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JÉSSICA SANTANA BERNACHI

MATURAÇÃO E FUNÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS

DERIVADAS DE MONÓCITOS DE CRIANÇAS E

ADOLESCENTES INFECTADOS PELO HIV

CAMPINAS

2014

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___________________________________________________________

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Ciências Médicas

JÉSSICA SANTANA BERNACHI

MATURAÇÃO E FUNÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DE

MONÓCITOS DE CRIANÇAS E ADOLESCENTES INFECTADOS PELO HIV

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da

Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos

exigidos para obtenção do Título de Mestra em Ciências, na

Área de Concentração em Saúde da Criança e do Adolescente.

ORIENTADORA: Profa. Titular Dra. Maria Marluce dos Santos Vilela

CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Taís Nitsch Mazzola

Campinas

2014

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA

DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA JÉSSICA

SANTANA BERNACHI E ORIENTADA PELA PROFA. DRA.

MARIA MARLUCE DOS SANTOS VILELA.

__________________________

Assinatura da Orientadora

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Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas

Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402

Bernachi, Jéssica Santana, 1990-

B456m Maturação e função de células dendríticas derivadas de monócitos de crianças e adolescentes infectados pelo HIV / Jéssica Santana Bernachi. -- Campinas, SP : [s.n.], 2014.

Orientador : Maria Marluce dos Santos Vilela. Coorientador : Taís Nitsch Mazzola. Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de

Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.

1. HIV. 2. Células dendríticas. 3. Criança. 4.

Adolescente. I. Vilela, Maria Marluce dos Santos,1947-. II. Mazzola, Taís Nitsch,1982-. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Monocyte-derived dendritic cell maturation and function from

HIV-infected children and adolescentes

Palavras-chave em inglês:

HIV

Dendritic cells

Child

Adolescent

Área de concentração: Saúde da Criança e do Adolescente

Titulação: Mestra em Ciências

Banca examinadora:

Maria Marluce dos Santos Vilela [Orientador]

Maria Notomi Sato

Ronei Luciano Mamoni

Data de defesa: 18-11-2014

Programa de Pós-Graduação: Saúde da Criança e do Adolescente

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RESUMO

A vacinação terapêutica com células dendríticas derivadas de monócitos (MDDC) têm sido

associada com o controle da carga viral em adultos infectados pelo HIV, mas os seus

efeitos em crianças não foram explanados. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi

avaliar a função das MDDC isoladas de crianças e adolescentes verticalmente infectados

pelo HIV sob terapia antiretroviral combinada.

Os pacientes foram recrutados no Ambulatório de Imunodeficiência Secundária Pediátrica

do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas, sendo 25 com carga viral

indetectável e 14 com carga viral ≥1000 cópias de RNA/mL. Além disso, 20 crianças e

adolescentes saudáveis participaram como controles. Monócitos obtidos do sangue

periférico foram cultivados durante seis dias com GM-CSF e IL-4 para a obtenção das

MDDC, as quais foram avaliadas por citometria de fluxo quanto à expressão de CD40,

CD80, CD83, CD86, DC-SIGN e HLA-DR. As MDDC foram pulsadas com HIV-1

inativado por aldritiol-2 e cocultivadas com linfócitos autólogos para avaliação da

expressão gênica e proteica de citocinas e da linfoproliferação HIV específica. Foram

avaliados também hemogramas, subpopulações de células dendríticas mielóides e

plasmocitóides e de linfócitos CD3, CD4 e CD8.

As MDDC dos pacientes infectados pelo HIV apresentaram um fenótipo semelhante aos

controles saudáveis e foram capazes de induzir a produção de citocinas do tipo Th1; no

entanto, crianças com carga viral ≥1000 cópias de RNA/mL apresentaram menor

linfoproliferação HIV-específica.

viii

Em geral, as MDDC de crianças verticalmente infectadas pelo HIV geradas in vitro foram

capazes de induzir resposta imune celular HIV específica, mostrando-se potenciais

candidatos para imunização terapêutica usando MDDC.

PALAVRAS-CHAVE: HIV; células dendríticas; criança; adolescente.

ix

ABSTRACT

Therapeutic vaccination with monocyte-derived dendritic cells (MDDC) has been

associated with viral load control in immunized HIV-infected adults, but its effects in

children were not explored yet. We aimed to evaluate the function of MDDC isolated from

vertically HIV-infected children and adolescents under combined antiretroviral therapy.

Patients were recruited at the Out-Patients Unit at the University of Campinas, which 25

patients had undetectable viral load and 14 patients had viral load ≥1000 RNA copies/mL.

In addition, 20 healthy children and adolescents served as controls. Monocytes obtained

from peripheral blood were cultured for six days with GM-CSF and IL-4 to get the MDDC,

which were assessed by flow cytometry for CD40, CD80, CD83, CD86, DC-SIGN and

HLA-DR expression. T cell proliferation and cytokine expression and production were

evaluated in cocultures of MDDC pulsed with aldrithiol-2-inactivated HIV-1 and

autologous lymphocytes. Hemogram, myeloid and plasmacytoid dendritic cells and CD3,

CD4 and CD8 lymphocytes were evaluated in the peripheral blood.

MDDC from HIV-infected children exhibited a similar phenotype to those in healthy

individuals and were able to induce a Th1-type cytokine production; however, T

lymphoproliferation was impaired in children with viral load ≥1,000 RNA copies/mL.

MDDC generated in vitro boosted HIV-specific cellular immune responses in vertically

HIV-infected children and could be potential candidates for MDDC therapeutic

immunization.

KEYWORDS: HIV; dendritic cells; child; adolescent.

x

xi

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1

HIV e AIDS ......................................................................................................................... 1

Transmissão vertical e profilaxia ........................................................................................ 2

HIV e AIDS em pacientes pediátricos ................................................................................ 3

Terapia antirretroviral ......................................................................................................... 7

Células dendríticas e vacinas terapêuticas .......................................................................... 9

2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 17

Objetivo geral .................................................................................................................... 17

Objetivos específicos ......................................................................................................... 17

3. MÉTODOS ................................................................................................................. 19

Populações estudadas ........................................................................................................ 19

População de pacientes e local do estudo ...................................................................... 19

Aspectos éticos .............................................................................................................. 20

Cálculo amostral ............................................................................................................ 21

População de controles saudáveis .................................................................................. 21

Coleta de sangue ................................................................................................................ 21

Hemograma ....................................................................................................................... 22

Carga viral de HIV ............................................................................................................ 22

Imunofenotipagem de linfócitos T .................................................................................... 22

Fenotipagem de células dendríticas plasmocitóides e mielóides ...................................... 23

Coculturas de MDDC e linfócitos ..................................................................................... 24

Isolamento das células mononucleares do sangue periférico ........................................ 24

xii

Obtenção em cultura de MDDC .................................................................................... 24

MDDC pulsadas com HIV inativado ............................................................................. 25

Separação e viabilidade de linfócitos ............................................................................. 26

Cocultivo de MDDC e linfócitos ................................................................................... 27

Produção de citocinas no sobrenadante ............................................................................. 27

Extração do RNAm e reação de transcrição reversa (cDNA) ........................................... 28

PCR quantitativo em tempo real ....................................................................................... 29

Linfoproliferação HIV específica ...................................................................................... 31

Análise estatística .............................................................................................................. 32

4. RESULTADOS .......................................................................................................... 33

População de estudo .......................................................................................................... 33

Hemograma, linfócitos CD3, CD4 e CD8 e carga viral .................................................... 35

Caracterização das subpopulações de células dendríticas do sangue periférico ............... 36

Caracterização das células dendríticas derivadas de monócitos ....................................... 38

Produção de citocinas no sobrenadante das culturas de MDDC ....................................... 42

Produção de citocinas no sobrenadante das coculturas de MDDC e linfócitos ................ 43

PCR quantitativo em tempo real ....................................................................................... 47

Linfoproliferação HIV específica ...................................................................................... 49

5. DISCUSSÃO .............................................................................................................. 51

6. CONCLUSÃO ............................................................................................................ 59

7. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 61

8. ANEXOS E APÊNDICES ......................................................................................... 73

xiii

Dedico este trabalho aos meus pais, Tito e Cida,

meus ídolos que, com amor e paciência, me

apoiam em todas as minhas decisões.

xiv

xv

AGRADECIMENTOS

A Deus, por se fazer tão presente em minha vida, por guiar meus passos, iluminar meus

pensamentos e pela parceria em desenvolver este mestrado comigo.

À Profa. Dra. Maria Marluce dos Santos Vilela, pela orientação, por abrir as portas de seu

laboratório, pela confiança a este trabalho e pela convivência acadêmica.

À minha co-orientadora Taís Mazzola, grande amiga, companheira, pela imensa paciência e

carinho diários, por acreditar em mim, pela disponibilidade, pelo incentivo à minha

carreira, pelas motivações e por compartilhar suas experiências comigo.

Ao Prof. Dr. Marcos Tadeu Nolasco da Silva, pela colaboração no desenvolvimento deste

trabalho.

À Dra. Telma Oshiro, pela colaboração na padronização do protocolo de diferenciação dos

monócitos.

Aos meus pais, Maria Aparecida Bernachi e José Domingos Bernachi, pelo amor, pela

compreensão, pelo cuidado, pela força, por estarem sempre comigo e por me fazer enxergar

sempre o lado bom de tudo. Amo vocês!

Aos meus irmãos Eleandro Bernachi e Fernando Bernachi, pela sabedoria, pelos exemplos,

pelas risadas e pela eterna amizade.

Ao meu querido sobrinho Gabriel Bernachi, por me lembrar que motivados por nossos

sonhos podemos ser o que quisermos, até mesmo super-heróis.

A todos meus tios e tias, primos e primas e demais familiares, pela motivação,

companheirismo e torcida em minha formação profissional.

Às companheiras Vanessa Ramalho, Beatriz Abramczuk, Vanessa Oya, Júlia Machado,

Caroline Natania, Lia Marega, Ana Luísa, Mariana Castelhano, Silvana Dalgé, os também

xvi

companheiros Vitor Macedo, Marcelo Ananias, Emanuel Borges e Paulo César e todos os

funcionários do Centro de Investigação em Pediatria (CIPED) por toda a ajuda, pelas

risadas diárias e pela amizade.

À equipe de Imunodeficiência Secundária do Ambulatório de Pediatria do Hospital de

Clínicas (HC) e à assistente social Márcia Gimenez, pela ajuda clínica, burocrática e pela

dedicação aos pacientes pediátricos de HIV/AIDS.

Aos amigos do Centro de Hematologia e Hemoterapia (Hemocentro), Ana Leda Longhini,

Irene Pereira dos Santos, Luís Gustavo Fernandes, pela colaboração e dicas científicas

durante o desenvolvimento do projeto.

Aos funcionários das Seções de Coleta, Hematologia e Imunologia da Patologia Clínica,

Laboratório de Pesquisa em AIDS e Hospital Dia, pela ajuda com as coletas de sangue e

exames.

Às minhas amigas Josiane Tonetti, Rafaella Lelis, Juliana do Valle, Thatiane Kanazawa,

Lilian Arzenares, Daiane Teófilo, por estarem comigo desde a graduação, pelas risadas e

pela torcida!

A todos os meus amigos do Treinamento de Liderança Cristã, por serem espelhos de Deus,

pelo incentivo, pela serenidade transmitida, pelo crescimento espiritual e pessoal.

Ao Prof. Dr. Jörg Kobarg, Dra. Gabriela Meirelles e todos os amigos do LNBio, onde eu

aprendi o que é pesquisa científica, pelos preciosos ensinamentos que levarei por toda vida.

Ao meu namorado, Felipe Florindo, pelo amor infinito, pelo carinho, pela paciência, pela

motivação, pela ajuda espiritual, por ouvir os meus lamentos e principalmente por estar

sempre do meu lado.

xvii

Aos pacientes do ambulatório de Imunodeficiências Secundárias do Hospital de Clínicas da

Unicamp, seus responsáveis e todas as demais crianças que participaram deste trabalho.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), por conceder minha

bolsa de mestrado (Processo Fapesp: 2012/06525-5) e suporte financeiro para o

desenvolvimento deste projeto (Auxílio Pesquisa: 2010/16513-9).

Ao curso de Pós Graduação em Saúde da Criança e do Adolescente pelo apoio.

À Universidade Estadual de Campinas, pela oportunidade de realização deste trabalho.

xviii

xix

“Não é o quanto fazemos, mas quanto amor

colocamos naquilo que fazemos. Não é o quanto

damos, mas quanto amor colocamos em dar.”

(Beata Madre Teresa de Calcutá)

xx

xxi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Painel de análise das células dendríticas periféricas por citometria de fluxo ... 37

Figura 2: Percentual de células dendríticas mielóides e plasmocitóides em relação ao total

de células mononucleares do sangue periférico de pacientes com CV indetectável, CV

≥1000 cópias de RNA/mL e controles ............................................................................... 38

Figura 3: Microscopia de contraste de fase da diferenciação de monócitos em MDDC em

cultura ................................................................................................................................. 39

Figura 4: Painel de análise de células dendríticas derivadas de monócitos por citometria de

fluxo ..................................................................................................................................... 40

Figura 5: Mediana da intensidade de fluorescência de CD40, HLA-DR, CD80, CD83,

CD86 e DC-SIGN das MDDC dos pacientes infectados por HIV com CV indetectável, CV

≥1000 cópias de RNA/mL e controles antes e após o estímulo com AT-2 HIV e com as

microvesículas H9 .............................................................................................................. 41

Figura 6: Concentração das citocinas IL-12 e TGF-β1 (pg/mL) nos sobrenadante de

culturas de MDDC de pacientes infectados pelo HIV com CV indetectável, CV ≥1000

cópias de RNA/mL e controles ........................................................................................... 43

Figura 7: Concentração das citocinas IFN-γ, IL-2, TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6, IFN-α, TGF-β1

(pg/mL) nos sobrenadante das coculturas de MDDC e de linfócitos de pacientes infectados

pelo HIV com CV indetectável, CV ≥1000 cópias de RNA/mL e controles ..................... 45

xxii

Figura 8: Expressão gênica relativa de IFN-γ, IL-8, IL-6, IL-9, IFN-α17 e IFN-β1 nas

coculturas de MDDC e linfócitos de pacientes com CV indetectável, CV ≥1000 cópias de

RNA/mL e controles saudáveis, estimuladas com AT-2 HIV-1 ........................................ 48

Figura 9: Linfoproliferação HIV específica e estimulada por PHA e a porcentagem de

células blásticas CD4+ e CD8+ nas coculturas de MDDC e linfócitos sem estímulo ou

estimuladas com HIV, microvesículas ou PHA de pacientes com CV indetectável ou CV

≥1000 cópias de RNA/mL e controles saudáveis ............................................................... 50

xxiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Resumo da literatura dos principais resultados obtidos nos ensaios clínicos em

adultos, utilizando a vacina terapêutica com MDDC ......................................................... 14

Tabela 2: Genes e assays de expressão gênica de IFN-γ, IL-8, IL-6, IL-9, IFN-α17 e IFN-

β1 ......................................................................................................................................... 30

Tabela 3: Dados clínicos dos pacientes infectados pelo HIV com CV indetectável e CV

≥1000 cópias de RNA/mL .................................................................................................. 34

Tabela 4: Mediana (mínimo - máximo) dos parâmetros de hemograma, fenotipagem e CV

de pacientes infectados pelo HIV com CV indetectável, CV ≥1000 cópias de RNA/mL e

controles saudáveis ............................................................................................................. 35

Tabela 5: Valores de eficiência, R² e das equações das retas dos sistemas dos genes

alvo/gene de referência obtidos pela quantificação gênica absoluta nos experimentos de

RT-qPCR ............................................................................................................................ 47

xxiv

xxv

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AIDS: Síndrome da imunodeficiência adquirida (Acquired Immunodeficiency Syndrome)

APC: Aloficocianina (Allophycocyanin)

AT-2: Aldritiol-2

BDCA-2: Blood Dendritic Cell Antigen-2

Blimp-1: B-Lymphocyte–induced maturation protein-1

CBA: Cytometric Bead Array

CD: Cluster of Differentiation

CDC: Center for Diseases Control and Prevention

CMSP: Células Mononucleares do Sangue Periférico

CV: Carga Viral

DC: Células dendríticas (Dendritic Cells)

DC-LAMP: Dendritic Cell Lysossome-Associated Membrane Glycoprotein

DC-SIGN: Dendritic Cell-Specific Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Non-

Integrin

DEC-205: Dendritic Cell Receptor for Endocytosis-205

DMSO: Dimetil-sulfóxido

EDTA: Ácido diaminotetracético etileno (Ethylene Diaminetetraacetic Acid)

ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

FITC: Isotiocianato de fluoresceína (Fluorescein Isothiocyanate)

GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

GM-CSF: Fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (Granulocyte-

Macrophage Colony-Stimulating Factor)

xxvi

HGNC: HUGO Gene Nomenclature Committee database

HIV: Vírus da imunodeficiência humana (Human Immunodeficiency Virus)

HLA: Antígenos leucocitários humanos (Human Leukocyte Antigens)

HPRT1: Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1

HSV: Vírus herpes simplex (Herpes Simplex Virus)

HTLV: Vírus linfotrópico de células T humanas (Human T-cell Lymphotropic Virus)

ICAM: Intercellular Adhesion Molecule

IFN: Interferon

IL: Interleucina

IP: Inibidores da Protease

ITRN: Inibidores da Transcriptase Reversa análogos de Nucleosídeo/Nucleotídeo

ITRNN: Inibidores da Transcriptase Reversa Não-análogos de Nucleosídeos

LTNP: Long-Term Nonprogressors

MDA5: Melanoma Differentiation-Associated Gene-5

mDC: Células Dendríticas Mieloides

MHC: Moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (Major

Histocompatibility Complex)

MDDC: Células dendríticas derivadas de monócitos (Monocyte-Derived Dendritic Cells)

NK: Natural Killer

NOD-like: Nucleotide-Binding Oligomerization Domain-Like

PACTG 076: Pediatric AIDS Clinical Trials Group Protocol 076

PAMP: Padrões moleculares associados a patógenos (Pathogen-Associated Molecular

Pattern)

xxvii

PCR: Reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction)

PBS: Tampão fosfato salino (Phosphate-Buffered Saline)

pDC: Células Dendríticas Plasmocitóides

PE: Ficoeritrina (Phycoerythrin)

PerCP: Clorofila peridinina (Peridinin Chlorophyll)

PGE2: Prostaglandina E2

PHA: Fitohemaglutinina (Phytohemagglutinin)

PRR: Receptores de reconhecimento de padrões (Pattern Recognition Receptors)

RAL: Raltegravir

RIG-I: Retinoic Acid-Inducible Gene-I

RNA: Ácido ribonucleico

RT-qPCR: PCR quantitativo em tempo real (Real Time Quantitative PCR)

SINAN: Sistema de Informação de Agravos de Notificação

SIV: Vírus da imunodeficiência símia (Simian Immunodeficiency Virus)

TARV: Terapia Antirretroviral

TARVc: Terapia Antirretroviral Combinada

TNF: Fator de necrose tumoral (Tumor Necrosis Factor)

TREC: Círculos de excisão do receptor de células T (T-cell Receptor Excision Circles)

TREG: Linfócitos T Regulatórios

WHO: World Health Organization

ZDV: Zidovudina

xxviii

1

1. INTRODUÇÃO

HIV e AIDS

A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (Acquired Immunodeficiency

Syndrome, AIDS) é caracterizada por uma imunossupressão profunda e progressiva gerada

pela infecção do Vírus da Imunodeficiência Humana (Human Immunodeficiency Virus,

HIV), retrovírus da família Lentiviridae. Essa imunodeficiência secundária foi reconhecida

primeiramente em 1981, nos Estados Unidos (Barre-Sinoussi et al., 1983; Popovic et al.,

1984) e o primeiro caso no Brasil surgiu em São Paulo em 1980, mas só foi diagnosticado

em 1982 (Castilho & Chequer, 1997).

Atualmente, segundo a World Health Organization (WHO) e a Joint United Nations

Programme on HIV/AIDS, estima-se que 35,3 milhões de pessoas no mundo vivam com

HIV, sendo que destas, 3,3 milhões são crianças (UNAIDS, 2013). No Brasil foram

registrados 686.478 casos de AIDS no Sistema de Informação de Agravos de Notificação

(SINAN) no período de 1980 a 2013, com notificações de 14.352 casos de crianças com

AIDS na faixa etária de zero a 13 anos. Ainda, 12.551 crianças foram notificadas por

exposição vertical ao HIV (Ministério da Saúde, 2013).

Devido a diferenças na estrutura genômica e antigênica, foram identificadas duas

variantes do vírus: HIV-1 e o HIV-2, isolados em 1983 e 1986, respectivamente (Greene et

al., 1991; Feinberg et al., 1992). O HIV-2 possui uma imunossupressão mais lenta e parece

não ter uma transmissão eficiente (Cohen et al., 2008). Já o HIV-1 é mais virulento, com

maior probabilidade de transmissão e maior prevalência mundial, e é dividido em três

grupos de acordo com diferenças encontradas no gene Env (M, N e O). Desses, o grupo M

2

é o mais prevalente e subdividido em nove subtipos (A, B, C, D, F, G, H, J e K) (Turner et

al., 1999; Simon et al., 2006; Cohen et al., 2008).

A infecção pelo HIV-1 acontece por meio da interação da proteína de seu envelope

viral, gp120, com o receptor CD4 e com os coreceptores de quimiocinas presentes na

superfície da célula-alvo (Turner et al., 1999; Chinen & Shearer, 2002). O curso da

infecção pelo HIV-1 é caracterizado por uma fase aguda com um rápido aumento da carga

viral (CV) e declínio acentuado na contagem dos linfócitos T CD4+ (CD4), que são as

principais células-alvo do HIV (Rosenberg et al., 1997). Nesta fase também há a

disseminação do vírus para os órgãos linfoides secundários e início do desenvolvimento de

uma resposta HIV-específica, principalmente com uma grande proliferação de linfócitos T

CD8+ (CD8) citotóxicos (Douek et al., 2003; Simon et al., 2006; Cohen et al, 2008).

Na fase crônica, as células CD8 e CD4 HIV específicas participam da contenção

parcial da replicação viral, desenvolvendo uma resposta celular contra o vírus (Norris &

Rosenberg, 2001; Munier & Kelleher, 2007). Com a progressão da doença, as respostas

citotóxicas específicas paulatinamente decaem e a conseqüência é a persistência do vírus

(Norris & Rosenberg, 2001). Concomitantemente há um aumento na ativação imunológica

crônica dos linfócitos T de memória e näive e consequente depleção sistêmica destas

células, deixando o indvíduo vulnerável a infecções oportunistas, levando à AIDS (Davison

& Nicoll, 1997; Chinen & Shearer, 2002; Douek et al., 2003).

Transmissão vertical e profilaxia

No adulto, a transmissão do HIV se dá pelo contato com fluídos orgânicos

contaminados a partir de relações sexuais, compartilhamento de agulhas e seringas,

3

transfusão de sangue e hemoderivados e acidentes em centros de saúde (Joshi et al., 1996;

Castilho & Chequer, 1997).

Na criança, a transmissão vertical do HIV é a principal responsável pelos casos de

AIDS e pode ocorrer durante a vida intra-uterina (passagem transplacentária), intra-parto

(exposição da pele ou mucosa do recém-nascido ao sangue ou secreções maternas) ou

durante o aleitamento materno (Blanche et al., 1989; Wara et al., 1993).

A introdução de medidas profiláticas como a investigação da infecção durante o

pré-natal, a cesárea eletiva e o não aleitamento materno, em conjunto com a administração

da terapia antirretroviral (TARV) às gestantes e aos recém-nascidos de mulheres infectadas,

proporcionaram uma significativa redução na transmissão vertical do HIV (Hawkins et al.,

2005; Ministério da Saúde, 2009). No Brasil, a transmissão vertical apresentou uma queda

de 63,8% entre 1996 a 2007, que coincidiu com a introdução de TARV e outras profilaxias

para a gestante (Ministério da Saúde, 2010). O estudo Pediatric AIDS Clinical Trials Group

Protocol 076 (PACTG 076) utilizou um protocolo constituído de Zidovudina (ZDV) oral a

partir da 14ª semana para a gestante, ZDV endovenoso 4 horas antes do parto e ZDV oral

para o recém-nascido por seis semanas, e observou uma redução de 67,5% na taxa de

transmissão vertical (Robinson & Lee, 2000). Atualmente, o Mnistério da Saúde indica o

início de TARV entre a 14ª e a 28ª semana de gestação e de ZDV ao recém-nascido por 30

dias de vida (Ministério da Saúde, 2010; Ministério da Saúde, 2014).

HIV e AIDS em pacientes pediátricos

No momento da transmissão vertical do HIV, o sistema imunológico ainda está em

desenvolvimento e maturação, o que resulta em uma interação vírus-hospedeiro diferente

4

da que ocorre nos adultos (Mc Closkey et al., 2004; Jaspan et al., 2006). A infecção pelo

HIV-1 via transmissão vertical é caracterizada por uma maior replicação viral e declínio da

CV plasmática de modo mais lento, o que pode acarretar em uma evolução clínica mais

rápida e grave (Usuga et al., 2008). Há três formas clínicas de progressão da infecção: os

progressores rápidos (10 a 15% das crianças), cujos sintomas surgem nos dois primeiros

anos de vida; os progressores intermediários (50 a 70%), com sintomas iniciais leves nos

primeiros cinco anos; e os progressores lentos (10 a 15%), os quais são livres de

manifestações até oito anos (Barnhart et al., 1996). Estes últimos podem permanecer

assintomáticos por períodos muito longos, mesmo na ausência de TARV, como é o caso de

alguns adultos, conhecidos como long-term nonprogressors (LTNP) (Ananworanich et al.,

2010). Nas crianças com progressão lenta observaram-se uma robusta resposta citotóxica

pelos linfócitos CD8 HIV específica (particularmente contra a proteína Gag), defeitos na

maquinaria de replicação do HIV (mutações no gene Nef), além de mutações no alelo do

co-receptor de quimiocina CCR5 (CCR5-∆32) (Pereyra et al., 2008; Miura et al., 2010;

Ananworanich et al., 2010). Outros estudos mostraram que a progressão da doença pode

estar relacionada com a similaridade do genótipo dos antígenos leucocitários humanos

(Human Leukocyte Antigens, HLA) entre a criança verticalmente infectada e sua mãe, visto

que a resposta imune materna modula a evolução do vírus autólogo. Assim, a criança

adquire um vírus com maior capacidade em escapar da resposta imune (Tiemessen & Kuhn,

2006). Curiosamente, as crianças que adquiriram o HIV por transfusões de sangue, mesmo

durante o período neonatal, tendem a ter um melhor prognóstico do que crianças

verticalmente infectadas (Frederick et al., 1994).

5

A primeira classificação de AIDS pediátrica foi publicada em 1987 e atualizada em

1994 pelo Center for Diseases Control and Prevention (CDC), a qual inclui quatro

categorias clínicas: N para crianças assintomáticas; A para crianças com sinais e/ou

sintomas clínicos leves; B para aqueles com sinais e/ou sintomas clínicos moderados; e C

para indivíduos com sinais e/ou sintomas clínicos graves. O CDC também classifica os

pacientes pediátricos de acordo com o status imunológico quanto ao percentual dos

linfócitos CD4, sendo Alteração Ausente quando CD4 >25%; Moderada entre 15 a 24%; e

Grave <15% (CDC, 1987; CDC, 1994; Ministério da Saúde, 2014).

Crianças verticalmente infectadas apresentam um amplo espectro de manifestações

clínicas, como, por exemplo, há a ocorrência de vômitos, febre, anemia, linfopenia, atipia

linfocitária, hepatoesplenomegalia, linfoadenopatia, diarreia crônica, sarcoma de Kaposi,

além de atraso no desenvolvimento neuromotor (Chakraborty, 2005). Nosso grupo já

relatou um comprometimento na curva de crescimento de crianças infectadas com relação a

crianças saudáveis (Leandro-Merhi et al., 2001), alterações no metabolismo e na

composição corporal (Ramalho et al., 2011). Há a ocorrência de infecções respiratórias de

repetição e bacterianas de pele, dermatites, lesões orais (especialmente candidíase) e

esofagianas, além da vulnerabilidade à infecção por Treponema pallidum, pelos vírus das

hepatites B e C, HTLV-1/2, vírus herpes simplex (Herpes Simplex Virus, HSV),

citomegalovírus, Toxoplasma gondii, Mycobacterium tuberculosis, Pneumocystis jiroveci

(Ministério da Saúde, 2014) e Epstein Barr Virus (Toro et al., 2010). Com relação ao estado

nutricional, seu comprometimento está relacionado à gravidade da infecção (Centeville et

al., 2005). Além disso, foram relatados níveis plasmáticos subnormais de antioxidantes,

6

como a glutationa, a qual foi inversamente correlacionada com a progressão da doença e

ocorrência de coinfecções (Moreno et al., 2006).

A transmissão vertical do HIV tem um importante impacto no desenvolvimento do

sistema imune e são relatadas alterações no número e função das células imunológicas

(Correa & Muñoz-Fernándes, 2002; Zacarelli-Filho et al., 2007), como depleção profunda

das células CD4, ativação policlonal das células B e persistente ativação imune associada

com a progressão da doença (Ananworanich et al., 2010).

Desde a infância, lactentes infectados apresentaram uma queda mais acentuada dos

valores percentuais e absolutos de CD4 e aumento significativo da subpopulação CD8,

promovendo uma inversão das porcentagens de células CD4 e CD8 (Gallagher et al. 1997).

Na fase crônica da infecção pelo HIV na criança, há um comprometimento do timo

e, conseqüentemente, do desenvolvimento da imunidade a antígenos T dependentes (Joshi

et al., 1990; Correa & Muñoz-Fernándes, 2002). O HIV-1 pode comprometer diretamente

os timócitos e danificar células epiteliais tímicas necessárias para uma timopoiese normal e

sinalização de timócitos (Correa & Muñoz-Fernándes, 2002; Chakraborty, 2005). Há uma

correlação inversa entre os valores de T-cell receptor excision circles (TREC) em crianças

e sua CV, que são considerados marcadores moleculares de emigrantes tímicos para

linfócitos T (Douek et al., 2003), confirmando o impacto do HIV na função do timo. Além

disso, já foi observada elevação da interleucina (IL)-7 plasmática em crianças infectadas e

expostas não infectadas, sugerindo que a exposição ao HIV ou a passagem das proteínas

virais pela placenta pode perturbar a timopoiese (Alfano & Poli, 2005; Resino et al., 2003).

Em crianças infectadas pelo HIV com imunossupressão grave, houve aumento da

porcentagem de linfócitos T regulatórios (Treg) em relação a controles, o que foi associado

7

à progressão à AIDS (Argüello et al., 2012). Há uma redução na produção de IL-17,

correlacionado inversamente com a viremia de HIV-1 (Ndhlovu et al., 2008). Já é descrito

um desequilíbrio das subpopulações de células Natural Killer (NK) (Ananworanich et al.,

2010) e NKT, devido à sua susceptibilidade à infecção pelo HIV (Sandberg et al., 2002).

Desde a fase aguda da infecção pelo HIV, o compartimento B apresentou redução do

número de linfócitos B totais e de memória (Ananworanich et al., 2010; Iwajomo et al.,

2011).

A infecção pelo HIV também compromete o funcionamento da medula óssea e é

freqüentemente associada com anormalidades hematológicas, especialmente anemia, além

de neutropenia, linfopenia, trombocitopenia e alterações na eritropoiese (Silva et al., 2001;

Meira et al., 2005), que podem ser atribuídas aos efeitos diretos e indiretos da infecção pelo

HIV-1, às infecções oportunistas e à toxicidade de TARV (Silva et al., 2001).

Estudos mostram que TARV em conjunto com a plasticidade de recuperação do

sistema imunológico de pacientes pediátricos provoca um aumento do número de células

CD4, o que possivelmente se explica pela reconstituição e função do timo e a constante

produção de linfócitos T naïves, mostrando uma capacidade de regenerar clones de células

T perdidos na infecção por HIV (Correia & Muñoz-Fernándes, 2002).

Terapia antirretroviral

Os progressos na compreensão sobre a dinâmica viral e celular na infecção pelo

HIV, ao lado do desenvolvimento de novas classes de drogas, propiciaram resultados

positivos no tratamento da AIDS. A introdução de TARV às crianças tem como objetivo a

redução da mortalidade e morbidade, adequação do crescimento e desenvolvimento,

8

aumento da qualidade de vida e preservação ou reconstrução do sistema imunológico, por

meio da supressão da replicação viral e consequente aumento dos números de linfócitos

CD4 (Ministério da Saúde, 2009; Guillén et al., 2010; Bunupuradah et al., 2011).

Uma das primeiras drogas utilizadas foi a ZDV, que inibe a replicação viral atuando

sobre a enzima transcriptase reversa e foi utilizada como TARV inicialmente em 1984

(Volberding et al., 1990; Jain & Deeks, 2010). Atualmente, o esquema terapêutico se baseia

em combinações de três ou mais drogas, compondo a TARV combinada (TARVc)

(Ministério da Saúde, 2009). O Ministério da Saúde (2009) agrupa em classes as drogas

utilizadas na TARV para crianças e adolescentes de acordo com o modo de atuação no

processo de replicação viral: inibidores da transcriptase reversa análogos de

nucleosídeo/nucleotídeo (ITRN), como abacavir e tenofovir; inibidores da transcriptase

reversa não-análogos de nucleosídeos (ITRNN), tais como nevirapina e efavirenz;

inibidores da protease (IP), como atazanavir, indinavir, lopinavir e ritonavir; inibidores de

fusão, como a enfuvirtida; e inibidores da integrase, como raltegravir (RAL).

No Brasil, recomenda-se o início de TARVc para crianças menores de 12 meses

com diagnóstico de infecção por HIV independentemente de manifestações clínicas,

porcentagem de células CD4 ou da CV plasmática (Ministério da Saúde, 2009), devido a

benefícios da terapia precoce na recuperação imunológica (Walker et al., 2004; Turkova et

al., 2012). Em maiores de 12 meses de idade, são tratadas as crianças nas categorias B ou

C, ou com porcentagem de CD4 <25% ou ainda com CV >100.000 cópias de RNA/mL

(Ministério da Saúde, 2014).

Entretanto, é sabido que TARV pode gerar toxicidade a curto e longo prazo nos

indivíduos tratados, como o desenvolvimento de anemia, neutropenia, dislipidemia,

9

trombocitopenia, rash cutâneo e exantema, aumento de risco de doenças cardiovasculares,

redução da densidade mineral óssea, nefrotoxicidade, disfunções neurológicas e hepáticas

(Funk et al., 2008; Foster & Fidler, 2010; Marón et al., 2010). A toxicidade de TARV

associada com a resistência viral aos medicamentos, má absorção, dose inadequada por

interações entre as drogas ou ingestão subótima, restrição de medicamentos para idade e má

adesão podem levar à falha no tratamento e ao rebote virológico após a supressão inicial

(Feeney et al., 2003; Geretti et al., 2008; Marón et al., 2010; Turkova et al., 2012; Rath et

al., 2013). A boa adesão está relacionada à supressão virológica e, consequentemente, à

melhora da função imune e qualidade de vida do paciente (Ministério da Saúde, 2009).

Em função destes fatores, a total supressão viral plasmática se faz mais difícil de

alcançar em crianças e adolescentes infectados (Feeney et al., 2003; Geretti et al., 2008). A

utilização de vacinas terapêuticas tem sido apontada como uma possível intervenção para

aumentar a capacidade do organismo infectado de responder contra o HIV, melhorando

assim a efetividade da TARVc (Kundu et al., 1998; Lu et al., 2004; García et al., 2005; Ide

et al., 2006; Van Gulck et al., 2006; Connolly et al., 2008; Allard et al., 2008; García et al.,

2013). Isto implicaria numa melhor qualidade de vida, menor taxa de transmissão do vírus e

diminuição efetiva do uso de drogas.

Células dendríticas e vacinas terapêuticas

A ativação da imunidade celular e humoral pelo hospedeiro desempenha um papel

fundamental na indução de respostas HIV específicas no controle da replicação viral

(Borrow et al., 1994; Koup et al., 1994). Neste sentido, vários estudos têm destacado a

importância das células dendríticas (Dendritic Cells, DC) no controle da infecção pelo HIV

10

(Kundu et al., 1998; Lu et al., 2004; Ide et al., 2006; Connolly et al., 2008; García et al.,

2005; García et al., 2013), visto seu papel como principais células apresentadoras de

antígeno, regulando assim o início da resposta imune mediada por linfócitos T contra

patógenos invasores (Banchereau & Steinman, 1998).

Na periferia, as DC podem se diferenciar em dois tipos principais: as de origem

mielóide (mDC) e as de origem plasmocitóide (pDC) (Siegal et al., 1999; Sabado et al.,

2010). As mDC são CD11c+ e estão associadas com a captação de antígenos, ativação de

células T e secretam altos níveis de IL-12 (Fonteneau et al., 2004; Azzoni et al., 2005). As

pDC são CD11c-CD123+BDCA-2+ e, além da função de apresentação de antígenos, são

potentes produtoras de interferon (IFN)-α, o qual inibe diversas fases da replicação viral

(Chehini et al., 2002).

Como outras células do sistema imunológico, as DC reconhecem padrões

moleculares associados a patógenos (pathogen-associated molecular patterns, PAMP) por

meio dos receptores de reconhecimento de padrões (pattern recognition receptors, PRR),

que transduzem sinais ativadores para dentro da célula (Wu & Schwartz, 2013). Dentre os

PRR expressos na membrana celular estão os receptores Toll-like e receptores de lectina do

tipo C, tais como DC-SIGN (DC-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-

integrin), DC-LAMP (DC lysossome-associated membrane glycoprotein), DEC-205 (DC

receptor for endocytosis-205), receptores de manose e langerina. Os PRR também podem

ser expressos no meio intracelular, como RIG-I (retinoic acid-inducible gene-I), MDA5

(melanoma differentiation-associated gene-5) e NOD-like (nucleotide-binding

oligomerization domain-like), além de outros receptores Toll-like (Larsson et al., 2005; Wu

& Schwartz, 2013). Quando imaturas, as DC expressam um maior número de receptores

11

CD4 e de correceptores como CCR5 e CXCR4, entre outros, necessários no processo de

infecção do HIV na célula alvo (Douek et al., 2002; Teleshova et al., 2003).

Ao entrar em contato com o antígeno, as DC imaturas internalizam o antígeno por

fagocitose, endocitose ou macropinocitose em vesículas lisossomais. Em seguida, essas

células iniciam o processo de maturação, caracterizado pela redução na expressão dos PRR

(como DC-SIGN) e aumento da expressão das moléculas do complexo principal de

histocompatibilidade (Major Histocompatibility Complex, MHC), moléculas

coestimulatórias (como CD40, CD80, CD83 e CD86) e moléculas envolvidas na

quimiotaxia (como CCR7) (Banchereau & Steinman, 1998; Wu & Schwartz, 2013). As DC

maduras também expressam moléculas de adesão, como intercellular adhesion molecule

(ICAM)-1 entre outras, adquirindo a capacidade de migrar através dos vasos linfáticos

aferentes até as áreas ricas em células T nos linfonodos. Nestes locais, as DC apresentam os

antígenos aos linfócitos T, estimulando a expansão clonal dos linfócitos T näives e

influenciando na diferenciação de outras células como NK, linfócitos B e Treg (Banchereau

& Steinman, 1998; Liu et al., 2001). Classicamente, as células CD8 reconhecem peptídeos

endógenos apresentados pelo MHC-I, provocando a lise direta de células infectadas (Hogan

& Hammer, 2001). Já as células CD4 reconhecem peptídeos exógenos apresentados via

MHC-II, secretando assim citocinas como IL-2, que levam a uma resposta citotóxica e

humoral anti-HIV (Donaghy et al., 2003).

Sabe-se que, uma vez nos tecidos linfóides, as DC são capazes de transmitir o HIV

aos linfócitos CD4, espalhando a infecção (Finke et al., 2004; Groot et al., 2006). Tem sido

proposto que o HIV pode aproveitar da função endocítica das DC para infectar as células

CD4 em um processo denominado trans-infecção, envolvendo a captura inicial e

12

internalização de vírions intactos, por meio da interação de alta afinidade de DC-SIGN com

a proteína de envelope gp120 do HIV (Geijtenbeek et. al., 2000; Boily-Larouche et al.,

2012). Além disso, DC-SIGN também está envolvido na formação de sinapses

imunológicas entre as DC e células T, interagindo com ICAM-3 expresso em células CD4

näives (Geijtenbeek et al., 2000; Wu & Schwartz, 2013).

É sabido que durante a infecção pelo HIV em adultos e crianças há o

comprometimento do número e função das subpopulações de DC periféricas e várias

hipóteses têm sido propostas para explicar a redução destas subpopulações na periferia, tais

como a morte destas células devido à infecção viral, um prejuízo de células precursoras de

DC, redução da expressão de marcadores de superfície ou a migração para tecidos linfóides

secundários (Barron et al., 2003; Fonteneau et al., 2004). O HIV também leva à alteração

na expressão e secreção de citocinas pelas DC, como IL-12, IL-15 e IFN-α (Finke et al.,

2004; Groot et al., 2006). A CV se correlaciona inversamente às porcentagens de pDC e

mDC de adultos e com a secreção de IFN-α (Donaghy et al., 2001; Barron et al., 2003;

Finke et al., 2004; Killian et al., 2006; Sabado et al., 2010). Desai et al. (2007) mostraram

uma correlação inversa da frequência de pDC com a ativação de linfócitos CD4 e CD8 ao

longo da progressão da infecção por HIV em crianças.

Crianças e adolescentes com HIV sob TARVc possuem uma tendência para

recuperar o número e a função das subpopulações de DC, possivelmente em função da

maior plasticidade do sistema imunológico nesses pacientes (Azzoni et al., 2005; Zhang et

al., 2006), enquanto que em adultos tratados permanecem diminuídas ao longo ao tempo

nas porcentagens de pDC (Chehimi et al., 2002). Há também maior nos níveis de IL-12 e

13

IFN-α em pacientes com CV indetectável relação aos pacientes com viremia não controlada

(Zhang et al., 2006).

Considerando o papel central que as DC desempenham no direcionamento da

resposta imune, tem sido proposta a manipulação do sistema imunológico para o controle e

eliminação da infecção pelo HIV por meio de vacinas terapêuticas utilizando estas células

como adjuvantes e carreadoras de antígeno para induzir respostas HIV específicas de

células T (Lu et al., 2004; Andrieu & Lu, 2007).

Em macacos, a imunoterapia com DC derivadas de monócitos (Monocyte-Derived

Dendritic Cells, MDDC) pré-cultivadas com o vírus da imunodeficiência símia (Simian

Immunodeficiency Virus, SIV) inativado e na presença oligodesoxinucleotideos

imunoestimuladores com motivos CpG foi capaz de promover o controle virológico e

aumento significativo na resposta celular e humoral SIV específica (Lu et al., 2003;

Teleshova et al., 2006). Além disso, outros estudos já demonstraram a eficácia de

protocolos de vacinação baseados em MDDC contra outras patologias, como o câncer

(Schuler et al., 2003) e doenças infecciosas causadas por Micobacterium tuberculosis

(Demangel et al., 1999), Bordetella pertussis (George-Chandy et al., 2001), Candida

albicans (d’Ostiani et al., 2000), HSV (Schön et al., 2001), entre outras.

Em adultos infectados pelo HIV-1, vários estudos têm mostrado que a vacina

terapêutica com MDDC pulsadas com peptídeos de HIV ou com o vírus inativado são

seguras e podem reduzir a CV mesmo na ausência de TARV e induzir respostas HIV

específicas, tais como a proliferação de células CD4 e CD8, estimulação de citotoxicidade,

indução de IFN-γ e IL-2, além de anticorpos para epítopos específicos do HIV-1 (Tabela 1)

14

(Kundu et al., 1998; Lu et al., 2004; García et al., 2005; Ide et al., 2006; Connolly et al.,

2008; García et al., 2011; García et al., 2013).

Tabela 1: Resumo da literatura dos principais resultados obtidos nos ensaios clínicos utilizando a vacina

terapêutica com MDDC.

Referência N Pacientes /

Tratamento

Maturação

MDDC Antígeno Resultados

Kundu et al.,

1998 6 / näive

Sem

estímulo

gp160 ou peptídeos de Gag,

Pol e Env

Aumento de citotoxicidade HIV específica

e linfoproliferação

Lu et al., 2004 18 / näive IL-1β, IL-6

e TNF-α

HIV-1 autólogo inativado

com AT-2

Redução de 90% na CV em 8 pacientes e

aumento de CD4 IL-2+ IFN-γ+

García et al.,

2005 12 / TARVc IFN-α

HIV-1 autólogo inativado

com calor

Redução de 0,5 log na CV em 4 pacientes

e fraco aumento na linfoproliferação de

CD4 e nas células CD8 citotóxicas

Ide et al., 2006 4 / TARVc TNF-α Peptídeos de Gag, Env e Nef Citotoxicidade moderada contra Nef em 2

pacientes

Connolly et al.,

2008 18 / TARVc

IL-1β, IL-6

e TNF-α Peptídeos de Gag, Env e Pol

Aumento de citotoxicidade contra Gag,

Env e Pol

García et al.,

2011 24 / näive

IL-1β, IL-6

e TNF-α

HIV-1 autólogo inativado

com calor

Tendência de aumento da citotoxicidade

inversamente correlacionada com CV

García et al.,

2013 24 / TARVc

IL-1β, IL-

6, TNF-α,

PGE2

HIV-1 autólogo inativado

com calor

Redução na CV inversamente

correlacionada com aumento da

linfoproliferação e produção de IFN-γ

As MDDC podem ser geradas in vitro a partir de monócitos cultivados com o fator

estimulador de colônias de granulócitos e monócitos (GM-CSF) e IL-4 (Romani et al.,

1994). Como os monócitos não são alvos principais do HIV, o vírus não é detectado em

MDDC autólogas de pacientes infectados pelo HIV (Sapp et al., 1999). As MDDC

originadas de pacientes com HIV são CD14- e, após o estímulo de maturação in vitro,

apresentam expressão normal de CD40, CD80, CD83 e CD86, além de MHC-I e II,

15

importantes marcadores de maturação necessários para uma efetiva ativação das células T

(Carbonneil et al., 2003; Newton et al., 2006; Buisson et al., 2009).

Os ensaios clínicos publicados até hoje utilizando vacinas de MDDC se focaram na

imunoterapia de adultos. Nestes indivíduos, está claro o papel do controle da viremia pela

TARVc e seu impacto na restauração ou não do sistema imune. Visto o grande impacto da

infecção vertical pelo HIV no desenvolvimento do sistema imunológico dos pacientes

pediátricos, falta uma maior compreensão sobre a relação da infecção crônica e o

desenvolvimento de resposta celular específica para o HIV na faixa etária pediátrica. Sendo

as DC as principais apresentadoras de antígenos para linfócitos T, um melhor conhecimento

da maturação e função de MDDC de crianças e adolescentes com infecção crônica pelo

HIV trará novas informações para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para

melhorar a eficácia de TARVc nesses pacientes.

16

17

2. OBJETIVOS

Objetivo geral

Analisar a influência da CV de HIV-1 nas DC periféricas e na maturação e função

de MDDC de pacientes pediátricos, utilizando partículas inativadas do HIV-1.

Objetivos específicos

Em crianças e adolescentes com infecção vertical pelo HIV sob TARVc, verificar:

1. Número de linfócitos CD3, CD4 e CD8;

2. As freqüências de mDC e pDC;

3. O fenótipo de maturação de MDDC quanto à expressão de CD40, CD80, CD83,

CD86, DC-SIGN e HLA-DR;

4. A produção de citocinas no sobrenadante de cultura de MDDC;

5. A interação entre MDDC e linfócitos T em coculturas pela avaliação da

linfoproliferação, expressão gênica e produção de citocinas frente ao estímulo com

partículas de HIV-1 inativado por aldritiol-2.

18

19

3. MÉTODOS

Populações estudadas

População de pacientes e local do estudo

O estudo transversal foi conduzido dentre uma coorte de 180 crianças e

adolescentes infectados com HIV, com idade de zero a 21 anos, recrutados no Ambulatório

de Imunodeficiência Secundária da Pediatria do Hospital de Clínicas (HC) da Universidade

Estadual de Campinas (UNICAMP), localizada na cidade de Campinas, no estado de São

Paulo, Brasil. O acompanhamento dos indivíduos ocorreu no próprio Ambulatório.

Os critérios de inclusão foram a presença da infecção por transmissão vertical do

HIV comprovada de acordo com os critérios do Ministério da Saúde (2009) e uso de terapia

antirretroviral por, ao menos, seis meses.

Os critérios de não inclusão para os pacientes foram a evidência clínica e/ou

laboratorial de co-infecção por hepatite B ou C, citomegalovírus, sífilis, toxoplasmose ou

tuberculose e ocorrência de malformação congênita, doença genética ou condição clínica

grave. Os dados clínicos foram coletados dos prontuários dos pacientes.

As crianças eleitas tiveram anotados detalhadamente os endereços residenciais com

pontos de referência, telefone residencial, endereço e telefone comerciais dos responsáveis,

além de um endereço alternativo, para evitar as perdas por mudança de endereço.

Visando uma maior compreensão do impacto da CV sobre a resposta imune, os

pacientes foram separados em dois grupos, de acordo com sua CV plasmática de HIV-1:

- Pacientes com controle virológico: apresentavam CV indetectável (CV <50 cópias de

RNA/mL) na data de coleta dos exames e durante o último ano, no mínimo.

20

- Pacientes viremicos: apresentavam CV ≥1000 cópias de RNA/mL na data de coleta dos

exames e CV >50 cópias de RNA/mL nos últimos seis meses. Viremia acima de 1000

cópias de RNA/mL é considerada falha virológica em crianças (Bunupuradah et al., 2011).

Aspectos éticos

Na entrevista de acolhimento, os pais ou representantes legais, as crianças e

adolescentes foram informados sobre os objetivos, métodos, benefícios e duração do

estudo. Após ciência da natureza dos procedimentos e desconfortos aos quais os pacientes

seriam submetidos e com capacidade de livre arbítrio, sem qualquer coação, foi solicitado

que os responsáveis assinassem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

(ANEXOS). Os riscos previstos para o paciente como ansiedade e o desconforto da coleta

de sangue foram informados. Os responsáveis pelo paciente (e o próprio paciente, no caso

dos adolescentes) e o pesquisador responsável pelo estudo assinaram o Termo em duas

vias, uma arquivada na instituição e outra entregue aos responsáveis. As amostras dos

pacientes foram identificadas com siglas para preservação do sigilo dos participantes.

Todos os procedimentos obedeceram às recomendações para pesquisas biomédicas

envolvendo seres humanos propostas pela Resolução de número 196 de 10 de outubro de

1996, do Conselho Nacional de Saúde. Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética da

Faculdade de Ciências Médicas (FCM), da UNICAMP, com o protocolo de número

876/2010 (ANEXOS).

21

Cálculo amostral

Considerando um teste bicaudal com desvio padrão de 4,5 (em resultados

preliminares de ensaios de proliferação celular específica para o HIV-1), a diferença a ser

detectada de 5, o nível de significância de 5% e o poder do teste de 80%, o número

amostral calculado foi de 13 indivíduos em cada grupo de pacientes com HIV.

População de controles saudáveis

Crianças e adolescentes saudáveis entre quatro e 21 anos de idade foram convidados

a participar do estudo como controles. Foi realizada uma consulta médica e exames

laboratoriais para avaliar a saúde destes indivíduos. Os critérios de exclusão para os

controles foram a evidência clínica e/ou laboratorial de infecção por HIV, hepatite B ou C,

citomegalovírus, sífilis, toxoplasmose ou tuberculose, ou ocorrência de malformação

congênita, imunodeficiência primária, doença genética, condição clínica grave ou uso de

imunossupressor.

Coleta de sangue

Entre agosto de 2012 a maio de 2014, as coletas dos controles saudáveis foram

realizadas no Centro de Investigação em Pediatria (CIPED) na FCM da UNICAMP,

enquanto que as coletas das crianças infectadas com o HIV foram realizadas na Seção de

Coleta da Patologia Clínica do HC da UNICAMP. O volume total de amostra de sangue

periférico coletado foi de 20 mL a 50 mL.

22

Hemograma

O hemograma foi realizado a partir de um mililitro de sangue periférico coletado em

tubo com ácido diaminotetracetico etileno (EDTA) K3 líquido na Seção de Hematologia do

Laboratório de Patologia Clínica do HC da UNICAMP, havendo a contagem de células

global e diferencial no equipamento XE 5000 (Sysmex Corporation, Japão).

Carga viral de HIV

A quantificação da CV de HIV-1 foi realizada a partir do plasma obtido de 4 mL de

sangue periférico coletado em tubo com EDTA K3 líquido no Laboratório de AIDS do HC

da Unicamp, por meio do método quantitativo de Branched-DNA no equipamento Versant

440 (Siemens Healthcare Diagnostics inc., EUA) até março de 2013. A partir de abril de

2013, empregou-se o sistema Abbott M2000sp Real Time (Abbott Molecular, EUA). Os

limites mínimo e máximo para detecção do RNA de HIV-1 foram de 50 e 500.000 cópias

de RNA/mL, respectivamente.

Imunofenotipagem de linfócitos T

A imunofenotipagem dos linfócitos CD3, CD4 e CD8 foi realizada a partir de 0,5

mL de sangue periférico coletado em tubo com EDTA K3 líquido, por meio de citometria

de fluxo (citômetro de fluxo BD FACSCalibur, BD Biosciences, EUA). Os exames dos

pacientes foram efetuados no Laboratório de AIDS do HC da UNICAMP por citometria

com quatro marcadores: anti-CD3 conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC), anti-

CD4 conjugado a aloficocianina (APC), anti-CD8 conjugado a ficoeritrina (PE) e anti-

23

CD45 conjugado a proteína clorofila peridinina (PerCP), por meio do ensaio Trucount para

contagem absoluta de células. A imunofenotipagem dos controles saudáveis foi feita no

Laboratório de Marcadores Celulares do Centro de Hematologia e Hemoterapia

(HEMOCENTRO) da UNICAMP, usando citometria com três marcadores monoclonais:

anti-CD3 PerCP, anti-CD4 APC, e anti-CD8 PE, gerando as porcentagens de cada

população linfocitária. Para a contagem absoluta de linfócitos CD3, CD4 e CD8 dos

controles, foram usadas as contagens absolutas de linfócitos do hemograma da mesma

amostra.

Fenotipagem de células dendríticas plasmocitóides e mielóides

Após isolamento por gradiente de densidade (Ficoll-Paque, GE Healthcare, Suécia),

células mononucleares do sangue periférico (CMSP) na concentração de 1x106 células/mL

foram incubadas com anticorpos anti-CD14 PE, anti-HLA-DR PerCP, anti-CD11c FITC

(BD Biosciences, EUA) e anti-BDCA-2 APC (Miltenyi Biotec, Alemanha), para distinguir

as populações de células dendríticas plamocitóides e mielóides. Após lavagem, a leitura foi

realizada em citômetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, EUA). Foram adquiridos

no mínimo 30.000 eventos para análise no programa computacional FACSDiva versão 6.2

(BD Biosciences, EUA).

24

Coculturas de MDDC e linfócitos

Isolamento das células mononucleares do sangue periférico

As CMSP foram isoladas por centrifugação por gradiente de densidade (Ficoll-

Paque, GE Healthcare, Suécia). Após a contagem em câmara de Neubauer, as células foram

ressuspendidas em tampão para separação magnética (Miltenyi Biotec, Alemanha), na

concentração de 107 células em 80 µL de tampão.

Os monócitos foram separados dentre CMSP usando 20 µL de esferas magnéticas

contendo anti-CD14 para cada 107 células, de acordo com o protocolo do fabricante (kit de

seleção positiva, Miltenyi Biotec, Alemanha), para assim proceder a separação magnética

em equipamento VarioMacs (Miltenyi Biotec, Alemanha). Estas células foram utilizadas

para a obtenção de células dendríticas em cultura.

Obtenção em cultura de MDDC

As células CD14+ foram cultivadas na concentração de 2x106 células/mL em placas

de poliestireno de seis poços com fundo achatado (Nunc, Dinamarca) com até 4 mL/poço

em incubadora (Forma Scientific, Thermo Scientific, EUA) a 37ºC, com atmosfera de 5%

de CO2, em meio AIM-V (Gibco, EUA), com 50 ηg/mL de IL-4 e 50 ηg/mL de GM-CSF

(PeproTech, EUA) para promover a diferenciação de monócitos em células dendríticas.

No terceiro dia de cultura foi acrescentado um reforço de citocinas (50 ηg/mL de

IL-4 e 50 ηg/mL de GM-CSF) e meio de cultura AIM-V (Gibco, EUA). No sexto dia de

cultura, uma alíquota de MDDC foi incubada com anticorpos monoclonais humanos

produzidos em camundongo anti-CD11c FITC, anti-HLA-DR PerCP, anti-CD40 APC,

25

anti-CD80 PE, anti-CD83 APC, anti-CD86 PE e anti-DC-SIGN PE (BD Biosciences,

EUA) para verificação de sua diferenciação. A leitura foi realizada em citômetro de fluxo

FACSCalibur (BD Biosciences, EUA) com a aquisição de 5.000 eventos para análise no

programa computacional BD FACSDiva versão 6.2 (BD Biosciences, EUA).

MDDC pulsadas com HIV inativado

No sexto dia de cultura, as MDDC foram pulsadas por duas horas com HIV-1 clade

B (MN) inativado por aldritiol-2 (AT-2) cultivado em células H9, gentilmente cedido pelo

Dr. Jeffrey Lifson, coordenador de AIDS and Cancer Virus Program da Instituição SAIC-

Frederick, NCI-Frederick, EUA. As células H9 são derivadas de uma linhagem de linfoma

cutâneo de linfócitos T, altamente permissiva à proliferação do HIV. O antígeno foi diluído

em PBS (Phosphate-Buffered Saline) estéril (Sigma-Aldrich, EUA) e utilizado na

concentração de 750 ηg/mL de equivalente de p24 em cultura e como controle negativo foi

usada uma solução de microvesículas de uma cultura de células H9 não infectadas por HIV-

1, também diluídas em PBS estéril (Sigma-Aldrich, EUA), em concentração protéica total

equivalente ao AT-2 HIV-1. Após a incubação com os antígenos, as células foram lavadas

com meio AIM-V e assim foi adicionado novo reforço de IL-4 e GM-CSF e também

citocinas recombinantes para a maturação das MDDC, sendo 50 ηg/mL de TNF-α, 100

ηg/mL de IL-6 e 10 ηg/mL de IL-1β (PeproTech, EUA).

No oitavo dia de cultura, a placa foi incubada em banho de gelo por seis minutos e o

sobrenadante foi retirado para posterior análise de citocinas por meio da técnica Cytometric

Bead Array (CBA) e Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Para maior

recuperação das células aderidas à placa, foi adicionado 1 mL de solução de 0,25% Tripsina

26

com EDTA (Gibco, EUA) durante 10 minutos e, em seguida, as células foram lavadas com

meio AIM-V e ressuspensas na concentração de 2x106 células/mL com meio AIM-V.

Uma alíquota de MDDC foi incubada com anticorpos monoclonais humanos

produzidos em camundongo anti-CD11c FITC, anti-HLA-DR PerCP, anti-CD40 APC,

anti-CD80 PE, anti-CD83 APC, anti-CD86 APC e anti-DC-SIGN PE (BD Biosciences,

EUA), para avaliar a maturação celular por citometria de fluxo.

Para ilustrar a diferenciação morfólogica de monócitos em MDDC, as células de um

controle saudável foram fotografadas por microscopia de contraste de fase no terceiro dia

de cultura com GM-CSF e IL-4, antes e após a indução da maturação com citocinas

próinflamatórias e incubação com AT-2 HIV-1.

Separação e viabilidade de linfócitos

Após a separação magnética, as células CD14- (em sua maioria linfócitos) foram

congeladas na concentração de 107 células/mL a -80ºC em soro bovino fetal com 10% de

dimetil-sulfóxido (DMSO) para posterior cocultivo. No dia anterior à incubação com as

MDDC, as células foram descongeladas em banho-maria a 37ºC e incubadas em meio

AIM-V (com 10% de soro bovino fetal) na concentração de 3x106 células/mL em placas de

poliestireno de seis poços com fundo achatado ou garrafas de cultura (TPP, Suíça) em

incubadora a 37ºC, com atmosfera de 5% de CO2 durante 24 horas. No dia seguinte, foi

verificada a viabilidade e acertada a concentração para 1x107 células/mL com meio AIM-

V.

27

Cocultivo de MDDC e linfócitos

As células dendríticas pulsadas com HIV inativado e com microvesículas H9 foram

incubadas com linfócitos, na proporção de 1 MDDC: 30 linfócitos em meio AIM-V com

10% de soro humano AB inativado (Sigma, EUA), em incubadora a 37ºC, com atmosfera

de 5% de CO2 durante 48 horas. No décimo dia, o sobrenadante da cocultura foi coletado e

congelado a -80°C para posterior análise das citocinas através das técnicas de CBA e

ELISA. As células foram ressuspensas em 350 µL de tampão RA1 do kit comercial Illustra

RNAspin Mini (GE Healthcare, EUA) para posterior extração do mRNA.

Produção de citocinas no sobrenadante

No oitavo dia de cultura, o sobrenadante das MDDC foi coletado e congelado a -

80°C para posterior análise das citocinas, assim como o sobrenadante das coculturas de

MDDC e linfócitos após 48 horas de incubação. Foram verificadas as concentrações de IL-

2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α, IFN-γ e IFN-α pela técnica de CBA (Human Th1/Th2

Cytokine Kit e Human IFN-α Flex Set, BD Biosciences, EUA) em pg/mL no citômetro

FACSVerse (BD Biosciences, EUA). A análise foi realizada com o programa

computacional FCAP Array versão 3.0.1 (BD Biosciences, EUA). Os limites de detecção

foram 2,6 ρg/mL para IL-2 e IL-4, 2,4 ρg/mL para IL-5, 2,8 ρg/mL para IL-10 e TNF-,

7,1 ρg/mL para IFN- e 1,5 ρg/mL para IFN-α, sendo que para amostras que tiveram

concentrações inferiores a estes limites foram estabelecidos valores de metade dos limites

de detecção para respectiva citocina.

28

As concentrações de IL-12, IL-6 e Transforming Growth Factor (TGF)-β1 foram

verificadas pela técnica de ELISA, usando os kits comerciais Human IL-12 p40/p70 ELISA

Kit (Invitrogen, EUA), BD OpteiaTM IL-6 (BD Biosciences, EUA) e Human TGF-β1 Duo

Set ELISA Kit (R&D Systems, EUA). Os limites de detecção foram de 2,0 ρg/mL para IL-

12, 4,7 ρg/mL para IL-6 e 15,6 ρg/mL para TGF-β1, sendo também adotado o valor da

metade destas concentrações para amostras que tiveram concentrações inferiores aos limites

de detecção.

Extração do RNAm e reação de transcrição reversa (cDNA)

As células cultivadas na cocultura tiveram o RNAm extraído pelo kit comercial

Illustra RNAspin Mini (GE Healthcare, EUA). Para a quantificação de RNA foi usado o kit

comercial Qubit™ RNA BR (Invitrogen, EUA), segundo o protocolo do fabricante e leitura

no fluorômetro Qubit® 2.0 (Invitrogen, EUA).

A transcrição reversa foi efetuada utilizando o kit comercial High Capacity cDNA

Reverse Transcriptase (Applied Biosystems, EUA) segundo o protocolo do fabricante.

Após pipetagem e centrifugação breve, as amostras foram incubadas em termociclador com

gradiente de temperatura (Mastercycler Eppendorf, EUA), em um ciclo de 25ºC por 10

minutos, 37º por 120 minutos, 85ºC por 5 minutos, seguido de um resfriamento a 4ºC. O

cDNA foi armazenado a -20°C.

29

PCR quantitativo em tempo real

Para uma análise preliminar da expressão gênica de citocinas das coculturas, foi

realizado PCR array usando a placa Human Common Cytokines PCR Array (Life

Technologies, EUA), que possui 28 genes de interesse das citocinas em triplicata e quatro

genes de normalização de expressão (housekeeping genes). Para o array, foram realizados

pools com amostras de seis pacientes com carga viral indetectável, seis com CV ≥1000

cópias de RNA/mL e de seis controles saudáveis, a fim de totalizar 10 ng/poço de RNA

convertido em cDNA. As reações de PCR foram realizadas de acordo com o protocolo do

fabricante, usando o reagente TaqMan® Gene Expression Master Mix (Life Technologies,

EUA), com o sistema ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems,

EUA). Foram identificados seis genes alvo com hiper ou hipoexpressão em relação ao

controle saudável estimulado com as microvesículas H9 (amostra de referência com

quantificação igual a 1,0), os quais foram avaliados utilizando assays específicos para a

confirmação destas diferenças. A Tabela 2 apresenta a nomenclatura dos genes de acordo

com o banco de dados de HUGO Gene Nomenclature Committee database (HGNC).

30

Tabela 2: Genes e assays de expressão gênica utilizados no estudo.

Símbolo Nome Task Nº TaqMan Assay Amplificado (pb)

GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Endógeno 4333764 F 122

HPRT1 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 Endógeno 4333768 F 100

IFN-α17 Interferon, alpha 17 Alvo Hs00819693_sH 217

IFN-β1 Interferon, beta 1, fibroblast Alvo Hs01077958_s1 73

IFN-γ Interferon, gamma Alvo Hs00989291_m1 73

IL-6 Interleukin 6 (interferon, beta 2) Alvo Hs00985639_m1 66

IL-8 Interleukin 8 Alvo Hs00174103_m1 101

IL-9 Interleukin 9 Alvo Hs00914237_m1 104

Antes de se realizar um experimento de expressão gênica utilizando a técnica de

PCR quantitativo em tempo real (Real Time Quantitative PCR, RT-qPCR), foi realizada a

quantificação absoluta validando o sistema gene alvo/gene de referência. Os genes alvo

foram validados para os genes de referencia GAPDH e HPRT1 utilizando-se sete

concentrações diferentes de cDNA (diluições seriadas de 5 vezes) de uma amostra de uma

cocultura de um controle saudável. A eficiência da curva (E=10(-1/slope)) foi calculada com o

programa 7500 software versão 2.0.5 (Life Technologies, EUA), devendo estar próxima ao

100%. A partir disto, construiu-se um gráfico do logaritmo das concentrações de cDNA

utilizadas pela diferença das médias dos ciclos threshold do gene de referência e do gene

alvo obtidas para cada concentração. Equações dos gráficos constituindo retas com

inclinação menor do que 0,1 foram consideradas estáveis nas concentrações testadas.

Prosseguiu-se então com os experimentos para quantificação relativa da expressão

gênica dos genes alvo. O produto da transcrição reversa realizada conforme descrito

31

anteriormente foi utilizado nas reações de RT-qPCR em triplicata utilizando um volume

total de reação de 12,5 μL pelo método TaqMan® (Applied Biosystems, EUA). As leituras

de fluorescência foram realizadas no equipamento ABI Prism 7500 Sequence Detection

System e, posteriormente, analisadas pelo 7500 software versão 2.0.5 (Applied Biosystems,

EUA). Para a avaliação da expressão gênica foi utilizado o método de 2-ΔΔCt, onde os dados

representam mudanças da expressão com relação ao controle saudável com o estímulo das

microvesículas H9 com quantificação relativa igual a 1,0, sendo todos os genes

normalizados com a combinação dos controles endógenos GAPDH e HPRT1.

Linfoproliferação HIV específica

Para avaliar a linfoproliferação HIV específica foram usadas as MDDC pulsadas

com AT-2 HIV-1, com microvesículas H9 e células não estimuladas. As MDDC foram

cocultivadas com linfócitos, na proporção de 1 MDDC: 30 linfócitos em meio AIMV com

10% de soro humano AB inativado, em placas de poliestireno de 96 poços com fundo

arredondado (Nunc, Dinamarca) a 37ºC, com atmosfera de 5% de CO2 durante 6 dias. A

fitohemaglutinina (PHA), na concentração de 7,5 µg/mL (Sigma, EUA), foi utilizada como

controle positivo e o meio AIM-V (Gibco, EUA) foi usado como cultivo sem estímulo.

Após a coleta da cultura, foi realizada a marcação fenotípica dos linfócitos com

anticorpos anti-CD3 PerCP, anti-CD4 FITC e anti-CD8 APC (BD Biosciences, EUA). A

leitura das amostras foi realizada no citômetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences,

EUA), adquirindo-se 50.000 eventos totais para análise no programa computacional BD

FACSDiva versão 6.2 (BD Biosciences, EUA). As células blásticas foram identificadas por

32

observação em forward e side light scatters. A proliferação linfocitária foi avaliada pelo

percentual de blastos viáveis CD3+. Para cada cultura, o percentual de blastos foi dado por:

Percentual de células no gate de blastos x 100

Percentual de blastos + percentual de linfócitos pequenos

O cálculo de blastos para cada cultura estimulada foi feito da seguinte forma:

1. Blastos de HIV = percentual de blastos de HIV - percentual de blastos de

microvesículas.

2. Blastos de PHA = percentual de blastos de PHA - percentual de blastos do controle

sem estímulo.

As porcentagens das subpopulações CD4 e CD8 foram quantificadas dentre as

células no gate de blastos de cada cultura. Assim, foram comparadas as suas proporções e

não os números absolutos.

Análise estatística

Os dados foram organizados e analisados em SPSS® software for Windows versão

17.0. (SPSS Inc, EUA). A análise estatística foi realizada com os testes de Kruskal-Wallis,

Wilcoxon, Mann-Whitney, comparações múltiplas não paramétricas e Correlação de

Spearman. O nível de significância adotado foi p valor <0,05. Os gráficos foram feitos no

Software GraphPad Prism versão 5.0 (GraphPad Software, EUA).

33

4. RESULTADOS

População de estudo

Para este estudo foram recrutados 39 pacientes infectados pelo HIV-1, em uso de

terapia antirretroviral, os quais foram agrupados de acordo com a CV plasmática de HIV-1,

sendo 25 pacientes com CV indetectável e 14 pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL

no dia da coleta. A Tabela 3 mostra os dados clínicos destes pacientes, coletados de seus

prontuários.

Para o grupo controle foram recrutados 20 indivíduos, sendo que destes nove eram

do sexo masculino. A mediana de idade foi de 16,39 anos, com a idade mínima foi de 4,06

e a máxima de 22,30. Não houve diferença de idade entre os três grupos (p=0,110, teste de

Kruskal-Wallis). Nenhum controle havia usado antiinflamatórios e antibióticos no período

de um mês antes da coleta. Também não apresentavam nenhum histórico familiar de

imunodeficiência primária.

O volume de sangue coletado de alguns pacientes e controles não foi suficiente para

realizar todos os experimentos descritos anteriormente. Alguns pacientes passaram por uma

segunda coleta de sangue para que fossem realizados os demais experimentos.

34

Tabela 3: Dados clínicos dos pacientes infectados pelo HIV com CV indetectável e CV ≥1000 cópias de

RNA/mL (CV ≥1000). CDC: Centro de Controle de Doenças e Prevenção; NA: não se aplica; ITRN:

Inibidores da transcriptase reveresa análogos à nucleosídeos e nucleotídeos; ITRNN: Inibidores da

transcriptase reveresa não-análogos à nucleosídeos e nucleotídeos; IP: Inibidores da protease; RAL:

raltegravir.

CV indetectável CV ≥1000

n 25 14

Sexo

Masculino 13 6

Feminino 12 8

Mediana de idade em anos (mínimo - máximo) 13,50 (4,32 - 21,27) 9,13 (1,60 - 19,45)

Idade (anos)

≤ 2 0 2

2 - 5 1 1

> 5 24 11

Classificação clínica pelo CDC

N 3 3

A 1 1

B 17 6

C 4 4

Classificação imunológica pelo CDC

1 4 2

2 11 4

3 10 8

CD4

≥ 25% 23 6

*15% - 24% 2 5

< 15% 0 3

Nadir médio (mínimo - máximo) 376 (10 - 954) 351 (20 - 1377)

Idade no início da TARV em anos 1,95 (0,00 - 9,97) 1,05 (0,00 - 6,70)

Tempo de tratamento em anos 10,32 (3,24 - 19,58) 7,38 (1,30 - 18,43)

TARV

2 ITRN + 1 ITRNN 9 2

2 ITRN + 1 IP 8 6

2 ITRN + 2 IP 2 2

3 ITRN + 1 IP 0 1

**2 ITRN + 1 ITRNN + 1 IP 1 2

2 ITRN + 1 ITRNN + 1 IP + RAL 1 0

2 ITRN + 1 ITRNN + 2 IP + RAL 2 0

2 ITRN + 1 IP + RAL 1 0

2 ITRN + 2 IP + RAL 1 0

1 ITRN + 2 IP + RAL 0 1

*Em uma segunda coleta, um paciente mudou a classificação de CD4 para <15%.

** Em uma segunda coleta, um paciente mudou a TARV para 2 ITRN + 1 ITRNN.

35

Hemograma, linfócitos CD3, CD4 e CD8 e carga viral

Foram realizados hemogramas e fenotipagens de linfócitos CD3, CD4 e CD8 de

todos os pacientes e controles. Na Tabela 4 são apresentados os valores referentes aos

hemogramas, imunofenotipagens e CV em sangue periférico dos pacientes e controles

saudáveis.

Tabela 4: Mediana (mínimo - máximo) dos parâmetros de hemograma, fenotipagem e CV de pacientes

infectados pelo HIV com CV indetectável, CV ≥1000 cópias de RNA/mL (CV ≥1000) e controles saudáveis.

P valor corresponde à comparação dos grupos pelo teste de Kruskal-Wallis.

CV indetectável

n=25

CV ≥1000

n=14

Controles

n=20 p valor

Leucócitos (109 cél/L) 5,87 (3,23-10,10) 6,04 (3,52-19,75) 6,73 (4,00-12,00) 0,459

Linfócitos (109 cél/L) 2,25 (1,30-5,92) 2,77 (1,81-13,88) 2,28 (1,14-6,67) 0,031

Monócitos (109 cél/L) 0,53 (0,28-0,82) 0,63 (0,39-2,62) 0,46 (0,27-0,81) 0,029

Neutrófilos (109 cél/L) 2,72 (0,41-5,10) 2,66 (0,57-7,35) 3,14 (1,61-8,48) 0,370

Eosinófilos (109 cél/L) 0,16 (0,00-1,07) 0,15 (0,08-0,77) 0,15 (0,05-1,19) 0,911

Basófilos (109 cél/L) 0,02 (0,00-0,06) 0,02 (0,01-0,11) 0,02 (0,00-0,09) 0,862

Eritrócitos (1012 cél/L) 4,21 (3,18-5,82) 4,31 (3,29-5,14) 4,83 (3,85-5,34) 0,016

Hemoglobina (g/dL) 14,0 (11,6-16,4) 12,5 (9,0-14,3) 13,4 (11,9-16,3) 0,005

Hematócrito (%) 40,7 (34,2-47,5) 36,2 (29,5-43,3) 39,5 (36,3-47,0) 0,002

Plaquetas (109 cél/L) 230 (156-428) 273 (134-522) 256,5 (141-384) 0,385

CD3 (106 cél/L) 1842 (918-6004) 2218 (1617-8590) 1666 (896-4662) 0,008

CD4 (106 cél/L) 828 (372-2908) 822 (174-2161) 891,5 (424-2210) 0,872

CD8 (106 cél/L) 937 (421-2828) 1285 (954-6216) 658,5 (361-1958) <0,001

Razão CD4/CD8 0,93 (0,46-1,96) 0,55 (0,08-1,40) 1,32 (0,81-2,04) <0,001

CV de HIV-1 (cópias RNA/mL) <50 4820 (1215-471374) N/A N/A

CV de HIV-1 (log RNA/mL) N/A 3,7 (3,1-5,7) N/A N/A

Na série vermelha, os pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL tiveram menor

número absoluto de eritrócitos que os controles saudáveis (p<0,05, teste de comparações

múltiplas não paramétricas). Além disso, estes pacientes tiveram menor concentração de

hemoglobina e percentual de hematócrito em relação aos pacientes com CV indetectável e

36

em relação aos controles saudáveis (p<0,05, teste de comparações múltiplas não

paramétricas para todos os casos).

Na série branca, os pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL apresentaram

maior número absoluto de monócitos e de CD3 que os controles saudáveis (p<0,05, teste de

comparações múltiplas não paramétricas para ambos). Quanto à subpopulação de linfócitos

CD8, os pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL tiveram um maior número absoluto

de CD8 em relação aos pacientes com CV indetectável e os ambos os grupos de pacientes

apresentaram contagem de CD8 mais elevada e menor razão CD4/CD8 em relação ao

grupo controle (p<0,05, teste de comparações múltiplas não paramétricas para todos os

casos). Foi observada uma correlação negativa entre a CV e a porcentagem de células CD4

para os pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL (Spearman’s rho=-0,846, p<0,001,

n=14).

Caracterização das subpopulações de células dendríticas do sangue periférico

Na Figura 1 é mostrado um exemplo de caracterização das mDC e pDC por

citometria de fluxo, sendo descritas as suas porcentagens em 30.000 eventos totais de

CMSP. As mDC foram caracterizadas como CD14-CD11c+HLA-DR+ e as células pDC

foram caracterizadas como CD11-BDCA-2+HLA-DR+.

37

Figura 1: Painel de análise das DC periféricas por citometria de fluxo. Após seleção das células

mononucleares do sangue periférico foi desenhado um gate nas populações CD14-CD11c+ para as DC

mielóides (mDC), outro nas populações CD11c-BDCA-2+ para as DC plasmocitóides (pDC) e observou-se

então a expressão de HLA-DR. As porcentagens de mDC e pDC são calculadas em relação ao Grand Parent.

Na Figura 2 são apresentados os percentuais das subpopulações de mDC e pDC em

pacientes infectados por HIV e em controles saudáveis. Ao se comparar os três grupos,

houve uma diferença significativa para as duas subpopulações de DC periféricas, porém

estas diferenças não foram identificadas nos testes de comparações múltiplas não

paramétricas. Não foi observada correlação entre as porcentagens de ambas as

subpopulações de DC com a CV nos pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL, porém a

porcentagem de pDC correlacionou diretamente com o tempo do tratamento nos pacientes

com CV indetectável (Spearman’s rho=0,554, p=0,004, n=25).

38

CV indetectável CV 1000 Controles0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

p=0,041

n=25 n=14 n=20

mD

C (

%)

CV indetectável CV 1000 Controles0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

p=0,045

n=25 n=14 n=20

pD

C (

%)

Figura 2: Percentual de células dendríticas mielóides (A) e plasmocitóides (B) em relação ao total de células

mononucleares em sangue periférico de pacientes com CV indetectável (), CV ≥1000 cópias de RNA/mL

(CV ≥1000, ) e controles (■), obtido por citometria de fluxo. P corresponde à comparação dos grupos pelo

teste de Kruskal-Wallis.

Caracterização das células dendríticas derivadas de monócitos

Na Figura 3 é apresentado um exemplo da morfologia das MDDC obtidas em

cultura antes e após os estímulos de maturação. Quando imaturas, as MDDC são

caracterizadas por um aspecto arredondado, apresentando uma morfologia estrelada com

projeções dos dendritos após a maturação.

A B

39

.

Figura 3: Microscopia de contraste de fase da diferenciação de monócitos em MDDC em cultura de um

controle saudável (A) no terceiro dia de cultura com GM-CSF e IL-4, (B) antes e (C) após a indução da

maturação com citocinas próinflamatórias e incubação com AT-2 HIV (aumento de 20x).

Na Figura 4 é apresentado o painel de caracterização das MDDC pela expressão dos

marcadores de maturação por citometria de fluxo. A diferenciação se deu com a partir de

monócitos isolados com pureza de aproximadamente 97% e as MDDC foram

caracterizadas como CD14-CD11c+. Foi analisada a expressão de CD40, HLA-DR, CD80,

CD83, CD86 e DC-SIGN.

A B C

40

Figura 4: Painel de análise das MDDC por citometria de fluxo. Após seleção das células viáveis em um

gráfico FSC x SSC é feito um gate nas populações CD11c+ (próximo a 100%) e observa-se então a expressão

de CD40, HLA-DR, CD80, CD83, DC-SIGN (CD209), CD86.

A Figura 5 mostra a comparação das medianas de intensidade de fluorescência entre

as MDDC antes e após o estímulo com AT-2 HIV-1 e com as microvesículas H9. Em geral,

houve maior expressão de todas as moléculas estudadas após o pulso antigênico para

pacientes e controles, exceto para DC-SIGN, que apresentou maior expressão antes do

estímulo. Não foi observada diferença entre as MDDC estimuladas com AT-2 HIV-1 ou

com as microvesículas H9, exceto para a expressão de CD86 nos controles saudáveis que

estava aumentada para as MDDC estimuladas com AT-2 HIV-1 em relação às MDDC

estimuladas com as microvesículas. Quando imaturas, a expressão de DC-SIGN nos

pacientes com CV indetectável foi menor que os controles saudáveis (p<0,05, teste de

comparações múltiplas não paramétricas).

41

CD40

n=12 n=8 n=8 n=11 n=7 n=7 n=12 n=9 n=90

2000

4000

6000

8000

10000

CV indetectável CV 1000 Controles

p=0,012 p=0,018 p=0,011

MF

I

HLA-DR

n=12 n=8 n=8 n=11 n=7 n=7 n=12 n=9 n=90

10000

20000

30000 p=0,012 p=0,028 p=0,008

CV indetectável CV 1000 Controles

MF

I

CD80

n=12 n=8 n=8 n=11 n=7 n=7 n=12 n=9 n=90

5000

10000

20000

30000 p=0,012 p=0,018 p=0,008

CV indetectável CV 1000 Controles

MF

I

CD83

n=12 n=8 n=8 n=11 n=7 n=7 n=12 n=9 n=90

5000

10000

15000

20000 p=0,012 p=0,018 p=0,008

CV indetectável CV 1000 Controles

MF

I

CD86

n=12 n=8 n=8 n=11 n=7 n=7 n=12 n=9 n=90

20000

40000

60000

80000 p=0,017 p=0,018 p=0,008

CV indetectável CV 1000 Controles

p=0,038

MF

I

DC-SIGN

n=12 n=8 n=8 n=11 n=7 n=7 n=12 n=9 n=90

2000

4000

6000

8000

10000

p=0,036 p=0,018 p=0,008

CV indetectável CV 1000 Controles

p* <0,05

MF

I

Figura 5: Mediana da intensidade de fluorescência (MIF) de CD40 (A), HLA-DR (B), CD80 (C), CD83 (D),

CD86 (E) e DC-SIGN (F) das MDDC dos pacientes infectados por HIV com CV indetectável, CV ≥1000

cópias de RNA/mL (CV ≥1000) e controles antes ( ) e após o estímulo com AT-2 HIV-1 ( ) e com as

microvesículas H9 ( , obtida por citometria de fluxo. P e p* correspondem às diferenças observada pelos

testes de Wilcoxon e comparações múltiplas não paramétricas, respectivamente.

A B

C D

E F

42

Produção de citocinas no sobrenadante das culturas de MDDC

Foram realizadas as dosagens de IL-12, IFN-α e TGF-β1 nos sobrenadantes de

cultura de das MDDC incubadas com HIV e microvesículas H9. Na Figura 6 são

apresentadas as concentrações destas citocinas em pacientes infectados por HIV, com CV

indetectável ou CV ≥1000 cópias de RNA/mL e em controles saudáveis. Não houve

diferença significativa entre os grupos para IL-12 e TGF-β1 (Figura 6A e 6B) e não foi

observada qualquer produção de IFN-α pelas MDDC independentemente do grupo (CV

indetectável n=20; CV ≥1000 cópias de RNA/mL n=12; controles n=12). Foi observada

uma correlação positiva entre a concentração de IL-12 e TGF-β1 para os pacientes com CV

indetectável (Spearman’s rho=0,503, p=0,020, n=21) e para os controles (Spearman’s

rho=0,687, p=0,010, n=13).

43

HIV Micro HIV Micro HIV Micro

0

4000

8000

12000

16000

CV indetectável

n=21

CV 1000

n=11

Controles

n=13

Co

nce

ntr

ação

de

IL

-12 (

pg

/mL

)

HIV Micro HIV Micro HIV Micro

0

100

200

300

400

500 p=0,006

CV indetectável

n=22

CV 1000

n=14

Controles

n=15

Co

nce

ntr

ação

de

TG

F-

1 (

pg

/mL

)

Figura 6: Concentração das citocinas IL-12 (A) e TGF-β1 (B) (pg/mL) nos sobrenadante de culturas de

MDDC de pacientes infectados pelo HIV com CV indetectável, CV ≥1000 cópias de RNA/mL (CV ≥1000) e

controles, obtidas por testes de ELISA. () corresponde às MDDC estimuladas com AT-2 HIV-1 e ()

corresponde às MDDC estimuladas com microvesículas H9 (Micro). P corresponde a diferença observada

pelo teste de Wilcoxon

Produção de citocinas no sobrenadante das coculturas de MDDC e linfócitos

Na Figura 7 são apresentadas as concentrações de IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10,

TNF-α, IFN-γ, IFN-α e TGF-β1 dosadas nos sobrenadantes das coculturas de MDDC e

linfócitos em pacientes com CV indetectável, CV ≥1000 cópias de RNA/mL e em controles

saudáveis. Houve uma diferença entre os grupos quanto à concentração de IFN-γ (Figura

7A). Interessantemente, foi observada uma maior produção de citocinas do padrão Th1

(IFN-γ, IL-2 e TNF-α) pelas coculturas estimuladas com HIV em relação às coculturas

estimuladas com microvesículas de ambos os grupos de pacientes, além da produção da

citocina pró-inflamatória IL-6 e da antiviral IFN-α (Figura 7A, 7B, 7C, 7F e 7G). O mesmo

A B

44

não foi observado para as citocinas do padrão Th2, onde poucos pacientes apresentaram

produção de IL-4 e IL-5 acima dos limites de detecção e não foi observada produção de IL-

10 independentemente do grupo ou estímulo (CV indetectável n=17; CV ≥1000 cópias de

RNA/mL n=13; controles n=14).

No grupo de pacientes com CV indetectável, a concentração de IFN-γ

correlacionou-se à produção de IL-2 (Spearman’s rho=0,894, p<0,001, n=17) e IL-6

(Spearman’s rho=0,715, p=0,001, n=17). Para os pacientes com CV ≥1000 cópias de

RNA/mL foram observadas correlações positivas entre IFN-γ e IL-2 (Spearman’s

rho=0,714, p=0,006, n=13), IFN-γ e IFN-α (Spearman’s rho=0,674, p=0,011, n=13), IFN-α

e IL-2 (Spearman’s rho=0,608, p=0,028, n=13) e entre IL-2 e IL-6 (Spearman’s rho=0,782,

p=0,008, n=10).

45

HIV Micro HIV Micro HIV Micro

0

1000

2000

3000

4000

8000

10000

p=0,002 p=0,028

p*=0,043

CV indetectável

n=17

CV 1000

n=13

Controles

n=14

Co

nce

ntr

ação

de

IF

N-

(p

g/m

L)

HIV Micro HIV Micro HIV Micro

0

100

200

300

400 p=0,002 p=0,028

CV indetectável

n=17

CV 1000

n=13

Controles

n=14

Co

nce

ntr

ação

de

IL

-2 (

pg

/mL

)

HIV Micro HIV Micro HIV Micro

0

50

100

150 p=0,038

CV indetectável

n=17

CV 1000

n=13

Controles

n=14

Co

nce

ntr

ação

de

TN

F-

(p

g/m

L)

HIV Micro HIV Micro HIV Micro

0

100

200

300600

800

CV indetectável

n=17

CV 1000

n=13

Controles

n=14

Co

nce

ntr

ação

de

IL

-4 (

pg

/mL

)

A B

C D

46

HIV Micro HIV Micro HIV Micro

0

2

4

6

8

10

CV indetectável

n=17

CV 1000

n=13

Controles

n=14

Co

nce

ntr

ação

de

IL

-5 (

pg

/mL

)

HIV Micro HIV Micro HIV Micro

0

100

200

300

400

500 p=0,003 p=0,028

CV indetectável

n=17

CV 1000

n=10

Controles

n=11

Co

nce

ntr

ação

de

IL

-6 (

pg

/mL

)

HIV Micro HIV Micro HIV Micro

0

50

100

150

200

1000

2000

3000p=0,028

CV indetectável

n=17

CV 1000

n=13

Controles

n=14

Co

nce

ntr

ação

de

IF

N-

(p

g/m

L)

HIV Micro HIV Micro HIV Micro

0

500

1000

1500

2000

2500p=0,002 p=0,033

CV indetectável

n=18

CV 1000

n=13

Controles

n=13

Co

nce

ntr

ação

de

TG

F-

1 (

pg

/mL

)

Figura 7: Concentração das citocinas IFN-γ (A), IL-2 (B), TNF-α (C), IL-4 (D), IL-5 (E), IL-6 (F), IFN-α

(G), TGF-β1 (H) (pg/mL) nos sobrenadante das coculturas de MDDC e de linfócitos de pacientes infectados

pelo HIV com CV indetectável, CV ≥1000 cópias de RNA/mL (CV ≥1000) e controles, obtidas pelos testes

de ELISA e CBA. () corresponde às coculturas estimuladas com AT-2 HIV-1; e () corresponde às

coculturas estimulas com microvesículas H9 (Micro). P e p* correspondem às diferenças observadas pelos

testes de Wilcoxon e teste de Kruskal-Wallis, respectivamente.

G H

E F

47

PCR quantitativo em tempo real

Foram realizadas as validações dos sistemas gene alvo/gene de referência por meio

da quantificação da expressão gênica absoluta. Na Tabela 5 são apresentados os valores da

eficiência da amplificação, que estavam próximos a 100%, além das equações das linhas de

tendência, que apresentaram inclinação menor do que 0,1, apontando que os sistemas foram

validados.

Tabela 5: Valores de eficiência (Eff%), R² e das equações das retas dos sistemas dos genes alvo/gene de

referência obtidos pela quantificação gênica absoluta nos experimentos de RT-qPCR.

Gene alvo R² Eff% Equação da reta

GAPDH HPRT1

IFN-α17 0,962 101,48 y=0,0749x-12,148 y=0,0972x-8,5939

IFN-β1 0,962 102,52 y=-0,0667x-9,3659 y=0,0005x-6,8999

IFN-γ 0,991 100,29 y=0,0463x-4,1644 y=0,0593x-1,7044

IL-6 0,987 105,37 y=0,0483x-4,4637 y=0,0421x-1,8774

IL-8 0,990 107,75 y=0,0062x-1,1868 y=-0,0037x-5,7734

IL-9 0,983 103,91 y=0,0185x-12,328 y=0,0738x-8,0774

A Figura 8 mostra a análise da expressão dos seis genes identificados no PCR Array

com hiper ou hipoexpressão em relação aos controles saudáveis por RTqPCR de amostras

de 10 indivíduos de cada grupo. Para analisar a expressão dos genes alvo, o RNAm das

células estimuladas com microvesículas H9 foram utilizadas como referência com

quantificação igual a 1,0. Houve diferença significativa na expressão de IFN-γ, que foi

maior em ambos os grupos de pacientes em relação aos controles saudáveis (p<0,05, teste

de comparações múltiplas não paramétricas). Foi observada uma diferença na expressão

gênica de IL-8, porém a mesma não foi identificada no teste de comparações múltiplas não

paramétricas.

48

CV indetectável CV 1000 Controles0

10

20

30

40

50p<0,05

p<0,05

Exp

ressão

rela

tiva d

e IF

N-

CV indetectável CV 1000 Controles

0

1

2

3

4

5p*=0,038

Exp

ressão

rela

tiva d

e IL

-8

CV indetectável CV 1000 Controles0

5

10

15

Exp

ressão

rela

tiva d

e IL

-6

CV indetectável CV 1000 Controles0

2

4

6

8

Exp

ressão

rela

tiva d

e IL

-9

CV indetectável CV 1000 Controles0

10

20

30

150

200

Exp

ressão

rela

tiva d

e IF

N-

17

CV indetectável CV 1000 Controles

0

5

10

1540

60

Exp

ressão

rela

tiva d

e IF

N-

1

Figura 8: Expressão gênica relativa de IFN-γ (A), IL-8 (B), IL-6 (C), IL-9 (D), IFN-α17 (E) e IFN-β1 (F) nas

coculturas de MDDC e linfócitos de 10 pacientes com CV indetectável, 10 com CV ≥1000 cópias de

RNA/mL e 10 controles saudáveis, estimuladas com AT-2 HIV-1, obtida pelos ensaios de RT-qPCR. A

expressão foi avaliada em relação às amostras de referência estimuladas com microvesículas H9, com

quantificação igual a 1,0 e todos os genes foram normalizados com os controles endógenos GAPDH e

HPRT1. Dados apresentados como mediana, mínimo e máximo (Tukey); (●) correponde aos outliers; p e p*

correspondem às diferenças observadas pelos testes de comparações múltiplas não paramétricas e Kruskal-

Wallis, respectivamente.

A B C

D E F

49

Linfoproliferação HIV específica

Após a estimulação com AT-2 HIV-1 ou com as microvesículas, as MDDC maduras

foram cocultivadas com linfócitos autólogos para determinar a proliferação linfocitária. A

proliferação HIV específica foi maior nos pacientes com CV indetectável em comparação

com pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL (p=0,004, teste de Mann-Whitney,

Figura 9). Não houve diferença para a linfoproliferação estimulada por PHA entre os

grupos (p=0,067, teste de Kruskal-Wallis). Não foi observada diferença significativa entre

os grupos para as proporções de blastos CD4 e CD8 nas coculturas estimuladas com HIV

ou PHA (teste de Mann-Whitney e teste de Kruskal Wallis, p>0,05 em todos os casos). A

proliferação HIV específica nas coculturas dos pacientes com CV indetectável

correlacionou-se à produção de IL-2 (Spearman’s rho=0,834, p=0,005, n=9) e de IFN-α

(Spearman’s rho=0,749, p=0,020, n=9).

50

CV indetectável CV 1000 Controles-20

0

20

40

60p=0,004

n=10

Lin

fop

rolife

ração

HIV

esp

ecífic

a (

%)

n=8 n=8

CV indetectável CV 1000 Controles0

20

40

60

80

100

Lin

fop

rolife

ração

PH

A e

sp

ecífic

a (

%)

n=9 n=8 n=7

Ne

g

HIV

Mic

ro

PH

A

Ne

g

HIV

Mic

ro

PH

A

Ne

g

HIV

Mic

ro

PH

A

0

50

100

150

CV indetectável CV 1000 Controles

Bla

sto

s C

D4+

(%

)

Ne

g

HIV

Mic

ro

PH

A

Ne

g

HIV

Mic

ro

PH

A

Ne

g

HIV

Mic

ro

PH

A

020

40

60

80

100

CV indetectável CV 1000 Controles

Bla

sto

s C

D8+

(%

)

Figura 9: Linfoproliferação HIV específica e estimulada por PHA (A, B) e a porcentagem de células

blásticas CD4 e CD8 (C, D) nas coculturas de MDDC e linfócitos sem estímulo (Neg: ●) ou estimuladas com

HIV (■), microvesículas (Micro: ▲) ou PHA (▼) de pacientes com CV indetectável ou ≥1000 cópias de

RNA/mL (CV ≥1000) e controles saudáveis, obtidas por citometria de fluxo. As barras indicam as medianas

e p corresponde à diferença observada pelo teste de Mann-Whitney.

C D

A B

51

5. DISCUSSÃO

Embora a TARVc tenha reduzido drasticamente a morbidade e mortalidade dos

indivíduos infectados pelo HIV nos últimos anos, a total supressão viral plasmática ainda se

faz difícil de alcançar em crianças e adolescentes devido a fatores como a resposta

imunológica do indivíduo, a resistência viral, a toxicidade das drogas e a baixa adesão.

Assim, muitos estudos têm focado na utilização de vacinas terapêuticas com MDDC

pulsadas com o HIV inativado como uma estratégia promissora para indivíduos com

infecção crônica pelo HIV. Visto o papel das DC como potentes adjuvantes naturais

capazes de induzir a resposta imune celular, este estudo visou quantificar as subpopulações

periféricas de DC e avaliar o fenótipo e função das MDDC frente às partículas de HIV-1

inativado de pacientes pediátricos verticalmente infectados por HIV com CV indetectável e

com viremia persistente, bem como de controles saudáveis.

Nós analisamos os subconjuntos de DC periféricas para determinar se a viremia

plasmática afeta numericamente estas células em crianças com infecção crônica pelo HIV.

Ao se comparar os três grupos, foram observadas diferenças significativas nos percentuais

de mDC e pDC, porém estas diferenças não foram identificadas nos testes de comparações

múltiplas não paramétricas.

Já foi descrito uma diminuição do número de mDC no estágio primário e crônico da

infecção pelo HIV-1 (Pacanowski et al., 2001; Sabado et al., 2010) e uma correlação

negativa das mDC com a CV em adultos e também em crianças sem TARV (Chehimi et al.,

2002; Zhang et al., 2006).

Mesmo sem identificar qual grupo teve diferença na frequência de pDC, a maioria

dos pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL apresentou porcentagem de pDC próxima

52

a zero. Estudos anteriores correlacionaram alta CV com uma diminuição na produção de

IFN-α entre crianças (Azzoni et al., 2005) e adultos infectados pelo HIV (Finke et al., 2004;

Chehimi et al., 2002). Adicionalmente, foi relatada uma correlação inversa entre a CV e as

porcentagens de pDC de adultos (Donaghy et al., 2001; Barron et al., 2003; Killian et al.,

2006; Desai et al., 2007; Sabado et al., 2010), associada com a progressão da doença e

surgimento de infecções oportunistas (Desai et al., 2007). Alguns estudos apontam para

uma recuperação dos percentuais das subpopulações de DC de adultos sob TARVc após a

supressão viral (Donaghy et al, 2001; Pacanowski et al, 2001; Barron et al., 2003; Finke et

al., 2004; Desai et al. 2007). Contudo, o trabalho de Chehimi et al. (2002) mostra uma

redução persistente dos percentuais de pDC em comparação aos controles saudáveis. Já

Azzoni et al. (2005) e Zhang et al. (2006) comentam que, ao contrário dos adultos, crianças

e adolescentes infectados sob TARV, têm uma tendência para recuperação total das

percentagens de mDC e pDC, devido à maior plasticidade do sistema imune dessa faixa

etária. Além disso, observamos uma correlação direta entre a porcentagem de pDC e o

tempo de tratamento nos pacientes com CV indetectável, reforçando a importância da

TARV na recuperação das subpopulações de DC em crianças e adolescentes.

Os pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL apresentaram uma monocitose em

relação aos controles saudáveis, o que demonstra a preservação da medula óssea desses

pacientes em constante produção celular mesmo sob o estado da infecção crônica (Silva et

al., 2001). Os monócitos de ambos os grupos de pacientes foram diferenciados in vitro em

MDDC com sucesso, utilizando meio AIM-V suplementado com as citocinas

recombinantes GM-CSF e IL-4. Assim, as MDDC foram submetidas ao processo de

53

maturação utilizando coquetel de citocinas pró-inflamatórias pulsadas com AT-2 HIV-1 ou

microvesículas H9.

Após a maturação, as MDDC dos três grupos apresentaram maior expressão de HLA-

DR, CD40, CD80, CD83 e CD86, corroborando com os dados da literatura para MDDC de

adultos infectados pelo HIV (Chougnet et al., 1999; Sapp et al., 1999; Newton et al., 2006;

Buisson et al., 2009). A expressão destas moléculas no estado maduro é extremamente

necessária para uma efetiva apresentação de antígenos e ativação das células T (Donaghy et

al., 2001; Pacanowski et al., 2001). Não foi observada diferença na expressão destes

marcadores entre as MDDC estimuladas com AT-2 HIV-1 ou com as microvesículas H9 e,

suplantando estes resultados, já foi verificado que o HIV por si só não é capaz de induzir a

maturação MDDC; ainda, a infecção pode comprometer este processo, reduzindo, por

exemplo, a expressão de MHC-II (Granelli-Piperno et al., 2004; Buisson et al., 2009;

Fairman et al., 2012). Nossos dados são similares aos obtidos por Newton et al. (2006), que

não encontraram diferenças no fenótipo entre as MDDC de adultos infectados pelo HIV sob

TARV com CV <1000 cópias de RNA/mL, sem TARV com CV >30900 cópias de

RNA/mL e controles saudáveis. Estes resultados nos mostram que MDDC de indivíduos

infectados por HIV com diferentes CV apresentam uma tendência à expressão normal das

moléculas coestimulatórias após a maturação.

As MDDC imaturas dos pacientes com CV indetectável apresentaram menor

expressão de DC-SIGN em relação aos controles saudáveis, igualmente relatado por

Carbonneil et al. (2003). DC-SIGN está envolvida na interação e captação de antígenos

(Engering et al., 2002; Caparrós et al., 2006), desempenhando um papel regulador na

maturação de MDDC, uma vez que as vias de processamento do HIV estimuladas por DC-

54

SIGN podem induzir a expressão de MHC de classe I e II (Moris et al., 2004; Moris et al.,

2006). Esses resultados demonstram que apesar da menor expressão de DC-SIGN, o

fenótipo de maturação das MDDC nos pacientes com CV indetectável foi semelhante aos

controles saudáveis.

Nesse sentido, foi analisada a capacidade das MDDC em apresentar o HIV para as

células T autólogas. Embora nos pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL o fenótipo

das MDDC maduras e o padrão de linfoproliferação para PHA terem sido normais, a

linfoproliferação HIV específica nas coculturas foi reduzida em comparação com

indivíduos com CV indetectável. Semelhante aos nossos resultados, as MDDC de pacientes

com CV suprimida estimuladas com p24 de HIV apresentaram uma maior capacidade

linfoproliferativa em relação aos indivíduos sem TARV (D’ettorre et al., 2004) ou com

CD4 <200 células/µL e CV >1000 cópias de RNA/mL (Hsieh et al., 2003). As MDDC de

pacientes com alta CV apresentaram menor capacidade de induzir a proliferação de células

NK (Mavilio et al., 2006). Desse modo, é possível que a falha na estimulação seja dos

linfócitos, como, por exemplo, na expressão da molécula coestimulatória CD28, que

interage com CD83 e CD86 e leva à expansão clonal de células T e aumento na secreção de

IL-2 (Bertram et al., 2004). Ou ainda, há uma maior expressão de B-Lymphocyte–induced

maturation protein-1 (Blimp-1) em linfócitos T estimulados por MDDC pulsadas com

HIV-1 (Shankar et al., 2011), a qual reprime diretamente a expressão de IL-2 e,

consequentemente, há menor linfoproliferação em pacientes com viremia (Seddiki et al.,

2013) e exaustão nas células T (Thaventhiran & Fearon, 2013).

Ao analisar a produção de citocinas por MDDC, não foi observada produção de IFN-

α, provavelmente devido ao fato que MDDC geradas in vitro apresentam um fenótipo

55

mielóide (Ghanekar et al., 2007). Comparando os três grupos, não houve diferenças na

produção de IL-12 e TGF-β1. Da mesma forma, Connolly et al. (2008) não observaram

diferenças na secreção de IL-12 entre MDDC maduras de adultos infectados pelo HIV sob

TARV e indivíduos saudáveis. IL-12 é um requisito para a eficácia da imunoterapia contra

a infecção pelo HIV e atua como modulador na diferenciação de CD4 näives em células do

tipo Th1, favorecendo respostas T citotóxicas antivirais e na secreção de IFN-γ

(Banchareau et al., 1998).

Quanto às citocinas produzidas pelas coculturas, as MDDC pulsadas com AT-2 HIV-

1 foram capazes de induzir a produção de citocinas do perfil Th1, como IL-2, TNF-α e

IFN-γ, mas sem diferenças entre os grupos. Interessantemente, nos ensaios de RT-qPCR,

houve uma maior expressão relativa de mRNA de IFN-γ em ambos os grupos de pacientes

em relação aos controles. Resultados semelhantes já foram relatados em coculturas de

MDDC de adultos eletroporadas com peptídeos de HIV (Van Gulck et al., 2006; Allard et

al., 2008). Vários ensaios clínicos já demonstraram um fenótipo Th1 induzido pelas MDDC

(Kundu et al., 1998; Lu et al., 2004; García et al., 2005), associado com o aumento de

respostas T anti-HIV (García et al., 2012) e com o controle da infecção pelo HIV (Reuter et

al., 2012). Em um dos primeiros ensaios publicados, Lu et al. (2004) mostraram que a

vacina com MDDC pulsadas com AT-2 HIV-1 em adultos infectados sem TARV reduziu a

CV em 90% após 1 ano da vacinação em 8 de 18 indivíduos vacinados e aumentou a

porcentagem de células CD4 HIV específicas expressando IL-2 e IFN-γ. Em nossos

resultados, nos pacientes com CV indetectável, a concentração de IL-2 correlacionou-se à

produção de IFN-γ e à linfoproliferação em coculturas. Da mesma forma, células CD4

polifuncionais (IL-2+IFN-γ+) foram mais frequentes em crianças com CV mais baixas

56

(Correa et al., 2007). Jost et al. (2014) mostraram que a vacina terapêutica em indivíduos

sob TARVc pode reconstituir a frequência de células CD4 IL-2+ HIV específicas, que, por

sua vez, promovem o aumento do número de células NK IFN-γ+. Concomitantemente, a

falta de secreção de IL-4, IL-5 e IL-10 observada em nossos resultados fortalece os dados

da literatura, nos quais as MDDC evitam a diferenciação de células do tipo Th2 (García et

al., 2012). Encontramos uma significativa concentração de IL-6 e IFN-α nas coculturas de

MDDC nos pacientes com CV indetectável, possivelmente produzidas por células NK ou

até mesmo pDC presentes no momento do congelamento das células CD14-, no caso de

IFN-α (Siegal et al., 1999; Hosmalin & Lebon, 2006). Esses resultados nos revelam que o

estímulo in vitro das MDDC com antígenos do HIV-1 promovem uma complexa resposta

imune HIV específica.

Nós observamos uma produção basal de TGF-β1 nas culturas de MDDC,

correlacionada fortemente com a produção de IL-12 nos pacientes com CV indetectável e

nos controles. Além disso, houve um aumento na secreção de TGF-β1 após a cocultura com

linfócitos. As DC são capazes de produzir TGF-β1, levando à diferenciação das células

Treg (Kushwah et al., 2011), que também secretam TGF-β1 (Sojka et al., 2008). Pacientes

vacinados com MDDC sob TARVc apresentam uma maior frequência de células Treg

(Connolly et al., 2008; Rinaldo et al., 2009), e quando há a depleção dessas células de

CMSP em cultura, há um aumento de respostas de células CD8 polifuncionais Gag

específicas (Macatangay et al., 2010). Estes dados sugerem que as células Treg podem

impedir uma resposta de células T anti-HIV mais robusta (Macatangay & Rinaldo, 2010).

Ao mesmo tempo, a presença de Treg pode controlar uma ativação imune exacerbada e

evitar a progressão mais rápida da doença (Card et al., 2010). Em nossos experimentos,

57

houve o desenvolvimento de respostas HIV específicas, mesmo com a presença de TGF-β1

nas coculturas.

As características imunológicas aqui apresentadas foram associadas com resultados

positivos publicados até hoje nos ensaios clínicos envolvendo a imunoterapia com MDDC

em adultos infectados pelo HIV (Kundu et al., 1998; Lu et al., 2004; García et al., 2005; Ide

et al., 2006; Van Gulck et al., 2006; Connolly et al., 2008; Allard et al., 2008; García et al.,

2013). Nós somos os primeiros a demonstrar que MDDC obtidas a partir de monócitos de

crianças e adolescentes verticalmente infectados pelo HIV apresentam um fenótipo e

função preservados. Quando cultivadas com linfócitos autólogos, as MDDC induziram

respostas antivirais, inclusive produção de citocinas do padrão Th1 e significativa

expressão gênica de IFN-γ em relação aos controles saudáveis. Contudo, observou-se um

prejuízo na linfoproliferação HIV específica nos pacientes com CV ≥1000 cópias de

RNA/mL. Nossos resultados representam um passo inicial para o desenvolvimento de

vacinas terapêuticas utilizando MDDC como alternativa para crianças e adolescentes que

apresentam a infecção pelo HIV desde o período perinatal e têm a perspectiva de uso

contínuo de TARVc ao longo de toda a sua vida.

58

59

6. CONCLUSÃO

Após análise dos resultados deste trabalho, pôde-se concluir que:

1. Crianças e adolescentes verticalmente infectados pelo HIV-1 sob TARVc

apresentaram maior percentual de linfócitos T CD8 e menor razão CD4/CD8 em

relação aos controles saudáveis.

2. Em geral, crianças e adolescentes verticalmente infectados pelo HIV-1 sob TARVc

apresentaram percentuais de DC periféricas semelhantes aos controles saudáveis.

3. As MDDC geradas in vitro de crianças e adolescentes infectados pelo HIV-1

apresentaram um fenótipo normal após o estímulo de maturação, expressando

CD40, CD80, CD83, CD86 e HLA-DR semelhantemente aos controles saudáveis.

4. As MDDC de crianças verticalmente infectadas pelo HIV-1 foram capazes de

induzir respostas imunes celulares HIV específicas, como a produção de citocinas

do padrão Th1.

5. Houve um prejuízo na linfoproliferação nas coculturas de MDDC pulsadas com AT-

2 HIV-1 com linfócitos autólogos de crianças com CV >1000 cópias RNA/mL.

6. Crianças e adolescentes verticalmente infectados pelo HIV em fase crônica sob

TARVc a longo prazo se mostraram bons candidatos para a imunoterapia utilizando

as MDDC, sendo que aqueles com CV indetectável apresentaram resultados mais

promissores.

60

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73

8. ANEXOS E APÊNDICES

74

75

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (para crianças infectadas por HIV) Declaro, por livre e espontânea vontade, que permito a participação de

___________________________________________, com registro hospitalar de no

_______________________________ que se encontra sob responsabilidade de

______________________________________________, com idade de ______ anos, com

o RG de no ___________________, residente na Rua

_________________________________________________________________________,

cujo grau de parentesco é _______________, na pesquisa intitulada “Infecção crônica pelo

HIV em crianças e adolescentes: resposta inata e adaptativa a partículas inativadas de

HIV”, promovida pelo Centro de Investigação em Pediatria, da Faculdade de Ciências

Médicas (FCM) da Unicamp, sob coordenação da Profª Dra Maria Marluce dos Santos

Vilela. Esta pesquisa tem o objetivo de investigar como o organismo das crianças e dos

adolescentes infectados pelo vírus da AIDS realiza as defesas contra esse vírus. Como o

organismo da criança e do adolescente está em processo de desenvolvimento, é importante

avaliar qualquer fraqueza nessa resposta de defesa que possa piorar a evolução da AIDS.

Atesto que recebi esclarecimentos quanto aos propósitos e procedimentos que serão

realizados, tais como:

a) entrevista para complementar a situação clínica atual do paciente;

b) coleta de sangue de veia com seringa descartável pela enfermeira para realizar exames

que medem a capacidade de defesa contra o vírus da AIDS.

Quanto aos riscos da coleta de sangue, recebi a informação de que ela causa dor pela picada

da agulha e ansiedade. A coleta será realizada por profissional preparado e com agulha e

seringa descartáveis somente em pacientes que não têm problemas de sangramentos. Dessa

maneira, a coleta de sangue não traz riscos para o paciente.

Compreendo que minha participação é voluntária e que posso sair a qualquer momento do

estudo, sem prejudicar ou influenciar os resultados. Autorizo a liberação dos dados obtidos

aos pesquisadores, aos membros da comissão de ética e à comissão científica da FAPESP,

assim como a publicação em revistas científicas especializadas e apresentação em

congressos e jornadas científicas.

Não existem danos imediatos ou futuros previsíveis decorrentes da pesquisa, e, portanto a

mesma não inclui a possibilidade de indenização. Estou ciente de que não receberei

remuneração em troca da minha participação na pesquisa e que todas as informações não

serão identificadas por nome, para garantir o absoluto sigilo. O pesquisador me garantiu

que receberei esclarecimento a qualquer dúvida em relação aos assuntos relacionados à

pesquisa, seja antes, durante ou após a realização da pesquisa. Fui informado de que

receberei uma cópia deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

De acordo,

Responsável pelo Participante: ________________________________________________

Profª Drª Maria Marluce dos Santos Vilela (telefone 19 3521-8963):___________________

Campinas,____ de ______________ de _______. Secretaria do Comitê de Ética em Pesquisa:

Rua Tessália Vieira de Camargo, 126. Caixa Postal 6111, CEP 13083-887, Campinas, SP.

Telefone: 19-3521-8936

Fax: 19-3521-7187

E-mail: cep@fcm.unicamp.br

76

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (para adolescentes infectados por HIV)

Declaro, por livre e espontânea vontade, que eu, ______________________

_____________________________, com registro hospitalar de no _____________, sob

responsabilidade de ______________________________________________, com idade

de ______ anos, com o RG de no ___________________, residente na Rua

_________________________________________________________________________,

cujo grau de parentesco comigo é _______________, desejo participar da pesquisa

intitulada ““Infecção crônica pelo HIV em crianças e adolescentes: resposta inata e

adaptativa a partículas inativadas de HIV”, promovida pelo Centro de Investigação em

Pediatria, da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da Unicamp, sob coordenação da Profª

Dra Maria Marluce dos Santos Vilela. Esta pesquisa tem o objetivo de investigar como o

organismo das crianças e dos adolescentes infectados pelo vírus da AIDS realiza as defesas

contra esse vírus. Como o organismo da criança e do adolescente está em processo de

desenvolvimento, é importante avaliar qualquer fraqueza nessa resposta de defesa que

possa piorar a evolução da AIDS.

Atesto que recebi esclarecimentos quanto aos propósitos e procedimentos que serão

realizados, tais como:

a) entrevista para complementar a situação clínica atual do paciente;

b) coleta de sangue de veia com seringa descartável pela enfermeira para realizar exames

que medem a capacidade de defesa contra o vírus da AIDS.

Quanto aos riscos da coleta de sangue, recebi a informação de que ela causa dor pela picada

da agulha e ansiedade. A coleta será realizada por profissional preparado e com agulha e

seringa descartáveis somente em pacientes que não têm problemas de sangramentos. Dessa

maneira, a coleta de sangue não traz riscos para o paciente.

Compreendo que minha participação é voluntária e que posso sair a qualquer momento do

estudo, sem prejudicar ou influenciar os resultados. Autorizo a liberação dos dados obtidos

aos pesquisadores, aos membros da comissão de ética e à comissão científica da FAPESP,

assim como a publicação em revistas científicas especializadas e apresentação em

congressos e jornadas científicas.

Não existem danos imediatos ou futuros previsíveis decorrentes da pesquisa, e, portanto a

mesma não inclui a possibilidade de indenização. Estou ciente de que não receberei

remuneração em troca da minha participação na pesquisa e que todas as informações não

serão identificadas por nome, para garantir o absoluto sigilo. O pesquisador me garantiu

que receberei esclarecimento a qualquer dúvida em relação aos assuntos relacionados à

pesquisa, seja antes, durante ou após a realização da pesquisa. Fui informado de que

receberei uma cópia deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

De acordo,

Responsável pelo Participante: ________________________________________________

Participante: _______________________________________________________________

Profª Drª Maria Marluce dos Santos. Vilela (telefone 19 3521-8963):_________________

Campinas,____ de ______________ de _______. Secretaria do Comitê de Ética em Pesquisa:

Rua Tessália Vieira de Camargo, 126. Caixa Postal 6111, CEP 13083-887, Campinas, SP.

Telefone: 19-3521-8936

Fax: 19-3521-7187

E-mail: cep@fcm.unicamp.br

77

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (para crianças saudáveis)

Declaro, por livre e espontânea vontade, que permito a participação de

___________________________________________, com registro hospitalar de no

_______________________________ que se encontra sob responsabilidade de

______________________________________________, com idade de ______ anos, com

o RG de no ___________________, residente na Rua

_________________________________________________________________________,

cujo grau de parentesco é _______________, na pesquisa intitulada “Infecção crônica pelo

HIV em crianças e adolescentes: resposta inata e adaptativa a partículas inativadas de

HIV”, promovida pelo Centro de Investigação em Pediatria, da Faculdade de Ciências

Médicas (FCM) da Unicamp, sob coordenação da Profª Dra Maria Marluce dos Santos

Vilela. Esta pesquisa tem o objetivo de investigar como o organismo das crianças e dos

adolescentes infectados pelo vírus da AIDS realiza as defesas contra esse vírus. Como o

organismo da criança e do adolescente está em processo de desenvolvimento, é importante

avaliar qualquer fraqueza nessa resposta de defesa que possa piorar a evolução da AIDS.

Para isso, precisamos comparar sua defesa a de crianças saudáveis.

Atesto que recebi esclarecimentos quanto aos propósitos e procedimentos que serão

realizados, tais como:

a) entrevista para complementar a situação clínica atual do paciente;

b) coleta de sangue de veia com seringa descartável pela enfermeira para realizar exames

que medem a capacidade de defesa contra o vírus da AIDS.

Quanto aos riscos da coleta de sangue, recebi a informação de que ela causa dor pela picada

da agulha e ansiedade. A coleta será realizada por profissional preparado e com agulha e

seringa descartáveis somente em pacientes que não têm problemas de sangramentos. Dessa

maneira, a coleta de sangue não traz riscos para o paciente.

Compreendo que minha participação é voluntária e que posso sair a qualquer momento do

estudo, sem prejudicar ou influenciar os resultados. Autorizo a liberação dos dados obtidos

aos pesquisadores, aos membros da comissão de ética e à comissão científica da FAPESP,

assim como a publicação em revistas científicas especializadas e apresentação em

congressos e jornadas científicas.

Não existem danos imediatos ou futuros previsíveis decorrentes da pesquisa, e, portanto a

mesma não inclui a possibilidade de indenização. Estou ciente de que não receberei

remuneração em troca da minha participação na pesquisa e que todas as informações não

serão identificadas por nome, para garantir o absoluto sigilo. O pesquisador me garantiu

que receberei esclarecimento a qualquer dúvida em relação aos assuntos relacionados à

pesquisa, seja antes, durante ou após a realização da pesquisa. Fui informado de que

receberei uma cópia deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

De acordo,

Responsável pelo Participante: ________________________________________________

Profª Drª Maria Marluce dos Santos Vilela (telefone 19 3521-8963):___________________

Campinas,____ de ______________ de _______. Secretaria do Comitê de Ética em Pesquisa:

Rua Tessália Vieira de Camargo, 126. Caixa Postal 6111, CEP 13083-887, Campinas, SP.

Telefone: 19-3521-8936

Fax: 19-3521-7187

E-mail: cep@fcm.unicamp.br

78

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (para adolescentes saudáveis)

Declaro, por livre e espontânea vontade, que eu, ______________________

_____________________________, com registro hospitalar de no _____________, sob

responsabilidade de ______________________________________________, com idade

de ______ anos, com o RG de no ___________________, residente na Rua

_________________________________________________________________________,

cujo grau de parentesco comigo é _______________, desejo participar da pesquisa

intitulada ““Infecção crônica pelo HIV em crianças e adolescentes: resposta inata e

adaptativa a partículas inativadas de HIV”, promovida pelo Centro de Investigação em

Pediatria, da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da Unicamp, sob coordenação da Profª

Dra Maria Marluce dos Santos Vilela. Esta pesquisa tem o objetivo de investigar como o

organismo das crianças e dos adolescentes infectados pelo vírus da AIDS realiza as defesas

contra esse vírus. Como o organismo da criança e do adolescente está em processo de

desenvolvimento, é importante avaliar qualquer fraqueza nessa resposta de defesa que

possa piorar a evolução da AIDS. Para isso, precisamos comparar sua defesa a de

adolescentes saudáveis.

Atesto que recebi esclarecimentos quanto aos propósitos e procedimentos que serão

realizados, tais como:

a) entrevista para complementar a situação clínica atual do paciente;

b) coleta de sangue de veia com seringa descartável pela enfermeira para realizar exames

que medem a capacidade de defesa contra o vírus da AIDS.

Quanto aos riscos da coleta de sangue, recebi a informação de que ela causa dor pela picada

da agulha e ansiedade. A coleta será realizada por profissional preparado e com agulha e

seringa descartáveis somente em pacientes que não têm problemas de sangramentos. Dessa

maneira, a coleta de sangue não traz riscos para o paciente.

Compreendo que minha participação é voluntária e que posso sair a qualquer momento do

estudo, sem prejudicar ou influenciar os resultados. Autorizo a liberação dos dados obtidos

aos pesquisadores, aos membros da comissão de ética e à comissão científica da FAPESP,

assim como a publicação em revistas científicas especializadas e apresentação em

congressos e jornadas científicas.

Não existem danos imediatos ou futuros previsíveis decorrentes da pesquisa, e, portanto a

mesma não inclui a possibilidade de indenização. Estou ciente de que não receberei

remuneração em troca da minha participação na pesquisa e que todas as informações não

serão identificadas por nome, para garantir o absoluto sigilo. O pesquisador me garantiu

que receberei esclarecimento a qualquer dúvida em relação aos assuntos relacionados à

pesquisa, seja antes, durante ou após a realização da pesquisa. Fui informado de que

receberei uma cópia deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

De acordo,

Responsável pelo Participante: ________________________________________________

Participante: _______________________________________________________________

Profª Drª Maria Marluce dos Santos. Vilela (telefone 19 3521-8963):_________________

Campinas,____ de ______________ de _______. Secretaria do Comitê de Ética em Pesquisa:

Rua Tessália Vieira de Camargo, 126. Caixa Postal 6111, CEP 13083-887, Campinas, SP.

Telefone: 19-3521-8936, Fax: 19-3521-7187

E-mail: cep@fcm.unicamp.br

79

Atividades profissionais e acadêmicas durante o período do mestrado

Atividades de Ensino

- Monitoria na 11ª edição do projeto Ciência e Artes nas Férias (9 de janeiro a 6 de

fevereiro de 2013), que envolveu o estágio de alunos do Ensino Médio no Laboratório de

Imunologia do Centro de Investigação em Pediatria da Faculdade de Ciências Médicas da

UNICAMP, em Campinas, SP.

- Monitoria na 12ª edição do projeto Ciência e Artes nas Férias (8 a 31 de janeiro de 2014),

que envolveu o estágio de alunos do Ensino Médio no Laboratório de Imunologia do

Centro de Investigação em Pediatria da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, em

Campinas, SP.

Participação em eventos científicos e cursos

- 2013, VIII Curso Avançado da Patogênese do HIV, 11 a 17 de abril, Faculdade de

Medicina da USP (FMUSP), São Paulo, SP.

- 2014, IX Curso Avançado da Patogênese do HIV, 19 a 26 de março, Faculdade de

Medicina da USP (FMUSP), São Paulo, SP.

- 2014, 16th International Congress on Infectious Diseases, de 2 a 5 de abril, na Cidade do

Cabo, África do Sul.

- 2014, VII Semana de Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas, de 19 a 22 de maio, em

Campinas, SP.

80

Apresentação de trabalhos em congressos

- Taís N. Mazzola, Jéssica S. Bernachi, Emanuel B.V. Anjos, Ana L.F. Longhini, Renata

Lemos, Sara T.O. Saad, Sandra C.B. Costa, Marcos T.N. Da Silva, Maria M.S. Vilela. Viral

load impact in HIV cellular immune response from children and adolescents. Pôster

apresentado no 15º Internacional Congress of Immunology, de 22 a 27 de agosto de 2013,

em Milão, Itália.

- Jéssica S. Bernachi, Taís N. Mazzola, Ana Leda F. Longhini, Emanuel B.V. Anjos, Luiz

G.R. Fernandes, Telma M. Oshiro, Renata M.B.P. Lemos, Marcos T.N. Da Silva, Maria

M.S. Vilela. Viral Load and Dendritic Cells from vertically HIV-Infected Children and

Adolescents. Pôster apresentado no 16th International Congress on Infectious Diseases, de 2

a 5 de abril de 2014, na Cidade do Cabo, África do Sul.

- Jéssica S. Bernachi, Taís N. Mazzola, Ana Leda F. Longhini, Emanuel B.V. Anjos, Luiz

G.R. Fernandes, Telma M. Oshiro, Renata M.B.P. Lemos, Marcos T.N. Da Silva, Maria

M.S. Vilela. Influência da carga viral nas células dendríticas de crianças e adolescentes

verticalmente infectados pelo HIV. Pôster presentado na VII Semana de Pesquisa da

Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, de 19 a 22 de maio

de 2014, em Campinas, SP. (Menção honrosa).

- Caroline N. Araújo; Taís N. Mazzola; Jéssica S. Bernachi; Renata M.B.P. Lemos;

Emanuel, B. V. dos Anjos; Marcos T.N. Da Silva, Maria M.S. Vilela. Cinética de produção

de citocinas frente ao HIV em cultura de células de pacientes pediátricos com infecção

vertical por HIV. Pôster presentado na VII Semana de Pesquisa da Faculdade de Ciências

Médicas da Universidade Estadual de Campinas, de 19 a 22 de maio de 2014, em

Campinas, SP.