeneradas com

núcleo central e altas concentrações plasmáticas da enzima creatina quinase. O ciclo de

degeneração-regeneração tem seu pico por volta da terceira ou quarta semana de vida do

animal (PARTRIDGE et al., 1989). Ao redor de 1-3 meses de vida, a necrose atinge seu

ápice e após o quarto mês a incidência de fibras necróticas é reduzida (TANABE et al.,

1986).

Camundongos idosos apresentam avançada fraqueza muscular nos membros

acompanhada por progressiva deterioração estrutural e funcional do músculo diafragma

(STEDMAN et al., 1991) e alterações degenerativas nas fibras musculares cardíacas, com

focos de fibrose presentes nos ventrículos, átrios, e no sistema de condução (HAINSEY et

al., 2002).

1.3 Cálcio e a patogênese da DMD

A manutenção da homeostase do Ca2+

é essencial para o crescimento e

funcionamento celular, particularmente nos músculos, onde grandes flutuações de Ca2+

são

necessárias para desencadear os ciclos de contração e relaxamento muscular

(BATCHELOR e WINDER, 2006).

A concentração de cálcio intracelular ([Ca2+

]i) é regulada pela interação de

múltiplos processos de influxo e efluxo (BOOTMAN et al., 2001). Assim sendo, as células

musculares usam altos níveis transientes de Ca2+

livre no citosol para a sinalização celular,

mantendo baixa a [Ca2+

]i (BOOTMAN et al., 2001; CONSTANTIN et al., 2006).

5

O gradiente de Ca2+

é mantido por canais presentes na membrana plasmática que

movem ativamente o Ca2+

para fora da célula. Ou ainda, este íon pode ser resgatado para o

retículo endoplasmático pela bomba Ca2+

-ATPase (ALBERTS et al., 2002).

O Ca2+

é mobilizado por canais voltagem-dependentes, os quais são acionados

mediante despolarização; canais de Ca2+

capacitativos, ativados pela diminuição dos

estoques intracelular e os canais de Ca2+

receptor-operados, que são ativados por

mensageiros bioquímicos. Os canais iônicos possuem ligação estrutural a proteínas ligadas

a membrana e contribuem para o trânsito anormal de Ca2+

em miócitos distróficos (FONG

et al., 1990; FRANCO-OBREGON Jr e LANSMAN, 1990; VANDEBROUCK et al.,

2002).

A entrada de Ca2+

, a partir da despolarização do sarcolema se faz através dos canais

voltagem-dependentes dihidropiridina (DHPRs) e tipo- L (L-type Ca2+

channel),

localizados nos túbulos transversos. O íon é primeiramente armazenado no retículo

sarcoplasmático e então liberado para o sarcoplasma através do receptor de rianodina

(RyRs) (BERCHTOLD et al.,2000).

O aumento da [Ca2+

]i leva a ativação de proteínas e consequente contração da fibra

muscular. O Ca2+

utilizado durante o processo de contração é bombeado via bomba Ca2+

-

ATPase da membrana plasmática para fora das fibras musculares ou retorna para o retículo

sarcoplasmático por ação da bomba Ca2+

-ATPase do Retículo Sarcoplasmático (SERCA),

impedindo dessa maneira o aumento da [Ca2+

]i e levando ao relaxamento (ROSSI e

DIRKSEN, 2006).

O Ca2+

bombeado para o retículo sarcoplasmático é sequestrado pela calsequestrina

(CSQ), principal proteína responsável pelo tamponamento deste íon com alta capacidade de

armazenamento. Além disto, a calsequestrina parece regular a liberação do cálcio para fora

do retículo sarcoplasmático através dos receptores rianodina (RyRs), permitindo níveis

normais de cálcio no citosol (YANO e ZARAIN-HERZBERG, 1994; OHKURA et al.,

1998; BEARD et al., 2002, ROSSI e DIRKSEN, 2006).

Outros canais podem estar envolvidos com o influxo de Ca2+

para o sarcoplasma,

por exemplo, os canais ativados por estiramento (SAC, stretch-activated channel; figura 3).

Aos canais SAC fazem parte a família de canais TRPC (transient receptor potential cation)

6

(MAROTO et al., 2005). Os canais TRPC são ativados por diferentes estímulos, como a

diminuição da reserva de cálcio ou influxo deste íon, permitindo o movimento de sódio

(Na+) e Ca

2+ através da membrana (ROWELL et al., 2010).

Figura 3: Organização molecular do complexo distrofina-glicoproteínas com representação

dos canais de cálcio ativados por estiramento (SAC, stretch-activated channel) e tipo- L (L-

type Ca2+

channel), através dos quais ocorre influxo de íon cálcio (Ca2+

). A conexão do

citoesqueleto intracelular com a matriz extracelular da fibra muscular é interrompida em

consequência a ausência da proteína distrofina. Fonte: Laboratório de Biologia Estrutural

da Junção Neuromuscular, 2011.

Compõe esta família sete canais, TRPC1-7, que contribuem com a excitabilidade e

não excitabilidade de células a entrada de cátions não-voltagem-dependentes

desempenhando funções fisiológicas ou com consequências patológicas (SABOURIN et

al., 2011).

Em músculos estriados esqueléticos, evidências indicam papel fundamental,

principalmente do TRPC1 na regulação do Ca2+

durante contrações repetidas, além de ser

considerado uma parte macromolecular do complexo que inclui a distrofina (SAUBORIN

et al., 2009; ZANOU et al., 2010). No sistema cardiovascular, o TRPC1 desempenha

função regulatória no controle do tônus vascular em resposta a constrição mediada por

endotelina 1 e potencializa a despolarização do músculo liso em resposta a uma sobrecarga

7

(INOUE et al., 2009). Adicionalmente, o TRPC1 apresenta um papel patológico no coração

ocasionando aumento do número de cardiomiócitos observado concomitantemente à

hipertrofia cardíaca em ratos e camundongos (OHBA et al., 2007; SETH et al, 2009;

MIJARES et al., 2014).

Na DMD e no camundongo mdx o influxo anormal de Ca2+ e alterações em sua

mobilização intracelular são fatores chave no processo de injúria levando a degeneração da

fibra muscular (TURNER et al., 1991; CONSTANTIN et al., 2006; WHITEHEAD et al.,

2006; KRUGUER et al., 2008).

O TRPC1, em fibras musculares distróficas, regula a entrada de Ca2+

(FRANCO-.

OBREGON JR e LANSMAN, 1994; GERVÁSIO et al., 2008), podendo ser ativado por

estiramento da membrana (MAROTO et al., 2005) levando a alteração na homeostase do

íon (VANDERBROUCK et al., 2002; WILLIAMS e ALEN, 2007) estando altamente

expresso nos músculos esquelético (VANDEBROUCK et al., 2002; MATSUMURA et al.,

2011) e cardíaco do mdx (WILLIAMS e ALLEN, 2007).

1.4 Cardiomiopatia na DMD e no camundongo mdx

O músculo cardíaco é comumente envolvido na DMD (ENGEL, 1994; ZHU et al.,

2002), sendo a cardiomiopatia a causa de morte em cerca de 20% dos pacientes

(WEHLING-HENRICKS et al., 2005).

Dentre as manifestações clínicas da doença cardíaca na DMD, têm-se descrito

taquicardia e arritmias ventriculares, insuficiência cardíaca congestiva e alterações

eletrocardiográficas (MANNING e CROPP, 1958). O eletrocardiograma (ECG) revela

ondas R de amplitudes anormalmente altas, intervalo PR diminuído, prolongamento do

intervalo QT, ondas R polifásicas, redução da razão R:S e contrações atriais e ventriculares

prematuras (SLUCKA, 1968; BIA et al., 1999; WEHLING-HENRICKS et al., 2005;

BRANCO et al., 2007; BOSTICK et al., 2008; BOSTICK et al., 2009; SPURNEY, 2011;

DE OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013).

A fibrose é o principal fator associado à cardiomiopatia (AU et al., 2011). A fibrose

é definida como acúmulo excessivo de matriz extracelular (MEC). A síntese da matriz é

8

estimulada por citocinas pró-fibróticas, como o fator de crescimento transformador beta-1

(TGF-β1) e o fator de crescimento de tecido conectivo (cTGF) (AU et al., 2011). A matriz

pode ser degradada por proteases zinco-dependentes, as chamadas metaloproteinases

(MMPs), cuja atividade enzimática pode ser controlada por inibidores teciduais endógenos

de metaloproteinases (TIMPs) (DAHIYA et al., 2011) (Figura 3).

Assim como na DMD, o camundongo mdx apresenta anormalidades no ECG (BIA

et al., 1999; CHU et al.; 2002; HAINSEY et al., 2002; QUINLAN et al., 2004; LOHAN et

al., 2005; DE OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013) e acúmulo progressivo de fibrose

cardíaca, sugerindo que a fibrose também é responsável por algumas características da

cardiomiopatia do mdx (HAINSEY et al., 2002; WEHLING-HENRICKS et al., 2005; DE

OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013). Adicionalmente, a produção exacerbada de espécies

reativas de oxigênio (EROs) no camundongo mdx, desempenha papel central na disfunção

do fluxo de cálcio nos miócitos cardíacos (WILLIAMS e ALLEN , 2007; JUNG et al.,

2008). Níveis elevados de cálcio intracelular são resultantes do influxo por meio de canais

TRPC, os quais estão envolvidos na hipertrofia patológica e remodelação do músculo

cardíaco (MIJARES et al., 2014).

9

Figura 4: Representação esquemática da cardiomiopatia na DMD e no camundongo mdx.

Ca2+

: cálcio; [Ca2+

]i: concentração de cálcio intracelular; CDG: complexo distrofina-

glicoproteínas; CK-MB: creatina quinase cardíaca; cTn-I: troponina cardíaca I; ECG:

eletrocardiograma; MMPs: metaloproteinases de matriz e TIMPs: inibidores teciduais

endógenos de metaloproteinases. Adaptado de KASPAR et al., 2010.

1.5 Receptores purinérgicos

Nucleotídeos extracelulares são conhecidos por participarem da regulação de

diversas respostas fisiológicas no sistema cardiovascular como, por exemplo, a função

10

cardíaca e regulação do tônus vascular, através de receptores chamados de P2 (KUNAPULI

e DANIEL, 1998).

A primeira descrição da sinalização extracelular por purinas foi realizada por

DRURY e SZENT-GYÖRGYI (1929), e os receptores purinérgicos foram definidos em

1976 (BURNSTOCK, 1976). Estes receptores foram divididos em receptores P1 e

receptores P2 (BURNSTOCK, 1978, apud ABBRACCHIO et al., 2006). Mais tarde, os

receptores P2 foram subdivididos farmacologicamente em P2X (receptores de canais

iônicos dependentes de transmissor) e P2Y (receptores acoplados à proteína G)

(BURNSTOCK e KENNEDY, 1985; HOU et al., 1999; ABBRACCHIO et al., 2003).

A sinalização através de receptores purinérgicos ocorre em numerosos processos

biológicos, na maioria dos tecidos (BURNSTOCK et al., 2013), uma vez que adenosina

trifosfato (ATP), adenosina difosfato (ADP), uridina trifosfato (UTP) e uridina difosfato

(UDP), nucleotídeos da classe das purinas e pirimidinas além de funcionarem como uma

fonte de energia intracelular atuam como importantes sinalizadores moleculares

extracelulares (ERLINGE e BURNSTOCK, 2008). Tais nucleotídeos podem ser liberados

para o fluido extracelular em resposta a estímulos que incluem o estiramento mecânico,

estresse químico, ativação plaquetária, inflamação, proliferação e morte celular

(BURNSTOCK, 1997; IDZKO et al., 2007; ELLIOTT et al., 2009; COHEN et al., 2011).

Uma vez liberados, esses nucleotídeos ativam os receptores P2X e P2Y (ABBRACCHIO et

al., 2006; ZIZZO et al., 2012).

Sete subtipos de receptores purinérgicos P2X (P2X1-7) e oito subtipos de receptores

P2Y (P2Y1,2,4,6,11,12,13,14) foram identificados e reconhecidos (RAVELIC e BURNSTOCK,

1998; NORTH, 2002, BURNSTOCK, 2004). Os receptores P2X são ativados por ATP

enquanto os receptores P2Y têm preferência por nucleotídeos de adenina (ATP e ADP;

P2Y1, P2Y2, P2Y11, P2Y12 e P2Y14), nucleotídeos de uridina (P2Y2, P2Y4 e P2Y6) ou

nucleotídeos de açúcar (UDP- glucose e UDP-galactose; P2Y14) (ABBRACCHIO et al.,

2006).

No sistema musculoesquelético, estudos iniciais demonstraram que os nucleotídeos

extracelulares podem induzir o aumento de Ca2+

intracelular em células ósseas (YU e

FERRIER, 1993) e inibir a formação óssea (HOEBERTZ et al., 2002). O mesmo foi

11

encontrado em cultura de fibras musculares humanas (CSERI et al., 2002). Posteriormente

foi reconhecido que os nucleotídeos extracelulares desempenham papel fundamental na

modulação da diferenciação, sobrevivência e função das células ósseas (BURNSTOCK et

al., 2013). Durante o desenvolvimento, a expressão dos receptores P2X2 coincide com o

aparecimento e a formação das junções neuromusculares (RYTEN et al., 2001) e ambos

P2X e P2Y tem sido implicados do desenvolvimento do músculo esquelético (RYTEN et

al., 2001, CHEUNG et al., 2003, BURNSTOCK et al., 2013).

Análises imuno-histoquímicas de biópsias de músculo esquelético humano

revelaram a localização de receptores P2Y2 no endotélio de capilares e no endotélio de

microvasos do músculo liso. Além disso, os receptores P2X1 foram encontrados no

sarcolema (MORTENSEN et al., 2009). Dessa forma, tem sido sugerido que ambos

receptores, P2X e P2Y, podem ser alvos potenciais para a estimulação da regeneração do

músculo esquelético e da restauração funcional após lesão (WARREN et al., 2011).

No sistema cardiovascular, a sinalização purinérgica também exerce importante

papel (ERLINGE e BURNSTOCK, 2008). O ATP e seu produto de degradação, ADP,

exercem potentes e diversos efeitos como dilatação e vasoconstrição, angiogênese,

remodelação vascular, coagulação, agregação plaquetária, inflamação e inibição da

transmissão simpática (ERLINGE, 1998; WANG et al., 2002; ERLINGE e BURNSTOCK,

2008; ERLINGE, 2011; BURNSTOCK, 2013) bem como atuam na migração celular,

proliferação e morte celular durante a angiogênese, aterosclerose e restenose, seguidos de

angioplastia (RAVELIC e BURNSTOCK, 1991; BURNSTOCK, 2013).

No cardiomiócito, o ATP causa efeito inotrópico positivo, mas também efeito

cronotrópico positivo (PIROTTON et al., 1988, apud HOU et al., 1999) podendo também

atuar em sinergismo com agonistas β-adrenérgicos para aumentar a contratilidade dos

miócitos cardíacos (VASSORT, 2001). Além disso, o ATP extracelular pode ser liberado

no coração a partir de nervos simpáticos, plaquetas, células endoteliais e em caso de

hipóxia (FREDHOLM et al., 1982, HOU et al., 1999).

A sinalização purinérgica e seus receptores também têm sido relacionados ao

desenvolvimento do infarto do miocárdio, rejeição de xenotransplantes, remodelamento

cardíaco e fibrose (VASSORT, 2001; ERLINGE e BURNSTOCK, 2008; BRAUN et al.,

12

2010; LU e INSEL, 2014; BURNSTOCK e RAVELIC, 2014). Atribui-se ao receptor P2Y2

a resposta pró-fibrótica e o aumento de cálcio cardíaco, uma vez que a ativação do P2Y2

parece promover o aumento da expressão de TGF-β1 e interleucina-6 (IL-6), fatores

envolvidos na injúria cardíaca (BRAUN et al., 2010). Em casos de insuficiência cardíaca

congestiva em ratos, tem-se relatado além da alta- regulação do receptor P2Y2, também a

expressão do P2X1 (HOU et al., 1999; VASSORT, 2001; ERLINGE e BURNSTOCK,

2008). Adicionalmente, atribui-se ao receptor P2X7 a morte de cardiomiócitos

(COSENTINO et al., 2012).

Na DMD, a ausência da distrofina e a rápida mudança nas concentrações de Ca2+

e

permeabilidade da membrana levam a maior liberação de ATP e seus produtos ocasionando

alteração do perfil de sinalização dos receptores purinérgicos nos músculos distróficos,

como anormalidades na função do receptor P2X consequentemente contribuindo para a

patogênese da DMD (JIANG et al; 2005; YEUNG et al., 2006).

Atribui-se ao curso do processo de degeneração/regeneração em músculos

distróficos uma acentuada alta-regulação de diferentes receptores purinérgicos identificados

em análises de DNA, como por exemplo, o receptor purinérgico P2X4 (JIANG et al., 2005),

o qual foi demonstrado estar localizado nos macrófagos (YEUNG et al., 2004). Além deste,

os receptores P2X1 e P2X6, também altamente regulados, apresentam-se co-localizados em

pequenas fibras em regeneração com núcleo centralizado, caracterizando o papel dos

subtipos desses receptores P2X predominantemente no processo de regeneração muscular

(RYTEN et al., 2004; JIANG et al., 2005), embora o subtipo P2X1 esteja também expresso

em miócitos cardíacos e envolvido na patologia do músculo cardíaco (HOU et al., 1999).

Em relação aos receptores da família P2Y na cardiomiopatia na DMD e no

camundongo mdx, mais especificamente o receptor P2Y2 que participa da resposta pró-

fibrótica, os dados são bastante escassos. Desta forma, o estudo do envolvimento deste

receptor na cardiomiopatia do camundongo mdx pode contribuir para o estabelecimento de

novas terapias direcionadas a inibição da formação de fibrose.

13

1.6 Metaloproteinases de matriz e inibidores teciduais endógenos

Visto que a fibrose é a principal responsável pela perda funcional dos músculos

distróficos, é importante ressaltar os mecanismos envolvidos na sua formação, que

necessariamente envolvem a regulação da matriz extracelular pelas metaloproteinases e

seus inibidores endógenos.

As metaloproteinases de matriz (MMPs) são uma família de endopeptidases zinco- e

cálcio-dependentes coletivamente capazes de degradar os componentes da MEC durante o

desenvolvimento embrionário, migração celular, morfogênese e remodelamento tecidual

(WOESSNER, 1991; CARMELI et al., 2004; ALI et al., 2011; VARGOVÁ et al., 2012).

As MMPs podem ser subdividas em cinco classes de acordo com sua estrutura

primária, a especificidade do seu substrato e a sua localização subcelular em: colagenases

(MMP-1, MMP-8 e MMP-13), gelatinases (MMP-2 e MMP-9), estromelisinas (MMP-3,

MMP-10, MMP-11 e MMP-12), matrilisinas (MMP-7 e MMP-26), as do tipo membrana

(MT)-MMPs (MT1-MMP até MT26-MMP) e outras MMPs (HIDALGO e ECKHARDT,

2001; EGEBLAD e WERB, 2002; ALI et al., 2011; VARGOVÁ et al., 2012).

As MMPs desempenham papéis essenciais no funcionamento normal de diferentes

tecidos durante o crescimento, desenvolvimento e envelhecimento, estando envolvidas em

processos como o remodelamento ósseo, ovulação e funcionamento da glândula mamária e

do útero (WOESSNER, 1991; CARMELI et al., 2004). Também estão envolvidas em

muitos processos patológicos da MEC, incluindo a inflamação, invasão celular,

angiogênese, doença renal, progressão de tumores, metástases, morte celular, estando ainda

relacionadas à insuficiência cardíaca, doença coronária, hipertensão pulmonar, artrite,

osteogênese imperfeita, doença de Alzheimer entre outras (EGEBLAD e WERB, 2002;

CARMELI et al., 2004; DESCHAMPS e SPINALE, 2006; ALI et al., 2011; CASTRO et

al., 2011; CHELLADURAI et al., 2012; VARGOVÁ et al., 2012).

A expressão das MMPs pode ser induzida por citocinas pró-inflamatórias e pró-

fibróticas como o cTGF e o TGF-β1 bem como por oxidação da S-glutationa, por espécies

reativas de oxigênio, estímulo físico e receptores purinérgicos (NAGASE et al., 2006;

DESCHAMPS e SPINALE, 2006; GU e WILEY, 2006; CHEN et al., 2011; AU et al.,

2011).

14

A atividade das MMPs é regulada por dois tipos de inibidores endógenos: α2-

macroglobulina e inibidores teciduais endógenos de metaloproteinases (TIMPs) (NAGASE

et al., 2006; MOORE et al., 2012). A α2-macroglobulina é uma glicoproteína plasmática de

725 KDa consistindo de quatro subunidades idênticas de 180 kDa que inibe as

metaloproteinases em tecidos fluidos por aprisionamento da mesma no interior da

macroglobulina (STAMENKOVIC, 2003; NAGASE et al., 2006, VIAPPIANI et al., 2009).

As TIMPs são uma família de quatro membros, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 e TIMP-4,

capazes de inibir a atividade das MMPs ligando-se a elas numa proporção estequiométrica

de 1:1 molar, bloqueando assim o acesso aos seus substratos extracelulares. Elas não

possuem especificidade para uma determinada MMP, embora haja alguma preferência da

TIMP-2 para a MMP-2 e da TIMP-1 para a MMP-9 (SCHULZ, 2007; VANHOUTE e

HEYMANS, 2010; CASTRO et al., 2011, GOMES et al., 2012). O balanço entre MMPs e

TIMPs tem papel importante na manutenção da integridade do tecido (PAGE-McCAW et

al., 2007) sendo seu desequilíbrio fator contribuinte para o remodelamento da matriz

extracelular (SCHULZ et al., 2007; AU et al., 2011).

Além da atividade inibitória das MMPs, tem-se descrito que as TIMPs atuam na

promoção do crescimento celular, possuem ação anti-apoptótica, antiangiogênica e

esteroidogênica (para revisão ver LAMBERT et al., 2004).

As MMPs têm papel importante na inflamação e fibrose dos músculos esqueléticos

presente na distrofia muscular na DMD e no camundongo mdx (BANI et al., 2008; LI et al.,

2009; DELFIN et al., 2012). A inibição genética ou farmacológica da MMP-2 e MMP-9 no

mdx melhora a capacidade regenerativa do músculo esquelético (LI et al., 2009;

MIYAZAKI et al., 2011). Em relação à patologia cardíaca, estudos em mdx idosos têm

demonstrado que níveis elevados de ambas as MMPs corroboram com o aumento do dano

cardíaco, resultando em dilatação ventricular e fibrose (AU et al., 2011; DAHIYA et al.,

2011). Além disso, relatos de que a MMP-2 degrada a troponina I dos cardiomiócitos

(WANG et al., 2002; BERGMAN et al., 2007) e que a MMP-9 exacerba a cardiomiopatia

no mdx por causar hipertrofia ventricular confirmam o envolvimento das MMPs no

desenvolvimento da disfunção cardíaca (DAHIYA et al., 2011, DELFIN et al., 2012).

15

1.7 Biomarcadores do dano cardíaco na DMD

O desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para o tratamento da DMD

ressalta a importância da identificação/utilização de marcadores biológicos que podem ser

utilizados como parâmetros para avaliar a predisposição, a presença e a progressão da

doença ou o efeito de um tratamento.

A creatina quinase (CK) é o biomarcador sérico utilizado como primeiro sinal de

diagnóstico para a DMD, visto que altos níveis desta enzima refletem lesão e/ou doença

muscular (ENGEL et al., 1994; GASPER e GILCHRIST, 2005; ROUILLON et al., 2014;

AARTSMA-RUS et., 2014). O diagnóstico precoce e preciso também é essencial na

avaliação do comprometimento cardíaco. O aumento da CK-MB (CK-cardíaca), uma

izoforma da CK, tem sido utilizado no diagnóstico da injúria cardíaca. Adicionalmente, as

troponinas cardíacas (ADAMS et al., 1993; BRAUN et al., 1996; REAGAN, 2010) têm

sido propostas como biomarcadores altamente sensíveis e específicos na detecção de dano

miocárdico (HAMMERER-LERCHER et al., 2001, LANDESBERG et al., 2003;

REAGAN, 2010).

1.7.1 Creatina quinase cardíaca e troponina cardíaca

A creatina quinase (CK) é uma enzima que catalisa a transferência de um grupo

fosfato entre a creatina fosfato e a adenosina difosfato (ADP). Resulta desta reação a

creatina, que pode ser reaproveitada pela célula, e a adenosina trifosfato (ATP), que se

encontra disponível para reações dependentes de energia na célula. O cérebro, os músculos

liso, cardíaco e esquelético são as principais fontes teciduais de CK (KATIRJI, 2001).

Os tecidos contêm três isoformas de CK. Estas formas consistem em dímeros

compostos de subunidades M e B em combinação MM, MB e BB. A CK-MM é encontrada

em músculos esqueléticos e outros tecidos, a CK-BB é encontrada no cérebro, enquanto a

CK-MB encontra-se no músculo cardíaco (NANJI, 1983; WALLIMANN et al., 1992;

KEMP et al., 2004). Considera-se uma quarta isoforma, a CK-Mi que se acumula

principalmente em mitocôndrias (WALLIMANN et al., 1992; APPLE et al., 1999; KEMP

et al., 2004).

16

Na DMD, a concentração de CK está 50 a 100 vezes acima dos limites superiores

dos valores de referência (ENGEL et al., 1994). Em camundongos mdx, os níveis de CK

também se mostram elevados durante toda a vida do animal (BULFIELD et al., 1984;

YOSHIDA et al., 2006).

A CK-MB é um marcador cardíaco normalmente utilizado, porém encontrado em

pequena quantidade no músculo esquelético (KEMP et al., 2004; LEWANDROWSKI,

2014). Consequentemente, injúrias musculoesqueléticas podem contribuir para um aumento

na atividade absoluta da CK-MB no sangue (KEMP et al., 2004). Ainda assim, níveis

elevados de CK-MB também são observados em pacientes DMD (VAINZOF et al., 1985;

HAMMERER-LERCHER et al., 2001).

A fim de se evitar um falso positivo mediante elevações da CK-MB, a mensuração

das troponinas cardíacas tornou-se critério clínico na detecção de injúria do miocárdio

(McLAURIN et al., 1997), sendo consideradas marcadores cardíacos altamente sensíveis e

específicos (LANDESBERG et al., 2003).

As troponinas são proteínas envolvidas na regulação da contração dos músculos

esquelético e cardíaco. Suas isoformas, em ambos os tipos musculares (esquelético e

cardíaco) são estruturalmente diferenciadas e codificadas por genes distintos. Consistem em

três subunidades incluindo a troponina I (TnI), a qual inibe a interação actina-miosina com

o Ca2+

, a troponina C (TnC), subunidade de ligação ao Ca2+

e a troponina T (TnT), a qual

ancora as troponinas a tropomiosina (Tm) e que também contribui para a regulação da

ativação muscular (KOCIOL et al., 2010).

A TnI é codificada por três genes e é diferencialmente expressa em vários tipos de

tecidos. No entanto, a troponina cardíaca I (cTn-I) é exclusivamente expressa no coração e

é distinta das formas rápida e lenta do músculo esquelético (ADAMS et al., 1993; APPLE

et al., 1999; CLAUSE et al., 2012). A cTn-I (contendo 209 aminoácidos) possui uma

extensão de 31 resíduos não presentes em outras isoformas (WARD et al., 2002) e regula o

processo de contração e relaxamento do músculo cardíaco ligando o Ca2+

ao sítio de ligação

da TnC mediante reações de ponte cruzada com o filamento fino (LAYLAND et al., 2005).

17

A troponina I tem pelo menos seis sítios de fosforilação e pode ser fosforilada pelas

proteínas-quinases PKA, as várias isoformas da PKC, a PKD, a proteína-quinase G e a

quinase ativada p-21 (MURPHY 2004).

A fosforilação da cTn-I nos sítios dos resíduso de serina 23 e 24 (Ser23 e Ser24)

pela PKA leva a uma diminuição da sensibilidade do miofilamento ao Ca2+

, por meio de

uma alteração conformacional do complexo de troponinas. Tal mudança estrutural reduz a

afinidade do Ca2+

de se ligar a TnC (LAYLAND et al., 2005; WIJNKER et al., 2013).

Assim sendo, alterações no processo de fosforilação em locais específicos da cTn-I pode

desencadear falhas cardíacas (MURPHY, 2004).

1.8 Suramina

A suramina, droga aprovada pela Food and Drud Administration (FDA; CHESON

et al., 1987; REED et al., 1992; MIETZ et al., 1998), apresenta 1492,2 g/mol de peso

molecular e é composta por oito anéis benzeno, quatro grupos amida, um grupo uréia e seis

grupos sulfonados (Figura 4; BOSCH et al., 1997).

Figura 5: Estrutura molecular da suramina (Bosch et al., 1997).

A suramina foi inicialmente descrita em 1920 como uma droga para o tratamento de

indivíduos com tripanossomíase africana mostrando-se eficiente também contra alguns

tipos de tumores (McNALLY et al., 2000; BISAGGIO et al., 2006; KATHIR et al., 2006;

ARAGÃO et al., 2009), incluindo o câncer prostático metastático, o linfoma, o carcinoma

do córtex adrenal e o carcinoma renal metastático (YONEDA et al., 1995; ERGUVEN et

al., 2008).

18

A ação anti-tumoral da suramina se dá por sua ligação com receptores para fatores

de crescimento, tais como fator de crescimento epidermal (epidermal growth factor, EGF),

fator de crescimento derivado de plaquetas (platelet-derived growth factor, PDGF), fator de

crescimento fibroblástico (fibroblast growth factor, FGF), fator de crescimento endotelial

vascular (vascular endothelial growth factor, VEGF) e fator de crescimento transformador

beta-1 (transforming growth factor beta-1, TGF-β1) (ZUMKELLER e SCHOFIELD,

1995).

A suramina foi também utilizada para impedir fibrose em músculos esqueléticos

normais após lesão. Seu uso em músculos esqueléticos lesados diminuiu a expressão do

TGF-β1 (STEIN et al., 1993; CHAN et al., 2005), promoveu regeneração muscular,

diminuiu a formação de fibrose e aumentou a força muscular após a lesão (NOZAKI et al.,

2008).

Estudos prévios realizados em nosso laboratório demonstraram que a suramina foi

capaz de proteger o músculo diafragma de camundongos mdx contra a mionecrose

(TANIGUTI et al., 2011), diminuir a fibrose e melhorar os níveis de beta-distroglicana, um

componente importante do complexo distrofina-glicoproteínas (TANIGUTI et al., 2012).

Mais recentemente, demonstramos efeitos positivos da droga na cardiomiopatia do mdx,

diminuindo a fibrose cardíaca e melhorando os parâmetros do eletrocardiograma, tais como

a razão R/S, o intervalo PR, a amplitude da onda Q e o índice de cardiomiopatia (DE

OLIVEIRA MOREIRA, et al., 2013).

A suramina tem sido utilizada como antagonista de alguns receptores purinérgicos

__P2X1, P2X2, P2X3, P2X5, P2Y1, P2Y2, P2Y11 e P2Y12 __ (BURNSTOCK, 2004) em

estudos de diversas patologias humanas (LI et al., 2011; NAKAMURA et al; 2011),

inclusive a DMD (IWATA et al; 2007). Efeitos benéficos decorrentes do tratamento com a

suramina no receptor P2Y2 têm sido relatados em outras patologias, como por exemplo, em

células tumorais de mama (LI et al., 2011), em células epiteliais do ducto pancreático

canceroso humano (CHOI et al., 2013) e em tumores hepáticos (XIE et al., 2014). Em

relação a patologias cardíacas, demonstrou-se eficácia da suramina como antagonista do

receptor P2Y2 na isquemia cardíaca (CONSENTINO et al., 2012).

19

Entretanto, não existem dados sobre os efeitos da inibição dos receptores

purinérgicos na cardiomiopatia na DMD e no camundongo mdx. Uma vez que a suramina

também é um inibidor destes receptores, consideramos que seria importante avaliar os

efeitos desta droga à luz da via de sinalização purinérgica. Isto permitirá uma nova

abordagem terapêutica para a cardiomiopatia distrófica. Adicionalmente, visto que a

suramina é utilizada para tratamento de outras patologias humanas, sendo conhecidas as

doses e efeitos colaterais em pacientes humanos, esta droga pode ser considerada para

estudos clínicos da DMD.

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivos gerais

Considerando a ação antagonista da suramina em receptores purinérgicos,

objetivamos estudar a expressão do receptor P2Y2 na cardiomiopatia distrófica e na

distrofinopatia do músculo diafragma. Buscamos entender os mecanismos (ou as vias de

sinalização: regulação do cálcio e fibrose) que podem ser afetados por esta terapia.

2.1.1 Objetivos específicos

No músculo cardíaco distrófico, verificar a ação da suramina:

1- nos níveis dos receptores P2Y2;

2- no cálcio total, bem como nos níveis da calsequestrina cardíaca, envolvida com o

tamponamento do cálcio intracelular e no canal de cálcio TRPC1;

3- nos biomarcadores do dano cardíaco, quais sejam, a CK-MB e a cTn-I;

4- na proteção do sarcolema, quantificando os níveis da b-distroglicana;

5- no remodelamento da matriz extracelular, medindo os níveis e/ou a atividade das

metaloproteinases MMP-2 e MMP-9, bem como da TIMP-1 e TIMP-2.

20

No músculo diafragma distrófico, verificar a ação da suramina:

1- nos níveis dos receptores P2Y2;

2- no cálcio total, bem como nos níveis da calsequestrina esquelética, envolvida com o

tamponamento do cálcio intracelular e no canal de cálcio TRPC1;

3- na proteção do sarcolema, quantificando os níveis da b-distroglicana;

5- no remodelamento da matriz extracelular, medindo os níveis e/ou a atividade das

metaloproteinases MMP-2 e MMP-9, bem como das TIMP-1 e TIMP-2.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Animais

Foram utilizados camundongos da linhagem C57BL/10 (n=27) e camundongos da

linhagem mdx (n=54) com 8 meses de idade, machos e fêmeas, provenientes do Biotério

Central da UNICAMP (Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica – CEMIB)

com peso médio de 30g. Os animais foram mantidos no biotério do Departamento de

Biologia Estrutural e Funcional, em caixas plásticas com três camundongos sob condições

ambientais controladas (12 horas de ciclo claro/escuro) com ração e água ad libitum e

temperatura ambiente de 24ºC.

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes para

experimentação animal de nossa Instituição, sob o protocolo da Comissão de Ética na

Experimentação Animal (CEEA-IB-UNICAMP) nº 2864-1.

3.2 Protocolo experimental e tratamento com suramina

Os animais foram divididos em três grupos experimentais: C57BL/10 tratados com

solução salina (n=27); camundongos mdx tratados com solução salina (mdx-sal; n=27) e

camundongos mdx tratados com 60mg/kg de suramina (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri)

diluída em solução salina (mdx-sur; n=27) (LOSSOS et al., 2000; TANIGUTI et al., 2011;

21

TANIGUTI et al., 2012; DE OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013). A solução salina e a

suramina foram injetadas intraperitonealmente durante três meses, duas vezes por semana

(DE OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013). Os camundongos tratados somente com solução

salina serviram de controle.

Após o último dia de tratamento, os animais foram eutanasiados com dose letal de

anestésico cloridrato de xilazina (6,8 mg/kg, 2% Virbaxyl, Virbac, São Paulo, Brasil) e

cloridrato de cetamina (130 mg/kg, Francotar, Virbac, São Paulo, Brasil). Os músculos

cardíaco e diafragma foram coletados e congelados de acordo com as técnicas descritas a

seguir.

No presente estudo, analisamos os efeitos da suramina também no músculo

diafragma de camundongos mdx, uma vez que este é o músculo mais acometido no modelo

experimental, apresentando fibrose semelhante à patologia no paciente DMD (STEDMAN

et., 1991; LOUBOUTIN et al., 1993). Ainda, drogas que melhoram a distrofia do músculo

esquelético podem ter efeitos contrários no coração (JORGENSEN et al., 2011) ou,

melhoram aspectos funcionais do músculo cardíaco não alterando a fibrose cardíaca, ou

mesmo não atuando na distrofia do diafragma (BISH et al., 2011).

Todas as análises descritas a seguir foram realizadas por um examinador às cegas.

3.3 Determinação de creatina quinase cardíaca (CK-MB)

Animais C57BL/10 (n=27), mdx-sal (n=27), mdx-sur (n=27) foram utilizados para

verificar o efeito da suramina nos níveis da enzima CK-MB. O sangue foi coletado por

punção cardíaca sob anestesia com cloridrato de cetamina (130 mg/Kg) e cloridrato de

xilazina (6,8 mg/Kg). Em seguida, o sangue foi centrifugado a 3000 RCF (Força centrífuga

relativa a aceleração da gravidade) à 4°C por 10 minutos. Utilizamos o kit CK-MB-Nac,

Bioliquid, Brasil para quantificação da CK-MB. As absorbâncias das amostras para CK-

MB foram lidas a 37°C utilizando-se espectrofotômetro (Thermo Electron Corporation

Genesys 20, Krackeler Scientific, Albany, New York, USA) com comprimento de onda de

340 nm e cubetas de quartzo de 1 cm de caminho óptico. Os valores foram expressos em

unidades internacionais (U/L).

22

3.4 Mensuração do cálcio total

Para observar os efeitos da suramina na quantidade de cálcio total das fibras dos

músculos cardíaco e diafragma realizamos a dosagem deste íon através de espectrometria

de plasma. Foram utilizados seis animais de cada grupo: C57BL/10, mdx-sal e mdx-sur.

Os músculos cardíaco e diafragma foram retirados, armazenados em tubo criogênico

(TPP, 1.2mL), pré-congelados em Nitrogênio líquido, mantidos a -80ºC em Biofreezer

(Bio-Freezer So Low. Environmental equipment Cincinatti, Ohio, EUA) e posteriormente

pesados em balança analítica. Para o preparo das amostras, utilizamos a técnica descrita por

YOSHIDA et al.; 2006. Os músculos foram colocados em balão volumétrico de 10 a 50 ml,

dependendo da massa do músculo, contendo 2% de seu volume de ácido nítrico p.a. a

100ºC até a digestão total dos músculos. O balão volumétrico foi completado com água

ultrapura e a amostra filtrada com algodão em um funil. A análise da amostra foi realizada

no espectrômetro de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente (inductively

coupled plasma optical emission spectrometry, ICP_OES; Optimum 3000 Duo View.

Pekin-Elmer, Boston, MA, USA) localizado no Instituto de Química da Universidade

Estadual de Campinas. Esta técnica utiliza argônio de elevada pureza para geração do

plasma à alta temperatura (aproximadamente 6727 ºC) para produzir átomos excitados que

emitem radiação eletromagnética em comprimentos de onda entre 125 a 950 nm,

característicos de cada elemento químico. Após separação por sistemas ópticos das

radiações emitidas, detectores medem a intensidade da emissão. Para correlacionar a

intensidade da emissão à concentração do elemento na amostra utilizamos uma curva de

calibração de cálcio. Utilizamos como padrão uma solução de fosfato de cálcio nas

concentrações de 0,495 a 8,250 ppm.

3.5 Western blotting

Para a quantificação do P2Y2, TRPC1, calsequestrina esquelética (CSQ-E),

calsequestrina cardíaca (CSQ-C), cTn-I, e β-distroglicana (b-DG), MMP-2, MMP-9, TIMP-

1, TIMP-2 foram utilizados nove camundongos de cada grupo experimental. Os

camundongos foram anestesiados com cloridrato de cetamina (130 mg/Kg) e cloridrato de

23

xilazina (6,8 mg/Kg) e perfundidos com PBS. Os músculos cardíaco e diafragma foram

retirados e homogeneizados em tampão para homogeneização (Tris-HCl 100 mM,

pirofosfato de sódio 100 mM, fluoreto de sódio 100 mM, 10 μg/ml aprotinin, PMSF 1 mM,

e Na3VO 0,25 mM) a 4ºC usando homogeneizador Polytron PTA 20S (Brinkmann

Instruments, Westbury, New York, EUA) operado em velocidade máxima por 30 segundos.

Os extratos foram centrifugados a 11000 rotações por minutos a 4ºC por 20 minutos e o

sobrenadante utilizado para análise por extrato total. A determinação da proteína foi

realizada pelo método de BRADFORD et al., 1976.

As amostras do extrato protéico foram tratadas com tampão Laemmli (azul de

bromofenol 0,04 mg/ml eTris-HCl 0,12 M, glicerol 20%, SDS 2% e ß-mercaptoetanol 0,28

M) e aquecidas por 5 minutos. Em seguida, 60 g de proteína foram aplicados em gel SDS

poliacrilamida 8-15% em aparelho para eletroforese (mini-Protean, Bio-Rad Laboratories,

Richmond, CA, EUA). A eletrotransferência do gel para a membrana de nitrocelulose foi

realizada em 90 minutos a 120 V em aparelho de transferência (mini-Protean, Bio-Rad

Laboratories, Richmond, CA, EUA). As membranas foram incubadas com solução basal

(Trisma base 10 mM, cloreto de sódio 150 mM e Tween-20 0,02%) contendo 3% de leite

desnatado, por 1 hora em temperatura ambiente para reduzir a ligação não específica de

proteínas. Posteriormente, foram incubadas com anticorpo primário diluído em 10 ml de

solução basal contendo 1% de leite desnatado a 4ºC, durante 12 horas. No dia seguinte, as

membranas foram lavadas por 30 minutos com solução basal e incubadas em 10 ml de

solução basal contendo 3% de leite desnatado e 2,5 l de anticorpo secundário conjugado a

peroxidase por duas horas em temperatura ambiente. Posteriormente, as membranas foram

lavadas por 30 minutos com solução basal.

Para detectar as bandas imunorreativas, as membranas foram expostas à solução de

quimioluminescência (Super Signal West Pico Chemiluminescente, Pierce) por 5 minutos e

a captura de fluorescência foi realizada utilizando-se o aparelho G-Box Chemi e o software

de aquisição de imagem GeneSnap (Syngene, Maryland-USA). As densidades das bandas

foram quantificadas pelo software de análise GeneTools (Syngene, Maryland- USA).

Após obtenção das bandas, as membranas foram lavadas com solução basal (3x10

minutos) e incubadas com 10mL de Stripping Buffer (10mM Tris-HCl pH 7.5;

24

Mercaptoethanol 0.1M; Uréia 8M) durante 1h, à 60°C. Em seguida, foi realizada uma

incubação em Tris-HCl 1M pH 7.5 por 30min para neutralizar o stripping. As membranas

foram lavadas com solução basal e processadas conforme descrito previamente para

marcação da proteína gliceraldeído 3-fosfato dehidrogenase (GAPDH). Esta é uma proteína

de controle interno, pois a quantidade desta proteína não se altera em diferentes condições

fisiológicas. As bandas marcadas com GAPDH foram utilizadas para normalização das

bandas.

Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: 1) P2Y2 (goat polyclonal; Santa

Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA); 2) TRPC1 (rabbit polyclonal; Alomone

Labs, Jerusalem, Israel); 3) calsequestrina cardíaca (rabbit polyclonal PA1-913, Affinity

BioReagents); 4) calsequestrina esquelética (mouse monoclonal VIIID12, Affinity

BioReagents, Golden, Colorado); 5) troponina cardíaca I (mouse monoclonal; Abcam,

Cambridge, MA, USA); 6) beta-distroglicana (mouse monoclonal; NCL-b-DG, Novocastra

Laboratories, Newcastle, UK); 7) MMP-2 (polyclonal goat, R&D Systems, USA); 8)

MMP-9 (polyclonal goat, R&D Systems, USA); 9) TIMP-1 (rat monoclonal; Abcam,

Cambridge, MA, USA); 10) TIMP-2 (mouse monoclonal; Millipore, USA); 11); GAPDH

(rabbit polyclonal; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA). Foi utilizado

o anticorpo secundário IgG mouse, rabbit, goat ou rat conjugado à peroxidadse

correspondente (H+L) (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA).

3.6 Zimografia

Para verificar se o tratamento com suramina altera a atividade das MMPs foi

realizada a técnica de zimografia para análise da MMP-2 e MMP-9. Foram utilizados os

músculos cardíaco e diafragma de animais C57BL/10 (n=6), mdx-sal (n=6), mdx-sur (n=6).

25

3.6.1 Preparação do extrato total

Os músculos foram retirados como descrito previamente e homogeneizados em

tampão de extração (30mg de músculo/100μl de solução), contendo Tris-HCl 50mM pH7,4,

NaCl 0,2M, Triton X-100 0,1%, CaCl2 10mM e 0,1% de coquetel inibidor de protease

(P8849 – Sigma) utilizando um homegeneizador Polytron PTA 20S (PT 10/35; Brinkmann

Instruments) em três ciclos de 5s cada. O homogeneizado foi incubado por 2h a 4ºC, em

seguida, foi centrifugado a 4000rpm por 20min a 4ºC. O sobrenadante foi coletado e a

concentração de proteínas foi determinada pelo método de BRADFORD, 1976.

3.6.2 Eletroforese

Alíquotas (30μg de proteína) do extrato foram submetidas à eletroforese sob

condições não redutoras (100V, a 4ºC) em gel de poliacrilamida a 7,5% (tampão Tris-HCl

1,5 M pH 8,8, acrilamida 30 %, bis-acrilamida 0,8 %, Glicerol 50 %, SDS 10 %, persulfato

de amônio 10 % e tetrametilenodiamina) contendo 1% de gelatina (colágeno desnaturado).

Após a eletroforese, os géis foram lavados em Triton X-100 2,5% duas vezes por 20min.

Posteriormente, os géis foram incubados em tampão de incubação (Tris-HCl 50mM pH 7,4,

NaCl 0,1M, CaCl2 dihidratado 1M, NaNO3 0,02%) com 0,004% de inibidor de protease,

por 20-24h a 37ºC, sob agitação. Após a incubação, os géis foram corados com Comassie

Brilliant Blue 0,25% e descorados com solução de etanol 30% e ácido acético 10%. Áreas

de proteólise aparecem como bandas claras contra um fundo azul escuro.

As bandas obtidas foram digitalizadas utilizando-se o aparelho G-Box Chemi e o

software de aquisição de imagem GeneSnap (Syngene, Maryland-USA). A atividade

gelenolítica das bandas da MMP-2 e -9 foram analisadas obtendo-se a densidade óptica

integrada (IOD) das bandas utilizando-se o software de análise Image J 1.46r (Wayne

Rasband, National Institutes of Health-USA).

26

3.7 Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. A comparação entre os

três grupos foi realizada por análise de variância (ANOVA; p≤0,05) seguida do pós-teste de

Bonferroni no programa estatístico BioEstat 5.0.

4 RESULTADOS

4.1 Quantificação dos níveis do receptor purinérgico P2Y2 nos músculos cardíaco e

diafragma distróficos

Verificamos a ação da suramina, considerada uma droga antagonista de receptores

purinérgicos P2, nos níveis do P2Y2, receptor envolvido na resposta pró-fibrótica, tanto no

músculo cardíaco quanto no diafragma.

Os níveis de P2Y2 estão 49% e 69% maiores no grupo mdx-sal quando comparados

ao grupo C57BL/10, respectivamente no músculo cardíaco e diafragma. A suramina

reduziu em 42% e 35% os níveis de P2Y2 no músculo cardíaco e diafragma,

respectivamente, quando comparados ao grupo mdx-sal (Figura 6).

27

Figura 6: Quantificação por Western blotting do receptor purinérgico P2Y2 nos músculos

cardíaco e diafragma de camundongos controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-

sal) e mdx tratados com suramina (mdx-sur). (A) Bandas representativas do receptor P2Y2.

(B) Bandas representativas do controle interno GAPDH. (C) Gráfico dos níveis de P2Y2

normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbitrária. Média ± desvio padrão. (*)

Diferença significante quando comparado ao C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste

Bonferroni). (#) Diferença significante quando comparado ao mdx-sal (p≤0,05, ANOVA,

pós-teste Bonferroni).

4.2 Quantificação do cálcio total e níveis de TRPC1 nos músculos cardíaco e


Na Figura 7, observamos os resultados da dosagem de cálcio total no músculo

cardíaco e diafragma. O cálcio total no músculo cardíaco encontra-se 51% aumentado no

mdx-sal quando comparado ao C57BL/10. No diafragma, o cálcio total está 34% maior no

mdx em relação ao C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA).

A suramina reduziu em 39% e 30% a concentração de cálcio total no músculo

cardíaco e diafragma, respectivamente (Figura 7).

28

Figura 7: Quantificação do cálcio total nos músculos cardíaco e diafragma em animais

controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx tratados com suramina (mdx-

sur). Valores expressos como média ± desvio padrão. (*) Diferença significante quando

comparado ao C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni). (#) Diferença

significante quando comparado ao mdx-sal (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni).

Quantos aos níveis de TRPC1, verificamos que estes encontram-se 25% e 45%

maiores no grupo mdx-sal quando comparados ao grupo C57BL/10, respectivamente no

músculo cardíaco e diafragma. A suramina reduziu em 23% e 41% os níveis de TRPC1 no

músculo cardíaco e diafragma, respectivamente, quando comparados ao grupo mdx-sal

(Figura 8).

29

Figura 8: Quantificação por Western blotting do TRPC1 nos músculos cardíaco e

diafragma de animais controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx

tratados com suramina (mdx-sur). (A) Bandas representativas da proteína TRPC1. (B)

Bandas representativas do controle interno GAPDH. (C) Gráfico dos níveis de TRPC1





4.3 Quantificação dos níveis de CSQ-C e CSQ-E

Para verificar se o tratamento com suramina altera os níveis da calsequestrina

cardíaca (CSQ-C) e calsequestrina esquelética (CSQ-E), proteína envolvida no

tamponamento do cálcio, realizamos a técnica de Western blotting para estas proteínas. Os

resultados estão apresentados na Figura 9.

No músculo cardíaco não houve diferença significativa entre os grupos estudados.

No diafragma verificamos que os animais mdx-sal apresentam redução de 52% comparada

ao controle C57BL/10. O tratamento com suramina aumentou em 49% os níveis de CSQ-E

em relação grupo mdx-sal (Figura 9).

30

Figura 9: Quantificação por Western blotting da CSQ-C (Calsequestrina cardíaca) e CSQ-

E (Calsequestrina esquelética) nos músculos cardíaco e diafragma de animais controle

C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx tratados com suramina (mdx-sur). (A)

Bandas representativas da proteína CSQ-C e CSQ-E. (B) Bandas representativas do

controle interno GAPDH. (C) Gráfico dos níveis de CSQ-C e CSQ-E normalizados pelo

GAPDH, expressos em unidade arbitrária. Média ± desvio padrão. (*) Diferença

significante quando comparado ao C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni). (#)

Diferença significante quando comparado ao mdx-sal (p≤0,05, ANOVA, pós-teste

Bonferroni).

4.4 Determinação da CK-MB e quantificação dos níves de cTn-I

Para verificar se a suramina atua na proteção a mionecrose no músculo cardíaco

distrófico, realização a dosagem da CK-MB no plasma e a quantificação dos níveis de cTn-

I por Western blotting. Os resultados estão apresentados nas figuras 10 e 11.

A CK-MB encontra-se 68% maior nos animais distróficos quando comparados aos

animais controles (p≤0,05). A suramina reduziu em 66% os níveis plasmáticos de CK-MB

(p≤0,05) (Figura 10).

31

Figura 10: A) Níveis plasmáticos da enzima CK-MB (U/L) dos camundongos controle

C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx tratados com suramina (mdx-sur).

(*) Diferença significante quando comparada aos camundongos C57BL/10 (p≤0,05,

ANOVA, pós-teste Bonferroni). (#) Diferença significante quando comparada aos

camundongos mdx-sal (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni).

A quantidade de cTn-I está 69% maior no grupo mdx-sal comparado ao C57BL/10

(figura 10, p≤0,05, ANOVA). A suramina reduziu 67% os níveis de cTn-I em relação ao

grupo mdx-sal, levando a valores próximos aos observados no grupo C57BL/10 (Figura 11,

p≤0,05, ANOVA).

32

Figura 11: Quantificação por Western blotting da troponina cardíaca (cTn-I) nos grupos

controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx tratados com suramina (mdx-

sur). (A) Bandas representativas da proteína cTn-I. (B) Bandas representativas do controle

interno GAPDH. (C) Gráfico dos níveis de troponina cardíaca normalizados pelo GAPDH,

expressos em unidade arbitrária. Média ± desvio padrão. (*) Diferença significante quando

comparado ao C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni). (#) Diferença

significante quando comparado ao mdx-sal (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni).

4.5 Quantificação dos níveis de b-distroglicana nos músculos cardíaco e diafragma

distróficos

Para verificar se o tratamento com suramina altera os níveis de b-distroglicana (b-

DG), proteína trans-sarcolemal que interage intracelularmente com a distrofina e com

proteínas sinalizadoras, realizamos a técnica de Western blotting para esta proteína. Os

resultados estão apresentados na Figura 12.

No coração, a b-DG estava 40% reduzida no grupo mdx-sal quando comparado ao

grupo C57BL/10. A suramina aumentou em 34% a b-DG no grupo mdx-sur em relação ao

mdx-sal. No diafragma, a b-DG estava reduzida em relação ao controle, porém não

33

encontramos diferença estatística. A suramina promoveu discreto aumento da b-DG, que

não foi diferente do mdx-sal (Figura 12).

Figura 12: Quantificação por Western blotting da b-DG (β-distroglicana) nos músculos

cardíaco e diafragma de animais controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e

mdx tratados com suramina (mdx-sur). (A) Bandas representativas da proteína b-DG. (B)

Bandas representativas do controle interno GAPDH. (C) Gráfico dos níveis de b-DG






distróficos

Para verificar se o tratamento com suramina auxilia na manutenção da integridade

do tecido muscular reduzindo o desequilíbrio entre a MMPs e a TIMPs, fator que contribui

34

para o remodelamento da MEC, realizamos a técnica de Western blotting para a

quantificação destas proteínas. Os resultados estão apresentados nas Figuras 13, 14.

A MMP-9 no músculo cardíaco encontra-se 37% aumentada no mdx-sal quando

comparada ao C57BL/10. No diafragma, a MMP-9 está 35% maior no mdx-sal em relação

ao C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA). O tratamento com suramina não alterou os níveis de

MMP-9 no músculo cardíaco, enquanto que no diafragma houve aumento de 23% (p≤0,05,

ANOVA; Figura 13).

Os níveis da TIMP-1 estão 53,4% e 57,7% maiores no grupo mdx-sal quando

comparados ao grupo C57BL/10, respectivamente no músculo cardíaco e diafragma. A

suramina aumentou em 52,6% e 62,5% os níveis de TIMP-1 no músculo cardíaco e

diafragma, respectivamente, quando comparados ao grupo mdx-sal (Figura 14).

Figura 13: Quantificação por Western blotting da MMP-9 nos músculos cardíaco e

diafragma de camundongos controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx

tratados com suramina (mdx-sur). (A) Bandas representativas da proteína MMP-9. (B)

Bandas representativas do controle interno GAPDH. (C) Gráfico dos níveis de MMP-9



35



Figura 14: Quantificação por Western blotting da TIMP-1 nos músculos cardíaco e


tratados com suramina (mdx-sur). (A) Bandas representativas da proteína TIMP-1. (B)

Bandas representativas do controle interno GAPDH. (C) Gráfico dos níveis de TIMP-1






distróficos

Em relação aos níveis de MMP-2, no músculo cardíaco, observamos que os animais

mdx-sal apresentam níveis 40% maior quando comparados ao grupo C57BL/10. No

diafragma, a MMP-2 encontra-se 47% aumentada no mdx-sal quando comparada ao

36

C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA). O tratamento com suramina não alterou os níveis dessa

metaloproteinase em ambos os músculos estudados (p≤0,05, ANOVA; Figura 15).

Os níveis da TIMP-2 estão 50% e 60% maiores no grupo mdx-sal quando

comparados ao grupo C57BL/10, respectivamente no músculo cardíaco e diafragma. A

suramina aumentou em 30% e 57% os níveis de TIMP-2 no músculo cardíaco e diafragma,

respectivamente, quando comparados ao grupo mdx-sal (Figura 16).

Figura 15: Quantificação por Western blotting da MMP-2 nos músculos cardíaco e


tratados com suramina (mdx-sur). (A) Bandas representativas da proteína MMP-2. (B)

Bandas representativas do controle interno GAPDH. (C) Gráfico dos níveis de MMP-2



Bonferroni).

37

Figura 16: Quantificação por Western blotting da TIMP-2 nos músculos cardíaco e


tratados com suramina (mdx-sur). (A) Bandas representativas da proteína TIMP-2. (B)

Bandas representativas do controle interno GAPDH. (C) Gráfico dos níveis de TIMP-2





4.8 Análise zimográfica da atividade da MMP-9 e MMP-2 nos músculos cardíaco e


A análise zimográfica do músculo cardíaco revelou que os animais mdx-sal

apresentam níveis elevados de MMP-9 (100kDa) e das três isoformas da MMP-2 (ativa

55kDa, pró 60kDa e pré 66kDa) quando comparados aos animais C57BL/10 (Figura 17). A

suramina aumentou significativamente a atividade da MMP-9 (p≤0,05) e não alterou a

MMP-2 (p≥0,05) (Figura 17).

38

Figura 17: A) Análise zimográfica das metaloproteinases 2 e 9 no músculo cardíaco de

camundongos controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx tratados com

suramina (mdx-sur). B) Atividade da MMP-9 (100kDa). C) Atividade de MMP-2 em suas

três isoformas: MMP-2 pré (66 kDa), MMP-2 pró (60 kDa) e MMP-2-ativa (55 kDa). (*)

Diferença significativa quando comparada aos camundongos C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA,

pós-teste Bonferroni). (#) Diferença significativa quando comparada aos camundongos

mdx-sal (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni).

No diafragma de animais mdx-sal ambas as metaloproteinases encontram-se com

atividade aumentada (p≤0,05) quando comparadas aos animais C57BL/10 (Figura 18). O

tratamento com suramina elevou significativamente a atividade de MMP-9 e reduziu a

atividade de MMP-2 (p≤0,05) (Figura 18).

39

Figura 18: A) Análise zimográfica das metaloproteinases 2 e 9 no músculo diafragma de

camundongos controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx tratados com

suramina (mdx-sur). B) Atividade da MMP-9 (100kDa). C) Atividade de MMP-2 em suas

três isoformas: MMP-2 pré (66 kDa), MMP-2 pró (60kDa) e MMP-2-ativa (55kDa). (*)




40

4.9 Apresentação numérica dos resultados

4.9.1 Western blotting

CORAÇÃO DIAFRAGMA

C57BL/10 Mdx-sal Mdx-sur C57BL/10 Mdx-sal Mdx-sur

P2Y2 4,26±1,38 9,05±1,38* 5,23±1,23# 1,10±0,81 3,55±1,42* 2,30±0,99*#

TRPC1 2,07±0,54 2,77±0,46* 2,11±0,62# 1,23±0,23 2.26±0.27* 1,33±0,31#

CSQ-C 2,43±0,78 1,92±0,30 2,07±0,95

CSQ-E 1,02±0,20 0,49±0,17* 0,95±0,27#

cTn-I 3,94±0,66 12,71±2.59* 4,21±2.24#

b-DG 11±3,04 6.59±2,66* 9.91±3,38# 1,20±0,40 0,99±0,27 1,18±0,09

MMP-9 2,61±0,23 4,14±0,57* 4,16±0,92* 1,06±0,02 1,64±0,15* 2,14±0,44*#

TIMP-1 1,86±0,78 3,99±0,52* 8,43±3,58*# 1,10±0,20 2,60±0,96* 6,93±2,11*#

MMP-2 2,48±0,27 4,13±1,71* 4,81±1,62* 1,26±0,87 2,39±0,88* 2,50±0,89*

TIMP-2 3,76±1,08 7,23±1,34* 10,26±3,76*# 3,09±1,77 7,66±3,03* 17,75±3,83*#

Tabela 1: Dados números obtidos em análises de Western blotting do receptor purinérgico

P2Y2 (P2Y2), canal de cálcio do tipo SAC (strech activated channel – TRPC1),

calsequestrina cardíaca (CSQ-C) e calsequestrina esquelética (CSQ-E), troponina cardíaca

(cTn-I), beta-distroglicana (b-DG), metaloproteinases -2 e -9 (MMP-2, MMP-9) e

inibidores teciduais de metaloproteinases -1 e -2 (TIMP-1 e TIMP-2) nos músculos


sal) e mdx tratados com suramina (mdx-sur). (*) Diferença significativa quando comparada

aos camundongos C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni). (#) Diferença

significativa quando comparada aos camundongos mdx-sal (p≤0,05, ANOVA, pós-teste

Bonferroni).

41

4.9.2 Cálcio total

C57BL/10 Mdx-sal Mdx-sur

CORAÇÃO 86,47±9,33 175,01±30,29* 106,99±15,39*#

DIAFRAGMA 137,87±26,78 208,90±49,44* 146±9,58*#

Tabela 2: Dados números obtidos na análise de determinação de cálcio total nos músculos


sal) e mdx tratados com suramina (mdx-sur). (*) Diferença significativa quando comparada

aos camundongos C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni). (#) Diferença


Bonferroni).

4.9.3 CK-MB

C57BL/10 Mdx-sal Mdx-sur

CK-MB 40,45±12,13 125,51±20,63* 42,60±19,67*#

Tabela 3: Dados números obtidos na análise de creatina quinase cardíaca (CK-MB) no

plasma de camundongos controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx

tratados com suramina (mdx-sur). (*) Diferença significativa quando comparada aos

camundongos C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni). (#) Diferença


Bonferroni).

42

4.9.4 Zimografia

CORAÇÃO DIAFRAGMA

C57BL/10 Mdx-sal Mdx-sur C57BL/10 Mdx-sal Mdx-sur

MMP-9 1,28±0,24 2,81±0,46* 7,25±1,80*# 0,73±0,21 3±0,71* 9,71±1,75*#

MMP-2

ativa

0,62±0,18 1,19±0,43* 1,42±0,73* 0,77±0,14 11,84±3,24* 5.57±1,78*#

MMP-2

pró

15,12±1,99 24,83±1,81* 24,53±7,26* 9,28±1,73 17,28±5.51* 9,37±2,79*#

MMP-2

pré

3,42±1,93 9,80±4,63* 10,85±6,49* 5,62±1,68 14,61±2,37* 11,08±2,40*#

Tabela 4: Dados números obtidos na análise zimográfica das metaloproteinases -2 e -9

(MMP-2 e MMP-9) nos músculos cardíaco e diafragma de camundongos controle

C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx tratados com suramina (mdx-sur). (*)




5 DISCUSSÃO

5.1 Suramina diminui os níveis do receptor purinérgico P2Y2 nos músculos cardíaco e


No presente estudo, considerando o antagonismo da suramina a receptores

purinérgicos, e o envolvimento destes receptores em outras patologias cardíacas

(VASSORT, 2001; ERLINGE e BURNSTOCK, 2008; BRAUN et al., 2010; LU e INSEL,

2014; BURNSTOCK e RAVELIC, 2014) investigamos o envolvimento do receptor P2Y2

na cardiomiopatia de camundongos mdx. Este é o primeiro estudo que sugere o

envolvimento da sinalização purinérgica, especificamente do receptor P2Y2, na

43

cardiomiopatia distrófica. Análises por western blotting revelaram a presença do receptor

P2Y2 tanto no animal controle quanto no camundongo mdx do músculo cardíaco distrófico,

indicando envolvimento da sinalização purinérgica no sistema cardiovascular de animais

modelos da DMD. Dados obtidos no músculo diafragma de camundongos mdx também

revelaram envolvimento do receptor P2Y2 na distrofinopatia de músculos esqueléticos na

DMD.

Ao compararmos os níveis de P2Y2 do camundongo distrófico ao animal controle,

observamos elevados níveis do receptor tanto no músculo cardíaco quanto no diafragma de

animais de 11 meses de idade. Isso indica que, assim como os receptores P2X (IWATA et

al., 2007), o receptor P2Y também encontra-se em níveis elevados no animal distrófico. È

possível que estes receptores encontrem-se em níveis elevados devido a maior liberação de

ATP e UTP decorrente do estiramento mecânico e ou inflamação que ocorrem na DMD

devido à ausência da distrofina (ENGEL et al., 1994; IWATA et al., 2007).

Estudos com cultura de fibroblastos cardíacos indicam o receptor P2Y2 como

ativador de fibroblastos (BRAUN et al., 2010). De fato, em estudo prévio observamos que

o coração de animais distróficos apresentam maior área de fibrose em relação ao controle

de mesma idade (DE OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013). Ainda, nossos dados revelam

níveis elevados de P2Y2 também no músculo diafragma distrófico. Acreditamos que, assim

como no músculo cardíaco, o receptor P2Y2 esteja implicado na resposta pró-fibrótica do

músculo diafragma, que em comparação ao animal controle apresenta extensa área de

fibrose (DE OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013).

O tratamento com suramina reduziu significativamente os níveis do receptor

purinérgico P2Y2 em ambos os músculos estudados. Possivelmente isso tenha ocorrido

devido a suramina atuar como um antagonista competitivo pelo mesmo sítio de ligação ao

receptor como previamente observado em cultura de células (CHARLTON et al., 1996),

impedindo assim a ligação de ATP e UTP ao receptor (Figura 19). Esses achados sugerem

o potencial efeito da suramina no controle da formação de fibrose nos músculos cardíaco e

esquelético através do receptor P2Y2.

44

Figura 19: Representação esquemática da fibra muscular cardíaca distrófica. O influxo de

cálcio (Ca2+

) por meio de canais do tipo SAC (strech activated channel) e tipo-L ocasionam

o aumento da concentração de cálcio intracelular Ca2+

i e ativa proteases cálcio-

dependentes levando a degradação de proteínas contráteis, aumento da creatina quinase

cardíaca (CK-MB) e troponina cardíaca (cTn-I) e consequente mionecrose. A ligação da

45

adenosina trifosfato (ATP) ao sítio de ligação do receptor purinérgico P2Y2, que por sua

vez está acoplado à proteína G, também ativa os canais do tipo SAC, contribuindo para o

influxo de cálcio. A suramina (sur) ao se ligar ao receptor P2Y2 impede que este atue sobre

os canais de cálcio. Dessa forma, a Ca2+

i,CK-MB e cTn-I diminuem e a fibra muscular é

protegida do processo de mionecrose.

5.2 Suramina diminui o cálcio total e os níveis de TRPC1 nos músculos cardíaco e


No presente trabalho, realizamos a dosagem total do Ca2+

nos músculos cardíaco e

diafragma, através de espectrometria de plasma, tal como descrito em trabalhos anteriores

(YOSHIDA et al., 2006; MATSUMURA et al., 2011; PEREIRA et al., 2014). A

concentração de Ca2+

total nos músculos do grupo mdx está aumentada quando comparada

ao controle (GLESBY et al., 1988; DUNN e RADDA, 1991; REEVE et al., 1997;

YOSHIDA et al., 2006; MATSUMURA et al., 2011). Portadores da DMD também

apresentam níveis elevados de Ca2+

total (BERTORINI et al., 1982; JACKSON et al.,

1985).

Estudo anterior demonstrou que os níveis de Ca2+

total estão elevados nos músculo

cardíaco e diafragma de camundongos mdx em todas as idades e não se correlaciona com a

mionecrose (DUNN e RADDA, 1991). Entretanto, posteriormente, atribuiu-se a perda da

homeostase do cálcio em músculos esqueléticos de camundongos mdx à fase de

degeneração muscular, visto que mdx com 3 meses de idade, apresentavam redução do

conteúdo total de Ca2+

em comparação a camundongos mais jovens (REEVE et al., 1997).

De fato, o diafragma de camundongos mdx com 36 dias de vida, fase na qual este músculo

passa por um pico de degeneração, apresenta níveis elevados de Ca2+

total (MATSUMURA

et al., 2011; PEREIRA et al., 2014).

No presente estudo, realizado em fase mais tardia da distrofia no camundongo mdx,

na qual o animal encontra-se com 11 meses de idade, estando o diafragma com extensa área

de fibrose (aproximadamente 32% de área total do músculo) e o músculo cardíaco

apresentando comprometimento tais como alterações eletrocardiográficas e fibrose, (DE

46

OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013) também observamos níveis elevados de Ca2+

total

corroborando com os achados anteriores realizados em diferentes idades (DUNN e

RADDA, 1991). Nossos dados sugerem que as alterações na homeostase do Ca2+

persistem

nos estágios mais avançados da doença e não são apenas consequência secundária ao

processo de degeneração muscular.

O TRPC1 regula a entrada de Ca2+

(FRANCO-OBREGON JR E LANSMAN, 1994;

GERVÁSIO et al., 2008), pode ser ativado por estiramento da membrana (MAROTO et al.,

2005) e causar alteração na homeostase de Ca2+

(VANDERBROUCK et al., 2002;;

WILLIAMS e ALEN, 2007). Sua atividade pode ser regulada por diversas proteínas, dentre

elas as caveolinas (BRAZER et al., 2003). A caveolina-3, especificamente expressa em

músculos esqueléticos, cardíaco e lisos, está co-localizada com a distrofina (SONG et al.,

1996) e aumentada na DMD e no camundongo mdx (BONILLA et al., 1981; REPETTO et

al., 1999; GERVÁSIO et al., 2008).

No presente estudo encontramos níveis elevados de TRPC1 em ambos os músculos

cardíaco e diafragma ao compararmos mdx-sal e grupo controle. O músculo diafragma de

camundongos mdx-sal apresentou níveis maiores de TRPC1 (20%) em relação ao músculo

cardíaco. Possivelmente isso se deve ao fato do músculo diafragma no modelo

experimental ser o mais acometido, se assemelhando ao paciente DMD (STEDMAN et.,

1991; LOUBOUTIN et al., 1993).

O aumento dos níveis de TRPC1 em ambos os músculos estudados pode ser

decorrente de alterações na caveolina-3, consequentemente predispondo ao influxo de

cálcio e contribuindo para a patogênese nos músculos estudados. Adicionalmente, canais

TRPC1 também podem ser estimulados por EROs (ALLEN et al., 2010). Considerando que

fibras musculares distróficas são susceptíveis as EROs (RANDO et al.,1998), estas

promovem a abertura desses canais permitindo a entrada de Ca2+

(ALLEN et al., 2010).

A suramina reduziu significativamente os níveis de Ca2+

total e TRPC1 em ambos

os músculos estudados possivelmente por ação antagonista nos receptores purinérgicos

(IWATA et al., 2007; NAKAMURA et al., 2011). Estes receptores são ativados por ATP

(ERLINGE e BURNSTOCK 2008; BRAUN et al., 2010) e participam do processo de

regulação da homeostase do Ca2+

em praticamente todas as células (NORTH 2002).

47

Também tem sido demonstrado ativação de canais da família TRPC por ATP (ALVAREZ

et al., 2008), uma vez que esta promove aumentos transitórios na concentração de Ca2+

intracelular (NAKAMURA et al., 2011). Dessa maneira, alterações nas funções desses

receptores tem importante papel no influxo de íons Ca2+

em músculos de camundongos

distróficos e, portanto, podem ter implicações na patogênese da DMD (YEUNG et al.,

2006). Nossos achados revelaram redução significativa dos níveis do receptor P2Y2 em

ambos os músculos estudados. Este receptor, além de participar da resposta pró-fibrótica,

induz o aumento do cálcio, TGB-β1 e IL-6 (BRAUN et al., 2010) (Figura 19).

5.3 Suramina não altera os níveis de CSQ-C e restaura os níveis de CSQ-E

A calsequestrina é a principal proteína responsável pelo tamponamento do Ca2+

com

alta capacidade de armazenamento do íon no retículo sarcoplasmático. Distingue-se em

duas formas: a cardíaca e a esquelética. A forma cardíaca é expressa somente nos músculos

cardíacos e nos músculos esqueléticos de contração lenta (25% do total de calsequestrina) e

não é observada em fibras de contração rápida (ARAI et al., 1992; BIRALD et al.,1992;

DAMIANI e MARGRETH, 1994). A forma esquelética é expressa nas fibras esqueléticas

de contração rápida e de contração lenta e é ausente no coração.

No presente estudo, em animais idosos, não observamos alteração nos níveis de

calsequestrina cardíaca em relação ao grupo controle embora nossos dados tenham

apresentado uma tendência a redução no grupo distrófico. Em animais mdx jovens, a

calsequestrina cardíaca também não encontra-se reduzida no coração (MATSUMURA et

al., 2009; PERTILLE et al., 2010). Entretanto, apesar de não agir sobre a calsequestrina

cardíaca, proteína responsável pelo tamponamento do cálcio (YANO e ZARAIN-

HERZBERG, 1994), o tratamento com suramina atuou positivamente nos níveis de Ca2+

total e TRPC1 o que contribuiu para a diminuição da mionecrose e fibrose no músculo

cardíaco de camundongos mdx idosos após o tratamento (DE OLIVEIRA MOREIRA et al.,

2013).

No músculo diafragma observamos redução nos níveis de calsequestrina esquelética

entre o grupo mdx-sal e o controle. Dados contrastantes foram previamente observados em

48

estudos que obtiveram redução nas proteínas semelhantes à calsequestrina CLP-150, CLP-

170 e CLP-220 em mdx, mas não encontraram diferença na calsequestrina de músculos

normais e mdx (CULLIGAN et al., 2002). Outros estudos, em mdx jovens também

encontraram redução da calsequestrina esquelética (MATSUMURA et al., 2009;

PERTILLE et al., 2010; PEREIRA et al., 2012).

O tratamento com suramina reestabeleceu os níveis da calsequestrina esquelética,

concomitantemente reduziu os níveis de Ca2+

total e TRPC1. Essa combinação de efeitos da

suramina no músculo diafragma de animais distróficos sugere a capacidade da droga em

atuar, direta ou indiretamente, no tamponamento do cálcio, bem como em canais de Ca2+

proporcionando o reestabelecimento da homeostase do íon e desta forma diminuir a

mionecrose e fibrose como previamente observado (DE OLIVEIRA MOREIRA et al.,

2013).

5.4 Suramina diminui a mionecrose no músculo cardíaco distrófico

Todos os processos envolvidos no crescimento e metabolismo das células

necessitam de energia. A produção, transporte, conversão e utilização de energia das

células são processos fundamentais que acontecem por vias metabólicas que envolvem um

grande número de reações catalisadas por enzimas, como por exemplo, a creatina quinase

(WALLIMANN et al., 1992).

No presente trabalho, observamos altos índices de CK-MB indicativo de

mionecrose. Esses índices foram consideravelmente reduzidos (66%), se aproximando ao

grupo controle sugerindo diminuição da mionecrose nesses animais, de acordo com nossos

achados prévios de redução de fibras positivas ao azul de Evans no coração de

camundongos mdx tratados com suramina (DE OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013).

Adicionalmente, observamos altos níveis de cTn-I no grupo mdx-sal (69% maior em

relação ao grupo controle). A elevação dos níveis de cTn-I no grupo mdx-sal pode ser

decorrente da ação das espécies reativas de oxigênio (EROs). As EROs aumentam a

expressão da cTn-I em células cardíacas, como previamente observado em estudos da

cardiomiopatia em ratos diabéticos (KU et al., 2011) e estão envolvidas na cardiomiopatia

49

dilatada no camundongo mdx (WILLIAMS e ALLEN, 2007). Além disso, sabe-se que a

PKA, uma proteína-quinase que fosforila a cTn-I (MURPHY, 2004), promove a

fosforilação de diversas outras proteínas, inclusive as envolvidas com os canais de Ca2+

tipo-L e dos receptores de rianodina do retículo sarcoplasmático (LAYLAND et al., 2005).

Esses canais tem sua atividade alterada na distrofia e estão envolvidos no influxo de Ca2+

e

consequentemente com a mionecrose.

Estudos sugerem que a depleção genética da fosforilação por PKA em receptores de

rianodina atenuam a cardiomiopatia no camundongo mdx, uma vez que a PKA está

associada à alteração da homeostase do Ca2+

(SARMA et al., 2010). Possivelmente, a

redução dos níveis de cTn-I pela suramina esteja relacionada à capacidade da droga em

inibir seletivamente a fosforilação pela PKA, como previamente observado em estudo com

vírus da hepatite B in vitro (OKABE et al., 2006) e/ou por aumentar a abertura e/ou a

condutância dos receptores de rianodina (RyRs) cardíacos, provavelmente competindo com

a calmodulina (CaM) pelo mesmo sítio de ligação (O’NEILL et al., 2003; HILL et al.,

2004).

Dessa maneira, é possível atribuir a suramina a capacidade de reduzir a mionecrose

do músculo cardíaco distrófico, possivelmente por atuar positivamente sobre os níveis de

cálcio total e TRPC1, consequentemente em decorrência de sua ação antagonista a

receptores purinérgicos P2 (IWATA et al., 2007; NAKAMURA et al., 2011) (Figura 19).

5.5 Suramina auxilia na manutenção da estrutura do complexo distrofina-

glicoproteínas no músculo cardíaco impedindo a redução dos níveis de b-DG

Alterações na expressão de proteínas do CDG e instabilidade do sarcolema são

consequências da ausência da distrofina (DOWLING et al., 2003). No músculo cardíaco, a

ausência da distrofina é claramente associada a alterações necróticas, inflamação, aumento

do tecido adiposo, fibrose, taquicardia e deficiências das propriedades contráteis no mdx

(SAPP et al., 1996; BIA et al., 1999; CHU et al.; 2002; WEHLING-HENRICKS et al.,

2005). Em estudo prévio, constatamos áreas de inflamação e fibrose no músculo cardíaco

50

de camundongos mdx com 11 meses de idade e alterações eletrocardiográficas (DE

OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013).

Em pacientes DMD, os componentes do CDG estão diminuídos ou ausentes no

sarcolema quando comparados a músculos normais (ERVASTI et al., 1990), sugerindo que

a distrofina é essencial para a correta formação do CDG. Em analogia ao paciente DMD, o

camundongo mdx também apresenta diminuição das glicoproteínas associadas à distrofina

(LOHAN et al., 2005; LEWIS et al., 2010). Em contrapartida, estudo recente apontou que a

b-DG, a α-distroglicana e a γ-distroglicana, são expressas em níveis normais no coração do

mdx, uma vez que a utrofina, proteína homóloga a distrofina, é expressa no músculo

cardíaco e consequentemente contribui para a manutenção do CDG no coração distrófico

(SHARPE et al., 2013).

No presente estudo observamos redução de 40% dos níveis de b-DG no músculo

cardíaco no grupo mdx-sal em relação ao grupo controle em animais idosos. Redução

significativa também foi encontrada em estudos com animais jovens (MATSUMURA et

al., 2009). Os níveis de b-DG no músculo cardíaco foram aumentados após tratamento com

suramina, sugerindo seu papel na manutenção da estrutura do complexo distrofina-

glicoproteínas. A MMP-9, uma metaloproteinase de matriz, quebra a b-DG (YAMADA et

al., 2001; ZHONG et al., 2006; MICHALUK et al., 2007). Dessa maneira, redução da

atividade da MMP-9 poderia explicar em parte o aumento dos níveis da b-DG como

previamente observado no músculo diafragma de camundongos mdx de 7 meses tratados

com suramina (TANIGUTI et al., 2012). Entretanto, em animais mais idosos e tratamento

em longo prazo não observamos alteração dos níveis desta MMP, embora a sua atividade

tenha sido aumentada pela suramina. Isso sugere que há outros fatores contribuintes para o

aumento dos níveis da b-DG além da redução da MMP-9. Estudo recente, em carcinoma de

adenóide cístico salivar atribuiu-se o restabelecimento da b-DG à regulação das TIMPs

(HAO et al., 2013). No presente estudo, observamos que a suramina, concomitantemente ao

aumento da atividade da MMP-9, aumentou os níveis da TIMP-1, seu inibidor tecidual.

Uma vez que atribui-se ao balanço entre MMPs e TIMPs a manutenção da integridade da

MEC (PAGE-McCAW et al., 2007; SCHULZ et al., 2007; AU et al., 2011) é possível que

no coração de animais distróficos tratados com a suramina, o aumento das TIMPs além de

51

auxiliar no remodelamento fisiológico da MEC, atue de maneira a impedir a redução dos

níveis de b-DG.

No músculo diafragma, não observamos alterações significativas nos níveis de b-

DG com o tratamento. Em contrapartida, estudo anterior utilizando suramina em animais de

7 meses tratados durante 6 semanas, verificou o reestabelecimento dos níveis de b-DG

mediante tratamento com o antifibrótico, em conjunta redução da atividade da MMP-9

(TANIGUTI et al., 2012). Em nossos estudos, com animais idosos (11 meses) e tratamento

em longo prazo, observamos aumento da atividade e níveis da MMP-9 no diafragma. È

possível, que este aumento esteja relacionado ao aumento dos níveis de TGF-β1 observados

no músculo diafragma de animais distróficos com 11 meses de idade (DE OLIVEIRA

MOREIRA et al., 2013), uma vez que esta citocina pode induzir a expressão de MMPs

(NAGASE et al., 2006; CHEN et al., 2011; AU et al., 2011). Adicionalmente, sabe-se que a

suramina não altera a produção de TGF-β1 e sim bloqueia seus receptores (DIJKE e HILL,

2004). Concomitantemente, a TIMP-1, inibidor tecidual endógeno da MMP-9, teve seus

níveis aumentados pela suramina. Acreditamos que esse aumento, ocorrido em semelhante

proporção ao aumento da MMP-9, se deu na tentativa de manter o balanço que garante a

integridade do tecido, fazendo com que a MMP-9 não degrade a MEC, mesmo

encontrando-se em altos níveis.

5.6 Efeitos da suramina na atividade da MMP-9 e MMP-2 e níveis das MMP-9, MMP-

2, TIMP-1, TIMP-2 nos músculos cardíaco e diafragma distróficos

A atividade e expressão de várias MMPs estão desreguladas em músculos

distróficos de camundongos mdx (KUMAR et al., 2010; MIYASAKI et al., 2011). Nossos

estudos também apontam essa desregulação tanto no músculo cardíaco quanto no

diafragma quando comparamos camundongos mdx-sal e C57BL/10 para ambas MMP-9 e

MMP-2 corroborando com estudos prévios (VON MOERS et al., 2005; ZANOTTI et

al.,2007; LI et al., 2009; KUMAR et al., 2010; TANIGUTI et al., 2012).

O aumento da atividade e níveis das MMPs pode ser dependente da ativação de

receptores purinérgicos (GU e WILEY,2006), ou está relacionada com a presença de

52

citocinas pró-inflamatórias e pró-fibróticas como o cTGF e o TGF-β1 (NAGASE et al.,

2006; DESCHAMPS e SPINALE, 2006; CHEN et al., 2011; AU et al., 2011), ambos

encontrados em níveis elevados em músculos distróficos (GROUNDS et al., 2008;

TANIGUTI et al., 2011, DE OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013)

No presente estudo, o tratamento com suramina aumentou a atividade da MMP-9 e

não alterou seus níveis no músculo cardíaco embora previamente tenha reduzido a fibrose

cardíaca (DE OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013). É provável que a redução da fibrose

cardíaca tenha ocorrido devido ao conjunto de ações da droga na proteção contra

mionecrose, reduzindo a CK-MB e níveis de cálcio total e TRPC1, bem como atuando na

redução dos níveis do receptor purinérgico P2Y2, diretamente envolvido na resposta pró-

fibrótica em fibroblastos cardíacos (BRAUN et al., 2010). Adicionalmente, a suramina

aumentou proporcionalmente a TIMP-1, inibidor tecidual endógeno da MMP-9.

Acreditamos que esse aumento tenha ocorrido com o objetivo de se manter o equilíbrio

entre a MMP-9 e TIMP-1, uma vez que o desequilíbrio entre MMPs e TIMPs contribui para

o remodelamento da MEC (PAGE-MCCAW et al., 2007; SCHULZ et al., 2007; AU et al.,

2011). Além disso, estudos com células C2C12 apontam que o aumento da expressão da

MMP-9 é favorável à migração celular miogênica (MORGAN et al., 2010).

Na DMD, o papel individual das MMPs parece ser dependente da fase de

progressão da doença (FINGLETON, 2008), se diferenciando entre os músculos

esqueléticos e também em relação à idade (BANI et al., 2008), sugerindo dessa maneira

que a inibição das MMPs pode apresentar consequências vantajosas e desvantajosas

(FINGLETON, 2008) uma vez que têm papel fundamental na MEC em ambos

remodelamento fisiológico e patológico (PAGE-McCAW et al., 2007; FINGLETON,

2008).

Estudo recente demonstrou que o tratamento de 6 semanas com suramina em

animais de 7 meses de idade diminui a atividade da MMP-9 (TANIGUTI et al., 2012). Em

contrapartida, observamos que em animais de 11 meses de idade e submetidos a tratamento

em longo prazo com a mesma droga, tanto a atividade quanto os níveis de MMP-9

encontram-se aumentados. De fato é possível que as MMPs se diferenciem em relação à

idade (BANI et al., 2008). A suramina, também no músculo diafragma, aumentou

53

proporcionalmente os níveis da TIMP-1 auxiliando o equilíbrio entre as MMPs e TIMPs,

provavelmente favorecendo o remodelamento fisiológico. Entretanto, há relatos de que a

inibição da MMP-9 melhora a patogênese do músculo esquelético e a regeneração em

camundongos mdx (LI et al., 2009). Em estudo anterior, demonstramos que a suramina

reduziu significativamente a mionecrose, inflamação e fibrose no músculo diafragma (DE

OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013). A melhora na patologia do diafragma pode ser

decorrente além da ação antifibrótica da droga, à sua ação nos níveis e tamponamento de

cálcio e consequentemente na mionecrose. Além disso, a suramina reduziu

significativamente os níveis do P2Y2 também no músculo diafragma.

Semelhante a MMP-9, a MMP-2 também tem sido encontrada em altos níveis em

miofibras do modelo experimental da DMD (KHERIF et al., 1999; LI et al., 2009). A

MMP-2 é considerada regulador positivo do crescimento de fibras em regeneração no mdx

(MIYAZAKI et al., 2011). Nossos achados indicam que a suramina tem pouca ou nenhuma

ação sobre a MMP-2 e que as MMPs parecem agir diferentemente em ambos os músculos

estudados.

54

CONCLUSÃO

O presente trabalho sugere que o receptor purinérgico P2Y2 está envolvido na

cardiomiopatia distrófica de camundongos mdx.

O antagonismo ao receptor purinérgico P2Y2 desencadeou alterações importantes

nos níveis desse receptor, bem como na via de sinalização do cálcio (possivelmente

melhorando o tamponamento deste íon ao reduzir os níveis de Ca2+

total e componentes dos

canais do tipo SACs, como o TRPC1), na modulação da matriz extracelular (promovendo o

equilíbrio entre MMPs e TIMPs) e na manutenção da estrutura do complexo distrofina-

glicoproteínas no músculo cardíaco distrófico restaurando os níveis de beta-distroglicana.

Em relação a distrofinopatia do músculo diafragma, concluímos que também há

envolvimento do receptor P2Y2 e que a suramina parece atuar de forma semelhante quanto a

via de sinalização do cálcio e modulação da matriz extracelular.

Os resultados obtidos indicam que a suramina, ao reduzir os níveis de receptores

purinérgicos e por ser uma droga já utilizada em outras patologias humanas, com doses e

efeitos colaterais estabelecidos, apresenta potencial papel na terapia da cardiomiopatia na

DMD, merecendo atenção em estudos clínicos da doença. Ainda, é importante ressaltar que

o desenvolvimento de novos antagonistas de receptores purinérgicos é de relevância para

novas terapias da DMD.

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ANEXO – COMISSÃO DE ÉTICA: CERTIFICADO

mecanismos de aÇÃo da suramina na...

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