marÍlia freitas de vasconcelos melo diversidade … · e ter mais uma nova chance de recomeçar....
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MARÍLIA FREITAS DE VASCONCELOS MELO
DIVERSIDADE GENÉTICA, ESTRUTURA GENÉTICA ESPACIAL, SISTEMA DE
REPRODUÇÃO E FLUXO GÊNICO EM JENIPAPO (Genipa americana Linnaeus)
UTILIZANDO MARCADORES MICROSSATÉLITES
Botucatu
2016
MARÍLIA FREITAS DE VASCONCELOS MELO
DIVERSIDADE GENÉTICA, ESTRUTURA GENÉTICA ESPACIAL, SISTEMA DE
REPRODUÇÃO E FLUXO GÊNICO EM JENIPAPO (Genipa americana Linnaeus)
UTILIZANDO MARCADORES MICROSSATÉLITES
Tese apresentada à Faculdade de
Ciências Agronômicas da Unesp Câmpus
de Botucatu, para obtenção do título de
Doutora em Ciência Florestal.
Orientador: Prof. Dr. Mario Luiz Teixeira
de Moraes
Coorientadora: Dra. Ana Veruska Cruz da
Silva
Botucatu
2016
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO – SERVIÇO TÉCNICO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - UNESP – FCA – LAGEADO- BOTUCATU (SP)
Melo, Marília Freitas de Vasconcelos, 1983- M528d Diversidade genética, estrutura genética espacial, sistema
de reprodução e fluxo gênico em jenipapo (Genipa americana Linnaeus) utilizando marcadores microssatélites / Marília Freitas de Vasconcelos Melo. – Botucatu :[s.n.], 2016
64 f.: ils. color., grafs.,tabs.
Tese (Doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agronômicas, Botucatu, 2016
Orientador: Mario Luiz Teixeira de Moraes Coorientadora: Ana Veruska Cruz da Silva Inclui bibliografia
1. Ecologia florestal. 2. Plantas – Melhoramento gene-
tico. 3. Genética de populações. 4. Marcadores genéticos. 5. Jenipapo – Genética. I. Moraes, Mario Luiz Teixeira de. II. Silva , Ana Veruska Cruz da. III. Universidade Esta-dual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (Campus de Botuca-tu). Faculdade de Ciências Agronômicas de Botucatu. IV. Título.
Aos meus pais,
Antônio Ferreira de Melo e Maria Freitas de Vasconcelos Melo. Amo vocês!
Dedico
A todos aqueles que de alguma forma torceram
para que eu chegasse até aqui
Ofereço
Agradecimentos
Primeiramente, agradeço a Deus pela oportunidade de acordar todos os dias
e ter mais uma nova chance de recomeçar.
Aos meus pais, fonte de luz, amor e sabedoria, por ser o meu porto seguro, por sempre me apoiar em minhas decisões e como isso... me oportunizar ter a certeza de hoje dizer... “Eu não existo longe de vocês”.
Aos meus sobrinhos, que em seus gestos simples e puro me fazem acreditar na esperança de um mundo melhor. Vocês me ensinaram uma linda forma de amar.
Aos meus irmãos, por sempre valorizarem a minha busca pelo conhecimento e por todos os momentos de alegria.
Ao meu noivo, Romullus de Sousa Lustosa, por entender que muitas vezes o tempo precisa ser limitado, por valorizar o meu trabalho e sempre acreditar que tudo vai dá certo.
À minha amiga, Danilla Cristina Lemos Souza, por toda amizade, respeito e convivência durante todo esse período. Sua presença tornou o caminho muito mais fácil de ser trilhado e a saudade suportada.
À minha co-orientadora, Dra. Ana Veruska Cruz da Silva Muniz, que esteve comigo desde o meu primeiro passo em busca dessa conquista, sempre me dizendo SIM, quando tudo parecia não ser possível.
Ao meu mestre, o Prof. Dr. Alexandre Magno Sebbenn, com quem eu tenho aprendido muito. Tenho certeza que nossos caminhos ainda vão se cruzar, pois ainda tenho muito que aprender e o considero uma das maiores fonte de conhecimento do nosso meio científico.
Ao Dr. Bruno César Rossini, pessoa fundamental para execução prática do meu trabalho. Obrigada por cada minuto de atenção a mim dedicado. Obrigada pela paciência e dedicação. Sem você, com certeza, o trabalho não teria fluido da maneira que ocorreu.
Ao Prof. Dr. Celso Luiz Marino, uma das pessoas mais simples e humana que conheci nessa minha trajetória. Que me recebeu da melhor forma que se pode receber alguém...me dizendo “ Se precisar de alguma coisa, estou por aqui”.
Ao meu orientador, o prof. Dr. Mario Luiz Teixeira de Moraes, por aceitar me orientar mesmo sem saber a pessoa quem eu era e, por todos os conhecimentos transmitidos.
A Sra. Selma, por todo atenção e presteza durante esse período.
Ao MSc José Cambuim, pessoa extremamente dedicada, de conhecimento ímpar e excelente profissionalismo, agradeço cada ida a campo e principalmente por cada palavra pronunciada.
À Dra. Ananda Virgínia, por toda ajuda, amizade, conhecimento compartilhado e por dividir momentos tão lindos durante o IUFRO 2014.
Aos amigos que Botucatu me proporcionou: Lídia, João,Karine, Thiago, Natália, Kelly e Andréia ...vocês são verdadeiros anjos que Deus colocou em minha vida.
Aos meus amigos Darlin Ulises, Kelly Cristina, Francine, Wanderley, Max, Ricardo e Diego por todos os momentos vividos. Vocês tornaram minha passagem por Ilha Solteira muito mais prazerosa.
Ao grupo de pesquisa da Embrapa Tabuleiros Costeiros, na pessoa de
Marina, Letícia, Adrielle e Jéssica, por todo apoio na execução do meu trabalho e amizade. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pela concessão da bolsa de doutorado referente ao Processo FAPESP nº2013/19444-6.
A todos vocês,
Muito Obrigada!
RESUMO
Estudos sobre ecologia e genética de populações são fundamentais para entender
os efeitos da fragmentação sobre espécies florestais. Um estudo baseado em
genética quantitativa e marcadores microssatélites foi realizado para investigar a
diversidade genética, estrutura genética espacial, sistema de reprodução e a
dispersão de pólen em uma população natural e em um teste de progênies de
Genipa americana L. para fins de conservação e melhoramento genético. As coletas
foram realizadas em duas populações: a primeira localizada no nordeste do Brasil,
em uma área de transição entre a Mata Atlântica e a Caatinga (POP-SE) e a
segunda no sudeste, em um Banco Ativo de Germoplasma estabelecido em área de
transição entre a Mata Atlântica representada pela Florestal Estacional Semidecidual
e o Cerrado (POP-SP). Foram coletados tecidos foliares de 30 árvores matrizes e 20
plantas/progênie em cada uma das populações. As análises do sistema de
reprodução foram realizadas com base no modelo misto de reprodução e modelo de
cruzamentos correlacionados. Como esperado em espécies dióicas, todas as
progênies foram originadas de cruzamento (tm= 1). A taxa de cruzamento entre
parentes (tm – ts) e a correlação de paternidade (rp) foram variáveis entre famílias (tm
– ts= 0,03-0,19; rp= 0,04-0,40). O índice de fixação (F) foi significativamente menor
em adultos que em progênies, indicando seleção contra indivíduos endogâmicos. A
correlação de paternidade dentro de frutos (0,40) foi maior que entre frutos (0,26),
indicando um menor número efetivo de doadores de pólen (Nep) dentro de frutos
(2,5) que entre frutos (3,8). Devido a maior rp na POP-SE, o tamanho efetivo dentro
de famílias nesta população foi menor (2,69) que na POP-SP (3,27). O coeficiente
de correlação de Spearman mostrou que o aumento no Nepaumenta a diversidade
genética e o Ne dentro de famílias.O padrão de dispersão de pólen foi fortemente
leptocúrtico, sugerindo dispersão de pólen a longa distância (média = 179 m). Os
resultados evidenciam a variabilidade genética entre os indivíduos e indicam a
potencialidade dos mesmos para a conservação in situ, coleta de sementes para
formação de bancos de germoplasma, bem como para a recuperação de áreas
degradadas e futuros programas de melhoramento genético em áreas de transição
entre diferentes biomas.
Palavras-chave: conservação genética, fragmentação florestal, genética de
populações
ABSTRACT
Studies about ecology and population genetics are essential to understand the
effects of fragmentation on forest species. A study based on quantitative genetics
and microsatellite markers was conducted to investigate the genetic diversity, spatial
genetic structure, mating system and pollen dispersal in a natural population and on
an progenies test of Genipa americana L. aiming conservation and breeding.
Samples were collected in two populations: the first located in the northeast of Brazil,
in a transition area between the Atlantic Forest and Caatinga (POP-SE) and the
second in the southeast, in an Active Germplasm Bank established in area transition
between the Atlantic represented by Forest Semideciduous and the Cerrado (POP-
SP).Leaf tissues were collected from 30 seed-trees and 20 plants/progeny in each of
the populations. The analysis of the mating system were performed based on the
mixed mating model and correlated crosses model. As expected in dioecious
species, all offspring were originated from outcrossing ( mt = 1). The mating among
relatives rate ( sm tt ) and paternity correlation ( pr ) were variable among families (
sm tt = 0.03-0.19; pr = 0.04-0.40), especially in NP. Fixation index ( F ) was generally
significant lower in the adults than offspring, indicating selection against inbreed
individuals. The paternity correlation within fruits (0.40) was higher than among fruits
(0.26), indicating that lower effective number of pollen donors ( epN ) within fruit (2.5)
than among fruits (3.8). Due to the highest pr in NP, the effective size within families (
eN ) was lower in NP (2.69) than PT (3.27). The Spearman ranking correlation
showed that the increase in epN increase the genetic diversity and eN within families.
The pollen dispersal pattern was strongly leptokurtic, suggesting long pollen
dispersal distance (mean= 179 m). The results show the genetic variability among
individuals and indicate the suitability of the same for conservation in-situ, seed
collection for genebanks in training, as well as the recovery of degraded areas and
future programs of breeding in transition areas between different biomes.
Keywords: genetic conservation, forest fragmentation, population genetics
SUMÁRIO 1 Introdução ............................................................................................................. 15 2 Objetivos ............................................................................................................... 15
2.1 Geral ................................................................................................................ 15
2.2 Específicos ....................................................................................................... 16
3 Revisão de Literatura ........................................................................................... 16 3.1 Fragmentação Florestal e seus efeitos genéticos ............................................ 16
3.2 Genipa americana L. ........................................................................................ 18
3.3 Parâmetros genéticos em espécies arbóreas nativas ...................................... 19
3.4 Genética de populações por marcadores genéticos ........................................ 21
3.5 Fluxo gênico ..................................................................................................... 23
3.6 Sistema de Reprodução ................................................................................... 23
4 Material e Métodos ............................................................................................... 25 4.1 Material ............................................................................................................ 25
4.2 Métodos ........................................................................................................... 27
4.2.1 Caracteres quantitativos ............................................................................ 27
4.2.1.1 POP-SE .................................................................................................. 27
a) Coleta, beneficiamento e semeadura ............................................................. 27
b) Formação de mudas ....................................................................................... 27
4.2.1.2 POP-SP .................................................................................................. 29
a) Teste de progênies e caracteres avaliados .................................................... 29
b) Modelo estatístico e estimativas de parâmetros genéticos ............................. 29
4.2.2 Análises dos locos microssatélites............................................................. 31
4.2.2.1 Atividades comuns as populações POP-SE e POP-SP .......................... 31
a) Coleta de tecidos foliares para extração do DNA ........................................... 31
b) Quantificação do DNA .................................................................................... 33
c) Diluição do DNA ............................................................................................. 34
d) Reações de PCR ............................................................................................ 34
e) Genotipagem .................................................................................................. 36
f) Diversidade, estrutura genética e endogamia ................................................. 36
g) Sistema de reprodução ................................................................................... 37
h) Coeficiente de correlação de Spearman ......................................................... 38
4.2.2.2 POP-SE .................................................................................................. 38
5 Resultados ............................................................................................................ 39 5.1 Genética quantitativa ....................................................................................... 39
5.2 Genética Molecular .......................................................................................... 40
5.2.1 Diversidade genética e endogamia ............................................................ 40
5.2.2 Dispersão de pólen .................................................................................... 41
5.2.3 Sistema de Reprodução em nível de população ....................................... 42
5.2.4 Sistema de reprodução em nível de família .............................................. 43
6 Discussão ............................................................................................................. 47 6.1 Genética Quantitativa ...................................................................................... 47
6.2 Genética Molecular .......................................................................................... 48
6.2.1 Diversidade genética e endogamia ........................................................... 48
6.2.2 Dispersão de pólen ................................................................................... 49
6.2.3 Sistema de Reprodução ............................................................................ 49
7 Conclusões .......................................................................................................... 51 Referências ............................................................................................................. 52 Apêndice .................................................................................................................. 64
15
1 Introdução
No Brasil ocorre uma exploração indiscriminada dos recursos naturais. Da
maneira que esta vem ocorrendo, puramente exploratória, tem contribuído
desfavoravelmente para a manutenção desses ecossistemas, sendo iminente a
necessidade de conservação dos mesmos, além da recuperação das áreas já
devastadas. Um exemplo prático desse fato está relacionado à Mata Atlântica, onde
a conservação desse ecossistema é considerada prioritária para a manutenção da
diversidade biológica no continente americano (DINERSTEIN et al., 1995). Esse
reconhecimento se deve principalmente a alta diversidade de espécies, aliada a
significativos níveis de endemismo (FONSECA, 1997; CORDEIRO, 1999) e ao
elevado grau de fragmentação de seus ambientes (CÂMARA, 1991). A avaliação da
diversidade genética é considerada vital para a formulação de estratégias de
conservação, principalmente para espécies ameaçadas de extinção. Somente com a
conservação da diversidade genética podem ser mantidos os processos evolutivos
atuantes nas populações (GLASENAPP et al., 2014).
Dentre as espécies arbóreas de ocorrência nesse Bioma, Genipa americana
Linnaeus, conhecida vulgarmente como jenipapo, apresenta relevância, tanto
ecológica quanto sócio- econômica. O jenipapeiro apresenta alta plasticidade
ecológica, ocorrendo em várias formações florestais de toda a América Tropical, o
que sugere alta diversidade genética entre e dentro de populações, uma vez que a
diversidade genética é determinada por fatores evolutivos como seleção natural,
mutações, deriva genética, migração e fluxo de genes.
A genética quantitativa e os marcadores moleculares são ferramentas
fundamentais para estudos sobre diversidade e estrutura genética de populações.
Tais ferramentas auxiliam no manejo de populações naturais e recuperação de
áreas degradadas, para fins de conservação e futuros programas de melhoramento
de G. americana L.
2 Objetivos
2.1 Geral
Avaliar a variabilidade e diversidade genética, endogamia, estrutura genética
espacial intrapopulacional (SGS), sistema de reprodução e dispersão de pólen em
16
uma população natural de Genipa americana e em um teste de progênies, visando à
conservação genética da espécie e coleta de sementes para fins de recuperação de
áreas degradadas.
2.2 Específicos
i) Quantificar a SGS na população natural;
ii) determinar a correlação de paternidade hierárquica entre e dentro de frutos
na população natural e em árvores no teste de progênies;
iii) determinar a distância da dispersão de pólen na população natural;
iv) determinar a diversidade genética, endogamia, tamanho efetivo de variância
e número de árvores matrizes para a coleta de sementes.
3 Revisão de Literatura
3.1 Fragmentação Florestal e seus efeitos genéticos
Devido ao impacto das atividades humanas, a diversidade biológica está se
reduzindo, principalmente com o aumento da taxa de extinção de espécies e
isolamento reprodutivo de populações e indivíduos, ações estas que desequilibram e
desestabilizam os ecossistemas.
No Brasil, como em outros países tropicais, uma exploração indiscriminada vem
ocorrendo em florestas nativas em virtude do crescimento demográfico e expansão
das fronteiras agrícolas. Este tipo de exploração, aliado ao desconhecimento das
exigências culturais, da biologia reprodutiva, da regeneração e do padrão de
distribuição genética das diferentes espécies florestais nativas, têm ocasionado
deterioração da base genética, comprometendo o patrimônio dos ecossistemas.
Além da exploração predatória, a fragmentação dos habitats pode acarretar a
extinção de populações locais e ainda levar a perdas da biodiversidade e mudanças
na distribuição e abundância das espécies devido à descontinuidade da vegetação
original, acarretando impedimentos para a migração, restrição do tamanho das
populações e acréscimo dos efeitos de borda (PINTO e CARVALHO, 2004).
Esse cenário é encontrado nos mais diferentes Biomas, sendo a situação mais
crítica observada na Mata Atlântica e Cerrado. Estes, portanto, são considerados
hotspots, ou seja, áreas prioritárias para a conservação da biodiversidade, uma vez
que possuem mais de 1500 espécies endêmicas de plantas e mais de ¾ da sua
17
vegetação original dizimada (MYERS et al., 2000). Em pesquisa recente tem-se que
a Mata Atlântica conta com apenas 8,5% (SOS MATA ATLÂNTICA, 2013) e o
Cerrado com 20% (CI, 2003) da sua vegetação original. Outro bioma que também
tem despertado a atenção da comunidade científica é a Caatinga, uma vez que é o
único ecossistema exclusivamente brasileiro e vem sendo vastamente explorado
sem nenhum plano de manejo prévio, o que leva a perda de espécies antes mesmo
de serem conhecidas. Hoje existe menos de 50% da vegetação original desse
Bioma (SPITZCOVSKY, 2013). Além dos estudos em ecossistemas distintos, as
áreas de transição (ecótonos) têm recebido atenção por parte dos pesquisadores,
uma vez que estas pressupõem a existência de interação ativa entre dois ou mais
ecossistemas, que resultam em propriedades que não existem em qualquer um dos
ecossistemas adjacentes (ODUM, 1997).
Ressalta-se que para conservação genética de uma espécie é necessário o
conhecimento da distribuição da diversidade genética entre e dentro de suas
populações (LACERDA e KAGEYAMA, 2003). Alem disso, o padrão espacial ou a
estrutura da diversidade genética dentro de populações é um componente
importante dos processos genético-ecológicos e evolutivos de populações naturais
de plantas. O conhecimento da estrutura genética espacial pode melhorar a
eficiência da amostragem para maximizar a diversidade gênica (EPPERSON, 1990),
uma vez que a estrutura genética espacial é determinada pelos mecanismos de
dispersão de pólen e sementes, ou seja, pelo fluxo gênico.
Diante disso, são imprescindíveis estudos genéticos em nível populacional das
espécies que compõem tais ecossistemas, buscando o entendimento dos efeitos da
fragmentação sobre o fluxo gênico, sistema de reprodução e diversidade, de modo
que sejam estabelecidas estratégias de conservação genética, sobretudo em áreas
perturbadas, procurando reunir subsídios que contribuam para a conservação in situ.
A preservação da diversidade genética se tornou objetivo da maioria dos
programas de conservação e conhecer a distribuição desta diversidade dentro e
entre populações naturais é o primeiro passo (CAVALLARI, 2004). O conhecimento
do modo como a diversidade genética de uma espécie está distribuída em suas
populações é essencial para a sua manutenção (REIS, 1999) e estabelecimento de
formas de exploração econômica (LACERDA et al., 2001). Gusson et al. (2005),
estudando diversidade e estrutura genética espacial em duas populações naturais
de espécie arbórea tropical- Eschweilera ovata (Cambess.) Miers (Biriba), - por meio
18
de marcadores isoenzimáticos, identificaram altos níveis de diversidade genética
dentro e baixo entre populações, logo estas tem alto potencial para conservação
genética in situ, bem como para a coleta de germoplasma, visando sua conservação
ex situ. Outro estudo visando a análise da estrutura genética espacial (SGS) foi
realizado por Moreno et al. (2009), com a finalidade de subsidiar estratégias para
conservação de Hymenaea stigonocarpa no Cerrado do Estado de São Paulo,
utilizando locos microssatélites cloroplastidiais (cpSSR) universais. Foi possível
concluir que para fins de conservação ex situ, a coleta de sementes nas populações
da Estação Ecológica de Assis e Floresta Estacional de Assis deverão obedecer a
uma distância mínima de 750 m entre árvores matrizes.
Aliado a tais parâmetros, deve-se também levar em consideração o
conhecimento dos processos reprodutivos de espécies arbóreas tropicais, uma vez
que pode fornecer informações importantes para auxiliar nas tomadas de decisão do
manejo florestal, a fim de garantir a reprodução e manutenção da diversidade
genética das espécies nas áreas manejadas. Estratégias adequadas de manejo
deveriam levar em consideração ainda o modo pelo qual populações de
polinizadores seriam influenciadas pelas modificações na freqüência e composição
das espécies florestais. Sabe-se que nas florestas tropicais existem grupos de
espécies de plantas que compartilham os mesmos vetores de polinização e a
susceptibilidade dessas espécies quanto à exploração florestal, visando à
manutenção da capacidade reprodutiva das populações (MAUÉS e OLIVEIRA,
2010).
3.2 Genipa americana L.
Genipa americana L. (Rubiaceae) distribui-se naturalmente entre o México e
Brasil (CARVALHO, 1994). É considerada uma espécie secundária tardia, com
características de clímax (CARVALHO, 1994). A planta é heliófita, seletiva, higrófila,
característica de florestas pluviais e semidecíduas situadas em várzeas úmidas e
brejosas (LORENZI, 1992), sendo comum nas matas ciliares, onde suporta longos
períodos de imersão, durante a época de cheia dos rios (NILSSON, 1989; DURIGAN
e NOGUEIRA, 1990). Apresenta uma altura média de 8 a 14 m, diâmetro a altura do
peito (DAP) de 49 a 60 cm (LORENZI, 1992), podendo atingir até 25 m de altura e
90 cm de DAP (CARVALHO, 1994). O jenipapeiro se reproduz por apomixia e
alogamia e a dispersão dos frutos ocorre por gravidade, zoocoria e hidrocoria
19
(CRESTANA, 1993; CARVALHO, 1994). A espécie é dioica (BAWA et al., 1985;
CRESTANA, 1993) e a polinização é entomofílica, efetivada por mamangavas
Bombus morio e Picharis rustica flava (CRESTANA, 1993). Sua madeira é
empregada na construção civil, marcenaria, na confecção de móveis, cabos de
ferramentas e para carpintaria em geral. A casca é usada em curtumes para tratar
couros por ser rica em taninos. Seus frutos, comestíveis, quando ainda verdes
fornecem um corante de cor azulada que é utilizado para diversas finalidades. Esta
propriedade já era bem conhecida pelos índios que os utilizavam para tingirem
tecidos, enfeites, cerâmicas e para pintar o corpo nas cerimônias religiosas e
durante as batalhas. Este poder corante é devido à presença de um iridóide
denominado genipina, que se apresenta originalmente incolor, mas que quando
exposto ao ar ou em contato com as proteínas da pele torna-se azul escuro e
finalmente preto. Para extrair o corante do fruto, este deve ser cortado imaturo,
espremido e depois o suco coado (CORRÊA, 1969; LORENZI, 2000; MORS et al.,
2000; DELPRETE et al., 2005).
Na literatura, trabalhos com o jenipapo são generalizados e envolvem a
fenologia e frutificação (CRESTANA et al., 1992; NASCIMENTO e DAMIÃO-FILHO,
1998; SOUZA et al., 1999), efeito de priming e armazenamento em sementes
(SANTOS et al., 2011), marcadores isoenzimáticos (SEBBENN et al. (1998a);
SEBBENN et al. (1998b); SEBBENN et al. (2003); SEBBENN, 2004), marcadores
RAPD (RABBANI et al., 2012), manejo para produção de madeira e marcadores
ISSR (SANTOS, 2012), diversidade e estrutura genética de um banco de
germoplasma por meio de SSR (SILVA et al., 2014) e estudos sobre diversidade,
estrutura genética, sistema de reprodução e fluxo gênico em Genipa americana,
também por meio de marcadores microssatélites (MANOEL et al., 2014a; MANOEL
et al., 2014b; MANOEL et al., 2015a; MANOEL et al., 2015b).
3.3 Parâmetros genéticos em espécies arbóreas nativas
Com o objetivo de quantificar a estrutura genética em populações de uma
espécie, têm-se como opção os estudos fenotípicos e genotípicos para caracteres
adaptativos (diâmetro, altura, sobrevivência, etc.), utilizando delineamentos
experimentais como testes de procedências e progênies, ou seja, por meio da
conservação ex situ (KAGEYAMA e DIAS, 1985). Os parâmetros genéticos de
caracteres quantitativos como herdabilidade, coeficientes de variação genética e
20
ganhos na seleção são estimados em testes de progênies pelos componentes de
variância, os quais são específicos para determinada população. Tais parâmetros
têm sido estimados por diferentes métodos que evoluem à medida que novas teorias
e técnicas computacionais são desenvolvidas (MELIS et al., 2003). Para tanto, o
primeiro passo seria a estimação dos parâmetros de herdabilidades e correlações,
os quais são extremamente importantes na definição da estratégia de melhoramento
genético a ser adotado (MARCONDES et al., 2000).
A conservação genética ex situ permite a manutenção da variabilidade genética,
além de fornecer informações a respeito dos padrões de variação genética e
controle genético de caracteres de interesse econômico (SEBBENN e ETTORI,
2001), a partir da estimativa de parâmetros genéticos de caracteres quantitativos
(ARAÚJO et al., 2014) e assim fornecer informações para futuros programas de
melhoramento da espécie de interesse.
Há, porém, carência de informações sobre as espécies tropicais nativas, o que
dificulta a adoção de práticas conservacionistas ou de recuperação de áreas
degradadas (CARPI et al., 1996). Na Tabela 1 segue alguns parâmetros de espécies
já estudadas sendo, portanto a base de informação que temos nos dias atuais.
21
Tabela 1 - Parâmetros genéticos para altura (ALT), diâmetro a altura do peito (DAP)
e sobrevivência (SOB) de algumas espécies arbóreas
h2a = herdabilidade individual no sentido restrito; h
2mp = herdabilidade média de progênies; h
2ad =
herdabilidade aditiva dentro de parcela; CVg = coeficiente de variação genética; CVe = coeficiente de variação experimental; CVr = coeficiente de variação relativa.
3.4 Genética de populações por marcadores genéticos
O processo de fragmentação florestal isola e reduz o tamanho das populações
e, consequentemente, afeta o fluxo gênico entre populações e pode aumentar a taxa
de autofecundação, taxa de cruzamentos correlacionados (YOUNG e BOYLE,
2000), estrutura genética espacial intrapopulacional e o parentesco e endogamia nas
Espécie Caracteres h2a h2
mp h2ad CVg CVe CVr Autores
Astronium
graveolens
ALT 0,08 8,2 38,6 Araújo et
al., (2014) DAP 0,15 21,2 29,5
SOB - - -
Eucalyptus
camaldulensis
ALT 0,72 3,36 20,44 Moraes et
al., (2007) DAP 0,73 5,39 33,66
SOB - - -
Myracrodruom
urundeuva
ALT 0,43 0,67 0,43 17,8 12,5 0,71
Otsubo et
al., (2015)
DAP 0,38 0,62 0,37 22,9 17,7 0,65
SOB 0,06 0,33 0,04 6,9 10,0 0,35
Astronium
fraxinifolium
ALT 0,18 0,52 0,16 13,2 12,6 0,52
DAP 0,38 0,51 0,18 16,5 16,2 0,51
SOB 0,04 0,20 0,03 6,3 12,8 0,25
Terminalia
argentea
ALT 0,39 0,81 0,32 19,3 9,5 1,02
DAP 0,20 0,73 0,22 21,0 12,7 0,83
SOB 0,25 0,62 0,21 30,5 24,0 0,64
Enterolobium
contortisiliquum
ALT 0,66 10,1 Sant’Ana et
al., (2013) DAP 0,65 10,8
SOB
Eucalyptus
urophylla
ALT 0,03 0,19 0,03 2,67 12,50 0,21 Souza et
al., (2011) DAP 0,10 0,50 0,08 5,61 12,63 0,44
SOB - - - - - -
Peltophorum
dubium
ALT 0,35 2,3 7,8 Senna et
al., (2012) DAP 0,66 4,8 8,4
SOB - - -
Dipteryx alata
ALT 0,29 0,84 17,3 17,3 1,02 Zaruma et
al., (2015) DAP 0,27 0,86 17,9 16,2 1,10
SOB - - - - -
22
gerações descendentes (CARVALHO et al., 2010). Devido a isso, estudos dos
efeitos da fragmentação são fundamentais para predizer as mudanças genéticas
causadas nas populações de espécies arbóreas tropicais e assim estabelecer
estratégias de conservação das mesmas. Em tais estudos, o conhecimento dos
sistemas de cruzamento e fluxo gênico é de extrema importância para compreender
a organização da diversidade genética em populações naturais de plantas. Esses
processos promovem a manutenção da diversidade genética das espécies vegetais
e, portanto, aumentam a adaptabilidade das espécies para futuras mudanças
ambientais (KANASHIRO et al., 2002).
Os marcadores microssatélites, devido ao seu alto grau de polimorfismo, em
termos de número de alelos, bem como o seu padrão de co-dominância, são
excelentes para estes estudos. Como exemplo da eficiência desse método, pode-se
citar o trabalho de Carvalho et al. (2010), onde tais marcadores foram utilizados para
investigar a taxa de imigração e a distância de dispersão de pólen e sementes em
uma pequena população fragmentada de Copaifera langsdorffii Desf., uma árvore
tropical, hermafrodita e polinizada por insetos (abelhas Apis melífera, Trigona sp e
outros insetos). Os resultados evidenciam que apesar do elevado nível de
fragmentação que se encontra, a população apresenta altos níveis de diversidade
genética, devido a uma intensa taxa de imigração de sementes e pólen.
Outro estudo se refere ao trabalho realizado por Gonela et al. (2013) onde a
diversidade genética, estrutura genética e o sistema reprodutivo de populações
naturais e progênies de C. langsdorffii foram estudados utilizando seis locos
microssatélites. Em conclusão, os resultados confirmam que o banco de
germoplasma (BG-USP/RP) mantém substancial diversidade genética de amostras
de populações de C. langsdorffii de forma que este estudo fornece subsídio para o
delineamento futuro de estratégias para a conservação da espécie.
Em G. americana (MANOEL et al., 2014b), foi investigada a diversidade
genética, a estrutura genética espacial intrapopulacional (SGS), o sistema de
reprodução e o fluxo gênico contemporâneo da espécie, em um pequeno
remanescente florestal (7,2 ha) na Estação Ecológica de Mogi-Guaçu, Mogi-Guaçú
(SP), o qual detectou que devido à dispersão de pólen por insetos e a dispersão de
sementes por animais e hidrocoria, a população não estava reprodutivamente
isolada e há conectividade genética entre o fragmento e outras populações.
23
3.5 Fluxo gênico
Fluxo gênico é considerado um fator fundamental na biologia evolucionária de
plantas, pois afeta a dinâmica de populações, comunidades e ecossistemas
(CONELL e SLATYER, 1977; HARDY et al., 2004). Fatores como o tipo de
polinização, diversidade de sistema reprodutivo, sazonalidade de polinização em
nível de comunidade e longevidade do florescimento, podem influenciar nos padrões
de fluxo gênico em populações de árvores tropicais (BAWA, 1990).
Pressões antropogênicas também podem alterar o padrão de fluxo gênico em
populações de plantas. Desmatamento, urbanização, agricultura intensiva e
fragmentação podem afetar a polinização e dispersão de sementes (BENETT et al.,
2006; JUMP e PENUELAS, 2006; LANDER et al., 2010; ROSAS et al., 2011). Além
disso, o corte seletivo de árvores também pode afetar o fluxo gênico e estrutura
genética espacial (SGS) na população (KANASHIRO et al., 2002), por reduzir a
densidade genética da população reprodutiva (LACERDA et al., 2008).
Com o fluxo gênico reduzido ou ausente, as populações poderão divergir e se
diferenciar ao longo do tempo, tendo como última consequência a especiação
(LOWE et al., 2004). Em curto prazo, em populações de plantas perturbadas são
esperadas o aumento da susceptibilidade às doenças e pragas (BARRETT e KOHN,
1991), a perda de alelos incompatíveis e fixação de alelos deletérios (HUENNEKE,
1991). Em longo prazo, espera-se que a perda de diversidade genética reduza a
capacidade das populações para responder às mudanças nas pressões de seleção
(YOUNG et al., 1996).
Vários trabalhos tem sido desenvolvido nesse tema (BALDAUF et al., 2014;
MEDINA-MACEDO et al., 2015; ARRUDA et al., 2015), de forma a responder
indagações que resultem na melhor estratégias de conservação das espécies, bem
como auxiliar em programas de melhoramento genético.
3.6 Sistema de Reprodução
A formulação de hipóteses sobre o impacto da fragmentação florestal sob o
sistema reprodutivo das populações de espécies arbóreas é fundamental para
compreender como os indivíduos isolados em fragmentos estão geneticamente
isolados (MORAES e SEBBENN, 2011). Isto é especialmente importante para as
espécies arbóreas da floresta tropical rica em diversidade, como a floresta brasileira,
24
onde a floresta natural tem sido intensamente convertida em pequenos fragmentos
florestais e árvores isoladas na paisagem em campos e pastagens. É crucial para as
futuras gerações, a conservação destas espécies arbóreas neotropicais, visto que
destas poderá ser obtido algum fármaco, produto químico ou outro recurso que
necessitem (MANOEL et al., 2012b).
O sistema de reprodução é um ponto importante a ser conhecido, uma vez que
se refere à forma como as espécies recombinam seus genes a cada evento
reprodutivo e formam as populações descendentes. O conhecimento da taxa de
cruzamento, taxa de cruzamento entre parentes e correlação de paternidade são
fundamentais em programas de melhoramento genético, conservação genética e
recuperação ambiental, visto que este determina o parentesco, a endogamia e,
portanto o tamanho efetivo das progênies (SEBBENN, 2006). Assim, tal
conhecimento é básico para determinar o número de árvores matrizes para a coleta
de sementes (SEBBENN, 2002; 2006), visto que o sistema de reprodução determina
a magnitude da coancestria e da endogamia nas populações descendentes (MORI
et al., 2013).
Algumas dessas estimativas para espécies arbóreas são apresentadas na
Tabela 2, onde podem ser observadas a predominância de cruzamentos aleatórios,
sendo todos os valores acima de 0, 816 para taxa de cruzamento multilocos (tm).
Tabela 2 - Sistema de reprodução em espécies arbóreas
Espécie tm tm -ts rp Autores
Acrocomia aculeata 0,986 0,383 0,564 Lanes et al., (2016)
Erbythrophleum suaveolens 0,816 0,098 0,112 Duminil et al., (2016)
Eremanthus erythropappus 0,963 0,049 0,394 Barrera et al., (2006)
Peltophorum dubium 0,924 0,092 0,001 Mori et al., (2013)
Copaifera langsdorffi 0,971 0,475 0,905 Manoel et al., (2012b)
Hymenaea stignocarpa 0,821 0,465 0,756 Moraes, (2016)
Eschweilera ovata 0,999 0,066 0,577 Gusson et al., (2006)
Genipa americana 0,946 0,368 0,747 Manoel et al., (2015b)
Bagassa guianensis 0,985 0,052 0,193 Silva et al., (2008)
Handroanthus heptaphyllus 1,000 0,210 0,110 Mori et al., (2015)
Carapa guianensis 0,862 0,134 0,081 Campos et al., (2013)
Myracrodruon urundeuva 1,000 0,020 0,148 Gaino et al., (2011)
tm = taxa de cruzamento multiloco; tm -ts = taxa de cruzamento entre parentes; rp = correlação de paternidade
25
4 Material e Métodos
4.1 Material
O estudo foi realizado em duas populações de Genipa americana: a primeira
está localizada em um fragmento florestal remanescente, no município de Arauá,
estado de Sergipe (POP-SE), nordeste do Brasil (11o 15' 22"S, 37o 37' 30" W, altitude
de 86 m). Essa população natural ocorre em uma área de transição entre a Floresta
Atlântica e a Caatinga e encontra-se em acentuado grau de fragmentação em
função da criação de gado leiteiro. Os solos presentes na área são os Podzólico
Vermelho Amarelo Equivalente Eutrófico e Podzólico Vermelho Amarelo. O tipo
climático é Megatérmico Úmido a Sub-Úmido, com temperatura média anual de 24,6
°C e precipitação pluviométrica média no ano de 863,3 mm. O intervalo mais
chuvoso é o de março a agosto (SERGIPE.SEPLANTEC/SUPES, 1997/2000).
Nessa área foram coletadas sementes de polinização aberta, em 30 árvores
matrizes georeferenciadas (Apêndice A e Figura 1), que tiveram seu DAP
mensurado e uma amostra de folha coletada para análise de DNA.
Figura 1 - Localização geográfica de matrizes de Genipa americana no Município de
Arauá/SE
26
A segunda população ocorre em um Banco Ativo de Germoplasma (BAG)
localizado em Rosana (POP-SP), estado de São Paulo, região sudeste do país (22°
30’ 38.84” S e 52 °57’ 23.20” W, altitude de 306 m). Esse BAG foi instalado em
novembro de 2000, com a finalidade de compensar o impacto causado pela
construção da Usina Hidrelétrica Engenheiro Sérgio Motta (Porto Primavera), na
região do Pontal do Paranapanema (Figura 2) e contém 32 espécies arbóreas da
Floresta Estacional Semidecidual, na forma de testes de progênies, sendo uma
delas a G. americana (POP-SP) com 30 progênies de polinização aberta,
provenientes da área que foi inundada pelo Reservatório (RODRIGUES, 2010). O
clima da região do Pontal do Paranapanema, com base na classificação climática
estabelecida por Köeppen, pode ser classificado com Cfa, ou seja, clima
mesotérmico temperado ou subtropical úmido, com verões quentes e chuvosos e
inverno seco. O solo do local, conforme o Sistema Brasileiro de Conservação do
Solo é um Latossolo Vermelho Distrófico, A moderado, textura média, relativamente
plano e suave ondulado (OLIVEIRA, 1999).
Figura 2 - Localização do BAG-SP, Rosana, SP (Google Earth, 2010).
27
4.2 Métodos
4.2.1 Caracteres quantitativos
4.2.1.1 POP-SE
a) Coleta, beneficiamento e semeadura
Quatro frutos foram coletados de cada árvore, com o objetivo de analisar
hierarquicamente o sistema de reprodução entre e dentro de frutos. Buscou-se a
coleta dos frutos maduros, preferencialmente sob a copa das árvores, e/ou em
estágio avançado de maturação quando ainda no pé, com o intuito de maximizar a
germinação das sementes. No Laboratório de Sementes Florestais da Embrapa
Tabuleiros Costeiros, em Aracaju-SE, as sementes foram retiradas dos frutos, com o
auxílio de um estilete e a polpa do fruto extraída e lavada em água corrente sobre
uma peneira de malha fina, até a completa despolpa das sementes. Em seguida,
essas foram deixadas para secar a temperatura ambiente sobre papel toalha,
transferidas para copos descartáveis previamente identificados com o número da
planta matriz e fruto (Figura 3). Não foi necessária nenhuma etapa para quebra de
dormência das sementes.
Figura 3 - Beneficiamento das sementes de Genipa americana (A), secagem (B) e
armazenamento (C) para o deslocamento até a casa de vegetação
b) Formação de mudas
A semeadura foi realizada em casa de vegetação, utilizando-se como recipientes
sacos de polietileno (16 x 24 cm) contendo substrato, na proporção 3:1, sendo três
medidas de terra preta para uma de esterco bovino curtido. Blocos de quatro fileiras
B A C
28
contendo sete sacos cada uma, foram dispostos de forma a separar matrizes (M) e
frutos (F). Em cada saco foi distribuída de três a quatro sementes (Figura 4).
Figura 4 - Disposição dos sacos de polietileno na casa de vegetação, visando a
produção de mudas de Genipa americana
O acompanhamento em dias alternados foi realizado de forma a obter
informações sobre a emergência das sementes e desenvolvimento das mudas
(Figura 5).
Figura 5 - Progênies de Genipa americana, provenientes do município de Arauá-SE,
aos cinco meses após a semeadura
O desenvolvimento das mudas foi acompanhado três vezes por semana, por um
período de seis meses, visando controle de pragas e doenças e verificação de
mortalidade e necessidade de replantio. Aos quatro meses foi identificada a
presença de cochonilhas, sendo necessária a pulverização de óleo de algodão para
29
controle da mesma. Fato esse que deve ter sido ocasionado devido ao alto teor de
umidade presente na casa de vegetação.
4.2.1.2 POP-SP
a) Teste de progênies e caracteres avaliados
No teste de progênies de Genipa americana, localizado em Rosana-SP, foram
avaliados, aos 16 anos após o plantio, os seguintes caracteres: altura de plantas
(ALT, m), diâmetro a altura do peito (DAP, cm), e sobrevivência (SOB) atribuindo-se
“1” para a presença da planta e “0” para a sua ausência, sendo que nos resultados
esse caráter foi expresso em porcentagem. Esse teste foi instalado com base no
delineamento em blocos casualizados com 30 tratamentos (progênies de polinização
aberta), três repetições e oito plantas por parcela linear, no espaçamento de 1,5 m,
na linha, entre plantas de G. americana e 3,0 m entre linhas, constituída por uma
espécie pioneira conhecida na região por mutambo (Guazuma ulmifolia).
b) Modelo estatístico e estimativas de parâmetros genéticos
As análises estatísticas foram desenvolvidas no programa computacional
genético-estatístico SELEGEN (RESENDE, 2007a), utilizando o método de
REML/BLUP (máxima verossimilhança restrita/melhor predição linear não viciada),
por meio do modelo 93. A análise de deviance para diferenciar os tratamentos foi
realizada também pelo “modelo 93”, do referido programa. O modelo estatístico
utilizado foi: y = Xr + Za + Wp + e, em que: y é o vetor de dados, r é o vetor dos
efeitos de repetição (assumidos como fixos) somados à média geral, a é o vetor dos
efeitos genéticos aditivos individuais (aleatórios), p é o vetor dos efeitos de parcelas
(aleatórios), e e é o vetor de erros ou resíduos (aleatórios). As letras maiúsculas
representam as matrizes de incidência para os referidos efeitos. As expressões da
estimativa dos componentes da variância e dos parâmetros genéticos foram
(RESENDE, 2002 e 2007b).
i) Variância genética aditiva ( 2a ): q/)]CA(trˆaA'a[ˆ 2212
e12
a . Essa variância
foi acomodada com base na estimativa da variância entre progênies ( 2ˆ p ) e no
coeficiente de parentesco (yxr ,
ˆ ), estimado com base nas plantas do próprio teste de
progênies, por marcador genético molecular do tipo microssatélites (SSR):
30
yx
p
ar ,
2
2
ˆ
ˆˆ
ii) Variância ambiental entre parcelas ( 2c ): 1
3322 /]ˆˆ'ˆ[ˆ sCtrcc ec
iii) Variância residual (ambiental + não aditiva) ( 2e ):
)](/[]''ˆ''ˆ''ˆ'[ˆ 2 xrNyWcyZayXryye ; em que: C22, C33, C44eC55 vem
da inversa de C. C: matriz dos coeficientes das equações de modelo misto; tr:
operador traço matricial; r(x): posto da matriz X; N, q, s: números de dados, de
indivíduos e de parcelas, respectivamente.
iv) Variância fenotípica individual ( 2f ):
2f = 2
a + 2c + 2
e
v) Herdabilidade individual no sentido restrito, ou seja, dos efeitos aditivos ( 2ah ):
2ah =
2
2
f
a
ˆ
ˆ
vi) Herdabilidade da média de progênies, assumindo sobrevivência completa ( 2mh ):
2mh =
rn
r
rr
r
eayxcaxy
ayx
.
ˆˆ.ˆ1ˆˆ.ˆ
ˆ.ˆ22
,2
2
2,
;
em que: :r número de repetições; n : número de plantas por parcela.
vii) Herdabilidade aditiva dentro de parcela ( 2adh ):
2adh =
22
,
2,
ˆˆ.ˆ1
ˆ.ˆ1
eayx
ayx
r
r
viii) Coeficiente de variação genética aditiva individual (evolvabilidade, HOULE,
1992) ( giCV ):
giCV (%) = m
a
ˆ
ˆ 2.100; em que: mé a média geral do experimento.
ix) Coeficiente de variação genotípica entre progênies ( gpCV ):
gpCV (%) = m
r ayx
ˆ
ˆ.ˆ 2,
.100
31
x) Coeficiente de variação experimental ( eCV ):
eCV (%) = m
nr ceayx
ˆ
ˆ}/]ˆˆ).ˆ1{[( 222,
.100
xi) Coeficiente de variação relativa ( rCV ):
rCV = e
gp
CV
CV
xii) Acurácia da seleção de progênies, assumindo sobrevivência completa ( aar ):
aar = 2mh
xiii) Coeficiente de determinação dos efeitos de parcela ( 2pC ):
2pC =
2
2
f
c
ˆ
ˆ
4.2.2 Análises dos locos microssatélites
4.2.2.1 Atividades comuns as populações POP-SE e POP-SP
a) Coleta de tecidos foliares para extração do DNA
A coleta nas 30 árvores matrizes da POP-SE foi realizada em propriedade
particular, no município de Arauá - SE, distando 103 km do município de Aracaju -
SE (Figura 6). O transporte ao laboratório foi realizado em caixa térmica, contendo
gelo para garantir a integridade das folhas, evitando sua oxidação. Devido à altura
das árvores foi necessária a utilização de um podão.
Figura 6 - Coleta de material foliar em árvores matrizes de Genipa americana, no
município de Arauá - SE
32
A coleta dos tecidos foliares nas progênies da POP-SE foi realizada na casa de
vegetação da Embrapa Tabuleiros Costeiros, no município de Aracaju/SE (Figura 7-
A). Todo tecido foliar coletado (Figura 7 – B, C) foi identificado, de acordo com o
número da matriz e fruto correspondente, acondicionado em sacos plásticos e
transportado ao Laboratório de Biologia Molecular da Embrapa Tabuleiros Costeiros.
Devido à proximidade entre o local de coleta e o laboratório para extração, as folhas
foram coletadas apenas no momento exato de terem seu DNA extraído, não
havendo necessidade de armazenamento.
A coleta de folhas nas progênies da POP-SP foi realizada no BAG da CESP no
entorno da Hidrelétrica Engenheiro Sérgio Motta em Porto Primavera (Rosana-SP),
adotando-se o mesmo procedimento feito na POP-SE. A extração do DNA foi
realizada no Laboratório de Genética de Populações e Silvicultura da Faculdade de
Engenharia de Ilha Solteira/UNESP. A distância entre Rosana-SP (Porto Primavera)
a Ilha Solteira - SP é de 375 km.
Figura 7 - Casa de vegetação (A) da Embrapa Tabuleiros Costeiros (Aracaju - SE) e
progênies de Genipa americana provenientes de sementes de árvores matrizes,
coletadas no município de Arauá-SE e semeadas em saco de polietileno contendo
terra adubada (B, C)
A extração de DNA foi baseada no método descrito por Doyle e Doyle (1990).
Foram utilizados, 15 discos de folhas tenras, obtidos por meio de perfurador de um
furo, para a extração de DNA. Esses discos foram macerados em tubo tipo
microtubo (1,5 mL), contendo nitrogênio líquido. Em seguida foi adicionado 750 µL
tampão de extração [Cetiltrimetil brometo de amônio 2%; Cloreto de sódio (NaCl) 1,4
mM; Tris 1 mM, pH 8,0; Polivinilpirrolidona (PVP) 1%)], 2 µL de β-mercaptoetanol e 3
µL de Proteinase K e posteriormente posto em banho-maria a 65 ºC por 60 min.,
homogeneizando-as a cada 10 min.
A B C
33
Após o período de incubação, as amostras passaram por um processo de
purificação, em que 500 µL da mistura de clorofórmio e álcool isoamílico (24:1) foi
adicionado ao microtubo. As amostras foram homogeneizadas por meio de lentas
inversões e centrifugadas a 5000 xg, a 20 ºC por 10 min.
O sobrenadante obtido foi coletado e transferido, com o auxílio de uma
micropipeta, para um microtubo contendo 400 µL de isopropanol gelado. As
amostras foram mantidas em freezer por 24 h para a precipitação do DNA, e logo
após centrifugadas a 10000 xg por 10 min., para a então formação do precipitado.
Em seguida o isopropanol foi descartado e substituído por álcool 70% e centrifugado
por 5 min. a 12000 xg. Essa etapa foi repetida mais uma vez. Por fim, foi descartado
o álcool 70% e substituído por álcool absoluto e centrifugado por 5 min. a 12000 xg.
A partir de então, a fase líquida foi descartada e o precipitado colocado para secar
em temperatura ambiente. Depois de seco, este foi ressuspendido em 100 µL de TE
(Tris HCL 10 mM, pH 7,4; EDTA 1 mM) e 6 µL de RNase (110 µg/µL) e incubados
por 30 min. a 37 ºC, em banho-maria.
b) Quantificação do DNA
A quantificação do DNA foi realizada no Departamento de Genética, do Instituto
de Biociências de Botucatu-SP-UNESP. Esse procedimento foi realizado em
espectrofotômetro do tipo NanoDrop 2000c, onde 2 µl do DNA diluído em 44 µl de
solução de extração + 6 µl de Rnase, foi depositado em local específico e
quantificado automaticamente.
Além da quantificação realizada no NanoDrop, algumas amostras foram também
testadas em gel de agarose a 0,8% [1,2 g de agarose e 150 mL de tampão 1x]. Ao
gel foi adicionado 5 uL de GelRed® para coloração. Foram utilizados 2 uL de DNA
concentrado, 7 uL de água ultrapura autoclavada e 4 uL de tampão de
carregamento, sendo aplicados nas canaletas do gel ao lado de uma série de
concentrações conhecidas de DNA, variando de 50 a 150 ng, sendo a concentração
das amostras estimada por comparação. Os géis foram submetidos à eletroforese
por 1 h e 20 min., e as condições de corrida foram: voltagem (100 V), potência (100
W) e amperagem (100 mA).
34
c) Diluição do DNA
De posse das concentrações do DNA extraído foram realizados testes para
identificar a melhor concentração para diluição de todo material. Com os resultados,
ficou definido que a concentração padrão seria de 50 ng. Assim, deu-se início ao
processo de diluição das amostras, sendo toda diluição realizada em placas para
PCR e adicionando água ultrapura autoclavada, até a concentração desejada. Para
cada amostra, o volume de DNA + Água, foi calculado por meio da expressão:
2211 .. VCVC ;
em que: :1C Concentração inicial; :1V Volume inicial; :2C Concentração final; :2V
Volume final.
d) Reações de PCR
O coquetel de reagentes para cada indivíduo foi composto por 5 µl de GoTaq
Colorless Master Mix; 0,2 µl do Primer Forward (10 mM); 0,2 µl do Primer Reverse
(10 mM), 0,2 µl do Primer contendo a cauda M13 (10 mM) (marcado com FAM, HEX,
NED, PET ou VIC); 4,4 µl de água ultrapura autoclavada e 1 µl do DNA de trabalho.
Foram testados oito conjuntos de primers: Gam 01, Gam 02, Gam 06, Gam 08,
Gam11, Gam24, Gam28 e Gam 41(Tabela 3; MANOEL et al., 2014a), que
apresentam segregação mendeliana e não estão ligados (MANOEL et al., 2015a),
adicionado de uma cauda M13 universal à porção 5’ dos primers forward ou reverse,
seguindo Schuelke (2000).
35
Tabela 3 - Características dos locos microssatélites desenvolvidos para Genipa
americana L., utilizados no estudo de diversidade genética, estrutura genética
espacial intrapopulacional, sistema de reprodução e fluxo gênico em população
natural e em banco de germoplasma da espécie
Loco Sequência do Primer bp Tm (°C)
Gam 01 F: CATTCCACATTTGCCCTTG
R: GCTTTCCTGTTCCCTAAATCC
175 60
Gam 02 F: GCACCAGAGTCTAAAGCCAGA
R: TGCACGAGTTCATTGAGATTG
186 60
Gam 06 F: CTCTGCGTGTGTGTGTGTGT
R: CAAAGACTGTGCGGCATCT
150 60
Gam 08 F: ACGGCTTTTCTTGTCTGGTC
R: GGCATAATCCAAACCTGCTA
175 59
Gam 11 F: AGCCACTACCACCAGTCCAT
R: GGAGACCGAGTGTTACATTTCA
215 59
Gam 24 F: TGTCCAAAAACCAGAAATC
R: CAGCTGGAATAAGAAAATGA
189 53
Gam 28 F: ACTCAGTCAACCTCCGAA
R: TACCCAAAAGATTCAGCC
226 54
Gam 41 F: TCTTGATTACTGGATGACAGAC
R: CCTTCACTGCTTCACACAC
132 55
bp= pares de base; Tm (°C)= temperatura de anelamento
O programa de amplificação do DNA consistiu de uma temperatura inicial de 94
°C por 5 min., seguido de 30 ciclos que envolvem temperaturas de 94 °C por 1 min.,
temperatura de anelamento do Primer (MANOEL et al., 2014a) por 1 min. e 72 °C
por 1 min. (etapa de amplificação do loco). Além disso, mais 12 ciclos de 94 °C por
30 segundos, 53 °C por 45 seg. e 72 °C por 45 seg. (anelamento e extensão da
cauda M13), uma extensão de 72 °C por 20 min. e finalização com 12 °C. A
amplificação se deu em termociclador Eppendorf, utilizando placas para PCR
contendo 96 poços e 11 L do coquetel.
Uma amostra de 16 indivíduos, por placa, teve seus produtos da amplificação
separados por eletroforese, realizada a 120 V, em gel de agarose a 3%, por 40 min.,
visando comprovar a eficiência da amplificação. A corrida eletroforética foi realizada
em cuba horizontal, contendo tampão TBE (Tris-Borato-EDTA) 0,5 X em quantidade
36
suficiente para deixar o gel submerso. Em seguida, os produtos da amplificação
foram visualizados sob luz ultravioleta.
e) Genotipagem
Para iniciar a genotipagem das amostras foi necessário montar novas placas de
PCR contendo em cada poço da placa para PCR, 1,0 µl do produto da amplificação
de até quatro primers. Adicionou-se 0,25 µl de ROX (marcador de peso molecular
conhecido), no caso da utilização das caudas M13 (FAM, NED e HEX), ou 0,25 µl de
LIZ, no caso das caudas M13 (FAM, NED, PET, VIC). Em seguida houve a
complementação com formamida, que possui efeito denaturante, totalizando 10 µl de
solução. Essa etapa foi realizada em sequenciador Applied Biosystems 3130/3130xl
Genetic Analyzer, seguida da identificação dos alelos por meio do programa
GeneMapper® Version5.0 para posteriores análises estatísticas referente à
diversidade e estrutura genética e sistema reprodutivo dos indivíduos. Sete
conjuntos de primers foram utilizados para as análises, uma vez que o conjunto Gam
02 apresentou número elevado de locos monomórficos, não sendo indicado para o
estudo.
f) Diversidade, estrutura genética e endogamia
A diversidade genética foi caracterizada para cada loco e a média entre locos
para os índices: número total de alelos por loco (k), riqueza alélica (R),
heterozigosidade observada (Ho) e heterozigosidade esperada (He) de acordo com
as proporções do equilíbrio de Hardy-Weinberg. A presença de endogamia foi
investigada pelo índice de fixação (F). A significância estatística dos valores F foi
testada usando permutação Monte Carlo de alelos entre os indivíduos. Todas as
análises foram realizadas utilizando o programa FSTAT (GOUDET, 1995). Como os
valores para as sementes de polinização aberta podem apresentar viés, devido ao
excesso de estimativas de frequências de genes de alelos maternos, causado pelo
fato de que cada planta dentro da descendência recebeu pelo menos um dos alelos
maternos, estimamos os valores com a base em Manoel et al. (2015b). A frequência
de alelos nulos (Null ) foi estimada para adultos e progênies de cada população com
base no modelo de endogamia da população (IIM), utilizando o programa INEST 2.0
(CHYBICKI e BURCZYK, 2009). Para testar se os índices genéticos foram
significativamente diferentes entre grupos, foram utilizados testes-t
37
desemparelhados. A diferenciação genética ( 'stG ) entre adultos, progênies e entre
adultos e progênies de cada população foi estimada utilizando o método de Hedrick
(2005).
g) Sistema de reprodução
As análises do sistema de reprodução foram baseadas no modelo misto
(RITLAND e JAIN, 1981) e modelo de cruzamentos correlacionados (RITLAND,
1989) e as estimativas obtidas utilizando o programa MLTR, versão 3.4 (RITLAND,
2002). As análises foram realizadas em nível de indivíduos dentro de famílias e em
nível de população, utilizando o método “Expectation Maximization” (EM) para
resolução numérica. Os índices estimados foram: frequência gênica do pólen e do
óvulo; o índice de fixação da árvores-matriz ( mF ), taxa de cruzamento multiloco ( mt ),
1- taxa de cruzamento uniloco (1- st ); taxa de cruzamento entre indivíduos
aparentados ( sm tt ˆˆ ) e da correlação de paternidade multilocos ( pr ). Como a
amostra foi hierárquica dentro e entre frutos para a POP-SE, a correlação de
paternidade multilocos também foi estimada dentro ( wpr ) e entre frutos ( apr ),
excluindo frutos com apenas uma progênie, resultando em 470 indivíduos. O
intervalo de confiança das estimativas foi obtido a partir de 1.000 reamostragens
bootstrap. As unidades de reamostragem foram as progênies na análise da
população e indivíduos dentro de progênie na análise individual. Esses índices foram
utilizados para estimar outros índices demográfico e genético, tais como o número
efetivo de doadores de pólen ( pep rN ˆ1ˆ ) e o coeficiente médio de coancestria ( )
dentro de progênies, calculado pela seguinte expressão: pm rF ˆ1.ˆ1.125,0ˆ ; em
que: mF é o coeficiente de endogamia na população parental (SOUSA et al., 2005),
estimada usando o programa SPAGEDI. O tamanho efetivo dentro de progênie ( eN )
foi estimado com base em Cockerham (1969):
nF
nneN
2
ˆ11.ˆ5,0ˆ
,
em que: n é o tamanho amostral dentro de famílias e F é o índice de fixação dentro
de progênies, estimado como descrito anteriormente. O número estimado de árvores
38
matrizes ( m ) para a coleta de sementes foi calculado assumindo que o objetivo é
reter na amostra total o tamanho efetivo de referência ( referênciaeN ) de 150. Assim, a
estimativa de mé dada por: ereferênciae NNm ˆˆˆ (SEBBENN, 2006).
h) Coeficiente de correlação de Spearman
Para investigar: i) se o tamanho da amostra dentro de progênies (n) nas
populações afeta os índices k , oH , oF , epN , e eN ; ii) se k afeta oH , oF ,
epN ,
e eN ; iii) se oH afeta oF , epN , e eN ; iv) se
epN afeta e eN , foi estimado o
coeficiente de determinação de Spearman, por meio do programa SAS (SAS, 1999).
4.2.2.2 POP-SE
A dispersão de pólen foi estimada apenas para a POP-SE, uma vez que as
coordenadas geográficas das árvores matrizes são conhecidas. Como apenas as
árvores matrizes e suas progênies de polinização aberta foram genotipadas, a
dispersão de pólen foi estimada utilizando a programa POLDIST (ROBLEDO-
ARNUNCIO e GARCÍA, 2007). Como não se conhece a densidade efetiva de
árvores polinizadoras (macho), utilizou-se o módulo de Kindist, que não depende de
um conhecimento prévio dessa densidade. O modelo Kindist é baseado na
diminuição esperada da correlação de paternidade ( )(z ) em progênies de
polinização aberta com a distância padrão ( Z ) entre os pares de árvores maternas
amostradas (ROBLEDO-ARNUNCIO et al., 2006). Para estimar a curva de dispersão
de Kernel, a correlação de paternidade deve-se reduzir com a distância espacial
entre as árvores matrizes. O POLDIST dá a distância média de dispersão de pólen e
parâmetros da curva de dispersão, como uma função da dispersão assumida. Aqui,
foi usado o modelo de dispersão exponencial, que é o mais apropriado para as
espécies que podem ser polinizadas a grandes distâncias (AUSTERLITZ et al.,
2004), como é o caso da G. americana, que é polinizada por abelhas.
Os parâmetros estimados foram a escala de parâmetro de dispersão de pólen
(a), a forma do parâmetro de dispersão (b), a média e o desvio padrão de dispersão
do pólen.
39
5 Resultados
5.1 Genética quantitativa
As progênies apresentaram aos 16 anos de idade SOB de 87,2% e um
crescimento médio para o caráter ALT de 10,96 m e DAP de 13,20 cm (Tabela 4),
representando um incremento médio anual (IMA) de 0,68 m (ALT) e 0,82 cm (DAP).
Tabela 4 - Componentes de variância/Parâmetros Genéticos (REML) para os
caracteres altura (ALT, m), diâmetro à altura do peito (DAP, cm), e sobrevivência
(SOB) para população de Genipa americana, aos 16 anos de idade, provenientes
do BAG, instalado na forma de teste de progênies, localizado no município de
Rosana/SP
Estimativas ALT DAP SOB
2a
1,7409 1,6719 0,0289
2c
0,0384 0,0556 0,0025
2e
10,7293 21,0844 0,0743
2f
12,5086 22,8119 0,1057
2ah
0,14±0,08 0,07±0,06 0,27±0,11
2ˆmph
0,46 0,30 0,60
2ˆadh
0.11 0.06 0.23
C2parc 0,0031 0,0024 0,0240
CVgi (%) 12,0 9,8 19,5
Cvgp (%) 6,0 4,9 9,8
CVe (%) 11,3 12,8 13,8
CVr 0,53 0,38 0,70
m 10,96 13,20 87,2
LRT 4,81* 2,28
ns 8,72
**
** significativo a 1%, *significativo a 5%, com 1 grau de liberdade; ns
= não significativo; Va = variância genética aditiva; Vparc = variância de parcela; Ve = variância residual; Vf = variância fenotípica individual; h2
a = herdabilidade individual no sentido restrito; h2mp = herdabilidade média de progênies;
C2parc = coeficiente de determinação dos efeitos de parcela; CVgi = coeficiente de variação genética
aditiva individual; CVgp = coeficiente de variação genotípica entre progênies; CVe = coeficiente de
variação experimental; m= média geral do experimento; LRT = Teste da razão de verossimilhança.
O efeito de progênies foi significativo para os caracteres ALT (P< 0,05) e SOB
(P<0,01), indicando que a estratégia amostral foi efetiva para reter a variabilidade
40
genética das populações, além de indicar a possibilidade de alterar média da
população por meio da seleção entre progênies.
A herdabilidade média entre progênies (h2mp) foi média para ALT (0,46) e DAP
(0,30) e alta para SOB (0,60).
Os coeficientes de variação genética (CVgi e CVgp) variaram entre 4,9% (DAP) e
19,5% (SOB), sugerindo a possibilidade de obterem-se de baixos a moderados
progressos genéticos.
Os valores do coeficiente de variação experimental (CVe) foram considerados
baixos, variando entre 11,3% (ALT) e 13,8% (SOB). Em experimentos onde ocorre
competição, valores CVe entre 10 e 20% podem ser considerados baixos
(PIMENTEL-GOMES e GARCIA, 2002).
5.2 Genética Molecular
5.2.1 Diversidade genética e endogamia
Para o total de indivíduos nas duas populações, o número de alelos variou entre
locos, de 8 a 23, totalizando 96 alelos ( k ), com uma média de 13,7. Devido ao
pequeno número de árvores matrizes amostradas, estas apresentaram menor
número de alelos que as progênies, com um máximo de 46 e 33, respectivamente
para as POP-SE e POP-SP (Tabela 5). Foram detectados 19 alelos privados na
POP-SE e 15 na POP-SP. A riqueza alélica media (R) variou entre as amostras de
4,7 a 7,5, a heterozigosidade observada (Ho) variou de 0,73 a 0,96 e a esperada ( eH
) de 0,60 a 0,73.
O índice de fixação ( F ) foi em geral significativamente menor que zero,
variando entre as amostras de -0,60 a 0,0, sugerindo ausência de endogamia.
Baseado no teste-t, R e F foram significativamente ((P< 0,05) menores em adultos
que em progênies da POP-SP. Alelos nulos ( Null ) foram detectados em baixas
frequências em todos os locos de adultos e progênies, variando entre locos e
amostras de 0 a 0,11 (Tabela 4). O índice de fixação para as progênies ( pF )
corrigido para o conjunto de pólen foi menor em relação ao valor de F, mas não foi
significativamente maior que zero, indicando também ausência de endogamia.
A diferenciação genética ('stG ) foi significativamente (P>0.05) maior que zero
entre árvores matrizes (0,64) e progênies (0,54) e entre arvores matrizes e progênies
41
da POP-SP (0,09), mas não significativamente diferente de zero entre árvores
matrizes e progênies da POP-SE.
Tabela 5 - Diversidade genética e endogamia em adultos e progenies de Genipa
Americana em Arauá (POP-SE) e Rosana (POP-SP) ±SD é o desvio padrão; * P<
0.05
POP-SE±SD POP-SP±SD
Matrizes Sementes
Matrizes Sementes
Tamanho da amostra: n 30 552 30 584
Número Total de alelos: k 46 81 33 77
Riqueza alélica para 29 genótipos: R 6,5±2,5 7,5±3,4 4,7±1,1 7,4±1,4
Heterozigosidade observada: oH 0,84±0,11 0,73±0,07
0,96±0,05 0,82±0,17
Heterozigosidade esperada: eH 0,70±0,11 0,73±0,11
0,60±0,06 0,73±0,08
Índice de fixação: F -0,19±0,17* 0,00±0,22 -0,60±0,16* -0,12±0,22*
Intervalo de frequência de alelos nulos:
Null
0,0-0,0 0,0-0,06
0,0-0,0 0,0-0,11
eH para o conjunto de pólen: )(peH - 0,77±0,13 - 0,79±0,05
F corrigido para o conjunto de pólen:pF - 0,05±0,02 - -0,04±0,05
5.2.2 Dispersão de pólen
A correlação linear entre a correlação de paternidade e a distância entre as
árvores matrizes foi negativa e mostrou uma tendência decrescente com o aumento
da distância entre elas (Figura 8).
Figura 8 - Representação da correlação de paternidade entre sementes de polinização aberta dependendo da distância entre árvores matrizes
-0,40
-0,30
-0,20
-0,10
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
- 100 200 300 400 500 600 700
Distancia (m)
rp
42
Portanto, foi possível estimar a curva da distância média de dispersão do pólen
na população. Usando o modelo de dispersão exponencial (Figura 9) forte (potência
exponencial), a escala de parâmetro de dispersão de pólen (a) foi 0,285, a forma do
parâmetro de dispersão (b) foi de 0,415 e a distância média de dispersão do pólen
foi 179 ± 18,9 m (± desvio padrão).
Figura 9 - Curva de Kernel de dispersão de pólen em Genipa americana, assumindo
dispersão exponencial
5.2.3 Sistema de Reprodução em nível de população
A taxa de cruzamento multilocos (tm) não foi significativamente diferente da
unidade (1,0) para as populações, indicando que todas as progênies foram
originadas de cruzamento, como esperado para espécies dióicas (Tabela 6). No
entanto, a taxa de cruzamento uniloco (ts) foi significativamente menor que 1,0 na
POP-SE (0,85) resultando em uma taxa de cruzamento entre parentes
significativamente maior que zero (tm-ts = 0,15).
A correlação de paternidade multilocos entre e dentro de frutos (rp), foi
significativamente maior que zero em ambas as populações, em especial na POP-
SE, indicando que algumas progênies são irmãs-completas. O número efetivo de
doadores de pólen ( epN ) foi significativamente maior na POP-SP (13,0) que em
POP-SE (2,9). A análise hierárquica de correlação de paternidade na POP-SE foi
maior dentro de frutos ( )(wpr = 0,40) que entre frutos ( )(apr = 0,26), indicando que
cerca de 2,5 doadores efetivos de pólen fertilizaram os frutos ( )(wepN ) e 3,8 entre os
frutos das árvores ( )(aepN ).
Devido a maior taxa de cruzamento correlacionado na POP-SE, o coeficiente de
coancestria dentro de progênies ( ), foi também maior nesta população (0,168) que
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700
Distancia (m)
Pro
bab
ilid
ade
de
den
sid
ade
43
na POP-SP (0,135) e o tamanho efetivo dentro de progênies ( eN ) foi menor na POP-
SE (2,69) que na POP-SP (3,27). Estes valores foram próximos aos esperados em
progênies de meio-irmãos (Θ = 0,125), resultando em uma estimativa de tamanho
efetivo de variância da população próxima do valor esperado em progênies de
meios-irmãos (Ne(v) = 4). Consequentemente, o número de árvores matrizes (m)
para coleta de sementes foi maior para a POP-SE (56) que para a POP-SP (46).
Tabela 6 - Sistema de reprodução em populações de G. americana provenientes do
município de Arauá (POP-SE) e Rosana (POP-SP). 95% é o intervalo de confiança
Índices POP-SE (95% CI) POP-SP (95% CI)
Taxa de cruzamento multiloco: mt 0,99 (0,98-1,00) 1,00 (1,00-1,00)
Taxa de cruzamento uniloco: st 0,85 (0,81-0,90) 1,00 (0,99-1,00)
Cruzamento entre parentes: sm tt 0,14 (0,10-0,19) 0,00 (0,00-0,01)
Correlação de paternidade dentro e entre frutos: pr 0,34 (0,23-0,38) 0,08 (0,05-0,09)
Correlação de paternidade dentro de frutos: )(wpr 0,40 (0,32-0,47) -
Correlação de paternidade entre frutos: )(apr 0,26 (0,21-0,31) -
Número efetivo de doadores de pólen (dentro e entre): epN 2,9 (2,6-4,3) 13,0 (12,1-18,2)
Número efetivo de doadores de pólen (dentro): )(wepN 2,5 (2,1-3,1) -
Número efetivo de doadores de pólen (entre): )(aepN 3,8 (3,3-4,9) -
Coancestria dentro de progênies: 0,168 (0,154-0,173) 0,135 (0,132-0,135)
Tamanho efetivo dentro de família: eN 2,69 (2,62-2,90) 3,27 (3,26-3,33)
Número de árvores matrizes: m 56 (52-57) 46 (45-46)
5.2.4 Sistema de reprodução em nível de família
Todos os índices estimados em nível de família foram variáveis entre progênies
(Tabelas 7 e 8): mF (POP-SE: -0,32 a 0,41, POP-SP: -0,43 a -0,03); k (POP-SE: 18
44
a 40, POP-SP: 37 a 48), oH (POP-SE: 0,52 a 0,89, POP-SP: 0,73 a 0,91), oF
(POP-SE: -0,16 a 0,33, POP-SP: -0,16 a 0,07), mt (POP-SE: 0,93 a 0,99, POP-SP:
0,97 a 0,99), st1 (POP-SE: 0,03 a 0,19, POP-SP: 0,04 a 0,10), pr (POP-SE: 0,06 a
0,40, POP-SP: 0,04 a 0,11), )(wpr (POP-SE: 0,05 to 0,91), )(apr (POP-SE: 0,06 to
0,35), epN (POP-SE: 2,5 a 17,9, POP-SP: 9,3 a 25,6), )(wepN (POP-SE: 1,1 a 19,6),
)(aepN (POP-SE: 2,8 a 17,9), (POP-SE: 0,132 a 0,235, POP-SP: 0,130 a 0,139) e
eN (POP-SE: 1,73 a 3,29, POP-SP: 3,12 a 3,42). No entanto, em 22 famílias da
POP-SE (73,3%) e em 28 famílias da POP-SP (93,3%) o mF foi menor que o oF ,
sugerindo seleção para menos indivíduos endogâmicos entre progênies que adultos.
Na POP-SE, para 28 famílias (93,3%) )(wpr foi maior que )(apr , mostrando que o
número efetivo de doadores de pólen foi, em geral, menor dentro do que entre
frutos.
45
Tabela 7- Sistema de Reprodução em famílias de Genipa americana, provenientes do município de Arauá/SE (POP-SE)
mF = índice de fixação das árvores matrizes; n = tamanho da amostra; k = número total de alelos; oH = Heterozigosidade observada; oF = índice de fixação das
progênies; mt±SD= taxa de cruzamento multiloco;
st1 = taxa de cruzamento entre parentes; pr = correlação de paternidade entre e dentro de frutos; )(wpr =
correlação de paternidade dentro de frutos; )(apr = correlação de paternidade entre frutos; epN = número efetivo de doadores de pólen (entre e dentro); )(wepN =
número efetivo de doadores de pólen (dentro); )(aepN = número efetivo de doadores de pólen (entre); = coancestria dentro de progênies; eN = tamanho efetivo
dentro de famílias.
Progênie mF n k oH oF mt ±SD st1 pr ±SD )(wpr ±SD )(apr ±SD epN )(wepN )(aepN eN
1 -0,17 12 30 0,82 -0,06 0,97±0,01 0,08 0,09±0,02 0,24±0,60 0,09±0,01 10,6 4,2 11,2 0,137 2,99 2 0,10 8 30 0,75 0,03 0,95±0,01 0,09 0,11±0,02 0,27±0,84 0,11±0,02 8,7 3,7 9,0 0,153 2,52 3 -0,09 16 33 0,77 0,00 0,98±0,00 0,09 0,12±0,03 0,37±0,41 0,10±0,02 8,1 2,7 9,6 0,140 3,08 4 -0,11 13 27 0,63 0,18 0,97±0,00 0,11 0,12±0,02 0,26±0,51 0,11±0,02 8,4 3,9 8,8 0,140 2,86 5 -0,07 11 27 0,67 0,13 0,96±0,01 0,12 0,12±0,02 0,61±0,56 0,09±0,01 8,5 1,6 10,6 0,140 2,80 6 -0,24 17 31 0,70 0,10 0,94±0,04 0,13 0,10±0,02 0,30±0,32 0,09±0,02 9,9 3,3 11,6 0,138 3,08 7 0,10 22 34 0,70 0,09 0,99±0,01 0,07 0,25±0,06 0,54±0,20 0,15±0,02 4,0 1,8 6,4 0,172 2,65
8 0,10 20 30 0,67 0,14 0,98±0,01 0,13 0,28±0,07 0,45±0,22 0,25±0,06 3,5 2,2 4,0 0,176 2,55 9 0,12 11 23 0,89 -0,16 0,96±0,01 0,08 0,29±0,04 0,91±0,42 0,26±0,04 3,4 1,1 3,9 0,181 2,38 10 -0,29 27 38 0,79 -0,02 0,99±0,01 0,14 0,21±0,05 0,23±0,19 0,20±0,05 4,7 4,3 5,0 0,152 3,03 11 0,17 27 38 0,77 0,00 0,99±0,01 0,08 0,13±0,04 0,21±0,21 0,12±0,04 7,6 4,7 8,6 0,165 2,82 12 -0,15 18 39 0,62 0,20 0,98±0,01 0,07 0,06±0,01 0,08±0,50 0,06±0,01 17,9 12,2 17,9 0,132 3,16 13 -0,10 25 36 0,61 0,21 0,99±0,00 0,17 0,21±0,06 0,25±0,19 0,19±0,05 4,8 3,9 5,2 0,133 3,29 14 -0,10 24 35 0,52 0,33 0,99±0,00 0,19 0,25±0,07 0,47±0,17 0,21±0,07 3,9 2,1 4,8 0,157 2,81 15 -0,14 28 38 0,54 0,30 0,96±0,03 0,16 0,20±0,07 0,45±0,16 0,15±0,05 4,9 2,2 6,5 0,150 2,98 16 -0,29 4 18 0,57 0,26 0,93±0,01 0,10 0,10±0,00 0,41±0,78 0,10±0,00 9,6 2,5 9,7 0,138 1,92 17 -0,32 28 37 0,85 -0,10 0,99±0,00 0,03 0,40±0,10 0,57±0,18 0,35±0,10 2,5 1,7 2,8 0,175 2,68 18 -0,22 25 36 0,79 -0,02 0,95±0,04 0,11 0,19±0,05 0,19±0,25 0,18±0,05 5,3 5,2 5,4 0,149 3,07 19 0,01 10 25 0,63 0,19 0,96±0,00 0,12 0,11±0,02 0,30±0,62 0,11±0,02 8,8 3,3 9,1 0,140 2,70 20 -0,05 17 38 0,79 -0,02 0,98±0,01 0,10 0,07±0,02 0,12±0,46 0,07±0,01 14,1 8,1 15,1 0,134 3,21 21 0,01 23 34 0,82 -0,07 0,99±0,00 0,09 0,19±0,05 0,18±0,31 0,18±0,05 5,3 5,6 5,4 0,150 3,03 22 -0,11 26 38 0,73 0,05 0,99±0,00 0,10 0,14±0,06 0,30±0,24 0,11±0,05 7,3 3,4 8,9 0,142 3,19 23 -0,05 18 30 0,81 -0,05 0,98±0,01 0,09 0,12±0,03 0,32±0,41 0,10±0,03 8,0 3,2 9,6 0,141 3,11 24 -0,19 20 35 0,79 -0,03 0,98±0,01 0,11 0,12±0,04 0,05±0,51 0,13±0,04 8,4 19,6 7,8 0,140 3,16 25 0,12 25 37 0,79 -0,03 0,99±0,00 0,13 0,19±0,07 0,34±0,20 0,15±0,06 5,4 2,9 6,5 0,166 2,79 26 0,18 19 36 0,82 -0,06 0,98±0,00 0,08 0,17±0,05 0,50±0,26 0,13±0,03 5,8 2,0 7,9 0,173 2,63
27 -0,11 20 40 0,84 -0,09 0,98±0,01 0,04 0,11±0,03 0,13±0,46 0,10±0,03 9,3 7,9 9,7 0,138 3,20 28 0,26 4 19 0,56 0,27 0,93±0,01 0,11 0,10±0,01 0,27±0,78 0,10±0,00 9,8 3,6 10,0 0,173 1,73
29 0,41 23 33 0,71 0,07 0,99±0,00 0,20 0,34±0,09 0,58±0,16 0,27±0,08 3,0 1,7 3,7 0,235 2,02 30 -0,04 11 27 0,79 -0,03 0,96±0,01 0,11 0,18±0,04 0,83±0,26 0,13±0,02 5,5 1,2 7,7 0,148 2,78
46
Tabela 8- Sistema de Reprodução em famílias de Genipa americana, provenientes do município de Rosana/SP (POP-SP)
mF = índice de fixação das árvores matrizes; n = tamanho da amostra; k = número total de alelos; oH = Heterozigosidade observada; oF = índice de fixação das
progênies; mt±SD= taxa de cruzamento multiloco; SD= desvio padrão;
st1 = taxa de cruzamento entre parentes; pr = correlação de paternidade entre e dentro
de frutos; epN = número efetivo de doadores de pólen (entre e dentro); = coancestria dentro de progênies; eN = tamanho efetivo dentro de famílias.
Progênie mF n k oH oF mt ±SD st1 pr ±SD epN eN
1 -0,03 22 46 0,82 -0,04 0,98±0,01 0,07 0,11±0,01 9,3 0,139 3,22 2 -0,12 20 44 0,77 0,03 0,97±0,01 0,09 0,06±0,01 15,9 0,133 3,29 3 -0,36 19 44 0,79 0,00 0,97±0,01 0,07 0,06±0,01 16,7 0,133 3,28 4 -0,36 24 45 0,76 0,04 0,98±0,01 0,07 0,05±0,01 21,3 0,131 3,40 5 -0,29 19 39 0,73 0,07 0,97±0,01 0,10 0,06±0,01 16,7 0,133 3,24 6 -0,39 19 45 0,77 0,03 0,97±0,01 0,10 0,06±0,01 15,6 0,133 3,27 7 -0,38 20 46 0,82 -0,04 0,97±0,01 0,08 0,09±0,01 11,6 0,136 3,24 8 -0,24 23 47 0,87 -0,10 0,98±0,01 0,05 0,09±0,01 11,0 0,136 3,29 9 -0,40 22 47 0,84 -0,06 0,98±0,01 0,07 0,05±0,01 18,2 0,132 3,36 10 -0,42 23 46 0,84 -0,06 0,99±0,01 0,05 0,04±0,01 25,6 0,130 3,42 11 -0,40 20 41 0,88 -0,11 0,97±0,01 0,07 0,06±0,01 16,9 0,132 3,32 12 -0,42 18 46 0,89 -0,13 0,97±0,01 0,07 0,05±0,01 19,2 0,132 3,28 13 -0,42 20 47 0,91 -0,16 0,97±0,01 0,05 0,05±0,01 18,5 0,132 3,32 14 -0,39 23 43 0,87 -0,10 0,99±0,01 0,04 0,06±0,01 15,6 0,133 3,36 15 -0,39 23 48 0,84 -0,06 0,99±0,01 0,05 0,06±0,01 16,9 0,132 3,38 16 -0,40 19 38 0,81 -0,03 0,97±0,01 0,05 0,10±0,01 10,1 0,137 3,20 17 -0,41 16 37 0,73 0,07 0,97±0,01 0,08 0,07±0,01 14,3 0,134 3,14 18 -0,43 18 41 0,75 0,05 0,97±0,01 0,08 0,07±0,01 13,9 0,134 3,21 19 -0,36 21 44 0,78 0,01 0,97±0,01 0,06 0,05±0,01 18,2 0,132 3,34 20 -0,40 18 42 0,80 -0,01 0,97±0,01 0,06 0,06±0,01 16,1 0,133 3,26 21 -0,43 20 41 0,82 -0,04 0,97±0,01 0,07 0,06±0,01 17,5 0,132 3,32 22 -0,39 20 38 0,80 -0,02 0,97±0,01 0,07 0,07±0,01 13,3 0,134 3,28 23 -0,39 20 46 0,87 -0,11 0,97±0,01 0,06 0,07±0,01 14,3 0,134 3,28 24 -0,39 18 41 0,84 -0,06 0,97±0,01 0,07 0,07±0,01 13,9 0,134 3,24 25 -0,39 15 41 0,88 -0,12 0,96±0,01 0,07 0,08±0,01 11,8 0,136 3,12 26 -0,28 15 43 0,79 -0,01 0,96±0,01 0,06 0,07±0,01 13,7 0,134 3,16 27 -0,40 15 45 0,88 -0,12 0,96±0,01 0,06 0,09±0,01 11,6 0,136 3,12 28 -0,29 16 43 0,84 -0,07 0,96±0,01 0,07 0,09±0,01 12,8 0,135 3,17 29 -0,05 17 40 0,87 -0,10 0,97±0,01 0,08 0,07±0,01 13,9 0,134 3,21 30 -0,12 16 41 0,78 0,01 0,96±0,01 0,09 0,09±0,01 11,2 0,136 3,14
47
6 Discussão
6.1 Genética Quantitativa
A alta taxa de sobrevivência (87,2%) reforça a ideia de que a espécie em estudo
é adaptada à região em questão. Oliveira et al. (2015) encontraram sobrevivência de
93,5% aos 5 anos em uma área em processo de recuperação do Cerrado; Sano e
Fonseca (2003) encontraram 85% aos 10 anos, estudando o comportamento de
espécie frutíferas nativas do cerrado; e, Silva e Corrêa (2008) encontraram
sobrevivência de 96,7% aos 18 meses de desenvolvimento em área minerada no
Distrito Federal, indicando portanto, que a espécie teria alto potencial para
reflorestamentos nessas áreas.
Os valores referentes ao incremento médio anual (IMA) para o caráter ALT (0,68
m) e DAP (0,82 cm) estão próximos aos encontrados para Enterolobium
contortisiliquum aos 19 anos de idade, sendo de 0,68 m de IMA para o caráter ALT e
de 1,16 cm para DAP (SANT’ANA et al., 2013), bem como para Balfourodendron
riedelianum aos 21 anos de idade, onde o IMA para ALT foi de 0,74 m e para o DAP
de 0,99 cm (SEBBENN et al., 2007) e para Gallesia integrifólia, aos 20 anos de
idade, foi de 0,68 m e 1,09 cm, para os caracteres ALT e DAP, respectivamente
(FREITAS et al., 2008).
A variação genética foi evidenciada para ALT e SOB por meio do teste da razão
da verossimilhança (LRT), o que indica que a amostragem das progênies de
polinização aberta reteve parte dessa variação. Essa variação genética entre as
progênies foi corroborada pelo fato das estimativas de coeficiente de variação
genética (CVgi) serem superiores a 10% e serem maiores que o coeficiente de
variação experimental. Este fato é de suma importância para o melhoramento
genético da espécie, pois o teste pode ser submetido ao método de seleção entre
progênies para se obter ganhos genéticos e aumentar o crescimento médio dos
caracteres silviculturais das mesmas, e assim obter materiais genéticos superiores
(ZARUMA et al,, 2015).
Devido ao fato da estimativa do coeficiente de herdabilidade individual no
sentido restrito (h2a) ter sido em geral de baixa magnitude, variando entre caracteres,
de 0,07 a 0,27, verifica-se um baixo controle genético nos caracteres, e, portanto,
baixas possibilidades de se obter ganhos genéticos com a seleção massal no teste.
No entanto, a estimativa da herdabilidade média entre progênies (h2mp), variou de
48
0,30 a 0,60, indicando forte controle genético e a possibilidade de obter-se ganhos
genéticos na população conservada ex situ, pela seleção entre progênies (ZARUMA
et al,, 2015). De acordo com Vencovsky e Barriga (1992), as herdabilidades em nível
de médias de progênies podem ser superiores às individuais, quando os efeitos
ambientais da h2mp são minimizados pelo número de repetições e de plantas por
parcela. Portanto, a seleção pode ser mais eficiente com base nas médias de
progênies do que em plantas individuais.
Os valores evidenciados para o CVe são considerados baixos, indicando boa
precisão experimental para um experimento em condição de campo. Valores
semelhantes foram encontrados por Zaruma et al, (2015) em teste de procedências
e progênies de Dipteryx alata , localizado em Selvíria-MS onde, esse parâmetro
variou de 12,4 a 17,7 entre procedências, para todos os caracteres avaliados aos
nove anos de idade. Batista et al. (2012) estudando progênies de população aberta
de Handroanthus vellosoi, aos 18 anos de idade, na Estação Experimental de Luiz
Antônio, observaram valores médios de CVe baixo para altura (16,8%), médio para
DAP (21,7%) e alto para sobrevivência (31,5%). Sebbenn et al. (2003) estudando
procedências de Grevillea robusta aos 11 anos de idade, na Estação Experimental
de Avaré, observou valores de CVe baixo para altura total (13,9%) e médio para
DAP (24,0%). Logo, os valores de CVe estimados no presente trabalho estão dentro
do padrão observado em outros estudos similares.
6.2 Genética Molecular
6.2.1 Diversidade genética e endogamia
Com base nos valores das freqüências alélicas dos sete locos microssatélites,
foram estimados os índices de diversidade e estrutura genética. A heterozigosidade
média observada ( oH ) para a POP-SE foi de 0,73 e de 0,82 para a POP-SP,
portanto, foi igual e maior que a heterozigosidade média esperada (POP-SE = 0,73 e
POP-SP = 0,73) para ambas as populações, o que indica uma maior ocorrência de
heterozigotos do que a esperada pelo Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Situação
semelhante foi evidenciada Pinto et al. (2004) para Copaifera langsdorffi ( oH = 0,48,
eH = 0,40), bem como por Gois et al. (2009), em população natural Spondias lutea
L. ( oH = 0,53; eH = 0,51). Os níveis de heterozigosidade detectados para a espécie
49
são altamente relevantes para a conservação in situ, visto o grande número de
novas recombinações genotípicas possíveis de ocorrer, mantendo assim o potencial
evolutivo da espécie, às adaptações às prováveis mudanças ambientais e à
colonização de novas áreas. De acordo com os resultados sugere-se que a
população apresenta potencial para exploração em futuros programas de
melhoramento e para coleta de sementes com fins de recuperação de áreas
degradadas (SEBBENN et al,, 1998a).
O índice de fixação foi negativo para ambas as populações, evidenciando
tendência ao excesso de heterozigotos em relação ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg
(EHW). Esse fato ocorre devido a dois fatores principais: a existência de alelos
deletérios ou genes letais; e a predominância de cruzamentos exogâmicos
(MURRAY, 1996).
6.2.2 Dispersão de pólen
A dispersão do pólen seguiu um padrão de isolamento por distância. Padrão
esse também observado no estudo realizado por Ramos et al (2016), em uma
população de Astrocaryum aculeatum na Amazônia brasileira, bem como por Dick et
al. (2003) em população fragmentada de Dinizia excelsa na floresta Amazônica.
Esse padrão de distribuição é representado por uma distribuição leptocúrtica, que é
caracterizado por uma queda íngreme próximo à origem, seguida de uma longa
cauda, o que está relacionado a raros eventos a longa distância (LEVIN e KESTER,
1974).
A distância média de dispersão de pólen (179 ± 18,9 m) foi similar a estimada
para outras espécies arbóreas tropicais que ocorrem em baixa densidade, como por
exemplo, para D. excelsa, que foi de 212 m (DICK et al, 2003), bem como para
Neobalanocarpus heimii, com uma distância de dispersão de pólen de 191,2 m
±104,9 m (KONUMA et al., 2000) e para Erythrophleum suaveolens, com 195 m
(DUMINIL et al., 2016).
6.2.3 Sistema de Reprodução
Os resultados referente ao sistema de reprodução na POP-SE representa o
padrão de cruzamento efetivo e na POP-SP, o padrão de cruzamento realizado, uma
vez que a análise na POP-SE é baseado na coleta de sementes e genotipagem logo
50
após a germinação e na POP-SP após o estabelecimento de longo tempo em um
ensaio de campo.
A taxa de cruzamento multilocos (tm=1,0) estimada para a POP-SE e para a
POP-SP é esperada para espécies dioica, uma vez que não existe possibilidade de
autofecundação, mas sim de cruzamentos entre parentes (tm-ts= 0,15), como
evidenciado para a POP-SE. Cruzamento entre parentes é um indicativo de
estrutura genética espacial intrapopulacional (SGS), com dispersão de sementes
sendo realizada próxima as árvores matrizes (HARDY et al.,2006; TARAZI et al.,
2010; DEGEN e SEBBENN, 2014).
A recombinação de genótipos por meio de cruzamentos é altamente favorável à
manutenção da viabilidade genética evolutiva das populações, pois a diversidade
genética é a matéria-prima da evolução, bem como do melhoramento genético.
Populações com alta diversidade genética são mais propícias à sobrevivência em
circunstâncias de pressão seletiva natural, visto que esta última pode favorecer a
sobrevivência dos genótipos mais adaptados e eliminar os menos adaptados às
novas condições ambientais (MANOEL et al., 2012b).
As análises dos eventos reprodutivos das populações de G. americana
evidenciaram que 100% das plântulas da POP-SE e POP-SP, foram geradas por
cruzamentos, sendo: 85% e 100% entre indivíduos não parentes, 15% e 0% entre
aparentados e 0,1% por prováveis apomíticos apenas para a POP-SE. Levanta-se
aqui a hipótese de apomixia, devido à espécie ser dióica, portanto, como foi dito
anteriormente, é impossível ocorrer autofecundação. A presença de acasalamentos
endogâmicos ou entre relativos confirma os níveis de endogamia sugeridos pelos
índices de fixação de Wright e desvios do equilíbrio de endogamia de Wright (EEW)
para as progênies (SEBBENN et al., 1998b).
A taxa de cruzamento correlacionado foi menor na POP-SP, o que implica em
um número efetivo de doadores de pólen maior nessa população. A redução na taxa
de cruzamento e o aumento da correlação de paternidade em árvores localizadas
em ambientes altamente antropizados têm sido atribuídos ao aumento do isolamento
das árvores, redução no tamanho da vizinhança reprodutiva e alterações no
comportamento dos polinizadores, desencadeada pela fragmentação de habitats.
Assim, sementes coletadas de polinização aberta de árvores isoladas e localizadas
em pequenos fragmentos podem conter maior parentesco e endogamia e, portanto,
51
menor tamanho efetivo do que sementes coletadas em populações contínuas
(MORAES et al., 2007).
A maior taxa de cruzamento correlacionado dentro que entre frutos na POP-SE
sugere que um máximo de 3 doadores de pólen têm fertilizado cada fruto ( )(wepN ) e
4, os frutos das árvores matrizes ( )(aepN ).
7 Conclusões
A diversidade identificada a partir dos caracteres silviculturais como altura, DAP
e sobrevivência, indicam que as populações têm potencial genético para responder
à seleção natural, assim como para a conservação genética ex situ e uso em
programas de melhoramento genético.
A reprodução ocorre por cruzamentos, sendo parte entre indivíduos parentes,
parte correlacionados e a maior parte são aleatórios.
Ambas as populações evidenciam alta diversidade genética, podendo ser
indicada para a coleta de sementes para fins de recuperação de áreas.
Necessita-se coletar um mínimo de 56 e 46 indivíduos para a POP-SE e POP-
SP, respectivamente, de forma a reter amostras de grupos de progênies com
tamanho efetivo total de 150 para essas populações.
A distância mínima para coleta de frutos entre árvores matrizes é de 179 m, de
forma a diminuir a probabilidade de coletar sementes de árvores parentes.
52
Referências
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Apêndice
APÊNDICE A - Coordenadas geográficas e DAP (Diâmetro Altura do Peito) das árvores-matriz de Genipa americana L., provenientes do município de Arauá/SE
MATRIZES Latitude S, Longitude W, DAP (cm)
1 11°17'42,1" 37°38'69,3" 32,05
2 11°17"41,6" 37°38'69,4" 34,73
3 11°17'45,6" 37°38'70,6" 45,23
4 11°17'69,8" 37°38'51,5" 50,20
5 11°17'89,3" 37°38'35,1" 46,47
6 11°17'72,2" 37°38'54,9" 62,45
7 11°17'72,0" 37°38'55,4" 61,15
8 11°17'70,5" 37°38'54,5" 62,45
9 11°17'69,6" 37°38'54,4" 49,34
10 11°17' 68,0'' 37°38'56,5'' 62,48
11 11°17'65,8'' 37°38'57,1" 36,64
12 11°17'71,1'' 37°38'57,3" 61,18
13 11°17'70,0'' 37°38'57,1" 18,68
14 11°17'71,1'' 37°38'59,0" 50,61
15 11°17'71,8'' 37°38'58,9" 57,81
16 11°17'71,3'' 37°38'60,4" 70,09
17 11° 17 70,9'' 37°38'62,0" 26,26
18 11°17'70,4'' 37°38'61,6" 42,84
19 11°17'90,7'' 37°38'36,3" 39,47
20 11°17'69,1'' 37°38'60,4" 55,00
21 11°17'63,4'' 37°38'57,1" 23,97
22 11°17'62,6'' 37°38'57,1" 63,95
23 11°17'70,8'' 37°38'46,7" 49,21
24 11°17'69,9'' 37°38'46,4" 43,48
25 11°17'72,6'' 37°38'46,4" 54,88
26 11°17'74,7'' 37°38'46,8" 40,81
27 11°17'81,0'' 37°38'48,3" 47,27
28 11°17' 83,0'' 37°38'43,1" 36,38
29 11°17'86,0'' 37°38'36,3" 31,39
30 11°17' 86,8'' 37°38'35,1" 14,26