marcelo fabiano andrÉ -...

i

MARCELO FABIANO ANDRÉ

“DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS EM EXTRATO DE CARQUEJA

EMPREGANDO TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS E ELETROFORÉTICAS”

Campinas

2014

iii

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUÍMICA

MARCELO FABIANO ANDRÉ



ORIENTADORA: PROFA. DRA. CARLA BEATRIZ GRESPAN BOTTOLI

TESE DE DOUTORADO APRESENTADA

AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP

PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE

DOUTOR EM CIÊNCIAS.

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA POR MARCELO

FABIANO ANDRÉ, E ORIENTADO PELA PROFA. DRA. CARLA BEATRIZ GRESPAN BOTTOLI.

______________________

Assinatura da Orientadora

CAMPINAS

2014

vii

“De tudo ficaram três coisas...

A certeza de que estamos começando...

A certeza de que é preciso continuar...

A certeza de que podemos ser interrompidos

antes de terminar...

Façamos da interrupção um caminho novo...

Da queda, um passo de dança...

Do medo, uma escada...

Do sonho, uma ponte...

Da procura, um encontro!”

Fernando Sabino

http://pensador.uol.com.br/autor/fernando_sabino/

ix

Dedico esta tese aos meus queridos e amados pais

Sebastião e Luzia.

xi

Agradecimentos pessoais

Aos meus pais e meus irmãos pelo apoio irrestrito durante esses anos.

Agradeço a todos os amigos, colegas e conhecidos que passaram grande parte do seu

tempo dividindo experiências, conhecimento e pontos de vistas.

Aos amigos Drª Daniele Oshita pelos vários esclarecimentos, a Marcelo Passos e Cecília

por toda ajuda durante esses anos, às Drªs Carla Grazieli e Mare Ponce pela companhia

nos vários dias de bandeco e pelas sugestões na melhoria da tese.

Aos amoreiros por toda receptividade em especial, às casas P12A, I10A e D4.

Aos amigos Dr. Fernado Quites, Marcio Santana, Gisele, Claudionor Valério, Guilherme

Godoi, Ms Douglas, Edna, Van, Aline Coelho, pelas alegrias compartilhadas.

Ao coral Zíper na boca pela libertação da alma através do canto.

Aos técnicos Ricardo, Rita, Lucília e Priscila, por tudo que me ensinaram durante a minha

permanência no IQ/UNICAMP.

Aos professores Drs. Fracassi e Lauro Kubota por permitirem minha participação como

PED voluntário.

Ao Dr. Gustavo Heiden pela coleta e identificação das primeiras amostras de carqueja.

Ao Dr. Ílio Montanari e ao CPQBA pelas amostras utilizadas como modelo para o

desenvolvimento dos métodos.

À banca do meu exame de qualificação pelas contribuições para a melhora do trabalho.

À ANPG pela luta constante pela saúde, educação, ciência e tecnologia e, sobretudo por

uma política de valorização das bolsas de pós-graduação e pelos direitos sociais dos pós-

graduandos.

Ao povo brasileiro por pagar seus impostos e permitir ao Congresso Nacional destinar

recursos aos Ministérios da Educação e Ciência e Tecnologia onde estão a Capes e o

CNPq, principais agências de fomento à pesquisa e inovação.

Aos paulistas por pagarem seus impostos e permitir que uma parte dos recursos sejam

destinados à Fapesp.

À Capes e INCT-Bioanalítica /CNPq pelas bolsas concedidas.

À Dra. Carla Beatriz Grespan Bottoli pelas correções realizadas na tese e pelo vínculo

institucional.

À banca pelo aceite deste convite.

Ao Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Madri, pela parceria realizada.

xiii

Currículo

1 Formação acadêmica (graduação e Pós-graduação):

2012-2013: Doutorado Sanduíche

Universidade Autônoma de Madri (Consejo Superior de Investigaciones Científicas

CSIC/ Foodomics).

Título: Caracterização e identificação de antioxidantes em extrato de carqueja

empregando técnicas de extração e de separação avançadas.

Supervisor: Alejandro Cifuentes.

Bolsista do(a): Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento, CNPq, Brasil.

2009-2014: Doutorado em Química

Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP, Brasil.

Título: Determinação de compostos fenólicos em extrato de carqueja empregando técnicas

cromatográficas e eletroforéticas.

Orientadora: Carla Beatriz Grespan Bottoli.

Bolsista do(a): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES,

Brasil.

2006 -2009: Mestrado em Química.

Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP, Brasil.

Título: Síntese de β-piperonil-ϒ-butirolactona e β-lactamas utilizando reações de Morita-

Baylis-Hillman.

Orientador: Fernando Antônio Santos Coelho.

Bolsista do(a): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES,

Brasil.

2001 – 2005: Graduação em Licenciatura em Química. Universidade Estadual Paulista

Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil.

2 Produção científica:

2.1 Artigos

1. Trazzi, Giordano; André, Marcelo Fabiano; Coelho, F. Diastereoselective

synthesis of β-piperonyl-γ-butyrolactones from Morita-Baylis-Hillman adducts. Highly

efficient synthesis of (±)-yatein, (±)-podorhizol and (±)-epi-podorhizol. Journal of the

Brazilian Chemical Society (Online) , v. 21, p. 2327-2339, 2010.

http://www.csic.es/

xiv

2.2 Resumos publicados em anais de congresso

1. André, Marcelo Fabiano; Silva, R.F.; Oliveira, K.J.; Silva, D.H.; Moro,V.R.

“Super pilha” (bateria) de batata doce, 13°SIMPEQ, Campinas, Brasil, 2014.

2. André, Marcelo Fabiano; Silva,G. M. S.; Carvalho, L. R. O.; Silva, F. R. Água

potável: uma questão de saúde, 13 SIMPEQ, Campinas, Brasil, 2014.

3. André, Marcelo Fabiano; Bottoli, C. B. G.; Cavalho, L. M. Identificação de

alguns antioxidantes em folhas de Baccharis trimera Less DC empregando UPLC-MS/MS. In:

34ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Florianópolis. 34ª Reunião Anual da

SBQ, 2011.

4. André, Marcelo Fabiano; Bottoli, C. B. G. Extraction of antioxidants from leaves

de Baccharis trimera Less DC using CE. In: 16th Latin- American Symposium, Florianópolis,

SC, Brasil, 2010.

5. André, Marcelo Fabiano; Coelho, F. A. S. Diastereosseletividade na adição do

tipo Michael de aminas em adutos de Morita-Baylis-Hillman. 31ª Reunião Anual da Sociedade

Brasileira de Química, Águas de Lindóia, SP, Brasil, 2008.

6. André, Marcelo Fabiano. A matéria pode ser transformada? V Evento de

Educação em Química, Unesp, Araraquara, SP, Brasil, 2007.

7. André, Marcelo Fabiano; Coelho, F. A. S Studies toward the steroselective

synthesis of lignans, 12th Brazilian Meeting Organic Synthesis, Itapema, SC, Brasil, 2007.

3 Outros

1. Participação voluntária PIBIC Jr., no período de setembro a novembro de 2011,

por acreditar na idéia de popularização da ciência.

2. Participação voluntária do Programa de Estagio Docência (PED), no 2º

semestre de 2011, para adquirir experiência didática no ensino de nível superior.

3. Participação do Programa Ciências sem fronteiras, período Junho/12 a Maio/13

(doutorado sanduíche).

xv

RESUMO



Antioxidantes naturais são metabólitos secundários presentes em uma gama variada de

plantas medicinais com propriedades específicas. Podem apresentar ação tranqüilizante,

analgésica, antiinflamatória, citotóxica, anticoncepcional, antimicrobiana, antiviral e

fungicida.Vários metabólitos secundários são conhecidos. Os três principais grupos são os

terpenos, os polifenóis (flavonóides) e os alcalóides. A carqueja [Baccharis Trimera (Less)

DC] foi escolhida por apresentar em sua composição vários compostos fenólicos

(antioxidantes). O trabalho foi realizado em duas etapas, a saber, a primeira etapa foi

realizada no Brasil, e teve como objetivo, o desenvolvimento e validação de métodos para

determinação de compostos fenólicos (ácidos fenólicos e flavonóides) em extrato de carqueja

empregando técnicas cromatográficas e eletroforéticas e análise de algumas amostras

comerciais de diferentes regiões. A segunda etapa foi realizada na Espanha, tendo como

objetivo o desenvolvimento e validação do método empregando a técnica de extração com

líquido pressurizado (PLE), considerada avançada e verde e também a técnica de separação

eletroforese capilar acoplada a um espectrômetro de massas (CE-ESI-TOF). Também na

Espanha, foi realizada a determinação de fenóis totais e atividade antioxidante empregando

os ensaios de Folin e DPPH, respectivamente. O desenvolvimento e preparo de amostra

incluiu a otimização das etapas de extração e hidrólise dos compostos fenólicos presentes na

carqueja, além de uma etapa de limpeza para a remoção de interferentes com a técnica de

extração em fase sólida (SPE). Os métodos foram validados segundo orientações da

ANVISA. Foram analisadas amostras comerciais de carqueja de três estados, a saber, São

Paulo, Minas Gerais e Bahia. Nestas amostras foram detectados e quantificados ácido

gálico, ácido cafeico, ácido ferúlico, rutina, quercetrina, ácido rosmarínico e canferol. A

amostra orinda da Bahia apresentou o maior teor de concentração dos compostos fenólicos

estudados. Comparando a concentração destes compostos nas diferentes amostras, obtida

por UHPLC-MS/MS e HPLC-UV, ao nível de 5% de significância, não houve diferença

significativa entre as técnicas.

xvii

ABSTRACT

"DETERMINATION OF PHENOLIC COMPOUNDS IN EXTRACT CARQUEJA USING

CHROMATOGRAPHIC TECHNIQUES AND ELETROPHORESIS"

Natural antioxidants are secondary metabolites in a wide range of medicinal plants with

specific properties. Many present action tranquilizer, analgesic, anti-inflammatory, cytotoxic,

contraceptive, antimicrobial, antiviral and fungicidal action. Several secondary metabolites are

known. The three main groups are terpenes, polyphenols (flavonoids) and alkaloids. Carqueja

[Baccharis Trimera (Less) DC] was chosen because it has in its composition various phenolic

compounds (antioxidants). The work was carried out in two stages, namely, the first step was

made in Brazil, and aimed at the development and validation of methods for the determination

of phenolic compounds (phenolic acids and flavonoids) in gorse extract using

chromatographic and electrophoretic techniques, with analysis of some commercial samples

from different regions. The second stage was conducted in Spain, having as objective the

development and validation of the method using the technique of pressurized liquid extraction

(PLE), considered an advanced and green process and also the technique capillary

electrophoresis coupled to mass spectrometry (CE-ESI-TOF). The determination of total

phenols and antioxidant activity assays employed Folin and DPPH reactions. The

development and sample preparation steps included the optimization of the extraction and

hydrolysis of phenolic compounds present in the carqueja, as well a cleaning for removal of

interfering usingmsolid phase extraction technique. The methods were validated the

according to the guidelines of ANVISA. Commercial samples of carqueja were analyzed from

three states, namely São Paulo, Minas Gerais and Bahia.In these samples were detected and

quantified gallic acid, caffeic acid, ferulic acid, rutin, quercetrin, rosmarinic acid and

kaempferol. The sample from Bahia presented the highest level of averaged concentration of

the phenolic compounds studied. Comparing the concentrations of these compounds in

different samples by UHPLC-MS / MS and HPLC-UV at the 5% level of significance, there

was no significant difference between the techniques.

xix

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS E ACRÔNIMOS xxiii

LISTA DE TABELAS xxv

LISTA DE FIGURAS xxvii

Capítulo 1 Introdução 3

Capítulo 2 Objetivos 9

2.1 Geral 9

2.1.1 No Brasil 9

2.1.2 Na Espanha 9

2.2 Objetivos específicos 9

2.2.1 No Brasil 9

2.2.2 Na Espanha 9

Capítulo 3. Revisão Bibliográfica 13

3.1 Aspectos históricos sobre a carqueja 13

3.2 Flavonóides: definição e rota biossintética 14

3.3 Técnicas de extração de flavonóides e ácidos fenólicos 18

3.3.1 Extração com soxhlet 18

3.3.2 Extração assistida por microondas 20

3.3.3 Extração assistida por ultrassom 20

3.3.4 Extração com fluído supercrítico 21

3.3.4.1 Extração Aquosa Subcrítica 22

3.3.5 Extração com líquido pressurizado (PLE) 22

3.3.6 Extração em fase sólida (SPE) 23

3.4 Principais técnicas de separação e quantificação de compostos fenólicos 25

3.4.1 Cromatografia líquida de alta eficiência 26

3.4.1.1 Cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas 26

3.4.1.2 Cromatografia líquida de ultra eficiência 31

3.4.1.2.1 Coluna Acquity BEH ( Ethylene Bridged Hybrid) 32

3.4.1.2.2 Transferência de métodos de HPLC para UHPLC 34

3.4.2 Eletroforese capilar 34

3.4.2.1 Principais conceitos eletroforéticos 38

3.4.2.1.1 Mobilidade eletroforética e mobilidade aparente 38

xx

3.4.2.1.2 Fluxo eletroosmótico (FEO) 39

3.4.2.2 Eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas 41

3.4.3 Interfaces utilizadas para acoplamento CE-MS 42

3.4.3.1 Interface com eletrospray (ESI) 42

3.4.3.2 Interface com líquido auxiliar (coaxial sheath liquid) 43

3.4.3.3 Interface sem líquido auxiliar (sheathless) 44

3.4.3.4 Interface com junção líquida (liquid junction) 45

Capítulo 4. Materiais e métodos 49

4.1 Reagentes 49

4.1.1 Utilizados no Brasil 49

4.1.2 Utilizados na Espanha 49

4.2 Equipamentos 49

4.3 Coleta e preparo do material vegetal 51

4.4 Preparação de soluções padrão dos compostos fenólicos 52

4.5 Preparo da amostra e extração dos compostos fenólicos 53

4.5.1 Extração com soxhlet 53

4.5.2 Extração com líquido pressurizado 58

4.6 Avaliação da atividade antioxidante dos extratos 59

4.6.1 Determinação de fenóis totais 59

4.6.2 Capacidade antioxidante usando ensaio DPPH 61

4.7 Condições eletroforéticas empregando detecção UV-VIS 62

4.7.1 Equipamento 1 62


4.8 Condições eletroforéticas empregando detecção CE-ESI-TOF-MS/MS 63

4.9 Condições cromatográficas de separação por HPLC-UV 64



4.10 Condições cromatográficas de separação por UHPLC-MS/MS 64

4.11 Efeito Matriz 65

4.12 Validação dos métodos 66

4.12.1 Seletividade 66

4.12.2 Linearidade 66

xxi

4.12.3 Limites de detecção e quantificação 67

4.12.4 Precisão 67

4.12.5 Exatidão 67

4.12.6 Determinação das concentrações dos compostos fenólicos 67

Capítulo 5. resultados e discussão 71

5.1 Otimização da separação cromatográfica dos compostos fenólicos 71

5.2 Extração dos compostos fenólicos 81

5.3 Validação do método 89

5.4 Determinação dos compostos fenólicos por UHPLC-MS/MS 92

5.4.1 Otimização da separação cromatográfica 92

5.4.2 Efeito matriz 95

5.4.3 Validação do método 99

5.5 Comparação entre as técnicas cromatográficas HPLC-UV x UHPLC-MS/MS 101

5.6 Análise de amostras comerciais empregando a técnicas cromatográficas

HPLC-UV x UHPLC-MS/MS 102

5.7 Otimização da separação dos compostos fenólicos por CE-UV 108

5.8 Desenvolvimento de método para quantificação dos compostos fenólicos por

CE-ESI-TOF/ MS 112

5.8.1 Extração e caracterização funcional dos polifenóis 112

5.8.2 Otimização da separação eletroforética 114

5.8.3 Validação do método 116

5.8.4 Determinação da concentração de compostos fenólicos presentes na

amostra 119

Capítulo 6. Conclusões 125

6.1 Sugestões futuras 126

xxiii

LISTA DE ABREVIATURAS E ACRÔNIMOS

ACN Acetonitrila

AS Fator de assimetria

CE Eletroforese capilar, do inglês “Capillary electrophoresis”

CE-MS Eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas, do inglês “Capillary

electrophoresis coupled mass spectrometry”

CPQBA Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas

DAD Detector por arranjo de diodos, do inglês “Photodiodo Array Detection”

DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazila, do inglês “2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl”

DPR Desvio padrão relativo

EtOH Etanol

Et2O Éter

ESI Ionização por eletrospray, do inglês “Electrospray ionization”

HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência, do inglês “High Performance Líquid

Chromatography”

HPLC-DAD Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada com detector por arranjo de

diodos, do inglês “High Performance Chromatography coupled diodo array detection”

HPLC-UV Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada com detector ultravioleta, do

inglês “High Performance Chromatography coupled ultraviolet detection”

LD Limite de detecção

LQ Limite de quantificação

MeOH Metanol

MS Espectrometria de massas, do inglês “Mass Spectrometry”

m/z razão massa/carga

n número de replicatas

PLE Extração com líquido pressurizado, do inglês “Pressurized Liquid

Extraction”

R2 coeficiente de correlação

SIM Monitoramento do íon-seletivo, do inglês “Selected íon monitoring”

SFE Extração com fluído supercrítico, do inglês “Supercritical Fluid Extraction”

SPE Extração em fase sólida, do inglês “Solid Phase Extraction”

UHPLC Cromatografia líquida de ultra eficiência, do inglês “Ultra High Performance

Liquid Chromatography”

UHPLC-MS/MS Cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de

massas sequencial, do inglês “ Ultra High Performance Liquid Chromatography with tandem

mass spectrometry”

UV Ultraviolet

TOF Analisador por tempo de voo, do inglês “Time of flight”

xxv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Alguns exemplos de aplicação de métodos para a determinação de

compostos fenólicos 25

Tabela 2: Condições experimentais da otimização dos tempos de extração e hidrólise 54

Tabela 3: Condições cromatográficas para separação dos compostos fenólicos 72

Tabela 4: Condições experimentais da eluição por gradiente 79

Tabela 5: Condiçõe experimentais de transferência do método para o equipamento 4 87

Tabela 6: Parâmetros das curvas analíticas para todos os antioxidantes empregando

HPLC-UV 91

Tabela 7: Exatidão e precisão para ácido gálico, ácido cafeico, ácido ferúlico, rutina,

quercetrina, ácido rosmarínico e canferol 91

Tabela 8: Confirmação das transições buscadas nos extratos de carqueja 94

Tabela 9: Parâmetros das curvas analíticas para os compostos fenólicos empregando

UHPLC-MS/MS 99

Tabela 10: Exatidão e precisão para o ácido gálico, ácido cafeico, ácido ferúlico, rutina,

quercetrina, ácido rosmarínico e canferol (expressos como %DPR) 100

Tabela 11: Comparação entre os métodos HPLC x UHPLC 101

Tabela 12: Quantificação dos compostos fenólicos ácido gálico, ácido cafeico, ácido

ferúlico, rutina, quercetrina, ácido rosmarínico e canferol em diferentes amostras de

carqueja 104

Tabela 13: Comparação entre as concentrações de ácido gálico presentes na amostra

comercial (SP2) empregando as técnicas de UHPLC e HPLC 105

Tabela 14: Análise de Variância com um fator (ANOVA) para o ácido gálico presente

nas diferentes amostras de carqueja 106

Tabela 15: Comparação entre as concentrações de ácido gálico presente na carqueja

nas diferentes regiões brasileiras 107

Tabela 16: Otimização da separação dos compostos fenólicos 109

Tabela 17: Valores de rendimento de extração, atividade antioxidante, e fenóis totais

obtidos para diferentes procedimentos de extração 113

Tabela 18: Parâmetros de desempenho quantitativo para padrões de antioxidantes e

LD e LQ de rutina, quercetrina, ácido ferúlico e ácido cafeico 118

Tabela 19: Recuperação e repetibilidade dos ensaios em três níveis de fortificação 119

xxvi

Tabela 20: Quantificação dos compostos fenólicos rutina, e ácido ferúlico (expressos

como (mg/g planta) 121

xxvii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Levantamento de publicações para as palavras chaves antioxidantes naturais 3

Figura 2: Esqueletos de base a partir dos quais os compostos fenólicos de origem

vegetal derivados 5

Figura 3: Baccharis trimera less DC: (A) estágio vegetatito (B) ramos de inflorescência 14

Figura 4: Estrutura básica dos flavonóides (núcleo flavan) 15

Figura 5: Biossíntese dos flavonoides (adaptado de Marques, 2008) 17

Figura 6: Sistema de extração com soxhlet 19

Figura 7: Fenômeno da cavitação (adaptado de Suslick, K.J.) 21

Figura 8: Etapas envolvidas na SPE: condicionamento do sorvente, adição da amostra,

remoção dos interferentes e eluição do analito 24

Figura 9: Representação genérica da obtenção do espectro de massas 27

Figura 10: Esquema geral dos componentes de um espectrômetro de massas 27

Figura 11: Esquema de um analisador triploquadrupolo 30

Figura 12: Reação química para síntese de sílica híbrida de segunda geração com

ponte de etano 32

Figura 13: Esquema dos diferentes tipos de fases estacionárias quimicamente ligadas

ao suporte híbrido BEH 33

Figura 14: Representação esquemática do sistema de CE 35

Figura 15: Dupla camada elétrica na parede do capilar e a criação do fluxo

eletroosmótico 39

Figura 16: Perfis de velocidade dos fluxos produzidos por (A) campo elétrico e (B)

pressão 41

Figura 17: Interface CE-ESI-MS com líquido auxiliar 43

Figura 18: Interface ortogonal CE-ESI-MS com líquido auxiliar 44

Figura 19: Interface CE-ESI-MS sem líquido auxiliar. O filme depositado está

representado pela parte escura 45

Figura 20: Interface CE-ESI-MS com junção líquida 46

Figura 21: Fluxograma da preparação do material vegetal 52

Figura 22: Estruturas químicas dos compostos fenólicos em estudo 53

Figura 23: Fluxograma da extração com soxhlet 57

Figura 24: Fluxograma da extração com líquido pressurizado 59

Figura 25: Fluxograma para a determinação de fenóis totais 60

Figura 26: Fluxograma para a determinação da atividade antioxidante 62

Figura 27: Espectro de UV-vis em MeOH:H2O (50:50 v/v) 71

Figura 28: Cromatograma da solução padrão dos compostos fenólicos obtidos com

fase móvel MeOH: H2O (pH 4,3) (50:50 v/v) 1. ácido rosmarínico, 2. miracetina, 3.

canferol, 4. quercetina, 5. ácido cafeico, 6. ácido ferúlico , 7. catequina, 8. fisetina, 9.

quercetrina. Concentração: 30 mg L-1. Condições cromatográficas: coluna Agilent

Zorbax-SB- C-18 3,5 µm (100 x 4,6 mm d.i.). Fase móvel: MeOH : H2O (pH 4,3) (50:50

v/v). Vazão: 0,7 mL min-1. Detecção: UV à 270 nm. Volume de injeção: 20 µL 74


xxviii

fase móvel MeOH: H2O (pH 4,3 ) (60:40 v/v): 1. ácido rosmarínico, 2. miracetina, 3.

canferol, 4. quercetina, 5. ácido cafeico, 6. ácido ferúlico , 7. catequina, 8. fisetina, 9.

quercetrina. Concentração: 30 mg L-1. Condições cromatográficas: coluna Agilent

Zorbax-SB-C-18 3,5 µm (100 x 4,6 mm d.i.). Fase móvel: MeOH : H2O (pH 4,3) (60:40

v/v). Vazão: 0,7 mL min-1. Detecção: UV à 270 nm. Volume de injeção: 20 µL

75


fase móvel MeOH: H2O (pH 9,0) (50:50 v/v) em: 1. fisetina, 2. miracetina, 3. ácido

rosmarínico, 4. catequina, 5. ácido cafeico, 6. ácido ferúlico, 7. quercetina, 8.

quercetrina, 9. canferol. Concentração: 30 mg L-1. Condições cromatográficas: coluna

Agilent Zorbax-SB-C-18 3,5 µm (100 x 4,6 mm d.i.). Fase móvel: MeOH : H2O (pH 9,0)

(50:50 v/v). Vazão: 0,7 mL min-1. Detecção: UV à 270 nm. Volume de injeção: 20 µL 76


fase móvel MeOH: H2O (pH 9,0) (60:40 v/v) em: 1. fisetina, 2. miracetina, 3. ácido


quercetrina, 9. canferol. Concentração: 30 mg L-1 .Condições cromatográficas: coluna

Agilent Zorbax-SB- C-18 3,5 µm (100 x 4,6 mm d.i.). Fase móvel: MeOH : H2O (pH 9,0)



fase móvel MeOH: H2O (pH 8,0) (55:45 v/v): 1. fisetina, 2. miracetina, 3. ácido


quercetrina, 9. canferol. Concentração: 30 mg L-1. Condições cromatográficas: coluna

Agilent Zorbax-SB-C-18 3,5 µm (100 x 4,6 mm d.i.). Fase móvel: MeOH : H2O (pH 8,0)


Figura 33: Cromatograma dos padrões dos compostos fenólicos. Solução padrão: 1.

ácido gálico, 2. ácido cafeico, 3. ácido ferúlico, 4. rutina , 5. quercetrina , 6. ácido

rosmarínico , 7. canferol . Condições experimentais: coluna Agilent ZORBAX-SB-C18

3,5 µm (100 x 4,6 mm d.i.). Fase móvel: A= H2O (pH 2, 65) e B= MeOH . Gradiente:

30% a 40% B em 3 min; 40% a 60 % B em 4 min; 60 % a 80 % em 5 min; 80% a 90%

em 5min; 90 % a 100% em 7 min; 100% por 4 min; 100% a 50% em 1 min; 50% a 30 %

em 1 min. Vazão: 1,0 mL min-1. Detecção: DAD à 270 nm. Volume de injeção: 10 µL 81

Figura 34: Cromatogramas dos extratos de carqueja obtidos com diferentes solventes

de extração: Condições de extração: 30 min extração, 30 min de hidrólise e 2,0 mL de

solvente de eluição. Solução padrão: 1. ácido gálico, 2. ácido cafeico , 3. ácido ferúlico ,

4. rutina, 5. quercetrina, 6. ácido rosmarínico, 7. canferol. Condições experimentais:

coluna Agilent ZORBAX-SB-C18 3,5 µm (100 x 4,6 mm d.i.). Fase móvel: A= H2O (pH 2,

65) e B= MeOH . Gradiente: 30% a 40% B em 3 min; 40% a 60 % B em 4 min; 60 % a

80 % em 5 min; 80% a 90% em 5min; 90 % a 100% em 7 min; 100% por 4 min; 100% a

50% em 1 min; 50% a 30 % em 1 min. Vazão: 1,0 mL min-1. Detecção: DAD à 270 nm.

Volume de injeção: 20 µL 83

Figura 35: Hidrólise ácida do glicosídeo da rutina (mecanismo proposto) 84

Figura 36: Cromatogramas dos extratos de carqueja obtidos com diferentes solventes

de extração: Condições de extração: 30 min extração, 30 min de hidrólise e 4,0 mL de

xxix

solvente de eluição. Solução padrão: 1. ácido gálico, 2. ácido cafeico, 3. ácido ferúlico,

4. rutina, 5. quercetrina, 6. ácido rosmarínico, 7. canferol. Condições experimentais:

coluna Agilent ZORBAX-SB-C18 3,5 µm (100 x 4,6 mm d.i.). Fase móvel: A= H2O (pH 2,

65) e B= MeOH . Gradiente: 30% a 40% B em 3 min; 40% a 60 % B em 4 min; 60 % a

80 % em 5 min; 80% a 90% em 5min; 90 % a 100% em 7 min; 100% por 4 min; 100% a

50% em 1 min; 50% a 30 % em 1 min. Vazão: 1,0 mL min-1. Detecção: DAD à 270 nm.

Volume de injeção: 20 µL

85

Figura 37: Cromatograma da mistura de antioxidantes no modo scan: A) SPE com

Acetona como solvente de eluição. B) SPE com éter como solvente de eluição.1. ácido

gálico (m/z,169, M-, 25%), 2. ácido cafeico (m/z, 179, M-, 65%); 3. ácido ferúlico (m/z,

193, M-, 30%), 4. rutina (m/z,609, M-, 20%), 5 quercetrina (m/z, 447, M-, 38%), 6 ácido

rosmarínico (m/z,359, M-, 50%), 7. canferol (m/z, 285, M-, 100%): Condições

experimentais: coluna Waters Acquity UPLC BEH C-18 1,7 μm (21x 50 mm d.i.); Fase

móvel: A= H2O (0,1% ácido fórmico) e B= ACN (0,1% ácido fórmico). Gradiente: 3% B

por 1 min; 3% a 15% B em 4 min; 15% a 40% em 3 min; 40% a 3% em 1 min. Vazão:

0,350 mL min-1. Modo de Ionização: ESI- (ionização por eletronebulização no modo

negativo, 30 kV). Volume de injeção: 3 μL. Detecção: espectrômetro de massas

hexapolar. 86

Figura 38: Cromatogramas com os padrões dos compostos fenólicos. Solução padrão:

1. ácido gálico, 2. ácido cafeico, 3. ácido ferúlico, 4. rutina, 5. quercetrina, 6. ácido

rosmarínico, 7. canferol. Condições experimentais: coluna Agilent Zorbax-SB-C-18 3,5

µm (100 x 4,6 mm d.i.). Fase móvel: A= H2O (pH = 2,65) e B= MeOH . Gradiente: 15% a

30% B em 5 min; 30% a 40 % B em 1 min; 40% B por 7min; 40% a 60% B em 2 min; 60

% a 80 B % em 2 min; 80 a 100% B em 1 min; 100% a 15% em 2 min; 15% B durante 3

min. Vazão: 1.0 mL min-1. Detecção : UV à 270 nm. Volume de injeção : 10 µL 89

Figura 39: Cromatograma do extrato metanólico de carqueja in natura fortificado com

padrões dos compostos fenólicos: 1. ácido gálico (37,5 µg mL-1), 2. ácido cafeico (18,8

µg mL-1), 3. ácido ferúlico (30,0 µg mL-1), 4. rutina (62,5 µg mL-1), 5. quercetrina (36,4 µg

mL-1), 6. ácido rosmarínico (60,0 µg mL-1), 7. Canferol (12,5 µg mL-1). Condições

experimentais: coluna Agilent Zorbax-SB-C-18 3,5 µm (100 x 4,6 mm d.i.) Agilent. Fase

móvel: A= H2O (pH = 2,65) e B= MeOH . Gradiente: 15% a 30% B em 5 min; 30% a 40

% B em 1 min; 40% por 7min; 40% a 60% B em 2 min; 60 % a 80 B % em 2 min; 80 a

100% B em 1 min; 100% a 15% em 2 min; 15% B durante 3 min. Vazão: 1,0 mL min-1.

Detecção : UV à 270 nm. Volume de injeção : 10 µL 90

Figura 40: Cromatograma da mistura de antioxidantes no modo scan: 1. ácido gálico

(m/z,169, M-, 25%), 2. ácido cafeico (m/z, 179, M-, 65%); 3. ácido ferúlico (m/z, 193, M-,

30%), 4. rutina (m/z,609, M-, 20%), 5 quercetrina (m/z, 447, M-, 38%), 6 ácido

rosmarínico (m/z,359, M-, 50%), 7. canferol (m/z, 285, M-, 100%): Condições

experimentais: coluna Waters Acquity UPLC BEH C-18 1,7 μm (21x 50 mm d.i.); Fase

móvel: A= H2O (0,1% ácido fórmico) e B= ACN (0,1% ácido fórmico). Gradiente: 3% B

por 1 min; 3% a 15% B em 4 min; 15% a 40% em 3 min; 40% a 3% em 1 min. Vazão:

0,350 mL min-1. Modo de Ionização: ESI- (ionização por eletronebulização no modo 93

xxx

negativo, 30 kV). Volume de injeção: 3 μL. Detecção: espectrômetro de massas

hexapolar

Figura 41: Cromatograma do extrato de carqueja: 1. ácido gálico (m/z,169, M), 2. ácido

cafeico (m/z, 179, M-); 3. ácido ferúlico (m/z, 193, M-), 4. rutina (m/z,609, M-), 5

quercetrina (m/z, 447, M-): Condições experimentais: coluna Waters Acquity UPLC BEH

C-18 1,7 μm (21x 50 mm d.i.); Fase móvel: A= H2O (0,1% ácido fórmico) e B= ACN

(0,1% ácido fórmico). Gradiente: 3% B por 1 min; 3% a 15% B em 4 min; 15% a 40%

em 3 min; 40% a 3% em 1 min. Vazão: 0,350 mL min-1. Modo de Ionização: ESI-

(ionização por eletronebulização no modo negativo, 30 kV). Volume de injeção: 10 μL.

Detecção :espectrômetro de massas hexapolar 95

Figura 42: Efeito matriz dos analitos utilizando UHPLC-MS/MS. Curvas analíticas

construídas a partir de soluçõe padrões de compostos fenólicos no extrato da matriz em

solvente. 97

Figura 43: Percentual do efeito matriz (%) empregando UHPLC-MS/MS, 1. ácido gálico,

2. ácido cafeico, 3. ácido ferúlico, 4. rutina, 5. quercetrina, 6. ácido rosmarínico, 7

canferol. 98

Figura 44: Cromatograma do extrato de carqueja: A) amostra comercial de Campinas

(SP2). B) amostra comercial da Bahia (BA) e C) amostra comercial de Minas gerais

(MG) 1. ácido gálico (m/z,169, M), 2. ácido cafeico (m/z, 179, M-); 3. ácido ferúlico (m/z,

193, M-), 4. rutina (m/z,609, M-), 5 quercetrina.(m/z, 447, M-), 7. canferol (m/z, 285, M-,

100%): Condições experimentais: coluna Waters Acquity UPLC BEH C-18 1.7 μm (21x

50 mm d.i.); Fase móvel: A= H2O (0,1% ácido fórmico) e B= ACN (0,1% ácido fórmico).

Gradiente: 3% B por 1 min; 3% a 15% B em 4 min; 15% a 40% em 3 min; 40% a 3% em

1 min. Vazão: 0,350 mL min-1. Modo de Ionização: ESI- (ionização por eletronebulização

no modo negativo, 30 kV). Volume de injeção: 10 μL. Detecção :espectrômetro de

massas hexapolar.

103

Figura 45: Eletroferograma da mistura de padrões dos compostos fenólicos. 1. rutina ,

2.quercetrina, 3. canferol , 4. ácido ferúlico, 5. ácido rosmarínico , 6. ácido cafeico, 7.

ácido gálico. Condições eletroforéticas: capilar Agilent 50 µm d.i. Comprimento efetivo:

40 cm. Tampão: tetraborato de sódio 10-40 mmol L-1, pH 9,4 injeção hidrodinâmica: 10s,

50 mbar. Potencial: 20 kV. Detecção: DAD em 270 nm

110

Figura 46: Eletroferograma do extrato de carqueja fortificado com padrões dos

compostos fenólicos. 1. rutina (6,25 µg mL-1), 2.quercetrina (6,25 µg mL-1), 3. canferol

(6,25 µg mL-1), 4. ácido ferúlico (6,25 µg mL-1), 5. ácido rosmarínico (12,5 µg mL-1), 6.

ácido cafeico (6,25 µg mL-1), 7. ácido gálico (6,25 µg mL-1). Condições eletroforéticas:

capilar Agilent 50 µm d.i. Comprimento efetivo: 40 cm. Tampão: tetraborato de sódio 10

mmol·L-1 (10% MeOH), pH 10,0, injeção hidrodinâmica: 10s, 50 mbar. Potencial: 20 kV.

Detecção: DAD em 270 nm 111

Figura 47: Eletroferograma da mistura de compostos fenólicos: 1. rutina, 2. quercetrina,

3. ácido ferúlico, 4. ácido cafeico.Concentração:1,25 µg mL-1.Condições eletroforéticas:

capilar 50 µm di. Comprimento efetivo: 85 cm. Tampão: NH4HCO3, CH5NO2 e

CH3COONH4, pH 10, injeção hidrodinâmica: 10s, 50 psi. Potencial: 27 kV. Detecção: 116

xxxi

ESI-TOF. Condições ESi: líquido auxiliar composto por 2-propanol-água (50:50 v/v) a

um fluxo de 0,24 mL·h-1; gás de secagem fluxo de 4 L·min-1 a 250ºC, pressão de gás

nebulizador de 4,00 psi.

Figura 48: Eletroferograma do extrato metanólico de carqueja in natura (1 e 3) e

fortificado com padrões (1+Pd e 3+Pd) de compostos fenólicos, onde: 1. rutina, 3. ácido

ferúlico. Concentração: 1,25 µg·mL-1. Condições eletroforéticas: capilar 50 µm id.

Comprimento efetivo: 85 cm. Tampão: NH4HCO3, CH5NO2 e CH3COONH4, pH 10,

injeção hidrodinâmica: 10s, 50 psi.Potencial: 27kV. Detecção: ESI-TOF. Condições ESi:

líquido auxiliar composto por 2-propanol-água (50:50 v/v) a um fluxo de 0,24 mL·h-1; gás

de secagem fluxo de 4 L·min-1 a 250ºC, pressão de gás nebulizador de 4,00 psi 117

Figura 49: Eletroferograma do extrato purificado por SPE, onde 1 representa o canal

correspondente ao monitoramento da transição m/z 609, correspondente ao composto

fenólico rutina e 3 representa o canal correspondente ao monitoramento da transição

m/z 193, correspondente ao composto fenólico ácido ferúlico.Condições eletroforéticas:

capilar 50 µm di. Comprimento efetivo: 85 cm. Tampão: NH4HCO3,CH5NO2 e

CH3COONH4, pH 10, injeção hidrodinâmica: 10s, 50 psi. Potencial: 27kV. Detecção:

ESI-TOF. Condições ESI: líquido auxiliar composto por 2-propanol-água (50:50 v/v) a

um fluxo de 0,24 mL·h-1; gás de secagem fluxo de 4 L·min-1 a 250ºC, pressão de gás

nebulizador de 4,00 psi 120

Tese de doutorado Marcelo Fabiano André

1

Capítulo 1

Introdução


2


3

Capítulo 1. Introdução

Várias substâncias de origem vegetal despertam interesse da comunidade científica,

por apresentarem compostos antioxidantes em sua composição e dentro deste contexto,

podem-se citar: frutas1, legumes2 e plantas medicinais3, 4.

A Figura 1 apresenta um levantamento a respeito do número de publicações com o tema

antioxidantes naturais. Os dados compilam apenas resultados da presente década (2009-

2014). A pesquisa foi realizada na base de dados SciFinder no dia 11 de Fevereiro de

2015, com as palavras chaves antioxidantes naturais5.

Figura 1: Levantamento de publicações para as palavras chaves antioxidantes naturais5.

Um antioxidante pode ser definido como “uma substância que, presente em baixas

concentrações quando comparado ao substrato oxidável, diminui significativamente ou

previne a oxidação daquele substrato”6. Os antioxidantes são compostos conhecidos por

reagirem com radicais livres e/ou espécies reativas de oxigênio, de forma a inativá-los,

prevenindo os danos oxidativos e, consequentemente, o desgaste celular. Muitos estudos

apontam o desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes como o causador de muitas

1 Block, G.; Patterson, B.; Subar, A. Nutr. Cancer 1992, 18, 1.

2 Amarowicz, R.; Pegg, R. B. Eur. J. Lipid Sci. technol. 2008, 110, 865.

3 Lago, J. H. G.; Romoff, P.; Fávero, O. A.; Souza, F. O.; Soares, M. G.; Baraldi, P. T.; Corrêa. F. O. Biochem.

Syst. Ecol. 2008, 36, 9, 737. 4 Sanjust, E.; Mocci, G.; Zucca, P.; Rescigno Nat. Prod. Res., 2008, 22, 8, 689.

5 https://scifinder.cas.org/scifinder/view/scifinder/scifinderExplore.jsf

6 Moon, J-K.; Shibamoto, T. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 1655.

2587

3339

3996

4523

3649 3803

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

Ano de publicação

N°

de P

ublic

ações

Antioxidantes Naturais

2009

2010

2011

2012

2013

2014


4

patologias, tais como: câncer7, infecção hepática8, envelhecimento9, artrite10, inflamação11,

diabetes12, parkinson13, alzheimer 12, 14 e aterosclerose15 .

Os compostos antioxidantes são metabólitos secundários de plantas. Os três principais

grupos de metabólitos secundários descritos na literatura são os terpenos, os alcalóides e

os polifenóis.2 Com algumas propriedades específicas, estes metabólitos agem na defesa

da planta contra diversos predadores e na atração ou repulsão de outros organismos.

Plantas da mesma espécie, cultivadas em diferentes localidades normalmente possuem

os mesmos componentes, mas as concentrações de compostos como os polifenóis,

podem diferir entre si16. Compostos fenólicos (fenóis simples e polifenóis) são um dos

mais importantes grupos de compostos antioxidantes presentes em plantas, onde estão

amplamente distribuídos. Os compostos fenólicos exibem um amplo espectro de

atividades biológica, incluindo efeitos antibacterianos, anti-inflamatório e antialérgico17. Os

flavonóides, uma das classes dos compostos polifenólicos presentes nas plantas, têm

interessado aos cientistas e indústrias de produtos manufaturados e consumo, uma vez

que eles ajudam a promover a manutenção da saúde e proteger de doenças cardíacas e

câncer18. Os flavonóides atuam como catalisadores na fase de luz da fotossíntese e ou

como reguladores de canais de ferro envolvendo fosforilação. Entretanto, eles têm a

propriedade de absorverem a radiação UV-B, protegendo as plantas e capturando os

radicais livres produzidos pela radiação solar19.

A forma de classificar os compostos fenólicos não está claramente estabelecida, e uma

possível classificação pode ser baseada no número de átomos de carbonos constituintes,

em conjunto com a estrutura do esqueleto de base fenólica, incluindo, por exemplo, fenóis

7 Paz-Elizur, T.; Sevilya, Z.; Leitner-Dagan, Y.; Elinger, D.; Roisman, L. C.; Liben, Z. Cancer Lett. 2008, 266, 60.

8 Preedy, V. R.; Reilly, M. E.; Mantle, D.; Peters, T. J. Int. Fed. Clin. Chem. 1998, 10, 16.

9 Liu, J.; Mori, A. Res. Commun. Biol. Psychol. Psychiat. Neurosci. 2006, 30-31, 103.

10 Colak, E. J. Med. Biochem. 2008, 27, 1.

11 Mukherjee, A.B.; Zhang, Z.; Chilton, B. S. Endocrine Rev. 2007, 28, 707.

12 Naito, Y.; Uchiyama, K.; Yoshikawa, T. Oxid. Stress Disease 2006, 21, 235.

13 Zhao, B. Neurochem. Res. 2009, 34, 630.

14 Patel, A. K.; Rogres, J. T.; Huang, X. Int. J. Clin Exp Med 2008, 1, 181.

15 Heinnecke, J. W. Curr. Opin. Lipidol. 1997, 8, 268.

16 Handbook of antioxidants, 2. Aufl., (Hrsg.: Cadenas, E.; Packet, L.); Dekker, M., 2002, New York.

17 Biesaga, M. J. Chromatogr. A 2011, 1218, 2505.

18 Arráez-Román, D.; Fu, S.; Sawalha, S. M. S.; Fernández-Gutiérrez, A. Electrophoresis 2010, 31, 2289.

19 Borella, J. C.; Duarte, D. P.; Novaretti, A. A. G.; Júnior, A. M.; França, S. C.; Rufato, C. B.; Santos, P. A. S.;

Veneziani, R. C. S.; Lopes, N. P. Rev. Bras. Farmacogn. 2006, 16, 4, 557.


5

simples, ácidos fenólicos, cumarinas, estilbenos e os flavonoides, como mostra a Figura

220.

Figura 2:. Esqueletos de base a partir dos quais os compostos fenólicos de origem vegetal

são derivados20.

Na busca por novas fontes naturais de antioxidantes que podem ser provenientes

de frutas18, algas21, grãos21, as plantas medicinais têm sido amplamente estudadas com

enfoque em sua atividade antioxidante21. A família Asteraceae apresenta um grande

número de espécies, que são utilizadas como plantas medicinais e a presença de várias

classes de metabólitos secundários faz considerar que a composição química é mais

importante do que a morfologia na evolução dessa família22.

A carqueja (Baccharis Trimera Less DC) é uma espécie originária da América do

Sul, seu uso mais descrito na literatura recai sobre suas ações no sistema digestivo,

especialmente funções hepáticas e biliares23, sendo objeto de extração devido à alta

demanda pela indústria de ervas 24,25.

20

Fernandéz, E. F.; Romero, M. G., Pancorbo, A. C. J. Pharmceut. Biomed. Anal. 2010, 53, 1130. 21

Exarchou,V.; Fiamegos, Y. C.; Van Beek, T. A.; Nanos, C.; Vervoort, J. J. Chromatogr. A 2006, 1112, 293. 22

Budel, J. M.; Duarte, M. R; Santos, C. A. M. Braz. J. Pharmacogn. 2004, 14, 1, 41. 23

Aldinia, G.; Regazzonia, L.; Pedrettia, A.; Carinia, M.; Chob, S-M.; Parkc, K-M.; Yeumd, K-J. J. Chromatogr. A

2011, 1218 2856. 24

Moon, J-K.; Shibamoto, T. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 1655.


6

A carqueja está entre as dez plantas medicinais mais comercializadas no Brasil e o

Paraná se destaca como seu maior produtor26,39. Em relação à sua atividade

farmacológica, vários estudos demonstraram atividade anti-inflamatória e também

antimutagênico26 em extratos aquosos e alcóolico (etanol).

Vários métodos têm sido utilizados para a extração de compostos fenólicos:

aqueles considerados clássicos, como por exemplo, maceração, soxhlet e infusão17,27,28, e

os métodos considerados modernos tais como, microondas17 e extração assistida por

ultrassom. Atualmente tende-se a considerar as técnicas contemporâneas como técnicas

verdes de extração, dentre as quais estão os fluídos supercríticos (SFE) e líquidos

pressurizados (PLE)29,30.

Entre as várias técnicas de separação utilizadas para a determinação de compostos

fenólicos em alimentos, estão: a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), a

cromatografia gasosa (CG)31,32,33,34,35 e a eletroforese capilar (CE), que surgiu como uma boa

alternativa dentre a técnicas de análise devido à rápida e eficiente separação e o baixo custo.

25

Paz-Elizur, T.; Sevilya, Z.; Leitner-Dagan, Y.; Elinger, D.; Roisman, L. C.; Liben, Z. Cancer Lett. 2008, 266, 60. 26

Oliveira, C. B.; Comunello, L. N.; Lunardelli, A.; Amaral, R. H.; Pires, M. G. S.; Silva, G. L.; Manfredini, V. Vargas, C. R.; Gnoatto, S. C. B.; Oliveira, J. R.; Gosmann, G. Molecules 2012, 17, 1113. 27

Maciel, M. A.; Pinto, A. C.; Veiga Jr.,V. F. Quim. Nova 2002, 25, 3, 429. 28

Carvalho, J. L. S.; Cunico, M. M.; Dias, J. F. G.; Miguel, M. D.; Miguel, O. G., Quim. Nova 2009, 32, 4, 1031. 29

Linares, I. B.; Arráez-Román, D.; Herrero, M.; Ibañez, E.; Segura-Carretero, Fernández-Gutiérrez, A. J.

Chromatogr. A 2011, 1218, 7682. 30

Plaza, M.; Santoyo, S.; Jaime, L.; Avalo, B.; Cifuentes, A.; Reglero, G.; Reina, G. G.; Señoráns, J. F. Ibañez,

E. Food Sci. Technol. 2012, 46, 245. 31

Verdi, L. G.; Brighente, I. M. C.; Pizzolatti, M. G. Quím. Nova 2005, 28, 85. 32

Cai, H.; Verschoyle, R. D., Steward, W. P.; Gescher, A. J., Biomed. Chromatogr. 2003, 17, 435. 33

Zheleva-Dimitrova, D.; Gevrenova, R.; Nedialkov, P.; Kitanov, G.; Phytochem. Anal. 2007, 18, 1. 34

Besten, M. A.; Jasinski, V. C. G.; Costa, A. G. L. C.; Nunes, D. S.; Sens, S. L.; Wisniewski, A.; Simionatto, E.

L.; Riva, D.; Dalmarco, J. B.; Granato, D. J. Braz. Chem. Soc. 2012, 23, 6, 1041. 35

Lago, J, H. G.; Romoff, P.; Favero, O. A.; Souza, F. O.; Soares, M. G. S.; Baraldi, P. T.; Correa, A. G.

Biochem. Sys. Ecol. 2008, 36, 737.


7

Capítulo 2

Objetivos


8


9

Capítulo 2 : Objetivos

2.1 Geral :

2.1.1 No Brasil

O objetivo geral do trabalho foi o desenvolvimento de métodos para a determinação

de compostos fenólicos majoritários em extrato de carqueja empregando técnicas

cromatográficas e eletroforéticas

2.1.2 Na Espanha

Caracterização e identificação de antioxidantes em extrato de carqueja empregando

técnicas de extração e de separação avançadas e a determinação da capacidade

antioxidante in vitro.

2.2 Os objetivos específicos compreenderam:

2.2.1 No Brasil

Avaliação do preparo de amostras: otimização das etapas de extração, hidrólise dos

compostos fenólicos majoritários na carqueja e pré-concentração;

Desenvolvimento e validação de métodos cromatográficos e eletroforéticos (HPLC-

UV, UPLC-MS/MS e CE-UV) para quantificação de ácido cafeico, ácido ferúlico,

ácido gálico, ácido rosmarínico, canferol, quercetrina e rutina, segundo orientações

da RE n°899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA;

Análise de amostras comerciais de carqueja de diferentes estados brasileiros.

2.2.2 Na Espanha

Desenvolvimento e validação de método eletroforético (CE-MS) para quantificação

de ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido gálico, ácido rosmarínico, canferol, quercetrina

e rutina, segundo orientações da RE n°899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA;

Extração de compostos fenólicos empregando extração com líquido pressurizado(

PLE).

Determinação da capacidade antioxidante in vitro empregando ensaios de DPPH

(2,2 difenil-1-picril-hidracila) e Folin-Ciocalteau.


10


11

Capítulo 3

Revisão Bibliográfica


12


13

Capítulo 3 : Revisão Bibliográfica

3.1- Aspectos históricos sobre a carqueja

O homem sempre buscou na natureza soluções para os problemas de saúde. A

utilização das plantas medicinais na prevenção e tratamento das doenças é feita desde os

tempos mais remotos da humanidade. De fato, descobertas realizadas junto aos restos

mortais dos primeiros hominídeos comprovam que há cerca de 60.000 anos já se

utilizavam, para fins medicinais, diversas plantas36.

Somente no final do século XVIII iniciou-se o isolamento e a determinação da

estrutura dos constituintes ativos dos produtos de origem natural dotados de propriedades

medicinais. Embora já tivessem sido isolados o ácido benzóico, a sacarose, a cânfora e o

timol, foram os trabalhos realizados por volta de 1770 pelo pesquisador sueco Scheele,

que deram início a esta nova etapa com a obtenção de vários ácidos orgânicos e também

a lactose e a glicerina, todos obtidos a partir de produtos naturais36.

Parte da população brasileira já se habituou à utilização de espécies vegetais

amargas para problemas hepáticos ou relacionados à digestão, sendo assim, a Baccharis

trimera, popularmente conhecida como carqueja36 é uma das espécies mais utilizadas

para este fim. No Brasil, a carqueja está entre as dez plantas medicinais mais

comercializadas e o Paraná se destaca como seu maior produtor39.

O nome Baccharis foi dado por Linnaeus, que descreveu o gênero em 1753. Anos

mais tarde, em 1836, De Candolle 1836, relacionou 225 espécies para o gênero, sendo

destas 95 para a flora do Brasil, enquanto Baker, em 1882 mencionou 133 espécies, das

quais 43 eram espécies novas. A maior contribuição para o conhecimento do gênero foi o

estudo realizado por Malagarriga em 1976, com a elaboração de um catálogo que inclui a

maioria dos nomes até então publicados, reconhecendo um total de 431 espécies e 80

entidades intraespecíficas37.

O gênero Baccharis, incluído na tribo Asterae, da família Asteraceae, é constituído por

cerca de 500 espécies. Uma das mais importantes é Baccharis trimera (Less.) DC, com

grande utilização na medicina tradicional e na produção de fitoterápicos38. A família

36

Karam, T.K.; Dalposso, L. M.; Casa, D .M. ; De Freitas, G.B.L Rev. Bras. Pl. Med. 2013, 15,.2, 280. 37

Pires, C. A. S. Dissertação de Metrado, Faculdade de Farmácia, UFRGS, 2004. 38

Borella, J. C.; Duarte, D. P.; Novaretti, A. A. G.; Júnior, A. M.; França, S. C.; Rufato, C. B.; Santos, P. A. S.; Veneziani, R. C. S.; Lopes, N. P. Braz. J. Pharmacogn. 2006, 16, 4, 557.


14

Asteraceae apresenta um grande número de espécies, que são utilizadas como plantas

medicinais e a presença de várias classes de metabólitos secundários faz considerar que a

composição química é mais importante do que a morfologia na evolução dessa família39. As

espécies do gênero Baccharis têm porte arbustivo, com altura entre 0,5 e 4,0 metros. Arbusto

bastante ramificado na base possui caules e ramos verdes com expansões trialadas. As

inflorescências são do tipo capítulo, dispostas lateralmente nos ramos, de cor

esbranquiçada36.

Figura 3: Baccharis trimera less DC em estágio vegetativo (A) e ramo de

inflorescência (B)36.

O primeiro registro escrito do uso da carqueja no Brasil data de 1931, informando o

emprego da infusão das folhas e ramos para tratamento da esterilidade feminina e da

impotência masculina e atribuindo-a propriedades tônicas, febrífugas e estomáticas36.

3.2- Flavonóides: definição, rota biossintética

Em investigação realizada com a Baccharis trimera, no que se refere aos

flavonóides, uma série deles já foram isolados: eupafolina, quercetina, luteolina, nepelina,

apiginina, eupatorina, rutina, canferol, entre outros40.

39

Budel, J. M.; Duarte, M. R; Santos, C. A. M. Braz. J. Pharmacogn. 2004, 14, 1, 41. 40

Verdi, L. G.; Brighente, I. M. C.; Pizzolatti, M. G. Quim. Nova 2005, 28, 85.


15

O termo “fenólico” ou “polifenólico” pode ser definido como sendo uma substância que

tem um ou mais núcleos aromáticos contendo substituintes hidroxilados e/ou seus derivados

funcionais (ésteres, éteres metílicos, glicosídeos e outros)41.

Os ácidos fenólicos são, em sua maioria, derivados dos ácidos cinâmico e benzóico

(Figura 2). Já os flavonóides ocorrem geralmente como derivados glicosilados em plantas41.

A estrutura básica dos flavonóides é o núcleo flavan (Figura 4)42, que consiste de 15

átomos de carbono, composto do tipo C6-C3-C6, dispostos em dois anéis aromáticos, que

são denominados A e B, conectados por uma ponte de três carbonos, que contém um átomo

de oxigênio (anel C)41.

Figura 4: Estrutura básica dos flavonóides (núcleo flavan).

A função dos flavonóides nas plantas varia desde a proteção contra as ações

deletérias dos raios UV e patógenos como vírus, fungos, insetos e bactérias à atração de

polinizadores, passando pela contribuição com a pigmentação e pelo controle de hormônios

vegetais e de enzimas. A abundância relativa dos flavonóides no reino vegetal, a

especificidade em algumas espécies e a relativa estabilidade e facilidade de identificação,

fazem desse grupo um marcador quimiotaxonômico42.

Muitos autores tem tentado elucidar a relação estrutura-atividade dos compostos

fenólicos quanto ao poder antioxidante. No entanto, isso é uma tarefa difícil, já que o

potencial antioxidante pode ser determinado por vários fatores, dos quais a lipofilicidade, a

quelação de ferro e a limpeza de radicais livres são os mais importantes41.

A biossíntese dos flavonóides (Figura 5) ocorre por uma via mista, a via do ácido

chiquímico e a do acetato. O ácido chiquímico é o precursor do composto inicial da síntese

dos flavonóides, a fenilalanina. Este aminoácido aromático depois de desaminado pela

fenilalanina-amônia-líase (PAL) produz ácido cinâmico, que por ação da 4-hidroxilase

41

Lima, F O. Tese de Doutorado, Instituto de Química, UFSM, 2013. 42

Silva, G C, Dissertação de Mestrado, Instituto de Química, UNICAMP,2012.

O

A C

B1

2

345

6

7

8 1'

2'3'

4'

5'

6'


16

cinamato é convertido em ácido p-cumárico. Estas duas enzimas estão associadas, o ácido

cinâmico não é libertado pela PAL, mas sim transferido diretamente para o centro ativo da

segunda enzima36.

Posteriormente ocorre a adição da CoA, catalisada pelo p-cumarato-CoA liase,

originando a p-cumaroil-CoA, que ao reagir com três moléculas de malonil-CoA forma a

naringenina chalcona. Esta reação é catalisada pela chalcona sintetase. Finalmente, ocorre a

ciclização do anel C, catalizada pela chalcona isomerase, para formar a naringenina que por

fim origina a hispidulina, por meio de metoxilação (Figura 5). Desta forma, nos flavanóides, o

anel A é formado via acetato, enquanto o B resulta da via chiquimato e os três átomos de

carbono que ligam o anel A ao B derivam do fosfoenolpiruvato36.


17

HO O

HO

OH

OH

Chiquimato

Fenilalani la-amônia- liase

OH

NH2

O

F eni lalanina

B 4-hidroxi lase cinamato

OH

OB

Ácido cinâmico

OH

OB

Ácido p- cumár ico

OH

p-cumarato-CoA-l iase

O

OB

p-cumaroil-CoA

OH

S CoA

3

S CoA

CO

CH2

CO

OH

Malonil-CoA

Chalcona sintetase

OHHO

OH O

OH

A

BChalcona isomerase OHO

OH O

OH

A

B

Nariginina Chalcona Nariginina

Metoxilação

OHO

OH O

OH

A

B

H3CO

Hispidul ina

Figura 5: Biossíntese dos flavonóides (adaptado de Marques, 2008)36.

Dentre as aplicações descritas na literatura empregando os flavonóides, sabe-se

que eles são utilizados como corantes naturais, conservantes em alimentos e na produção

de tintas e cosméticos. Os flavonóides são antioxidantes importantes por atuarem como

agentes redutores, doadores de hidrogênio, neutralizadores do oxigênio singlete e

quelando metais que possam iniciar ou propagar as reações em cadeia. Contudo, o


18

mecanismo de ação antioxidante mais estudado dos flavonóides é o de captação de

radicais livres, propriedade que depende da estrutura química da molécula em relação à

capacidade doadora de elétrons e a establilização do radical formado através da

deslocalização do elétron desemparelhado42.

3.3 Técnicas de extração de flavonóides e ácidos fenólicos

As plantas medicinais possuem vários compostos ativos e suas concentrações

podem ser influenciadas pela espécie, origem e técnica de processamento. Esta

característica cria um grande desafio para o controle de qualidade químico-analítico.

Devido às baixas concentrações de princípios ativos e à complexidade das amostras, o

preparo de amostra é uma etapa crucial no proceso de extração e análise do material

obtido43.

Vários métodos têm sido utilizados para a extração de compostos fenólicos:

aqueles considerados clássicos, como por exemplo, maceração, soxhlet e infusão17,44,45, e

os métodos considerados modernos tais como, microondas17 e extração assistida por

ultrassom. Atualmente tende-se a considerar as técnicas contemporâneas como técnicas

verdes de extração, dentre as quais estão os fluídos supercríticos (SFE) e líquidos

pressurizados (PLE)46,47.

3.3.1 Extração com Soxhlet

Idealmente busca-se trabalhar com técnicas de extração que sejam versáteis, de

fácil execução e relativamente baratas. A extração com soxhlet se enquadra neste perfil.

A Figura 6 mostra o comportamento do solvente durante a extração com Soxhlet.

Este aparelho foi criado por Franz Von Soxhlet, em 1879, para a extração de lipídeos.

43

Souza, K. P. Dissertação de Mestrado, Instituto de Química, UNICAMP, 2011. 44

Maciel, M. A.; Pinto, A. C.; Veiga Jr.,V. F. Quim. Nova 2002, 25, 3, 429. 45

Carvalho, J. L. S.; Cunico, M. M.; Dias, J. F. G.; Miguel, M. D.; Miguel, O. G., Quim. Nova 2009, 32, 4, 1031. 46

Linares, I. B.; Arráez-Román, D.; Herrero, M.; Ibañez, E.; Segura-Carretero, Fernández-Gutiérrez, A. J.

Chromatogr. A 2011, 1218, 7682. 47

Plaza, M.; Santoyo, S.; Jaime, L.; Avalo, B.; Cifuentes, A.; Reglero, G.; Reina, G. G.; Señoráns, J. F. Ibañez,

E. Food Sci. Technol. 2012, 46, 245.


19

Figura 6: Sistema de extração com Soxhlet48.

Um volume adequado de solvente é colocado num balão de fundo redondo, que por

sua vez, é aquecido por uma manta de aquecimento, originando vapor, quando o solvente

atinge a temperatura de ebulição. Esse vapor aquecido quando chega ao condensador é

resfriado, voltando ao estado líquido inicial e enche o extrator até ao nível do tubo lateral. A

amostra não fica em contato com o solvente muito quente, entretanto, o volume total deve

ser suficiente para atingir o sifão. Durante o processo de extração, o solvente liquefeito vai

arrastando os compostos presentes na amostra que são solúveis nele, e após alguns ciclos

obtêm-se e extrato final.

Esta técnica oferece a vantagem de permitir o contato da amostra com porções de

solvente fresco, prevenindo a saturação do solvente e aumentando a remoção dos

compostos presentes na matriz. Além disso, a amostra não fica em contato com o solvente

em refluxo, evitando a degradação dos analitos por excesso de aquecimento. Uma

desvantagem é que dependendo do objeto de extração, o processo pode demorar vários

dias43.

48

http://www.ebah.com.br/content/ABAAABN34AL/extracao-lipidios-alimentos - acessado em 20/01/2015.

http://www.ebah.com.br/content/ABAAABN34AL/extracao-lipidios-alimentos


20

3.3.2 Extração assistida por micro-ondas

Esta técnica baseia-se na associação da extração convencional com solvente sob a

aplicação de micro-ondas. Devido à alta energia, essa extração pode ser realizada em

intervalo de tempo curto. Esta técnica tem sido amplamente empregada na extração de

composto voláteis em plantas43.

Como a energia de micro-ondas é responsável pela migração de íons e rotação de

dipolos, é essencial que haja tanto na matriz como no solvente moléculas polares ou

espécies iônicas43.

Além da homogeneidade e reprodutibilidade da extração, outras vantagens, como

economia de energia, de solvente e menor quantidade de resíduos gerados, podem ser

atribuídas a essa técnica. Por outro lado, como se trata de um processo de extração

essencialmente térmico, os problemas descritos na literatura para extrações térmicas,

também valem para extração43 assistida por micro-ondas.

3.3.3 Extração assistida por ultrassom

A extração assistida por ultrassom (UAE do inglês, “ultrasound-assisted extraction”)

é uma alternativa rápida, eficiente e de baixo custo aos métodos de extração

convencionais. UAE melhora tanto a penetração do solvente nas matrizes vegetais quanto

a liberação do material intracelular, pela ruptura das paredes celulares, principalmente

devido aos efeitos mecânicos de cavitação acústica43.

Como qualquer onda sonora, o ultra-som é propagado via uma série de ondas de

compressão e rarefação induzido nas moléculas do meio através do qual as ondas

atravessam. Em potências suficientemente elevadas, o ciclo de rarefação pode exceder às

forças atrativas das moléculas do líquido e bolhas serão formadas. Tais bolhas crescem

através de um processo conhecido como difusão retificada, isto é, pequenas quantidades

de vapor ou gás do meio entram na bolha durante sua face de expansão, e não são

totalmente expelidos durante a compressão. As bolhas crescem durante um período de

poucos ciclos até um tamanho de equilíbrio para uma frequência particular aplicada. O

campo acústico experimentado por uma bolha não é estável, por causa da interferência de

outras bolhas que estão sendo formadas ao redor dela. Como resultado algumas bolhas

atingem um tamanho instável e colapsam violentamente. É a implosão violenta dessas


21

bolhas que gera energia para os efeitos químicos e mecânicos49. Este fenômeno está

representado na Figura 7.

Figura 7: Fenômeno da cavitação ( adaptação de Suslick, K.S.)50

3.3.4 Extração com fluido supercrítico

Os fluídos supercríticos têm sido utilizados para isolar produtos naturais desde o fim

da década de 70, mas apenas nos últimos anos o interesse pelo desenvolvimento de novos

processos e equipamentos tem aumentado51. O principal solvente supercrítico usado é o

dióxido de carbono em condições críticas de temperatura e pressão (CO2, 30.9°C, 73.8 bar),

pois ele é barato, ambientalmente correto e é reconhecido pelos órgãos de controle como o

FDA (do inglês, “Food Drug Admnistration”) e o EFSA51( do inglês, “European Food Safety

Autorithy”).

A extração em fluído supercrítico tem importantes vantagens sobre as técnicas de

extração convencionais, principalmente o baixo volume de solventes orgânicos, e a

49

André, M. F. Dissertação de Mestrado, Instituto de Química, UNICAMP, 2009. 50

a) Ley, S. V.; Low, C. M. R. Ultrasound in Synthesis, Springer-Verlag: New York, 1989, Vol. 27. P 2; b) Suslick, K. S. Handbook of Heterogeneous Catalysis; Ertl, G., Knozinger, H., Witkamp, J., Eds.; Wiley-VCH: Weinheim, Germany, 1997; Vol. 3, 1350. 51

Herrero, M.; Mendiola, J. A.; Cifuentes, A.; Ibañez, E. J. Chromatogr. A 2010, 1217, 2495.


22

possibilidade de obtenção de extratos livres de solventes após evaporação do fluído

extrator52.

3.3.4.1 Extração Aquosa subcrítica

Uma outra forma de extração em fluído supercrítico é a extração aquosa subcrítica, a

qual utiliza água pressurizada e altas temperaturas para manter o estado líquido, extraindo

os compostos de maneira rápida e “verde”53. Elevadas temperaturas modificam a constante

dielétrica da água e alteram sua polaridade, permitindo a obtenção de extrações seletivas e

adequadas para extração de plantas aromáticas53.

3.3.5 Extração com líquido pressurizado (PLE)

Sabe-se que as técnicas de extração tradicionais apresentam desvantagens, como

longos tempos de extração, baixos rendimentos, exposição dos extratos a aquecimento

excessivo, luz e oxigênio. A extração em líquido pressurizado aparece como uma alternativa

vantajosa sobre as técnicas convencionais, uma vez que utiliza pequena quantidade de

solvente e pouco tempo de extração, o processo é automatizado e o produto obtido não é

exposto a luz e à presença de oxigênio, além de ser considerada uma técnica verde54.

A PLE tem recebido vários nomes, tais como extração acelerada por solvente (do

inglês, “accelerated solvent extraction”, ASE), extração por fluido pressurizado (do inglês,

“pressurized fluid extraction”, PFE), extração por solvente aquecido pressurizado (do inglês,

“pressurized hot solvent extraction”, PHSE), extração por solvente subcrítico (do inglês, “

subcritical solvent extraction”, SSE) e extração por água aquecida (do inglês, “hot water

extraction”, HWE). Esta técnica utiliza solventes que são levados próximos à região

supercrítica, onde estes demostram melhores propriedades de extração. Em altas

temperaturas, os percentuais de recuperação aumentam, pois a viscosidade e a tensão

superficial diminuem, enquanto a sua solubilidade e a taxa de difusão na amostra aumentam.

O uso combinado de altas pressões (500 a 3000 psi) e temperaturas (50 a 200°C) possibilita

52

Herrero, M.; Plaza, M.; Cifuentes, A.; Ibáñez, E. J. Chromatogr. A 2010, 1217, 2512. 53

Meioso-Rodriguez, I.; Jaime, L.; Santoyo, S.; Señoráns, F. J.; Cifuentes, A.; Ibañez, E. J. Pharm. Biom. Anal. 2010, 51, 456. 54

Meiozo-Rodriguez, I.; Jaime, L.; Santoyo, S.; Cifuentes, A.; Reina, G. G-B.; Ibañez, E J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 3517.


23

um processo de extração rápido (5 a 10 min), com menor quantidade de solvente em

comparação com a extração tradicional55.

3.3.6 Extração em fase sólida

Atualmente a extração em fase sólida (SPE do inglês, “Solid Phase Extraction”) é uma

das ferramentas mais poderosas e mais empregadas para a extração e/ ou pré-concentração

de analitos presentes em matrizes complexas, permitindo que concentrações em níveis muito

baixos sejam detectadas pelos instrumentos. Esta técnica possui avanços quando

comparada à técnica tradicional da extração líquido-líquido, principalmente com relação à

redução da quantidade de solventes e amostra envolvidas em cada extração.

Uma das etapas mais importantes na análise de matrizes complexas ou amostras

“reais” consiste na extração e no isolamento dos analitos de interesse, de forma a possibilitar

sua determinação qualitativa e quantitativa por meio de uma técnica analítica adequada.

A extração em fase sólida é uma técnica de extração cujo objetivo é a remoção do(s)

analito(s) da matriz, sem interferentes. O princípio de extração é bastante simples, sendo que

uma solução contendo o analito de interesse é colocada no topo do cartucho contendo um

sorvente sendo aspirada com vácuo da ordem aproximada de 10 mbar de forma a penetrar

no cartucho de extração. Depois de drenada toda a fase líquida, o analito retido no sorvente

do cartucho é eluído com pequeno volume de solvente, de forma a coletar o analito em

concentração já apropriada para análise. O isolamento do analito (clean-up) pode ser obtido

retendo-se o analito no sorvente e removendo os interferentes da matriz ou retendo a matriz

no sorvente para permitir que os analitos sejam coletados juntamente com o solvente da

amostra. Nos casos onde o analito fica retido no sorvente, é possível realizar a concentração

e o clean-up em um mesmo procedimento de extração, como ilustra a Figura 8.

55

Prestes, O. D.; Martins, M. L.; Friggi, C. A.; Munaretto, J. S.; Adaime, M. B.; Zanella, R. Quim. Nova 2013, 36, 5, 697.


24

Figura 8: Etapas envolvidas na SPE: condicionamento do sorvente, adição da amostra,

remoção dos interferentes e eluição do analito56.

O procedimento de extração em fase sólida envolve basicamente quatro etapas:

a) Condicionamento do cartucho: esta etapa destina-se a ativar o material existente dentro

do cartucho e o solvente a ser empregado depende principalmente do material a ser ativado.

Um fator muito importante é impedir que o sorvente seque, para evitar a formação de

caminhos preferenciais e comprometer a separação e a reprodutibilidade na extração.

b) Adição da amostra: a adição da amostra deve ser quantitativa e normalmente é feita com

o auxílio de uma pipeta ou uma seringa. A velocidade de aplicação pode ser um fator crítico

e idealmente deve ser lenta.

c) Remoção dos interferentes: esta etapa visa eliminar os interferentes com um solvente que

não possua força suficiente para remover o analito de interesse do sorvente.

d) Eluição do analito: a eluição deve ser feita com um solvente que seja capaz de eluir os

compostos de interesse, mas não permitir a eluição de interferentes que não tenham sido

eliminados na etapa anterior. O volume utilizado deve ser mínimo para que a solução

coletada já se encontre em concentração apropriada para análise.

De um modo geral, a SPE é usada para atender seis propostas principais na preparação

de amostra: remoção de interferentes que podem danificar a coluna e prejudicar a resolução,

56

Caldas, S. S.; Gonçalves, F. F.; Primel, E. G. Quim. Nova 2011, 34, 9, 1604.


25

concentração ou enriquecimento de traços do analito, dessalinização, troca de solvente,

derivatização in situ e estocagem ou transporte de amostra57.

3.4 Principais técnicas de separação e quantificação de compostos fenólicos

Entre as várias técnicas de separação utilizadas para a determinação de compostos

fenólicos em alimentos, estão: a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), a

cromatografia gasosa (CG)58,59,60,61,62 e a eletroforese capilar (CE), que surgiu como uma boa

alternativa dentre a técnicas de análise devido à rápida e eficiente separação e o baixo

custo63.

A Tabela 1 mostra exemplos de aplicações destas técnicas na determinação dos

compostos fenólicos estudados neste trabalho.

Tabela 1: Alguns exemplos de aplicação de métodos para a determinação de compostos

fenólicos

Matriz Analitos(s) Técnica Referência

Geléia de uva Ácido gálico e rutina HPLC-DAD Morelli64

Erva-mate Ácido cafeico de rutina HPLC-UV Goulart65

Forrageira Ácidos gálico, ferúlico e cafeico HPLC-DAD Lage66

Uva preta Rutina HPLC-ED Gomes67

Calopo Ácido ferúlico, rutina e canferol CE-UV Santos68

Abiu-roxo, amora e

tomate

Ácidos gálico, ferúlico e cafeico CE-DAD Fukuji69

Brócolis e repolho Ácidos cafeico e ferúlico CE-DAD Breadmore70

57

Fonseca, F. N. Tese de Doutorado, Instituto de Química, USP, 2002. 58

Verdi, L. G.; Brighente, I. M. C.; Pizzolatti, M. G. Quím. Nova 2005, 28, 85. 59

Cai, H.; Verschoyle, R. D., Steward, W. P.; Gescher, A. J., Biomed. Chromatogr. 2003, 17, 435. 60

Zheleva-Dimitrova, D.; Gevrenova, R.; Nedialkov, P.; Kitanov, G.; Phytochem. Anal. 2007, 18, 1. 61

Besten, M. A.; Jasinski, V. C. G.; Costa, A. G. L. C.; Nunes, D. S.; Sens, S. L.; Wisniewski, A.; Simionatto, E.

L.; Riva, D.; Dalmarco, J. B.; Granato, D. J. Braz. Chem. Soc. 2012, 23, 6, 1041. 62

Lago, J, H. G.; Romoff, P.; Favero, O. A.; Souza, F. O.; Soares, M. G. S.; Baraldi, P. T.; Correa, A. G.

Biochem. Sys. Ecol. 2008, 36, 737. 63

Vaher, M.; Koel, M.; J. Chromatogr. A 2003, 990, 225. 64

Morelli, L.L.L. Dissertação de Mestrado, Faculdade de Engenharia de Alimentos, UNICAMP, 2010. 65

Goulart, F. L. D.; Hoffman-Ribani, R. Quim. Nova 2010, 33, 1, 119. 66

Lage, F. F. Dissertação de Mestrado, Química Ambiental, UFLA, 2009. 67

Gomes, S. M. C. Dissertação de Mestrado, Química Ambiental, Universidade de Coimbra, 2010. 68

Santos, S.; Moraes, M. L.L.; Rezende, M. O. O.; Souza Filho, A. P.S. Ecl. Quím., 2011, 36, 2, 51. 69

Fukuji, T. S. Tese de Doutorado, Instituto de Química, USP-São Paulo, 2011. 70

Breadmore, M, C. Food. Chem. 2011,127, 797.


26

3.4.1 Cromatografia líquida de alta eficiência

A cromatografia líquida de alta eficiência tem a capacidade de realizar separações e

análises quantitativas de uma grande variedade de compostos presentes em diversos tipos

de amostras, em escala de tempo reduzido (poucos minutos), com alta resolução, eficiência

e detectabilidade. Dentre os avanços na cromatografia líquida, estão a cromatografia líquida

acoplada ao espectrômetro de massas (HPLC-MS), a cromatografia líquida de ultra eficiência

(UHPLC) e a cromatografia líquida multidimensional (HPLC x HPLC).

3.4.1.1 Cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas

A cromatografia líquida de alta eficiência têm sido utilizada juntamente com a

espectrometria de massas, empregando os modos de ionização química à pressão

atmosférica (APPI) ou eletronebulização (ESI) para a identificação e quantificação de

compostos fenólicos em plantas e alimentos, uma vez que estes modos de ionização são

técnicas mais seletivas e brandas71,72. Esta técnica associada a um espectrômetro de

massas pode fornecer a impressão digital da composição da amostra que somado aos dados

de ressonânica magnética nuclear de 1H e 13C, por exemplo, possibilita uma análise

completa de concentrações individuais e estereoquímica relativa da amostra. Medindo-se o

D, pode-se também obter a estereoquímica absoluta dos componentes em estudo.

A espectrometria de massas é uma importante ferramenta analítica disponível, já que é

capaz de fornecer informações sobre: a composição elementar de amostras; a estrutura

molecular, a composição qualitativa e quantitativa de misturas complexas, a estrutura e a

composição de superfícies sólidas e as proporções isotópicas de átomos em amostras73.

A aparência do espectro de massas de uma espécie molecular é altamente dependente

do método de ionização usado. Os agentes ionizantes empregados em espectrometria de

massas podem ser distribuídos em duas categorias: as que requerem a amostra em fase

gasosa e os agentes que provocam dessorção em amostras sólidas ou liquidas73.

A Figura 9 ilustra o processo genérico de obtenção de um espectro de massas, onde M

representa as moléculas de um composto puro na fase gasosa. Após um processo de 71

Flamini, R. Mass Spectrom. Rev. 2003, 22, 218. 72

Vukics, V.; Guttman, A. Mass Spectrom. Rev. 2010, 29, 1. 73

Breve Revisão de Espectrometria de Massa e da Técnica de PDMS, Capítulo 2, 1. Puc-Rio, certificação digital 0124802/CA:


27

ionização, M+ se fragmenta gerando íons de massas menores que, detectados, geram o

espectro de massas.

Figura 9: Representação genérica da obtenção do espectro de massas73.

De modo genérico, o espectrômetro de massas é constituído por uma fonte de íons, um

analisador de massas e o detector. A fonte de íons faz com que os analitos presentes na

amostra sejam ionizados pela ação de um agente ionizante. Os íons gerados podem ser

positivos (cátions) ou negativos (ânions) e a partir da ionização, estes são imediatamente

acelerados em direção ao analisador de massas. A função do analisador de massas é

separar tais íons de acordo com a sua relação massa-carga (m/z). Os espectrômetros de

massas podem ser classificados em várias categorias dependendo da natureza do

analisador de massas. Finalmente, um detector recebe os íons que foram separados pelo

analisador, transformando a corrente de íons em sinais elétricos que são processados,

armazenados na memória de um computador e mostrados em uma tela73.

Figura 10: Esquema geral dos componentes de um espectrômetro de massas.


28

O modo de ionização por eletronebulização (ESI, do inglês “electrospray ionization”),

uma técnica branda que mimetiza as condições de uma solução na fase de vapor, com um

analisador de massas hexapolopolar e um detector em tandem.

Em ESI, o líquido no qual o analito de interesse se encontra presente (na fase móvel,

no caso do eluente da HPLC) passa através de um capilar, à pressão atmosférica, mantido

sob alta voltagem. Na saída do capilar são formadas pequenas gotas altamente carregadas

(“spray”) que são dessolvatadas ao se deslocarem em sentido contrário ao posicionamento

de um eletrodo, em uma região de pressão atmosférica. A dessolvatação é assistida por um

fluxo contínuo de gás seco (geralmente N2) na região do “spray”. À medida que ocorre a

dessolvatação, o tamanho das gotas é reduzido até o ponto em que a força de repulsão entre

as cargas similares fica maior que as forças de coesão da fase líquida (tensão superficial).

Neste momento ocorre a chamada “explosão coulômbica”, que gera gotas com tamanhos

equivalentes a 10% do tamanho das gotas originais. Uma série de explosões passa então a

ocorrer até que são produzidos íons do analito a partir destas gotas, os quais são

transferidos para o interior do espectrômetro de massas por uma série de dispositivos de

focalização74,76,77.

Como em ESI a ionização ocorre diretamente na solução, compostos sensíveis à

temperatura podem ser ionizados sem sofrer degradação. Uma vez que em ESI são gerados

íons com múltiplas cargas, esta técnica pode ser aplicada a compostos com massas molares

relativamente grandes, pois, como o espectrômetro de massas mede a razão massa/carga

(m/z) dos íons, o intervalo de “massa” de aplicabilidade do instrumento pode ser expandido

por um fator equivalente ao número de cargas do íon, isto é, um íon com m/z 1000 e com 20

cargas representa um composto com uma massa molar de 20000 daltons (Da). Devido ao

modo de obtenção dos íons por esta fonte de ionização, a sua aplicação a compostos

ionizáveis em solução e compostos altamente polares que podem ser facilmente ionizados é

favorecida 75 ,76.

A espectrometria de massas sequencial (MS-MS) é a técnica espectrométrica que, ao

invés de utilizar apenas um analisador de massas para separar os íons de mesma razão m/z

gerados na fonte de ionização, utiliza dois estágios de espectrometria de massas (MS1 e

MS2), em que um deles é usado para isolar o íon de interesse e o outro é usado para

74

Ardrey, R. E.; Liquid Chromatography-Mass Spectrometry: An Introdution, Wiley: Huddersfield, 2003. 75

Kitson, F. G.; Larsen, B. S.; McEwen, C. N.; Gas Chromatography and Mass Spectrometry - A Pratical Guide, Academic: London, 1996.


29

estabelecer uma relação entre este íon de interesse isolado e outros íons que foram gerados

a partir da sua decomposição induzida76. Esta técnica é amplamente empregada na detecção

de compostos presentes em baixas concentrações em matrizes complexas, acoplada à

cromatografia. Também uma vez que possibilita um aumento na detectabilidade e reduz a

interferência espectral de compostos presentes na matriz, além de aumentar a quantidade de

informação estrutural que se pode obter77.

O analisador de massas hexapolo é um instrumento constituído por três quadrupolos

em série, sendo que o segundo quadrupolo não é utilizado para separar íons de mesma

razão m/z, mas sim como cela de colisão, na qual ocorre a fragmentação dos íons

selecionados no primeiro quadrupolo geralmente por dissociação induzida por colisão com

um gás inerte (CID- do inglês, “collision-induced dissociation”), e também é empregado como

direcionador dos íons produzidos ao terceiro quadrupolo76.

Na CID, o íon precursor proveniente do primeiro quadrupolo é acelerado por um

potencial elétrico para uma região de alto vácuo no interior do segundo quadrupolo, onde

sofre repetidas colisões com um gás inerte de elevada energia (geralmente Ar, He ou N2), o

que leva a um aumento na energia potencial deste íon até ocasionar sua fragmentação,

conduzindo à formação dos íons produto. Quando CID é realizada sob elevada energia, as

reações de fragmentação geram informações estruturais mais significativas, uma vez que

pode levar à quebra das moléculas em posições características. Porém, quando a energia é

muito elevada pode levar a uma fragmentação descontrolada76, 78.

Além de informações estruturais, CID pode melhorar a detectabilidade do método

quando usada para gerar um íon característico de uma molécula e assim realizar sua

detecção a partir deste íon fragmento quando a molécula do analito de interesse se encontra

em presença de outras moléculas de mesma massa molar nominal, uma vez que reduz o

ruído e aumenta a detectabilidade76, 78 (Figura 11).

Todos os quadrupolos são controlados para transmitir íons de uma única razão m/z ou

de um intervalo de razões m/z para gerar informação analítica mais exata79.

76

Chiaradia, M. C.; Collins, C. H.; Jardim, I. C. S. F, Quim. Nova 2008, 31, 623. 77

Vékey, K.; J. Chromatogr. A 2001, 921, 227. 78

http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/cid-fragmentation.html, acessada em Janeiro 2011. 79

Hager, J. W.; Le Blanc, J. C. Y.; J. Chromatogr. A 2003, 1020, 3.


30

169 > 69

Transição de Quantificação

169 > 125

Transição de Confirmação

Figura 11: Esquema de um analisador triploquadrupolo.

O modo de análise full scan permite encontrar a massa molecular de compostos

desconhecidos, enquanto o tandem MS, o caminho de fragmentação.

O monitoramento seletivo de reações (SRM do inglês,“selected-reaction monitoring”) é

um tipo de varredura que monitora a fragmentação de um íon precursor selecionado no triplo

quadrupolo por MS1 aos seus correspondentes íons produtos que atravessam MS2 . No “ion-

trap” o íon precursor é selecionado da mesma forma que na varredura dos íons produzidos,

mas, neste caso, um íon produto de uma única razão m/z de interesse é confinado76.

Quando se monitora a fragmentação de vários íons precursores simultaneamente,

este modo de varredura é denominado monitoramento de reações múltiplas (MRM, do inglês

“multiple-reaction monitoring”) 76.

Os sistemas de detecção mais utilizados são a fotomultiplicadora e multiplicadora de

elétrons para a detecção dos íons. Este sistema de detecção promove a conversão de íons

em elétrons, que são amplificados em uma região denominada dinodo. A magnitude do sinal

elétrico é convertida em um espectro de massas onde aparecem os picos para cada íon

selecionado, m/z. Embora sejam muito sensíveis, esses detectores apresentam vida útil

relativamente curta em função do desgaste da superfície amplificadora do sinal, que também

causa a necessidade de calibração frequente do mesmo91. O cromatograma contendo todos

os íons produzidos pelo espectrômetro de massas é denominado cromatograma de íons

totais (TIC, do inglês “total ion chromatogram”)76,77.


31

O cromatograma constituído apenas pelos íons de interesse pode ser obtido pelo

monitoramento dos íons selecionados (SIM, do inglês “selected ion monitoring”), ajustando-

se o detector de massas para que sejam observados apenas os íons de razão m/z de

interesse ou selecionando-os a partir de um banco de dados que contenha os espectros de

massas completos76,77.

3.4.1.2 Cromatografia líquida de ultra eficiencia

A cromatografia líquida de ultra eficiência está entre as ferramentas mais recentes

dentre as técnicas de separação, utiliza os mesmos princípios da cromatografia líquida de

alta eficiência com a vantagem de trabalhar com fases estacionárias com partículas menores

que 2 μm. O uso destas partículas juntamente com as altas velocidades lineares da FM

aumentam a resolução e a detectabilidade e diminuem o tempo das

análises.80,81,82,83,84,85,86,87,88,89

Essa nova técnica de separação é intrinsecamente dependente de instrumentação

(bombas, injetores e detectores) apropriada para trabalhar em altas pressões. O primeiro

equipamento comercial capaz de operar em pressões acima de 100 MPa (15000 psi) foi

desenvolvido pela Waters Corporation e foi nomeado de AcquityTM ultra performance liquid

chromatography system (UPLCTM).81,82 Logo em seguida, outros fabricantes lançaram seus

equipamentos de UHPLC, podendo trabalhar em pressões acima de 100 MPa90,81,82.

O emprego da técnica de UHPLC oferece inúmeras vantagens, das quais se destacam:

menor tempo de análise; maior precisão nos resultados em termos de tempo de retenção e

áreas dos picos cromatográficos; menor consumo de solventes orgânicos utilizados como

fase móvel (FM); maior eficiência, resolução e detectabilidade, devido à formação de picos

mais altos e estreitos, se comparados às análises realizadas utilizando-se HPLC. Além disso,

80

Nováková, L.; Matysová, L.; Solich, P.; Talanta 2006, 68, 908. 81

Swartz, M. E.; J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2005, 28, 1253. 82

Swartz, M. E.; LCGC North Am. Suppl. S 2005, Suppl. S, 8. 83

. Dongre, V. G.; Karmuse, P. P.; Rao, P. P.; Kumar, A.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2008, 46, 236. 84

Guan, J.; Lai, C. M.; Li, S. P.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2007, 44, 996. 85

Englmann, M.; Fekete, A.; Kuttler, C.; Frommberger, M.; Li, X.; Gebefugi, I.; Fekete, J.; Kopplin, P. S.; J. Chromatogr. A 2007, 1160, 184. 86

Guillarme, D.; Nguyen, D. T. T.; Rudaz, S.; Veuthey, J. L.; Eur. J. Pharm. Biopharm. 2007, 66, 475. 87

Pedraglio, S.; Rozio, M. G.; Misiano, P.; Reali, V.; Dondio, G.; Bigogno, C.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2007, 44, 665. 88

Guillarme, D.; Nguyen, D. T. T.; Rudaz, S.; Veuthey, J. L.; Eur. J. Pharm. Biopharm. 2008, 68, 430. 89

Apollonio, L. G.; Pianca, D. J.; Whittall, I. R.; Maher, W. A.; Kyd, J. M.; Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2006, 836, 111. 90

Nguyen, D. T. T.; Guillarme, D.; Rudaz, S.; Veuthey, J. L.; J. Sep. Sci. 2006, 29, 1836.


32

outra vantagem que merece destaque em UHPLC é a possibilidade de transferência do

método desenvolvido por HPLC para UHPLC e vice-versa91.

3.4.1.2.1 Colunas Acquity BEH (Ethylene Bridged Hybrid)

A coluna AcquityTM UPLC BEH (Ethylene Bridged Hybrid) C18 foi empregada no

presente trabalho para a separação dos compostos fenólicos. O desenvolvimento dessas

colunas preenche todos os requisitos necessários para trabalhar na condição de máximo

desempenho em cromatografia líquida de ultra eficiência. A tecnologia das colunas Acquity

tem como característica a presença de partículas de sílica híbrida em sua estrutura que

combina material orgânico e inorgânico, denominada de sílica de segunda geração. Este

suporte é constituído por polietoxissilano (BPEOS), que é obtido através da reação de

bis(trietoxissilil)etano (BTEE) e tetraetoxissilano (TEOS) na proporção 1:4 m/m,

respectivamente92.

Na Figura 12 pode-se observar a reação que promove a inserção de pontes etano na

estrutura da sílica, oferecendo maior estabilidade hidrolítica à fase, pois resiste a condições

ácidas e básicas (pH 1-12), quando comparada com a sílica pura. A inserção dos grupos

etanos na estrutura do suporte também promove um aumento na estabilidade mecânica,

uma vez que as ligações silício-carbono são similares às ligações silício-oxigênio. Além

disso, a combinação de material orgânico e inorgânico promove maior estabilidade térmica à

coluna (até 60°C) e fornece boa simetria de pico, devido à menor quantidade de silanóis

residuais presentes91.

Si

OEt

EtOOEt

OEtEtO C

H2

H2

C

EtO

EtO

OEtOEt

OEt

Si

O O

EtO

SiO

SiO

Si

O

O

EtO OEt OEt

O

OEt

O

OEt

OEt

OEt

Tetraetoxissilano(TEOS)

Bis (Trietoxissilil)etano(BTEE)

Polietoxissilano(BPEOS)

n

Figura 12: Reação química para síntese da sílica híbrida de segunda geração com

ponte etano. 92

91

Macedo, L. Disertação de Mestrado, Instituto de Química, UNICAMP, 2014. 92

Wyndham, K. D.; Ogara, J. E.; Glose, K. H.; Lawrence, N. L.; Alden, B. A.; Izzo, G. S.; Hudalla, C. J.; Iraneta, P. C.; Anal. Chem. 2003, 75, 6781.


33

Encontram-se disponíveis diferentes colunas com os mais diversos tipos de fases

ligadas à estrutura do suporte BEH, das quais se podem destacar colunas BEH C8, BEH

C18, Shield RP18, C6 Fenil e BEH HILIC (Figura 13).

C8

C18

Shield RP18

C6 Fenil

BEH HILIC

Figura 13: Esquema dos diferentes tipos de fases estacionárias quimicamente ligadas ao

suporte híbrido BEH 93.

As colunas BEH C8 e C18 são recheadas com fase estacionária contendo cadeias

alquil ligadas ao suporte híbrido contendo oito e dezoito carbonos, respectivamente. As

colunas que apresentam cadeias C18 são mais hidrofóbicas que as C8, devido ao aumento

da cadeia alquila, promovendo maior retenção para os compostos apolares. As colunas

Shield RP18 tem como característica a presença de grupos polares embutidos (carbamatos)

que conferem maior polaridade à fase estacionária e as colunas C6 Fenil são recheadas com

fases do tipo fenil que conferem maior seletividade para compostos aromáticos e compostos

que contém elétrons π. Adicionalmente, as colunas BEH HILIC (Hydrophilic Interaction

Chromatography) foram lançadas pela Waters com objetivo de separar compostos iônicos e

que apresentam características mais polares.

93 Colunas Acquity BEH (Ethylene Bridged Hybrid) UPLC Waters. Disponível em:

<http://www.waters.com/waters/pt_BR/ACQUITY-UPLC-Columns/nav.htm?locale=pt_BR&cid=513206>

Acessado em outubro de 2014.


34

3.4.1.2.2 Transferência de Métodos de HPLC para UHPLC

De acordo com dados relatados na literatura, a transferência de métodos entre as

técnicas de HPLC e UHPLC pode ser realizada, levando em consideração alguns fatores que

devem ser ajustados, como volume de injeção de amostra, tempo e vazão utilizados no

método de separação, dependendo se é empregada eluição por gradiente ou isocrático. A

possibilidade de transferência de um método já desenvolvido, empregando um sistema de

HPLC para o UHPLC é um aspecto muito importante a ser considerado, pois é possível

analisar um crescente número de amostras em um curto intervalo de tempo, melhorando a

eficiência e a resolução cromatográfica, sem a necessidade de desprender de um tempo

longo para o desenvolvimento de um novo método94,95.

Os parâmetros necessários para a transferência de métodos podem ser obtidos através

de equações desenvolvidas por Guillarme et al.94, 95, ou pela utilização de softwares como,

console de cálculo do UHPLC ACQUITY. Vale ressaltar que para uma transferência bem

sucedida, é necessário que a fase estacionária seja similar à do método já existente e a

proporção de fase móvel orgânica e aquosa (composição) deve ser constantes no início e fim

do gradiente de eluição. Se as dimensões da coluna são mantidas constantes e o tamanho

de partícula é reduzido, são obtidas melhorias na eficiência, resolução e capacidade de

picos. Se além da redução do tamanho da partícula, as dimensões da coluna também forem

reduzidas, o tempo de análise também será menor.

A transferência de métodos desenvolvidos por HPLC para UHPLC pode ser realizada,

no entanto, como qualquer outra técnica, a UHPLC também possui suas limitações.

Mudanças indesejáveis na seletividade, fator de retenção e eficiência têm sido atribuídas ao

fenômeno do aquecimento por fricção (do inglês, “Frictional heating”), devido ao atrito da FM

com a fase estacionária e ao aumento de pressão no sistema cromatográfico91. Entretanto,

estas dificuldades não têm limitado o emprego e a expansão da UHPLC, sendo realizados

alguns ajustes do método de partida se adequando nas análises por UHPLC.

3.4.2 Eletroforese capilar

A eletroforese capilar (CE do inglês, “capillary electrophoresis”) é uma técnica de

separação baseada na migração diferenciada de compostos iônicos ou ionizáveis em um

campo elétrico (Figura 14). Vários métodos de separação, com mecanismos singulares e

94

Guillarme, D.; Nguyen, D.; Rudaz, S.; Veuthey, J. L.; Eur. J. Pharmacol. 2007, 66, 475. 95

Guillarme, D.; Nguyen, D.; Rudaz, S.; Veuthey, J. L.; Eur. J. Pharmacol. 2008, 68, 430.


35

seletividade característica, são possíveis: fronteira móvel, zona, isotacoforese e focalização

isoelétrica96. O rápido avanço da eletroforese capilar decorre, em parte, da simplicidade

instrumental, mas principalmente da variedade dos modos de separação que podem ser

efetuados em uma única coluna capilar e da diversidade dos compostos passíveis de análise

em cada modo97.

Em eletroforese capilar no modo separação em solução livre (FSCE do ingês, “ free

solution capillary electrophoresis”), o tubo capilar é simplesmente preenchido com um

eletrólito, geralmente com características tamponantes. A separação ocorre como resultado

de duas estratégias: maximizar as diferenças entre as mobilidades efetivas dos solutos e

minimizar as causas de alargamento das zonas.

Figura 14: Representação esquemática do sistema de CE98

As equações tradicionais que descrevem resolução, eficiência e tempo de migração

em FSCE incorporam o fenômeno de difusão como única causa de alargamento das zonas,

e podem ser escritas como:

Equação (1)

Equação (2)

Equação (3)

96

Tavares, M. F. M. Quím. Nova 1996, 19, 173. 97

Tavres, M. F. M. Quím. Nova 1997, 20, 5, 493. 98

Segato, M. P.; Silva, C. R.; Jardim, I. C. S. F. Quim. Nova 2009, 32, 2, 431.


36

onde μi e μi+1 são as mobilidades aparentes de dois solutos eluindo em posições adjacentes,

μmédia é a mobilidade média dos solutos, μef é a mobilidade eletroforética do soluto i, μosm é a

mobilidade do fluxo eletroosmótico, V é a diferença de potencial aplicada, D é a média dos

coeficientes de difusão dos dois solutos, Ltot é o comprimento do capilar e Ldet é a distância

do ponto de injeção à posição do detector.

As equações (1) a (3) indicam que o uso de voltagens elevadas é vantajoso, pois

implica em um ganho de resolução e eficiência, assim como na diminuição do tempo de

análise. Outra observação pertinente é que, em separações difíceis, a resolução de pares de

solutos eluindo muito próximos pode ser melhorada pelo ajuste da magnitude do fluxo

eletroosmótico. Quando a mobilidade eletroosmótica for aproximadamente igual, mas de

sinal oposto à mobilidade dos solutos, um ganho de resolução é alcançado (equação 1). As

penalidades para este tipo de estratégia, no entanto, são: perda de eficiência (equação 2) e

aumento considerável do tempo da análise (equação 3).

Quando a separação envolve solutos com caráter ácido-base, a mobilidade

eletroforética do soluto depende do pH do eletrólito. Neste caso, o termo mobilidade efetiva,

o qual incorpora o produto das mobilidades eletroforéticas das espécies em equilíbrio e a

distribuição das concentrações relativas de cada espécie no pH considerado, é empregado.

Assim sendo, o controle do pH é aconselhável e a escolha de uma solução tampão

adequada tem implicações diretas na otimização da separação. Adicionalmente, a

suscetibilidade do fluxo eletroosmótico a variações de pH requer que o tampão apresente

constância no valor de pH (alta capacidade). Outras propriedades desejáveis para um

sistema tampão incluem: baixo valor de absorbância no comprimento de onda selecionado

para a análise, e baixa mobilidade, para minimizar a geração de calor por efeito Joule. Além

disso, a escolha do tampão está vinculada a considerações sobre a forma da banda: via de

regra, tampões contendo íons com mobilidade semelhante à do soluto previnem distorções

no perfil da banda e minimizam o seu alargamento.

De forma geral, os sistemas tampão são eficientes em um intervalo de pH

correspondente ao pKa, mais ou menos uma unidade. Em capilares de sílica fundida, o

intervalo de pH adequado para trabalho varia entre 2 e 11, mas em geral este intervalo é

limitado pela estabilidade do soluto. A concentração das soluções tampões usadas em

eletroforese capilar varia tipicamente entre 5 e 200 mmol L-1. Na escolha da concentração

são considerados vários efeitos. Altas concentrações favorecem o aumento da corrente


37

elétrica. Baixas concentrações podem aumentar a tendência de adsorção de certos solutos

na parede do capilar se tiverem afinidade pela sílica e, portanto, ocasionar alargamento e

distorção das bandas. Adicionalmente, em baixas concentrações, o fluxo eletroosmótico

(FEO do inglês, “eltroosmotic flow”) pode se tornar errático, o que dificulta a reprodutibilidade

dos tempos de migração e conseqüentemente prejudica a identificação inequívoca dos

solutos.

Na eletroforese capilar, a separação é conduzida em tubos com dimensões de 15 a

100 m de diâmetro interno, e 50 a 100 cm de comprimento, preenchidos com um eletrólito

condutor, e submetidos a ação de um campo elétrico96. O uso do capilar oferece muitas

vantagens sobre os outros meios utilizados para a eletroforese (placas de gel, papel, etc.).

Devido à relação entre a área superficial interna e o volume serem apreciavelmente

grande, possibilitando a dissipação eficiente de calor, gerado pela passagem de corrente

elétrica (efeito Joule)96. Além disso, a alta resistência elétrica do capilar permite o

estabelecimento de campos elétricos elevados (100 a 500 V/cm), resultando em

separações de alta eficiência (geralmente excede a 105 pratos teóricos), resolução

inigualável e tempos de análise apreciavelmente curtos. Outras vantagens da eletroforese

capilar são: pequena demanda de amostra, com volumes tipicamente da ordem de 1 a 10

nL, e a possibilidade de injeção e detecção em fluxo96.

A limitação primária dos métodos eletroforéticos em solução livre é a impossibilidade

de separar compostos neutros97. Em geral, compostos neutros migram no capilar por ação

exclusiva do fluxo eletroosmótico96, não havendo descriminação espacial e/ou temporal dos

solutos na chegada ao detector. Em 1984, Terabe e colaboradores99 introduziram uma

versão modificada da eletroforese capilar, a eletrocromatografia micelar ou cromatografia

eletrocinética micelar. Nesta nova versão, agentes tensoativos iônicos, em condições

apropriadas à formação micelar, são adicionados ao eletrólito de corrida proporcionando

assim um sistema cromatográfico de duas fases97. A partição diferenciada de solutos

neutros entre estas duas fases é responsável pela seletividade da separação.

99

Terabe, S.; Otsuka, K.; Ichikawa, K.; Ando, T. Anal. Chem. 1984, 56, 111.


38

3.4.2.1 Principais conceitos eletroforéticos

Em eletroforese capilar em solução livre, dois fenômenos são considerados

essenciais para explicar a separação dos analitos: a migração eletroforética e migração

eletroosmótica. A seguir serão descritos ambos fenómenos com maiores detalhes100.

3.4.2.1.1 Mobilidade eletroforética e mobilidade aparente

O movimento (migração) de espécies carregadas sob a influencia de um campo

elétrico é caracterizado pela mobilidade eletroforética, µef. A mobilidade não depende só

da densidade de carga do soluto (carga e tamanho da molécula), mas também da

constante dielétrica (Ɛ) e da viscosidade do eletrólito (ƞ). Na presença de FEO (2.5.2.1.2),

a mobilidade aparente (µa) é a soma das mobilidades eletroforéticas do analito, µef, e a

mobilidade do FEO, µFEO100.

µa = µef + µFEO Equação (4)

A mobilidade aparente pode ser determinada, experimentalmente, pela equação 5:

µa= I/ ta·E = I·L/ ta·V Equação (5)

onde I é a distância desde o ponto de injeção até o detector, ta é o tempo que a

espécie leva para migrar até o detector e E é o campo elétrico (V/L), onde V é a voltagem

aplicada e L é a distancia entre os dois eletrodos, que é o comprimento total do capilar.

Ao se establecer um potencial elétrico, os íons adquirem velocidades eletroforéticas

(vef), as quais são dependentes da intensidade do campo elétrico (E) e da µef de cada

espécie envolvida, segundo a equação 6:

vef = µef E = µef·V/ L Equação (6)

Em presença de FEO, a equação 7 pode ser reescrita:

va = µa E = µa·V/ L Equação (7)

100

Ponce, M. J. G. Tese de Doutorado, Instituto de Química, UNICAMP, 2011.


39

3.4.2.1.2 Fluxo eletroosmótico (FEO)

Dentre os varios tipos de capilares usados em CE (teflón, pyrex e sílica) o capilar de

sílica fundida é atualmente o mais usado. Por ser um material dielétrico, o mesmo permite

o emprego de alta tensão, além de possuir um recobrimento externo de poliimida que lhe

proporciona uma melhor resistência mecânica. O capilar de sílica contém grupos silanóis

(Si-OH) com um pka de 5,9, os quais ionizam quando estão em contato como uma solução

eletrolítica100.

[SiOH](S) [SiO-](s) + [H+](aq)

Com a ionização, a superficie do capilar fica carregada negativamente e uma

camada de contra-íons, no caso cátions do tampão, é estabelecida a fim de contrabalançar

o excesso de cargas negativas e, dessa forma, manter a eletroneutralidade no meio.

Assim, se estabelece uma dupla camada elétrica (Figura 15) e é gerada uma diferença de

potencial, que é chamada de potencial zeta (ƺ).

Figura 15: Dupla camada elétrica na parede do capilar e a criação do fluxo eletroosmótico.

A primeira camada é firmemente ligada por forças eletrostáticas (camada compacta)

e a outra é mais fracamente ligada (camada difusa). Ao se aplicar o campo elétrico dentro

da coluna capilar ocorre o deslocamento das cargas presentes da camada difusa no


40

sentido do eletrodo de carga contrária. No processo de migração, os íons transportam

consigo moléculas de água, o que induz, por sua vez, um fluxo da solução como um todo,

sendo este processo conhecido como fluxo eletroosmótico100.

Após o potencial elétrico ser estabelecido (geralmente entre 5 e 30 kV), os íons

(positivos) e as moléculas solvatadas migram em direção ao polo negativo, sendo este

considerado o fluxo normal.

O FEO está relacionado diretamente com o pH do eletrólito de corrida, visto que o

potencial zeta está ligado à ionização dos grupos silanóis da sílica. Em valores de pH

abaixo de 4, a ionização dos grupos silanóis é pequena e o FEO é baixo, enquanto que em

valores de pH acima de 9,0, os silanóis ficam completamente ionizados e, portanto, o FEO

é alto. A magnitude pode ser expressa em termos da velocidade ou mobilidade, segundo

as equações100:

vFEO = I/Δt Equação (8)

onde Δt é o intervalo de tempo necessário para o fluxoeletroosmótico percorrer o capilar.

µFEO = I/Et Equação (9)

onde t é o tempo necessário para o fluxo eletroosmótico percorrer o capilar.

vFEO = µFEO E Equação (10)

A presença do FEO indica que a migração das espécies, dentro do capilar, não

depende somente de suas respectivas mobilidades eletroforéticas, mas também da

mobilidade do FEO, como mencionado na equação 4.

Além do pH, outros fatores também alteram o FEO, como: viscosidade (ƞ) e

temperatura (T). O aumento da viscosidade do meio dificulta a mobilidade dos íons na

solução, ocasionando uma diminuição no valor da mobilidade do FEO. Mudanças de

temperatuda da ordem de um grau Kelvin acarretam variações de até 2% na viscosidade

do eletrólito e, por consequência, na mobilidade do FEO. A temperatura também pode

influenciar o valor de pH do eletrólito e causar variações de 0,5%. Desse modo, a

reprodutibilidade nos resultados poderá ser mantida, mantendo a temperatura constante.


41

A força iônica do eletrólito também pode causar efeito na variação da mobilidade do

FEO. Eletrólitos com elevada força iônica produzem compressão da dupla camada elétrica

e, com isso, diminuem o FEO.

Um aspecto interessante do FEO é que este apresenta um perfil de velocidade linear

praticamente planar, ou seja, as componentes da velocidade eletroosmótica dos analitos

em diferentes regiões do capilar são iguais, enquanto que o fluxo pressurizado, que ocorre

em cromatografia líquida capilar, apresenta um perfil parabólico e os analitos no centro do

capilar migram mais rapidamente que aqueles próximos à parede do tubo, causando

alargamento do pico, reduzindo a eficiência da separação100.

Figura 16: Perfis de velocidade dos fluxos produzidos por (A) campo elétrico e (B) por

pressão 100.

3.4.2.2 Eletroforese capilar acoplada à espectrômetria de massas

Desde sua introdução no fim dos anos 80 seja por Olivares et al.101, segundo alguns

autores, ou por Smith et al.102, para outros, a combinação de eletroforese capilar com

detecção por espectrometria de massas (CE-MS) tem recebido crescente atenção. O

sucesso desta combinação alia o alto poder de resolução e eficiência da CE com a

universalidade e detectabilidade que o MS oferece frente a outros sistemas de detecção

como, por exemplo, espectofotometria na região do UV-visível, bem como fluorescência

induzida a laser (LIF, do inglês “Laser Induced Fluorescence), que são pouco informativos

em relação à estrutura do analito.103

Atualmente as investigações nesta área estão dedicadas ao desenho e

desenvolvimento da instrumentação para que a CE-MS seja uma valiosa ferramenta para

101

Olivares, J. A.; Nguyen, N. T.; Yonker, C. R.; Smith, R. D.; Anal. Chem. 1987, 59, 1230. 102

Smith, R. D. Udseth HR Nature 1988, 331, 639. 103

Assunção, N. A.; Bechara, E. J.; Simionato, A. V. C.; Tavares, M. F. M. Quim. Nova 2008, 31, 8, 2133.


42

resolver cada vez mais questionamentos analíticos104. A eletroforese capilar acoplada ao

espectrômetro de massas tornou-se uma abordagem bem aceita, complementar e/ou

competitiva para as técnicas clássicas de separações hifenizadas105.

A combinação da evolução rápida da eletroforese capilar, com a capacidade de

detecção seletiva da espectrometria de massas, somada aos modos de ionização adaptáveis

(ESI, APCI, APPI, APLI) permitiu esses avanços. Seus diferentes métodos são

particularmente adequados para resolver os desafios de análise de misturas complexas, tais

como aquelas encontradas em pós-genômica105. Outro exemplo é o uso de CE-MS em

análise de alimentos promovendo importantes vantagens devido a combinação da grande

capacidade de separação de CE e o poder do MS na identificação e confirmação do analito

pelo método desenvolvido106.

3.4.3 Interfaces utilizadas para o acoplamento CE-MS

Desde que as separações em fase líquida foram acopladas ao espectrômetro de

massas, uma série de diferentes interfaces foram desenvolvidas e testadas com essa

finalidade. Muitas dessas interfaces, que foram originalmente desenvolvidas para a

hifenização de HPLC (high performance liquid chromatography) e MS, conseqüentemente,

foram utilizadas para o acoplamento da CE com MS107.

Combinando os métodos de eletroseparação capilar com MS, duas tarefas principais

são necessárias: primeiro, a transferência, de preferência completa, dos analitos da coluna

capilar para o orifício de MS e, em segundo lugar, um requerimento adicional

especificamente para métodos de eletroseparação, para proporcionar um aterramento

adequado para o circuito elétrico da coluna capilar. Diferentes tipos de interface cumprem

este papel107 acima, os quais são descritos a seguir.

3.4.3.1 Interface com eletrospray (ESI)

A interface com eletrospray é a mais comumente empregada quando se trata da

hifenação de CE com MS. De acordo com o princípio fundamental do modo de ionização do

104

Klampfl, C. W. Electrophoresis 2008, 29, 1955 105

Schrnitt-Kopplin, P. Electrphoresis 2009, 30, 1609. 106

Verardo,V.; Gomez-Caravaca, A. M.; Segura-Carretero, A.; Caboni, M. F.; Fernández-Gutiérrez, A.

Electrophoresis 2011, 32, 669. 107

Klampfl, C. W. Electrophoresis 2006, 27, 3.


43

eletrospray, ou seja, a protonação ou desprotonação dos solutos ou a formação de adutos

carregados, esta é uma técnica bem adequada para a análise de compostos polares,

mostrando assim boa compatibilidade com o tipo de analitos geralmente separados pela

CE107.

As três interfaces mais comuns encontradas na literatura para o acoplamento entre

CE e ESI-MS são: com líquido auxiliar coaxial, com junção líquida e, sem líquido auxiliar.

3.4.3.2 Interface com líquido auxiliar (coaxial sheath liquid)

A configuração mais comumente encontrada para o sistema CE-ESI-MS (Figura 17)

está associada à interface com líquido auxiliar pelas vantagens que oferece devido a sua

fácil construção, estabilidade e reprodutibilidade. Entretanto, a principal desvantagem é a

perda de detectabilidade, uma vez que os analitos são diluídos ao se solubilizarem no líquido

auxiliar, fornecendo limites de detecção maiores que o esperado103.

Uma alternativa para melhorar os resultados da análise baseia-se na otimização dos

parâmetros eletroforéticos (como pH, concentração e natureza do tampão) e do modo de

ionização (natureza e concentração de solvente orgânico e vazão do líquido auxiliar). Para

este sistema os tampões orgânicos mais utilizados são: ácido fórmico e acetato ou

bicarbonato de amônio103.

Figura 17: Interface CE-ESI-MS com líquido auxiliar103.


44

Em busca de melhores resultados, um novo modelo desta interface foi desenvolvido,

com formato de uma interface ortogonal à entrada da amostra, isto é, a 90° com relação ao

eixo do espectrômetro108 (Figura 18).

Figura 18: Interface ortogonal CE-ESI-MS com líquido auxiliar103.

Como vantagem, esta interface reduz o risco de contaminação ou obstrução da

entrada do MS e permite que alguns tampões moderadamente não voláteis sejam

empregados com a finalidade de obter uma separação mais adequada dos analitos em

estudo109.

Nesta interface, a agulha do ESI é aterrada e uma alta tensão é aplicada na entrada

do MS, para onde os íons são direcionados devido à interação eletrostática. Assim, a

probabilidade de apenas moléculas carregadas entrarem no MS é maior do que em

interfaces lineares, aumentando a detectabilidade das interfaces ortogonais. Por essas

razões, a interface ESI ortogonal é a mais usada e comercializada para o acoplamento CE-

ESI-MS103.

3.4.3.3 Interface sem líquido auxiliar (sheathless)

Esta modalidade de interface é vista experimentalmente como a mais difícil para o

acoplamento CE-ESI-MS, pela dificuldade em manter simultaneamente os circuitos elétricos

108

Lu, M.; Tong, P.; Xiao, H.;Xia, S.; Zheng, X.; Liu, W.; Zhang, L.; Chen, G. Electrophoresis 2007, 28, 1461. 109

Liu, C. C.; Alary, J. F.; Vollmerhaus, P.; Kadkhodayan, M. Electrophoresis 2005, 26, 1366.


45

de CE e ESI. O problema pode ser contornado pela deposição de um material condutor (por

exemplo, ouro, prata, polímero condutor ou grafite) na forma de um filme fino sobre a

extremidade do capilar110. A tensão é aplicada na saída do capilar sob o material condutor

depositado na sua extremidade.

Embora conceitualmente seja a mais simples e mais adequada, este tipo de

interface apresenta limitações como: o curto tempo de vida, em que apresenta uma interface

delicada para ser montada, a formação de espécies químicas originadas a partir das reações

eletroquímicas nesta superfície, sendo detectadas pelo espectrômetro de massas e, por fim,

a necessidade de filmes de cobertura com ótima qualidade, tendo em vista o funcionamento

adequado do sistema de ionização (ESI)103 . (Figura 19)

Figura 19: Interface CE-ESI-MS sem líquido auxiliar. O filme depositado está representado

pela parte escura103.

3.4.3.4 Interface com junção líquida (liquid junction)

Segundo Assunção e colaboradores103, nesta configuração, um eletrodo é inserido

na extremidade próxima à entrada do MS pela junção do capilar com outro capilar e o ponto

onde o sistema é aterrado. O capilar eletroforético termina em um reservatório contendo um

líquido auxiliar, usado para fechar o circuito eletroforético, e este é alinhado com a agulha do

eletrospray, posicionada do lado oposto do reservatório. O contato elétrico para fechar o

circuito é estabelecido através do líquido auxiliar (Figura 20).

110

Viberg, P.; Skoog, K.; Nilsson, S.; Anal. Chem. 2004, 76, 4241.


46

Figura 20: Interface CE-ESI-MS com junção líquida.

A vantagem deste tipo de acoplamento consiste na flexibilidade de escolha do

eletrólito de separação e também pelos modos independentes de operação do equipamento

de CE e ESI. Entretanto, pode ocorrer a formação de bolhas no eletrodo pela eletrólise

originada das reações eletroquímicas, ocasionando interrupção no sistema de CE e o volume

morto que leva a um aumento da dispersão, resultando na perda de eficiência.


47

Capítulo 4

Materiais e métodos


48


49

Capítulo 4: Materiais e métodos

4.1 Reagentes

4.1.1 Utilizados no Brasil

Os padrões dos antioxidantes fornecidos pela Sigma-Aldrich foram: ácido gálico

(C7H6O5), ácido rosmarínico (C18H16O8), quercetrina hidratada (C21H14O6 H2O). Os padrões

dos antioxidantes fornecidos pela Fluka Analytical foram ácido ferúlico (C15H10O9), canferol

(C15H10O6), ácido cafeico (C9H8O4) e rutina tri-idratada (C27H30O16 3 H2O) (São Paulo,

Brasil).

Hidróxido de sódio (NaOH) por Sigma-Aldrich (São Paulo, Brasil), Os solventes

orgânicos acetona (C3H6O), acetonitrila (CH3CN) e metanol (CH3OH) por Tedia (Rio de

Janeiro, Brasil).

4.1.2 Utilizados na Espanha

Os padrões dos antioxidantes fornecidos pela Sigma-Aldrich foram: ácido gálico

(C7H6O5), ácido rosmarínico (C18H16O8), quercetrina hidratada (C21H14O6 H2O). Os padrões

dos antioxidantes fornecidos pela Fluka Analytical foram ácido ferúlico (C15H10O9), canferol

(C15H10O6), ácido cafeico (C9H8O4) e rutina tri-idratada (C27H30O16 3 H2O) (São Paulo,

Brasil).

Ácido bórico (H3BO3), hidróxido de sódio (NaOH) por Sigma-Aldrich (Madri,

Espanha), bicarbonado de amônio (NH4HCO3) e ácido fórmico (HCOOH), por Fluka

Analytical (Madri, Espanha). Acetato de amônio (CH3COONH4) por Panreac (Madri,

Espanha). Os solventes orgânicos acetona (C3H6O), acetonitrila (CH3CN) e 2-propanol

(C3H7O) por Lab-Scan (Madri, Espanha), metanol (CH3OH) por Hipersolv Chromanorm

(Madri, Espanha), amônia (NH3) por Merck (Madri, Espanha).

4.2 Equipamentos

Equipamentos de eletroforese capilar

Agilent Technologies 7200 com detector de arranjo de diodos (DAD) (Santa

Clara, USA) equipado com software ChemStation (equipamento1).


50

Beckman P/ACE 2050 (Fullerton, USA) equipado com detector UV-vis operando

em 200, 214 e 254 nm (equipamento 2).

Beckman P/ACE 5010 (Fullerton, USA) acoplado com um espectrômetro de

massas do tipo tempo de voo“microTOF” de Bruker Daltonik, interface ESI

interfacemodelo G1607A de Agilent Technologies. Sheath liquid realizado através de

uma bomba-seringa modelo 74900-00-05 Cole-Palmer (Vernon Hills, USA).

Equipamento de UHPLC-MS/MS

Waters AcquityTM Ultra performance LC equipado com espectrômetro de

massas triploquadrupolar (Waters - Quattro Micro TM APPI) (Milford, USA).

Coluna Waters Acquity UPLC BEH C-18 1,7µm (21 x 50 mm d.i.)

Equipamento de HPLC-DAD

Shimadzu Prominence modelo LC -20 AD/ T LPGEKIT com detector de

arranjo de diôdos (PAD ou DAD) e injetor automático (Kyoto, Japão) equipado com

sofware LC- Solution (equipamento 3).

Coluna Agilent Zorbax – SB-C-18 3,5 µm (100 x 4,6 mm d.i.)

Equipamentos de HPLC-UV

Waters modelo 510 constituído por Bomba Waters modelo 510 (Milford, EUA)

com detector UV-vis Shimadzu modelo SPD -10 AVP (Milford, EUA) equipado com

software Chromperfect.

Coluna agilent zorbax- SB- C-18 3,5 µm (100 x 4,6 mm d.i.)

HPLC Agilent Technologies, com detector de ultravioleta (UV) e injetor

automático equipado com sofware LC- Solution (Milford, EUA).

coluna agilent Zorbax-SB-C-18 3,5 µm (100 x 4,6 mm d.i.) (equipamento 4)


51

Outros equipamentos

Sistema de extração em fase sólida Supelco, modelo VisipredTM (Saint-

Quentin-Fallavier, Alemanha).

Rotaevaporador R-210 Buchi Labortechnik AG (Flawil, Suiça)

Sistema Milli-Q Water Millipore (Billerica, USA).

pHmetro Seven easy Mettler-Toledo 8603 (China)

Estufa modelo 315 E Yamato (Kyoto, Japão).

Deionizador Millipore Direct-QTM (Bellerico, USA).

Extrator de Solvente acelerado ASE 200, Dionex (Sunnyvale, USA)

Leitor de placas BioTek Instrument (Winooski, USA).

Cartuchos para SPE

Cartucho Supelclean LC C-18 (500 mg),Supelco (Park Bellefonte, EUA)

Cartucho Isolute ENV+ (200 mg),Symta (Uppsala, Suécia).

Cartucho Isolute C-18 (EC) (100 mg) Symta (Uppsala, Suécia).

4.3 Coleta e preparo do material vegetal

As amostras de carqueja foram coletadas no campo experimental do Centro

Pluridisciplinar de Pesquisas Química, Biológia e Agrícola (CPQBA) (Campinas, Brasil).

Esta espécie está depositada no Ministério da agricultura sob o nome CPQBA 1 e sua

excicata está depositada no herbário do CPQBA sob o número 1286. As amostras foram

coletadas anualmente, no período de 2010-2012 no mês de fevereiro, no período da

manhã. Os resultados apresentados neste trabalho são referentes a amostra coletada em

2012. O material foi estabilizado por 10 min a 70°C e seco a 60°C em estufa Fanem,

modelo 515. Após a secagem procedeu-se a pulverização das folhas em moinho de

bancada, e o armazenamento foi em frasco de vidro sob refrigeração e ao abrigo da luz. O

fluxograma do preparo de material vegetal está representado na Figura 21.


52

Figura 21: Fluxograma da preparação do material vegetal.

4.4 Preparação de soluções padrão dos compostos fenólicos

5,0 mL de soluções estoque de padrões dos compostos fenólicos - ácido rosmarínico,

ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido gálico, canferol, quercetrina e rutina- foram preparadas na

concentração de 500 µg·mL-1, através de pesagem cuidadosa da respectiva massa,

solubilização em solvente adequado (metanol - grau cromatográfico, filtrado em membrana

porosa, desgaseificado em ultrassom), transferência quantitativa para o balão volumétrico,

aferição do balão e subseqüente homogeneização da solução. A partir delas, as soluções

foram diluídas e empregadas na faixa de concentração de trabalho. A estrutura molecular

dos compostos pode ser vista na Figura 22.

500 g carqueja

Estabilizado 10 min.;

70°C;

Armazenamento (vidro);

Refrigeração 4°C ao abrigo de luz.

Pó de carqueja

Secagem em estufa Fanem ( 60°C / 24h)

Pulverização em moinho de bancada


53

Figura 22: Estruturas químicas dos compostos fenólicos em estudo.

4.5 Preparo da amostra e extração dos compostos fenólicos

4.5.1 Extração com Soxhlet

Para esta extração foram avaliados o tempo de extração (60, 30 e 15 min.), tipo de

solvente de extração água, metanol e tetraidrofurano (H2O, MeOH e THF), tempo de hidrólise

empregando uma solução H2O : MeOH (33: 66 v/v- ajustado a pH 2,65 com H3PO4) (60, 30 e

15 min.). Para a limpeza da amostra foi empregada a extração em fase sólida (SPE). A

ativação da fase estacionária foi realizada empregando-se uma solução H2O: MeOH (33 : 66

v/v) pH 2,65 ajustado com H3PO4 (0,1 mol L-1), em razão da escolha da fase móvel e pKa

dos compostos fenólicos. Na etapa da extração em fase sólida, foram testados volumes

diferentes de solvente (0,5; 2,0 e 10,0 mL) para averiguação de qual seria o volume

adequado de extrato que deveria ser percolado no cartucho de SPE, conforme Tabela 2.

Nestes ensaios, uma variável foi mantida fixa e a outra foi alterada, com a finalidade de

selecionar aquela que apresentasse a melhor condição experimental. Como solvente de

eluição foram avaliados o éter, metanol e tetraidrofurano ( Et2O, MeOH, THF).

HO

HO

OH

OH

O

ÁCIDO GÁLICO

(pKa1-3= 3,94; 4,26; 11,45)

OOH

HO

HOO

O

OH

OH

O

OH

OH

OOH

HO

OR

QUERCETRINA

(pKa1-3= 7,19; 9,36; 11,56)

O

OH

OOH

HO

OH

CANFEROL

(pKa1-3= 7,05; 9,04;11,04)

OH

O

HO

HO

ÁCIDO CAFEICO

(pKa1-2= 4,43; 8,69)

O

OH

OH

OOH

HO

O OHO

OH

OH

O

O

OHHO

H3CHO

OH

O

OCH3

HO

ÁCIDO FERÚLICO

(pKa1-2= 4,52; 9,39)

RUTINA

(pKa1-3= 7,1; 9,15;11,65)

ÁCIDO ROSMARÍNICO(pKa= 2,5)


54

Tabela 2: Condições experimentais da otimização dos tempos de extração e hidrólise.

Condição Tempo de

Extração

(min)

Tempo de

hidrólise (min)

Volume de

extrato SPE (mL)

Volume de

solvente SPE

(mL)

1 15 30 0,2 0,5

2 15 30 0,2 2,0

3 15 30 0,4 0,5

4 15 30 0,4 2,0

5 15 30 0,4 10,0

6 15 30 0,5 0,5

7 15 30 0,5 2,0

8 15 30 0,5 10,0

9 15 60 0,2 0,5

10 15 60 0,2 2,0

11 15 60 0,2 10,0

12 15 60 0,4 0,5

13 15 60 0,4 2,0

14 15 60 0,4 10,0

15 30 15 0,2 0,5

16 30 15 0,2 2,0

17 30 15 0,2 10,0

18 30 15 0,2 0,5

19 30 15 0,4 2,0

20 30 15 0,4 10,0

21 30 15 0,4 0,5

22 30 15 0,5 2,0

23 30 15 0,5 10,0

24 30 30 0,2 0,5

25 30 30 0,2 2,0

26 30 30 0,2 10,0

27 30 30 0,4 0,5

28 30 30 0,4 2,0


55

29 30 30 0,4 10,0

30 30 30 0,5 0,5

31 30 30 0,5 2,0

32 30 30 0,5 10,0

33 30 60 0,2 0,5

34 30 60 0,2 2,0

35 30 60 0,2 10,0

36 30 60 0,4 0,5

37 30 60 0,4 2,0

38 30 60 0,4 10,0

39 30 60 0,5 0,5

40 30 60 0,5 2,0

41 30 60 0,5 10,0

42 60 15 0,2 0,5

43 60 15 0,2 2,0

44 60 15 0,2 10,0

45 60 15 0,4 0,5

46 60 15 0,4 2,0

47 60 15 0,4 10,0

48 60 15 0,5 0,5

49 60 15 0,5 2,0

50 60 15 0,5 10,0

51 60 30 0,2 0,5

52 60 30 0,2 2,0

53 60 30 0,2 10,0

54 60 30 0,4 0,5

55 60 30 0,4 2,0

56 60 30 0,4 10,0

57 60 30 0,5 0,5

58 60 30 0,5 2,0

59 60 30 0,5 10,0

60 60 60 0,2 0,5


56

61 60 60 0,2 2,0

62 60 60 0,4 0,5

63 60 60 0,4 2,0

64 60 60 0,4 10,0

65 60 60 0,5 0,5

66 60 60 0,5 2,0

67 60 60 0,5 10,0

A acetona foi avaliada posteriormente como solvente de eluição no volume de 6 mL,

correspondente a uma razão 1:12.

Após a otimização das condições de extração, a validação do método e as análises

das amostras foram realizadas nas seguintes condições:

6,50 g de folhas de carqueja maceradas foram submetidas a extrações a quente

(Soxhlet) utilizando 150 mL de metanol (MeOH) como solvente extrator. O extrato bruto (A)

foi hidrolisado em meio ácido (MeOH:H2O 66:33 v/v- água acidificada com H3PO4– 0,1%, pH

2,65), por 30 min, rotaevaporado e redissolvido em 15,0 mL de MeOH (extrato A1). Esse

procedimento foi utilizado para as técnicas HPLC-UV, UHPLC-MS/MS e CE-UV. Os extratos

avaliados pela técnica de CE-MS foram hidrolisados em solução ácida MeOH:H2O, 66:33 v/v,

água acidificada com 0,1% de ácido bórico, a pH 2,65 durante 30 min a 25ºC. A seguir os

extratos (A1) foram submetidos à extração em fase sólida (SPE) empregando cartuchos

contendo sorventes do tipo C-18 (Supelco).

Os cartuchos foram ativados empregando 3,0 mL de metanol e 3,0 mL de água (pH

2,65 ajustada com solução H3PO4 0,1% ou com ácido bórico 0,1%), seguido da adição de 0,5

mL do extrato redissolvido (A1). Após concentração dos solutos no sorvente do cartucho,

estes foram eluídos utilizando 6,0 mL de acetona como solvente extrator. O extrato (B)

proveniente do cartucho foi evaporado com N2 e redissolvido em 1,0 mL de MeOH. O eluato

foi filtrado em filtro de nylon 0,22 µm antes de ser injetado no equipamento. Este

procedimento foi realizado para todas as técnicas de análise. Para as análises com CE-MS,

o extrato foi dividido em aliquotas de 100,0 µL de volume, evaporado com um fluxo de N2

gasoso e armazenado em freezer a uma temperatura de -20ºC até as amostras serem

analisadas. Antes da análise por CE-MS, as alíquotas secas foram dissolvidas a 100,0 µL

com metanol, e foi preparada uma solução hidro-alcóolica empregando 40,0 µL de

metanol:água 3:1, v/v. O fluxograma está representado na Figura 23.


57

Figura 23: Fluxograma da extração com Soxhlet.

Soxhlet;

MeOH (150 mL) (30 min.);

Hidrolisado (30 min.) MeOH:H2O 66:33 v/v, pH 2,65 ;

Solvente evaporado;

Redissolvido em MeOH;

Eluído com 6 mL de Acetona

Evaporação (N2);

Ressuspendido em 1 mL de MeOH;

100 µL avolumado para 2 mL

6,50 g de pó de carqueja

0,5 mL de extrato (A1)

Extrato (B)

Injeção no equipamento

SPE C-18

Extrato ( A)

Extrato( A1- hidrolisado)

Ativação do cartucho;

3 mL de MeOH;

3 mL H2O (H3PO4 0,1% v/v), pH 2,65


58

4.5.2 Extração com líquido pressurizado

A extração com líquido pressurizado foi realizada com dois diferentes solventes isto é,

metanol e etanol. As extrações empregando 100% de metanol ou 100% de etanol foram

realizadas em quatro diferentes temperaturas de extração (50 75, 100 e 150ºC). O tempo de

extração estática foi mantido constante em 20 minutos para todos os testes. Antes de cada

extração, houve uma etapa de pré-aquecimento das células de extração efetuada durante

um determinado tempo, o qual foi fixado pelo sistema (5 minutos quando a temperatura de

extração foi de 50, 75 e 100ºC, e de 7 min, quando a temperatura de extração foi de 150ºC).

Todas as extrações foram realizadas empregando células de extração de 11,0 mL, contendo

2,0 g de amostra e misturada homogeneamente com 2,0 g de areia do mar para evitar o

entupimento do sistema. O procedimento de extração é como se segue: (i) a amostra é

carregada na célula, (ii) a célula é preenchida com o solvente até uma pressão de 1500 psi,

(iii) o tempo de aquecimento é aplicado, (iv) a extração estática inicia e todas as válvulas do

sistema ficam fechadas, (v) a célula é lavada com o solvente de extração com um volume de

célula de 60%, (vi) o solvente é removido da célula com N2 gasoso e (vii) a despressurização

ocorre. Entre as extrações, uma lavagem de todo o sistema foi feita para evitar qualquer

contaminação. Após as extrações, os solventes foram evaporados usando um evaporador

rotativo e armazenados a -22°C. Pouco antes da análise no CE-MS, os extratos secos foram

novamente dissolvidos com 100,0 µL de metanol e filtrados através de filtros de nylon 0,22

µmol L-1. O extrato obtido foi hidrolisado em solução ácida MeOH:H2O, 66:33 v/v, água

acidificada com 0,1% de ácido bórico, a pH 2,71 durante 30 min a 25ºC. O extrato hidrolisado

foi seco utilizando um evaporador rotativo. Uma vez obtido o extrato seco, este foi

redissolvido em 5,0 mL de metanol e purificado por um procedimento de SPE usando os

cartuchos Supelclean LC C-18 (500 mg) da Supelco. Estes cartuchos foram ativados com 3,0

mL de água com 0,1% de ácido bórico, a pH 2,71 e 3,0 mL de metanol. Em seguida, 0,50 mL

de extrato metanólico de carqueja foram carregados no cartucho. A eluição da amostra foi

realizada com 6,0 mL de acetona. O extrato obtido foi evaporado até à secura com N2

gasoso e redissolvido em 1,0 mL de metanol. O extrato foi dividido em aliquotas de 100,0µL

de volume, evaporado com N2 gasoso e armazenado a -20ºC até à análise. Antes da análise

CE-MS, as alíquotas secas foram dissolvidas em 100,0 µL de metanol, e foi preparada uma

solução hidro-alcóolica empregando 40,0µL de MeOH:H2O 3:1, v/v. O fluxograma está

representado na Figura 24.


59

Figura 24: Fluxograma da extração com líquido pressurizado.

4.6 Avaliação da atividade antioxidante dos extratos

4.6.1 Determinação de fenóis totais

Fenóis totais foram avaliados tanto para os extratos obtidos por Soxhlet como pelos

obtidos via PLE. Os valores encontrados foram estimados como equivalentes de ácido gálico

(GAE), e expressos em mg de ácido gálico/g de extrato de acordo com os ensaios de Folin–

Amostra carregada na célula;

Célula preenchida com solvente (1500 psi);

Válvulas fechadas;

Lavadas com solvente de extração (60% -volume célula);

Remoção do solvente (N2);

Despressurização

Evaporação (rotavapor).

Extrato seco

Extrato

Extração estática ( 20 min.)

2,0 g de pó de carqueja

+

2,0 g de areia


60

Ciocalteau111. A reação consiste da mistura de 600,0 µL de água e 10,0 µL de amostra com

50,0 µL do reagente de Folin-Ciocalteau não diluído. Após 1 minuto, 150,0 µL de uma

solução de Na2CO3 20% (m/v) foram adicionados e o volume final completado para 1,0 mL

com água. Após 2h de incubação a 25°C, 300,0 µL da mistura foi transferida para uma

microplaca. A absorbância foi medida em 760 nm num espectrômetro leitor de placas e

comparado com a curva analítica de ácido gálico (0,031 – 2,0 mg·mL-1) elaborada da mesma

maneira. Os dados foram apresentados como média das análises em duplicata. Este método

foi adaptado de Miron et al.112 O fluxograma está representado na Figura 25.

Figura 25: Fluxograma para a determinação de fenóis totais.

111

M. Kosar, Dorman, H. J. D., Hiltunen,R. Food Chem. 2005, 90, 525. 112

Miron,T.L., Plaza, M., Bahrim, G., Ibáñez, E., Herrero M., J. Chromatogr. A 2011, 1218, 4918.

50 µL reagente Folin- Ciocalteau;

1 min.;

H2O ( Vfinal = 1,0 mL) ;

2h incubação a 25°C

Transferidos para microplaca;

Leitura de absorbância (λ = 760 nm);

300 µL mistura

600,0 µL H2O + 10,0 µL amostra

150 µL Na2CO3 20% (m/v)

Resultados em mg de ácido/ g

de extrato


61

4.6.2 Capacidade antioxidante usando ensaios DPPH

A capacidade antioxidante de todos os extratos obtidos foi medida usando ensaios de

DPPH (do inglês, “2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl”) seguindo protocolo de Brand-Williams et

al113. Para isto, uma solução foi preparada dissolvendo 23,5 mg de DPPH em 100,0 mL de

metanol. Esta solução estoque foi diluída numa razão 1:10 com metanol. Diferentes

concentrações de extratos foram testadas (0,5 a 8,0 mg mL-1). 25,0 µL destas soluções

contendo os extratos foram adicionadas a 975,0 µL de solução diluída de DPPH para

completar o volume final de 1,0 mL. Após 4h a temperatura ambiente, 300,0 µL da mistura foi

transferida para uma microplaca e a absorbância foi medida a 516 nm num espectrômetro

leitor de placas. Soluções DPPH-metanol (0,50 a 1,5 mg mL-1) foram usadas como

referência. A concentração de DPPH restante foi calculada a partir da curva analítica. A

percentagem remanescente de DPPH versus a concentração de extrato foi então plotada

para a obtenção da quantidade de antioxidante necessária para diminuir a concentração

inicial de DPPH em 50% (EC50). Assim, quanto menor o valor EC50, maior a capacidade

antioxidante. As medições foram feitas em triplicata. O fluxograma está representado na

Figura 26.

113

Herrero, M., Plaza, M., Cifuentes, A., Ibañez, E., J. Chromatogr. A 2010, 1217, 2512.


62

Figura 26: Fluxograma para a determinação da atividade antioxidante.

4.7 Condições eletroforéticas empregando detecção UV-vis

4.7.1 Equipamento 1

O capilar usado tinha 40 cm de comprimento efetivo (Leff) com 50 µm de d.i, fornecido

pela Agilent Technologies. O capilar primeiramente foi condicionado com hidróxido de sódio

(1 mol L-1) por 10 min para ativar os grupos silanóis presentes no capilar. Em seguida foi

lavado com água deionizada MiliQ por 20 min, para retirar o excesso de NaOH. A terceira

etapa do condicionamento consistiu na introdução do tampão tetraborato de potássio na

concentração de análise da amostra, sob pressão 20 psi, por 10 min e depois 10 min

aplicando voltagem (25 kV). As injeções foram feitas no modo anódico usando pressão de

0,5 psi durante 10 s.

Para a otimização da separação eletroforética, foram variadas a concentração de

Diluição numa razão 1:10 com metanol (v/v);

Adição de 975,0 µL DPPH dil. ( Vfinal = 1,0 mL) ;

4h incubação a 25°C

Transferidos para microplaca;

Leitura de absorbância (λ = 516 nm).

300 µL mistura

23,5 µL DPPH em 100,0 mL MeOH

(solução estoque)

Resultados de Ec50 em (µg/mL)

25,0 µL solução extrato (m/v)

(0,50 – 0,80 mg/mL)


63

tampão (faixa de 10 a 40 mmol L-1), porcentagem de modificador orgânico (0, 5 % e 10 %),

pH (9 e 10) e voltagem (20 e 25 KV). Para cada ensaio, os parâmetros eficiência (N),

resolução (Rs) e mobilidade efetiva (μeff) foram calculados para cada analito de interesse.

Essas análises foram desenvolvidas com detecção com ultravioleta a um comprimento de

onda (ʎ) de 270 nm.

4.7.2 Equipamento 2

A separação foi efetuada utilizando um capilar de sílica fundida (85 cm x50 µm di,)

fornecido pela Composite Metals Service. Antes do primeiro uso, o capilar foi condicionado

com NaOH (1 mol L-1) durante 20 min, seguido de15 min com água e 15 min com BGE,

utilizando-se em todos os casos N2 pressurizado a 20 psi (1380 mbar). Entre as análises, o

capilar foi condicionado com hidróxido de amônio (25 mmol L-1) por 3 min, água por 6 min e

BGE (eletrólito de corrida, do inglês “background electrolyte”) por 6 min. As injeções foram

feitas no modo anódico usando pressão de 0,5 psi de N2 durante 10 s. Diferentes tampões de

separação foram testados (bicarcarbonato de amônio, acetato de amônio, carbonato de

amônio e ácido bórico / hidróxido de amônio). A detecção foi realizada em 200 e 280 nm. As

condições de separação foram otimizadas neste equipamento para posterior utilização no

CE-ESI-TOF/MS.

4.8 Condições eletroforéticas empregando detecção CE-ESI-TOF/MS

As análises por CE-ESI-TOF/MS foram realizadas em um capilar de sílica fundida (85

cm x 50 µm di) fornecido por Composite Metals Service. Antes da primeira utilização, o

capilar foi condicionado com NaOH (1 mol L-1) durante 20 min, seguido de 15 min com água

e 15 min com BGE, utilizando-se em todos os casos N2 pressurizado a 20 psi (1380 mbar).

Entre as análises, o capilar foi condicionado com hidróxido de amônio (25 mmol L-1) por 3

min, água por 6 min e BGE por 6 min. As injecções foram feitas com N2 a 0,5 psi durante 10

s. A separação foi realizada a 27 kV com um BGE constituído por hidrogêno carbonato de

amônio, acetato de amônio, formiato de amônio, 10 mmol L-1, pH 10 (ajustado com hidróxido

de amônio, 1 mol L-1). O contato elétrico na ponta da agulha ESI foi estabelecido através de

um líquido auxiliar composto de 2-propanol: água (50:50, v/v) a uma vazão de 0,24mL/h. O


64

TOF-MS foi operado no modo de íons negativos. O gás nebulizador selecionado/condições

de secagem de gás foram: 4 psi de pressão do gás nebulizador e 4 L/min de vazão a 250ºC.

4.9 Condições cromatográficas de separação por HPLC-UV

Incialmente foram feitas tentativas para desenvolver um método empregando HPLC

no modo de eluição isocrático, entretanto, as melhores condições de análise ocorreram no

modo de eluição por gradiente em pH ácido, num comprimento de onda de 270 nm a uma

vazão de 1,00 mL/min,. A melhor condição de separação cromatográfica foi a seguinte:

4.9.1 Equipamento 3

Coluna Agilent Zorbax-SB-C18 3,5 µm (100 x 4,6 mm d.i.). Fase móvel : A= H2O (pH =

2,65) e B= MeOH . Gradiente: 33% B durante 3 min; 33% a 50 % B em 2 min; 50 % a 60 % B

em 8 min; 60% a 70% B em 5min; 70 % a 80 % B em 4 min; 80% a 90% B em 4 min; 90% a

100% B em 3 min; 100% durante 3min; 100 % a 33 % B em 1 min. Vazão: 1.0 mL min-1.

Detecção : UV à 270 nm. Volume de injeção : 10 µL

4.9.2 Equipamento 4

Coluna Agilent Zorbax-SB-C18 3,5 µm (100 x 4,6 mm d.i.). Fase móvel : A= H2O (pH =

2,65) e B= MeOH . Gradiente: 15% a 30% B em 5 min; 30% a 40 % B em 1 min; 40% por

7min; 40% a 60% B em 2 min; 60 % a 80 B % em 2 min; 80 a 100% B em 1 min; 100% a

15% em 2 min; 15% B durante 3 min. Vazão: 1,0 mL min-1. Detecção: DAD à 270 nm.

Volume de injeção: 10 µL.

4.10 Condições cromatográficas de separação por UHPLC-MS/MS

A otimização da análise cromatográfica empregando UHPLC-MS/MS foi iniciada

utilizando o modo de análise de detecção do triploquadripolo full scan, para localizar a massa

molecular dos compostos de interesse. Para a identificação e construção das curvas

analíticas foi empregado o modo SIM (do inglês, “single ion monitoring”) e para a

confirmação da presença dos compostos fenólicos na amostra, foram monitoradas as

transições m/z dos íons precursores e íons produtos. As condições experimentais de análise

foram: coluna Waters Acquity UPLC BEH C-18 1,7 μm (21 x 50 mm d.i.); Fase móvel: A=

H2O (0,1% ácido fórmico) e B= ACN (0,1% ácido fórmico). Gradiente: 3% B por 1 min; 3% a


65

15% B em 4 min; 15% a 40% em 3 min; 40% a 3% em 1 min. Vazão: 0,350 mL min-1. Modo

de Ionização: ESI- (ionização por eletronebulização no modo negativo, 30 kV). Volume de

injeção: 3,0 μL. Detecção: espectrômetro de massas triploquadrupolar.

4.10.1 Monitoramento do íon simples (do inglês, “single ion monitoring”, SIM).

Os intervalos de detecção para os compostos fenólicos em estudo foram: ácido gálico

(0,00-1,50min), ácido cafeico (2,00-3,50min), ácido ferúlico (4,00-4,60min), rutina (4,60-

5,15min), quercetrina (5,15-5,50min), ácido rosmarínico (5,50-6,50min), canferol (6,50-

7,50min).

4.10.2 Monitoramento múltiplo de reação (do inglês, “monitoring reaction multiple”,

MRM).

Os intervalos de detecção para os compostos fenólicos em estudo foram: ácido gálico

(0,28-0,60min), ácido cafeico (2,35-3,15min), ácido ferúlico (4,10-4,70min), rutina (4,65-

5,10min), quercetrina (5,25-5,60min), ácido rosmarínico (5,55-5,90min), canferol (6,70-

7,20min).

4.10.2.1 Transições m/z monitoradas

Ácido gálico (169>79 e 169>125), ácido cafeico (179>89 e 179>135), ácido ferúlico

(193>178 e 193>134), rutina (609>301 e 609>271), quercetrina (447>300 e 447> 271),

ácido rosmarínico (359>197 e 359>161) e canferol (285>93 e 285>187)

4.10.2.2 Parâmetros do espectrômetro de massas sequencial (MS/MS) empregados

Voltagem do capilar 3Kv, extrator 3 V, RF Lens 0,2V, temperatura da fonte 120 °C,

temperatura de dessolvatação 400 °C, vazão do gás de dessolvatação 600 L h-1, vazão do

cone 120 L h-1

4.11 Efeito matriz

Para avaliação do efeito matriz foi empregado o método “adição pós-extração”. Os

valores do efeito matriz (%) foram obtidos com base na comparação das inclinações das


66

curvas analíticas dos analitos preparados em solvente e no extrato da matriz (branco

fortificado), conforme descrita pela equação 11114.

100100(%)

solventenopreparadaanaliíticacurvadainclinação

matriznapreparadaanalíticacurvadainclinaçãomatrizEfeito

Equação (11)

As porcentagens do efeito matriz indicam como os componentes endógenos da

carqueja atuam na resposta do detector. Valores negativos de efeito matriz indicam que há

redução do sinal analítico, valores positivos indicam aumento do sinal analítico dos analitos.

Não é observado efeito matriz quando as porcentagens estão próximas a 0%115, 114.

4.12 Validação dos métodos

Os métodos foram validados seguindo as figuras de mérito: linearidade, seletividade,

faixa linear, precisão, exatidão, limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ), de

acordo com os critérios descritos pela Anvisa116.

4.12.1 Seletividade

A seletividade do método foi avaliada usando os parâmetros de tempo de migração e

os espectros de UV para CE-UV, tempo de migração e m/z para CE-MS, tempo de retenção

e espectro de UV para HPLC-UV, tempo de retenção, massa molecular e transições m/z do

íon precursor e íons produtos para UPLC-MS/MS.

4.12.2 Linearidade

A linearidade foi estabelecida através das curvas analíticas obtidas por análises em

triplicata para 5 níveis de concentração para cada composto. As curvas foram geradas pela

injeção das soluções extraídas e fortificadas com os compostos fenólicos e também pelas

soluções preparadas em solvente. A linearidade e a sensibilidade foram expressas através

do coeficiente de correlação e o coeficiente angular da curva analítica, respectivamente.

114

Economou, A.; Botist, H.; Antoniou, S.; Tsipi, D J. Chromatogr. A 2009, 31, 1216, 5856. 115

Taylor, P. J. Clin. Biochem. 2005, 38, 328. 116

Brasil, Agência Nacional de Vigilância Sanitária; Resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003, Diário Oficial

da União, 02/06/2003.


67

4.12.3 Limites de detecção e quantificação

Os limites de detecção e de quantificação foram estimados pela injeção de diluições

sucessivas da mistura de padrões até a observação da relação sinal/ ruído 3:1 (LD) e 10:1

(LQ) para cada composto fenólico, respectivamente.

4.12.4 Precisão

A repetibilidade do método foi realizada em quintuplicata em três níveis diferentes.

Para o CE-UV, CE-MS, HPLC e UPLC os valores das concentrações da fortificação foram

calculados para três níveis que correspondem à 1,0; 1,5 e 2,0 vezes a concentração do limite

de quantificação.

4.12.5 Exatidão

A exatidão foi avaliada através da recuperação(R) dos analitos nas extrações e foi

calculada a partir das respostas analíticas para cada um dos compostos fenólicos

(concentrações encontradas) nos extratos fortificados, menos a concentração dos extratos in

natura, dividida pela concentração das soluções dos padrões, multiplicado por 100. Os

extratos foram fortificados em 3 níveis de concentração antes de serem eluídas por SPE

(n=9), onde n representa o número total de ensaios. O nível de fortificação representa 1,0,

1,5 e 2,0 vezes o limite de quantificação.

R = [((CAm+Pd - CAm)/CPd)*100] Equação (12)

Onde CAm+Pd representa a concentração calculada para a amostra fortificada com o

padrão, CAm é a concentração encontrada para a amostra e CPd é a concentração da solução

padrão do composto fenólico adicionada ao extrato no processo de fortificação.

4.12.6 Determinação das concentrações dos compostos fenólicos

A concentração dos compostos fenólicos foi calculada substituindo os valores de área

nas equações das curvas analíticas, sendo consideradas as diluições efetuadas durante o

procedimento.


68


69

Capítulo 5

Resultados e discussão


70


71

5. Resultados e discussão

5.1 Otimização da separação cromatográfica dos compostos fenólicos

Inicialmente buscou-se o comprimento de onda (λ) mais adequado para os compostos

fenólicos de interesse. Nesse comprimento de onda, a absorção da radiação ultravioleta

pelos grupos cromóforos presentes nas moléculas destes analitos é máxima. A Figura 27

mostra a absorção dos grupos cromóforos presentes nos antioxidantes no intervalo

compreendido entre 200-400 nm.

Figura 27: Espectro de UV-vis dos compostos fenólicos dissolvidos em MeOH:H2O

(50:50 v/v).


72

Entretanto, como a quantidade de compostos fenólicos constituintes do extrato é

grande, é necessário trabalhar num comprimento de onda mediano e, de acordo com a

Figura 27 poderiam ser escolhidos 270 nm ou 330 nm. Apesar de em 330 nm ser mais

sensível (maior valor de Ɛ), e ser uma região mais estável, para este trabalho foi escolhido o

comprimento de onda de 270 nm porque tem dois compostos que não absorvem em 330 nm.

A escolha da fase móvel foi feita levando-se em conta suas características físico-

químicas, a saber, alto grau de pureza, dissolução completa da amostra sem decompor ou

dissolver a FE, compatibilidade com o detector, baixa viscosidade e baixo ponto de ebulição.

Para o modo de eluição fase reversa são usadas a mistura binária metanol-água (MeOH :

H2O) ou acetonitrila-água (ACN : H2O). Neste trabalho foi empregada a fase (MeOH : H2O).

A força cromatográfica mede a capacidade da fase móvel em interagir com os

componentes da amostra. Esta interação se dá por meio das forças de Van der Waals

(dispersivas ou de London e as de dipolo-dipolo), além das ligações de hidrogênio ou forças

dielétricas, intrinsecamente ligadas a polaridade do solvente. A força cromatográfica do

solvente é atribuída em função da polaridade da fase estacionária. Desta forma, o solvente

denomina-se forte quando possui grau de polaridade semelhante ao da fase estacionária e

fraco quando em polaridade diferente. Portanto, fase móvel forte em cromatografia líquida

em fase reversa contém maior proporção de solvente orgânico117. Neste trabalho com o

objetivo de encontrar as condições ótimas de separação foram avaliadas várias condições

cromatográficas, conforme apresentado na Tabela 3.

Tabela 3: Condições cromatográficas para separação dos compostos fenólicos.

Ensaio

pH

Vazão (mL

min-1)

λ

Composição da

Fase Móvel

MeOH:H2O (v/v)

1 4,3 0,7 270 50:50

2 4,3 1,0 270 50:50

3 4,3 0,7 300 60:40

4 4,3 1,0 300 60:40

117

Collins, C. H.; Braga, G. L.; Bonato, P. S. Fundamentos de Cromatografia, Editora da Unicamp: Campinas, 1ª Ed, 2006.


73

5 4,3 0,7 270 60:40

6 4,3 1,0 270 60:40

7 4,3 0,7 300 50:50

8 4,3 1,0 300 50:50

9 9,0 0,7 270 50:50

10 9,0 1,0 270 50:50

11 9,0 0,7 300 60:40

12 9,0 1,0 300 60:40

13 9,0 0,7 270 60:40

14 9,0 1,0 270 60:40

15 9,0 0,7 300 50:50

16 9,0 1,0 300 50:50

17 8,0 0,8 330 55:45

De acordo com os dados apresentados na tabela 1, assume-se que neste primeiro

estágio a força cromatográfica foi selecionada empiricamente por tentativa e erro, iniciando

com uma proporção 50:50 metanol-água (v/v), e aumentando gradativamente (60:40)

metanol-água (v/v).

O trabalho foi iniciado empregando o cromatógrafo Waters modelo 510, com detecção

por radiação ultravioleta e coluna cromatográfica Agilent Zorbax-SB-C18 no modo de eluição

isocrático. Entretanto, conforme mostrado nas figuras 28-32 não houve separação, sendo

assim, foi necessário alterar a seletividade da fase móvel, variando o pH da mesma. O

objetivo de variar o pH da fase móvel foi manter os compostos fenólicos protonados, tendo

em vista que estes analitos são ácidos afim e em meio ácido interação com a fase

estacionária da coluna cromatográfica é aumentada, pois os compostos estão na forma

molecular, resultando no aumento do tempo de retenção, e melhora na assimetria dos picos .

Ainda assim, nota-se que vários picos estão sobrepostos.


74

Fase móvel MeOH : H2O (pH 4,3) (50:50 v/v)

Figura 28: Cromatograma da solução padrão dos compostos fenólicos obtidos com fase

móvel MeOH: H2O (pH 4,3) (50:50 v/v) 1. ácido rosmarínico, 2. miracetina, 3. canferol, 4.

quercetina, 5. ácido cafeico, 6. ácido ferúlico , 7. catequina, 8. fisetina, 9. quercetrina.

Concentração: 30 mg L-1. Condições cromatográficas: coluna Agilent Zorbax-SB- C-18 3,5

µm (100 x 4,6 mm d.i.). Fase móvel: MeOH : H2O (pH 4,3) (50:50 v/v). Vazão: 0,7 mL min-

1. Detecção: UV à 270 nm. Volume de injeção: 20 µL.


75



móvel MeOH: H2O (pH 4,3) (60:40 v/v): 1. ácido rosmarínico, 2. miracetina, 3. canferol, 4.

quercetina, 5. ácido cafeico, 6. ácido ferúlico, 7. catequina, 8. fisetina, 9. quercetrina.

Concentração: 30 mg L-1. Condições cromatográficas: coluna Agilent Zorbax-SB-C-18 3,5

µm (100 x 4,6 mm d.i.). Fase móvel: MeOH : H2O (pH 4,3) (60:40 v/v). Vazão: 0,7 mL min-



76



móvel MeOH: H2O (pH 9,0) (50:50 v/v): 1. fisetina, 2. miracetina, 3. ácido rosmarínico, 4.

catequina, 5. ácido cafeico, 6. ácido ferúlico, 7. quercetina, 8. quercetrina, 9. canferol.


µm (100 x 4,6 mm d.i.). Fase móvel: MeOH : H2O (pH 9,0) (50:50 v/v). Vazão: 0,7 mL min-1.

Detecção: UV à 270 nm. Volume de injeção: 20 µL.


77



móvel MeOH: H2O (pH 9) (60:40 v/v): 1. fisetina, 2. miracetina, 3. ácido rosmarínico, 4.

catequina, 5. ácido cafeico, 6. ácido ferúlico, 7. quercetina, 8. quercetrinao, 9. canferol.

Concentração: 30 mg L-1 .Condições cromatográficas: coluna Agilent Zorbax-SB- C-18 3,5

µm (100 x 4,6 mm d.i.). Fase móvel: MeOH : H2O (pH 9,0) (60:40 v/v). Vazão: 0,7 mL min-1.

Detecção: UV à 270 nm. Volume de injeção: 20 µL.


78



móvel MeOH: H2O (pH 8,0) (55:45 v/v): 1. fisetina, 2. miracetina, 3. ácido rosmarínico, 4.

catequina, 5. ácido cafeico, 6. ácido ferúlico, 7. quercetina, 8. quercetrina, 9. canferol.


µm (100 x 4,6 mm d.i.). Fase móvel : MeOH : H2O (pH 8,0) (55:45 v/v). Vazão: 0,8 mL min-


Como houve sobreposição de vários dos compostos fenólicos em virtude da

proximidade dos pKas, visto que existe grande semelhança estrutural entre alguns

analitos118, foram realizados novos experimentos, empregando uma fase móvel com pH

2,65, pois neste pH, os grupos ácidos dos compostos fenólicos estariam protonados. No

entanto, também não houve separação cromatográfica neste pH. Esgotadas as

possibilidades no modo isocrático, desenvolveu-se a otimização da separação, onde foram

118

Bernardes, C. D. Dissertação de Mestrado, Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas (UnUCET), UEG, 2009.


79

testadas outras condições de separação, empregando eluição por gradiente. As vantagens

da sua utilização é que se obtém maior simetria para os picos cromatográficos, melhor

resolução, detectabilidade e menor tempo de análise.

As condições de separação no modo gradiente foram baseadas no trabalho de

Fonseca e Tavares119, empregando um cromatógrafo com detecção por arranjo de diodos.

Várias adaptações foram estudadas empregando o equipamento Shimadzu prominence,

conforme mostra a Tabela 4.

Tabela 4: Condições experimentais da eluição por gradiente.

Métodos Referência119 Descrição do método

A

Fase móvel : A= H2O (pH = 2,65) e B= MeOH . Gradiente:

5,5% B por 2 min; 5,5% a 24% B em 18 min; 24 % a 25 %

de B em 10 min; 25% a 100% B em 3min; 100 % B

durante 5 min; 100% a 5,5% B em 2 min; 5,5% B durante

13 min. Vazão: 1,0 mL min-1 . Detecção : DAD à 270 nm.

Volume de injeção : 20 µL

B


5% B por 2 min; 5% a 20% B em 16 min; 20 % a 25 % de

B em 2,5 min; 25% a 30% B em 5min;30 % a 45% B em

20 min; 45% a 100% B em 5,5 min; 100% B durante 5

min; 100% a 5% em 3 min; 5% B durante 10 min. Vazão:

1,0 mL min-1 . Detecção : DAD à 270 nm. Volume de

injeção : 20 µL

Métodos Adaptados Descrição do método

1


10% a 40% B em 10 min; 40% a 80 % B em 5min; 80 %

durante 3 min; 80% a 90% em 3min; 90 % a 100 % em 3

min; 100% durante 3 min; 100% a 40% em 2 min; 40% a

10% em 1min; 10 % durante 2 min. Vazão: 1,0 mL min-1 .

Detecção : DAD à 270 nm. Volume de injeção : 20 µL


119Fonseca, F. N. Tese de Doutorado, Instituto de Química, USP, 2002.


80

2

15% a 60% B em 10 min; 60% a 80 % B em 5min; 80 %

durante 3 min; 80% a 90% em 3min; 90 % a 100 % em 3

min; 100% durante 2 min; 100% a 40% em 2 min; 40% a

15% em 1min; 15 % durante 2 min. Vazão: 1,0 mL min-1 .

Detecção : DAD à 270 nm. Volume de injeção : 20 µL

3


25% a 40% B em 10 min; 40% a 60 % B em 5min; 60% a

80 % B em 3 min; 80% a 90% B em 3min; 90 % a 100 % B

em 3 min; 100% B durante 3 min; 100% a 40% B em 2

min; 40% a 25% B em 1min; 25 % durante 2 min. Vazão:

1,0 mL min-1 . Detecção : DAD à 270 nm. Volume de

injeção : 20 µL

4


20% a 40% B em 5 min; 40% a 60 % B em 5min; 60% a

80 % B em 8 min; 80% a 90% B em 3min; 90 % a 100 % B

em 3 min; 100% B durante 2 min; 100% a 40% B em 2

min; 40% a 20% B em 1min; 20 % B durante 2 min. Vazão:

1,0 mL min-1 .Detecção : DAD à 270 nm. Volume de

injeção : 20 µL

5

Fase móvel : A= H2O (pH = 2, 65) e B= MeOH .

Gradiente: 30% a 40% B em 3 min; 40% a 60 % B em 4

min; 60 % a 80 % B em 5 min; 80% a 90% B em 5min; 90

% a 100 B % em 7 min; 100% B durante 4 min; 100% a

50% B em 1 min; 50% A 30%B em 13min; 30 % B durante

1 min. Vazão: 1,0 mL min-1. Detecção: DAD à 270 nm.

Volume de injeção: 20 µL

A partir dos cromatogramas obtidos com empregando as condições experimentias

apresentadas na Tabela 4, foi possível concluir que a separação dos compostos fenólicos

ocorreu em grande parte dos métodos. A melhor condição experimental foi aquela obtida

pelo método 5 (Tabela 3) e seu cromatograma é apresentado na Figura 33 a seguir.


81

0 5 10 15 20

0.0

5.0x104

1.0x105

1.5x105

2.0x105

2.5x105

Inte

nsid

ad

e /

mA

U

Tempo / min

1

2

3

4 5

6

7

Figura 33: Cromatogramas dos padrões dos compostos fenólicos. Solução padrão: 1. ácido

gálico , 2. ácido cafeico , 3. ácido ferúlico , 4. rutina , 5. quercetrina , 6. ácido rosmarínico , 7.

canferol. Condições experimentais: coluna Agilent ZORBAX-SB-C18 3,5 µm (100 x 4,6 mm

d.i.). Fase móvel: A= H2O (pH 2, 65) e B= MeOH . Gradiente: 30% a 40% B por 3 min; 40% a

60 % B em 4 min; 60 % a 80 % em 5 min; 80% a 90% em 5min; 90 % a 100% em 7 min;

100% por 4 min; 100% a 50% em 1 min; 50% a 30 % em 1 min. Vazão: 1,0 mL min-1.

Detecção: DAD à 270 nm. Volume de injeção: 20 µL.

5.2 Extração dos compostos fenólicos

Para a extração dos compostos fenólicos das folhas de carqueja foi escolhida a

extração a quente empregando Soxhlet120, 121, por ser um método eficiente e bem

estabelecido para extração destes polifenóis122, 123, 124. A avaliação das melhores condições

de extração por Soxhlet foi acompanhada pela técnica de HPLC-DAD utilizando as condições

120

Rockenbach, I. I.; Rodrigues, E.; Gonzaga, L. V.; Lima, A.; Mancini-Filho, J.; Fett, R. Alim. Nutr. 2008, 19, 3, 271. 121

Dadaková, E.; Kalinová, J. J. Sep. Sci. 2010, 33, 1633. 122

Sterbová, D.; Vlcek, J.; Kubán, V. J. Sep. Sci. 2006, 29, 308. 123

Ribani, M. Tese de Doutorado, Instituto de Química, UNICAMP, 2008 124

Dias, A. L. S.; Souza, J. N. S.; Rogez, H. Quim. Nova 2010, 33, 1, 38.


82

de separação otimizadas anteriormente. Para isto, foi observada a quantidade de picos

eluídos nos cromatogramas dos compostos fenólicos através dos seus respectivos tempos

de retenção (tR). O intervalo dos tempos de retenção dos picos cromatográficos para

identificar os compostos fenólicos foi obtido após o cálculo da média e a estimativa do desvio

padrão provenientes de 15 replicatas de uma solução contendo a mistura de 7 padrões de

compostos fenólicos, a partir do qual se definiu o intervalo dos tempos de retenção com 95%

de confiança. Além dos tempos de retenção também foram comparados os espectros UV-vis

de cada pico com os espectros dos padrões. Se os espectros de UV fossem iguais aos dos

padrões e os tempos de retenção estivessem dentro do intervalo calculado para os padrões,

os picos cromatográficos seriam atribuídos aos compostos fenólicos identificados. Outra

maneira de confirmar a identidade dos picos foi fazer uma injeção de uma solução da

amostra fortificada com os padrões, para observar se haveria um aumento na intensidade de

absorção.

As variáveis investigadas neste trabalho foram o tempo de extração (60, 30 e 15 min.),

tipo de solvente de extração (H2O, MeOH e THF), tempo de hidrólise empregando uma

solução H2O : MeOH (33: 66 v/v- ajustado a pH 2,65 com H3PO4) (60, 30 e 15 min.), volume

de solvente durante a eluição na etapa de SPE (0,5 a 10 mL) e o solvente empregado na

eluição da SPE (Et2O, THF e MeOH). A Figura 34 mostra os cromatogramas obtidos dos

extratos em diferentes solventes, empregando as mesmas condições de hidrólise (30 min) e

extração em fase sólida (2,0 mL de Et2O).


83

0 5 10 15 20 25 30 35

0.05.0x10

41.0x10

51.5x10

52.0x10

52.5x10

50 5 10 15 20 25 30 35

0.05.0x10

41.0x10

51.5x10

52.0x10

52.5x10

50 5 10 15 20 25 30 35

0.05.0x10

41.0x10

51.5x10

52.0x10

52.5x10

50 5 10 15 20 25 30 35

0.05.0x10

41.0x10

51.5x10

52.0x10

52.5x10

5

7

2

Tempo /min

padroes

1

2 3

45

67

3

456

456

extrato em THF

extrato em MeOH

Inte

nsid

ad

e /

mA

U extrato em H

20

Figura 34: Cromatogramas dos extratos de carqueja obtidos com diferentes solventes de

extração: Condições de extração: 30 min extração, 30 min de hidrólise e 2,0 mL de solvente

de eluição (Et2O). Solução padrão: 1. ácido gálico , 2. ácido cafeico , 3. ácido ferúlico , 4.

rutina , 5. quercetrina , 6. ácido rosmarínico , 7. canferol. Condições experimentais: coluna

Agilent ZORBAX-SB-C18 3,5 µm (100 x 4,6 mm d.i.). Fase móvel: A= H2O (pH 2,65) e B=

MeOH . Gradiente: 30% a 40% B em 3 min; 40% a 60 % B em 4 min; 60 % a 80 % em 5

min; 80% a 90% em 5min; 90 % a 100% em 7 min; 100% por 4 min; 100% a 50% em 1 min;

50% a 30 % em 1 min. Vazão: 1,0 mL min-1. Detecção: DAD à 270 nm. Volume de injeção:

20 µL.

Para avaliar qual o melhor solvente de extração por Soxhlet os cromatogramas obtidos

nos diferentes tipos de solventes foram comparados entre si, e o melhor solvente foi aquele

onde houve a identificação do maior número de compostos fenólicos, e neste sentido, o

melhor solvente extrator foi o metanol.

A seguir, foi avaliado o tempo de hidrólise, uma vez que na maior parte dos

procedimentos analíticos para quantificar os flavonóides, os glicosídeos são hidrolisados e as

agliconas resultantes são identificadas e quantificadas.

A hidrólise preliminar das amostras tem sido usada com a finalidade de minimizar

interferentes na cromatografia e simplificar os dados cromatográficos, uma vez que existe


84

uma diversidade de glicosídeos para cada flavonóide, sendo que para a maioria destes não

são disponíveis padrões comerciais125. Os glicosídeos de um mesmo flavonóide variam nos

mesmos comprimentos de onda de absorção máxima, podendo ainda apresentar diferentes

absortividades, não sendo adequado o uso de agliconas ou apenas um tipo de glicosídeo

para quantificar todos os glicosídeos presentes em uma amostra125. A Figura 35 apresenta a

hidrólise ácida do glicosídeo presente na rutina transformando-a em quercetina (aglicona) e

dois resíduos, a saber, um de glicose e um de ramnose.

O

O

OH

OH

H

HO

H

OH

OH

H

Quercetina

H

MeOH/ H2O

Rutina

O

OH

OH

OOH

HO

O OHO

OH

OH

O

O

OHHO

H3CHO

OH

O

OHHO

H3CHO

Glicose

HO OHO OH

Ramnose

OH

Figura 35: Hidrólise ácida do glicosídeo da rutina (mecanismo proposto).

Após definir o melhor solvente de extração e o tempo de hidrólise (30 min para

ambos), foram testadas várias razões volume de amostra/ volume de solvente (mL/mL) nos

cartuchos de SPE, a fim de conseguir extrair a maior quantidade de analito contido na

amostra. Num primeiro momento foram testadas eluições subseqüentes no mesmo cartucho,

para a mesma amostra, aumentando a ordem de polaridade, sendo 1,0 mL de Et2O, 1,0 mL

de THF, 1,0 mL de acetona e 1,0 mL de MeOH. Cada fração foi recolhida e injetada no

cromatógrafo. À medida que aumentava o volume de cada solvente, menos picos apareciam

nas frações seguintes. Quando a razão 1: 20 ou seja, 0,5 mL de amostra para 9,5 mL de

solvente foi atingida, não havia nenhuma espécie para ser detectada em nenhuma das

frações, portanto, todas as espécies haviam sido dessorvidas do cartucho. Foram otimizados

os volumes do extrato (0,2 a 0,5 mL) com intuito de minimizar as perdas da percolação e

saturação da fase estacionária do cartucho, onde o solvente empregado foi o próprio

solvente presente no extrato da carqueja, e a otimização da eluição da SPE com os

solventes de eluição Et2O, THF e MeOH (0,5 a 10 mL). 125

Huber, L.S.; Rodrigues-Amaya, D. B.Alim. Nutr. 2008, 19, 1, 97.


85

Alguns ensaios são apresentados na Figura 36, onde é mantida a razão de 1:8 mL do

extrato por mL de solvente percolado no cartucho de SPE. Como pode ser observado o éter

é o melhor solvente de eluição para os compostos fenólicos em estudo.

0 5 10 15 20 25 30 35 40

01x10

52x1053x1054x1055x1056x105 0 5 10 15 20 25 30 35 40

01x10

52x1053x1054x1055x1056x105 0 5 10 15 20 25 30 35 40

01x10

52x1053x1054x1055x1056x105 0 5 10 15 20 25 30 35 40

01x10

52x1053x1054x1055x1056x105

Inte

nsid

ad

e /

mA

U

Tempo / min

MeOH 1:8

THF 1: 8

1

Et2O 1:8

padroes

2 345

7

6

1 76

1

2 3 45

7

6

Figura 36: Cromatogramas dos extratos de carqueja obtidos com diferentes solventes de

extração: Condições de extração: 30 min extração, 30 min de hidrólise e 4,0 mL de solvente

de eluição (Et2O). Solução padrão: 1. ácido gálico, 2. ácido cafeico, 3. ácido ferúlico, 4.

rutina, 5. quercetrina, 6. ácido rosmarínico, 7. canferol. Condições experimentais: coluna

Agilent ZORBAX-SB-C18 3,5 µm (100 x 4,6 mm d.i.). Fase móvel: A= H2O (pH 2, 65) e B=

MeOH . Gradiente: 30% a 40% B em 3 min; 40% a 60 % B em 4 min; 60 % a 80 % em 5

min; 80% a 90% em 5min; 90 % a 100% em 7 min; 100% por 4 min; 100% a 50% em 1 min;

50% a 30 % em 1 min. Vazão: 1,0 mL min-1. Detecção: DAD à 270 nm. Volume de injeção:

20 µL.

Além dos solventes anteriormente empregados na eluição na extração por fase sólida,

resolveu-se testar também a acetona e os resultados podem ser vistos através do

cromatograma abaixo (Figura 37)


86

Figura 37: Cromatograma do extrato de carqueja: A) SPE com Acetona como solvente de

eluição. B) SPE com Éter como solvente de eluição. 1. ácido gálico (m/z,169, M), 2. ácido


quercetrina.(m/z, 447, M-), 7. canferol (m/z, 285, M-, 100%): Condições experimentais: coluna

Waters Acquity UPLC BEH C-18 1.7 μm (21x 50 mm d.i.); Fase móvel: A= H2O (0,1% ácido

fórmico) e B= ACN (0,1% ácido fórmico). Gradiente: 3% B por 1 min; 3% a 15% B em 4 min;

15% a 40% em 3 min; 40% a 3% em 1 min. Vazão: 0,350 mL min-1. Modo de Ionização: ESI-


Detecção :espectrômetro de massas hexapolar.


87

De acordo com os cromatogramas acima, pode ser visto que utilizando acetona como

solvente de eluição na extração em fase sólida, é observado o aumento da intensidade e

áreas dos picos de cada composto fenólico, sugerindo uma melhor afinidade por este

solvente ao invés do éter.

O método desenvolvido para o condicionamento e eluição dos compostos fenólicos

está em concordância com os trabalhos de Pereira et al126 , Silva et al42 e também de

Sterbová et al122.

Neste momento, com intuito de averiguar a robustez do método, foi usado o

equipamento 4 . As adaptações realizadas para a transferência do método estão presentes

na Tabela 5.

Tabela 5: Condições experimentais da transferência de método para o equipamento 4

Métodos Referência Descrição do método

C*

Fase móvel : A= H2O (pH = 2, 65) e B= MeOH .

Gradiente: 30% a 40% B em 3 min; 40% a 60 % B em 4

min; 60 % a 80 % B em 5 min; 80% a 90% B em 5 min; 90

% a 100 B % em 7 min; 100% B durante 4 min; 100% a

50% B em 1 min; 50% A 30% B em 13 min; 30 % B

durante 1 min. Vazão: 1,0 mL min-1. Detecção: DAD à 270

nm. Volume de injeção: 20 µL

Métodos Adaptados Descrição do método

1

Fase móvel : A= H2O (pH = 2,65) e B= MeOH .

Gradiente: 15% a 30% B em 5 min; 30% B a 40 % B em 1

min; 40% por 7min; 40% a 60% B em 2 min; 60 % a 80 B

% em 2 min; 80 a 100% B em 1 min; 100% a 15% em 2

min; 15% B durante 3 min. Vazão: 1,0 mL min-1. Detecção

: UV à 270 nm. Volume de injeção : 10 µL.

Fase móvel : A= H2O (pH = 2,65) e B= MeOH .

Gradiente: 33% B durante 3 min; 33% a 50% de B em 2

min; 50 % a 60 % B em 8 min; 60% a 70% B em 5 min; 70

126

Pereira, C. A. M.; Yariwake, J. H.; Lanças, F. M.; Wauters, J.; Tits, M.; Angenot, L. A. Phytochem. Analyis 2004, 14, 4, 241.


88

2 % a 80 B % em 4 min; 80 a 90% B em 4 min; 90% a 100%

em 3 min; 100% B durante 3 min; 100% a 33% em 1 min.

Vazão: 1,0 mL min-1. Detecção : UV à 270 nm. Volume de

injeção : 10 µL.

3


35% a 55% B em 3 min; 55% a 60 % B em 10 min; 60 % a

70 % B em 8 min; 70% a 80% B em 5 min; 80 % a 90 B %

em 3 min; 90% a 100% B em 1min; 100% B durante 1min;

100% a 35% B 1 min. Vazão: 1,5 mL min-1. Detecção : UV

à 270 nm. Volume de injeção : 10 µL

4


35% a 50% B em 3 min; 50% a 55% B em 1,5 min; 55% a

60 % B em ,1,5 min; 60 % a 63 % B em 2 min; 63% a

63,5% B em 0,4min; 63.5 % a 70 B % em 6 min; 70% a

80% B em 4min; 80% a 90% B em 2 min; 90% a 100% B

em 2min; 100% a 35% B em 1 min. Vazão: 1,5 mL min-1.

Detecção : UV à 270 nm. Volume de injeção : 10 µL

*C corresponde ao método descrito na entrada 5 da Tabela 4.

Após esses experimentos a análise dos dados experimentais levaram às condições

ótimas do trabalho que foram extração em MeOH (30 min), hidrólise ácida (30 min – pH 2,65

ajustada com H3PO4), eluído em SPE com 6,0 mL de acetona empregando o método

cromatográfico descrito na entrada 1 da tabela 5. A Figura 38 apresenta a separação

cromatográfica dos compostos fenólicos em estudo.


89

Figura 38: Cromatograma com padrões dos compostos fenólicos: 1. ácido gálico, 2. ácido

cafeico, 3. ácido ferúlico, 4. rutina, 5. quercetrina, 6.ácido rosmarínico, 7. canferol. Condições

experimentais: coluna Agilent Zorbax-SB-C-18 3,5 µm (100 x 4,6 mm d.i.). Fase móvel: A=

H2O (pH = 2,65) e B= MeOH . Gradiente: 15% a 30% B em 5 min; 30% a 40% B em 1 min;

40% por 7min; 40% a 60% B em 2 min; 60 % a 80 B % em 2 min; 80 a 100% B em 1 min;

100% a 15% em 2 min; 15% B durante 3 min. Vazão: 1,0 mL min-1. Detecção : UV à 270 nm.

Volume de injeção : 10 µL.

5.3.Validação do método.

A seletividade foi avaliada pela comparação dos tempos de retenção com as soluções

de padrões e pelo aumento de intensidade dos picos da amostra e amostra fortificada com

padrões (Figura 39).

0 5 10 15 20

0

1x102

2x102

3x102

4x102

5x102

Inte

nsid

ad

e / m

AU

Tempo / min

Padroes dos compostos fenolicos

1

2

34

5

6

7


90

0 5 10 15 20

0.0

2.0x102

4.0x102

Inte

nsid

ad

e /

mA

U

Tempo /min

Amostra fortificada

1

2

34

5

6

7

Figura 39: Cromatograma do extrato metanólico de carqueja in natura fortificado com

padrões dos compostos fenólicos: 1. ácido gálico (37,5 µg mL-1), 2. ácido cafeico (18,8 µg

mL-1), 3. ácido ferúlico (30,0 µg mL-1), 4. rutina (62,5 µg mL-1), 5. quercetrina (36,4 µg mL-1),

6.ácido rosmarínico (60,0 µg mL-1), 7. canferol (12,5 µg mL-1). Condições experimentais:

coluna Agilent Zorbax-SB-C-18 3,5 µm (100 x 4,6 mm d.i.) agilent. Fase móvel: A= H2O (pH =

2,65) e B= MeOH . Gradiente: 15% a 30 % B em 5 min; 30% a 40 % B em 1 min; 40% por

7min; 40% a 60% B em 2 min; 60 % a 80 B % em 2 min; 80 a 100% B em 1 min; 100% a

15% em 2 min; 15% B durante 3 min. Vazão: 1,0 mL min-1. Detecção : UV à 270 nm. Volume

de injeção : 10 µL.

A faixa linear para a construção das curvas analíticas para todos os compostos

fenólicos estudados foram de 12,5 –600,0 µg mL-1. Os coeficientes de correlação foram

maiores que 0,99 para a maioria dos analitos e são mostrados na Tabela 6.


91

Tabela 6: Parâmetros das curvas analíticas para todos os compostos fenólicos empregando

o HPLC-UV.

Composto fenólico Faixa de aplicação

(µg·mL-1) R2 LD

(µg·mL-1)

LQ

(µg·mL-1)

Ácido gálico 37,5– 90,0 0,9989 11,4 37,5

Ácido cafeico 18,8– 60,0 0,9910 5,6 18,8

Ácido ferúlico 30,0– 90,0 0,9915 9,0 30,0

Rutina 62,5– 120,0 0,9889 18,9 62,5

Quercetrina 120,0– 600,0 0,9965 36,3 120,0

Ácido rosmarínico 60,0– 120,0 0,9902 18,0 60,0

Canferol 12,5– 60,0 0,9976 3,8 12,5

R2= coeficiente de correlação, LD= limite de detecção e LQ= limite de quantificação.

O canferol apresentou os menores valores de LD e LQ 3,8 e 12,5 µg mL-1, enquanto

que a quercetrina apresentou os valores mais elevados 36,4 e 120,0 µg mL-1,

respectivamente.

Os valores encontrados para a recuperação e precisão variaram de 73,2 a 107 % e de

0,1 a 2,1 %, respectivamente e, estão de acordo com a margem permitida pela Anvisa116

para todos os compostos em estudo. Estes dados estão na Tabela 7.


quercetrina, ácido rosmarínico e canferol (expressos como % DPR).

Antioxidante

Ácido gálico (n=9)

Nível de fortificação (µg·mL-1)

37,5 56,3 75,0

Recuperação (%) 80 104 78,1

DPR (%) 1 1 0,1

Ácido cafeico (n=9)


18,8 28,1 37,5

Recuperação (%) 86 96 97,2

DPR (%) 1 1 0,4


92

Ácido ferúlico (n=9)


30,0 45,0 60,0

Recuperação (%) 77,4 98,3 91,4

DPR (%) 0,2 0,2 0,2

Rutina (n=9)


62,5 93,8 125,0

Recuperação (%) 73,2 93 98,2

DPR (%) 0,9 1 0,2

Quercetrina (n=9)


62,5 93,8 125,0

Recuperação (%) 107 100 107

DPR (%) 2 2 0,2

Ácido romarínico

(n=9)


120,0 180,0 240,0

Recuperação (%) 75 96,8 94,8

DPR (%) 0,8 0,9 0,2

Canferol Nível de fortificação (µg·mL-1)

12,5 18,8 25,0

Recuperação (%) 76,6 71,1 84,8

DPR (%) 0,3 0,2 0,1

5.4 Determinação de compostos fenólicos por UHPLC-MS/MS

5.4.1 Otimização da separação cromatográfica

A otimização da separação cromatográfica foi realizada através da conversão do


93

método cromatográfico desenvolvido para HPLC-UV, através do software ACQUITY UPLC

Columns Calculator.

A Figura 40 mostra um cromatograma da mistura de compostos fenólicos empregando

cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial

(UHPLC-MS/MS) no modo scan, cujo objetivo foi avaliar o perfil cromatográfico da mistura de

padrões.

Figura 40: Cromatograma da mistura de compostos fenólicos no modo scan. : 1. ácido gálico

(m/z,169, M-, 25%), 2. ácido cafeico (m/z, 179, M-, 65%); 3. ácido ferúlico (m/z, 193, M-,

30%), 4. rutina (m/z,609, M-, 20%), 5 quercetrina (m/z, 447, M-, 38%), 6. ácido rosmarínico

(m/z,359, M-, 50%), 7. canferol (m/z, 285, M-, 100%): Condições experimentais: coluna

Waters Acquity UPLC BEH C-18 1.7 μm (21x 50 mm d.i.); Fase móvel: A= H2O (0,1% ácido

fórmico) e B= ACN (0,1% ácido fórmico). Gradiente: 3% B por 1 min; 3% a 15% B em 4 min;

15% a 40% em 3 min; 40% a 3% em 1 min. Vazão: 0,350 mL min-1. Modo de Ionização: ESI-


Detecção: espectrômetro de massas hexapolar.

Após esta otimização da separação, foi selecionado o modo SIM (do inglês, “select ion

monitoring”), para a quantificação dos compostos de interesse, uma vez que neste modo de

varredura, a detectabilidade e a seletividade são aumentadas. O modo SIM permite

monitorar apenas os íons de interesse numa janela de tempo definida.


94

Para os extratos da carqueja, considerou-se o tempo de retenção dos picos eluídos e

seus respectivos espectros de massas, nos quais foram monitoradas transições de m/z para

os íons precursores e íons produto. A partir destas informações foi possível a identificação e

confirmação dos seguintes compostos: ácido gálico (m/z: 169,M-, 35%), ácido cafeico (m/z:

179,M-, 15%), ácido ferúlico (m/z: 193,M-, 75%), rutina (m/z: 609,M-,100%), quercetrina (m/z:

447,M-, 50%) e canferol (m/z: 285,M-, 50%). O cromatograma no modo SIM para o extrato é

mostrado na Figura 38. A Tabela 9 mostra os parâmetros estudados para identificação dos

analitos de interesse. De acordo com os dados apresentados na Tabela 8, verifica-se que

para o ácido rosmarínico, não foi encontrada nenhuma transição correspondente a

confirmação deste composto fenólico no extrato de carqueja.

Tabela 8: Confirmação das transições buscadas nos extratos de carqueja.

Composto fenólico tR (min) MRM

Ip T1 T2 Confirmação

Ácido gálico 0,48 169 169 > 79 169 > 125 tR, T1 e T2

Ácido cafeico 2,82 179 179 > 89 179 > 135 tR, T1 e T2

Ácido ferúlico 4,38 193 193 > 178 193 > 134 tR, T1 e T2

Rutina 4,79 609 609 > 301 609 > 271 tR, T1 e T2

Quercetrina 5,36 447 447 > 300 447 > 271 tR, T1 e T2

Ácido rosmarínico 5,62 359 359 > 197 359 > 161- -

Canferol 6,84 285 285 > 93 285 > 187 tR, T1 e T2

tR= tempo de retenção do composto, Ip= íon precurssor, T1= transição de identificação, T2= transição de

confirmação, MRM=.Monitoramento múltiplo de reação.

- ausência.


95

Figura 41: Cromatograma do extrato de carqueja: 1. ácido gálico (m/z,169, M), 2. ácido


quercetrina.(m/z, 447, M-), 7. canferol (m/z, 285, M-, 100%): Condições experimentais:

coluna Waters Acquity UPLC BEH C-18 1.7 μm (21x 50 mm d.i.); Fase móvel: A= H2O

(0,1% ácido fórmico) e B= ACN (0,1% ácido fórmico). Gradiente: 3% B por 1 min; 3% a

15% B em 4 min; 15% a 40% em 3 min; 40% a 3% em 1 min. Vazão: 0,350 mL min-1. Modo

de Ionização: ESI- (ionização por eletronebulização no modo negativo, 30 kV). Volume de

injeção: 10 μL. Detecção :espectrômetro de massas hexapolar.

5.4.2 Efeito Matriz em Espectrometria de Massas

Como mencionado na parte introdutória, a avaliação do efeito matriz durante o

desenvolvimento e validação de um método analítico é de suma importância, pois a presença

de interferentes inerentes à matriz pode ocasionar alteração na resposta cromatográfica dos

analitos, aumentando ou diminuindo a intensidade do sinal analítico.

Trabalhos descritos na literatura, no que diz respeito à detecção por espectrometria de

massas, evidenciam que o efeito matriz é mais acentuado quando é utilizada a fonte de


96

ionização por electrospray – ESI se comparada a outras fontes de ionização à pressão

atmosférica, como a ionização química127,128

Os componentes endógenos da matriz podem interferir na eficiência de ionização dos

analitos, ocasionando a supressão ou acréscimo desta. Também conhecido como

“supressão ou aumento da resposta cromatográfica induzida pela matriz”, o efeito matriz é

usado para explicar a alteração na ionização dos analitos na presença de componentes da

matriz coeluentes. Este efeito afeta de maneira significativa a detectabilidade e a precisão

dos resultados127, 91.

Após a etapa de otimização do método empregando a UHPLC-MS/MS, a avaliação

do efeito matriz foi realizada. Os valores do efeito matriz (%) foram obtidos com base na

comparação das inclinações das curvas analíticas dos analitos, construídas em cinco níveis

de concentração, em solvente e no extrato da matriz (fortificado), conforme equação 11. A

Figura 41 apresenta o comportamento da inclinação da reta para um dos compostos

fenólicos em estudo, o ácido gálico, em três amostras comerciais de diferentes estados

brasileiros. Como pode ser observado na Figura 42, existe uma diferença bastante

acentuada entre os padrões e as amostras comerciais de Minas gerais e da Bahia, já na

amostra do estado de São Paulo, para o ácido gálico essa diferença é pequena.

127

Kwon, H.; Lehotay, S.; Asteggiante, L. G.; J. Chromatogr. A 2012,1270, 235. 128

Mastovska, K. J.; Doreiler, S. J.; Lehotay, J. S.; Wegscheid, K. A.; Szpylka J. Agric. Food Chem. 2010 58, 5959.


97

Figura 42: Efeito matriz dos analitos utilizando UHPLC-MS/MS. Curvas analíticas

construídas a partir da solução padrão de ácido gálico no extrato da matriz e em solvente.

De acordo com as curvas analíticas obtidas para todos os compostos fenólicos, foi

possível observar que existe uma diferença significativa nos coeficientes angulares para

alguns compostos, indicando a presença do efeito matriz pronunciado quando o

espectrômetro de massas sequencial (MS/MS) foi empregado. Os valores do efeito matriz

(%) para cada composto fenólico estão mostrados na Figura 43.

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0

1000

2000

3000

4000

5000

y = 625,45 x + 55,253

R2= 0,9988

Extrato da matriz da amostra comercial (SP)

Padrao de acido galico

Are

a

Concentracao (ug L-1)

y = 579,45 x + 198,49

R2= 0,9939

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0

2000

4000

6000

8000

10000

Y = 1061,6 X + 1251,4

R2= 0,9883

Are

a


Extrato da matriz da amostra comercial (MG)


Y = 990,6 X + 27,897

R2= 0,9999

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0

2000

4000

6000

8000

10000

Y= 1166,4 x + 428,69

R2 = 0,9975

Extrado da matriz da amostra comercial (BA)


Are

a


Y= 849,83 x + 865,84

R2 = 0,9985


98

Figura 43: Percentual do efeito matriz (%) empregando UHPLC-MS/MS. 1 ácido gálico;

2 ácido cafeico; 3 ácido ferúlico; 4 rutina; 5 quercetrina; 6 ácido rosmarínico; 7 canferol.

De acordo com os resultados mostrados na Figura 41, verifica-se que o efeito matriz

negativo é mais pronunciado para os compostos mais hidrofílicos (1, 2, 4 e 5), evidenciando

forte supressão de sinal. Segundo Macedo 91 a forte supressão da ionização para estes

compostos é observada devido a maior quantidade de coextrativos polares da matriz, que

eluem próximo ao início da corrida cromatográfica. Os compostos de média polaridade, ácido

ferúlico, quercetrina e canferol apresentaram porcentagens de efeito matriz positivas,

indicando que a presença da matriz aumenta as suas ionizações.

Desta forma, conclui-se que o efeito matriz é significativo para grande parte dos

compostos fenólicos avaliados, sendo necessário o emprego de superposição da matriz para

a quantificação dos compostos fenólicos, a fim de corrigir os efeitos da matriz provocados por

interferentes coextraídos.

-100.00

-80.00

-60.00

-40.00

-20.00

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

1 2 3 4 5 6 7

São Paulo

Minas Gerais

Bahia


99

5.4.3 Validação do método

A seletividade foi avaliada pelos tempos de retenção, pelo aumento de intensidade

dos picos da amostra fortificada com os padrões e, pelas massas moleculares e as

respectivas transições m/z para os íons monitorados.

A linearidade foi avaliada pelos parâmetros das curvas analíticas, os quais podem ser

vistos na Tabela 9.

Tabela 9: Parâmetros das curvas analíticas para os compostos fenólicos empregando o

UHPLC-MS/MS.

Composto fenólico Faixa de aplicação

(µg·mL-1) R2

LD

(µg·mL-1)

LQ

(µg·mL-1)

Ácido gálico 0,23 – 7,50 0,9971 0,11 0,38

Ácido cafeico 0,23 – 3,75 0,9995 0,06 0,19

Ácido ferúlico 0,23 – 3,75 0,9994 0,09 0,30

Rutina 0,23 – 3,75 0,9950 0,19 0,63

Quercetrina 0,8 – 12,5 0,9934 0,36 1,20

Ácido rosmarínico 0,23 – 12,5 0,9923 0,19 0,60

Canferol 0,23 – 12,5 0,9940 0,04 0,13


A quercetrina apresentou os valores mais elevados de LD e LQ, 0,36 e 1,20 µg mL-1,

respectivamente, enquanto que canferol os menores limites de detecção e quantificação 0,04

e 0,13 µgmL-1, respectivamente.

Os valores encontrados para recuperação (Tabela 10) estão de acordo com a margem

permitida pela Anvisa116, tendo em vista que se trata de uma amostra complexa, onde o

menor valor permitido é 50%.

Para os ensaios de repetibilidade (inter-ensaio) três níveis de concentração foram

avaliados e os desvios padrão relativo (DPR) ficaram abaixo de 3%.


100


quercetrina, ácido rosmarínico e canferol (expressos como % DPR).

Composto fenólico

Ácido gálico (n=9)


1,6 2,3 3,1

Recuperação (%) 80,5 98 93

DPR (%) 0,6 1 1



0,8 1,2 1,6


DPR (%) 0,1 1 0,7



0,8 1,2 1,6

Recuperação (%) 76,5 93,2 90

DPR (%) 0,6 0,9 2

Rutina (n=9)


0,8 1,2 1,6

Recuperação (%) 74,2 88,8 87,0

DPR (%) 0,3 0,1 0,1

Quercetrina (n=9)


1,2 1,8 2,4

Recuperação (%) 82 92,0 92

DPR (%) 3 0,6 2

Ácido romarínico


0,8 1,2 1,6


101

(n=9)

Recuperação (%) 90,9 100,7 93

DPR (%) 0,7 0,8 1

Canferol Nível de fortificação (µg·mL-1)

0,8 1,2 1,6


DPR (%) 1 2 2

Desta forma, o método desenvolvido e validado pode ser aplicado em amostras

comerciais de carqueja para quantificação dos compostos fenólicos estudados.

5.5 Comparação entre as técnicas cromatográficas HPLC-UV x UHPLC-MS/MS

A Tabela 11 mostra alguns parâmetros comparativos entre as técnicas cromatografia

líquida de alta eficiência e cromatorafia líquida de ultra eficiência.

Tabela 11: Comparação entre os métodos HPLC x UPLC

Fator analisado em cada técnica HPLC UHPLC

Diâmetro de particula (nm) 3,5 1,7

Volume de injeção (µL) 10 3

Tempo de análise (min) 25 13

Volume gasto de solvente / análise (mL) 25 13

Detecção UV MS/MS

Limite de Quantificação (µg·mL-1)

Composto Fenólico

37,5 Ácido gálico 0,38

18,8 Ácido cafeico 0,19

30,0 Ácido ferúlico 0,30

62,5 Rutina 0,63

120,0 Quercetrina 1,20

60,0 Ácido rosmarínico 0,60

12,5 Canferol 0,13


102

De acordo com os dados apresentados, pode-se perceber que o emprego da técnica

cromatográfica de ultraeficiência apresenta menor diâmetro de partícula o que melhora a

eficiência, diminui o tempo de retenção favorecendo uma análise mais rápida levando a um

menor consumo de solvente quando comparada com a cromatografia líquida de alta

eficiência. O uso de um volume menor tanto de amostra e quanto de solvente de consumo

também são vantagens tendo em vista que a análise sai mais barata e gera menos resíduo.

Com relação à seletividade, UHPLC-MS/MS também se mostrou mais vantajosa que

a HLPC-UV. A UHPLC com detector triplo quadrupolo detecta o íon do analito e os íons

dos fragmentos gerados a partir deles. A informação estrutural adicional, fornecida pelos

fragmentos gerados, permite que, mesmo quando se analisa compostos fenólicos de

mesma massa molar, consiga diferenciá-los entre si, desde que eluam em tempos de

retenção diferentes. Esta é uma propriedade muito importante no caso de análise de

matrizes complexas, como é o caso da carqueja. Algumas agências reguladoras

estabelecem que a espectrometria de massas sequencial é a técnica de detecção mais

adequada para ser empregada em métodos oficiais de determinação de resíduos em

amostras complexas de alimentos, devido a sua seletividade129.

Os cromatogramas obtidos nas janelas de retenção dos compostos fenólicos

mostraram que os sinais obtidos foram gerados apenas pelo composto fenólico almejado.

Já com HPLC-UV, essa identificação pode ser prejudicada se interferentes da matriz eluem

no mesmo tempo de retenção do composto e absorvem no mesmo comprimento de onda.

5.6 Análise de amostras comerciais empregando as técnicas cromatográficas HPLC-

UV x UHPLC-MS/MS.

A fim de comparar o desempenho das técnicas HPLC-UV e UHPLC-MS/MS na

determinação de compostos fenólicos em diversas amostras, os métodos foram utilizados

para a quantificação de amostras comerciais de carqueja de diferentes regiões do Brasil, a

saber, amostra de Feira de Santana (BA), amostra de Belo Horizonte (MG), amostra de

Campinas (SP) e amostra cultivada pelo CPQBA (Campinas –SP). Esta última foi

empregada para desenvolver e validar os métodos deste trabalho. A Figura 44 mostra os

cromatogramas dos extratos das amostras anteriormente mencionados.

129

Magalhães, L. L. S Tese de Doutorado, Instituto de Química, UNICAMP, 2011.


103

Figura 44: Cromatograma do extrato de carqueja: A) amostra comercial de Campinas

(SP2). B) amostra comercial da Bahia (BA) e C) amostra comercial de Minas gerais (MG).

1. ácido gálico (m/z,169, M), 2. ácido cafeico (m/z, 179, M-); 3. ácido ferúlico (m/z, 193, M-),

4. rutina (m/z,609, M-), 5 quercetrina.(m/z, 447, M-), 7. canferol (m/z, 285, M-, 100%):

Condições experimentais: coluna Waters Acquity UPLC BEH C-18 1.7 μm (21x 50 mm d.i.);

Fase móvel: A= H2O (0,1% ácido fórmico) e B= ACN (0,1% ácido fórmico). Gradiente: 3% B

por 1 min; 3% a 15% B em 4 min; 15% a 40% em 3 min; 40% a 3% em 1 min. Vazão: 0,350

mL min-1. Modo de Ionização: ESI- (ionização por eletronebulização no modo negativo, 30

kV). Volume de injeção: 10 μL. Detecção :espectrômetro de massas hexapolar.


104

Os resultados da determinação das concentrações individuais dos compostos

fenólicos estudados para todas as amostras estão compilados na Tabela 12.

Tabela 12: Quantificação dos compostos fenólicos ácido gálico, ácido cafeico, ácido ferúlico,

rutina, quercetrina, ácido rosmarínico e canferol em diferentes amostras de carqueja.

SP1 = amostra do CPQBA, SP2 = amostra de Campinas, MG = amostra de Minas Gerais e BA = amostra da Bahia.

N.D. = não detectado, <L.Q.= abaixo do L.Q.

Para a análise dos dados da Tabela 12 foi realizado o test T de Student com 95% de

confiança. Este teste foi usado para comparar o conjunto de dados obtidos pela técnica de

cromatografia líquida de ultra-eficiência com outros dados determinandos pela

cromatografia líquida de alta-eficiência, a fim de decidir se eles são ou não diferentes

estaticamente.

Os dados obtidos após tratamento estatístico estão na Tabela 13. A seguir será

apresentado um exemplo genérico de tratamento estatístico para um dos compostos

fenólicos em estudo, o ácido gálico. O raciocínio utilizado para o ácido gálico é válido para

todos os outros compostos e ácidos fenólicos.

Concentração (mg·g-1

de planta)

UHPLC-MS/MS

HPLC-UV

Composto

Fenólico

SP1 SP2 MG BA SP1 SP2 MG BA

Ácido gálico 0,19

±0,02

0,20

±0,02

1,03

±0,09

0,33

±0,01

0,21

±0,02

0,22

±0.01

1,1

±0,2

0,39

±0,01

Ácido cafeico 0,24

±0,02

0,26

±0,05

0,95

±0,07

1,5

±0,5

0,25

±0,03

0,22

±0,04

0,96

±0,04

1,6

±0,2

Ácido ferúlico 0,30

±0,02

0,27

±0,05

1,3

±0,3

2,1

±0,3

0,31

±0,05

0,26

±0,01

1,73

±0,03

2,2

±0,2

Rutina 3,2

±0,3

3,6

±0,1

0,8

±0,1

2,01

±0,06

3,5

±0,2

3,5

±0,1

0,82

±0,1

2,4

±0,4

Quercetrina 0,67

±0,04

1,3

±0,1

1,16

±0,2

1,2

±0,3

<L.Q. 1,08

±0,04

1,34

±0,06

1,3

±0,2

Ácido

rosmarínico

N.D. 0,27

±0,09

2,10

±0,1

1,8

±0,4

N.D. 0,31

±0,03

2,2

±0,2

1,7

±0,1

Canferol 1,8

±0,4

2,8

±0,4

2,17

±0,10

3,1

±0,3

2,2

±0,5

2,4

±0,2

2,0

±0,2

3,5

±0,3


105

Tabela 13: Comparação entre as concentrações de ácido gálico presentes na amostra

comercial (SP2) empregando as técnicas de UHPLC e HPLC.

Composto Comparação entre UHPLC X HPLC

Ácido gálico

Amostra SP2 a b d= a- b LS LI

1 0,21 0,18 0,03 0,028 0,026

2 0,20 0,16 0,04

3 0,222 0,21 0,01

média 0,210 0,183 0,027

dp 0,010 0,025 0,0153

gl 4 4 4

t4 (95%) 2,78 t4 x var 0,001

var 0,000

a= concentração UHPLC (mg/g planta), b= concentração HPLC (mg/g planta) d= diferença entre as

concentrações UHPL e HPLC, LS= limite superior, LI= limite inferior, dp= estimativa do desvio padrão, gl=

grau de liberdade [(Na + Nb)-2], t4= t de student com 4 graus de liberdade e 95% de confiança, var= variância.

A análise do intervalo de confiança foi feita considerando a diferença média entre as

duas técnicas (0,023) somando e subtraindo o valor t4 multiplicado pela variância (2,172).

Sendo assim, para o caso do ácido gálico o intervalo foi [0,026, 0,028]. Uma vez que 0,027

está entre este intervalo, conclui-se que para este composto não existe diferença

significativa entre os métodos de análise ao nível de 95% de confiança.

O mesmo raciocínio foi aplicado aos demais compostos fenólicos em estudo e foi

averiguado que para todas as amostras comerciais das diferentes regiões, não houve

diferença significativa, na determinação das concentrações dos mesmos, quando

comparadas as duas técnicas cromatográficas.

Ainda a partir da Tabela 13 é possível avaliar se existe diferença significativa entre

as concentrações dos compostos fenólicos presentes nas amostras das diferentes regiões.

Para que seja feita essa análise é necessário realizar um tratamento estatístico

empregando a análise de Variância (ANOVA). ANOVA é um procedimento utilizado para

comparar três ou mais tratamentos. Existem muitas variações da ANOVA devido aos

diferentes tipos de experimentos que podem ser realizados. Nessa tese foi empregada

apenas a análise de variância com um fator.

A Tabela 14 apresenta os dados da análise de variância que serão discutidos em

seguida.


106

Tabela 14: Análise de variância com um fator (ANOVA) para o ácido gálico presente nas

diferentes amostras de carqueja.

RESUMO

Amostra Contagem Soma Média Variância

SP2 3,00 0,55 0,18 6,3 E-4

Ba 3,00 1 0,33 1,33 E-4

MG 3,00 3,09 1,03 7,6 E-3

SP1 3,00 0,63 0,21 1 E-4

ANOVA

Fonte da variação SQ gl MQ F valor-P F crítico

Entre grupos 1,43 3,00 0,478 225,95 4,53E-8 4,06

Dentro dos grupos 0,02 8,00 0,002

Total 1,45 11,00

SP1 = amostra do CPQBA, SP2 = amostra de Campinas, BA = amostra da Bahia, MG = amostra de Minas

gerais.

SQ= soma dos quadrados, gl = graus de liberdade, MQ= média dos quadrados, F= teste F

De acordo com os dados presentes na Tabela 14 é possível dizer que existe

diferença significativa entre as diferentes amostras tendo em vista que o Fcalculado > Fcrítico

(225,95 > 4,06). Outro dado importante é o valor de P, pois quanto menor o valor de P

menor é a probabilidade de esta diferença ser casual, sendo assim utiliza-se a seguinte

regra prática: se o valor de P < 0,05, então existe diferença siginificativa entre as amostras.

Neste caso, o valor de P é 4,53·10-8, com um nível de 95% de confiança.

Após ser concluído que existe diferença significativa entre as amostras, por meio do

teste F, outros testes podem ser realizados para avaliar a magnitude destas diferenças. Por

exemplo, o teste de Tukey permite testar qualquer contraste, sempre, entre duas médias de

tratamentos, ou seja, não permite comparar grupos entre si. O teste baseia-se na diferença

mínima significativa (d.m.s.) Δ. A estatística do teste é dada conforme apresentado na

equação 12:

Δ = q

Equação (12)

Onde q é a amplitude total studentizada, valor tabelado, QMRes é o quadrado médio

do resíduo da análise de variância (na Tabela 15 corresponde ao valor de MQ 0,002), e r é o


107

número de repetições (na Tabela 14 corresponde ao 3- na coluna contagem). O valor de q

depende do número de tratamentos e do número de graus de liberdade do resíduo (4

amostras com 3 replicatas) sendo igual a 12, menos o número de amostras que é igual a 4.

Portanto, o número de graus de liberdade é 8 (na Tabela 15 corresponde ao 8 na coluna gl).

Também em um teste de comparação de médias, deve-se determinar um nível de

significância (α) para o teste. Neste trabalho foi utilizado o nível de 5% de significância. O

valor de qtabelado correspondente a 4 amostras e 8 graus de liberdade a um nível de 5% de

significância ou 95% de confiança é 4,53.

Substituindo os valores na equação 13, obteve-se:

Δ = 4,53

= 0,116 Equação (13)

De acordo com o teste de Tukey, duas médias são estatisticamente diferentes sempre

que o valor absoluto da diferença entre elas for igual ou superior ao valor de Δ.

Como o teste de Tukey é, de certa forma, independente do teste F, é possível que,

mesmo sendo significativo o valor de Fcalculado, não se encontrem diferenças significativas

entre contrastes de médias.

A Tabela 15 apresenta a comparação entre as diferentes amostras estudadas neste

trabalho.

Tabela 15: Comparação entre as concentrações de ácido gálico presente na carqueja

nas diferentes regiões brasileiras.

Pares de médias Valor absoluto da

diferença

Ba – SP2 0,33 – 0,20 = 0,13

MG – Ba 1,03 – 0,33 = 0,7

MG – SP2 1,03 – 0,20 = 0,83

MG – SP1 1,03 – 0,18 = 0,85

Ba – SP1 0,33 – 0,18 = 0,15

SP2 – SP1 0,20 – 0,18 = 0,02

SP1 = amostra do CPQBA, SP2 = amostra de Campinas, Ba = amostra da Bahia, MG = amostra de Minas

gerais.


108

Comparando os valores apresentados na Tabela 15 com o resultado calculado

através da fórmula apresentada na equação 13, é possível assumir que ao nível de 5% de

significância existe diferença significativa entre as amostras das diferentes regiões,

excetuando para a amostra SP2 comparada com SP1, onde não houve diferença

significativa (0,02 < 0,116).

O mesmo raciocínio foi aplicado aos demais compostos fenólicos em estudo e foi

averiguado que para todas as amostras comerciais das diferentes regiões quando

comparadas, houve diferença significativa, entre as concentrações dos mesmos.

5.7 Otimização da separação dos compostos fenólicos por CE-UV

A eletroforese capilar de zona também foi empregada para o desenvolvimento de método

de separação para a quantificação dos compostos fenólicos presentes na carqueja (CPQBA).

No entanto, nesta etapa foram estudados apenas os 7 compostos fenólicos descritos nas

duas técnicas anteriormente mencionadas (HPLC e UHPLC) para fins comparativos, no

sentido de otimizar a técnica onde fosse possível encontrar a maior quantidade presente

destes compostos fenólicos.

Inicialmente, foi realizada a otimização da separação eletroforética dos compostos,

para isto foram avaliadas as seguintes variáveis: concentração do tampão tetraborato de

potássio (10 a 40 mmol L-1), percentagens de modificador orgânico (0 e 10%), pH do

eletrólito de corrida (8,5 a 10) e diferentes voltagens (20 e 25 kV). Na Tabela 16, encontram-

se as condições experimentais avaliadas para a separação dos compostos fenólicos.


109

Tabela 16: Otimização da separação dos compostos fenólicos

Condições experimentais

Concentração pH Voltagem (kV)

10 mmol·L-1

8,5

25

20

9,4

10

20 mmol·L-1

8,5

25

20

9,4

10

30 mmol·L-1

8,5

25

20

9,4

10

40 mmol·L-1

8,5

25

20

9,4

10

Através da Figura 45 é possível observar que ocorre uma separação parcial dos

analitos. Nestas condições, as duas separações mais promissoras são aquelas com

concentração de tampão tetraborato de sódio 10 e 40 mmol·L-1.


110

Figura 45: Eletroferograma da mistura de padrões dos compostos fenólicos. 1. rutina ,

2.quercetrina, 3. canferol, 4. ácido ferúlico, 5. ácido rosmarínico, 6. ácido cafeico, 7. ácido

gálico. Condições eletroforéticas: capilar Agilent 50 µm d.i. Comprimento efetivo: 40 cm.

Tampão: tetraborato de sódio 10-40 mmol L-1, pH 9,4 injeção hidrodinâmica: 10s, 50 mbar.

Potencial: 20 kV. Detecção: DAD em 270 nm.

Quando a separação envolve solutos de caráter ácido-base, a mobilidade eletroforética

do soluto depende do pH do eletrólito. Neste caso, o termo mobilidade efetiva, o qual

incorpora o produto das mobilidades eletroforéticas das espécies em equilíbrio e a

distribuição das concentrações relativas de cada espécie no pH considerado, é empregado97.

É esse controle de pH e a presença de um tampão que apresente constância no valor de pH

(alta capacidade), além da voltagem que proporciona uma melhor separação eletroforética.

A Figura 45 mostra que entre as 4 situações experimentais apresentadas, duas delas

apresentam as melhores situações de separação, aquela com concentração 10 mmol·L-1 e

aquela com 40 mmol L-1, entretanto, após outros ensaios, foi verificado que a melhor


111

condição de separação consiste na situação em que se adiciona de modificador orgânico ao

tampão, conforme demonstrado através da Figura 46.

0 3 6 9 12 15 18 21

0

1x101

2x101

3x101

4x101

Inte

nsid

ade /m

AU

Concentraçمo /ug mL-1

Amostra fortificada

1

2

3 4 5 6 7

Figura 46: Eletroferograma do extrato de carqueja fortificado com padrões dos compostos

fenólicos. 1. rutina (6,25 µg mL-1), 2.quercetrina (6,25 µg mL-1), 3. canferol (6,25 µg mL-1), 4.

ácido ferúlico (6,25 µg mL-1), 5. ácido rosmarínico (12,5 µg mL-1), 6. ácido cafeico (6,25 µg

mL-1), 7. ácido gálico (6,25 µg mL-1). Condições eletroforéticas: capilar Agilent 50 µm d.i.

Comprimento efetivo: 40 cm. Tampão: tetraborato de sódio 10 mmol·L-1 (10% MeOH), pH

10,0, injeção hidrodinâmica: 10s, 50 mbar. Potencial: 20 kV. Detecção: DAD em 270 nm.

Estes resultados serviram para o desenvolvimento do trabalho intitulado

caracterização e identificação de antioxidantes em extratos de carqueja empregando

técnicas de extração e separação avançadas, realizado em Madri.


112

5.8 Desenvolvimento de método para a quantificação de compostos fenólicos por

CE-ESI-TOF/MS

Esta parte do trabalho foi desenvolvida em Madri (Espanha) no grupo Foodomics. O

Laboratório de Foodomics, coordenado pelo Profº. Dr. Alejandro Cifuentes, têm ampla

experiência em identificação e caracterização de compostos funcionais, empregando

técnicas consideradas avançadas e verdes no processo de extração, como extração em

fluído supercrítico (SFE), extração em líquido pressurizado (PLE) e extração aquosa e

processo de formação de partícula on-line (WEPO), sendo esta última uma patente

(P2009001164, 2009) desenvolvida em seu grupo de pesquisa.

5.8.1 Extração e caracterização funcional dos polifenóis

A extração de polifenóis da carqueja para determinação por CE-MS foi realizada

usando dois procedimentos diferentes de extração: o método convencional por Soxhlet e o

PLE130,131. No método de PLE, foram usados dois solventes: metanol e etanol. Neste caso,

metanol foi selecionado para fins de comparação com a extração por Soxhlet. Por outro lado,

a extração com etanol empregando PLE é normalmente usada para este método de extração

de compostos fenólicos132,112,133. Contudo ambos podem ser considerados solventes verdes

do ponto de vista químico dependendo dos critérios de aceitação de Jessop 134, entretanto,

do ponto de vista alimentar o metanol é extremamente tóxico ao organismo e, por

conseguinte, a sua utilização não é recomendada. A capacidade de extração em ambos

solventes também foi estudada.

O rendimento da extração foi calculado como a razão entre a massa extraída dividida

pelo peso inicial e multiplicada por 100. A atividade antioxidante(EC50) foi expressa em

µg/mL e o conteúdo de fenol total foi expresso como mg de ácido gálico/ g extrato (Tabela

17).

130Laghari, A. H., Memon, S., Nelofar, A., Khan, K. M., Food Chem .2011, 126, 1850. 131

Jaiswal, R., Kiprotich, J., Kuhnert, N., Phytochemistry 2011, 72, 781. 132

Herrero, M., Arraez-Roman, D., Segura, A., Kenndlerc, E., Gius, B., Raggi, M. A., Ibanez, H., Cifuentes, A., J. Chromatogr. A 2005, 1084, 54. 133

Herrero, M., Plaza, M., Cifuentes, A., Ibañez, E., J. Chromatogr. A 2010, 1217, 2512. 134

Jessop, P. G. Green Chem. 2011, 13, 1391.


113

Tabela 17. Valores de rendimento de extração, atividade antioxidante, e fenóis totais obtidos

para diferentes procedimentos de extração.

Tipo de

Extração

Solvente T

(ºC)

Rendimento

(%)

Fenóis totais

(mg ácido

gálico/g extrato)

Atividade

Antioxidante

EC50 (µg/mL)

PLE EtOH 50 18,5 62 ± 4 33 ± 3

75 22,1 55 ± 3 83 ± 4

100 20,7 64 ± 4 86,4 ± 0,9

150 32,3 72 ± 4 33 ± 5

PLE MeOH 50 26,1 50 ± 3 109 ± 21

75 25,7 49 ± 3 109,7 ± 0,8

100 28,5 51,4 ± 0,4 120 ± 5

150 33,6 61 ± 3 105 ± 9

Soxhlet MeOH 65 22,2 60 ± 4 64 ± 2

Como pode ser observado nesta tabela, o rendimento da extração em PLE foi superior

quando se aumentou a temperatura para 150°C acelerando o processo de extração. Este

fato é devido a um aumento da transferência de massa em temperaturas mais elevadas,

onde há uma diminuição da viscosidade do solvente,o que ajuda o solvente penetrar na

matriz112. Valores semelhantes foram obtidos para ambos os solventes, exceto quando a

temperatura de extração foi mantida entre 50 e 100°C em que o rendimento de extração era

ligeiramente maior quando foi utilizado metanol como solvente de extração. Fazendo uma

comparação entre os resultados obtidos com a extração por Soxhlet e a extração com PLE,

pode-se ver que o valor do rendimento da primeira é comparável aos extratos a 75 ºC para

ambos os solventes. Os resultados sugerem que existe uma quantidade significativa dos

polifenóis de média e alta polaridade dos compostos presentes na planta, uma vez que a

extração está sendo realizada com solventes polares.


114

A caracterização funcional dos extratos obtidos por Soxhlet e PLE baseou-se na

determinação da sua atividade antioxidante e o seu conteúdo de fenóis totais. Os resultados

obtidos também estão apresentados na Tabela 17. O método DPPH foi usado para avaliar a

atividade antioxidante por meio do valor de EC50, isto é, a quantidade de antioxidante

necessária para reduzir à metade a concentração de radicalar inicial. Como pode ser visto,

os extratos com maiores atividades antioxidantes foram obtidos para o extrato a 50 °C

utilizando o etanol como solvente extrator.

A quantidade de compostos fenólicos presentes nos extratos foi obtida usando o método

de Folin que proporciona uma estimativa da quantidade de compostos fenólicos que podem

ser responsáveis pela capacidade antioxidante do extrato. Como pode ser observado na

Tabela 17, o teor de fenóis totais aumentou ligeiramente com o aumento da temperatura de

extração para ambos os protocolos de PLE e foram semelhantes aos obtidos com Soxhlet.

Oliveira135et al. relataram valores de 261,59 mg de ácido gálico/g carqueja e 15,49

µg/mLpara fenóis totais e EC50, respectivamente, em extratos de Baccharis Trimera usando

etanol como solvente. Dias et al.136 relataram um intervalo de valores de 17,69 a 68,11 µg/mL

EC50 para os extratos de Baccharis Trimera usando etanol como solvente, numa faixa de

concentração de 5 a 25 µg mL-1. Em ambos os casos, eles utilizaram métodos de extração,

concentração e matrizes diferentes uns dos outros e também diferente da condição

experimental deste trabalho. O valor elevado de fenóis totais sugere que estão sendo

contabilizados os compostos fenólicos e também os taninos presentes na amostra. Não foi

encontrada qualquer relato abordando a determinação da atividade antioxidante e fenóis

totais de carqueja com líquidos pressurizados ou Soxhlet como métodos de extração,

utilizando metanol ou etanol como solventes extratores.

5.8.2 Otimização da separação eletroforética

Antes da análise dos extratos de carqueja por CE-ESI-TOF/ MS, foi efetuada a

transferência do método desenvolvido no Brasil no equipamento 1 para uma otimização

preliminar da separação eletroforética utilizando CE-UV na Espanha (equipamento 2). Assim,

foram estudados os diferentes tampões: hidrogenocarbonato de amônio, carbonato de

135Oliveira, C. B., Comunello, L. N.; Lunardelli, A., Amaral, R. H.; Pires, M. G. S., Silva, G. L., Manfredini, V. Vargas, C. R.; Gnoatto, S. C. B., Oliveira, J. R., Gosmann, G. Molecules 2012, 17, 1113. 136

Dias, L. F. T., Melo, E, S.; Hernandes, L. S., Bacchi, E. M., Braz J. Pharmacogn. 2009, 19, 1B, 309.


115

amônio, acetato de amônio, formiato de amônio, ácido bórico/hidróxido de amônio, em

diferentes concentrações (de 20 a 60 mmol L-1), com diferentes percentagens de modificador

orgânico (de 0 a 5%) e a diferentes pH (9 e10). Os resultados preliminares mostraram

diferenças significativas em termos de eficiência e resolução de picos, mas as mobilidades

efetivas permaneceram dentro da mesma ordem de grandeza. A análise utilizando tampão

tetraborato de amônio (ácido bórico / hidróxido de amônio) não apresentou uma separação

adequada da mistura de compostos fenólicos, já as soluções tampões de

hidrogenocarbonato de amônio, carbonato de amônio ou acetato de amônio na concentração

de 60 mmol L-1 contendo 5% de MeOH, a pH 9 resultaram separações adequadas para todos

os compostos (dados não mostrados).

A técnica de CE-ESI-TOF MS tem um fator limitante, que é a necessidade de utilização

de tampões voláteis, o que reduz o campo de aplicações. Esta necessidade se deve porque

a presença de componentes não voláteis137 no tampão de separação de CE diminui a

detectabilidade, aumenta o ruído de fundo e, em condições extremas, pode entupir o

sistema138. De acordo com os resultados preliminares de CE-UV, as melhores condições de

separação foram obtidas quando o hidrogeno carbonato de amônio, carbonato de amônio ou

acetato de amônio foram utilizados a 60 mmol L-1, 5% de MeOH, a pH 9. No entanto, foi

necessário fazer uma adaptação do método a fim de obter o melhor desempenho de

separação em condições estáveis (contato elétrico na interface do CE e robustez do ESI). A

influência da composição do 2-propanol no líquido auxiliar foi estudada a 40, 50 e 60%. Maior

detectabilidade e estabilidade para o CE foi obtida empregando a composiçãode 50% de 2-

propanol: água (v/v).Os resultados obtidos usando esta composição foram promissores, no

entanto, a forma dos picos não foi satisfatória.

Com o objetivo de melhorar a forma dos picos, novos ensaios foram realizados

considerando os parâmetros concentração do tampão (intervalo de 10 a 40 mmol L-1), a

percentagem de modificador orgânico (0, 5 e 10%), pH (9 e 10), voltagem (25 e 27 kV) e

tempo de análise. Mesmo após estas alterações, os picos continuaram deformados. O

problema foi solucionado quando uma mistura de tampão que consiste de

hidrogenocarbonato de amônio, formiato de amônio e acetato de amônio foram utilizados a

uma concentração de 10 mmol L-1, pH 10, 5% de MeOH e 5% de ACN, foi usado, como pode

ser visto na Figura 47.

137

Cai, J., Henion, J., J. Chromatogr. A 1995, 703, 667. 138

Tavares, M., Quim. Nova 1996, 19, 2, 173.


116

Figura 47: Eletroferograma da mistura de compostos fenólicos.1. rutina, 2. quercetrina, 3.

ácido ferúlico, 4. ácido cafeico. Concentração:1,25 µg mL-1.Condições eletroforéticas: capilar

50 µm di.Comprimento efetivo: 85 cm. Tampão:NH4HCO3,CH5NO2 e CH3COONH4, pH 10,

injeção hidrodinâmica: 10s, 50 psi. Potencial: 27 kV. Detecção: ESI-TOF. Condições ESi:

líquido auxiliar composto por 2-propanol-água (50:50 v/v) a um fluxo de 0,24 mL/h; gás de

secagem fluxo de 4 L/min a 250ºC, pressão de gás nebulizador de 4,00 psi.

5.8.3 Validação do método

A seletividade foi avaliada pela comparação entre o tempo de migração e o espectro

de massas da amostra e da amostra fortificada como padrão, como pode ser visto na Figura

48.

1

2

3 4

0 2 4 6 8 10 12 14 Time [min]

0

1

2

3

4

4x10

Intens.


117

Figura 48: Eletroferograma do extrato metanólico de carqueja in natura (1 e 3) e fortificado

com padrões (1+Pd e 3+Pd) de compostos fenólicos, onde: 1.rutina, 3. ácido ferúlico.

Concentração: 1,25 µg·mL-1. Condições eletroforéticas: capilar 50 µm id. Comprimento

efetivo: 85 cm. Tampão: NH4HCO3, CH5NO2 e CH3COONH4, pH 10, injeção hidrodinâmica:

10s, 50 psi.Potencial: 27kV. Detecção: ESI-TOF. Condições ESi: líquido auxiliar composto

por 2-propanol-água (50:50 v/v) a um fluxo de 0,24 mL/h; gás de secagem fluxo de 4 L/min a

250ºC, pressão de gás nebulizador de 4,00 psi.

O eletroferograma apresentado na Figura 48 retrata a composição das transições m/z

obervadas para os compostos fenólicos em análise. Só estão apresentados os espectros de

massas da rutina e ácido ferúlico, porque foram os únicos compostos fenólicos encontrados

na amostra.

A faixa linear para a construção de curvas analíticas para os compostos fenólicos

estudados foram: rutina (1,25-20,0 µgmL-1), ácido ferúlico (0,63-10,0 µgmL-1), quercetrina

(1,25-20,0 µgmL-1) e ácido cafeico (4,69-75,0 µgmL-1). Os coeficientes de correlação obtidos

neste estudo foram superiores a 0,99116, e são mostrados na Tabela 18.


118

Tabela 18. Parâmetros de desempenho quantitativo para padrões de compostos

fenólicos e LD e LQ de rutina, quercetrina, ácido ferúlico e ácido cafeico

Antioxidantes Faixa linear

(µg·mL-1)

R2 LD

(µg mL-1)

LQ

(µg mL-1)

Rutina 1,25 – 20,0 0,9955 0,38 1,25

Quercetrina 1,25 – 20,0 0,9959 0,38 1,25

Ácido ferúlico 0,63 – 10,0 0,9995 0,19 0,63

Ácido cafeico 4,69 – 75,0 0,9991 1,42 4,69


Os LD e LQ foram experimentalmente determinados a partir da relação sinal-ruído de

3:1e10:1, respectivamente. Ácido ferúlico apresentou os menores valores de LD e LQ, 0,19 e

0,63 µg mL-1, enquanto que o ácido cafeico apresentou os valores mais elevados 1,42 e 4,69

µg mL-1, respectivamente. Estes dados podem ser vistos na Tabela 18.

A exatidão foi determinada através de testes de recuperação. A recuperação dos

analitos foi calculada seguindo a recomendação da ANVISA116, a partir das respostas

analíticas para cada um dos compostos nos extratos e soluções fortificadas. Os extratos

foram enriquecidos antes da eluição através do cartucho de SPE. Foram utilizadas

concentrações em três níveis de fortificação como segue: a rutina e quercetrina (1,25, 2,50 e

1,88 µg mL-1), ácido ferúlico (0,63, 0,94 e 1,25 µg mL-1) e ácido cafeico (4,69, 7,03 e 9,38 µg

mL-1). A recuperação variou de 80-120%, considerando os três níveis de fortificação. Os

valores de recuperação estão em conformidade com amargem permitidapela ANVISA116,com

uma variação entre 80 a 120%. Os resultados das recuperações estão resumidos na Tabela

19.

Para os ensaios de repetibilidade (intra-ensaio), três níveis de concentração foram

necessários, os resultados foram expressos como o desvio-padrão relativo (DPR). A

repetibilidade variou 0,9-4% considerando os três níveis de fortificação. Os valores de DPR

ficaram abaixo de 5%. Estes dados estão na Tabela 19.


119

Tabela 19 Recuperação e repetibilidade dos ensaios em três níveis de fortificação.

Antioxidante

Rutina (n=9)


1,25 1,88 2,50


DPR (%) 1 1 2

Quercetrina (n=9)


1,25 1,88 2,50


DPR (%) 2 2 1



0,63 0,94 1,25


DPR (%) 4 1 0,4



4,69 7,03 9,38


DPR (%) 0,9 4 3

5.8.4 Determinação da concentração de compostos fenólicos presentes na amostra

Após o desenvolvimento do método foi injetado um extrato de carqueja para a

identificação de compostos fenólicos. Por este método de análise foram encontrados dois

compostos de interesse na amostra, a saber, a rutina e ácido ferúlico, conforme pode ser

visto na Figura 49. Os outros polifenóis como, quercetrina e ácido cafeico não foram

encontrados.


120

Figura 49: Eletroferograma do extrato purificado por SPE, onde 1 representa o canal

correspondente ao monitoramento da transição m/z 609, correspondente ao composto

fenólico rutina e 3 representa o canal correspondente ao monitoramento da transição m/z

193, correspondente ao composto fenólico ácido ferúlico. Condições eletroforéticas: capilar

50 µm di. Comprimento efetivo: 85 cm. Tampão: NH4HCO3,CH5NO2 e CH3COONH4, pH 10,

injeção hidrodinâmica: 10s, 50psi. Potencial:27kV. Detecção: ESI-TOF. Condições ESI:

líquido auxiliar composto por 2-propanol-água (50:50 v/v) a um fluxo de 0,24 mL/h; gás de

secagem fluxo de 4 L/min a 250ºC, pressão de gás nebulizador de 4,00 psi.

Fazendo a interpolação dos dados na curva analítica foi possível calcular a

concentração de duas espécies presentes no extrato e fazer uma comparação entre os

diferentes métodos de extração utilizados neste trabalho.

De acordo com os resultados mostrados na Tabela 20, observa-se que à medida que

aumenta a temperatura, aumenta a concentração das espécies em estudo (rutina e ácido

ferúlico), independente do solvente utilizado, ainda que este efeito seja mais pronunciado

usando metanol como solvente extrator do que com etanol. Os valores estimados de rutina

para este incremento considerando a faixa total de temperatura (50 a 150 ºC) foram de 6,56

mg g-1 a 12,8 mg g de folha seca e 7,69 mg g-1 a 13,8 mg g-1 de folha seca para a rutina

empregando etanol e metanol como solventes extratores, respectivamente. Fazendo a

mesma comparação para o ácido ferúlico foram encontrados uma faixa de 2,2 mg g-1a 6,2

mg g-1 de folha seca e 2,6 a 6,45 mg g-1 de folha seca empregando etanol e metanol como

solventes extratores, respectivamente. Os valores encontrados para o mesmo composto

empregando extração por soxhlet foram 24 e 5 mg g-1de planta para a rutina e ácido ferúlico,

respectivamente.


121

Tabela 20: Quantificação dos compostos fenólicos rutina, e ácido ferúlico (expressos como

mg/g planta) presentes na amostra de carqueja SP1 (CPQBA).

Técnica de

extração

Solvente T (ºC) Concentração

de rutina

Concentração de

ácido ferúlico

(mg/g folha) (mg/g folha)

PLE EtOH 50 6,56 ± 0,08 2,2 ± 0,9

75 7,0 ± 0,5 3,0 ± 0,4

100 9,65 ± 0,02 2,4 ± 0,5

150 12,8 ± 0,8 6,2 ± 0,5

PLE MeOH 50 7,69 ± 0,06 2,6 ± 0,2

75 7,8± 0,4 3,36 ± 0,05

100 13,4 ± 0,7 5,6 ± 0,2

150 13,8 ± 0,1 6,45 ± 0,06

Soxhlet MeOH 75 24,0 ± 0,9 5,0 ± 0,1

T= temperatura em grau Celsius.

Ao comparar a extração utilizando líquidos pressurizados com aquela empregando

Soxhlet, observa-se que a maior concentração de rutina foi obtida à 75°C com a técnica de

extração considerada clássica. Já a maior concentração de ácido ferúlico foi obtida à 150°C

pela PLE considerada avançada, tanto com etanol quanto com o metanol como solventes

extratores.


122


123

Capítulo 6

Conclusões


124


125

6.0 Conclusões

Comparando as técnicas CE-UV e CE-MS, conclui-se que apesar da CE-UV ter maior

detectabilidade e ser mais simples, a CE-MS é mais seletiva para a separação dos

compostos estudados. A concentração de rutina variou de 6,56 ± 0,08 até 13,1 ± 0,1 mg g-1 e

a concentração de ácido ferúlico variou de 2,2 ± 0,9 até 6,45 ± 0,06 mg g-1 para CE-MS.

Comparando as técnicas HPLC-UV e UHPLC-MS/MS, foi possível averiguar que na

primeira o tempo de análise é maior, e o número de compostos identificados são menores

para a mesma amostra. No UHPLC-MS/MS trabalhou-se nos modos de varredura SIM e no

modo MRM, onde foram monitoradas as transições m/z dos íons precursores e íons

produtos. Através da análise foi possível determinar a presença e concentração de 6

compostos fenólicos, rutina (3,2 ± 0,3 mg g-1 – majoritário), quercetrina, ácido ferúlico, ácido

cafeico, ácido gálico e canferol (1,8 ± 0,04 mg g-1 – minoritário), estes dados são referentes à

amostra fornecida pelo CPQBA e utilizada como padrão para o desenvolvimento e validação

do método.

Comparando as técnicas de extração foi averiguado que a extração empregando

Soxhlet, pode ser considerada melhor que a extração por PLE, quando considerado a soma

das concentrações individuais dos compostos fenólicos estudados, independentemente dos

dois solventes empregados.

O efeito matriz influenciou na quantificação dos compostos fenólicos, no entanto, o

efeito matriz não impediu o emprego dos métodos na determinação da concentração dos

compostos fenólicos na carqueja, uma vez que para compensar esse efeito foram utilizadas

na quantificação curvas analíticas com adição de padrão dos compostos fenólicos na matriz.

Além disso, usando-se o espectrômetro de massas foi possível identificar 6 dos compostos

fenólicos de interesse.

As análises das amostras comerciais mostraram que o maior teor de compostos

fenólicos em estudo está presente na amostra da Bahia (10,84 mg g-1- soma das massas

individuais dos compostos fenólicos), seguido por Minas Gerais (9,49 mg g-1 ) e por último

São Paulo (8,62 mg g-1).

De acordo com os dados encontrados na literatura para a atividade antioxidante da

carqueja e comparados com os extratos acóolicos obtidos neste trabalho conclui-se que a

carqueja tem atividade antioxidante moderada.


126

6.1 Sugestões futuras

Estudar a sazonalidade, aprofundar estudos sobre plantas de diferentes regiões,

estudo de plantas exóticas, estudar frações menos polares e os óleos essenciais e outras

classes de compostos fenólicos.

marcelo fabiano andrÉ -...

Documents