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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE AQUICULTURA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA
MARCAÇÃO QUÍMICA DE JUNDIÁS Rhamdia quelen COM
ALIZARINA VERMELHA
Dissertação submetida ao Programa de Pós-
Graduação em Aquicultura, Centro de
Ciências Agrárias da Universidade Federal
de Santa Catarina, como requisito para a
obtenção do título de mestre em Aquicultura.
Orientador: Evoy Zaniboni Filho
ANA ROSA SANT´ANNA DE SÁ
Florianópolis
2014
Marcação química de jundiás Rhamdia quelen com alizarina
vermelha
Por
ANA ROSA SANT'ANNA DE SÁ
Esta dissertação foi julgada adequada para a obtenção do título de
MESTRE EM AQUICULTURA
e aprovada em sua forma final pelo Programa de
Pós-Graduação em Aqüicultura.
_____________________________________
Prof. Alex Pires de Oliveira Nuñer, Dr.
Coordenador do Programa
Banca Examinadora:
__________________________________________
Dr. Evoy Zaniboni Filho – Orientador
__________________________________________
Dr. Alex Pires de Oliveira Nuñer
__________________________________________
Dr. Giuliano Palemão Carlos Maia Huergo
__________________________________________
Dra. Renata Maria Guereschi
"Se não posso dançar, não é minha revolução"
(Emma Goldman)
AGRADECIMENTOS
Primeiro de tudo agradeço a minha mãe, Dona Vera, a mulher mais forte
do mundo (em todos os aspectos), que sempre esteve ao meu lado “pra
puxar a orelha” ou dar “aquele abraço”, por toda a força, amor e por
fazer as melhores e mais deliciosas comidas. Mamãe, amo você!
Aos meus “irmãos prediletos”, Renato e Renan, por me agüentarem
triste/feliz/com raiva, sempre com as melhores piadas, as melhores
palavras de conforto “vai estudar mandriona”, as pizzas, as brigas,
considero vocês pra caramba!!
Ao meu pai, que deixou saudades infinitas, muitas lembranças boas, que
papai e Rufão sejam melhores amigos onde quer que estejam!
Aos familiares que acreditaram nessa jornada, sempre dando apoio.
Ao Carlos, companheiro, que viu essa jornada desde o início (nossa
quanto tempo hein!), que me agüenta todos os dias, estando sempre ao
meu lado, pelo amor e carinho, e por tornar essa caminhada mais
prazerosa e alegre.
Aos amigos “pombônicos”, pelo companheirismo, pelas risadas a mil, as
melhores resenhas, a amizade, que guardarei para sempre.
Aos amigos “do Cazé” que agora são meus também, sempre estiveram
ali, a gente que não se enxergava. Agora tudo junto e misturado,
aprendemos e compartilhamos tantas coisas que não trocaria vocês pelo
filme do Pelé, jamais!
À Samara e Prof. Evoy por toda a assistência, pelas orientações e
sugestões, e pela experiência profissional.
Para todos que estiveram presentes e de algum modo ajudaram e
apoiaram nos meus estudos, eu agradeço de coração, sem vocês esse
objetivo não seria possível, nem tão agradável e divertido.
RESUMO
Desde a construção dos primeiros empreendimentos hidrelétricos
grandes esforços têm sido empregados na tentativa de mitigar os
impactos e manejar a ictiofauna. Ao desenvolver ações de
repovoamento é necessário fazer uma avaliação destas atividades através
de monitoramentos contínuos. Um pré-requisito fundamental antes de
qualquer avaliação eficaz do sucesso das ações de estocagem é uma
identificação confiável dos peixes introduzidos. A aplicação de marcas
químicas é considerada uma técnica de grande potencial para
monitoramento de estocagens, pois permite marcar grandes lotes de
peixes nos variados estágios de vida. Diversos protocolos têm sido
utilizados para a marcação química. A introdução do marcador pode ser
feita através de injeção, ingestão alimentar e banho de imersão. O
objetivo deste estudo foi definir os procedimentos de marcação química
com Alizarina Vermelha para o jundiá Rhamdia quelen. Foram testadas
três concentrações de Alizarina Vermelha (30mg/L, 60mg/L e, 90mg/L)
com tempo de imersão de 18 horas (banho longo), sendo divididos em
dois grupos: a) com prévia indução osmótica salina, quando os peixes
foram mantidos em solução a 30ppt de NaCl durante 10 minutos e
imediatamente submetidos ao banho com o marcador; b) sem indução
osmótica, quando os peixes foram diretamente submetidos ao banho
com o marcador, e três concentrações de Alizarina Vermelha (90mg/L,
300mg/L e 700mg/L) com tempo de imersão de 10 minutos (banho
curto), todos com prévia indução osmótica salina (solução aquosa de
NaCl a 30ppt) durante 10 minutos. Todos os tratamentos apresentaram a
marcação química após uma semana, sendo os melhores resultados
obtidos nos tratamentos de 90mg/L com choque osmótico (banho longo)
e o tratamento de 300mg/L realizado em banho curto. Na reavaliação
das marcas, feita após três meses do banho imersão no marcador
químico foi possível notar que todos os tratamentos continham marcas
visíveis, tendo melhores resultados nos tratamentos submetidos ao
choque osmótico, que apresentaram marcas mais intensas. A indução
osmótica antes do banho de imersão no marcador químico Alizarina
Vermelha resultou em uma maior intensidade nas marcações. A
Alizarina Vermelha foi verificada com eficácia como marcador químico
em banhos de imersão para jundiá Rhamdia quelen.
Palavras-chave: Indução osmótica, banho de imersão, fluormarcador,
nadadeira caudal.
ABSTRACT
Since the construction of the first large hydropower developments many
efforts have been employed in an attempt to mitigate the impacts and
manage fish populations. When developing restocking actions it is
necessary to evaluate these activities through continuous monitoring. A
fundamental prerequisite before any effective evaluation of the success
of these actions is a reliable identification of the introduced fish. The
application of chemical marks is considered a technique of great
potential for monitoring restocking actions because it allows large
batches of fish in various stages of life. Several protocols have been
used for chemical marking. The aim of this study was to define the
procedures for chemical marking using Alizarin Red for the catfish
Rhamdia quelen. Three concentrations of Alizarin Red (30mg/L,
60mg/L and 90mg/L) were tested with immersion time of 18 hours (long
bath), divided into two groups: a) with a prior osmotic saline induction
(30ppt) for 10 minutes; b) without osmotic induction: and three
concentrations of Alizarin Red (90mg/L, 300mg/L and 700mg/L) with
immersion time of 10 minutes (short bath), all of them with a prior
osmotic saline induction (30ppt) for 10 minutes. All treatments showed
the chemical marking after a week, with the best results for the 90mg/L
treatment with osmotic shock (long bath) and for the 300mg/L treatment
(short bath). On the reevaluation of the marks after three months it was
possible to observe that all treatments contained visible marks, with the
best results being in the treatments subjected to osmotic shock, which
showed stronger marks. The osmotic induction before bath immersion in
the chemical marker Alizarin Red resulted in a greater intensity in the
labeling. The Alizarin Red was verified effectively as a chemical mark
in immersion baths for catfish Rhamdia quelen.
Keywords: osmotic induction, immersion bath, chemical marking,
caudal fin
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Raios da nadadeira caudal de jundiá R.quelen submetidos
a marcação com Alizarina Vermelha e observados em Scanner
CONFOCAL TCS SP5. ......................................................................... 30
Figura 2: Intensidade de fluorescência após uma semana do banho
de imersão em Alizarina Vermelha. Banhos com duração de 18 horas
nas concentrações de 30mg/L (a), 60mg/L (b) e 90mg/L (c), ou
submetidos aos banhos com duração de 18 horas precedidos pelo
choque osmótico de 10 minutos nas concentrações de 30mg/L (d),
60mg/L (e) e 90mg/L (f). Banhos com duração de 10 minutos e
precedidos pelo choque osmótico de 10 minutos nas concentrações
de 300mg/L (g), 700mg/L (h) e 90mg/L (i). ......................................... 32
Figura 3: Intensidade de Fluorescência dos raios das nadadeiras de
jundiá depois de uma semana do banho de imersão em Alizarina
Vermelha, (A) banho longo (18 horas), (B) banho em concentrações
de 90 mg/L precedido pelo choque osmótico em banho curto (10
minutos ) e banho longo (18 horas), (C) banho curto (10 min).. ........... 33
Figura 4: Intensidade de fluorescência após três meses da aplicação
do banho de imersão em Alizarina Vermelha. Banhos com duração
de 18 horas nas concentrações de 30mg/L (a), 60mg/L (b) e 90mg/L
(c), ou submetidos aos banhos com duração de 18 horas precedidos
pelo choque osmótico de 10 minutos nas concentrações de 30mg/L
(d), 60mg/L (e) e 90mg/L (f). Banhos com duração de 10 minutos e
precedidos pelo choque osmótico de 10 minutos nas concentrações
de 300mg/L (g), 700mg/L (h) e 90mg/L (i). ......................................... 34
Figura 5: Intensidade de Fluorescência dos raios das nadadeiras de
jundiá depois de três meses da aplicação do banho de imersão em
Alizarina Vermelha, (A) banho longo (18 horas), (B) banho em
concentrações de 90 mg/L precedido pelo choque osmótico em
banho curto (10 minutos ) e banho longo (18 horas), (C) banho curto
(10 min).. ............................................................................................... 35
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Parâmetros de qualidade de água durante os banhos de
imersão com Alizarina Vermelha. ......................................................... 31
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL ...................................................................... 19
OBJETIVO GERAL ............................................................................. 23
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................ 23
ABSTRACT .......................................................................................... 24
MATERIAL E MÉTODOS................................................................... 28
RESULTADOS ..................................................................................... 31
DISCUSSÃO ......................................................................................... 36
CONCLUSÃO ...................................................................................... 39
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................. 40
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DA INTRODUÇÃO GERAL .. 42
19
INTRODUÇÃO GERAL
Desde a construção dos primeiros empreendimentos hidrelétricos
grandes esforços têm sido empregados na tentativa de mitigar os
impactos e manejar a ictiofauna, seja através da construção de
mecanismos de transposição para peixes, da implantação de programas
de estocagem ou da instalação de pisciculturas (Pelicice; Agostinho;
Agostinho, 2009). A estocagem de peixes, também conhecida como
repovoamento ou peixamento, é uma das ações de manejo mais aplicada
em todo o mundo (Welcomme, 1988). As estocagens, como forma de
manejo, podem ser classificadas, segundo Agostinho et al. (2007), em:
introdução, utilizando espécies não nativas para estabelecer populações
sustentáveis; manutenção, na qual as ações são repetidas anualmente
visando manter uma espécie que não se reproduz naturalmente no novo
ambiente (reservatório); suplementação, quando a ação busca aumentar
a população ou melhorar a variabilidade genética de uma determinada
espécie de peixe. Os dois últimos casos são usualmente chamados de
repovoamento, pois tratam de ações de estocagem com espécies nativas.
O repovoamento às vezes se faz necessário para recompor os estoques
naturais e promover a preservação de uma espécie (Weingartner et al.,
2008), sendo também amplamente utilizados para reabilitar espécies de
peixes ameaçadas (Cowx, 1994).
Ao desenvolver ações de repovoamento é necessário fazer uma
avaliação destas atividades através de monitoramentos contínuos, que
pode se dar por meio de pescas experimentais ou também do
acompanhamento das atividades pesqueiras.
Um pré-requisito fundamental antes de qualquer avaliação eficaz
do sucesso das ações de estocagem é uma identificação confiável dos
peixes introduzidos (Champigneullee, Cachera, 2003).
Como forma de monitoramento e identificação dos indivíduos
utilizados nas estocagens pode ser feita a marcação destes com marcas
externas e internas, como PIT tags, DART tags, T-bars e outras, que
apesar da fácil visualização, tem como principal problema a necessidade
da marcação individual de grandes lotes de peixes, além da
possibilidade de extravio destas marcas, impossibilitando assim a
avaliação adequada dos resultados das estocagens. Para contornar essa
problemática, tem sido utilizada a marcação química das estruturas
ósseas dos peixes.
20
A Marcação Química
A marcação química consiste em utilizar substâncias que se ligam
aos tecidos calcificados dos peixes e quando expostas à luz ultravioleta
(UV) ficam fluorescentes (Isben; Urist, 1964 apud Fielder, 2001).
Segundo Taylor et al. (2005) a imersão em produtos químicos que
apresentam fluorescência sob luz UV e ligam-se a extremidade
crescente do osso permite a marcação de um grande número de juvenis
com relativamente pouco esforço e, geralmente, resultam em uma boa
retenção da marca ao longo do tempo associado a uma mortalidade
mínima.
Diversas substâncias fluormarcadoras têm sido utilizadas para
marcação química como Alizarina Complexona (ALC), Oxitetraciclina
(OTC), Alizarina Vermelha (ALZ) e Azul de Calceína, tendo resultados
satisfatórios em Scophthalmus maximus (Iglesias; Rodriguéz-Ojea,
1997), em Perca flavescens (Unkenholz; Brown; Pope, 1997), em
Sparus aurata (Sánchez-Lamadrid, 2001), Argyrosomus japonicus
(Taylor et al., 2005), Coregonus lavaretus (Eckmann, 2003),
Oncorhynchus mykiss e O. tshawytscha (Negus; Tureson, 2004),
Acipenser sturio (Lochet; Jatteau, 2011) e Stizostedion vitreum (Brooks;
Heidinger; Kohler, 1994).
A introdução do marcador pode ser feita através de injeção,
ingestão alimentar e banho de imersão (Lagardére, 2000). A marcação
em banhos de imersão, quando o produto é aplicado em uma solução e
absorvido através das brânquias, é a mais utilizada, pois apresenta maior
custo-benefício, podendo ser administrada em grandes lotes de peixes,
demandando menor tempo quando comparada aos outros métodos,
reduzindo o manejo, o estresse e a mortalidade dos peixes (Nielsen,
1992).
Diversos protocolos são utilizados para marcação química. Para
marcação com OTC, Fielder (2001) sugeriu doses de 700mg/L em
banhos de imersão de 8 horas; Iglesias e Rodriguéz-Ojea (1997)
utilizaram ALC em doses de 60mg de em banhos de 24 horas, enquanto
Lagardére, Thibaudeau e Anras (2000) recomendam doses de ALZ de
400mg/L em banhos de 24 horas. Taylor et al. (2005) encontraram
resultados satisfatórios com ALC em doses de 30 -60mg/L e com OTC
na concentração de 600mg/L em banhos de imersão de 6 a 12 horas.
Uma técnica que permite uma redução considerável no tempo de
contato entre os peixes e as soluções de marcação foi mostrada por
Alcobendas et al. (1991), com a enguia européia Anguilla anguilla que
21
mostrou uma rápida absorção de corantes fluorocromo quando imerso
em uma solução hiperosmótica antes do banho de imersão na solução de
marcação. Ao expor os peixes à água com alta salinidade, é gerada uma
condição em que o ambiente externo é hiperosmótico em relação aos
fluidos do corpo do peixe. Conte (1969) afirma que o meio salino
provoca uma perda de água obrigatória através da pele, brânquias e rim
(em menor grau), por causa das diferentes concentrações osmóticas.
Subsequentemente, quando os peixes são abruptamente transferidos para
uma solução de marcação, a diferença osmótica resulta em uma
absorção rápida da solução, passando por osmose através da pele e
brânquias, diminuindo o tempo do banho de imersão necessário para a
inclusão de uma mesma quantidade do marcador.
A visualização das marcas químicas é realizada através do
microscópio de fluorescência com lâminas feitas a partir das estruturas
calcificadas: escamas, otólitos e segmento da vértebra (Babaluk; Craig,
1990). O microscópio de fluorescência transmite um cone de luz de
excitação que passa através dos filtros, por espelho dicróico específico e
da lente objetiva padrão até a amostra. A luz é parcialmente absorvida
ou refletida pela amostra. Segundo Maeda (2013) o efeito da
fluorescência ocorre quando incide excitação eletromagnética no
material. Os marcadores fluorescentes possuem espectros característicos
exclusivos para absorção (ou excitação) e emissão de luz, portanto, é
necessário escolher o filtro de luz apropriado para observar a luz
fluorescente emitida por cada marcador (Lichtman; Conchello, 2005).
A aplicação de marcas químicas é considerada uma técnica de
grande potencial para monitoramento de estocagens, pois permite
marcar grandes lotes de peixes nos variados estágios de vida (ovos,
larvas e juvenis) (Tsukamoto; Umezawa, 1988; Secor; Houde, 1995)
O Rhamdia quelen
De nome popular jundiá, a espécie Rhamdia quelen pertence à
seguinte divisão taxonômica: classe Osteichthyes, série Teleostei, ordem
Siluriformes, família Heptapteridae, gênero Rhamdia (Silfvergrip,
1996).
Esta espécie, segundo Baldisserotto et al. (2010), apresenta
distribuição desde o sudeste do México ao centro da Argentina.
Rhamdia quelen habita lagos e poços fundos dos rios, ambientes de
águas mais calmas com fundo de areia e lama, junto às margens e
22
vegetação. Abrigam-se entre pedras e troncos apodrecidos e à noite
saem à procura de alimento (Guedes, 1980).
Quanto a sua alimentação, o jundiá, na fase adulta apresenta
hábito onívoro e sua preferência por um determinado alimento é
decorrente da abundância do mesmo no local (Guedes, 1980; Meurer;
Zaniboni Filho, 1997; Gomiero; Souza; Braga, 2007). De acordo com
Guedes (1980), a observação dos organismos encontrados no conteúdo
gastrointestinal da espécie, indica não serem restritos ao habitat
bentônico, sugerindo que o Rhamdia quelen é generalista com relação à
escolha de alimento.
O Rhamdia quelen atinge a maturidade sexual no primeiro ano de
vida (Baldisserotto, 2010). Seu período reprodutivo pode variar de um
ano para outro, sendo que no sul do Brasil considera-se entre agosto e
março (Gomes et al., 2000). A espécie é ovulípara, realiza migração
lateral e, no habitat natural, quando estão prontos para desovar, grandes
cardumes de jundiá procuram lugares de água rasa, limpa, com pouca
correnteza e com fundo pedregoso. Acredita-se que há um sincronismo
entre machos e fêmeas durante a desova, ocorrendo durante o
amanhecer (Godinho et al., 1978; Andreatta, 1979).
O jundiá, como integrante da ictiofauna de importantes bacias
hidrográficas brasileiras, também é afetado pela construção de barragens
ao longo do leito dos rios. Com o barramento de um rio, a hidrologia
local é severamente alterada, levando a criação de novos habitats
(Agostinho et al., 2007). Após o represamento, a comunidade de peixes
a se constituir é primariamente dependente da fauna preexistente na
região alagada. As adaptações e particularidades de cada espécie
determinarão quais terão sucesso na exploração de novos habitats
(Fernando; Holcík, 1982; Agostinho; Miranda; Bini; Gomes; Thomaz;
Suzuki, 1999). De acordo com Agostinho et al. (2007), nos
reservatórios, a natureza recente das interações entre a ictiofauna, a
modificação nos habitats e os procedimentos operacionais nas barragens
tornam esses ambientes altamente estocásticos e, portanto, sujeitos a
maiores flutuações populacionais, tornando assim indispensável a
utilização de ações ambientais.
Como forma de monitoramento de ações de estocagens este
trabalho visa contribuir com uma metodologia de marcação química
com Alizarina Vermelha para o jundiá Rhamdia quelen.
O presente trabalho será submetido à publicação na revista
Neotropical Ichthyology.
23
OBJETIVO GERAL
Definir os procedimentos de marcação química com Alizarina
Vermelha para o jundiá Rhamdia quelen. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar o tempo ideal de imersão para a marcação química
do jundiá Rhamdia quelen;
Definir a concentração ideal da Alizarina Vermelha para os
banhos de marcação;
24
Marcação química de Jundiás Rhamdia quelen com alizarina
vermelha
Ana Rosa Sant´Anna de Sá1*, Samara Hermes-Silva
1, Evoy Zaniboni-
Filho1
1Laboratório de Biologia e Cultivo de Peixes de Água Doce –
LAPAD/CCA/UFSC
Rodovia SC 406, nº 3532, CEP 88066-000, Armação, Florianópolis/SC,
Brasil.
*Corresponding author: [email protected]
ABSTRACT
The need for proper technique for marking large batches of fish in a
variety of sizes, species and detection intervals is a constant challenge
for managers who wish to evaluate restocking actions. A marking tool
which receives increasing attention is the group of chemical marks.
Several protocols have been used for chemical marking. The aim of this
study was to define the procedures for chemical marking using Alizarin
Red for the catfish Rhamdia quelen. Three concentrations of Alizarin
Red (30mg/L, 60mg /L and 90mg/L) were tested with immersion time
of 18 hours (long bath), divided into two groups: a) with a prior osmotic
saline induction (30ppt) for 10 minutes; b) without osmotic induction;
and three concentrations of Alizarin Red (90mg/L, 300mg/L and
700mg/L) with immersion time of 10 minutes (short bath), all of them
with prior osmotic saline induction (30ppt) for 10 minutes. All
treatments showed the chemical marking after a week, with the best
results for the 90mg/L treatment with osmotic shock (long bath) and for
the 300mg/L treatment (short bath). On the reevaluation of the marks
after three months it was possible to observe that all treatments
contained visible marks, with the best results being in the treatments
subjected to osmotic shock. The osmotic induction before bath
immersion in the chemical marker Alizarin Red resulted in a greater
intensity in the labeling. The Alizarin Red was verified effectively as a
chemical mark in immersion baths for catfish Rhamdia quelen.
Keywords: osmotic induction, immersion bath, chemical marking,
caudal fin
25
RESUMO
A necessidade de uma técnica adequada para marcação de grandes lotes
de peixes em uma variedade de tamanhos, espécies e intervalos de
detecção é um desafio constante para órgãos gestores que desejam
avaliar ações de estocagens. Uma ferramenta de marcação que recebe
cada vez mais atenção é o grupo das marcas químicas. Diversos
protocolos têm sido utilizados para a marcação química. O objetivo
deste estudo foi definir os procedimentos de marcação química com
Alizarina Vermelha para o jundiá Rhamdia quelen. Foram testadas três
concentrações de Alizarina Vermelha (30mg/L, 60mg/L e, 90mg/L) com
tempo de imersão de 18 horas, sendo divididos em dois grupos: a) com
prévia indução osmótica salina, quando os peixes foram mantidos em
solução a 30ppt de NaCl durante 10 minutos e imediatamente
submetidos ao banho com o marcador; b) sem indução osmótica, quando
os peixes foram diretamente submetidos ao banho com o marcador. E
três concentrações de Alizarina Vermelha (90mg/L, 300mg/L e
700mg/L) com tempo de imersão de 10 minutos, todos com prévia
indução osmótica salina (solução aquosa de NaCl a 30ppt) durante 10
minutos. Todos os tratamentos apresentaram a marcação química após
uma semana, sendo os melhores resultados obtidos nos tratamentos de
90mg/L com choque osmótico (banho longo) e o tratamento de
300mg/L realizado em banho curto. Na reavaliação das marcas, feita
após três meses do banho imersão no marcador químico foi possível
notar que todos os tratamentos continham marcas visíveis, tendo
melhores resultados nos tratamentos submetidos ao choque osmótico. A
indução osmótica antes do banho de imersão no marcador químico
Alizarina Vermelha resultou em uma maior intensidade nas marcações.
A Alizarina Vermelha foi verificada com eficácia como marcador
químico em banhos de imersão para jundiá Rhamdia quelen.
Palavras-chave: Indução osmótica, banho de imersão, fluormarcador,
nadadeira caudal
26
INTRODUÇÃO
A necessidade de uma técnica adequada para marcação de
grandes lotes de peixes em uma variedade de tamanhos, espécies e
intervalos de detecção é um desafio constante para órgãos gestores que
desejam avaliar ações de estocagens (Negus & Tureson, 2004).
Uma das formas de monitoramento das estocagens é o uso de
marcas externas e internas nos peixes (PIT tags, DART tags, T-bars e
outras), no entanto, apesar da fácil visualização destas marcas, seu
principal problema consiste na marcação de grandes lotes, além da
possibilidade de extravio ou perda, prejudicando assim a avaliação
adequada dos resultados das estocagens.
Uma ferramenta de marcação que recebe cada vez mais atenção é
o grupo das marcas químicas, que dependem de compostos
fluormarcadores que rotulam tecidos ósseos ou calcificados dos peixes
(Mohler, 2003), e que quando expostas à luz ultravioleta (UV) ficam
fluorescentes (Isben; Urist, 1964 apud Fielder, 2001). Diversas
substâncias fluormarcadoras têm sido utilizadas para marcação química,
tais como Alizarina Complexona, Oxitetraciclina, Alizarina Vermelha e
Azul de Calceína. O método mais comum de se fazer a marcação
química consiste nos banhos de imersão, quando o produto é aplicado
em uma solução e absorvido através das brânquias. Este método é o
mais utilizado, pois apresenta maior relação custo-benefício, podendo
ser administrado em grandes lotes de peixes, demandando menor tempo
quando comparado aos demais métodos, reduzindo o manejo, o estresse
e a mortalidade dos peixes (Nielsen, 1992).
Muitos trabalhos têm empregado a Alizarina Vermelha como
marcador químico em banhos de imersão (Campanella, 2013; Liu et al.,
2009; Crook et al., 2007; Lagardére, 2000), sendo observadas marcas
intensas em otólitos, raios da nadadeira caudal e espinhos peitorais em
Odontesthes bonariensis, Paralichthys olivaceus, Macquaria ambígua, e
Scophthalmus maximus.
Uma técnica que tem sido utilizada para possibilitar uma redução
considerável no tempo de contato entre os peixes e as soluções de
marcação é aquela que associa aos banhos de imersão o choque
osmótico prévio, que consiste em imergir os peixes em uma solução
hiperosmótica antes da realização do banho de marcação.
Ainda que diversos protocolos tenham sido utilizados para a
marcação química, não há registro de estudos desenvolvidos com
espécies nativas das bacias hidrográficas brasileiras. O jundiá, como
27
integrante da ictiofauna de importantes bacias hidrográficas brasileiras,
também é afetado pela construção de barragens ao longo do leito dos
rios. Esta espécie, segundo Baldisserotto et al. (2010), apresenta
distribuição desde o sudeste do México ao centro da Argentina, habita
lagos e poços fundos dos rios, ambientes de águas mais calmas com
fundo de areia e lama, junto às margens e vegetação. Abrigam-se entre
pedras e troncos apodrecidos e à noite saem à procura de alimento
(Guedes, 1980).
Devido à necessidade de marcar grandes lotes de peixes e a
ausência de estudos desta técnica em peixes nativos do Brasil, o objetivo
deste estudo foi definir os procedimentos de marcação química com
Alizarina Vermelha para o jundiá Rhamdia quelen, em diferentes
concentrações e tempos de imersão associados ao choque osmótico.
28
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado no Laboratório de Biologia e Cultivo
de Peixes de Água Doce (LAPAD) do Departamento de Aqüicultura
(CCA - Centro de Ciências Agrárias) da Universidade Federal de Santa
Catarina (UFSC). Os 334 juvenis de Rhamdia quelen utilizados foram
provenientes da reprodução induzida, realizada em março de 2013, de
indivíduos do plantel de reprodutores oriundos da bacia do rio Uruguai.
Os juvenis foram mantidos em 28 tanques de 20 litros ligados ao
sistema de recirculação de água (salinizado com NaCl a 2,5ppt), sendo
alimentados manualmente três vezes ao dia com náuplios de artêmia e
ração farelada.
Marcação dos Juvenis
Os procedimentos para os testes de marcação foram realizados
com juvenis de aproximadamente 40 mm + 210 mm de comprimento
total, mantidos em uma biomassa de 9g/L por tanque (7 litros de volume
útil).
Foram testadas três concentrações de Alizarina Vermelha
(30mg/L, 60mg/L e, 90mg/L) com tempo de imersão de 18 horas (banho
longo), sendo divididos em dois grupos: a) com prévia indução osmótica
salina, quando os peixes foram mantidos em solução a 30ppt de NaCl
durante 10 minutos e imediatamente submetidos ao banho com o
marcador; b) sem indução osmótica, quando os peixes foram
diretamente submetidos ao banho com o marcador, e três concentrações
de Alizarina Vermelha (90mg/L, 300mg/L e 700mg/L) com tempo de
imersão de 10 minutos (banho curto), todos com prévia indução
osmótica salina (solução aquosa de NaCl a 30ppt) durante 10 minutos.
Todos os testes foram realizados com três repetições e um tanque
controle, sendo monitorados os valores de oxigênio dissolvido,
temperatura e pH. No preparo das soluções de Alizarina Vermelha para
os banhos de marcação, para garantir a estabilização do pH, foi utilizada
uma solução de 20% NaOH afim de manter o ph entre 6,5 e 7,5. Durante
os banhos de choque osmótico e com a solução de marcação os peixes
permaneceram em jejum, e sem troca de água. Para o choque osmótico
foram realizados testes preliminares até uma concentração de 30g/L
(30ppt) com banho de 10 minutos. Após os banhos de imersão, todos os
peixes foram transferidos aos tanques de 20 litros mantidos ligados ao
sistema de recirculação de água do laboratório.
29
Observação das Marcas
A observação das marcas foi realizada uma semana após os
tratamentos, sendo que a permanência destas marcas foi reavaliada três
meses depois da marcação. Foram analisados três peixes por tanque
(nove peixes por tratamento). As lâminas para a observação das marcas
foram confeccionadas com uma amostra da nadadeira caudal colocada
entre lâmina e lamínula e lacrada com esmalte incolor. Para a
visualização e registro das marcas, as lâminas foram analisadas sob um
microscópio LEICA DMI6000 B com filtro UV na faixa de 405 a
660nm, sob aumento de 50x; o registro fotográfico foi obtido a partir do
Scanner CONFOCAL TCS SP5 acoplado ao microscópio utilizando-se
o software CONFOCAL LEICA LAS AF lite. Todas as imagens foram
obtidas utilizando-se o mesmo aumento e tempo de exposição. As
imagens foram avaliadas quanto à presença ou ausência da marca e sua
intensidade avaliada em uma escala de 0 a 255 em Valores de Cinza
(VC) a partir de uma área amostral igual para todas as imagens obtidas
(figura 1). Para medição da intensidade da marcação, foi selecionada a
área com a maior intensidade de fluorescência de cada imagem.
Análise Estatística
A intensidade de fluorescência dos diferentes tratamentos foi
avaliada através de uma Análise de Variância (ANOVA), seguido do
teste de Tukey, quando necessário. Todas as análises foram realizadas
utilizando-se o programa STATISTICA 7.0. Para essas análises, foi
utilizado o valor médio obtido pela leitura da intensidade obtida em cada
um dos três peixes de cada repetição. Foram comparados os tratamentos
submetidos aos banhos longos, aos banhos rápidos e para a concentração
de 90mg/L (com choque osmótico) entre os diferentes tempos de
exposição ao banho de marcação. Para todas as análises foi utilizado
0,05 como o nível de significância estatística.
30
Figura 1: Raios da nadadeira caudal de jundiá R.quelen submetidos a
marcação com Alizarina Vermelha e observados em Scanner CONFOCAL
TCS SP5. Em detalhe elipse que indica a região selecionada para mensurar
a intensidade da marcação e quadro contendo os valores da intensidade de
fluorescência medida em valores de cinza.
31
RESULTADOS
Durante os banhos de marcação não houve nenhuma mortalidade
e a qualidade da água foi mantida próxima ao conforto da espécie
(tabela 1).
Tabela 1: Parâmetros de qualidade de água durante os banhos de imersão
com Alizarina Vermelha.
Duração
do
Banho
Temperatura
(°C)
Salinidade
(ppt)
Dureza
(mgCaCO3/L)
pH Oxigênio
Dissolvido
(mg/L)
18 h 24,8 0,24 197 7,60 6,51
10 min 26,4 0,26 197 7,02 7,37
Todos os tratamentos apresentaram a marcação química nos raios
das nadadeiras após uma semana da aplicação (figura 2). Na avaliação
entre os tratamentos de banho longo a concentração de 90mg/L e
60mg/L, ambos precedidos pelo choque osmótico, proporcionaram
marcas mais intensas e que apresentaram diferença significativa em
relação aos outros tratamentos, que apresentaram marcas mais tênues.
Na análise entre os tratamentos com a mesma concentração (90mg/L) e
tempos diferentes (18 horas e 10 min.), o tratamento de banho longo
apresentou melhor absorção da Alizarina Vermelha e resultou na
formação de marcas mais intensas em comparação ao tratamento de
banho curto. Entre os tratamentos de banho curto, as concentrações de
300mg/L e 700mg/L não mostraram diferenças entre si, embora tenham
produzido marcas mais intensas que as obtidas com o tratamento de 90
mg/L (figura 3).
Na reavaliação das marcas, realizadas três meses depois do banho
de imersão, foi observado que todos os tratamentos ainda apresentavam
a marcação química (figura 4). Não houve diferença quanto à
intensidade das marcas entre os tratamentos de banho longo. Quando
comparados os tratamentos de 90mg/L aplicados em diferentes tempos
de exposição (banho longo e curto), ambos precedidos do choque
osmótico, não foram observadas diferenças significativas na intensidade
da marca. Na avaliação entre as concentrações aplicadas em banho
curto, o tratamento de 300mg/L produziu marcas mais intensas e que
apresentaram diferença significativa em relação aquelas produzida pelo
tratamento de 90mg/L, mas não apresentou diferença aquelas produzidas
pelo tratamento de 700mg/L (figura 5).
32
Figura 2: Intensidade de fluorescência após uma semana do banho de
imersão em Alizarina Vermelha. Banhos com duração de 18 horas nas
concentrações de 30mg/L (a), 60mg/L (b) e 90mg/L (c), ou submetidos aos
banhos com duração de 18 horas precedidos pelo choque osmótico de 10
minutos nas concentrações de 30mg/L (d), 60mg/L (e) e 90mg/L (f).
Banhos com duração de 10 minutos e precedidos pelo choque osmótico de
10 minutos nas concentrações de 300mg/L (g), 700mg/L (h) e 90mg/L (i).
33
Figura 3: Intensidade de Fluorescência dos raios das nadadeiras de jundiá
depois de uma semana do banho de imersão em Alizarina Vermelha, (A)
banho longo (18 horas), (B) banho em concentrações de 90 mg/L precedido
pelo choque osmótico em banho curto (10 minutos ) e banho longo (18
horas), (C) banho curto (10 min). Letras iguais correspondem médias iguais (P>0,05).
34
Figura 4: Intensidade de fluorescência após três meses da aplicação do
banho de imersão em Alizarina Vermelha. Banhos com duração de 18 horas
nas concentrações de 30mg/L (a), 60mg/L (b) e 90mg/L (c), ou submetidos
aos banhos com duração de 18 horas precedidos pelo choque osmótico de
10 minutos nas concentrações de 30mg/L (d), 60mg/L (e) e 90mg/L (f). Banhos com duração de 10 minutos e precedidos pelo choque osmótico de
10 minutos nas concentrações de 300mg/L (g), 700mg/L (h) e 90mg/L (i).
35
Figura 5: Intensidade de Fluorescência dos raios das nadadeiras de jundiá
depois de três meses da aplicação do banho de imersão em Alizarina
Vermelha, (A) banho longo (18 horas), (B) banho em concentrações de 90
mg/L precedido pelo choque osmótico em banho curto (10 minutos ) e
banho longo (18 horas), (C) banho curto (10 min). Letras iguais correspondem médias iguais (P>0,05).
36
DISCUSSÃO
Diversos estudos foram realizados para avaliar marcadores
químicos em peixes, em sua maioria foi analisada a marcação química
produzida em otólitos e escamas, sendo que o primeiro caso um método
destrutivo que exige o sacrifício do peixe, além de necessitar de um
tempo adicional para o preparo dos otólitos para a observação em
lâminas, fatores que dificultam sua utilização e impedem a reavaliação
contínua destas marcas. A utilização das escamas para análise da
marcação fica excluída dos peixes de couro, como o jundiá, devido à
ausência dessas estruturas nos Siluriformes. Stewart & Long (2011) ao
avaliarem marcação química com Oxitetraciclina em Ictalurus punctatus nos otólitos e espinhos peitorais, observaram erosão nos anéis dos
espinhos peitorais, relatando a difícil visualização das marcas, fator que
impediu uma reavaliação adequada. Campanella et al. (2013) ao avaliar
marcação química em Odontesthes bonariensis, nos otólitos, escamas e
nadadeira caudal, verificaram que após 1 ano do banho de imersão
apenas as marcas da nadadeira caudal continuavam visíveis. O presente
estudo avaliou a marcação química nos raios da nadadeira caudal dos
peixes, sendo coletadas sem a necessidade do sacrifício dos indivíduos.
Na avaliação das marcas feita após uma semana do banho de imersão,
foi observado que as marcas localizaram-se nas extremidades dos raios
da nadadeira caudal. Na avaliação feita depois de três meses da
marcação, essas marcas estavam localizadas mais distante da
extremidade dos raios, evidenciando que o crescimento dos raios
ocorrido ao longo dos três meses não impediu a visualização das
marcas.
Os resultados deste trabalho mostram a eficácia da Alizarina
Vermelha para marcação química em banhos de imersão, semelhante ao
observado por Eckmann (2003), Crock et al (2007), Liu et al. (2009) e
Campanella et al. (2013), que obtiveram sucesso na marcação química
de peixes com Alizarina Vermelha. Apesar das variações observadas na
intensidade das marcas, essa marcação dos raios da nadadeira caudal do
jundiá foi confirmada em todos os tratamentos, tanto na análise feita
depois de uma semana quanto aquela realizada depois de três meses da
aplicação do banho de imersão. Esses resultados mostram que a
Alizarina Vermelha pode ser usada para a marcação química do jundiá
em banhos de imersão, confirmando o seu potencial de uso na pesquisa
biológica e na avaliação de programas de estocagem, atendendo aos
37
requisitos preconizados por alguns autores (Liu et al., 2009, Crook et al., 2007, Campanella et al., 2013).
A indução osmótica realizada antes do banho de imersão no
marcador químico Alizarina Vermelha resultou em uma maior
intensidade nas marcações observadas neste trabalho. Resultados
semelhantes foram observados por Mohler (2003) que utilizou Calceína
como marcador para Salmão do Atlântico, e Campanella et al. (2013)
que aplicaram a Alizarina Vermelha para marcação de Odontesthes
bonariensis. Ao expor os peixes a uma solução contendo uma alta
salinidade, é criada uma condição em que o ambiente externo fica
hiperosmótico em relação aos fluidos corporais do peixe, induzindo a
perda de água pelos peixes promovida pelo diferencial osmótico (Conte,
1969), assim quando os peixes são posteriormente transferidos para a
solução de marcação, a situação se inverte e os fluidos corporais dos
peixes passam a ser hiperosmóticos em relação ao meio. Essa diferença
osmótica resulta em uma absorção rápida da solução de marcação que
passa por osmose através da pele e brânquias, diminuindo assim o
tempo do banho de imersão necessário para a absorção de uma mesma
quantia do marcador. O tempo de duração do banho e a concentração de
sais utilizada no choque osmótico variam de acordo com a tolerância de
cada espécie utilizada. Neste estudo foram realizados testes preliminares
até uma concentração de 30g/L (30ppt) com banho de 10 minutos,
quando foi verificado que os peixes apresentaram perda de equilíbrio e
natação errática, sendo que poucos minutos depois que retornaram a
água doce apresentaram sinais de completa recuperação. No decorrer do
choque osmótico nenhuma mortalidade foi constatada. Procedimento
semelhante para a definição do choque osmótico foi adotado por Negus
& Tureson (2004) para trabalho com Oncorhynchus mykiss, utilizando
banhos de 3,5 minutos com 50ppt de salinidade, e por Campanella et al. (2013) para marcação de Odontesthes bonariensis, que usaram banhos
de 10 minutos numa solução salina a 22ppt.
Na reavaliação das marcas realizada após três meses do banho
imersão no marcador químico foi possível notar que todos os
tratamentos mantinham marcas visíveis, tendo os melhores resultados de
intensidade de marcação registrados nos tratamentos submetidos ao
choque osmótico. Resultados semelhantes foram observados por Crock
et al. (2007) para Macquaria ambígua após 100 dias do banho de
imersão, por Mohler (2003) para Salmo salar após 120 dias do banho de
imersão e por Campanella et al. (2013) depois de 1 ano do banho de
imersão para Odontesthes bonariensis.
38
A partir desta pesquisa vemos o potencial da Alizarina Vermelha
como marcador químico em banhos de imersão para Rhamdia quelen
associados ou não a técnica da indução osmótica, porém, há a
necessidade de se avaliar a qualidade dessas marcas nos peixes expostos
à luz solar. Como relatado por Bashey (2004) para Poecilia reticulata
marcadas com Alizarina Vermelha, quando os peixes foram expostos à
luz solar houve fotodegradação das marcas e uma redução da qualidade
das marcas, dificultando sua observação. Embora o presente estudo
confirmasse que as marcas eram claramente visíveis após três meses do
tratamento, com os peixes mantidos sob iluminação artificial nos
tanques, é prescrito um estudo mais aprofundado em longo prazo para
avaliar a estabilidade das marcas por um tempo maior e em animais
exposta às condições de campo.
A marcação de peixes por imersão envolve um compromisso
entre custo, concentração, período de imersão, salinidade, mortalidade
causada pelo tratamento e retenção da marca ao longo do tempo, como
critério para definir melhor procedimento de marcação (Taylor et al.,
2005). Como relatado por Crock et al. (2007), a técnica de marcação
química com Alizarina Vermelha pode reduzir o trabalho necessário
para marcar grandes lotes de peixes, além disso, a indução osmótica
pode reduzir o tempo necessário para a exposição do peixe ao marcador
químico e a concentração da Alizarina Vermelha exigida nos banhos de
imersão. O efeito do choque osmótico foi claramente evidenciado neste
estudo com Rhamdia quelen. A recomendação dos procedimentos de
marcação química do jundiá com Alizarina Vermelha podem seguir
duas estratégias: 1) quando há tempo para manter os peixes sobre o
banho de imersão, uma menor concentração do marcador é exigida,
sendo recomendados banhos de imersão com duração de 18 horas numa
solução de 90mg/L de Alizarina Vermelha, precedido pela indução
osmótica que consiste na imersão por 10 minutos em solução salina a
30ppt. 2) quando é escolhido um menor tempo de exposição dos peixes
ao banho de marcação, situação comumente encontrada em trabalhos
realizados à campo, é necessária uma maior concentração do marcador
no banho de imersão, sendo proposto banhos de imersão por 10 minutos
numa solução contendo 300mg/L de Alizarina Vermelha, igualmente
precedido pelo choque osmótico de10 minutos em solução salina a
30ppt.
39
CONCLUSÃO
A Alizarina Vermelha é marcador químico eficaz quando
utilizada em banhos de imersão para jundiá Rhamdia quelen. Essa
marcação química dos raios das nadadeiras se manteve visível mesmo
depois de três meses da aplicação do banho de imersão. O estudo
mostrou que o choque osmótico que precede o banho de imersão
proporciona melhores resultados na intensidade das marcas químicas e
permite reduzir o tempo de duração do banho de imersão. Esta técnica
mostrou-se eficaz para obtenção de marcas químicas com um baixo
custo e eficiente para proporcionar a marcação de grandes lotes de
peixes.
A partir desta pesquisa são recomendados dois métodos que
podem ser utilizados para a marcação química com Alizarina Vermelha
em jundiás submetidos a banhos de imersão, de acordo com a
disponibilidade de tempo para a realização do banho de imersão e da
quantidade do marcador químico a ser consumida: a) em banhos de
imersão de 18 horas em concentração de 90mg/L; b) em banhos de 10
minutos em concentrações de 300mg/L. Em ambos os casos, a marcação
deve ser precedida pelo choque osmótico, quando os peixes são
mantidos por 10 minutos numa solução salina a 30ppt.
40
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