módulo i: moléculas pequeñas. módulo ii:...

CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyN-INTI

Docente a cargo: SANTAGAPITA, Patricio

CEBI_E1_3 : Western y Southern Blots

Materia de Especialización CEBI_E1Técnicas de análisis en biotecnología

Módulo I: Moléculas pequeñas. Módulo II: Macromoléculas.

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Western Blot

Técnicas de Análisis-Macromoléculas

Es una técnica que se utiliza para identificar y localizar proteínas en base a su capacidad para unirse a anticuerpos específicos.

Es utilizado en biología molecular, bioquímica e inmunogenética para la detección de proteínas en una muestra.

4 PASOS:

1) Utiliza electroforesis en geles de poliacrilamida. Caso más común: separar proteínas desnaturalizadas por peso molecular (SDS PAGE).

2) Las proteínas son transferidas desde el gel hacia la membrana (generalmente nitrocelulosa), donde permanecen fijas.


Western Blot


3 y 4) Luego las proteínas son detectadas utilizando anticuerposespecíficos para dicha proteína.

Esquema


Western Blot


SDS-PAGE:- Separo los complejos de proteínas en individuales- Separo las proteínas por tamaño

Western Blot Análisis:- Transferencia de las proteínas a una membrana de nitrocelulosa- Son más estables y permanentes- Identifiicación de proteínas por immunodetección: uso de anticuerpos especificos contra la proteína de interés

BIORAD ©

Tandem


Western Blot


Las electroforesis más utilizadas son las que utiliza geles depoliacrilamida, SDS-PAGE o IEF.

La separación de las proteínas de la muestra puede ser por su puntoisoeléctrico (pI) o por su pesomolecular (MW).

Por lo tanto el tipo de separacióndepende del tratamiento de lamuestra y de la naturaleza del gel.


Western Blot


Preparación de las muestras:

Las muestras deberán ser tratadas según su tipo.

Si fuese de un cultivo o tejido sufrirán pasos de lisis celular y solubilización de proteínas, centrifugación y filtración si fuese necesario.

Luego de la extracción se prepara la muestra según la electroforesis a utilizar.


Western Blot


PASOS WESTERN

a) Preparación del sistema de blotting y transferencia

b) Bloqueo de la membrana (de nitrocelulosa)

c) Incubación con soluciones de anticuerpos

d) Desarrollo de color del blot


Western Blot


Preparación para la transferencia de las

proteínas a la membrana (de nitrocelulosa) Corte del gel

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Western Blot


Transferencia:

Para hacer accesibles las proteínas a la detección de los anticuerpos, éstas deberán ser transferidas desde el gel hacia una membrana. Las más utilizadas son las de nitrocelulosa o polyvinylidene difluoride (PVDF). Estas son elegidas por su propiedad de pegado de proteínas no especifico, basado en interacciones hidrofóbicas e interacción de cargas.

2 métodos generales:- capilaridad- electrotransferencia


Western Blot


Electrotransferencia.

Se usa corriente eléctrica para impulsar las proteínas del gel hacia la membrana. Corren hacia el polo positivo.

El sandwich del gel, membrana y papeles de filtro (o goma espuma) se coloca entre dos planchas metálicas, conectadas respectivamente a los polos.


Western Blot


Esquema de la celda de Trans-Blot

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Western Blot


Transferencia de proteínas desde el

gel hacia la membrana

30 minutes100V

Buffer para el blotting1x Tris-glicina con

20% etanolC

orriente eléctrica

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Western Blot


Preparando la transferencia electroforetica

Tips

Se puede adicionar una unidad congelada en el tanque para paliar el aumento de temperatura (Bio-Ice cooling unit)

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Uso de barra de agitación magnética para mantener la distribución de iones y temperatura


Western Blot


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Western Blot


Transferencia x capilaridad:

La membrana se coloca sobre el gel y sobre este una pila de papeles de filtro.

El sandwich formado se sumerge en una solución buffer, que ingresa por capilaridad, llevándose la proteína a la membrana.

Demora mucho más tiempo que la electrotransferencia (overnight).

Nota: la nitrocelulosa es mas barata que el PVDF, pero mas frágil.


Western Blot


La uniformidad y eficiencia de transferencia se puede confirmar con colorantes como el Ponceau S.

Ponceau S es el más comúnmente utilizado por su alta sensibilidad, rápido teñido (5 min) y su solubilidad en agua lo que hace mas fácil su posterior desteñido.

Útil para nitrocelulosa, PVDF(reversible en ambos casos)


Western Blot


Bloqueo

Se debe prevenir la interacción entre el anticuerpo utilizado y lamembrana.

Para ellos, se incuba la membrana con una solución de proteínas (BSA, leche en polvo descremada-funciona muy bien y es económica-) que no serán detectadas por el anticuerpo y llenarán los espacios libres de la membrana evitando que interaccione el anticuerpo “inespecíficamente” con esta. Esto reduce el “ruido” del producto final dejando resultados más claros.


Western Blot


Bloqueo

Buffer de bloqueo: BSA 0,1-1% + Tween 20 0,005% - leche en polvo 3-5% + Tween 20 0,025-0,05%, Caseína, etc. (en buffer TBS o PBS, que mantiene el correcto pH y fuerza iónica)

Luego del bloqueo se realizan lavados para eliminar el exceso de proteína de bloqueo. Se realizan con TBS o PBS + Tween 20 0,05%.

TBS: Tris/Borate/salinePBS: Phosphate/Borate/saline


Western Blot


Detección:

Uso de anticuerpos como herramienta de diagnóstico

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Hoy en día hay compañías que se especializan en proveer anticuerpos (monoclonales y policlonales – éstos últimos son los más usados-) contra una gran cantidad de proteínas.


Western Blot


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1) La proteína de interés es enfrentada contra un anticuerpo especifico

1) Unión de un 2do anticuerpo contra el primero (no hay necesidad que sea específico). Posee enzima.

1) Detección por adición de sustrato de la enzima. Reacción colorimétrica/ quimioluminiscente.

3 pasos:

Proteínas en la membrana


Western Blot


Detección

Los anticuerpos se diluyen en la solución de bloqueo.

La incubación debe llevar una leve agitación, la temperatura puede variar, cuanto mayor sea se incrementará la unión tanto especifica (señal deseada) como no especifica (ruido).

Puede dejarse 1 h a T amb, también a 37C; u overnight en heladera, de preferencia con agitación (tb fciona sin).


Western Blot


Tomada de http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/Techniques/TechElectrophoresis.htm


Western Blot



Western Blot


1er anticuerpo: 0,5 - 5 g/ml

2do anticuerpo: dirigido a la porción “especie específico” (Fc) delanticuerpo primario

Otras opciones: ej. puede estar unido a biotina, o a enzimas tales como fosfatasa alcalina o peroxidasa

Los más utilizados son los unidos a peroxidasa, con los cuales se utiliza como sustrato alfa-cloronaftol (más barato y menos sensible), o reactivos quimioluminiscentes (se revela en una placa fotográfica)(ver catálogos)


Western Blot


Resultado: Western Blot

Si el Blot se hizo desde un gel no teñido

Si el Blot se hizo desde un gel teñido

Western Blot




Western Blot


Recomendaciones:

Algunos anticuerpos pueden reusarse (entre 1 y 3 veces, y según como están conservados-buffer, leche-), pero hay que definir según la técnica.

Agitación constante en las incubaciones, excepto en frío overnight.

Respetar tiempos y lavados. Es importante sacar el exceso de bloqueo y de anticuerpo para eliminar background.

Nitrocelulosa es mas barata pero mas frágil.

Sensibilidad: 0,1 ng.

No dejar burbujas de aire.


Western Blot


Recomendaciones y aplicaciones:

Identificación de la proteína (criterio de identidad).

Detección de agregados no muy degradados.

Alta concentración de albúmina puede interferir.

No es cuantitativo.

Permite diferenciar entre moléculas de mayor PM y agregados de la proteína.


Western Blot


Deteccíón de proteína CKK47 por SDS-PAGE y Western Blot


Southern Blot


Similar a la técnica descripta para Western

Se puede hacer tanto para geles de agarosa com poliacrilamida, pero precaución en el método de transferencia (electrotransferencia únicamente).

Paso 1: Como preparar y correr un gel de agarosa(How to Make and Run an Agarose Gel (DNA Electrophoresis))http://www.youtube.com/watch?v=2UQIoYhOowM

Paso 2: Procedimiento de Southern


Southern Blot


Membranas más comunes: nitrocelulosa (ojo, es frágil), nylon (positivas o negativas, permiten reuso)

Luego de la transferencia, se debe FIJAR el DNA a la membrana. Métodos más comunes: irradiación UV (para nylon) o “cocinado” (nitrocelulosa).

Brown, Encyclopedia of Life Sciences (2001) Nature Publishing Group


Southern Blot


Brown, Current Protocols in Molecular Biology (1999) 2.9.1-2.9.20

Ver capítulo de libro anexo (Brown, Current Protocols in Molecular Biology (1999) 2.9.1-2.9.20) donde se dan detalles de protocolos para transferencias en medio ácido o básico según polaridad de membrana.


Southern Blot


Procedimiento completo Southern blot

http://v.youku.com/v_show/id_XMjYwODM5MTY4.html

http://www.youtube.com/watch?v=NaDGkF16Jm8


Southern Blot


Revelado más comunes

-Radioactivos: Probe radioactiva – autoradiografia

-No radioactivos: quimioluminiscenica, colorimétrico (streptoavidina-biotina-enzima).

Los métodos de revelado más comunes no son los mismos que para Western


Southern Blot


Aplicaciones y selección de membrana

-Nylon retiene fragmentos hasta 50 nucleot, mientras nitrocelulosa, 500. (Ojo en análisis de fragmentos de DNA digeridos con enz. restricción)

-Para PCR: mejor nylon, pero se usa nitrocelulosa dada la alta cantidad de DNA de partida.

Principales aplicaciones: a) identificación de clones y localización de fragmento más pequeño conteniendo el gen de interés.

b) Mapeo RFLP (restriction fragment length polymorphism)(ver detalles en Brown, Encyclopedia of Life Sciences (2001) Nature Publishing Group)


Otros Blots


Existen los llamados Northern blot y “Eastern blot”.

Northern blot Se basa en la detección y separación de ARN a partir de geles de agarosa

(video de muestra del proceso http://www.dnatube.com/video/2999/Nouthern-Blot)

“Eastern blot”.Variante (y extensión) del Western blot. Se usa principalmente para analizar modificaciones post-traduccionales de proteínas (lipi-, glico-, fosfo-rilaciones). Polémica y no aceptaciones global del término.

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