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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A

PRODUTOS PARA A SAÚDE

MARIANA MARTINELLI JUNQUEIRA RIBEIRO

ESTUDOS QUÍMICOS E BIOLÓGICOS DE Clusia grandiflora Splitg.

(Clusiaceae).

NITERÓI, RJ

2016



(Clusiaceae).

Dissertação apresentada ao Curso

de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a

Produtos para Saúde da Faculdade de

Farmácia da Universidade Federal

Fluminense, como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre.

Campo de Confluência: Pesquisa e

Desenvolvimento de Produtos para a Saúde.

Orientação:

PROFª DRª SELMA RIBEIRO DE PAIVA

PROFª DRª ALESSANDRA LEDA VALVERDE

Niterói, RJ

2016

R 484 Ribeiro, Mariana Martinelli Junqueira.

Estudos químicos e biológicos de Clusia grandiflora Splitg. / Mariana

Martinelli Junqueira Ribeiro; Orientadora: Selma Ribeiro de Paiva;

Coorientação: Alessandra Leda Valverde. - Niterói, 2016.

118 f.: il.

Monografia (Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas em

Produtos de Saúde) – Universidade Federal Fluminense, 2016.

1. Tecnologia farmacêutica 2. Clusiaceae 3. Cromatografia de filtração.

em gel I. Paiva, Selma Ribeiro II. Valverde, Alessandra Leda III. Título.

CDD 615.19



(Clusiaceae).

Dissertação apresentada ao Curso

de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a

Produtos para Saúde da Faculdade de

Farmácia da Universidade Federal

Fluminense, como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre.

Campo de Confluência: Pesquisa e

Desenvolvimento de Produtos para a Saúde.

BANCA EXAMINADORA

Profª Drª Selma Ribeiro de Paiva (UFF) - Orientadora

Profa. Dra. Ana Joffily Coutinho (UFF) - Titular

Profa. Dra. Angélica Ribeiro Soares (UFRJ) - Titular

____________________________________________

Profa. Dra. Luciana Moreira Chedier (UFJF) – Suplente

Niterói, RJ

2016

I

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, à Deus, por ter concedido a força de sempre continuar,

independente do que aconteça.

Às minhas orientadoras, Selma Ribeiro de Paiva e Alessandra Leda Valverde,

pela oportunidade deste trabalho, pela orientação, pela paciência e carinho durante

os anos em que estivemos juntas.

A todos alunos que estão ou passaram pelo Laboratório de Botânica

Funcional e Estrutural e Laboratório de Produtos Naturais Marinhos. Principalmente,

à Maria Carolina Anholeti e Arthur Macedo por sempre me ajudarem com seus

conhecimentos, as alunas, Tatiana Godoi, Luana Sodré e Fernanda Moreira pela

ajuda cotidiana no laboratório e a Karen Dutra pela ajuda e amizade.

À professora Adriana Lobão pela identificação da espécie. E à professora Ana

Joffily por sempre me ajudar durante esses anos.

Ao Jardim Botânico do Rio de Janeiro, principalmente à Profª Drª Claudia

Barros e a aluna Karla Marins, e à Plataforma de Metodologia Analítica de

Farmanguinhos - Fiocruz pelo suporte na pesquisa.

Ao Laboratório de Produtos Naturais (PN3) em Farmanguinhos-Fiocruz,

principalmente ao funcionário Alan Heringer, e ao Laboratório de RMN da UFF pelas

análises realizadas.

Ao Laboratório de Citogenética Humana do Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal do Pará, principalmente Profª. Drª. Raquel Carvalho

Montenegro e a aluna Laine Celestino, ao Laboratório de Antibióticos, Bioquímica,

Ensino e Modelagem Molecular do Instituto de Biologia da Universidade Federal

Fluminense, principalmente a Profª. Drª. Helena Carla Castro e a aluna Louise

Azulay Palavecino, que se dispôs sempre para as análises, e ao Laboratório de

II

Metabolismo de Parasitos do Instituto de Biologia da Universidade Federal

Fluminense, principalmente a Profª. Drª. Evelize Folly das Chagas, pela colaboração

para realização das atividades biológicas.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para

Saúde pela oportunidade de continuar meus estudos.

À Fundação Comissão de Aperfeiçoamento de Pessoal do Nível Superior pelo

fomento concedido.

Aos demais professores e alunos, que estão ou já passaram, pelo Setor de

Botânica pela convivência durante esses quase 7 anos.

Aos meus colegas da pós-graduação pelos dias de estudos e conversas

durante esses dois anos, principalmente a Glauce Duarte a Aline Fleck.

A todos os amigos que fiz na graduação, principalmente aqueles que

permanecem com o convívio diário, Lucas Fajardo, Mariana Dupim, Thamires Conti,

Pedro Ramos, Thaíz Mattos, Juliana Araújo, Ana Amélia Ribeiro, Esthefanie Ribeiro,

Rafaela Bahia, Amanda Cecília, Ana Carolina Cavalini, João Paladino, Renato

Pereira, Júlia Hauaji, Luciana Cardoso e Raísa Reis.

Aos meus pais, Luciene Pereira e Marcos Martinelli, meus avós, Paulo Ferraz,

Tereza Mota e Aldaíza Ribeiro, ao meu tio Carlos Ribeiro e demais familiares que

sempre acreditaram e incentivaram meus estudos.

Ao meu namorado Vitor Balestro, não só por entender meus estudos, mas por

sempre me incentivar a continuar, por me ensinar tantas outras coisas e me

proporcionar muita felicidade. E sua família, pois foi onde sempre encontrei um “vai

dar tudo certo”.

III

Aos demais amigos, que entenderam e conviveram com meus estudos,

Mariah Conti, Aline Mota, Ana Paula Carneiro, Daniele Lima, Nathália Jardim, Maísa

Cavalcanti, Gercia Maria, Rubia Monteiro e a todos os outros.

E a todos que direta ou indiretamente fizeram parte de tudo isso.

IV

“ Por isso, os frutos servirão

de alimento e as folhas de remédio. ”

(Ezequiel 47:12).

V

RESUMO

Clusia grandiflora Splitg. é uma espécie distribuída, principalmente, na floresta Amazônica. Pertence à família Clusiaceae Lindl., que merece destaque pela sua representatividade e potencial biológico. Há poucos trabalhos com C. grandiflora, apresentando, assim, grande relevância seu estudo para sua melhor caracterização morfológica, química e biológica. Partes vegetativas e reprodutivas de C. grandiflora foram coletadas no bairro Jardim Botânico, Rio de Janeiro, RJ. Folhas e ramos foram caracterizados morfologicamente por técnicas tradicionais em anatomia vegetal. A folha apresentou epiderme unisseriada, presença de hipoderme, estômatos restritos à face abaxial e cilindro vascular com feixes acessórios, que também foram identificados no pecíolo. O ramo apresentou tecidos primários ainda instalados, assim como início de crescimento secundário. Os testes histoquímicos localizaram substâncias fenólicas, amido e lipídeos. O material coletado foi processado e, posteriormente, submetido à extração por maceração estática com hexano, seguido de etanol. Os extratos brutos obtidos tiveram seus perfis analisados por CCD, CLAE-DAD e RMN de H1, tendo sido identificados principalmente substâncias fenólicas simples, flavonoides, benzofenonas e terpenos. O perfil dos extratos brutos hexânicos também foram analisados por CG/EM e observaram a presença de hidrocarbonetos alifáticos, triterpenos e esteroides. Os extratos brutos etanólicos foram avaliados quanto a atividade antioxidante e o extrato bruto das raízes adventícias apresentou o melhor CE50 (1,8±0,4 g extrato/g DPPH) com menor concentração de DPPH remanescente nas concentrações de 125 e 250 µg/mL (aproximadamente 5 % em ambas). A análise do doseamento de flavonoides totais nos extratos brutos etanólicos indicou maior presença de flavonas e flavonóis no extrato bruto das flores (1,6 ± 0,0 %). Os extratos brutos foram avaliados quanto a citotoxidade e tiveram resultados promissores para o extrato etanólico dos ramos e folhas. Os extratos também foram avaliados quanto atividade antimicrobiana, sendo os extratos etanólicos dos ramos, folhas e raízes adventícias os mais ativos. Foi feita a atividade acaricida para os extratos brutos hexânicos e o melhor resultado foi para o extrato dos ramos. O extrato bruto etanólico dos ramos foi fracionado por CLV, e submetidos a testes de atividade antimicrobiana, com o melhor resultado para fração em diclorometano. Esta fração foi, então, novamente fracionada por cromatografia em coluna com sílica gel, resultando em frações enriquecidas com 3-oxo-friedelina. Esta foi testada quanto a atividade antimicrobiana e o resultado indicou que esta atividade não está relacionada a 3-oxo-friedelina ou que esta não age sozinha.

Palavras-chave: Clusiaceae Lindl., Clusia grandiflora Splitg., cromatografia, terpenos, atividades biológicas.

VI

ABSTRACT

Clusia grandiflora is a distribuited species mainly in the Amazon forest. Belongs to the family Clusiaceae Lindl., which worth mentioning for its representativeness and biological potential. There are few studies with C. grandiflora, and thus its study shows relevant for best morphological, chemical and biological description. Vegetative and reproductive parts of C. grandiflora were collected in the Botanical Garden neighborhood, Rio de Janeiro, RJ. Leaves and stems were morphologically characterized by traditional techniques in plant anatomy. The leaves presented uniseriate epidermis, presence of hypodermis, stomata restricted to abaxial face and vascular cylinder with accessory bundles, which were also identified in the petiole. The stems presented primary tissues already installed and early secondary growth. The histochemical tests located phenolic substances, starch and lipids. The collected material processed and after subjected to static maceration by extraction with hexane, followed by ethanol. The obtained extracts had their profiles analyzed by TLC, HPLC-DAD and 1H-NMR, being mainly identified simple phenolic substances, flavonoids, benzophenone and terpenes. The profile of the hexane crude extracts were also analyzed by GC/MS and presence of aliphatic hydrocarbons, triterpenes and steroids were observed. The ethanol crude extracts were evaluated for antioxidant activity and the adventitious roots crude extract showed the best EC50 (1,8 ± 0,4 g extract / g DPPH) with lower concentrations of remaining DPPH at concentrations of 125 and 250 mg/mL (approximately 5 % in both). The analysis of total flavonoids content in ethanol crude extracts showed greater presence of flavones and flavonols in the flowers crude extract (1.6 ± 0.0 %). The extracts were evaluated for cytotoxicity and had promising results for the stems and leaves ethanol extract. The extracts were also evaluated for antimicrobial activity and the stems, leaves and adventitious roots ethanol extracts the most active. It was made acaricide activity for hexane extracts and the best result was for the stems extract. The stems crude ethanol extract was fractionated by CLV and subjected to antimicrobial activity test, with the best result for dichloromethane fraction. This fraction was again fractionated by column chromatography with silica gel, resulting in fractions enriched with 3-oxo-friedelin. This was tested for antimicrobial activity and the results indicated that this activity is not related to 3-oxo-friedelin or that it does not act alone. Keywords: Clusiaceae Lindl, Clusia grandiflora Splitg, chromatography, terpenes,

biological activities.

VII

SUMÁRIO

Resumo.........................................................................................................V

Abstract.........................................................................................................VI

Lista de figuras.............................................................................................IX

Lista de tabelas............................................................................................XIII

Lista de siglas e símbolos..........................................................................XIV

1. Introdução................................................................................................1

1.1. Família Clusiaceae Lindl......................................................................2

1.2. Gênero Clusia L....................................................................................3

1.3. Espécie Clusia grandiflora Splitg.......................................................3

2. Objetivo....................................................................................................5

2.1. Objetivos específicos..........................................................................5

3. Revisão da Literatura.............................................................................5

3.1. Aspectos gerais de Clusiaceae, Clusia L. e Clusia grandiflora Splitg

......................................................................................................................5

3.2. Terpenoides.........................................................................................17

4. Materiais e Métodos...............................................................................20

4.1. Levantamento bibliográfico...............................................................20

4.2. Coleta da planta..................................................................................21

4.3. Identificação da planta.......................................................................21

4.4. Descrição anatômica..........................................................................21

4.5. Testes histoquímicos.........................................................................21

4.6. Processamento do material botânico...............................................22

4.7. Extração do material botânico...........................................................23

4.8. Atividade antioxidante........................................................................23

4.9. Dosagem de flavonoides....................................................................24

4.10. Atividade citotóxica..........................................................................24

4.11. Atividade antimicrobiana.................................................................25

4.12. Atividade acaricida...........................................................................26

4.13. Perfil cromatográfico dos extratos bruto.......................................27

4.13.1. Perfil por cromatografia em camada delgada (CCD) .....................27

VIII

4.13.2. Perfil por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à detector de

arranjo de fotodiodo (CLAE-DAD) ..............................................................28

4.13.3. Perfil por ressonância magnética nuclear (RMN) de hidrogênio (1H)

.....................................................................................................................28

4.13.4. Perfil por cromatografia com fase gasosa acoplado à espectrômetro de

massas (CG-EM) ........................................................................................29

4.14. Fracionamento do extrato bruto.....................................................29

4.15. Isolamento e purificação de substâncias......................................29

4.16. Elucidação estrutural de substâncias...........................................30

5. Resultados e discussão.......................................................................30

5.1. Descrição anatômica.........................................................................30

5.2. Teste histoquímico............................................................................36

5.3. Processamento e extração do material botânico...........................39

5.4. Atividade antioxidante......................................................................40

5.5. Doseamento de flavonoides............................................................46

5.6. Atividade citotóxica.........................................................................49

5.7. Atividade antimicrobiana................................................................52

5.8. Atividade acaricida..........................................................................54

5.9. Perfil dos extratos brutos...............................................................56

5.9.1. Perfil por cromatografia em camada delgada (CCD) ....................56

5.9.2. Perfil por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) .............61


.................................................................................................................66


massas(CG-EM) .....................................................................................76

5.10. Fracionamento do extrato bruto CGREt.....................................87

5.10.1. Atividade antimicrobiana das frações da CLV........................91

5.10.2. Isolamento e purificação de substâncias obtidas em CGREtD e suas

elucidações estruturais........................................................................91

5.10.3 Atividade antimicrobiana da 3-oxo-friedelina.........................100

6. Conclusões.......................................................................................100

7. Referências.......................................................................................102

IX

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Distribuição geográfica da família Clusiaceae .........................2

Figura 2. Aspecto das folhas e fruto de Clusia grandiflora Splitg

..................................................................................................................4

Figura 3. Estrutura de metabólitos secundários encontrados em Clusiaceae

..................................................................................................................9

Figura 4. Benzofenonas identificadas em C. grandiflora.........................16

Figura 5. Esquema geral da biossíntese de terpenoides........................18

Figura 6. Exemplos de triterpenos...........................................................19

Figura 7. Estrutura química dos triterpenos 13 e 14................................20

Figura 8. Estrutura química do triterpeno 15...........................................20

Figura 9. Pecíolo e mesofilo de C. grandiflora em cortes transversais...33

Figura 10. Nervura principal de C. grandiflora em cortes transversais...34

Figura 11. Bordo e ramo de C. grandiflora em cortes transversais........35

Figura 12. Testes histoquímicos da lâmina foliar e ramos de C.

grandiflora................................................................................................38

Figura 13. Estrutura do DPPH antes e depois da reação com um agente

antioxidante (A-H)

................................................................................................................41

Figura 14. Cinética reacional do BHT com DPPH..................................43

Figura 15. Cinética reacional da rutina com DPPH................................44

Figura 16. Cinética reacional das raízes adventícias com DPPH..........44

Figura 17. Cinética reacional dos ramos com DPPH.............................45

Figura 18. Cinética reacional das folhas com DPPH.............................45

Figura 19. Cinética reacional das flores com DPPH..............................46

Figura 20. Esquema da complexação do cloreto de alumínio com flavonoides

................................................................................................................47

Figura 21. Teste de Correlação de Pearson entre os valores de CE50 dos extratos de

C. grandiflora e o percentual de flavonoides ..........................................49

Figura 22. Teste de imersão de fêmeas adultas nos extratos brutos hexânicos de C.

grandiflora ...............................................................................................55

X

Figura 23. CCD dos extratos brutos etanólicos e hexânicos de C. grandiflora eluídos

em hexano: acetato de etila: ácido acético (65:34:1) e revelados em lâmpada de luz

UV .........................................................................................................57

Figura 24. CCD dos extratos brutos etanólicos de C. grandiflora eluídos em hexano:

acetato de etila: ácido acético (50:49:1) e revelados em Dragendorff

..............................................................................................................58

Figura 25. CCD dos extratos brutos hexânicos de C. grandiflora eluidos em hexano:

acetato de etila: ácido acético (75:24:1) e revelados em vanilina sulfúrica

.............................................................................................................59

Figura 26. CCD dos extratos brutos de C. grandiflora revelados em DPPH

............................................................................................................60

Figura 27. Estrutura química das substâncias 13, 15 e 16................61

Figura 28. CCD dos extratos brutos hexânicos de C. grandiflora e frações

enriquecidas com as substâncias 13, 15 e 16 (setas) eluidos em hexano: acetato de

etila: ácido acético (80:19:1) e revelados em vanilina sulfúrica..........61

Figura 29. Cromatogramas dos extratos hexânicos de C. grandiflora em água (A) e

acetonitrila (B), ambos com 0,05% de ácido trifluoroacético, variando de 25% a 55%

de B (0 – 15 min), 55% a 100% de B (15 – 18 min), mantendo os 100% até 30 min,

em 270 nm..........................................................................................64

Figura 30. Cromatogramas obtidos dos extratos etanólicos de C. grandiflora em

água (A) e acetonitrila (B), ambos com 0,05% de ácido trifluoroacético, variando de

10% a 45% de B (0 – 40 min), 45% a 100% de B (40 – 50 min), mantendo os 100%

até 55 min, em 270 nm........................................................................65

Figura 31. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato hexânico das raízes

adventícias (CGRAH) de C. grandiflora (CDCl3; 500MHz)..................67

Figura 32. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato hexânico dos ramos

(CGRH) de C. grandiflora (CDCl3; 500MHz).......................................68

Figura 33. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato hexânico das folhas

(CGFoH) de C. grandiflora (CDCl3; 500MHz).....................................69

Figura 34. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato hexânico das flores

(CGFH) de C. grandiflora (CDCl3; 500MHz).......................................70

XI

Figura 35. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato etanólico das raízes

adventícias (CGRAEt) de C. grandiflora (MD3OD; 500MHz).............72

Figura 36. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato etanólico dos ramos

(CGREt) de C. grandiflora (MD3OD; 500MHz)..................................73

Figura 37. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato etanólico das folhas

(CGFoEt) de C. grandiflora (MD3OD; 500MHz)................................74

Figura 38. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato etanólico das flores

(CGFEt) de C. grandiflora (MD3OD; 500MHz)..................................75

Figura 39. Cromatograma obtido por CG/EM de CGRAH...............79

Figura 40. Fragmentação das substâncias encontradas em CGRAH

.........................................................................................................80

Figura 41. Cromatograma obtido por CG/EM de CGRH.................81

Figura 42. Fragmentação das substâncias encontradas em CGRH

.........................................................................................................82

Figura 43. Cromatograma obtido por CG/EM de CGFoH...............83

Figura 44. Fragmentação das substâncias encontradas em CGFoH

.........................................................................................................84

Figura 45. Cromatograma obtido por CG/EM de CGFH.................85

Figura 46. Fragmentação das substâncias encontradas em CGFH

........................................................................................................86

Figura 47. Fluxograma do fracionamento do CGREt.....................88

Figura 48. CCD do extrato bruto etanólico dos ramos e das frações obtidas por CLV

eluídas em hexano: acetato de etila: ácido acético (80:19:1) e reveladas em lâmpada

de luz UV em 254 nm.....................................................................89

Figura 49. CCDs do extrato bruto etanólico dos ramos e das frações obtidas na CLV

........................................................................................................90

Figura 50. CCD das frações obtidas na CLV e frações enriquecidas com as

substâncias 13, 16 e 17 eluídas em hexano: acetato de etila: ácido acético (80:19:1)

e revelados em vanilina sulfúrica...................................................90

Figura 51. CCD do extrato bruto etanólico dos ramos, da fração CGCEtD, das

frações 1 a 4 e frações 3 e 4 recristalizadas eluídas em hexano: acetato de etila:

XII

ácido acético (85:14:1) e revelados sob lâmpada de luz UV em 365 nm

......................................................................................................92

Figura 52. CCD do extrato bruto etanólico dos ramos, da fração CGCEtD e das

frações 5 a 9 eluídas em hexano: acetato de etila: ácido acético (50:49:1) e

revelados sob lâmpada de luz UV em 256 nm.............................93

Figura 53. CCD das frações 1 a 9, frações recristalizadas e frações enriquecidas

com as substâncias 13, 16 e 17 eluídas em hexano: acetato de etila: ácido acético

(80:19:1) e revelados em vanilina sulfúrica.................................93

Figura 54. Cromatograma e fragmentação das substâncias obtidas na fração

CGREtD 3rec...............................................................................95


CGREtD 4rec..............................................................................96

Figura 56. Proposta de fragmentação da 3-oxo-friedelina.........97

Figura 57. Espectro de RMN de H1 da 3-oxo-friedelina e expansões do campo alto

....................................................................................................98

Figura 58. Estrutura química da 3-oxo-friedelina (13)

....................................................................................................99

XIII

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Gêneros pertencentes a Clusiaceae e suas respectivas tribos..6

Tabela 2. Espécies de Clusia utilizadas na medicina popular....................11

Tabela 3. Atividades biológicas descritas para alguns extratos e substâncias

isoladas a partir de espécies do gênero Clusia..........................................13

Tabela 4. Testes histoquímicos utilizados para caracterização em C. grandiflora

....................................................................................................................22

Tabela 5. Localização das classes químicas detectadas na lâmina foliar e no ramo

de C. grandiflora utilizando teste histoquímico...........................................39

Tabela 6. Rendimentos extrativos obtidos de C. grandiflora.....................39

Tabela 7. Valores do CE50 dos padrões e dos extratos etanólicos de C.

grandiflora..................................................................................................41

Tabela 8. Teor de flavonoides, expressos em flavonas e flavonóis, obtidos para os

extratos etanólicos de C. grandiflora.........................................................47

Tabela 9. Valores da concentração do CI50 dos extratos brutos obtidos de C.

grandiflora.................................................................................................50

Tabela 10. Diâmetro dos halos de inibição formados em função dos extratos de C.

grandiflora frente às cepas P. aeruginosa e E. coli..................................52

Tabela 11. Concentrações inibitória mínima (CIM) dos extratos ativos de C.

grandiflora frente às cepas P. aeruginosa e E. coli..................................54

Tabela 12. Índice de postura de ovos (IPO) e inibição de postura, em porcentagem,

15 dias após o tratamento com extratos hexânicos de C. grandiflora

.................................................................................................................56

Tabela 13. Substâncias identificadas nos extratos hexânicos de C. grandiflora por

CG/EM, sua correlação com o banco de dados e abundância...............76

Tabela 14. Concentrações mínimas necessárias de cada fração para inibir o

crescimento das cepas P. aeruginosa e E. coli......................................91

Tabela 15. Substância majoritária identificada nas frações cromatogradas em coluna

com gel de sílica de C. gradiflora por CG/EM........................................94

Tabela 16. Dados do RMN de H1 da friedelina comparados a literatura

...............................................................................................................99

XIV

LISTA DE SIGLAS E SÍMBOLOS

AAT- Atividade antioxidante total

AGP-01- Linhagem de células tumorais de ascite gástrica

ANOVA- Análise de variância simples

ANVISA- Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ATCC- American Type Culture Collection

BHT- Butil-hidróxitolueno

CCD- Cromatografia em camada delgada

CE50- Concentração de amostra necessária para reduzir em 50% a concentração

inicial

CIM- Concentração inibitória mínima

CG/EM- Cromatografia com fase gasosa acoplada à espectrometria de massas

CGFH: extrato hexânico das flores de C. grandiflora

CGFEt: extrato etanólico das flores de C. grandiflora

CGFoH: extrato hexânico das folhas de C. grandiflora

CGFoEt: extrato etanólico das folhas de C. grandiflora

CGRAH: extrato hexânico das raízes adventícias de C. grandiflora

CGRAEt: extrato etanólico das raízes adventícias de C. grandiflora

CGRH: extrato hexânico dos ramos de C. grandiflora

CGREt: extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora

CGREtH: extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora fração em hexano da CLV

CGREtD: extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora fração em diclorometano da

CLV

CGREtAc: extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora fração em acetato de etila

da CLV

CGREtM: extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora fração em metanol da CLV

CGREtMA: extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora fração em metanol:água da

CLV

CGREtD 3rec: fração 3rec da coluna obtida da fração em diclorometano da CLV do

extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora

XV


extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora

CGREtF: fração enriquecida com friedelina de C. grandiflora

CL50- Concentração de amostra letal necessária para reduzir em 50% a

amostragem inicial

CLAE-DAD- Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à detector de arranjo

de fotodiodo

CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute

CLV- Cromatografia líquida à vácuo

DMEM- Meio de cultura Eagle modificado por Dulbecco

DMSO- Dimetilsulfóxido

DNFH- 2,4-dinitrofenilhidrazina

DPPH- 2,2-difenil-1-picrilhidrazina

FDA- Food and Drug

HCT-116- Linhagem de células tumorais de cólon humano

IC95- Intervalo de confiança de 95%

IE- Índice de eficácia

IPO- Índice de postura de ovos

MCF7- Linhagem de células tumorais de mama humana

MRC5- Linhagem de fibroblasto humano

MRSA- Staphylococcus aerus resistente à meticilina

MTT- Teste do sal tetrazóleo

NCI- Nacional Cancer Institute

PEG- Polietilenoglicol

PF- Ponto de fusão

Rf- Fator de retenção

RMN 1H- Ressonância magnética nuclear de hidrogênio

THF- Tetraidrofurano

TSA- Teste de sensibilidade bacteriana

UV- Ultravioleta

VRE- Enterococcus faecium resistente à vancomicina

MHz- Mega-hertz

XVI

µL- Microlitros

mL- Mililitros

mg- Miligramas

µg- Micrograma

M- Molar

µM- Micromolar

m- Metros

mm- Milímetros

µm- Micrometros

nm- Nanômetros

h- Horas

min- Minutos

%- Porcentagem

δ- Deslocamento químico

ºC – graus Celsius

1

1.INTRODUÇÃO

O uso de espécies vegetais com fins de tratamento e cura de doenças

remete ao início da civilização humana, desde o momento em que o homem

despertou a consciência e começou um longo percurso de manuseio, adaptação e

modificação de recursos naturais para o seu benefício (DI STASI, 1998). As

propriedades curativas das plantas foram descobertas inicialmente de forma

empírica e por diversas vezes resultavam da observação de animais. O

conhecimento adquirido acerca de tais propriedades foi então repassado entre as

gerações, permitindo ao longo do tempo o reconhecimento e a diferenciação de

plantas benéficas e tóxicas à sua saúde (FERRO, 2006).

A utilização de produtos naturais pela população vem apresentando um

acelerado acréscimo, sendo na maioria dos casos de forma indiscriminada. Esse

fato se agrava, quando se observa que muitas plantas medicinais vêm sendo

comercializadas sem que haja um eficaz controle da qualidade (SILVA et al., 2010).

Junto ao uso indiscriminado, há o agravamento dos problemas ambientais,

ocorrendo assim, o crescimento da filosofia que busca a manutenção da

biodiversidade e desenvolvimento sustentável. Aliado a esses problemas muitas

espécies provavelmente se extinguiram sem ao menos serem conhecidas (VIEIRA et

al., 2005).

É notória a importância dos estudos para produção de substâncias que

possam servir como protótipo de novas drogas, já que se observa o uso de produtos

naturais na área da saúde, impulsionando as indústrias farmacêuticas a

desenvolverem novos fármacos, que possuam atividades frente a doenças nas quais

o tratamento original mostrava-se ineficaz. São inúmeros os exemplos de

medicamentos que foram desenvolvidos direta ou indiretamente a partir de fontes

naturais, especialmente das plantas, como a morfina, pilocarpina, digitálicos,

atropina, entre outros (YUNES & CALIXTO, 2001).

Segundo o Ministério do Meio Ambiente, o Brasil é responsável pela maior

biodiversidade do mundo, com cerca de 11% a 14% da flora. Apresenta

aproximadamente, até o ano de 2014, mais de 41 mil espécies catalogadas e

milhares ainda desconhecida pela ciência.

2

1.1. Clusiaceae Lindl.

Clusiaceae Lindl. (=Guttiferae Juss.) pertence à ordem Malpighiales (APG III,

2009) e apresenta-se constituídas por plantas lenhosas, de porte arbóreo ou

arbustivo, e raramente lianas (BITTRICH, 2015), muitas com grande valor

econômico fornecendo madeiras-de-lei, frutos comestíveis, resinas e óleos

essenciais (JOLY, 1987). Possuem látex na maioria dos seus tecidos, motivo pelo

qual a família recebeu originalmente o nome Guttiferae, que significa “portando

goma” (FERNANDES, 2007).

A família conta com 14 gêneros e aproximadamente 600 espécies

(STEVENS, 2001 onwards) de ampla distribuição geográfica, com maior ocorrência

nos trópicos (Figura 1). No Brasil ocorrem 12 gêneros (sendo 2 endêmicos) e 127

espécies (43 endêmicas) (BITTRICH, 2015). Alguns gêneros originalmente

pertencentes a essa família foram reorganizados formando outras famílias, como o

gênero Hypericum que, atualmente, pertence à família Hypericaceae (APG III, 2009).

Figura 1. Distribuição geográfica da família Clusiaceae.

Fonte: http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb/. Acesso em

26/03/2015

As lâminas foliares de espécies da família Clusiaceae são, normalmente,

espessas, com margens inteiras e com canais de resina. As flores têm pétalas e

sépalas livres e grande número de estames, por vezes, podem se apresentar em

http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb/

3

fascículos. O fruto, quando há deiscência, abre ao longo do raio de septo

(STEVENS, 2001 onwards).

Do ponto de vista químico e biológico, a família possui diferentes metabólitos

secundários identificados, assim como atividades biológicas, como exemplo, a

presença de terpenoides com atividade frente à leucemia humana (WANG et al.,

2008), flavonoides com efeito antinociceptivo in vivo (BITTAR et al., 2000) e

benzofenonas com atividade antimicrobiana (LOKVAM et al., 2000).

1.2. Clusia L.

O gênero Clusia L. ocorre na região neotropical e reúne cerca de 330-400

espécies semi-epífitas, trepadeiras, arbustivas e arbóreas (BITTRICH & AMARAL,

1996, 1997; STEVENS, 2001 onwards), das quais 68 ocorrem no Brasil, sendo 23

endêmicas (BITTRICH, 2015).

Todas as espécies produzem látex que quando extravasado formam uma

barreira química defensiva contra insetos além da produção de resinas florais que

atuam como recompensa para as abelhas na construção de seus ninhos e

polinização (OLIVEIRA et al., 1999; PORTO et al., 2000; LOKVAM et al., 2000;

LANGENHEIM, 2003; MEDINA et al., 2004). Os frutos são cápsulas carnosas

septífragas com geralmente duas ou mais sementes por lóculo, as sementes podem

ser cobertas por um arilo não-vascularizado (BITTRICH et al., 2013). As folhas de

Clusia variam de tamanho e em geral são inteiras e suculentas, podem ser coriáceas

e não são estipuladas (STEVENS, 2007), o que ajuda na tolerância a condições de

seca.

Quanto à composição química, há presença de benzofenonas, flavonoides e

terpenoides, principalmente. Esses metabólitos estão associados às atividades

encontradas no gênero, como anti-inflamatória (DE MELO et al., 2014) e que serão

discutidos adiante.

1.3. Clusia grandiflora Splitg.

4

A espécie (Figura 2) apresenta-se como árvores hemiepífitas e encontra-se

principalmente na Amazônia em florestas de terra firme, sendo conhecida

popularmente como apuí, cebola da mata e cebola grande da mata (BITTRICH,

2015).

Figura 2. Aspecto das folhas e fruto de Clusia grandiflora Splitg.

Área urbana - Bairro Jardim Botânico, Rio de Janeiro - RJ

Fonte: Mariana M. J. Ribeiro

Apesar da escassez de estudos com a espécie, os encontrados na literatura

mostraram que do látex presente nos caules (LOKVAM et al., 2000) e das resinas

das flores femininas de Clusia grandiflora foram isoladas benzofenonas com potente

atividade biológica, como antimicrobiana (DE CASTRO et al., 2011; SERKEDJIEVA

et al., 1992).

Plantas pouco estudadas necessitam de um controle botânico, químico e

microbiológico para se eleger marcadores que possam servir como controle para

não serem comercializadas de forma equivocada ou com adulterações. Assim, estes

estudos em Clusia grandiflora se fazem importantes, já que se trata de uma espécie

nativa, originada de uma família botânica com grandes aplicações em atividades

biológicas e com uso popular, podendo ser uma promissora fonte de substâncias

que atuem como protótipo na indústria farmacêutica.

5

2. OBJETIVOS

Este trabalho teve como objetivo a análise e descrição da organização celular,

a caracterização química dos extratos e a investigação de atividades biológicas de

Clusia grandiflora, ampliando o conhecimento da espécie em estudo.

2.1. Objetivos específicos:

• Caracterização da organização e morfologia celular das folhas e ramos;

• Estudo histoquímico das folhas e ramos;

• Obtenção de extratos brutos;

• Prospecção química dos extratos;

• Avaliação da atividade antioxidante e o doseamento de flavonoides dos

extratos etanólicos;

• Avaliação da atividade citotóxica, antimicrobiana e acaricida dos extratos e

frações;

• Isolamento, purificação e identificação de metabólitos secundários.

3. REVISÃO DA LITERATURA

3.1. Aspectos gerais de Clusiaceae, Clusia L. e Clusia grandiflora.

Do ponto de vista taxonômico, segundo Stevens (2001 onward), a família

Clusiaceae inclui-se na ordem Malphighiales e possui 14 gêneros distribuídos

conforme a Tabela 1.

6

Tabela 1. Gêneros pertencentes a Clusiaceae e suas respectivas tribos, conforme

Stevens (2001 onwards).

Família Clusiaceae

Tribos Clusieae Garcinieae Symphonieae

Gêneros Clusia L. Allanblackia

Bentham

Lorostemon

Ducke

Chrysochlamys

Poepp.

Garcinia L. Montrouziera

Planchon &

Triana

Dystovomita

(Engler) D'Arcy

Moronobea

Aublet

Tovomita Aublet Pentadesma

Sabine

Tovomitopsis

Planchon & Triana

Platonia Martius

Symphonia L. f.

Thysanostemon

Maguire

Do ponto de vista anatômico, segundo Metcalfe & Chalk (1950), são

características da família Clusiaceae: estômatos paracíticos em grande parte das

espécies; ocorrência de cristais de oxalato de cálcio em tecidos parenquimatosos;

cavidades e canais esquizógenos frequentes em raízes, caules e folhas, locais onde

vários metabólitos secundários seriam elaborados e secretados (ALVAREZ &

POTIGUARA, 2013).

Do ponto de vista químico, a família Clusiaceae se caracteriza pela presença

de xantonas, benzofenonas, flavonoides, cumarinas, terpenoides, esteroides, entre

outros (OLIVEIRA et al., 1996; FERREIRA et al., 2012). Algumas dessas

substâncias são importantes na biologia de espécies de Clusiaceae, outras já foram

isoladas e submetidas a testes biológicos (OLIVEIRA et al., 1996), demonstrando

7

um grande potencial biodinâmico, o que incentiva o estudo mais aprofundado dos

constituintes químicos produzidos por espécies dessa família.

Espécies do gênero Allanblackia Bentham são comuns e de grande

importância comercial na África. O óleo das sementes de algumas espécies é

utilizado tradicionalmente como alimento funcional, decoctos das folhas e casca são

usados para tratar dor de dente, disenteria e hipertensão, quando em extrato é

aplicado topicamente como um analgésico (CROCKETT, 2015). Xantonas já foram

isolados a partir de espécies do gênero, tendo a xantona 1 (Figura 3) atividade frente

à leucemia (CROCKETT, 2015; AZEBAZE et al., 2009). Xantonas também já foram

isoladas dos gêneros Symphonia L. f. (FROMENTIN et al., 2015); Montrouziera

Planchon & Triana (ITO et al., 2000) e Lorostemon Ducke (FILHO et al, 1973), além

dos gêneros Chrysochlamys Poepp. com atividade antimalárica (MOLINAR-TORIBIO

et al. 2006); Pentadesma Sabine (DJOUFACK et al., 2010) com atividade

antiplasmodial e citotóxica (ZELEFACK et al., 2009) e Garcinia L. (STARK et al.,

2015) com atividade antiproliferativa, in vitro, à células leucêmicas (LI et al., 2015) e

atividade antioxidante (THONG et al., 2015);.

O gênero neotropical Tovomita Aublet está distribuído pela América Central e

Sul (NOGUEIRA et al., 1998). A classe metabólica mais comumente encontrada em

diferentes espécies do gênero também foram as xantonas (DE OLIVEIRA et al.,

1972; GABRIEL & GOTTLIEB, 1972; MESQUITA et al., 1975; DE OLIVEIRA et al.,

1984; MARQUES et al., 2000), das quais foram descritas atividades fungicida

(ZHANG et al., 2002), citotóxica e antimicrobiana (PECCHIO et al., 2006). Além da

presença dos esteroides 2 e 3 (Figura 3) (GABRIEL & GOTTLIEB, 1972; DE

OLIVEIRA et al., 1972).

A casca do caule do gênero Garcinia L. é usado tradicionalmente na África

para tratar doenças gastrointestinais e metabólicas e seu uso levou a estudos

fitoquímicos que constataram como principais substâncias bioativas os flavonoides

(STARK et al., 2015). Uma série de trabalhos já foram realizados e mostraram que o

biflavonoide 4 (Figura 3), entre outros, possuem atividade antioxidante (STARK et

al., 2015). Do gênero Pentadesma Sabine também já foram caracterizados

flavonoides (DJOUFACK et al., 2010). O extrato alcoólico dos frutos do gênero é

usado tradicionalmente para febre, constipação, bronquite, diarreia e disenteria

8

(TAMOKOU et al., 2013) e possuem atividade antitumoral e antimicrobiana

(TAMAKOU et al., 2013).

As benzofenonas são metabólitos bastante presentes na família sendo,

encontradas nos gêneros Allanblackia Bentham (LENTA et al., 2007); Tovomitopsis

saldanha Engl. (BITTRICH et al., 2003) e Moronobea Aublet (DIAS et al., 1974;

MARTI et al., 2009) demonstrando atividade antiplasmodial (MARTI et al., 2009). Em

Garcinia L., mostraram atividade antitumoral (IONTA, et al., 2015) e em Pentadesma

Sabine, atividade antiproliferativa (ZELEFACK et al., 2009; WABO et al., 2010).

Plantonia insignis, a espécie mais estudada de Platonia Martius, a árvore

frutífera e madeireira é de maior importância socioeconômica da região Norte do

Brasil (DE SOUZA et al., 2013). É conhecida popularmente como bacuri e na

medicina tradicional é utilizada para o tratamento de diarreia (SILVA et al., 2015),

depressão, doenças de pele e inflamatórias (DA SILVA, et al. 2014). Da espécie

foram também isoladas benzofenonas com atividade leishmanicida, antioxidante,

vasorelaxante, antiplasmodial, antiviral, antinflamatória (SILVA et al., 2015) e tendo a

benzofenona 5 atividades anticonvulsivante (DA SILVA, et al. 2014).

O gênero Symphonia L.f. é, principalmente, representado pela espécie

Symphonia globulifera L.f.. As folhas, o látex e o caule são amplamente utilizados na

medicina tradicional da África e América do Sul contra doenças parasitárias, dores

no corpo, sarna, tosse, febre, malária, diabetes, entre outras (FROMENTIN et al.,

2015). A literatura descreve a presença, principalmente, das benzofenonas na

espécie, que apresentaram atividade biológica interessante, como antiplasmodial,

antioxidante, antiparasitária, antimicrobiana e citotóxica (FROMENTIN et al., 2015).

Outra classe química também encontrada foi a das isocumarinas, sendo a

cumarina 6 (Figura 3) isoladas do gênero Montrouziera Planchon & Triana (ITO et

al., 2000).

Tovomitopsis Planchon & Triana é um gênero pequeno quanto ao número de

espécies e está bastante ligado ao gênero Clusia L., sendo ainda pouco investigado

sobre o ponto de vista químico (BITTRICH et al., 2003). Um estudo realizado

demonstrou atividade antibacteriana do extrato etanólico das folhas de Tovomitopsis

psychotriifolia contra Bacillus cereus, Staphylococcus aureus e Pseudomonas

9

aeruginosa, sendo a substância ativa identificada como o ácido 7 (Figura 3)

(SETZER et al., 1995).

Os gêneros, Dystovomita (Engler) D'Arcy e Thysanostemon Maguire, não

apresentaram, até o momento, estudos do ponto de vista químico e farmacológico

descritos nas bases de dados consultadas.

Figura 3. Estrutura de metabólitos secundários encontrados em Clusiaceae

(CROCKETT, 2015; AZEBAZE et al., 2009; GABRIEL & GOTTLIEB, 1972; DE

10

OLIVEIRA et al., 1972; STARK et al., 2015; DA SILVA, et al. 2014; ITO et al., 2000;

SETZER et al., 1995).

Quanto à Clusia L., dados da literatura mostram que suas espécies

apresentam grande número cavidades secretoras, muitas destas preenchidas de

látex (LÜTTGE E DUARTE, 2007; METCALFE E CHALK, 1950). Anatomicamente,

as folhas ainda podem apresentar características comumente presentes em

espécies que se adaptaram a ambientes xéricos, como por exemplo: cutícula

espessa, número elevado de estômatos e abundância de tecido mecânico

(FERNANDES, 2007). Algumas espécies são amplamente utilizadas na medicina

popular, como mostra a Tabela 2. Os estudos químicos e biológicos mostraram

ainda atividades biológicas de extratos e substâncias isoladas como terpenoides,

cumarinas, xantonas, flavonoides e, principalmente, benzofenonas, apresentados na

Tabela 3.

11

Tabela 2. Espécies de Clusia utilizadas na medicina popular.

Espécie

Nome popular Origem Parte utilizada Uso medicinal popular Referência

Clusia amazonica

Planch. & Triana

capei e cope Brasileira raiz e casca lepra HASHIMOTO, 2002

Clusia coclensis

Standl.

azahar de

monte, copey e

copeicillo

Costa

Rica

folhas hipertensão arterial GARCIA-GONZÁLEZ &

MATAMOROS, 1998

Clusia flava Jacq. não informado México folhas carminativo, dores de

cabeça, feridas e sífilis

BARRIOS et al., 1991

Clusia insignis Mart. apuí; cebola-

brava, e guapoí

Brasil resinas constipação e cicatrizante de

fissuras nos seios

HASHIMOTO, 2002

Clusia lineata (Benth.)

Planch. & Triana

came Peru cascas e caules reumatismo SANZ-BISET et al.,

2009

Clusia opaca Maguire não informado Brasil resina cicatrização LANGENHEIM, 2003

Clusia palmicida Rich.

ex Planch. & Triana

Came Peru cascas reumatismo, hérnia inguinal e

ossos quebrados

SANZ-BISET et al.,

2009

Clusia planchoniana

Engl.

não informado Colômbia resina dores de dente LANGENHEIM, 2003

Clusia salvinii Donn.

SM.

orelha de

coyote

México não informado gonorreia e dores renais YASUNAKA et al.,

2005

12

Clusia purpurea

(Splitg.) Engl.

cebola-brava Brasil entrecasca antisséptico e cicatrizante de

feridas

FENNER et al., 2006.

13

Tabela 3. Atividades biológicas descritas para alguns extratos e substâncias isoladas a partir de espécies do gênero Clusia.

Espécie Substâncias / Extratos Atividade Referência

Clusia amazonica

Planch. & Triana

extrato aquoso das folhas e caules leishmanicida ODONNE et al., 2009

Clusia coclensis

Standl.

extrato aquoso das folhas hipotensor em ratos

GARCÍA-GONZÁLEZ

& MATAMOROS,

1998

Clusia columnaris Engl. I3,II8-binaringenina (flavonoide) antinociceptivo BITTAR et al., 2000

Clusia flava Jacq. extrato metanólico das folhas leishmanicida PERAZA-SÀNCHEZ

et al., 2007

Clusia guatemalensis

Hemsl.

extrato metanol/diclorometano (1:1)

das folhas

inibição da enzima transcriptase

reversa do vírus HIV-1

HUERTA-REYES et

al., 2004

Clusia hilariana Schltdl. ácido oleanólico (terpenoide)

nemorosona A e B (benzofenona)

toxidez sobre larvas R. prolixus e

promoção de atraso da ecdise

promoção de atraso de ecdise de

larvas de R. prolixus

KELECON et al.,

2002

KELECON et al.,

2002

Clusia insignis Mart. resinas das flores masculinas antimicrobiano PORTO et al., 2000

Clusia lanceolata

Cambess

resinas das flores masculinas antimicrobiano PORTO et al., 2000

Clusia massoniana extrato metanol/diclorometano (1:1) antiviral HUERTA-REYES et

14

Lundell das folhas al., 2004

Clusia nemorosa G.

Mey.

ácido betulínico (terpenoide)

prevenção da obesidade em

camundongos

DE MELO et al., 2009

Clusia palmana Standl. vitexina e epicatequina (flavonoides) neutralização do efeito hemorrágico

induzido por veneno de Bothrops

asper em ratos

CASTRO et al., 1999

Clusia paralicola G.

Mariz

clusiparalicolina A e B (derivados

bifenila)

promotora de cisão em fitas de DNA

e atividade antitumoral

SEO et al., 1999

Clusia quadrangula

Bartlett

extrato diclorometano/metanol (1:1)

das folhas

antiviral HUERTA-REYES et

al., 2004

Clusia renggerioides

Planch. & Triana


Clusia rosea Jacq.

guttiferona E e xantochimol

(benzofenona)

nemorosona (benzofenona)

inibição dos efeitos citopáticos da

infecção pelo vírus HIV em células

linfoblastóides humanas

citotoxidez contra as linhagens de

células humanas HeLa, HEp-2

(carcinoma laríngeo), PC-3 (câncer

de próstata) e células de

neuroblastoma

GUSTAFSON et al.,

1992

CUESTA-RUBIO et

al., 2002; DÍAZ-

CARBALLO et al.,

2008a

15

nemorosona (benzofenona)

bloqueio da proliferação e indução

de apoptose em linhagens de

células de leucemia

DÍAZ-CARBALLO et

al., 2008b

Clusia spiritu-

sanctensis G.Mariz et

Weinberg


Clusia torresii Standl.

vitexina e epicatequina (flavonoides)

clusianona e 7-epiclusianona

(benzofenona)

neutralização do efeito hemorrágico

induzido por veneno de Bothrops

asper em ratos

inibição da infecção pelo vírus HIV-

1 na linhagem de células humanas

C8166 (células T linfoblastóides)

CASTRO et al., 1999

PICCINELLI et al.,

2005

Clusia weddelliana

Planch. & Triana


16

Das resinas florais de Clusia grandiflora já foram identificadas as

benzofenonas 8 e 9 e isolada a benzofenona 10 (OLIVEIRA, 1999; LOKVAM et al.,

2000). Do látex do caule foram isoladas as benzofenonas 11 e 12 (LOKVAM et al.,

2000) (Figura 3). As substâncias 10 e 11 mostraram atividade antimicrobiana contra

os patógenos do mel Paenibacillus larvae e Paenibacillus alvei (LOKVAM et al.,

2000). As resinas das flores estaminadas mostraram atividade antimicrobiana contra

S. aureus, B. subtilis, e C. albicans em ensaio de bioautografia, enquanto as resinas

florais pistiladas apresentaram atividade antimicrobiana contra S. aureus e B. subtilis

(PORTO et al.,2000).

Figura 4. Benzofenonas identificadas em Clusia grandiflora (OLIVEIRA, 1999;

LOKVAM et al., 2000).

17

Assim, a partir do levantamento bibliográfico, constata-se que a espécie

estudada pertence a uma família com grande potencial farmacológico e diferentes

classes de substância, sendo os terpenoides a classe mais abundante, o que

justifica o estudo de C. gradiflora.

3.2. Terpenoides em Clusia.

Os terpenoides ou terpenos formam uma diversificada classe de metabólitos

secundários de origem vegetal e são considerados como derivados do isopreno,

uma molécula com cinco átomos de carbono ou unidade C5 (MCNAUGHT &

WILKINSON, 1997). Os terpenoides se classificam em monoterpenos,

sesquiterpenos, diterpenos, sesterpenos, triterpenos e tetraterpenos, seguindo o

número de unidades isoprênicas que os formam. O uso ampliado dos terpenoides na

indústria e na medicina, desperta o interesse por novas substancias desta classe

(UGAZ, 1994).

Os terpenos, de modo resumido, são formados a partir da condensação de

uma unidade da acetoacetil-CoA com uma molécula da acetil-CoA, que após uma

hidrólise se reduz a mevalonato. O mevalonato é, então, convertido em pirofosfato

de isopentenila ou isopreno ativo. A polimerização do mevalonato vai originar

moléculas de cadeias carbonadas crescentes de cinco em cinco átomos de carbono.

O isopreno ativo e seu isômero formam o pirofosfato de geranila (monoterpeno) que

é responsável pela formação dos demais monoterpenos. Ligações cabeça-cauda

entre geranila e isopentenila geram sesqui- e diterpenos, ligação cauda-cauda entre

duas moléculas de pirofosfato de farnesila (sesquiterpeno) origina o esqualeno,

precursor da maioria dos triterpenos (Figura 5) (SIMÕES et al., 2007).

18

Figura 5. Esquema geral da biossíntese de terpenoides (SIMÕES et al., 2007).

Os terpenos fazem parte dos metabólitos especiais com maior ocorrência em

espécies de Clusia, sendo os sesquiterpenos os de maior ocorrência, seguido dos

triterpenos (VIRGINIO, 2015).

Os triterpenos são estruturas relativamente complexas, geralmente são

tetracíclicos e pentacíclicos e podem conter grupos hidroxilas, cetonas, aldeídos e

ácido carboxílicos (UGAZ, 1994), conforme mostra a Figura 6.

19

Figura 6. Exemplos de triterpenos (UGAZ, 1994).

Dentre os triterpenos identificados em Clusia destacam-se os pentacíclicos,

sendo de maior ocorrência o tipo friedelano (VIRGINIO, 2015).

Os triterpenos friedelano podem ser classificados em cinco grupos conforme

sua estrutura química: friedelanos “normais” (Tipo I), secofriedelanos (Tipo II),

norfriedelanos (Tipo III), dímeros de friedelanos (Tipo IV) e friedelanos rearranjados

(Tipo V). Essas substâncias são comumente encontradas nas famílias Celastraceae,

Hippocrateaceae, Euphorbiaceae, Flacourtiaceae e Clusiaceae. Algumas destas

substâncias têm sido utilizadas como protótipos farmacológicos nos estudos de

processos biológicos ou para o desenvolvimento de medicamentos (SHAN et al.,

2013). Dentre os friedelanos, a 3-oxo-fridelina (13) (Figura 7) foi o triterpeno com

maior ocorrência em espécies de Clusia (VIRGINIO, 2015) e já foi identificada

também em diferentes gêneros de Clusiaceae (SPINO et al., 1995; MARQUES et al.,

2000; MEDINA et al., 2004; AZEBAZE et al., 2009).

A substância 13 é um friedelano “normal” e possui diversos estudos

mostrando sua atividade anti-inflamatória por diminuir edemas induzidos em ratos

(SHAN et al., 2013; SHIMIZU & TOMOO, 1994), atividade antimicrobiana in vitro

sobre S. aureus, E. coli e também contra o fungo Aspergillus niger (SINGH &

DUBEY, 2001) e atividade citotóxica (ZHENG, 1994). Possui também ação

alelopática (SANTOS et al., 2008) e antiulcerogênica (QUEIROGA et al., 2000)

20

quando associada ao epi-friedelanol (14) (Figura 7) (SANTOS et al., 2008). Assim

como 13, 14 é um friedelano “normal” (SHAN et al., 2013) e estudos relatam que

este também possui ação anti-inflamatória (SUPUDOMPOL et al., 2005) e

antitumoral (KUNDU et al., 2000).

Figura 7. Estrutura química dos triterpenos 13 e 14 (SHAN et al., 2013).

A substância 13 foi identificada nas espécies C. nemorosa (FERREIRA et al.,

2015), C. burlemarxii (RIBEIRO et al., 2011), C. obdeltifolia (TEIXEIRA et al., 2006) e

C. schomburgkiana (MEDINA et al., 2004). O trabalho de Medina e colaboradores

(2004) explorou a composição de ceras epicuticulares para caracterizar espécies

mediante marcadores químicos, sendo 13, junto ao triterpeno taraxerol (15), os

marcadores em C. grandiflora.

Figura 8. Estrutura química do triterpeno 15.

4. MATERIAS E MÉTODOS

4.1. Levantamento bibliográfico

21

O levantamento bibliográfico da família Clusiaceae foi realizado entre os anos

de 2014 3 2015. Foi realizada a pesquisa sobre dados fitoquímicos, usos medicinais,

atividade biológicos de extratos, substâncias isoladas e triterpenos em bases de

dados on-line (Scopus, Web of Science e SciFinder).

4.2. Coleta da planta

Partes vegetativas e reprodutivas (raiz adventícia, ramo, folha e flor

masculina) de Clusia grandiflora foram coletadas no dia 04/12/2012 em área urbana

na Rua Zara no Bairro Jardim Botânico, Rio de Janeiro – RJ.

4.3. Identificação da planta

A espécie coletada foi identificada pela Profa. Adriana Quintella Lobão (UFF) e

um voucher encontra-se depositado no Herbário do Jardim Botânico do Rio de

Janeiro sob número de registro RB 603161.

4.4. Descrição anatômica

Para a descrição da organização celular, foram selecionados folhas e ramos

que foram fixados em álcool 70%. Foram retirados fragmentos da região mediana do

pecíolo e ramos, e da lâmina foliar na região da nervura principal, região intercostal

e bordo. O ramo e o pecíolo foram emblocados em polietilenoglicol (PEG) puro

(Proquímios), conforme proposto por Burger e Richter (1991) e lâmina foliar em

historesina (Leica), conforme metodologia do laboratório do Jardim Botânico.

Posteriormente, secções foram realizadas em micrótomo rotativo RMC

Products MT990 e coradas em Azul de Astra (Sigma-Aldrich) e Fucsina Básica

(Vetec), conforme indicado por Johansen (1940). As secções já coradas foram

dispostas em lâminas semi-permanentes (montadas com glicerina 50%) e

visualizadas e fotografadas em microscópio óptico Primo Star Zeis.

4.5. Testes histoquímicos

22

Para os testes histoquímicos foi utilizado material fresco proveniente do ramo

e folhas, que foram seccionados transversalmente à mão livre. As folhas foram

também emblocadas em historesina e seccionadas em micrótomo para observação

em reagentes fluoróforos.

O material foi tratado com diferentes reagentes para a detecção de

metabólitos secundários (Tabela 4), conforme metodologia proposta por Sant’Anna-

Santos et al. (2006) com modificações.

Tabela 4. Testes histoquímicos utilizados para caracterização em Clusia grandiflora.

Substância Reagente Referência

Substâncias lipofílicas Sudam III

Sudam IV

Auramina 0,05%

(JOHANSEN, 1940)

(JOHANSEN, 1940)

(CONSIDINE & KNOX, 1979)

Flavonoides Cloreto de alumínio (CHARRIÈRE-LADREIX, 1976)

Alcaloides Reagente de Wagner (FURR & MAHLBERG, 1981)

Taninos Vanilina Clorídrica (MACE & HOWELL, 1974)

Substâncias fenólicas Cloreto férrico (JOHANSEN, 1940)

Carboidratos: Amido

Celulose

Lugol

Calcoflúor

(JOHANSEN, 1940)

(HERTH & SCHNEPF, 1980)

As secções coradas foram dispostas em lâminas semi-permanentes

(montadas com glicerina 50%) e visualizadas e fotografadas em microscópio óptico.

As secções coradas com fluoróforos Auramina (Excitação 450-480

nanometros (mn)/ Emissão 515 nm) e Calcoflúor (Excitação 360-370 nm/ Emissão

420 nm) foram visualizadas e fotografadas em microscópio de fluorescência com

software LAS AF LITE (versão 2.6.0) (Leica Microsystems) com confocal de

varredura a laser Leica TCS SPE, acoplado a câmera CoolSnap anexado a um BX

Olympus 50.

Foram utilizadas lâminas com o material fresco sem o uso de reagentes como

controle.

4.6. Processamento do material botânico

23

As partes vegetativas e reprodutivas coletadas foram secas em estufa Solab

SL com circulação de ar forçada a 40ºC e, posteriormente, reduzidas a pequenos

fragmentos com o uso de um processador Tron.

4.7. Extração do material botânico

Raízes adventícias, ramos, folhas e a flores processados foram submetidos à

extração por maceração estática em hexano VETEC (a cada uma semana foi feita a

troca do solvente tendo um total de quatro semanas) e, posteriormente, em etanol

VETEC (a cada uma semana foi feita a troca do solvente tendo um total de cinco

semanas). O material extraído foi concentrado em evaporador rotatório Buchi R 114,

resultando na obtenção dos extratos brutos hexânicos e etanólicos. Para realização

dos estudos químicos e biológicos foi obtido autorização junto ao CGEN nº

010415/2013-0.

4.8. Atividade antioxidante

A avaliação da atividade antioxidante total (AAT) dos extratos brutos

etanólicos foram determinados pelo método do sequestro do radical livre DPPH (2,2-

difenil-1-picrilhidrazila) (Sigma-Aldrich), conforme metodologia proposta por Silva &

Paiva (2012).

O experimento consta de uma curva de calibração de diferentes

concentrações do DPPH, seguido das leituras da absorvância, feita em

espectrofotômetro UV-VIS Biospectro SP 220, de três ensaios independentes em

diferentes concentrações dos extratos e padrões BHT (Purifarma) e rutina (Sigma-

Aldrich), cada um em triplicata, com exceção para os extratos brutos de folhas e

flores, em que um dos ensaios foi realizado em duplicata. Como controle negativo foi

utilizado o radical DPPH.

O potencial antioxidante dos extratos foi avaliado através da comparação do

seu CE50 – concentração de amostra necessária para reduzir em 50% a

concentração inicial de DPPH - com dos padrões.

Foi observado, ainda, o comportamento cinético da reação dos extratos com o

radical DPPH por 30 minutos (min), através de uma curva dose-resposta relativa ao

decréscimo do percentual remanescente de DPPH em função do tempo.

24

As significâncias estatísticas das diferenças obtidas entre os ensaios para

uma mesma amostra e entre amostras diferentes foram avaliadas usando ANOVA

(análise de variância simples). Em caso de rejeição da hipótese nula por ANOVA,

entre amostras diferentes, foi aplicado o teste de Tukey-Kramer.

4.9. Dosagem de flavonoides

O teor de flavonoides totais expressos como flavonas e flavonóis foi

determinado nos extratos brutos etanólicos utilizando método colorimétrico

envolvendo reação com cloreto de alumínio, conforme metodologia descrita por Silva

& Paiva (2012).

O experimento consta de uma curva de calibração da rutina em diferentes

concentrações, onde foram adicionadas alíquotas etanol (VETEC), solução de

cloreto de alumínio 10% (Proquímios), acetato de potássio 1 M (VETEC) e água

destilada. A mistura reacional foi incubada à temperatura ambiente por 30 min. Após

esse período, as absorvâncias foram lidas em espectrofotômetro. Em seguida, foram

realizadas as leituras das absorvâncias dos extratos etanólicos em três ensaios

independentes, cada um em triplicata, com o mesmo procedimento aplicados às

soluções de rutina.

As significâncias estatísticas das diferenças obtidas entre os ensaios para

uma mesma amostra e entre amostras diferentes foram avaliadas usando ANOVA

(análise de variância simples). Em caso de rejeição da hipótese nula por ANOVA,

entre amostras diferentes, foi aplicado o teste de Tukey-Kramer. Para avaliar a

relação entre os teores de flavonoides e a atividade antioxidante dos extratos foi

empregado o teste de correlação de Pearson.

4.10. Atividade citotóxica

A avaliação citotóxica foi realizada em colaboração com o Laboratório de

Citogenética Humana do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do

Pará coordenado pela Profª. Drª. Raquel Carvalho Montenegro em colaboração com

a aluna de doutorado Laine Celestino.

O objetivo do teste foi verificar a toxidez in vitro dos extratos em linhagens de

células tumorais (HCT-116 = cólon humano, AGP-01 = ascite gástrica, MCF7 =

25

mama-humano) e uma linhagem de fibroblasto humano (MRC5 =fibroblasto humano)

através do teste com sal de tetrazóleo (MTT) [3-(4,5-dimetil-2-tiazol) -2,5-difenil-2-H-

brometo de tetrazóleo], seguindo metodologia proposta por Mosmann (1983), com

modificações.

Os extratos e as células já preparadas em meio adaptado para as linhagens

foram plaqueados e incubados por 72 horas (h), em seguida, foram centrifugadas. O

sobrenadante foi aspirado e adicionado a 100 μL de solução de MTT 0,5 mg/mL em

DMEM, a placa foi colocada em estufa a 5 % de CO2 por 3 h. As placas foram

novamente centrifugadas e o sobrenadante foi aspirado, o seu precipitado foi

ressuspenso em 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) e agitado por 10 min, até

completa dissolução dos cristais de formazan. As placas foram analisadas em

espectrofotômetro a um comprimento de onda de 570 nm. A doxorrubicina foi

utilizada como controle positivo. A partir deste ensaio, foi obtido o percentual de

inibição de cada extrato através da média±desvio-padrão no programa Excel, e os

mais ativos foram selecionados para a realização da curva concentração-resposta

(50μg/mL-0,312μg/mL) ao qual também foi obtido a média±desvio-padrão.

Foi verificada também a atividade hemolítica, plaqueando-se os eritrócitos

coletados de camundongos junto aos extratos em triplicata e na concentração de

200 μg/mL. As placas foram incubadas por 1 h sob agitação e, posteriormente,

centrifugadas. O sobrenadante foi transferido para outra placa e foi realizada a

leitura em espectrofotômetro no comprimento de onda de 450 nm. Triton X-100

(0,5%) e DMSO foram utilizados como controle positivo e negativo, respectivamente.

A concentração média capaz de provocar 50% do efeito máximo (CE50) e seu

respectivo intervalo de confiança (IC95) para cada amostra foi obtido a partir da

regressão não-linear no programa GraphPad Prism versão 5.0.

4.11. Atividade antimicrobiana

A avaliação antimicrobiana foi realizada em colaboração com o Laboratório de

Antibióticos, Bioquímica, Ensino e Modelagem Molecular do Instituto de Biologia da

Universidade Federal Fluminense coordenado pela Profª. Drª. Helena Carla Castro

em colaboração com a aluna Louise Azulay Palavecino.

O objetivo do teste foi identificar o perfil de sensibilidade de cepas

bacterianas (TSA) ATCC (American Type Culture Collection) gram-positivas

26

(Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, S. epidermidis e S. simulans) e

gram-negativas (Serratia marcescens, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae,

Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Klebisiella pneumoniae) frente aos

extratos brutos. As placas foram semeadas e, em seguida, os discos de

antimicrobiano foram depositados na sua superfície. Nos respectivos discos foram

adicionados 5 μL de cada extrato, de controle positivo e de controle negativo. Para

finalizar, as placas foram armazenadas na estufa a 35 °C e sua leitura foi realizada

entre 16 e 18 h após o teste. Os testes foram realizados em triplicata e os extratos

com ausência de cepas ao seu redor tiveram seus halos de inibição médios medidos

em milímetros. Os extratos com atividade no teste anterior foram submetidos ao

teste de concentração inibitório mínima (CIM), conforme metodologia proposta pelo

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) apenas para as cepas inibidas no

TSA. As placas foram semeadas e armazenadas a 35 °C por 16-20 h em incubador

em ar ambiente. O CIM foi realizado em triplicata e determinado a olho nu, através

da turbidez ou não dos poços presentes na placa, e em seguida, adicionou-se o

corante azul de resazurina (7-hidroxi-10-oxidofenoxazina-10-ium-3-ona) diluída em

água destilada estéril (0,1 mg/mL) em todos os poços.

4.12. Atividade acaricida

A avaliação acaricida foi realizada em colaboração com o Laboratório de

Metabolismo de Parasitos do Instituto de Biologia da Universidade Federal

Fluminense e coordenado pela Profª. Drª. Evelize Folly das Chagas.

O objetivo foi avaliar a atividade dos extratos brutos hexânicos no carrapato

bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus conforme metodologia descrita por

Drummond e colaboradores (1973), com modificação no tempo de imersão para 1

min. As fêmeas adultas (teleóginas) após a imersão nos extratos (5 mg/mL) diluídos

em 5 % de DMSO, 47,5 % de etanol e 47,5 % de água destilada, foram separadas

em grupos de 10, colocadas em placas de Petri, pesadas e incubadas. A

mortalidade das fêmeas foi avaliada, usando como parâmetro a movimentação dos

túbulos de Malpighi observada em estereomicroscópio. Os ensaios foram feitos em

duplicata utilizando como controle negativo 5 % de DMSO, 47,5 % de etanol e 47,5

% de água destilada.

27

Para avaliar o índice de ovopostura foram utilizados os dados dos pesos das

teleógenas vivas e dos ovos postos após 15 dias do tratamento, conforme

metodologia descrita por Ribeiro e colaboradores (2008).

Índice de postura (IPO) = peso dos ovos postos (g)

peso inicial das fêmeas (g)

% de inibição de postura = (IPO grupo controle – IPO grupo tratado) x 100

IPO grupo controle

Os dados foram analisados estatisticamente utilizando o software Graph Pad

Prism e a porcentagem de mortalidade das fêmeas foi calculada de acordo com a

fórmula de Abbot (1925).

4.13. Perfil cromatográfico dos extratos brutos

Os extratos brutos hexânicos e etanólicos das raízes adventícias, ramos,

folhas e flores foram analisados por diferentes técnicas para a investigação e

comparação quanto à presença de metabólitos secundários.

4.13.1. Perfil por cromatografia em camada delgada (CCD)

Foi preparada uma solução de 20 mg/mL dos extratos brutos, onde, com a

ajuda de um capilar graduado, uma alíquota de 15 µL foi aplicada em placas

cromatográficas de gel de sílica 60 F254 Merck. As placas preparadas foram eluídas

em diferentes gradientes de concentração de hexano (VETEC), acetato de etila

(VETEC) e metanol (VETEC) em ácido acético (VETEC). Todas as placas foram

reveladas em lâmpada de luz ultravioleta (UV) BOITTON em comprimentos de onda

254 e 365 nm, para identificação de cromóforos. Utilizaram-se também as soluções

de vanilina sulfúrica, DPPH, Dragendorff e 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNFH),

conforme metodologias descritas por Wagner & Bladt (1987) e Mensor e

colaboradores (2001), como reveladores químicos.

28

4.13.2. Perfil por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à detector

de arranjo de fotodiodo (CLAE-DAD)

As análises por CLAE-DAD foram realizadas em cromatógrafo ParkinElmer,

sistema Flexar SQ 300 MS, detector de arranjos diodo (DAD) e coluna Symmetry

Shield RP-18 (Waters), com temperatura de 25 ºC. Os extratos brutos hexânicos e

etanólicos foram preparados em tetraidrofurano (THF) (grau CLAE/UV VETEC) e

metanol (grau CLAE/UV VETEC), respectivamente, com concentração 5 mg/mL com

o auxílio do banho ultrassom UltraCleaner 1400 Unique e filtração.

Para análise dos extratos hexânicos foi utilizado sistema em gradiente que

consistiu de uma fase móvel: água Milli-Q (Millipore) (A) e acetonitrila (grau cLAE

VETEC) (B), ambos com 0,05% de ácido trifluoroacético (VETEC), com vazão de 0,8

mL/min, variando de 25% a 55% de B (0 – 15 min), 55% a 100% de B (15 – 18 min),

mantendo os 100% até 30 min. Entre as análises foi realizado o reequilíbrio da

coluna que consistiu de gradiente linear de 100% a 25% de B (0 – 5 min) seguido de

5 min com 25% de B.

Para análise dos extratos etanólicos foi utilizado sistema em gradiente que

consistiu de uma fase móvel: água (A) e acetonitrila (B), ambos com 0,05% de ácido

trifluoroacético, com vazão de 0,8 mL/min, variando de 10% a 45% de B (0 – 40

min), 45% a 100% de B (40 – 50 min), mantendo os 100% até 55 min. Entre as

análises foi realizado o reequilíbrio da coluna que consistiu de gradiente linear de

100% a 10% de B (0 – 10 min) seguido de 5 min com 10% de B.

Os cromatogramas foram analisados nos comprimentos de onda 220, 270,

335 e 360 nm para monitoramento.


Os extratos brutos hexânicos e etanólicos, preparados, em quantidade de 10

mg e dissolvidos em 600-700 µL de clorofórmio e metanol deuterado (Sigma-

Aldrich), respectivamente, foram enviados ao Laboratório Multiusuário de RMN da

Universidade Federal Fluminense (LaReNM-UFF) onde foram analisados por RMN

de 1H em equipamento Varian modelo VNMRS 300 MHz e 500 MHz.

29


massas (CG-EM)

Uma alíquota dos extratos brutos hexânicos foram enviados para Plataforma

de Metodologia Analítica de Farmanguinhos-FIOCRUZ. A análise foi realizada em

cromatógrafo com fase gasosa AGILENT modelo 6890N, acoplado a um detector de

massas modelo 5973N, utilizando coluna composta por 5% fenil e 95%

metilpolisiloxano modelo J&W 122-5532 DB-5ms e marca AGILENT (30 m x 0,25

mm, 0,25 µm de espessura), tendo hélio como gás de arraste com fluxo de 2 mL/min

e injeção de 1 μL da amostra. A temperatura do injetor foi de 300 ºC, detector a 280

ºC e a seguinte programação de temperatura: 150 ºC aumentando 10 ºC por minuto

até atingir os 300 ºC, mantendo-se em 300 ºC por 15 min. Os espectros de massa

obtidos na análise foram confrontados com o banco de dados Wiley.

4.14. Fracionamento do extrato bruto

O extrato bruto etanólico dos ramos de C. grandiflora foi fracionado por

cromatografia líquida à vácuo (CLV), conforme metodologia descrita por Coll &

Bowden (1986), com modificações. O sistema à vácuo foi montado, o funil

sinterizado foi preenchido com gel de sílica 5-25 µ (Merck) e o extrato foi aplicado na

forma de pastilha em celite 545 (Fluka). Foi utilizado gradiente de polaridade

crescente, utilizando-se hexano, diclorometano, acetato de etila, metanol e metanol:

água, obtendo as respectivas frações.

Os solventes foram removidos em evaporador rotatório. As frações obtidas

foram analisadas por CCD de acordo com o item 4.2.11.1.

4.15. Isolamento e purificação de substâncias

A fração dos ramos de C. grandiflora obtida em diclorometano foi

recromatografada em coluna com gel de sílica 60 (0.063 – 0.200 mm) (Merck)

utilizando como eluentes hexano, acetato de etila e metanol, em gradientes de

polaridades crescentes. As frações resultantes foram agrupadas após análise por

CCD, utilizando lâmpada de luz UV e vanilina sulfúrica como reveladores.

30

As frações reveladas anteriormente, quando oportunas foram recristalizadas

em acetato de etila e etanol, visando a obtenção de substâncias puras. Os cristais

tiveram seu ponto de fusão (PF) aferidos em Fisher – Johns.

4.16. Elucidação estrutural de substâncias

As substâncias obtidas foram enviadas para Plataforma de Metodologia

Analítica de Farmanguinhos-FIOCRUZ para análise por CG/EM e para o Laboratório

Multiusuário de RMN da Universidade Federal Fluminense (LaReNM-UFF) onde

foram analisados por RMN 1H.

5. RESULTADOS E DISCUSSÂO

5.1. Descrição anatômica

A utilização da anatomia na sistemática é útil tanto para a identificação prática

quanto para a caracterização das relações filogenéticas entre as plantas (JUDD et

al., 1999), especialmente quando associados aos aspectos ecológicos e

comparativos (METCALFE & CHALK, 1983), além de serem o primeiro passo de

identificação de uma espécie vegetal no controle de qualidade (DUARTE &

MENARIM, 2006).

A distinção morfológica do gênero é baseada, principalmente, em materiais

vegetativos e frutos (PIPOLY et al., 1998). Em C. grandiflora foram descritas as

características morfológicas dos ramos e folhas.

O pecíolo de C. grandiflora em corte transversal da região mediana,

apresentou epiderme unisseriada e cutícula espessa que formavam flanges cobrindo

toda a epiderme (Figura 9A). Subjacente à epiderme, observou-se de 10-12

camadas de colênquima anelar com estruturas secretoras em abundância (Figura

9A e 9B). Nas camadas mais internas do córtex, posterior ao colênquima,

apresentaram-se células de parênquima fundamental com paredes delgadas e

tamanhos variados e presença de cavidades secretoras e idioblastos com drusas

(Figura 9B). O sistema vascular do pecíolo apresentou formato de arco aberto com

as extremidades fletidas para o interior (Figura 9C), sendo os feixes do tipo colateral.

Verificou-se ainda presença de feixes acessórios na região do parênquima

31

fundamental cortical (Figura 9B). O sistema vascular descrito, já foi mencionado por

Paula (1976) em Clusia aff. macropoda, porém os feixes acessórios estavam

ausentes. No xilema, os elementos de proto e metaxilema estavam dispostos em

séries radiais (Figura 9D). Na região correspondente à medula, ocorreram células

parenquimáticas de tamanhos variados (Figura 9C).

Observou-se um mesofilo, em plano transversal (Figura 9E – 9G), isobilateral,

hipostomático e epiderme unisseriada, coberta por cutícula espessa que penetrou

entre as paredes, formando flanges cuticulares. Abaixo da epiderme, observou-se a

presença de uma hipoderme com cerca de duas camadas de células elípticas de

tamanho variado na face adaxial e uma camada na fase abaxial. A hipoderme é

comum no gênero Clusia (METCALFE & CHALK, 1950) e já foi descrita em Clusia

aff. macropoda (PAULA, 1976), Clusia hilariana (SILVA et al., 2005), Clusia

spiritu'sanctensis (SCHNEIDER, 1985) e Clusia criuva (FERNANDES, 2007). Para

Esau (1974), a hipoderme é uma camada subepidérmica e funciona como um tecido

armazenador de água, estando presente principalmente em xerófitas. O parênquima

paliçádico apresentou-se em duas camadas de células de tamanho variado próximo

à face adaxial e uma camada próximo à face abaxial. O parênquima lacunoso

possuiu espaços intercelulares grandes e abundantes, como descrito para outras

espécies (FERNANDES, 2007), com 10-12 camadas de células de tamanho variado,

onde foram encontradas cavidades secretoras e idioblastos com drusas. A

vascularização foi feita por diversos feixes recobertos por fibras presentes no

parênquima lacunoso próximo à face adaxial.

No plano transversal da lâmina foliar em nível da nervura principal (Figura 10)

observou-se uma epiderme unisseriada, com cutícula espessa que circundou a

célula epidérmica (Figura 10B e 10C). Subjacente à epiderme, estiveram presentes

células colenquimáticas com presença de diversas cavidades secretoras e

idioblastos com drusas, seguido de parênquima fundamental cujas células

aumentavam de tamanho em direção à medula (Figura 10A, 10D e 10E). O sistema

vascular foi formado por cerca de 30 feixes colaterais em forma circular, diferente do

pecíolo. Grupos de fibras perivasculares ocorreram junto ao tecido floemático em

toda a extensão do sistema vascular (Figura 10A e 10F). Inseridos na medula

parenquimática, observou-se de 9-10 feixes acessórios dispostos em duas faixas.

Esse sistema vascular já foi descrito na nervura e no pecíolo de Clusia obdeltifolia

(SILVA et al., 2014).

32

O bordo foliar (Figura 11A – 11C) apresentou uma epiderme unisseriada com

células alongadas, com cutícula bastante espessa que, não só formaram flanges,

como circundou toda a célula epidérmica (Figura 11A). As camadas subjacentes à

epiderme foram ocupadas por células do parênquima fundamental com a presença

de cavidades secretoras e vascularização composta por um único feixe, com xilema

voltado para a face adaxial e floema para a face abaxial, com fibras perivasculares

que os circulava (Figura 11A, 11B e 11C).

Algumas características mencionadas para lâmina foliar, como cutícula

espessa, estômatos restritos à face abaxial, inúmeras cavidades secretoras e

idioblastos com drusas foram consideradas características comuns em Clusiaceae,

segundo Stevens (2007) e Metcalfe & Chalk (1950).

A cutícula espessa formando flanges descrita anteriormente já foi observada

em Clusia hilariana (SILVA et al., 2005; ROCHA et al., 2014), Clusia obdeltifolia

(SILVA et al., 2014) e Clusia lanceolata (GUIMARÃES et al., 2013).

A presença de diversos canais esquizógenos na lâmina foliar de C. grandiflora

foi observada. Paula (1976) observou em Clusia aff. macropoda a presença de

canais de origem esquizógena e esquizolisigena, porém Paula (1966) relatou a

origem dos canais em C. grandiflora como esquizógena, corroborando com o obtido

neste trabalho. Porém, ainda há necessidade de estudos de ontogênese para as

estruturas secretoras encontradas.

Paula (1966) relata ainda nas folhas a ocorrência de esclereídeos em C.

grandiflora, sendo neste trabalho não definido quais tipos de fibra presente próximo

ao sistema vascular.

O ramo (Figuras 11D, 11E e 11F) possuiu tecidos primários ainda instalados e

início do crescimento secundário. Observou-se epiderme uniestratificada, com

células de formato irregular recobertas por cutícula espessa (Figura 11D). O córtex

foi formado por camadas de células parenquimáticas, de diâmetros variados (Figura

11D). Na região vascular houve floema e xilema secundário, seguido de medula.

Solereder (1908) citou aspectos anatômicos do caule comuns a família, como raios

medulares estreitos. A medula foi formada exclusivamente por células

parenquimáticas, que aumentaram de calibre conforme se aproximam do centro

(Figura 11F). Características como a presença de epiderme em estrutura com

crescimento secundário também já foi observado em Clusia aff. Macropoda (PAULA,

1976).

33

Figura 9. Pecíolo e mesofilo de C. grandiflora em cortes transversais. A) Pecíolo

com presença de epiderme revetida por cutícula e colênquima com estruturas

secretoras (seta). B) Pecíolo com presença do colênquima, parênquima fundamental

com presença de idioblastos com drusas (seta vermelha), cavidades secretoras

(seta preta) e feixes colaterais acessórios (chave). C) Visão geral do sistema

vascular com células parenquimáticas do pecíolo. D) Feixe vascular colateral. E)

Visão geral do mesofilo com presença de epiderme, hipoderme, parênquima

paliçádico e parênquima lacunoso com feixe vascular, idioblastos com drusas (seta

vermelha) e estruturas secretoras (seta preta). F) Visão dos estômatos presentes na

34

face abaxial do mesofilo.co: colênquima, cu: cutícula, ep: epiderme, fl: floema, fva:

feixe vascular acessório, fv: feixe vascular, hi: hipoderme, pf: parênquima

fundamental; pa: células parenquimáticas, xi: xilema. pl: parênquima lacunoso, pp:

parênquima paliçádico.

Figura 10. Nervura principal de C. grandiflora em cortes transversais. A) Visão geral

da nervura principal destacando o colênquima, o sistema vascular (chave) com

fibras (seta) e os feixes vasculares anexos (chave). B e C) Face adaxial e abaxial,

respectivamente, mostrando a cutícula, epiderme e colênquima. D) Idioblasto com

drusa presente no colênquima - seta. E) Estrutura secretora presente no colênquima

- seta. F) Detalhe de feixes vasculares. co: colênquima, cu: cutícula, ep: epiderme, fi:

fibras, fl: floema, fva: feixe vascular acessório, sv: sistema vascular, xi: xilema.

35

Figura 11. Bordo e ramo de C. grandiflora em cortes transversais. A) Detalhe do

bordo evidenciando a cutícula, epiderme e parênquima fundamental. B) Estruturas

secretoras no parênquima fundamental do bordo (seta). C) Visão do feixe vascular

do bordo. D) Visão da epiderme do ramo. E) Região de fibras próximos ao tecido

vascular do ramo. F) Região vascular e medula do ramo. ep: epiderme, cu: cutícula,

fi: fibras, fl: floema, me: medula, pf: parênquima fundamental, pc: parênquima

cortical, rv: região vascular, xi: xilema.

36

5.2. Teste histoquímico

A histoquímica tem como objectivo localizar in situ, os principais grupos

químicos que ocorrem nos tecidos. Os testes histoquímicos são aplicados em

estudos de caracterização de plantas que apresentem metabólitos primários e/ou

secundários. Além destes estudos, os testes podem ser incorporados em futuro

controle de qualidade (LEITE, 2009).

Para identificar a possível presença de determinadas classes de substâncias

na folha e ramo de C. grandiflora, essas partes vegetativas foram submetidos à

diferentes reagentes.

Os alcalóides podem se acumular em células epidérmicas e a reação positiva

para o reagente de Wagner se deu devido a precipitação do metabólito em presença

de halogênios, corando em vermelho a castanho-avermelhado (Figura 12A)

(FIGUEIREDO et al., 2007). Em C. grandiflora a presença da substância se deu na

epiderme e no feixe vascular de toda lâmina foliar e no pecíolo, porém não foram

encontrados na literatura tal metabólito secundário para o gênero.

A presença de carboidratos, metabólito primário essencial para sobrevivência

da planta, se deu devido a presença de dois tipos de polissacarídeos, o estrutural

(celulose) e de reserva (amido) (FIGUEIREDO et al., 2007). Para detecção de amido

foi utilizado o lugol, ao qual é constituído por iodeto de potássio que se acumula na

molécula de amido gerando coloração marrom, roxo ou negro (Figura 12B)

(FIGUEIREDO et al., 2007). Este metabólito foi encontrado em todas as partes da

folha, pecíolo e ramo, principalmente no parênquima cortical e medular do pecíolo e

da nervura principal, próximo ao cilindro vascular; no parênquima lacunoso da região

intercostal e parênquima cortical do ramo. Essa substância que está bastante

presente na espécie (ESAU, 1974). Para detecção de celulose foi utilizado o

calcoflúor, um fluoróforo que quando irradiado com luz UV o complexo formado

fluoresce intensamente de azul (FIGUEIREDO et al., 2007), sua presença foi

sugerida apenas na epiderme do mesofilo (FIGURA 12C).

Substâncias lipídicas e seus derivados são corados por um processo

puramente físico, isto é, afinidade do reagente pelo metabólito primário

(FIGUEIREDO et al., 2007). Para tal detecção foram utilizados sudan III, sudan IV e

auramina. Os sudans coraram em alaranjado (Figura 12D e 12E) (FIGUEIREDO et

al., 2007) e, em C. gradiflora, foram evidenciados, principalmente, nas cutículas

37

presente em toda lâmina foliar e ramo e em idioblastos presentes nos parênquimas

corticais e medulares da nervura principal, no parênquima cortical do pecíolo, no

parênquima fundamental do bordo e no parênquima cortical do ramo. Já o fluoróforo

auramina quando irradiado com luz UV o complexo formado fluoresce em

esverdeado (Figura 12F) e, em C. gradiflora foi onservado, principalmente, na

cutícula presente em toda lâmina foliar.

Substâncias fenólicas foram detectadas pela reação com cloreto férrico que

se complexaram formando precipitados cuja coloração puderam variar do verde

intenso, púrpura, azul a negro (Figura 12G) (FIGUEIREDO et al., 2007). Este tipo de

substância está amplamente distribuído no reino vegetal e compreende cumarinas,

xantonas, flavonoides, entre outras (CARVALHO et al., 1999), sendo muitas delas

encontradas em Clusiaceae e Clusia. Em C. gradiflora foram encontrados no

parênquima paliçádico da região intercostal, no parênquima fundamental do bordo,

sistema vascular do pecíolo e a região cortical do ramo.

Uma das classes de subtâncias fenólicas são os taninos. Para detecção

dessas substâncias utilizou-se vanilina clorídrica que formam um produto de

condensação resultante da reação dos grupos aldeídicos da vanilina com os fenóis,

resultando em uma coloração vermelho alaranjado (Figura 12H) (FIGUEIREDO et

al., 2007). Em C. gradiflora foram idenficados em tecidos parenquimáticos da

nervura principal e epiderme do ramo. Esta classe de substância tem atuação na

defesa contra insetos, fungos e bactérias (SANTOS & MELLO, 1999) e já foram

descritos por Fernandes (2007) em Clusia criuva.

Por fim, para detecção de outra classe de substâncias fenólicas, foi utilizado

cloreto de alumínio que se complexa com flavonóides (flavonas) com grupos

hidroxilo livres em 3' ou 5', corando em amarelo sob luz UV (Figura 12I).

(FIGUEIREDO et al., 2007). Em C. grandiflora, esta metodologia não foi a mais

promissora, sendo detectado com pouca clareza apenas no sistema vascular do

pecíolo, porém, já foram identificados flavonoides em espécies de Clusia.

A Tabela 5 evidencia as classes químicas encontradas em diferentes partes

da planta.

38

Figura 12. Testes histoquímicos da lâmina foliar e ramos de C. grandiflora. A)

Epiderme e feixe vascular corados com ragente de Wagner no bordo foliar sugerindo

presença de alcaloides. B) Parênquima medular da nervura principal, próximo ao

cilindro vascular, corado com lugol (seta) indicando a presença de amido. C)

Mesofilo envidenciando a presença de celulose na epiderme corado com calcofluor.

D) Cutícula do pecíolo corada com Sudam IV indicando a presença de lipídios. E)

Idioblastos no parênquima cortical do ramo corado com Sudam III indicando a

presença de liídeos F) Bordo foliar evidenciando a presença de lipídeos quando

corados com auramina. G) Parênquima paliçádico da região intercostal corado com

cloreto férrico, evidencia a presença de substâncias fenólicas, comum ao gênero. H)

Idioblasto presentes na nervura corado com vanilina clorídrica evidenciando a

presença de taninos, já descrito em outras espécies de Clusia. I) Possível resultado

positivo para flavonoides, classe descrita em outras espécies de Clusia, devido a

coloração amarelada quando em presença de cloreto de alumínio nas células

39

presente no pecíolo. ep: epiderme, cu: cutícula, fv: feixe vascular, pf: parênquima

fundamental, pp: parênquima paliçádico.

Tabela 5. Localização das classes químicas detectadas na lâmina foliar e no ramo

de C. grandiflora utilizando teste histoquímico.

Classe

química

Reagente Pecíolo Bordo Mesofilo Nervura Ramo

Substâncias

lipofílicas

Sudam III + + + + +

Sudam IV + + + + +

Auramina + + + + n

Flavonoides Cloreto de

alumínio

+ - - - -

Alcaloides Reagente de

Wagner

+ + + + -

Taninos Vanilina

Clorídrica

- - - + +

Substâncias

fenólicas

Cloreto

férrico

+ + + - +

Carboidratos:

Amido

Calulose

Lugol

+

+

+

+

+

Calcofluor - - + - n

Legenda: + presença, - ausência, n: não realizado teste para parte vegetatitva

5.3. Processamento e extração do material botânico

As raízes adventícias, os ramos, as folhas e as flores de C. grandiflora foram

coletadas, adequadamente processadas e submetidas à extração sucessivas com

hexano e etanol. A Tabela 6 apresenta os rendimentos extrativos obtidos.

Tabela 6. Rendimentos extrativos obtidos de C. grandiflora.

Parte da

planta

Peso

seco (g)

Solvente (mL) Peso do

extrato (g)

Rendimento

(%)

Código

Flores 31,60 Hexano (100) 0,41 1,30 CGFH

40

Etanol (100) 2,49 7,88 CGFEt

Raízes

adventícias

45,58 Hexano (100) 1,34 2,93 CGRAH

Etanol (100) 2,16 4,74 CGRAEt

Ramos 887,10 Hexano (1000) 7,41 0,84 CGRH

Etanol (1000) 26,69 3,00 CGREt

Folhas 1126,95 Hexano (1500) 25,15 2,23 CGFoH

Etanol (1500) 51,28 4,55 CGFoEt

Os melhores rendimentos foram obtidos nas partes vegetativas e reprodutivas

extraídos com etanol, tendo o extrato etanólico das flores (CGFEt) o melhor

rendimento, 7,88%.

5.4. Atividade antioxidante

Nas últimas décadas vem sendo observado um aumento importante no

conhecimento acerca de substâncias antioxidantes, particularmente aquelas

capazes de prevenir efeitos deletérios dos radicais livres no corpo humano e

prevenir a deterioração de alimentos. Nos dois casos, há uma preferência por

antioxidantes de origem natural àqueles oriundos de fontes sintéticas, já que estes

últimos são bastante voláteis e decompõem-se facilmente em temperaturas

elevadas, além de apresentarem problemas relacionados à toxidez (ABDALLA,

1999).

Para determinar o potencial antioxidante da espécie, os extratos foram

avaliados quanto a sua capacidade de sequestro radical livre DPPH (2,2-difenil-1-

picrilhidrazila), um método colorimétrico que, apesar de não representar condições

semelhantes aos processos que ocorrem in vivo, representa uma forma rápida e

simples para caracterizar a presença de substâncias com propriedades

antioxidantes em extratos vegetais brutos, afim de que estes se tornem alvo de

ensaios bioguiados com a finalidade de isolamento de tais substâncias (SILVA &

PAIVA, 2012).

O DPPH é um radical livre estável que, em solução, apresenta coloração

violeta, e quando inserido em um meio onde existem substâncias com propriedades

antioxidantes é reduzido, refletindo em uma mudança na sua coloração, que passa a

41

amarelo, com consequente diminuição da absorvância na faixa de 518 nm,

absorvância máxima da cor violeta (Figura 13) (DA SILVA, 2015).

Figura 13. Estrutura do DPPH antes e depois da reação com um agente

antioxidante (A-H) (RUFINO et al., 2009).

Inicialmente, a curva analítica do DPPH e dos padrões BHT e rutina foram

obtidas por regressão linear e resultaram em um bom coeficiente angular (r2 > 0,90).

As curvas para avaliação da atividade dos extratos foram obtidas por regressão

linear dos ensaios e mostraram um bom coeficiente de determinação (r2 > 0,80). A

Tabela 7 mostra os valores de CE50, concentração de extrato necessária para reduzir

em 50% a concentração inicial de DPPH, encontrados. O tratamento estatístico dos

dados realizados por ANOVA não mostrou diferença significativa entre os três

ensaios independentes para mesma amostra (p ≥ 0,05), exceto para o extrato bruto

dos ramos (p = 0.0139).

Tabela 7. Valores do CE50 dos padrões e dos extratos etanólicos de C. grandiflora.

Padrões/ Código das amostras CE50 (g amostra/g DPPH)

Rutina 0,58±0,03

BHT 0,75±0,12a

Raízes Adventícias 1,79±0,36a

Folhas 2,49±0,25b

Flores 2,64±0,52b

42

Ramos 3,46±0,30c

Legenda: a sem diferença significativa entre as amostras por Tukey-Kramer b um dos ensaios independente foi feito em duplicata c diferença significativa entre os três ensaios independentes por ANOVA

A avaliação do grau de significância das diferenças entre os valores de CE50

obtidos para cada extrato também foi efetuada por ANOVA, que considerou a

diferença significativa. Como o resultado da análise de variância levou à rejeição da

hipótese nula, ou seja, a afirmação de que todos os valores de CE50 são iguais, foi

realizado testes de comparações múltiplas que permitem identificar essas

diferenças. Para esta análise, foi escolhido o teste de Tukey-Kramer, que compara

contrastes de variância e discrimina de forma mais clara as comparações, dando

maior embasamento estatístico às análises (DA SILVA, 2015).

A Tabela 7 mostra que todos os extratos apresentaram valores de CE50

maiores que o encontrado para os padrões. No entanto, o teste de estatístico de

Tukey-Kramer sugere que há diferença significativa entre os valores de CE50 dos

padrões e dos extratos analisados, exceto quando o BHT é comparado com o

extrato das raízes adventícias.

Os extratos quando comparados aos padrões apresentaram maior CE50,

entretanto, cabe lembrar que tratam-se de extratos brutos constituídos de diversas

substâncias em menores quantidades, enquanto os padrões são substâncias puras

(SILVA & PAIVA, 2012).

Os extratos etanólicos brutos apresentam desde substâncias ligeiramente

apolares até polares, como as substâncias fenólicas. Essas substâncias podem ser

encontradas em todas as partes da planta e estão disponíveis como ácidos

fenólicos, flavonoides, lignanas, estilbenos, cumarinas e taninos (POMPILHO et al.,

2014). Os baixos valores de CE50 dos extratos analisados podem estar relacionados

com a presença dessas substâncias, tendo o extrato das raízes adventícias o menor

valor de CE50 (1,79±0,36 g amostra/ g DPPH), conferindo-lhe melhor atividade e

maior proximidade com o padrão BHT, enquanto o extrato dos ramos apresentou o

maior CE50 (3,46±0,30 g amostra/ g DPPH).

O valor de CE50 isolado nem sempre é o melhor parâmetro para avaliar a

atividade antioxidante de uma amostra, pois não leva em consideração o fato de que

43

a amostra em questão pode apresentar perfis reacionais diferentes em

concentrações diferentes (DA SILVA, 2015).

Do ponto de vista cinético, os extratos obtiveram, na maior parte das

concentrações analisadas, cinética rápida, ou seja, foi atingido o estado de equilíbrio

em menos de 5 minutos, já nas concentrações de 50 e 125 μg/mL a cinética foi

considerada intermediária, uma vez que o equilíbrio foi atingido no intervalo de 5 a

30 minutos (BRAND-WILLIAMS et al., 1995). A cinética reacional da rutina se

assemelha ao observado com os extratos, porém, a cinética foi intermediária na

concentração de 25 μg/mL. Já o BHT apresentou cinética intermediária em todas

concentrações. As Figuras 14-19 apresentam as cinéticas reacionais observadas

para os extratos e padrões, em cada concentração ao longo de 30 minutos.

Figura 14. Cinética reacional do BHT com DPPH.

44

Figura 15. Cinética reacional da rutina com DPPH.

Figura 16. Cinética reacional das raízes adventícias com DPPH.

45

Figura 17. Cinética reacional dos ramos com DPPH.

Figura 18. Cinética reacional das folhas com DPPH.

46

Figura 19. Cinética reacional das flores com DPPH.

Todos os extratos apresentaram atividade antioxidante máxima após 30

minutos de reação, nas maiores concentrações analisadas, com aproximadamente 5

% de DPPH remanescente, ou seja, com aproximadamente 95 % de atividade, o

mesmo é observado com os padrões. Tal similaridade aos padrões demonstra o

potencial antioxidante de substâncias presentes em C. grandiflora.

Quando comparada com outras espécies do gênero, C. grandiflora

demonstrou melhor atividade para os extratos das folhas, das flores e das raízes

adventícias que os extratos metanólicos e acetônicos das folhas, frutos e caules de

Clusia fluminensis (SILVA & PAIVA, 2012). Comparando o extrato das raízes

adventícias desta espécie com os extratos metanólicos das folhas de Clusia

lanceolata (FERREIRA et al., 2014), C grandiflora apresentou também melhor

atividade.

A atividade antioxidante pode estar relacionada à presença de substâncias

fenólicas, como os flavonoides, como observado nos testes histoquímicos. Esta

classe de metabólitos já foi identificada anteriormente no gênero Clusia, podendo ser

essas substâncias as responsáveis pela atividade na espécie C. grandiflora

(FERREIRA et al., 2014; OLIVEIRA et al., 2012; BITTAR et al., 2000).

5.5. Doseamento de flavonoides

47

Para identificar as possíveis substâncias responsáveis pelo efeito antioxidante

foi feito o doseamento de flavonoides expressos por flavonas e flavonóis. O princípio

desse método consiste na formação de complexos ácidos estáveis entre o cloreto de

alumínio e a carbonila em C-4 e a hidroxila em C-5 do anel A e entre as hidroxilas

em C-3 e C-4 do anel B em flavonóis e flavonas (Figura 20) (CHANG et al., 2002). A

presença de insaturação entre o C-2 e C-3 no anel C de flavonoides fornece um

máximo de absorção do complexo na faixa de 415-440 nm (CHANG et al., 2002).

Figura 20. Esquema da complexação do cloreto de alumínio com flavonoides

(MABRY et al. 1970).

A curva padrão obtida por regressão linear da rutina para a análise da dos

extratos brutos etanólicos resultou em um coeficiente angular r2 > 0,90. O tratamento

estatístico dos dados mostrou que as diferenças entre os três experimentos

independentes realizados para cada extrato não foram estatisticamente significativas

(p ≥ 0,05). Os resultados obtidos no doseamento de flavonoides podem ser

visualizados na Tabela 8.

Tabela 8. Teor de flavonoides, expressos em flavonas e flavonóis, obtidos para os

extratos etanólicos de C. grandiflora.

Código das amostras Teor de flavonoides (%)

Flores 1,57±0,00ª

Ramos 1,56±0,00ª

48

Raízes adventícias 1,56±0,00b

Folhas 1,56±0,00b

Legenda: a, b sem diferença significativa entre os extratos por Tukey-Kramer

A avaliação do grau de significância das diferenças entre os valores do teor

de flavonoides obtidos para cada extrato também foi efetuada por ANOVA que

considerou a diferença significativa. O teste de Tukey-Kramer também sugere essa

diferença, exceto quando comparado o extrato das flores com dos ramos e extrato

das raízes adventícias com das folhas.

Todos os extratos avaliados apresentaram baixos teores de flavonas e

flavonóis quando comparados a dados de outras espécies como, C. fluminensis

(SILVA & PAIVA, 2012) e C. lanceolata (FERREIRA et al., 2014). O maior teor foi

observado na amostra das flores (1,57±0,00%) e o menor valor foi obtido para a

amostra das folhas (1,56±0,00%), sugerindo que o potencial antioxidante pode não

estar relacionado a essas substâncias ou que estas não são as únicas responsáveis,

uma vez que estudos mostram que a formação de complexos do cloreto de alumínio

com flavonoides que não possuem essa insaturação resulta em uma absorvância

muito baixa na faixa de comprimento de onda utilizado (CHANG et al., 2002). Além

disso em Clusia identificou-se maior presença de flavonas e bisflavonoides que de

flavonóis (VIRGINIO, 2015). A presença de outros esqueletos flavonoídicos

diferentes pode justificar a alta atividade antioxidante observada ao lado do baixo

teor de flavonoides expressos como flavonas e flavonóis.

Para se saber se o teor de flavona e flavonol possui ou não correlação com a

atividade antioxidante, foi realizado o teste de Correlação de Pearson. Este teste é

uma ferramenta estatística que fornece um coeficiente definido pela medida de

associação linear entre variáveis. Os valores de Correlação de Pearson podem estar

situados entre -1 e +1, onde o número 1 indicaria uma correlação linear perfeita e o

sinal indicaria se essa correlação é negativa ou positiva, respectivamente (FILHO &

JÚNIOR, 2009). São classificados ainda como relação fraca quando os valores

estão entre 0,10 e 0,29; correlação moderada quando os valores estão entre 0,30 e

0,49 e correlação forte quando os valores estão 0,50 e 1 (COHEN, 1988).

Os resultados obtidos forneceram uma correlação positiva moderada (+0,48)

entre os valores de CE50 dos extratos e o percentual de flavonoides. Isto indica uma

49

tendência moderada de que o valor de CE50 aumenta conforme o aumento do teor

de flavonoides. A Figura 21 apresenta os resultados de Correlação de Pearson entre

o percentual de flavonoides e os valores de CE50, o que sugere a participação de

outras substâncias corroborando o efeito observado.

Figura 21. Correlação de Pearson (r2 = 0,2276) entre os valores de CE50 dos

extratos de C. grandiflora e o percentual de flavonoides.

5.6. Atividade citotóxica

Para desenvolvimento de um fármaco a toxidez pode fazer de moléculas

promissoras uma molécula descartada, já que sua segurança é um dos parâmetros

mais importantes (FLINT et al., 2000). O equilíbrio entre o efeito farmacológico e

toxicológico é sempre verificado quando se busca aplicabilidade como agente

terapêutico (MELO et al., 2000). Entretanto, para células neoplásicas o ideal é que o

fármaco seja tóxico apenas para células tumorais e não para as sadias. Por isso, o

estudo da toxidez se faz importante.

Um avanço na pesquisa de produtos naturais no campo da oncologia vem

ocorrendo desde o início do século XX. A maioria dos fármacos antitumoral, 60 %,

tem sua origem nos produtos naturais, dentre eles a vimblastina, vincristina,

vindesina, vinorelbina, paclitaxel, docetaxel, podofilotoxina, etoposídeo, teniposídeo,

camptotecina, topotecano e irinotecano (LOTUFO et al., 2010).

50

As substâncias de origem vegetal mostram ser boas perspectivas como

anticancerígeno por possuir diversidade química e potencial ilimitado para

modificação racional (DIAZ-CARBALLO et al., 2008).

A análise da toxidez e pelo método do MTT vem sendo utilizada no programa

de screening do National Cancer Institute (NCI) nos Estados Unidos, que testa mais

de 10.000 amostras a cada ano (SKEHAN et al., 1990). É um método rápido,

sensível e barato que tem a capacidade de analisar o estado metabólico da célula.

Consiste em uma análise colorimétrica baseada na clivagem do sal de tetrazóleo

(amarelo) para cristais de formazan (azul/púrpura), a partir de substratos de enzimas

microssomais e mitocondriais presentes somente nas células metabolicamente

ativas.

O estudo citotóxico pelo método do MTT permite definir facilmente a toxidez,

mas não o mecanismo de ação (BERRIDGE et al., 1996). Assim, o ensaio de

hemólise sugere se o mecanismo do extrato ou substância estudada pode ser

através da lise de membrana celular pelo fato da morte celular ser observada pela

presença de necrose.

A verificação da citoxicidade in vitro dos extratos brutos frente às células

tumorais HCT-116 (cólon humano), AGP-01 (ascite gástrica), MCF7 (mama-humano)

e MRC5 (fibroblasto humano) através do ensaio com MTT, assim como a atividade

hemolítica estão apresentados na Tabela 9, onde os valores da concentração

inibitória média do crescimento celular (Cl50) estão em μg/mL para os extratos e em

μM para doxorrubicina.

Tabela 9. Valores da concentração do CI50 dos extratos brutos obtidos de C.

grandiflora.

Código das

amostras

Cl50*

MCF7 AGP-01 HCT-116 MRC5 Hemólise

CGFH >50 >50 >50 >50 >200

CGFEt >50 >50 >50 >50 >200

CGRAH >50 >50 >50 >50 >200

CGRAEt >50 >50 >50 >50 >200

CGRH >50 >50 >50 >50 >200

51

CGREt >50 >50 24,30(18,54–31,84)

>50 >200

CGFoH >50 >50 >50 >50 >200

CGFoEt >50 44,15(34,79

– 56,02)

>50 >50 >200

Doxorrubicina 0,95 (0,73 – 1,24)

0,25(0,19-0,33)

0,1 (0,047-0,28)

0,2 (0,16-0,25)

>200

Legenda: * os valores das concentrações estão em µg/mL para os extratos e em µM

para dexorrubicina.

CGFH: extrato hexânico das flores de C. grandiflora; CGFEt: extrato etanólico das

flores de C. grandiflora; CGRAH: extrato hexânico das raízes adventícias de C.

grandiflora; CGRAEt: extrato etanólico das raízes adventícias de C. grandiflora;

CGRH: extrato hexânico dos ramos de C. grandiflora; CGREt: extrato etanólico dos

ramos de C. grandiflora; CGFoH: extrato hexânico das folhas de C. grandiflora;

CGFoEt: extrato etanólico das folhas de C. grandiflora.

Das amostras testadas as mais promissoras foram as extraídas em etanol. O

CGREt apresentou um bom resultado inibitório na linhagem HCT-116 com a CI50

24,3 μg/mL e o CGFoEt na linhagem AGP-01 com a CI50 de 44,2 μg/mL. Ressalta-se

que os extratos foram ativos apenas na linhagem tumoral e não inibiram o

crescimento da linhagem normal nas concentrações testadas. Segundo protocolo do

NCI (ALLEY et al., 1988), valores de CI50 ≤ 30 µg/mL devem ser considerados

interessantes para extratos brutos de origem vegetal, enquadrando-se CGREt.

O estudo realizado para a determinação de atividade hemolítica em células de

camundongos indicou que nenhuma das amostras testadas provocou lise na

membrana plasmática das células na maior concentração testada, apresentando

CI50 >200μg/mL, demonstrando não ser este o mecanismo de ação dos extratos.

Em Clusia, relatos de atividade citotóxica estão presentes na literatura, sendo

as benzofenonas os metabólitos secundários com maior ação. A nemorosona,

presente em Clusia rosea, foi citotóxica frente a diferentes linhagens tumorais e com

baixa citotoxidade em células sadias (CUESTA-RUBIO et al., 2002; DIAZ-

CARBALLO et al., 2003; DIAZ-CARBALLO et al., 2008; POPOLO et al., 2011).

Derivados bifenila presentes em Clusia paralicola também apresentaram citotoxidez

52

em linhagem de células KB (sublinhagem celular tumoral geral que formam

queratina) (SEO et al., 1999).

5.7. Atividade antimicrobiana

O crescente aumento da resistência bacteriana aos antibióticos em circulação

no mercado é considerado um dos maiores problemas atuais de saúde pública

(BALSALOBRE et al., 2014). O fato denota dados alarmantes, pois existem

bactérias que já são resistentes à grande maioria – senão a todos – os antibióticos

conhecidos, como é o caso de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina

(MRSA) e Enterococcus faecium resistentes à vancomicina (VRE) (GUIMARÃES et

al., 2010). Simultaneamente o número de novos antibióticos aprovados pela Food

And Drug Administration (FDA) tem diminuído ao longo dos anos (BOUCHER et al.,

2009). Devido à complexidade de suas estruturas químicas e às interações

específicas com seus alvos (GUIMARÃES et al., 2010), produtos de origem natural

têm sido vistos como uma boa alternativa a serem explorados (HARVEY et al.,2008),

já que poucos fármacos provenientes de recursos naturais foram reprovados pelo

FDA (SUFFREDINI et al., 2006).

Em vista disso, todos os extratos obtidos de C. grandiflora foram analisados

quanto sua atividade antimicrobiana frente às cepas de bactérias gram-positivas

(Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, S. epidermidis e S. simulans) e

gram-negativas (Serratia marcescens, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae,

Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Klebisiella pneumoniae). Primeiro, foi

realizada a análise por TSA e observou-se que as únicas cepas inibidas foram de P.

aeruginosa e E. coli para cinco dos oito extratos. Os resultados obtidos da média

entre os diâmetros das zonas de inibição (Halo = mm) estão apresentados na Tabela

10.

Tabela 10. Diâmetro dos halos de inibição formados em função dos extratos de C.

grandiflora frente às cepas P. aeruginosa e E. coli.

Código das amostras P. aeruginosa E. coli

CGFH - -

CGFEt 6,3 mm 6,6 mm

53

CGRAH - -

CGRAEt 7,0 mm 7,0 mm

CGRH 7,6 mm 7,8 mm

CGREt 6,6 mm 7,0 mm

CGFoH - -

CGFoEt 7,3 mm 6,2 mm

Legenda: - sem formação de halo

CGFH: extrato hexânico das flores de C. grandiflora; CGFEt: extrato etanólico das

flores de C. grandiflora; CGRAH: extrato hexânico das raízes adventícias de C.

grandiflora; CGRAEt: extrato etanólico das raízes adventícias de C. grandiflora;

CGRH: extrato hexânico dos ramos de C. grandiflora; CGREt: extrato etanólico dos

ramos de C. grandiflora; CGFoH: extrato hexânico das folhas de C. grandiflora;


Dos cinco extratos que mostraram atividade frente a P. aeruginosa, todos

obtiveram um diâmetro do halo variando de 6,3 mm até 7,6 mm. Já em E. coli, os

halos variaram de 6,2 mm a 7,8 mm. Este resultado é bastante promissor por se

tratar de um extrato bruto composto por várias substâncias em pequenas

concentrações que podem estar contribuindo de maneira sinérgica e reduzindo as

chances de resistência (DA SILVA, 2001).

Segundo à Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), a

sensibilidade dos microrganismos frente aos antimicrobianos é representada pela

concentração inibitória mínima (CIM) de cada microrganismo para cada

antimicrobiano, que corresponde a menor concentração do antimicrobiano capaz de

inibir o desenvolvimento visível do microrganismo.

Os extratos que apresentaram atividade no ensaio de TSA tiveram a CIM

determinada. Os resultados foram mensurados pela turbidez a olho nu e, em

seguida, pela mudança de coloração, devido a uma redução, de azul, do azul de

resazurina, para rosa, da resorufina. Essa mudança de coloração se deve a

presença de respiração aeróbia. Os resultados encontram-se na Tabela 11.

54

Tabela 11. Concentrações inibitória mínima (CIM) dos extratos ativos de C.

grandiflora frente às cepas P. aeruginosa e E. coli.


CGFEt 256 μg/mL 64 μg/mL

CGRAEt 32 μg/mL 16 μg/mL

CGRH 256 μg/mL 128 μg/mL

CGREt 64 μg/mL 32 μg/mL

CGFoEt 64 μg/mL 32 μg/mL

Legenda: CGFEt: extrato etanólico das flores de C. grandiflora; CGRAEt: extrato

etanólico das raízes adventícias de C. grandiflora; CGRH: extrato hexânico dos

ramos de C. grandiflora; CGREt: extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora;


O extrato CGRAEt foi o mais eficaz tanto frente à P. aeruginosa como à E.

coli, apresentando um CIM de 32 μg/mL e 16 μg/mL, respectivamente. O extrato

CGREt foi capaz de inibir completamente o crescimento de P. aeruginosa em uma

concentração de 64 μg/mL. Ainda em relação a P. aeruginosa, os extratos CGRH e

CGFEt apresentaram um CIM de 256 μg/mL. No caso de E. coli, o extrato CGRAEt,

como já mencionado, apresentou o melhor resultado de CIM, inibindo

completamente seu crescimento a partir da concentração de 16 μg/mL. Os extratos

CGREt e CGFoEt mostraram-se eficazes a partir da concentração de 32 μg/mL e o

extrato CGFEt inibiu em uma concentração de 64μg/mL. Por último, o extrato CGRH

apresentou um CIM de 128 μg/mL, mas ainda dentro da faixa de concentração

aceita pelo CLSI como um bom resultado (512 μg/mL> CIM> 0,25 μg/mL).

Estudos anteriores sobre C. grandiflora, mostraram que benzofenonas

possuem atividade antimicrobiana contra os patógenos do mel Paenibacillus larvae e

Paenibacillus alvei (LOKVAM et al., 2000) e as resinas florais mostraram atividade

antimicrobiana contra S. aureus, B. subtilis e C. albicans em ensaio de bioautografia

(PORTO et al.,2000). Este ensaio veio acrescentar que não apenas os componentes

das resinas florais podem apresentar atividade antimicrobiana, assim como extratos

de outros órgãos.

5.8. Atividade acaricida

55

Os carrapatos são artrópodes ectoparasitos hematófagos que afetam a

população animal e humana devido a transmissão de patógenos (ESTRADA-PEÑA

& JONGEJAN, 1999; PAROLA & RAOULT, 2001). O carrapato Rhipicephalus

microplus é um ixodídeo originário da Ásia, cujo principal hospedeiro é o bovino. Sua

incidência é maior na América, África, Ásia e Austrália (GONZALES, 1995; NARI,

1995).

Seus danos ao animal parasitado se devem, principalmente, pela espoliação

da grande quantidade de sangue (MARTINS, 2004) e transmissão de doenças

(MARTINS & CORREA, 1995), gerando grande perda econômica (GRISI et al.,

2002). Atualmente, o controle do carrapato é feito principalmente com o uso de

carrapaticidas e sua troca geralmente é indiscriminada e acaba não cumprindo o seu

objetivo de controlar os carrapatos, permitindo que sejam selecionados os indivíduos

tolerantes (FURLONG et al., 2003). O controle biológico de pragas tem sido uma

alternativa promissora, pois utiliza mecanismos naturais ao combate, menor impacto

ambiental, menor custo, maior especificidade e menor desenvolvimento de

resistência (ALVEZ, 1998; MILNER, 2000; SHAH & PELL, 2003; SHAMISH et al.,

2004).

Assim, avaliaram-se os extratos brutos hexânicos de C. grandiflora quanto

sua atividade acaricida frente ao carrapato bovino Rhipicephalus microplus. Os

resultados do teste de mortalidade por imersão de fêmeas adultas nos extratos

podem ser visualizados na Figura 22.

Figura 22. Teste de imersão de fêmeas adultas nos extratos brutos hexânicos

de C. grandiflora.

56

Os carrapatos imersos no controle apresentaram mortalidade apenas após o

quarto dia, chegando em torno de 15 % após 15 dias de análise. Já a mortalidade

por imersão no extrato CGFoH após os 15 dias foi semelhante ao controle, enquanto

que no extrato CGRAH foi o que exibiu o menor percentual de mortalidade. O extrato

que obteve a melhor atividade foi CGRH, com a mortalidade dos carrapatos

iniciando logo no primeiro dia, e com cerca de 50 % de mortalidade após 15 dias.

Os extratos foram também analisados frente ao índice de postura de ovos

(IPO) e porcentagem de inibição de postura 15 dias após o tratamento com extratos

hexânicos de C. grandiflora. Estes resultados estão expressos na Tabela 12.

Tabela 12. Índice de postura de ovos (IPO) e inibição de postura, em porcentagem,

15 dias após o tratamento com extratos hexânicos de C. grandiflora.

Amostras IPO Inibição de postura (%)

Controle Negativo 0,132 ± 0,014 ---

CGRH 0,106 ± 0,008 0

CGRAH 0,134 ± 0,011 0

CGFoH 0,125 ± 0,015 0

CGFH 0,107 ± 0 6,56

Legenda: CGFH: extrato hexânico das flores de C. grandiflora; CGRAH: extrato

hexânico das raízes adventícias de C. grandiflora; CGRH: extrato hexânico dos

ramos de C. grandiflora; CGFoH: extrato hexânico das folhas de C. grandiflora.

O extrato CGRH obteve melhor resultado com o menor valor de IPO e o

CGRAH foi próximo ao controle, porém, menor.

No gênero Clusia há relatos da atividade inseticida para espécie Clusia

hilariana frente as larvas de Rhodnius prolixus, transmissor da doença de Chagas,

devido a presença do triterpeno ácido oleanólico e da benzofenona nemorosona

(KELECOM et al., 2002).

5.9. Perfil dos extratos brutos

5.9.1. Perfil por cromatografia em camada delgada (CCD)

57

A presença das principais classes de metabólitos secundários nos extratos

brutos hexânicos e etanólicos de C. grandiflora foram avaliadas qualitativamente por

CCD utilizando diferentes sistemas de eluentes e reveladores.

A Figura 23 mostra a comparação do perfil dos extratos brutos hexânicos e

etanólicos, e pode ser observado uma diferença qualitativa no que diz respeito ao

aparecimento de bandas na placa sob a irradiação de 254 nm e 365 nm, entretanto,

há substâncias com Rf muito próximos em todos os extratos, como destacado.

Algumas similaridades do perfil são observadas apenas entre as partes vegetativas

e reprodutiva extraídas em mesmo solvente.

Figura 23. CCD dos extratos brutos etanólicos e hexânicos de C. grandiflora

eluídos em hexano: acetato de etila: ácido acético (65:34:1) e revelados em lâmpada

de luz UV. A) Luz UV 365nm B) Luz UV 254 nm. CG: C. grandiflora, FoH: Extrato

hexânico das folhas, FH: Extrato hexânico das flores, RAH: Extrato hexânico das

raízes adventícias, RH: Extrato hexânico dos ramos, FoEt: Extrato etanólico das

folhas, FEt: Extrato etanólico das flores, RAEt: Extrato etanólico das raízes

adventícias, REt: Extrato etanólico dos ramos.

Para confirmar o resultado positivo da presença de alcaloides no teste

histoquímico, utilizou-se Dragendorff como revelador químico na CCD. Porém, vale

ressaltar que este reagente pode resultar em um falso positivo, pois existem

descrições na literatura de uma variedade de substâncias oxigenadas não

nitrogenadas com reações alcaloide positivos devido a presença de um carbono

beta ligado a um oxigênio com alta densidade eletrônica (HABIB, 1980). O possível

58

resultado positivo é caracterizado pelo surgimento de sinais com coloração marrom

a laranja-amaronzado (WAGNER, 1984), que foi observado apenas nos extratos

etanólicos das flores (F) e das raízes adventícias (RA), conforme a Figura 24,

corroborando com os resultados dos testes histoquímicos.

Figura 24. CCD dos extratos brutos etanólicos de C. grandiflora eluídos em

hexano: acetato de etila: ácido acético (50:49:1) e revelados em Dragendorff. CGEt:

C. grandiflora extrato etanólico, Fo: folha, F: flor, RA: raíz adventícia, R: ramo.

A vanilina sulfúrica é um revelador geral que pode sugerir a presença de

diferentes classes de substâncias. A análise deste revelador, conforme a Figura 25,

pode sugerir a presença de substâncias terpenoídicas, apenas nos extratos

hexânicos, em função da coloração violeta nos extratos (WAGNER, 1984). A

presença de terpenos já foi indicada na família Clusiaceae, conforme apresentado

na revisão bibliográfica. Essas substâncias podem estar presentes nos óleos

essenciais e no látex, sendo este característico de Clusia segundo Metcalfe e Chalk

(1950).

59

Figura 25. CCD dos extratos brutos hexânicos de C. grandiflora eluidos em

hexano: acetato de etila: ácido acético (75:24:1) e revelados em vanilina sulfúrica.

CGH: C. grandiflora extrato hexânico, Fo: folha, F: flor, RA: raíz adventícia, R: ramo.

Para detecção de substâncias com atividade antioxidante foi utilizado como

revelador o DPPH. Ele possui uma cor violeta intenso, quando aplicado na CCD

adquire coloração amarelo ouro característica em presença de substâncias com

atividade antioxidante (CONFORTI et al., 2002), conforme é observado nas Figuras

26A no extrato hexânico das flores (F) e 26B em todos os extratos etanólicos. A

presença de possíveis substâncias com atividade antioxidante na CCD dos extratos

etanólicos corrobora com o bom resultado dos testes de atividade antioxidante dos

extratos brutos etanólicos mencionados anteriormente. As substâncias reveladas

podem pertencer a diferentes classes metabólicas já descritas no gênero, como

flavonoides, benzofenonas e outras substâncias fenólicas mais simples, sendo as

benzofenonas os fenóis com maior destaque em espécies de Clusia, principalmente

as benzofenonas poliisopreniladas (PORTO, 2000; SILVA ET AL., 2012; OLIVEIRA

ET AL., 1996 E 1999; LOKVAM ET AL., 2000).

60

Figura 26. CCD dos extratos brutos de C. grandiflora revelados em DPPH. A)

Extrato hexânico eluido em hexano: acetato de etila: ácido acético (75:24:1) B)

Extrato etanólico eluido em hexano: acetato de etila: ácido acético (50:49:1). CGEt:

C. grandiflora extrato etanólico, CGH: C. grandiflora extrato hexânico, Fo: folha, F:

flor, RA: raíz adventícia, R: ramo.

Os extratos brutos foram também comparados com frações enriquecidas de

3-oxo-friedelina (13), clusianona (16) e lanosterol (17) (Figura 27) já identificadas de

outras espécies presentes no laboratório e conforme sistema de eluente proposto

por Virgínio (2015) modificado quanto a adição de ácido acético. As placas

reveladas em vanilina sulfúrica indicaram que as substâncias 13 e 16 possuem

bandas com fatores de retenção (Rf) próximos, se diferenciando apenas na

coloração. A identificação dessas substâncias foi feita apenas nos extratos

hexânicos, conforme mostra a Figura 28. Sugere-se presença da substância 17 em

todos os extratos, a substância 16 nos extratos das folhas (Fo) e a substância 13

nos extratos dos ramos (R) e folhas (Fo).

61

Figura 27. Estrutura química das substâncias 13, 16 e 17.

Figura 28. CCD dos extratos brutos hexânicos de C. grandiflora e frações

enriquecidas com as substâncias 13, 16 e 17 (setas) eluidos em hexano: acetato de

etila: ácido acético (80:19:1) e revelados em vanilina sulfúrica. CGH: C. grandiflora

extrato hexânico, Fo: folha, F: flor, RA: raíz adventícia, R: ramo, lan: fração

enriquecida com a substância 17, ben: fração enriquecida com a substância 16, fri:

fração enriquecida com a substância 13.

5.9.2. Perfil por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

62

Os perfis dos extratos brutos de C. grandiflora também foram determinados

por CLAE, não só para confirmar a presença de classes de metabólitos encontrados

por CCD como para verificar a presença de possíveis novas substâncias.

A análise dos cromatogramas dos extratos brutos hexânicos obteve melhor

detecção em 270 nm (Figura 29). Estes cromatogramas apresentaram substâncias

com os mesmos tempos de retenção e espectros de UV tanto nas partes vegetativas

como reprodutivas (substâncias 1 a 10). CGRH possuiu um perfil mais diferenciado e

com o maior número de substâncias detectadas, já o CGFH foi o que obteve o

menor número de substâncias detectadas. Porém, a utilização do CLAE para análise

de metabólitos primários ou secundários não foram esclarecedoras, sendo

necessárias utilização de outras técnicas.

Já a análise dos cromatogramas dos extratos brutos etanólicos (Figura 30),

em 270 nm, indicou a presença de sinais com mesmo tempo de retenção

(substâncias 1 a 14) e espectros de UV, indicando que as partes vegetativas e

reprodutivas possuem similaridade quanto às substâncias presentes. A análise dos

espectros de UV das substâncias no cromatograma de CGRAEt sugerem a

presença de um flavonoide com máximos de absorção em 200 nm, 260 nm e 300

nm (F1), um flavonoide com máximos em 202 nm, 260 nm e 315 nm (F6)

característicos de uma flavona (Simões et al., 2007) e três arilpropanoides com

máximos em 200 nm e 312 nm (A1, A2 e A3) (Pimenta, 2002). Nos espectros de UV

de CGREt há presença apenas do flavonoide F6 e sugerem a presença dos

flavonoides F1 e F2 ambos com máximos em 200 nm, 260 nm e 300 nm, além dos

arilpropanoides A1 e A3. Nos espectros de UV correspondentes aos sinais

presentes no cromatograma de CGFoEt há presença dos flavonoides F1, F2 e F6 e

o arilpropanoide A3. Há ainda dois flavonoides com máximos de absorção em 202

nm, 260 nm e 330 nm (F3 e F4), um flavonoide com máximos em 202 nm, 255 nm e

325 nm (F5), outro flavonoide com máximos em 202 nm, 255 nm e 315 nm que se

assemelha com uma flavona (F7) (Simões et al., 2007) e um arilpropanoide com

máximos em 200 nm e 315 nm (A4). Embora a análise do cromatograma de CGFEt

tenha indicado menor número de substâncias que em CGFoEt, ambas sugeriram os

espectros de UV flavonoides e arilpropanoides similares (F1, F2, F6, F7, A3 e A4).

A análise por CLAE dos extratos etanólicos sugeriu com maior confiabilidade

a presença de substâncias fenólicas simples e flavonoides anteriormente verificados

63

por CCD. Essas substâncias podem estar relacionadas ao potencial antioxidante da

espécie, além de já terem sido isoladas no gênero.

64

Figura 29. Cromatogramas dos extratos hexânicos de C. grandiflora em água (A) e acetonitrila (B), ambos com 0,05% de

ácido trifluoroacético, variando de 25% a 55% de B (0 – 15 min), 55% a 100% de B (15 – 18 min), mantendo os 100% até 30 min,

em 270 nm. CGRAH: extrato bruto hexânico da raíz adventícia de C. grandiflora; CGRH: extrato bruto hexânico do ramo de C.

grandiflora; CGFoH: extrato bruto hexânico da folha de C. grandiflora; CGFH: extrato bruto hexânico da flor de C. grandiflora.

65

Figura 30. Cromatogramas obtidos dos extratos etanólicos de C. grandiflora em água (A) e acetonitrila (B), ambos com

0,05% de ácido trifluoroacético, variando de 10% a 45% de B (0 – 40 min), 45% a 100% de B (40 – 50 min), mantendo os 100%

até 55 min, em 270 nm. A) Espectro de UV de um flavonoide do tipo flavona obtido em 29,9 minutos. B) Espectro de UV de um

flavonoide do tipo flavona obtido em Vila (2006). C) Espectro de UV de um arilpropanoide obtido em 33,5 minutos. D) Espectro de

UV de um arilpropanoide obtido em Macedo (2013). CGRAEt: extrato bruto etanólico da raíz adventícia de C. grandiflora; CGREt:

extrato bruto etanólico do ramo de C. grandiflora; CGFoEt: extrato bruto etanólico da folha de C. grandiflora; CGFEt: extrato bruto

etanólico da flor de C. grandiflora.

66


O perfil por RMN foi avaliado para corroborar com as duas técnicas utilizadas

anteriormente. Essa técnica é utilizada principalmente para a elucidação estrutural

de metabólitos secundários, mas vem sendo eficiente também no perfil químico de

amostras complexas (LOPES DA SILVA et al., 2011).

A análise por RMN de 1H em clorofórmio deuterado (CDCl3) dos extratos

hexânicos e em metanol deuterado (CD3OD) dos extratos etanólicos da espécie, em

comparação com metabólitos encontrados para o gênero presentes na literatura

permitiu identificação de alguns metabólitos.

Em campo alto foram observados sinais para todos os extratos brutos. Os

sinais encontrados nos extratos hexânicos se restrigiram quase em totalidade nesta

região, já os etanólicos mostraram sinais tanto nesta região como em campo baixo

(Figuras 31 a 34).

Os extratos hexânicos apresentaram certa similaridade quanto a seu perfil,

principalmente em relação ao campo alto. Já em campo baixo, CGRAH (Figura 31),

principalmente, e CGFH (Figura 34) obtiveram sinais característicos de anel

aromático devido a presença de prótons entre δH 7,45 e 7,74 (PAVIA et al., 2001)

que podem estar relacionados à presença de benzofenonas, uma vez que estas já

foram identificadas na espécie, porém, por ser uma amostra complexa, comparada

com a literatura, alguns sinais não foram identificados no espectro de forma clara.

Da Silva (2011) relatou sinais, para benzofenona, entre δH 0,74 – 2,74 referentes aos

carbonos metínicos, metilênicos e metílicos; sinais entre δH 4,83 - 5,17 referentes a

dupla ligação; e sinais entre δH 7,38 – 7,53 do anel aromático, que possuíram certa

similaridade com os extratos CGRAH e CGFH. Este resultado corrobora com a CCD

devido a sugestão de presença de benzofenonas.

Os principais sinais, em todos os extratos hexânicos, variaram de δH 0,8 a 1,5

que são característicos de substâncias de cadeias longas de carbonos metínicos,

metilênicos e metílicos (PAVIA et al., 2001). A possível presença de olefinas se dá

devido aos sinais entre δH 4,15 a 4,30 presente com maior clareza apenas em

CGRAEt (Figura 31) (PAVIA et al., 2001). Foram observados também outros sinais

entre δH 2,0 a 6,0 de difícil caracterização, entretanto esse conjunto de sinais

sugerem a presença de terpenoides com insaturação ou esteroides (FERREIRA,

2011).

67

Figura 31. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato hexânico das raízes adventícias (CGRAH) de C. grandiflora (CDCl3;

500MHz).

68

Figura 32. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato hexânico dos ramos (CGRH) de C. grandiflora (CDCl3; 500MHz).

69

Figura 33. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato hexânico das folhas (CGFoH) de C. grandiflora (CDCl3; 500MHz).

70

Figura 34. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato hexânico das flores (CGFH) de C. grandiflora (CDCl3; 500MHz).

71

Os espectrso dos extratos etanólicos (Figuras 35 a 38) mostraram mais sinais

que os hexânicos, tanto em região de anel aromático, como olefinas e carbonos

metínicos, metilênicos e metílicos.

Os sinais mencionados anteriormente dos espectros dos extratos hexânicos

para presença de esteroides, terpenos e benzofenonas, também foram encontrados

nos extratos etanólicos, exceto para o CGREt (Figura 36) e CGFoEt (Figura 37), que

não foram observados sinais entre δH 7,45 e 7,74 referente ao anel aromático de

benzofenona.

Além destes sinais, outros também foram encontados nos extratos etanólicos,

como os deslocamentos entre δH 6-7. De acordo com Ferreira (2011), estes sinais

podem estar relacionados a presença de flavonoides. A sugestão da presença de

flavonoides corrobora com outros resultados obtidos anteriormente, como, teste

histoquímico, teste para atividade antioxidantem, CLAE e CCD.

72

Figura 35. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato etanólico das raízes adventícias (CGRAEt) de C. grandiflora (MD3OD; 500MHz).

73

Figura 36. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato etanólico dos ramos (CGREt) de C. grandiflora (MD3OD; 500MHz).

74

Figura 37. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato etanólico das folhas (CGFoEt) de C. grandiflora (MD3OD; 500MHz).

75

Figura 38. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato etanólico das flores (CGFEt) de C. grandiflora (MD3OD;

500MHz).

76


massas (CG-EM)

A caracterização dos extratos hexânicos também foi feita por CG/EM para

corroborar com a técnica mais conclusiva das realizadas anteriormente, o RMN de

H1. A partir dos cromatogramas obtidos foram selecionadas substâncias mais

representativas para cada extrato, cujos espectros foram determinados em

comparação com o banco de dados do aparelho e descrições da literatura. A Tabela

13 mostra as substâncias referentes a cada extrato, junto ao tempo de retenção,

correlação com o banco de dados e abundância na amostra. Os cromatogramas e

as fragmentações das substâncias majoritárias estão presentes nas Figuras 30 a 37.

Tabela 13. Substâncias identificadas nos extratos hexânicos de C. grandiflora por

CG/EM, sua correlação com o banco de dados e abundância.

Extrato Tempo de

retenção

(min)

Substância Correlação

banco de

dados (%)

Abundância

(%)

CGRAH

14,17 Hexacosano

(Hidrocarboneto)

98 2,32

14,91 Heptacosano

(Hidrocarboneto) -

majoritário

99 5,51

15,61 Octacosano

(Hidrocarboneto)

99 4,05

16,33 Nonacosano

(Hidrocarboneto)

99 4,01

16,99 Triacontano

(Hidrocarboneto)

99 3,08

17,69 Hentriacontano

(Hidrocarboneto)

* 2,36

22,34 3-oxo-friedelina

(Triterpeno)

96* 3,62

77

CGRH

8,71 Ácido palmítico

(Hidrocarboneto –

ácido graxo)

98* 3,54


(Hidrocarboneto)

* 1,52

20,08 α-amirina

(Titerpeno)

93* 3,25

22,22 Epifriedelinol

(Triterpeno)

95* 7,20


(Triterpeno) -

majoritário

96* 63,16

CGFoH

16,31 Nonacosano

(Hidrocarboneto)

* 2,16


(Hidrocarboneto)

* 6,26

19,52 Tritriacontano

(Hidrocarboneto)

* 10,65

20,69 β-amirina

(Triterpeno)

* 15,75

22,18 Epifriedelinol

(Triterpeno)

92* 11,82


(Triterpeno) -

majoritário

96* 23,69

CGFH

5,99 2-propenoato de

dodecila (Éster) -

majoritário

91* 22,81

8,69 Pentadecano

(Hidrocarboneto)

* 7,12

12,58 Tetracosano 99 2,59

78

(Hidrocarboneto)

13,39 Pentacosano

(Hidrocarboneto)

99 4,88

14,16 Hexacosano

(Hidrocarboneto)

* 6,35

14,91 Heptacosano

(Hidrocarboneto)

99 6,89

15,63 Octacosano

(Hidrocarboneto)

99 6,89

16,32 Nonacosano

(Hidrocarboneto)

99 6,26

16,98 Triacontano

(Hidrocarboneto)

99 4,04


(Hidrocarboneto)

* 2,65

Legenda: *literatura (SILVERSTEIN, 1979; ALMEIDA et al., 2011; SILVA, 2007)

CGRAH: extrato bruto hexânico das raízes adventícias de C. grandiflora; CGRH:

extrato bruto hexânico dos ramos de C. grandiflora; CGFoH: extrato bruto hexânico

das folhas de C. grandiflora; CGFH: extrato bruto hexânico das flores de C.

grandiflora.

79

Figura 39. Cromatograma obtido por CG/EM de CGRAH.

80

Figura 40. Fragmentação das substâncias encontradas em CGRAH. A)

Hexacosano. B) Heptacosano. C) Octacosano. D) Nonacosano. E) Triacontano. F)

Hentriacontano. G) 3-oxo-friedelina (fragmentos (m/z): 69,2; 205,3; 273,3; 426,5).

81

Figura 41. Cromatograma obtido por CG/EM de CGRH.

82

Figura 42. Fragmentação das substâncias encontradas em CGRH. A) Ácido

palmítico (fragmentos (m/z): 73,2; 185,3; 213,3; 227,3; 256,4). B) Hentriacontano. C)

α-amirina (fragmentos (m/z): 95,2; 189,3; 218,3; 426,5). D) Epifriedelinol (fragmentos

(m/z): 69,3; 95,2; 123,3; 275,4; 413,5). E) 3-oxo-friedelina (fragmentos (m/z): 69,3;

205,3; 273,4; 426,5).

83

Figura 43. Cromatograma obtido por CG/EM de CGFoH.

84

Figura 44. Fragmentação das substâncias encontradas em CGFoH. A) Nonacosano.

B) Hentriacontano. C) Tritriacontano. D) β-amirina (fragmentos (m/z): 95,3; 189,3;

218,3; 426,5). E) Epifriedelinol (fragmentos (m/z): 69,3; 95,2; 275,4; 413,5). F) 3-oxo-

friedelina (fragmentos (m/z): 69,3; 205,3; 273,4; 426,5).

85

Figura 45. Cromatograma obtido por CG/EM de CGFH.

87

Figura 46. Fragmentação das substâncias encontradas em CGFH. A) 2-propenoato

de dodecila B) Pentadecano. C) Tetracosano D) Pentacosano. E) Hexacosano. F)

Heptacosano. G) Octacosano. H) Nonacosano. I) Triacontano. J) Hentriacontano.

Dentre as substâncias identificadas como majoritárias destacaram-se, então,

a presença de triterpenos com esqueletos do tipo ursanos e friedelanos,

principalmente a 3-oxo-friedelina, que são comumente encontrados no gênero,

corroborando com os resultados encontrados por CCD.

5.10. Fracionamento do extrato bruto CGREt

88

Face os bons resultados obtidos frente aos ensaios biológicos realizados com

CGREt, parte deste extrato foi fracionado em CLV usando como eluentes hexano,

diclorometano, acetato de etila, metanol e metanol:água fornecendo cinco frações,

conforme o fluxograma da Figura 47.

Figura 47. Fluxograma do fracionamento do CGREt.

Após utilizar o solvente mais polar, metanol:água, observou-se que parte do

material ficou retido na fase estacionária, isto poderia estar relacionado com o baixo

rendimento total do fracionamento por esta técnica.

As frações obtidas foram cromatogradas em CCD e observou-se que a fração

CGREtH (1) sugere a presença de duas substâncias mais apolares como

majoritárias (setas), conforme mostra a Figura 48.

89

Figura 48. CCD do extrato bruto etanólico dos ramos e das frações obtidas

por CLV eluídas em hexano: acetato de etila: ácido acético (80:19:1) e reveladas em

lâmpada de luz UV em 254 nm. b: extrato bruto etanólico dos ramos, 1: fração

CGREtH, 2: fração CGREtD, 3: fração CGREtAc, 4: fração CGREtM, 5: fração

CGREtMA, setas: substâncias majoritárias apolares.

A fração CGREtD (2) quando revelada em vanilina sulfúrica (Figura 49A)

sugere a presença de aproximadamente sete substâncias, além de apresentar

resultado positivo para alcaloide (Figura 49B) e atividade antioxidante (Figura 49C).

A fração CGREtAc (3) sugeriu a presença de aproximadamente cinco substâncias

(Figura 49A), resultado positivo para alcaloide (Figura 49B) e uma boa atividade

antioxidante (Figura 49C). Já a fração CGREtM (4) apresentou apenas resultado

positivo para atividade antioxidante (Figura 49C).

90

Figura 49. CCDs do extrato bruto etanólico dos ramos e das frações obtidas

na CLV. A) CCD das frações 1 a 5 eluídas em hexano: acetato de etila: ácido acético

(60:39:1) e reveladas em vanilina sulfúrica. B) CCD das frações 2 a 5 eluídas em

hexano: acetato de etila: ácido acético (40:59:1) e reveladas em reagente

Dragendorff. C) CCD das frações 2 a 5 eluídas em hexano: acetato de etila: ácido

acético (20:79:1) e reveladas em DPPH. b: extrato bruto etanólico dos ramos, 1:

fração CGREtH, 2: fração CGREtD, 3: fração CGREtAc, 4: fração CGREtM, 5: fração

CGREtMA.

Por fim, as frações da CLV foram comparadas com frações enriquecidas das

substâncias 13, 16 e 17 (Figura 50) e indicam a presença de 13 na fração CGREtD

(2) e de 16 na fração CGREtH (1).

Figura 50. CCD das frações obtidas na CLV e frações enriquecidas com as

substâncias 13, 16 e 17 eluídas em hexano: acetato de etila: ácido acético (80:19:1)

91

e revelados em vanilina sulfúrica. 1: fração CGREtH, 2: fração CGREtD, 3: fração

CGREtAc, 4: fração CGREtM, 5: fração CGREtMA, lan: fração enriquecida com a

substância 17, clu: fração enriquecida com a substância 16, fri: fração enriquecida

com a substância 13, setas: substâncias majoritárias.

5.10.1. Atividade antimicrobiana das frações da CLV

As frações obtidas por CLV tiveram o CIM frente às cepas que foram inibidas

no CGREt (P. aeruginosa e. coli) e seus resultados encontram-se na Tabela 14.

Tabela 14. Concentrações mínimas necessárias de cada fração para inibir o

crescimento das cepas P. aeruginosa e E. coli.


CGREtH >256 μg/mL 128 μg/mL

CGREtD 128 μg/mL 8 μg/mL

CGREtAc >256 μg/mL 8 μg/mL

CGREtM >256 μg/mL >256 μg/mL

CGREtMA >256 μg/mL >256 μg/mL

A fração CGREtD foi a mais eficaz frente ambas às cepas. CGREtH e

CGREtAc obtiveram atividade frente à E. coli, tendo a CGREtAc um bom resultado.

Apesar dos altas CIM, as frações ainda mostraram valores dentro da faixa de

concentração aceita pelo CLSI (512 μg/mL> CIM> 0,25 μg/mL).

5.10.2. Isolamento e purificação de substâncias obtidas em CGREtD e

suas elucidações estruturais

Como a fração CGREtD (1,0573g) obteve o melhor resultado frente à

atividade antimicrobiana e presença de um número maior de substâncias

majoritárias nas CCDs, esta foi separada por cromatografia em coluna com gel de

sílica utilizando eluentes hexano, acetato de etila e metanol, em gradiente de

92

polaridade fornecendo um total de 34 frações que após a análise por CCD foram

reagrupadas em 9 frações.

As frações 3 e 4 exibiram cristais após a evaporação do solvente. Essas

foram, então, recristalizadas utilizando etanol e analisada com as demais frações por

CCD (Figura 51) e reveladas sob a lâmpada de luz UV em 365 nm. As frações de 5

a 9 foram analisadas separadamente em outro eluente (Figura 52).

Figura 51. CCD do extrato bruto etanólico dos ramos, da fração CGCEtD, das

frações 1 a 4 e frações 3 e 4 recristalizadas eluídas em hexano: acetato de etila:

ácido acético (85:14:1) e revelados sob lâmpada de luz UV em 365 nm. B: extrato

bruto etanólico dos ramos; C: fração CGCEtD obtida da CLV; 1 a 4: frações obtidas

da coluna em gel de sílica, 3rec e 4rec: frações obtidas após recristalização.

93

Figura 52. CCD do extrato bruto etanólico dos ramos, da fração CGCEtD e

das frações 5 a 9 eluidos em hexano: acetato de etila: ácido acético (50:49:1) e

revelados sob lâmpada de luz UV em 256 nm. B: extrato bruto etanólico dos ramos;

C: fração CGCEtD obtida da CLV; 5 a 9: frações obtidas da coluna em gel de sílica.

Por fim, as frações da coluna em gel de sílica foram comparadas com frações

enriquecidas das substâncias 13, 16 e 17 e indicam a presença de 13 na fração 3rec

e 4rec (Figura 53A) e da substância 17 nas frações de 5 a 9 (Figura 53B).

Figura 53. CCD das frações 1 a 9, frações recristalizadas e frações

enriquecidas com as substâncias 13, 15 e 16 eluídas em hexano: acetato de etila:

ácido acético (75:24:1) e revelados em vanilina sulfúrica. A) Frações de 1 a 4 obtidas

da coluna em gel de sílica, frações 3rec e 4rec recristalizadas e frações enriquecidas

com 13, 16 e 17. B) Frações de 5 a 9 obtidas da coluna em gel de sílica e frações

94

enriquecidas com 13, 16 e 17. lan: fração enriquecida com a substância 17, ben:

fração enriquecida com a substância 16, fri: fração enriquecida com a substância 13,

setas: substâncias majoritárias.

Após a análise por CCD as frações 8 e 9 foram cromatografadas em CCD

preparativa, porém, a quantidade de amostra resultante não foi o suficiente para

elucidação estrutural.

Já as amostras 3rec e 4rec, quando reveladas em vanilina com a fração

enriquecida da substância 13 apresentou mesmo Rf e mesma coloração como

proposta na literatura (NOUFOU et al., 2012). Essas amostras foram, então,

enviadas para CG/EM e tiveram suas substâncias majoritárias identificadas em

comparação com banco de dados do aparelho e dados da literatura (Tabela 15 e

Figuras 54 e 55).

Tabela 15. Substância majoritária identificada nas frações cromatogradas em coluna

com gel de sílica de C. gradiflora por CG/EM.

Fração Tempo de

retenção

(min)

Substância Correlação

banco de

dados (%)

Abundância

(%)

CGREtD 3rec 22.83 3-oxo-friedelina

(Triterpeno)

96* 92,28

CGREtD 4rec 22.85 3-oxo-friedelina

(Triterpeno)

96* 90,80

Legenda: *literatura (ALMEIDA et al., 2011)


extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora; CGREtD 4rec: fração 4rec da coluna

obtida da fração em diclorometano da CLV do extrato etanólico dos ramos de C.

grandiflora.

95


CGREtD 3rec. A) Cromatograma da fração CGCEtD 3rec. B) Espectro de massas da

substância 3-oxo-friedelina obtida da fração CGCEtD 3rec.

96


CGREtD 4rec. A) Cromatograma da fração CGCEtD 4rec. B) Espectro de massas da

substância 3-oxo-friedelina obtida da fração CGCEtD 4rec.

Como as frações obtidas são ricas em 3-oxo-friedelina (C30H50O) o processo

de fragmentação originou íon molecular m/z 426 e íons fragmentos de m/z 273, m/z

205 e m/z 69, conforme encontrado em Almeida (2011). O processo de

97

fragmentação foi proposto por Fernandes (2010) e Carvalho (2013) como é

mostrado na Figura 56.

Figura 56. Proposta de fragmentação da 3-oxo-friedelina.

A substância majoritária da fração 3rec, como estava em maior abundância

no CG/EM, também foi analisada por RMN de H1 e resultaram na presença de todos

os sinais característicos para um triterpeno friedelano: sete simpletos referentes às

metilas (δH 1,18; 1,05;1,01; 1,00; 0,95; 0,87 e 0,73) e um dupleto em δH 0,88

referente aos prótons metila ligados ao carbono C-23. Os demais sinais de

hidrogênio metilênicos e metílicos se acoplaram formando multipletos difíceis de

serem visualizados na região entre δH 1,18-1,59 e multipletos entre δH 2,20-2,39

referentes a prótons α-carbonílicos. Estes sinais estão de acordo com os dados da

literatura (ALMEIDA et al., 2011; CARVALHO, 2013), conforme mostra a Figura 57 e

Tabela 16. Confirmando mais uma vez que essa substância majoritária é a 3-oxo-

friedelina (13) (Figura 58).

98

Figura 57. Espectro de RMN de H1 da 3-oxo-friedelina e expansões do campo alto.

99

Tabela 16. Dados do RMN de H1 da 3-oxo-friedelina comparados a literatura*.

H δH fração δH literatura

1 a 1,96 (m) 1,96 (m)

1 b 1,69 (ddd, J = 26,1; 13,1;

5,1 Hz) - sobreposto

1,68 (dq; J = 13,0; 5,1 Hz)

2 a 2.39 (ddd, J = 13,7; 5,1,

2.0 Hz)

2,39 (ddd; J = 13,7; 5,1;

1,9 Hz)

2 b 2.30 (m) -sobreposto 2,29 (m; J = 13,8; 13,6;

6,5 Hz)

4 2.25 (dd, J = 14,1; 6,9 Hz)

- sobreposto

2,24 (q; J = 6,5 Hz)

6 a 1,75 (dd, J= 15,4; 2,7 Hz)

- sobreposto

1,75 (m)

23 0.88 (d, J = 6,7 Hz) -

sobreposto

0,87 (d; J = 6,5 Hz)

24 0,73 (s) 0,73 (s)

25 0,87 (s) - sobreposto 0,88 (s)

26 1.01 (s) 1,01 (s)

27 1,05 (s) 1,05 (s)

28 1,18 (s) 1,18 (s)

29 1,00 (s) 1,00 (s)

30 0,95 (s) 0,95 (s)

Legenda: *ALMEIDA et al., 2011

Figura 58. Estrutura química da 3-oxo-friedelina (13).

100

Como o CG/EM e o RMN de H1 mostraram que as frações ainda não estavam

puras e se trataram da mesma substância elas foram reunidas e novamente

recristalizadas com acetato de etila e lavadas com etanol, conforme proposto por

Pires e colaboradores (2009). Após cristalização observou-se a formação de um

sólido branco em forma de agulhas (CGREtF – 3,1mg), como descrito no trabalho de

Almeida e colaboradores (2011) e seu ponto de fusão (PF) resultou numa faixa de

260-265ºC próximo ao encontrado na literatura (260-261ºC) (SEUPEL et al., 2015).

5.10.3. Atividade antimicrobiana da 3-oxo-friedelina

Como a fração CGREtD (2) da CLV foi a mais ativa frente à P. aeruginosa e

E. coli decidiu-se avaliar a atividade antimicrobiana de CGREtF frente às mesmas

cepas.

O CIM para esta fração em ambas às cepas foi maior que 256 μg/mL,

indicando que, na concentração utilizada, possivelmente a 3-oxo-friedelina (13) não

foi a responsável ou não sozinha pela atividade antimicrobiana encontrada na fração

CGREtD (2), apesar de ser encontrados relatos na literatura quanto ao seu potencial

(SINGH & DUBEY, 2001).

6. CONCLUSÕES

As características anatômicas encontradas em C. grandiflora foram epiderme

unisseriada com estômatos restritos a face abaxial, cutícula espesssa com flages,

presença de hipoderme, diversas estruturas secretoras e idioblastos com drusas.

Essas características contribuíram com os dados da literatura descritos para a

família Clusiaceae e para similaridade com outras espécies.

Os testes histoquímicos demonstraram a presença de grãos de amido,

lipídeos, taninos e flavonoides em localização esperada e descrita na literatura.

A caracterização anatômica e histoquímica da espécie permitiu o

estabelecimento de parâmetros para futura verificação de autenticidade de

amostras.

101

A análise dos valores de CE50 e da atividade antioxidante máxima mostraram

que os extratos apresentaram potencial antioxidante, destacando-se o extrato

etanólico das raízes adventícias.

O teor de flavonoides expressos como flavonas e flavonóis obtiveram baixos

valores para estas substâncias. Porém, quando foram analisados estatisticamente

obtiveram uma correlação positiva entre o CE50 e a presença de flavonoides.

A atividade citotóxica foi promissora para os extratos etanólicos dos ramos e

folhas frente às linhagens de cólon humano e ascite gástrica, respectivamente.

Para a atividade antimicrobiana os extratos apresentaram atividade apenas

frente às cepas P. aeruginosa e E. coli, destacando-se todos os extratos etanólicos e

o extrato hexânico dos ramos. As frações obtidas do extrato etanólico dos ramos

também foram avaliadas e obtiveram bons resultados para as frações em

diclorometano, principalmente, e acetato de etila. A substância majoritária presente

na fração em diclorometano, a 3-oxo-friedelina, teve seu potencial avaliado e como

resultado pode-se sugerir que esta não foi a responsável ou não sozinha pela

atividade antimicrobiana na concentração utilizada. Sugerindo a utilização de uma

concentração maior para estudos futuros.

O potencial acaricida para os extratos hexânicos não apresentaram um bom

resultado, tendo uma melhor atividade apenas o extrato dos ramos.

A prospecção química sugeriu a presença de substâncias fenólicas,

benzofenonas e terpenoídicas. O perfil obtido por CCD foi bastante amplo, podendo

ser corroborado após a realização das demais técnicas. Por CLAE-DAD foi possível

sugerir a presença, principalmente, de substâncias fenólicas nos extratos etanólicos.

Por RMN de H1 foi sugerido a presença das substâncias terpenoidicas, flavonoides e

benzofenonas, mencionadas anteriormente, mas como se trata de uma matriz

complexa os sinais estavam sobrepostos dificultando a identificação. A análise por

CG/EM dos extratos hexânicos demonstrou, principalmente, a presença de

triterpenos do esqueleto friedelano.

Os resultados obtidos neste trabalho indicam que C. grandilora pode ser alvo

para estudos futuros visando o isolamento de outras classes de substâncias,

avaliação de outras atividades biológicas e busca por metabólitos que possam se

102

tornar alvo para indústria farmacêutica. Além disso, contribuiu para ampliação do

conhecimento da família e, assim, da flora brasileira.

7. REFERÊNCIAS

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