Orientador: Dr. Thiago Lívio Pessoa Oliveira de Souza

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE AGRONOMIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

MAPEAMENTO DE LOCOS DE RESISTÊNCIA AO CRESTAMENTO BACTERIANO COMUM DO

FEIJOEIRO (Phaseolus vulgaris L.)

ANA LAURA PEREIRA PASSOS

Maio – 2016

Goiânia - GO Brasil

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ANA LAURA PEREIRA PASSOS

MAPEAMENTO DE LOCOS DE RESISTÊNCIA AO CRESTAMENTO

BACTERIANO COMUM DO FEIJOEIRO (Phaseolus vulgaris L.)

Goiânia, GO - Brasil

2016

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Genética e Melhoramento de

Plantas, da Universidade Federal de Goiás, como

requisito parcial da obtenção do título de Mestre

em Genética e Melhoramento de Plantas.

Orientador:

Prof. Dr. Thiago Lívio Pessoa Oliveira de

Souza

Coorientadora

Profa. Dra. Patrícia Guimarães Santos Melo

Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através doPrograma de Geração Automática do Sistema de Bibliotecas da UFG.

CDU 633

Pereira Passos, Ana Laura Mapeamento de locos de resistência ao crestamento bacterianocomum do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) [manuscrito] / Ana LauraPereira Passos. - 2016. 78 f.: il.

Orientador: Prof. Dr. Thiago Lívio Pessoa Oliveira de Souza; coorientadora Dra. Patrícia Guimarães Santos Melo . Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Goiás, Escolade Agronomia (EA), Programa de Pós-Graduação em Genética &Melhoramentos de Plantas , Goiânia, 2016. Bibliografia. Apêndice.

1. mapeamento genético. 2. marcadores moleculares. 3.Xanthomonas axonopodis. 4. linhagens endogâmicas recombinantes.5. marcadores SNP. I. Pessoa Oliveira de Souza, Thiago Lívio, orient.II. Título.

"Muitos querem ter sorte, poucos são aqueles que decidem buscá-la."

Álex Rovira Celma e Fernando Triás de Bes.

"Os tesouros do coração são conquistados, não nos chegam através dos

genes."

Augusto Cury

AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a Deus pelo dom da vida, pelas oportunidades

maravilhosas que sempre me concedeu. A minha família, minha mãe que sempre me

apoiou e que passou seus dias e noites me ensinando a fazer as tarefas de casa com muita

paciência. Ao meu pai que sempre fez questão de oferecer tudo de melhor que podia e se

esforçava todos os dias além do trabalho para ser presente dar amor e carinho para mim e

minhas irmãs. As minhas irmãs com quem partilhei toda minha infância e juventude. A

minha tia e madrinha Andréa que me recebeu em sua casa quando estudei desde o ensino

médioe novamente quando tomei a decisão de fazer mestrado, por todo o carinho e atenção

dispensados a mim, pelo acolhimento e por cuidar, como mãe, de mim e de minhas irmãs.

Aos meus avós maternos por me ensinar a grandeza e o valor do estudo, por me incentivar

e me apoiar a buscar meu sonho independente do caminho que eu escolher trilhar. Aos

meus avós paternos por me ensinar a grandeza e o valor da família, por todo o carinho de

"casa de vó"que me ofereceram sempre. Gostaria também de agradecer ao meu namorado

Danilo pela paciência, pelo apoio, pelo companheirismo, pela amizade, e amor dispensados

a mim ao longo desses dois anos, e a sua família, que sempre me acolheu muito bem.

Agradeço também a todos os funcionários da Embrapa Arroz e Feijão que

colaboraram para o desenvolvimento deste trabalho, especialmente aos funcionários da

Biblioteca e aos funcionários do Apoio do Melhoramento. Aos amigos do Laboratório de

Fitopatologia e do Laboratório de Biotecnologia. De forma muito especial à Paula Ariele e

à Lorenna Lopes pela grande contribuição prestada para realização deste trabalho. Aos

meus colegas do mestrado com quem partilhei meus dias na Universidade Federal de

Goiás.

Agradeço ainda a todos os professores que contribuíram com a minha

formação nesses dois anos de curso, especial a Profa. Dr. Patrícia Melo, Prof. Dr.

Alexandre Coelho, que contribuíram de forma especial para realização deste trabalho. Ao

meu orientador Dr. Thiago Lívio Pessoa Oliveira de Souza, por me confiar à execução

deste projeto, pela paciência em ensinar, por me ajudar a crescer e desenvolver como

pessoa e profissional. À Embrapa Arroz e Feijão, àUniversidade Federal de Goiás, a Capes

e todas as instituições que colaboram para execução deste projeto.

Muito Obrigada!

SUMÁRIO

RESUMO ......................................................................................................................... 7

ABSTRACT ..................................................................................................................... 8

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 9

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................... 12

2.1 HISTÓRICO E IMPORTÂNCIA SOCIAL E ECONÔMICA DO FEIJOEIRO-

COMUM ......................................................................................................................... 12

2.2 CRESTAMENTO BACTERIANO COMUM ....................................................... 14

2.2.1 Agente causal e etiologia ..................................................................................... 15

2.2.2 Sintomas do CBC ................................................................................................ 16

2.2.3 Medidas de controle ............................................................................................ 17

2.2.4 Herança da resistência........................................................................................ 18

2.3 GENOMA DO FEIJOEIRO-COMUM ................................................................. 20

2.4 MAPEAMENTO GENÉTICO .............................................................................. 21

2.4.1 Marcadores moleculares .................................................................................... 22

2.4.2 Mapas de ligação................................................................................................. 23

2.5 QTLS LIGADOS À RESISTÊNCIA AO CRESTAMENTO BACTERIANO

COMUM ......................................................................................................................... 25

3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................ 27

3.1 MATERIAL GENÉTICO ..................................................................................... 27

3.2 ENSAIOS EM CAMPO ....................................................................................... 28

3.3 ENSAIO EM CASA DE VEGETAÇÃO .............................................................. 28

3.4 EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPAGEM DOS MARCADORES SNP ............ 30

3.5 ANÁLISES ESTATÍSTICAS DOS DADOS FENOTÍPICOS .............................. 31

3.6 ANÁLISE DE LIGAÇÃO E MAPEAMENTO GENÉTICO................................. 31

3.7 ANÁLISE DE QTL .............................................................................................. 32

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................ 33

4.1 SELEÇÃO DE MARCADORES PARA O MAPEAMENTO ............................... 33

4.2 MAPEAMENTO GENÉTICO E SELEÇÃO DE MARCADORES PARA A

ANÁLISE DE QTL ......................................................................................................... 34

4.3 ANÁLISES ESTATÍSTICAS DOS DADOS FENOTÍPICOS .............................. 39

4.4 ANÁLISEDE QTL PARA RESISTÊNCIA AO CRESTAMENTO BACTERIANO

COMUM ......................................................................................................................... 42

5 CONCLUSÕES ................................................................................................. 51

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................... 52

7

RESUMO

PASSOS, A. L. P. Mapeamento de locos de resistência ao crestamento bacteriano comum do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.). 81p. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas) - Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2016. ¹

O feijoeiro-comum (Phaseolus vulgaris) é cultivado no Brasil em vários locais e diversas condições edafoclimáticas. As doenças estão entre as principais causas de prejuízos na produtividade dessa leguminosa, sendo o crestamento bacteriano comum (CBC) a principal bacteriose que afeta essa cultura. A resistência ao CBC no feijoeiro-comum é uma característica complexa, quantitativa, que resulta da interação de vários genes. Os mapas genéticos são ferramentas que otimizam a busca de locos associados a esse tipo de característica, e os marcadores moleculares mais utilizados disponíveis para esse tipo de estudo são os SNPs (Single Nucleotide Polymorphism). Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivos: (i) construir um mapa genético robusto para o feijoeiro-comum, utilizando marcadores SNP e a população de RILs (Recombinant Inbreed Lines, ou linhagens endogâmicas recombinantes) derivada do cruzamento Rudá × AND 277; (ii) caracterizar esta população de RILs e seus genitores quanto à reação ao crestamento bacteriano comum, em campo e em casa de vegetação; e (iii) identificar regiões genômicas (genes de efeito principal e/ou QTLs) que controlam a reação ao crestamento bacteriano comum nesta população. Foram utilizados 393 indivíduos da população de RILs Rudá × AND 277, avaliados quanto à reação ao CBC em dois ensaios de campo em Ponta Grossa – PR, nas águas de 2012 e 2014, e em um ensaio de inoculação em casa de vegetação, em Santo Antônio de Goiás - GO. A população foi genotipada com 5.398 marcadores SNP e o mapeamento das RILs foi realizado utilizando os programas R-OneMap e MapDisto. As análises estatísticas foram realizadas no programa Genes, sendo o agrupamento de médias de Scott-knott realizado na plataforma R. A análise de QTL foi realizada no programa QTLCartographer. Por meio do teste de qui-quadrado (1:1) foram selecionados 2.062 marcadores para o mapeamento. Foram construídos três mapas genéticos com elevada robustez, saturação e resolução. As análises estatísticas evidenciaram que há variabilidade genética para a característica de resistência ao CBC na população de RILs. A análise de QTL identificou 10 QTLs ligados à resistência ao CBC na população de RILs Rudá × AND 277 nos cromossomos Pv01, Pv02, Pv07, Pv09 e PV11 com base em dados obtidos a partir de avaliações em campo e casa de vegetação. Os mapas contruídos para essa população apresentam elevada robustez e resolução e poderão ser utilizados para futuros trabalhos de mapeamento integrativo. As análises estatísticas evidenciaram o caráter quantitativo da resistência ao CBC em feijoeiro-comum e mostraram que o genitor Rudá possui alelos de resistência ao CBC. Espera-se que os marcadores ligados a esses QTLs identificados possam ser utilizados em futuros trabalhos de seleção assistida por marcadores.

Palavras-chave: Mapeamento genético, marcadores moleculares, Xanthomonas axonopodis, linhagens endogâmicas recombinantes, marcadores SNP, feijoeiro-comum.

¹ Orientador: Dr. Thiago Lívio Pessoa Oliveira de Souza

8

ABSTRACT

PASSOS, A. L. P. Genetic mapping of common bacterial blight resistance loci in common bean (Phaseolus vulgaris L.). 81p. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas) - Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2016.² The common bean (Phaseolus vulgaris) is grown in Brazil in various locations, soil and climatic conditions. The diseases are among the leading causes of losses in productivity of this legume, and the common bacterial blight (CBB) is the most important bacterioses that affects the culture. The resistance of CBB in common bean is a complex quantitative trait that results from the interaction of several genes. Genetic maps are tools that optimize the search for loci associated with this type of feature, and the most commonly used molecular markers available for this type of study are the SNPs (Single Nucleotide Polymorphism). In this sense, this study aimed to: (i) develop a robust genetic map for common bean using SNP markers and the RIL (Recombinant Inbreed Lines) mapping population derived from Ruda × AND 277; (ii) characterize this RIL population and their parents about the reaction to common bacterial blight in field and greenhouse; and (iii) identifying genomic regions (major genes and/or QTL) that control the bacterial blight in this population. We used 393 individuals of the Ruda × AND 277 RIL population, evaluated for reaction to CBB in two field trials in Ponta Grossa - PR, in the rain growing season of 2012 and 2014 and in an inoculation test at the greenhouse, in Santo Antônio de Goiás - GO. The population was genotyped with 5,398 SNP markers and mapping was performed using the R-OneMap and MapDisto programs. Statistical analyzes were performed in the Genes program, and the Scott-Knott method was used for averages groupingin R platform. The QTL analysis was conducted in QTLCartographer program. Using the chi-square test (1:1), 2,062 markers were selected for mapping. Three genetic maps with high strengt, saturation and resolution were built. Statistical analysis showed that there is genetic variability for the CBB resistance in the population of RILs. The QTL analysis identified 10 QTLs linked to resistance of CBB in the Ruda × AND 277 RIL mapping population, in the chromosomes PV01, PV02, Pv07, Pv09 and PV11, based on results from evaluations carried out in the field and greenhouse. The maps constructed for this population have high strength and resolution and may be used for future work on integrative mapping. The statistical analysis evidenced the quantitative character of resistance to CBB in common bean and showed that the parent Rudá has the CBB resistance alleles. It is expected that the markers linked to these QTLs identified can be used in future studies of marker assisted selection. Keywords: genetic mapping, molecular markers, Xanthomonas axonopodis, recombinant inbred lines, SNP markers, common bean.

² Adviser: Dr. Thiago Lívio Pessoa Oliveira de Souza

1 INTRODUÇÃO

O feijoeiro-comum (Phaseolus vulgaris L.) é cultivado em todo o mundo,

sendo que o Brasil ocupa posição de destaque por ser um dos principais produtores dessa

leguminosa e um dos maiores consumidores (FAO, 2016). Nos países em

desenvolvimento, é fonte de proteína essencial na dieta alimentar de classes sociais

economicamente menos favorecidas. Apresenta diversos tipos de grãos, mas, no Brasil,

70% do feijão consumido são do grupo comercial carioca (Carneiro et al., 2012).

As doenças que acometem o feijoeiro-comum constituem uma das principais

causas de queda nas produtividades observadas (Barros & Souza, 2012), visto que a cultura

é vulnerável a vários fitopatógenos e o clima nos trópicos favorece a incidência e o

desenvolvimento de doenças. Dentre as doenças causadas por bactérias, a mais importante

no Brasil, em virtude dos danos causados, é o crestamento bacteriano comum (CBC),

incitado por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli e Xanthomonas fuscans subsp. fuscans,

que ocorre em todo o país, principalmente em regiões de alta umidade e temperatura

elevada (Rava & Sartorato, 1994; Rava et al., 2003; Almeida, 2014).

Os patógenos causadores do crestamento bacteriano comum são transmitidos

principalmente pela semente infectada e restos culturais (Sartorato & Rava, 1994). As

estratégias utilizadas para controlar a doença são a rotação de cultura, o plantio direto, o

uso de sementes saudáveis, e principalmente, a utilização de cultivares resistentes

(Sartorato & Rava, 1994), sendo que esta última é considerada uma estratégia de grande

importância no manejo integrado.

Algumas características de interesse nos programas de melhoramento são

características de herança complexa governadas por vários genes e denominadas

quantitativas sabe-se que a resistência ao crestamento bacteriano comum no feijoeiro é

uma dessas características. Vários QTLs para resistência ao CBC já foram encontrados e

estudados no feijoeiro-comum (Viteri, 2015). Para tais características, como a resistência

ao CBC há uma maior dificuldade de seleção dos genótipos superiores por métodos

convencionais de melhoramento, baseados exclusivamente no fenótipo. Isso ocorre pelo

10

fato dessas características serem influenciadas pelo ambiente, de baixa herdabilidade,

apresentando fenótipos variados e de difícil avaliação visual.

Uma ferramenta relevante, e que tem contribuído para a seleção desse tipo de

característica, são os marcadores moleculares (Caixeta, 2006). Um marcador molecular é

definido como qualquer fenótipo molecular oriundo de um gene expresso ou de um

segmento específico de DNA (Ferreira & Grattapaglia, 1998). Dentre os marcadores

moleculares mais utilizados atualmente temos os SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms,

ou polimorfismos de um único nucleotídeo). Os SNPs são um exemplo de marcadores com

grande potencial para estudos genéticos, isso porque são as mais frequentes formas de

polimorfismo de um organismo, e estão presentes de modo mais abundante no genoma

(Chagné et al., 2007).

Os marcadores SNP permitem a construção de mapas genéticos de alta

saturação e resolução para a identificação e caracterização de locos de interesse, além de

análises de divergência genética e o estabelecimento de relações filogenéticas (Guimarães,

2009). Contudo, a aplicação de maior impacto para os programas de melhoramento é o

mapeamento genético.

Os mapas genéticos fornecem informações úteis para muitos estudos, tais como

a localização de regiões genômicas que controlam características fenotípicas alvo, estudos

de sintenia e a clonagem de genes (Campos et al., 2011). As informações obtidas com os

mapas genéticos subsidiam o processo de seleção assistida de genes e/ou QTLs (Barbosa-

Neto, 1998), reduzindo o tempo e aumentando a eficiência nas etapas iniciais de seleção

dos programas de melhoramento, como a seleção de plantas individuais em populações

segregantes. Entretanto, a disponibilidade de um mapa genético robusto, suficientemente

saturado e fidedigno depende de vários fatores, como o tipo, número e distribuição dos

marcadores utilizados, tamanho e estrutura genética da população analisada (Cruz, 2008).

Os mapas genéticos são construídos a partir do cálculo da frequência de

recombinação que são utilizados para a construção dos grupos de ligação, para a

construção de um mapa genético com elevada robustez e resolução faz se necessário o uso

de populações com elevado contraste e variabilidade genética, além disso, para o

mapeamento de QTL o tamanho da população mapeada é de grande importância para uma

boa resolução do mapa formado (Ferreira et al., 2006). Pensando em variabilidade

genética, quantidade de indivíduos e manutenção da população as (Recombinant Imbreed

Lines) veem sendo cada vez mais utilizadas e recomendadas para os trabalhos de

11

mapeamento genético. Diversos trabalhos de mapeamento já foram feitos para o feijoeiro-

comum, porém a maioria deles utiliza populações pequenas e pequeno número de

marcadores, fato este que pode comprometer as análises e a fidedignidade dos mapas

construídos (Ferreira et al., 2006).

Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivos: (i) construir um mapa

genético robusto para o feijoeiro-comum, utilizando marcadores SNP e a população de

RILs (Recombinant Inbreed Lines, ou linhagens endogâmicas recombinantes) derivada do

cruzamento Rudá × AND 277; (ii) caracterizar esta população de RILs e seus genitores

quanto à reação ao crestamento bacteriano comum, em campo e em casa de vegetação; e

(iii) identificar regiões genômicas (genes de efeito principal e/ou QTLs) que controlam a

reação ao crestamento bacteriano comum nesta população.

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 HISTÓRICO E IMPORTÂNCIA SOCIAL E ECONÔMICA DO FEIJOEIRO-

COMUM

O feijoeiro-comum (Phaseolus vulgaris L.) é a cultura cujo grão é o mais

consumido de forma direta na alimentação humana, em todo o mundo, principalmente por

ser uma importante fonte de proteínas, vitaminas, minerais e fibras para a população de

menor poder aquisitivo (Broughton et al., 2003). Segundo Carneiro (2002) e Melo (2007),

no Brasil, o feijão-comum é cultivado nas mais variadas condições edafo-climáticas e em

diferentes épocas e sistemas de cultivo. Segundo a Embrapa Arroz e Feijão em 2014 o

feijoeiro-comum foi plantado em 1,9 milhões ha em todo o Brasil, a produção foi de 2,6

milhões de toneladas e a produtividade foi de 1,4 mil kg/ha (Embrapa - Arroz e Feijão,

2015).

O gênero Phaseolus possui 55 espécies, das quais apenas cinco são cultivadas,

Phaseolus vulgaris, P. lunatus (feijão-de-lima), P. coccineis (ayocate), P. acutifolius

(tepari), P.polyanthus (petaco) (Vavilov, 1951). Assim como as demais espécies,

P.vulgaris é diploide (2n=22) e possui onze pares de cromossomos. Populações selvagens

de feijão são encontradas, naturalmente, desde o Norte do México até o Norte da Argentina

(Schmutz et al., 2014), em altitudes entre 500 e 2.000 m, e não são encontradas

naturalmente no Brasil (Debouck, 1986). Vestígios arqueológicos da espécie cultivada

chegam a idades próximas de 10.000 anos (Schmutz et al., 2014).

Trabalhos demonstraram que o feijoeiro-comum utilizado atualmente é

resultado de múltiplos eventos de domesticação dos seus ancestrais em dois centros

primários, América Central e Sul dos Andes, os quais foram isolados reprodutivamente

(Vlasova et al., 2016; Schmutz et al., 2014). Os genes característicos tanto das populações

andinas quanto das mesoamericanas são encontrados tanto em populações selvagens

quanto em populações domesticadas (Schmutz et al., 2014; Vlasova et al., 2016). Estudos

de diversidade genética do feijoeiro-comum demonstram que as populações Andinas e

Mesoamericana de feijão divergiram de um ancestral comum há mais de 100.000 anos

13

(Mamidi et al., 2013). Eventos posteriores à domesticação e a adaptação local resultaram

na diferenciação de características entre os dois pools gênicos.

Sementes oriundas de genótipos Mesoamericanas são, em geral, pequenas, um

exemplo é o feijão tipo carioca. Já o feijão Andino apresenta sementes maiores, como é o

caso dos feijões manteigões, como o tipo Jalo. Schmutz et al. (2014) sequenciaram o

genoma do feijão Andino (genótipo G19833) e Vlasova et al. (2016) sequenciaram o

genoma do feijão Mesoamericano (genótipo BAT 93). Ambos, os estudos comprovaram a

existência dos dois pools gênicos na espécie e ainda demonstraram, com base em análises

de diversidade, que as populações Andinas são derivadas de populações Mesoamericanas,

além disso, populações Mesoamericanas possuem mais diversidade que populações

Andinas. A ampla área de ocorrência de populações selvagens da espécie é um dos fatores

que permitiram o surgimento de diversas raças locais ou variedades crioulas, embora

também seja uma das causas da dificuldade de localização exata dos locais de

domesticação desta cultura (Freitas, 2006).

Apesar do feijoeiro-comum possuir grande variabilidade genética, algumas

características do cultivo dessa leguminosa, como cultivo em diferentes sistemas de

plantio, durante todo o ano, em diferentes regiões, sob diferentes condições climáticas,

cultivo de pequenos agricultores com pouca utilização de sementes e cultivares e pouca ou

nenhuma tecnologia empregada, fazem com que o a cultura seja suscetível ao ataque de

diversos patógenos (Krause et al., 2009). Sabe-se, por exemplo, que o uso de sementes

melhoradas é menor que 20% (ABRASEM, 2016), em estudo Fonseca et al. (2007)

encontraram cerca de 40% apresentavam mistura de até cinco linhagens diferentes, e a

maioria dos produtores não utilizam apenas uma cultivar sendo comum a utilização de pelo

menos dois ou três cultivares diferentes, geralmente devido à utilização de sementes

remanescentes.

O ciclo do feijoeiro-comum possui 65 a 110 dias, caracterizando assim uma

dependência da cultura às condições meteorológicas favoráveis para um perfeito

desenvolvimento da cultura (Lima et al., 2012). No Brasil, é plantado em três épocas

distintas em quase todos os estados, sendo elas: (i) safra das "águas" ou “primeira” safra,

que responde por aproximadamente 42% de toda a produção de feijão no país, sendo

plantada entre os meses de agosto e novembro; (ii) safra da "seca" ou “segunda” safra,

cultivada entre os meses de dezembro e abril, respondendo por cerca de 40% da produção

total de feijão; e (iii) safra de “outono/inverno”, “irrigada” ou “terceira" safra, cultivada

14

com uso de alta tecnologia e irrigação por pivô central, com plantio no período de abril a

junho, sendo responsável por cerca de 20% da produção total no Brasil (Embrapa Arroz e

Feijão, 2015).

2.2 CRESTAMENTO BACTERIANO COMUM

O feijoeiro-comum está sujeito a incidência de diversos patógenos que afetam

significativamente a produção de grãos, ou mesmo a estabilidade desta. Segundo Sartorato

& Rava (1994), os patógenos bacterianos que ocorrem em várias localidades do mundo e

afetam a cultura do feijoeiro-comum são: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Smith

1897) (Vauterin et al., 1995), Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola (Burkholder,

1926) (Gardan et al., 1992), Pseudomonas syringae pv. syringae (Van Hall, 1902),

Pseudomonas syringae pv. tabaci (Wolf & Foster) (Young et al., 1978) e Curtobacterium

flaccum faciens pv. flaccumfaciens (Hedges, 1922) (Collins & Jones, 1983).

Entre essas doenças causadas por bactérias, o crestamento bacteriano comum

(CBC), doença incitada por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli [Smith] e Xanthomonas

fuscans subs. fuscans (Burkholder) Starr & Burkholder, é de grande importância no Brasil

(Rava & Sartorato, 1994).

O CBC se caracteriza pelo surgimento de lesões necróticas em órgãos da parte

aérea da planta (Vauterin et al., 2000). A manifestação da doença em estádios iniciais do

crescimento em conjunto com condições de alta umidade e temperaturas entre 20 a 30º

podem potencializar o ataque e a disseminação do patógeno, provocando perdas de até

45% da produtividade em genótipos suscetíveis (Mahuku et al., 2006). O plantio direto, a

rotação de culturas, o uso de sementes sadias e de cultivares resistentes são a forma de

controle mais eficiente para esta doença (Rava et al., 2003).

O CBC é uma doença transmitida principalmente pela semente infectada e por

restos de cultura onde o patógeno pode ficar viável por até 15 anos (Rava & Sartorato,

1994). O CBC causa grandes perdas econômicas por ser capaz de causar perdas

significativas na produtividade das sementes e na qualidade dos grãos e por ainda exigir

controle anual dos campos de produção (Boersma et al., 2015). O uso de cultivares

resistentes é de suma importância para controle efetivo da doença sendo a melhor

alternativa econômica e ambiental para CBC. Genótipos resistentes a essa doença podem

ser encontrados nos dois pools gênicos Andino e Mesoamericano. Avanços significativos

15

foram feitos para compreender o mecanismo de resistência ao CBC no feijoeiro-comum e

diversos QTLs foram identificados (Singh & Miklas, 2015).

2.2.1 Agente causal e etiologia

O CBC é causado no feijoeiro por duas bactérias, Xanthomonas axonopodis pv.

phaseoli [Smith] (Xap) e Xanthomonas fuscans subs. fuscans (Burkholder) Starr &

Burkholder (Xff) (Almeida et al., 2014). As bactérias Xanthomonas pertencem à família

Pseudomonacea são bastonetes gram-negativos, móveis com um flagelo único. As colônias

de Xanthomonas sp. são amareladas, lisas e viscosas (García-Ochoa, 2000), são bactérias

gram-negativas, com dimensão de 0,4-0,9 x 0,6-2,6 µm apresentando flagelos polar

simples (Abd-Alla et al., 2010). Os membros do gênero Xanthomonas representam um

grupo de patógenos de plantas que infectam diversas culturas economicamente importantes

(Almeida et al., 2014; Souza-Júnior et al., 2015).

Xanthomonas são bactérias patogênicas de plantas encontradas em todo o

mundo. Xanthomonas axonopodis é um grupo de espécies heterogénea, que são

patogénicos em um grande número de plantas de interesse econômico como soja, feijão e

diversas plantas consideradas ervas daninhas (Mhedbi-Hajr et al., 2013). As espécies de

Xanthomonas possuem grande variabilidade genética (Rava et al., 1985; Mhedbi-hajr et al.,

2013), dentro das espécies de Xap e Xff existem diversas raças, Aritua et al. (2015)

sequenciaram o genoma de 26 raças, incluindo Xap e Xff, e identificaram 100 genes em

Xap que aparentemente foram adquiridos de Xff, mostrando que há grande fluxo gênico na

espécie. Mhedbi-Hajr et al. (2013) estudaram 131 raças e 21 patovares distintos de

Xanthomonas sp., incluindo os patovares phaseoli e fuscans, e concluíram que eventos

recentes oriundos de avanços na agricultura como a utilização de tecnologia e a utilização

de monocultura tem trazido maior diversidade e maior poder de virulência à espécie,

devido ao fato de diversas raças compartilharem o mesmo nicho e assim aumentarem o

fluxo gênico entre os indivíduos. Identificaram ainda que eventos de recombinação são três

vezes mais importantes para aumento da diversidade genética da espécie do que processos

de mutação. O estudo de diversidade genética distribuiu os genótipos em seis clusters

distintos, demonstrando que há variabilidade genética nas populações de Xanthomonas

(Mhedbi-Hajr et al., 2013).

16

As espécies do gênero Xanthomonas infectam a planta por meio de estômatos

ou ferimentos, posteriormente elas multiplicam-se nos espaços intercelulares, dentro dos

tecidos mesófilos e parenquimatosos das folhas e frutos causando manchas, as quais, mais

tarde, delimitarão lesões necróticas (Leyns, 1984; Denny, 1995). Algumas plantas

invasoras ou espontâneas também são hospedeiras da bactéria causadora de CBC, tais

como Acalypha aloperoides, Ambrosia artemisifolia, Amaranthussp, A. retroflexus,

Chenopodium album, Cyperus rotundus, Vicia sativa e V. villosa (Rava & Sartorato,

1994). As bactérias agentes causais do CBC são particularmente bem adaptadas para a

sobrevivência epífita, por ser capaz de se agregar em biofilmes que a protegem contra

estresses ambientais.

2.2.2 Sintomas do CBC

O CBC ataca toda a parte aérea, mas os sintomas são observados

principalmente nas folhas e caracterizam-se pela ocorrência de lesões secas e quebradiças

rodeadas por um halo amarelo aparente (Figura 1). Nos caules de plântulas ou plantas

jovens, as lesões são às vezes deprimidas e na forma de manchas aquosas. Posteriormente,

tomam a aparência de riscos vermelhos que se estende ao longo do caule, cuja superfície

frequentemente racha, o exsudato bacteriano pode se acumular na lesão. Nas vagens

surgem pequenas manchas aquosas, que aumentam progressivamente. À medida que as

lesões envelhecem, o tecido afetado perde sua aparência aquosa, tornando-se seco,

deprimido e avermelhado. A infecção ocorre principalmente nos elementos vasculares,

penetrando na semente através do funículo. As sementes podem apodrecer e enrugar, ou

ainda apresentar descoloração na região do hilo (Sartorato & Rava, 1994).

17

Figura 1. Sintoma característico de crestamento bacteriano comum nas folhas de feijoeiro-

comum cultivado em casa de vegetação na Embrapa Arroz e Feijão no ano de 2015.

Diversos fatores estão envolvidos na interação de bactérias fitopatogênicas

com plantas. São exemplos a produção de enzimas extracelulares, mecanismos estruturais

(lignificação), produção de substâncias químicas, produtos de alguns genes da planta e do

patógeno, além de fatores físicos como temperatura, luz e umidade (Barros et al., 2010). A

combinação de todos esses fatores determina tanto o desenvolvimento de sintomas nas

plantas quanto à resistência ou suscetibilidade dessas à doença.

Uma vez que a bactéria esteja presente na semente ou em restos culturais, a

doença é fortemente favorecida por condições de alta temperatura e umidade, por isso há

maior prevalência da doença nos países tropicais onde o feijoeiro-comum é produzido (Shi

et al., 2011). A perda na produtividade depende da intensidade da doença, das condições

ambientais que a cultura está submetida, e da suscetibilidade dos cultivares (Osdaghi,

2010).

2.2.3 Medidas de controle

O CBC é uma doença de difícil controle, em razão do cultivo do feijão ser

realizado em mais de uma época do ano, com aplicação de pouca tecnologia e em cultura

de subsistência, e da baixa eficiência do controle químico (Rava et al., 2003). Devido a sua

ampla distribuição e todo o Brasil, a capacidade de reduzir a produção e as dificuldades no

controle da doença, este é realizado através da adoção de várias medidas em conjunto.

18

Alguns países como os Estados Unidos e o Canadá têm como rotina o exame

sanitário das sementes do feijoeiro com intuito de eliminar possíveis propagações de

doenças de importância econômica para a cultura. No Brasil ainda não há emprego

rotineiro dessas análises de sementes (Bianchini et al., 2005). Outro problema que dificulta

o controle da doença no Brasil é a existência de lavouras que empregam pouca ou

nenhuma tecnologia em sementes, em produtos químicos e em cultivares resistentes, fato

este que acaba facilitando a perpetuação do patógeno (Rava et al., 2003).

Algumas práticas que podem ser adotadas para o controle da doença são a

incorporação de restos culturais, a rotação de culturas, o plantio direto, a eliminação de

pragas hospedeiras, uso de produtos químicos, controle biológico e a utilização de

cultivares resistentes (Costa et al., 2008). Dentre estas medidas, a estratégia que se destaca

por ser segura e vantajosa do ponto de vista econômico e ambiental, é o uso de cultivares

resistentes (Yu et al., 2000). Algumas cultivares com resistência ao CBC disponíveis são a

BRS Ametista, BRS Notável e BRS Pontal, com grãos carioca, BRS Esplendor, BRSMG

Realce e Jalo Precoce, com grãos preto, rajado e jalo, respectivamente (Embrapa Arroz e

Feijão, 2013).

2.2.4 Herança da resistência

As plantas desenvolveram ao longo do tempo mecanismos de defesa que

garantiram a sobrevivência e permanência das mesmas até os dias atuais. Os diversos

mecanismos de defesa baseiam-se em barreiras físicas e defesas químicas repelindo o

parasita, porém uma vez que há o contato com agente causador da doença a planta pode

desenvolver outros tipos de mecanismos, que vão desde mecanismos de tolerância onde a

planta tolera a presença dos sintomas e mecanismos de resistência genética, sendo que este

último é os mais importantes mecanismos de defesa existentes (Do Vale et al., 2001).

A resistência genética pode ser do tipo qualitativo, conferida por um gene de

efeito principal, o qual na maioria dos casos funciona pelo mecanismo de gene-a-gene, ou

seja, para cada gene que confere resistência na planta existe um gene no patógeno que

confere avirulência que resultando em incompatibilidade e a planta não desenvolve a

doença. Outro tipo de resistência existente nas plantas é a chamada quantitativa, nesse tipo

de resistência temos a variação de fenótipos de maneira contínua em uma determinada

população para a mesma doença, ou seja, há o aparecimento de diversos fenótipos de

19

resistência que podem ocorrer em menor grau (apenas uma pequena redução nos sintomas

da doença ou sinais patógeno) ou maior grau (Considerável redução nos sintomas da

doença ou sinais do patógeno). O tipo de resistência quantitativa é conferida por lócus

contendo vários genes, e também pode receber diversas nomenclaturas como resistência

complexa, resistência parcial ou residual e resistência horizontal (Do Vale et al., 2001).

Em geral, a resistência ao CBC é relatada como sendo complexa envolvendo

desde um a vários genes com diferentes graus de expressão e interação (Yu et al., 2004;

Zapata et al., 2011). Embora tenha sido relatado a existência de um gene de efeito principal

Xap-1 (Zapata et al., 2011), estudos recentes demonstraram que este gene na verdade

cosegrega com QTL ligado a SAP6 (Singh & Miklas, 2015).

Kelly et al., (2003) descreveram a existência de 22 QTLs associados à

resistência ao CBC, distribuídos nos onze grupos de ligação do feijoeiro-comum.

Kobayasti et al., (1999) também avaliaram o modo de herança da resistência ao CBC em

feijoeiro-comum utilizando experimentos em casa de vegetação e em campo, por meio de

caracterização de reação foliar dos indivíduos submetidos ao patógeno, e relataram que,

alguns genótipos que foram suscetíveis ou resistentes em campo não apresentaram a

mesma reação em casa de vegetação, demonstrando à grande influencia que o ambiente

exerce sobre essa característica intensificando ainda mais o caráter qualitativo da

resistência à doença.

Estudos sobre a herança da reação ao CBC nas folhas e interior e exterior das

vagens em cruzamentos dialélicos envolvendo seis progenitores foram conduzidos por

Valladares-Sanchez et al. (1983), a reação ao CBC foi quantitativamente herdada em todos

os casos. Ao contrário do que observaram Kobayasti et al. (1999), Valladares-Sanchez et

al. (1983) observaram altas correlações entre as reações de genótipos avaliados em casa de

vegetação e no campo, indicando que testes em casa de vegetação podem predizer o

comportamento de genótipos no campo. Park & Dhanvantari (1987) encontraram uma

distribuição normal para a reação ao CBC em estudos com populações F2 derivadas de

cruzamentos F2 entre o feijoeiro-comum e P.coccineus, indicando herança quantitativa .

Neste sentido, faz-se necessário a utilização de técnicas que aperfeiçoem o

processo de seleção de materiais resistentes que possam ser utilizados no processo de

melhoramento genético para essa característica. Até o momento a seleção assistida por

marcadores tem sido uma excelente ferramenta na otimização do desenvolvimento de

novas variedades nos programas de melhoramento. Uma das ferramentas utilizadas nos

20

processos de seleção assistida são os mapas genéticos que mostram associação do caráter

desejado com determinado gene facilitando o processo de seleção (Alzate-Marin et al.,

2005).

2.3 GENOMA DO FEIJOEIRO-COMUM

O genoma do feijoeiro-comum foi sequênciado por Schmutz et al. (2014),

utilizando o genótipo G19833 do pool gênico Andino. As sequências foram divididas em

11 cromossomos, incluindo 468 Mb de sequências mapeadas em 240 scaffols, sendo

27.197 lócos codificadores de proteínas.

Vlasova et al. (2016) também sequenciaram o genoma do feijoeiro-comum,

porém utilizando o genótipo BAT 93 de origem Mesoamericana. O genoma final obtido

possui 549 Mb de sequencias mapeadas e 81% destas foram ancoradas nos 11

cromossomos do feijoeiro.

Os dois trabalhos ainda evidenciaram a existência dos dois pools gênicos,

Andino e Mesoamericano, sendo que Schmutz et al. (2014), em estudo de diversidade

genética, mostraram que provavelmente o primeiro centro de origem pode ter sido no

México onde a diversidade é maior em linhagens do norte e menor em linhagens do centro

e do sul da América Central, sendo maior que a diversidade encontrada em linhagens da

região Andina.

Foi demonstrado ainda que eventos de domesticação de genótipos

Mesoamericano encontram-se, principalmente, nos cromossomo Pv02, Pv07 e Pv09, sendo

que 33% detes estão no cromossomo Pv09 (Schmutz et al., 2014). Já para genótipos

Andinos, os eventos de domesticação envolvem os cromossomos Pv01, Pv02 e Pv10

(Schmutz et al., 2014). Vlasova et al. (2016) demonstraram que os genótipos BAT 93,

Mesoamericano, e G19833, Andino, foram originados de eventos independentes de

domesticação e comprovaram que o tamanho da semente é um fenótipo que distingue

eventos de domesticação diferentes para os dois pools gênicos, sendo também capaz de

diferenciar genótipos Andinos, que possuem grãos variando de 11,6 a 13,9g, e genótipos

Mesoamericanos, que possuem grãos menores variando de 3,5 a 6,5g.

As informações apresentadas pelos sequênciamento do genoma do feijoeiro-

comum irão auxiliar os programas de melhoramento genético, por gerarem informações

valiosas a respeito da diversidade genética e dos processos de domesticação da espécie.

21

Essas informações poderão, ainda, serem utilizadas para a piramidação de genes, na

escolha de genes canditados como os genes que conferem características como resistência

à doença e que podem ter se perdido nos processo de domesticação e seleção (Schmutz et

al., 2014).

2.4 MAPEAMENTO GENÉTICO

No início do século XX foi elucidada a ligação entre genes localizados nos

cromossomos, possibilitando assim a construção de mapas genéticos. O desequilíbrio de

ligação é decorrente do processo de recombinação homóloga que ocorre entre cromátides

irmãs durante a meiose, em geral de forma randômica ao longo dos cromossomos (Liu,

1998; Carneiro & Vieira, 2002). Os mapas genéticos podem ser elaborados por meio da

relação entre a fração de recombinação e ligação física entre genes (Liu, 1998).

Os mapas genéticos são ferramentas que estão sendo bastante usadas na busca

pelo entendimento de como genes e alelos controlam lócus de características quantitativas,

que são em geral de alto valor econômico e de interesse agronômico. Neste contexto, o

desenvolvimento de mapas genéticos é considerado uma das aplicações de maior impacto

da tecnologia de marcadores moleculares. Os mapas genéticos possibilitam cobertura e

análise completa de genomas, além da localização de regiões genômicas que controlam

caracteres de importância, a quantificação do efeito dessas regiões na característica

estudada e por fim a utilização de toda essa informação nas pesquisas nos programas de

melhoramento genético (Faleiro et al., 2003).

Diversos trabalhos já foram conduzidos a partir do mapeamento genético de

várias populações no feijoeiro-comum, em 2015 Keller et al. desenvolveram um mapa

utilizando a população contendo 180 indivíduos F2 de G5686 × Sprite para identificação de

QTLs de resistência à mancha-angular que resultou em quatro QTLs no cromossomo PV04

do feijoeiro. Blair et al. (2010) desenvolveram um mapa baseado no cruzamento de duas

linhagens mesoamericanas BAT 477 × DOR 364, com uma população de RILS, com uso

de marcadores do tipo AFLP, RAPD e SSR, para estudar genes de resistência a seca no

feijoeiro-comum. Rodrigues et al. (2013) realizou mapeamento com SNPs e SSR para

estudo de QTLs associados a seca, o mapa foi feito utilizando população de RILS com 105

linhagens F8 de proveniente do cruzamento de AND 277 × SEA 5, 40 QTLs foram

identificados para resistência a seca no feijoeiro-comum. Os trabalhos com mapeamento

22

ainda podem ser utilizados para estudo de diversidade genética, integração de mapas e

identificação de marcadores para seleção assistida.

2.4.1 Marcadores moleculares

Um marcador genético tem como função identificar e marcar alelos, cuja

expressão seja ou não manifestada pelo fenótipo de maneira visível. Dessa maneira temos

condições de selecionar o alelo de interesse de forma indireta, por meio da identificação do

marcador (Bered, 1997). O desenvolvimento de marcadores moleculares permite uma

análise mais detalhada do genótipo e dos lócus que governam a expressão de caracteres

quantitativos, possibilitando detecção e mapeamento de regiões genômicas que os

controlam (Edwards et al., 1987).

Várias classes de marcadores moleculares têm sido utilizadas. Inicialmente o

predomínio foi o uso de marcadores co-dominantes RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism, ou polimorfismo de comprimento entre fragmentos de restrição do DNA) e

de marcadores dominantes RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA, ou

polimorfismos de DNA amplificado ao acaso). Posteriormente, alguns marcadores SCAR

(Sequence Characterized Amplified Regions, ou regiões amplificadas caracterizadas por

sequência) foram desenvolvidos a partir de marcadores RAPD ligados a genes de

resistência a doenças. Marcadores microssatélites também foram sendo gradativamente

desenvolvidos e disponibilizados nos últimos anos (Ferreira & Grattapaglia, 1998).

A classe mais atual disponível à comunidade científica é a dos marcadores SNP

(Single Nucleotide Polymorphisms, ou polimorfismos ao nível de um único nucleotídeo).

Milhares destes marcadores já foram desenvolvidos para o feijoeiro-comum (Barros &

Souza, 2012). Alguns desses marcadores já estão e estarão sendo disponibilizados para

acesso e uso em um banco público de dados, o Phaseolus Genes

(http://phaseolusgenes.bioinformatics.ucdavis.edu). No Brasil, um grande volume de

marcadores moleculares também vem sendo desenvolvido para o feijoeiro-comum. O foco

principal de interesse tem sido a resistência a doenças. Esse é o caso das Universidades

Federais de Viçosa e de Lavras, do Instituto Agronômico de Campinas e da Embrapa

Arroz e Feijão (Barros & Souza, 2012).

Os SNPs são a forma mais comum de variação genética em genomas

eucariotos (Zhu et al., 2003). Esses marcadores têm como base as alterações mais

23

elementares da molécula de DNA, ou seja, mutações em base únicas da cadeia de bases

nitrogenadas. As variações mais comuns são as transições (A/G) e (C/T). Menos frequentes

são as trocas de purina por pirimidina. No melhoramento de plantas os marcadores SNP

têm sido utilizados na identificação de QTLs e genes alvo, no estudo de diversidade

genética e na seleção assistida por marcadores. Já foram identificados SNPs para diversas

espécies vegetais, como arroz (Feltus et al., 2004), milho (Wright et al., 2005), soja (Choi

et al., 2007) e feijão (Souza et al., 2012).

Gaitán-Solís et al., (2008) identificaram SNPs em P. vulgaris comparando

sequências de regiões expressas e de regiões não-expressas obtidas no GenBank e no DNA

genômico. Esta avaliação resultou na descoberta de 372 novos SNPs em 41 STSs

(sequence-tagged sites) diferentes. Chavarro & Blair (2010) estudaram a diversidade de

marcadores SNP no feijoeiro-comum, desenvolvendo 84 novos SNPs como opção para

utilização em estudos no feijão. Hyten et al., (2010) encontraram, utilizando representação

reduzida de biblioteca, cerca de 3.487 SNPs contendo 2.795 sequências genômicas

flanqueadoras, Cortés et al., (2011) desenvolveram 94 SNPs e testaram estes marcadores

em 70 genótipos de feijão comum que têm sido utilizados como genitores de populações de

mapeamento e que foram previamente avaliados com marcadores SSRs. 667 SNPs foram

identificados por Souza et al., 2012, em genótipos de feijão andinos e mesoamericano.

Recentemente foi desenvolvido e disponibilizado para a comunidade acadêmica um chip

contendo 5.398 marcadores SNP (BARBean6K_3 IlluminaBeadChip) (Song et al., 2015).

2.4.2 Mapas de ligação

Com o desenvolvimento dos marcadores moleculares foi possível a construção

de mapas genéticos de ligação, os quais permitiram mapear e estimar a magnitude dos

efeitos dos QTLs (Paterson et al., 1988; Paterson et al., 1991). Essa técnica é importante,

principalmente, nos casos em que a característica de interesse é de avaliação difícil e

onerosa (Souza, 2001). Dentre os programas mais utilizados para o mapeamento de QTLs

temos QTLCartographer vs.2.5 – WinQTLCart (Wang et al., 2005) e QGENE 3.05

(Nelson, 1997) R-OneMap (Margarido et al., 2007) e MapDisto (Lourieux, 2012).

O primeiro mapa de ligação para a cultura do feijoeiro-comum foi publicado

por Lamprecht (1961) com utilização de marcadores morfológicos. Outros mapas de

ligação foram posteriormente desenvolvidos para esta cultura (Basset, 1991; Nodari et al.,

24

1993; Freyre et al., 1998; Blair et al., 2003; Grisi et al., 2007; Blair et al., 2010; Campos et

al., 2011; Asfaw & Blair, 2012). Freyre et al., (1998) descreveram o primeiro mapa

consenso para feijão-comum (Core Map), no qual 550 marcadores moleculares do tipo

RFLP e RAPD foram mapeados na população de RILs BAT93 × Jalo EEP558 (BJ).

Contudo, a população BAT93 × Jalo (Nodari et al., 1993) possui atualmente tamanho

reduzido, uma limitação para o seu uso. O tamanho reduzido limita a chance de encontrar

recombinações, sendo assim, a robustez do mapa fica limitada, pelo fato de algumas

regiões não apresentarem saturação. Para tanto, tem se buscado o uso de outras populações

maiores e a integração com novos marcadores moleculares (Yu et al., 2000; Blair et al.,

2003; Blair et al., 2006). Grisi et al. (2007) adicionaram novos marcadores SSRs ao mapa

de referência do feijão, totalizando 199 marcas SSR em 13 grupos de ligação sendo 11

cromossomos e dois grupos fragmentos de regiões que não foram ancoradas em nenhum

grupo de ligação, com 1.358 cM de tamanho total e distância mínima de 7,23 cM entre

marcadores. Estes autores também obtiveram o primeiro mapa de feijão exclusivamente de

microssatélites, com 106 marcas distribuídas em 606,8 cM, totalizando 12 grupos de

ligação sendo que os grupos correspondem parcialmente aos cromossomos e o grupo

quatro foi representado por dois grupos de ligação. Cordoba et al., (2010) realizaram a

integração do mapa físico e genético de feijão-comum, cuja importância está na capacidade

de localizar fisicamente loci que são conhecidos por ser polimórficos.

A principal população de mapeamento utilizada atualmente para o feijoeiro-

comum é formada por linhagens endogâmicas recombinantes (Recombinant Inbred Lines –

RILs) derivadas de cruzamentos entre as variedades BAT 93 (Mesoamericana) e Jalo EEP

558 (Andina) (Nodari et al., 1993). Esta população tem sido mantida pelo grupo de

pesquisa liderado pelo Dr. Paul Gepts (Universidade da Califórnia, Davis, CA, EUA -

http://www.plantsciences.ucdavis.edu/gepts/PVgm.html), e vem sendo usada na tentativa

de se construir um mapa genético integrado para o feijão (Miklas et al., 2006). Várias

outras populações de mapeamento também têm sido desenvolvidas e utilizadas em todo o

mundo, a exemplo das RILs desenvolvidas pelo CIAT (Cali, Colombia) a partir do

cruzamento DOR 346 (Mesoamericana) G19833 (Andina).

O tamanho reduzido é uma séria limitação para o uso destas e outras

populações atualmente disponíveis para mapeamento em feijão. Este fato compromete a

acurácia das estimativas de recombinação e, por consequência, a precisão do mapa

genético como um todo. Para Silva et al., (2007), os tamanhos mínimos populacionais e

25

respectivos níveis de saturação do genoma necessários para o desenvolvimento de mapas

genéticos robustos, considerando o uso de populações de RILs, seriam: 200 linhagens/5.0

cM, 300 linhagens/10.0 cM ou 500 linhagens/20 cM. Diante disso, o grupo de pesquisa do

BIOAGRO/UFV (Viçosa, MG) desenvolveu uma população de RILs composta por cerca

de 500 linhagens, a partir do cruzamento entre Rudá (Mesoamericana) e AND 277

(Andina) (Sanglard et al., 2013).

2.5 QTLS LIGADOS À RESISTÊNCIA AO CRESTAMENTO BACTERIANO

COMUM

Diversos trabalhos já foram realizados na busca por QTLs e genes associados à

resistência ao CBC, na tabela a baixo (Tabela 1) estão descritos alguns dos marcadores que

foram identificados como ligados a QTLs que conferem resistência ao CBC, o grupo de

ligação em que foram mapeados e as fontes de resistência.

Uma das primeiras cultivares registradas como resistente ao CBC foi

Montcalm. A resistência nessa cultivar é resultado do QTL ligado ao marcador SAP6, em

Pv10 (Viteri, 2014). Michaels et al. (2006) foram os primeiros a desenvolver uma cultivar

de feijão branco resistente ao CBC, a OAC Rex, que possui QTLs para resistência ao CBC

ligados aos marcadores Pv-ctt001, Bng71 e Bng21. Osorno et al. (2013) desenvolveram

uma cultivar de feijão vermelho, a Rio Rojo, a partir do cruzamento entre Buster × VAX 3,

essa cultivar carrega um QTL que confere resistência ao CBC, ligado ao marcador SU91.

Dentre os marcadores descritos na Tabela 1, os utilizados atualmente para

seleção assistida e desenvolvimento de cultivares resistentes ao CBC são BC420, SU91 e

SAP 6. O mais utilizado é SU91 que já foi encontrado ligado aos cromossomos Pv05 e

Pv08 (Pedraza et al., 1997; Perry et al., 2013), pois encontra-se fortemente ligado ao QTL

que confere resistência ao CBC. Segundo Singh & Miklas (2015), a maior parte das

cultivares resistentes ao CBC desenvolvidas por métodos convencionais de melhoramento

possuem o alelo SU91. BC420 já é menos utilizado, pois algumas pesquisas demonstram

que esse QTL também está ligado à coloração dos grãos conferindo manchas que o tornam

não comercias, porém pode ser utilizado em feijões que apresentem grãos do tipo branco,

bege, preto ou creme. O marcador SAP6 também é encontrado ligado ao QTL que confere

resistência ao CBC, porém seu uso também deve ser limitado, pois SAP6 foi encontrado

26

em algumas raças Mesoamericanas classificadas como suscetíveis ao CBC (Singh &

Miklas, 2015).

Kelly et al. (2003) realizaram um levantamento completo de estudos sobre

CBC no feijoeiro-comum e, na ocasião verificaram 20 QTLs que já haviam sido

identificados para resistência ao CBC no feijoeiro-comum. Singh & Miklas (2015),

realizaram estudo parecido e mais atual, confirmando a existência dos QTLs anteriormente

apresentados por Kelly et al. (2003) e acrescentando mais dois QTLs à lista, identificados

em Pv05 (SU91) (Perry et al., 2013) e Pv11 (Xa11.4) (Viteri et al., 2015).

Tabela 1. Principais QTLs já identificados como associados a resistência ao crestamento

bacteriano comum do feijoeiro (Phaseolus vulgaris), seus respectivos cromossomos e fontes de resistência.

Marcador Classe Cromossomo Gene/QTL/Loco Fonte de Resistência Referência

A10.1750 RAPD Pv02 CBBBA Belneb-RR-1/A55 Ariyarathne et al. (1999)

F13300/W7300 RAPD Pv02 CBBBH BAC 6/HT 7719 Jung et al.(1996)

AM21500/V18450 RAPD Pv02 CBBPX PC 50/XAN-159 Jung et al. (1997)

BNG21 RFLP Pv03 CBBS95 S95 Seaforth/OAC 95 Tar’an et al.

(2001)

Pv-tttc001 SSR Pv04 CBB1.4 HR67/ OAC95-4 Yu et al.(2000)

SU91 SCAR Pv05 SU91 P. vulgaris x P. acutifolius Perry et al.

(2013)

BC420 SCAR Pv06 BC420 HR67/W1744d Yu et al.(2000)

SU91 SCAR Pv08 SU91 XAN159 Pedraza et al.(1997)

SAP6 SCAR Pv10 SAP6 PRO313-58 Zapata et al.(2011)

SAP6 SCAR Pv10 SAP6 Calima 9/Tamaulipas 9B Duncan et al.

(2011)

BAC6 SCAR Pv10 CBBBH BAC6/HT 7719 Jung et al.(1999)

W10.550 RAPD Pv10 CBBBA Belneb-RR-1/A55 Ariyarathne et al. (1999)

SNP47467 SNP Pv11 Xa11.4 Othello/Vax Viteri et al.(2014)

Bng25a/Bng154 RFLP Pv11 CBBXC XR-235-1-1/Calima Yu et al.(1998)

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 MATERIAL GENÉTICO

Neste trabalho foram utilizados para ensaios de campo 400 indivíduos, sendo

393 RILs (Recombinant Inbreed Lines) na geração F12, dois genitores Rudá e AND 277 e

cinco testemunhas, BRS Estilo, BRSMG Majestoso, BRSMG Madrepéola, Pérola e

BRSMG Uai. A variabilidade genética entre os genitores desta população, bem como sua

reação diferencial a diversos patógenos que acometem a cultura do feijão, também foi

previamente comprovada por meio da análise com marcadores moleculares (Souza et al.,

2012).

O genitor Rudá é uma linhagem com grãos do tipo carioca desenvolvida pelo

CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical) e lançada como cultivar no Brasil em

1995 pela Embrapa Arroz e Feijão. É uma linhagem altamente produtiva, porém é

suscetível a maioria das doenças de importância econômica para o feijoeiro que ocorrem

no Brasil. A linhagem Rudá foi obtida a partir de cruzamentos entre os genitores, Carioca e

Rio Tibagi (Sanglard et al., 2013).

A linhagem genitora AND 277 possui grãos do tipo manteigão, foi também

desenvolvida pelo CIAT a partir do seguinte cruzamento múltiplo: [Cargabello ×

(Pompadour Checa x Linea17)] × (Linea 17 x RedCloud). Este genitor possui os genes

Phg-1 e Co-14, os quais conferem resistência à mancha-angular e à antracnose,

respectivamente (Sanglard et al., 2013). A população de RILs × AND 277 foi desenvolvida

pelo grupo de pesquisa em genética e melhoramento do feijão da Universidade Federal de

Viçosa, usando o método SSD (Single Seed Descent). Os indivíduos F2 oriundos do

cruzamento entre Rudá e AND 277 foram conduzidos até a geração F9 em casa de

vegetação. Posteriormente, plantas individuais foram colhidas e as sementes multiplicadas

em campo. A população conta com um total de 500 linhagens, as quais também estão

sendo mantidas e distribuídas pela Embrapa Arroz e Feijão. Desse total

28

de 500 linhagens, 393 foram utilizadas neste trabalho, as quais foram selecionadas pelo

critério de disponibilidade de sementes para os ensaios de campo e casa de vegetação.

3.2 ENSAIOS EM CAMPO

Os ensaios de campo foram conduzidos em Ponta Grossa-PR em duas épocas,

na safra das águas de 2012, e na safra das águas em 2014. Nas duas épocas foi utilizado

delineamento látice simples, com 400 tratamentos, 393 linhagens, cinco testemunhas, BRS

Estilo, BRSMG Majestoso, BRSMG Madrepéola, Pérola e BRSMG Uai, e os dois

genitores AND 277 e Rudá. A parcela consistia de duas linhas de 3,0 m espaçadas entre si

por0,45m. Os tratos culturais foram realizados conforme recomendado para a cultura.

Contudo, não foi realizado o controle da doença.

Não foi utilizada inoculação artificial para CBC nas áreas de condução dos

ensaios, após aparecimento de sintomas da doença na área foi realizada a avaliação com

base em escala de notas que considera 9 graus de severidade de doença (Melo, 2009) onde

as plantas que recebem nota 1 não possuem manifestação de sintomas da doença e plantas

com notas 9 são plantas mortas.

3.3 ENSAIO EM CASA DE VEGETAÇÃO

Primeiramente foram feitos testes de inóculos para identificar qual raça

ofereceria melhor capacidade de diferenciação entre as linhagens resistentes e suscetíveis,

foram escolhidas então da coleção da Embrapa Arroz e Feijão três raças distintas, de

Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli que são utilizadas costumeiramente nos ensaios de

CBC pelo laboratório de fitopatologia da mesma instituição, sendo elas as Xap 19, Xap 06

e Xap 94, o experimento com teste de inóculo foi conduzido em casa de vegetação no mês

de junho de 2015, foram inoculados sete materiais sendo os dois genitores BRS Estilo,

BRSMG Majestoso, BRSMG Madrepéola, Pérola e BRSMG Uai, o ensaio foi realizado

em DBC (Delineamento em Blocos Casualizados) com duas repetições, sendo as parcelas

constituídas por um vaso com quatro plantas, a avaliação foi feita por meio de escala visual

com notas de 0 a 6 (Rava, 1984), as notas foram atribuídas a parcela, ou seja, foi feito a

29

média das notas de cada uma das plantas contidas no vaso. A raça Xap 19 foi escolhida

para dar continuidade ao experimento por mostrar maior capacidade de diferenciação entre

as reações ao CBC nos genitores e nas testemunhas.

O ensaio em casa de vegetação foi realizado com 393 linhagens, dois genitores

e cinco testemunhas com duas repetições, plantadas em DBC (Delineamento em Blocos

Casualizados), com parcelas constituídas por um vaso contendo quatro plantas.

Posteriormente, foram realizadas quatro etapas do experimento em casa de

vegetação, cada etapa do experimento com duração de aproximadamente um mês,

consistiu do plantio de 98 linhagens e os dois genitores AND 277 e Rudá, inoculação após

dez a quinze dias de plantio e avaliação das plantas após dez dias de inoculadas.

O inóculo foi preparado utilizando isolados de Xap 19 com 48 horas de

crescimento em ágar nutriente a 24°C. O inóculo consistiu de uma suspensão bacteriana

em água destilada estéril, cuja concentração foi ajustada em espectrofotômetro (A445 =

1,0), que corresponde a 108 UFC/mL. Aproximadamente dez a quinze dias após a

semeadura, as plântulas foram inoculadas empregando-se a metodologia de incisão das

folhas primárias (Figura 2) descrita por Rava (1984). A avaliação dos sintomas foi

realizada nove dias após a inoculação, utilizando-se a escala de 0 a 6 graus, descrita por

Rava (1984) (Figura 3), as notas foram atribuídas a cada uma das plantas na parcela e

posteriormente foi feito a média da parcela.

Figura 2. Cortes realizados nas folhas de feijoeiro-comum para inoculação de crestamento

bacteriano comum.

30

Figura 3. Sintomas de crestamento bacteriano comum apresentado por plantas de feijoeiro-comum

aos dez dias após a inoculação, as quais ilustram cada um dos seis graus de reação a doença da escala de avaliação proposta por Rava (1984).

3.4 EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPAGEM DOS MARCADORES SNP

Das 393 RILs 376 foram genotipadas, isso porque as amostras foram

processadas em quatro placas de 96 amostras sendo que os genitores foram sempre

incluídos em cada placa. Para a extração de DNA, foram utilizadas amostras compostas

pelo tecido foliar de 10 plantas coletadas em bulk a partir de cada linhagem, ou seja, foram

amostradas 10 folhas por genótipo. Foi utilizado o kit comercial Invisorb® Spin Plant Mini

Kit, seguindo as orientações do fabricante. A genotipagem dos marcadores SNP foi

realizada no Soybean Genomics and Improvement Laboratory, USDA-ARS/BARC-W

(Beltsville, MD, EUA), utilizando o BARBean6K_3 Illumina Bead Chip, constituído por

5.398 SNPs, utilizando a plataforma de genotipagem Illumina Infinium HD Assay Ultra®,

conforme descrito por Song et al. (2015). Todas as 376 RILs e os genitores foram então

genotipados no software Genome Studio 2011.1 (Illumina, EUA).

Visando obter informações prévias acerca de qual grupo de ligação ou

cromossomo cada marcador SNP está fisicamente posicionado, as sequências contendo

SNPs informativos, ou seja, que foram polimórficos e que apresentaram definição clara do

cluster ao qual pertencia, além de serem significativos no teste do qui-quadrado, foram

alinhadas com o genoma de referência do feijão (genótipo G19833), disponível no

31

Phytozome (http://www.phytozome.net/commonbean.php) (Schmutz et al., 2014),

utilizando a ferramenta BlastN do CLC Genomics Workbench version 5.5.

3.5 ANÁLISES ESTATÍSTICAS DOS DADOS FENOTÍPICOS

Nas análises dos dados fenotípicos de reação ao CBC, como pressuposto da

análise de variância, foi realizado o teste de normalidade de Shapiro-Wilk utilizando para

tal a plataforma R (Ihaka & Gentleman, 1996). As análises de variância individuais e

conjunta foram feitas com auxílio do programa Genes (Cruz, 2008). Foi feito ainda teste de

agrupamento de médias pelo método de Scott-Knott (Scott-Knott, 1974), utilizando a

plataforma R.

3.6 ANÁLISE DE LIGAÇÃO E MAPEAMENTO GENÉTICO

Inicialmente, para a seleção dos marcadores visando ao mapeamento genético,

foi realizado teste de qui-quadrado com o auxílio do programa MapDisto (Lorieux,

2012).A hipótese testada foi a segregação de 1:1, conforme se espera para uma população

de RILs. Com isso, objetivou-se eliminar marcadores com distorção de segregação.

O cálculo da frequência de recombinação e das distâncias genéticas entre os

marcadores SNP, bem como a determinação do posicionamento destes, foi realizado com o

auxílio dos programas R-OneMap (Margarido et al., 2007) e MapDisto (Lourieux, 2012).

Com isso, foram selecionados os marcadores para serem utilizados nas análises de QTL.

O ordenamento no MapDisto foi realizado por meio dos comandos

“Ordersequence”, “Rippleorder” e “Checkinversions”. No caso de um grande número de

marcadores, como alternativa, também foram usados os comandos "AutoRipple" e "Auto

CheckInversions". Além disso, o comando “Boostraporder” foi utilizado adicionalmente

para confirmar a melhor ordem dos marcadores, representando boa alternativa para

confirmar a robustez do mapa gerado. O comando “Droplocus” foi utilizado para encontrar

locos posicionados erroneamente ou que possivelmente representavam erros ocorridos na

leitura de dados.No software MapDisto, o mapa genético foi construído adotando valor de

LOD igual a 3,0e frequência de recombinação r=0,30.A conversão da frequência de

recombinação para centiMorgans (cM) foi realizada utilizando a distância de mapeamento

32

de Kosambi (Kosambi, 1944). Os grupos de ligação foram desenhados utilizando o

comando “Draw a Sequence”.

Para construção do mapa genético utilizando o software R-OneMap

(Margarido et al., 2007), foi adotado também um valor de LOD mínimo igual a 3,0 e

frequência de recombinação de r=0,3. A conversão da freqüência de recombinação para

centiMorgans (cM) foi realizada também pela distância de mapeamento de Kosambi

(Kosambi, 1944).Os marcadores foram separados em grupos de ligação ou cromossomos e

mapeados separadamente. Primeiramente foram ancorados dois marcadores em cada grupo

de ligação, utilizando o comando "rf.2pts", ou seja, foi feito o cálculo das distâncias

(frações de recombinação) para todos os pares de locos, com a finalidade de construir os

grupos de ligação desses marcadores.

Após identificar a melhor ordenação, utilizou-se o comando “ripple.seq”, para

verificar o ordenamento. Cada grupo de ligação foi desenhado utilizando o comando

"draw.map". No total foram desenhados onze grupos de ligação de P. vulgaris, como

esperado para a espécie P. vulgaris que possui 11 cromossomos.

3.7 ANÁLISE DE QTL

Para a análise de QTLs foi utilizado o programa QTL Cartographer (Basten et

al., 1999), método de mapeamento por intervalo composto, o qual faz uso da razão de

verossimilhança para se considerar um QTL, para a análise foi utilizada razão 11,5 (By

manual imput). Utilizaram-se os dados de cada um dos onze grupos ligação

separadamente, e os dados de reação ao CBC em três ambientes distintos, sendo eles: (i)

safra das águas de 2012 Ponta Grossa, PR e (ii) águas de 2014, em Ponta Grossa, PR, e (iii)

reação ao CBC em casa de vegetação, na Embrapa Arroz e Feijão, em 2015, Santo Antônio

de Goiás, GO. Para as análises de QTL, em todos os casos, foram utilizadas as médias

ajustadas obtidas a partir da análise de variância.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 SELEÇÃO DE MARCADORES PARA O MAPEAMENTO

Dos 5.398 SNPs testados, 3.288 SNPs (60,91%) apresentaram produtos de

amplificação realmente evidentes e robustos para o conjunto de amostras avaliadas e, por

isso, foram selecionados para a análise de ligação. Entre os outros 2.110 SNPs (39,09%)

não selecionados, 2.034 SNPs foram monomórficos para todas as amostras, apresentando

um único cluster, e 76 SNPs não apresentaram amplificação.

Do total de 3.288 SNPs selecionados, 3.263 SNPs (99,24%) foram genotipados

com elevada eficiência, amplificando mais de 90% dos genótipos avaliados. Estes

marcadores foram então alinhados com sucesso contra o genoma de referência do feijão

(genótipo G19833) (Schmutz et al. 2014). Assim foram definidos previamente os

cromossomos em que cada marcador estaria ligado. Como esperado, 11 grupos foram

formados (LOD = 3.0, r = 0.3). Após alinhamento das sequências dos marcadadores no

BLAST, foram eliminados 74 marcadores que se encontravam em scaffolds ou não ligados

a nenhum dos 11 cromossomos. A segregação destes 3.189 marcadores SNP resultantes foi

aferida pelo teste do Qui-quadrado (χ2), usando como critério a frequência esperada para

uma população de RILs (1AA:1aa).

Um total de 2.062 SNPs (38,2%) foram selecionados para serem mapeados, por

apresentarem segregação conforme o esperado. Foi realizada ainda uma análise de

distorção para identificar qual a porcentagem de distorção dos marcadores em cada

cromossomo e para cada um dos genitores, Rudá e AND 277 (Tabela 2). Nessa análise foi

identificado que a maior parte de SNPs estavam distorcendo para o genitor Rudá.

34

Tabela 2. Distorção percentual dos marcadores genotipados com elevada eficiência (3189 SNPs) em cada cromossomo do feijoeiro e para cada genitor da população de RILs Rudá × AND 277.

Grupo de Ligação Nº de SNP Nº de SNPs Distorcidos % de distorcidos Pv01 327 47 14.37% Pv02 324 139 42.90% Pv03 212 23 10.85% Pv04 367 137 37.33% Pv05 356 21 5.90% Pv06 172 52 30.23% Pv07 250 13 5.20% Pv08 245 78 31.84% Pv09 277 163 58.84% Pv10 283 255 90.11% Pv11 376 220 58.51% Total 3189 1148 36.00% % de distorcidos Rudá 631,4 55,8% % distorcidos AND 277 424,7 37,4%

4.2 MAPEAMENTO GENÉTICO E SELEÇÃO DE MARCADORES PARA A

ANÁLISE DE QTL

Foram utilizados um total de 2.062 marcadores SNP para a construção do mapa

de ligação, selecionados conforme os critérios apresentados no item 4.1. Destes, 2.041

SNPs foram inicialmente separados em 11 grupos distintos pelo programa R-OneMap.

Ao utilizar o comando "safe" do programa R-OneMap para obter o mapa

genético 851 SNPs dos 2.041 SNPs foram mapeados, com distância média entre

marcadores de 86,16 cM. Embora haja grande confiabilidade no ordenamento dos

marcadores mapeados usando o comando "safe", esse mapa mostrou-se restritivo e

limitado em número de marcadores para futuras análises de QTL. A saturação e a

distribuição dos marcadores ao longo dos 11 cromossomos do mapa resultante do comando

"safe" são apresentadas na Tabela 2. O número de marcadores por cromossomo variou de

11 (Pv10) a 132 (Pv05). O tamanho dos grupos variou de 76,44 cM (Pv06) a 732,97 cM

(Pv11). A distância média entre marcadores em cada cromossomo variou de 0,74 cM

(Pv05) a 41,97(Pv10).

Utilizando o comando "force" do OneMap foi construído outro mapa de

ligação. Esse comando do programa gerou um mapa com todos os marcadores, ou seja, as

2.041 marcas foram mapeadas em todos os onze cromossomos. Porém algumas destas

35

marcas possivelmente posicionadas em sccafolds, não agrupadas em nenhum cromossomo,

podem ter sido incluídas em cada cromossomo sem confiabilidade no ordenamento, o que

torna o uso desse mapa não recomendado para análise de QTL pouco recomendada. O

resultado do número de marcadores por cromossomo e o tamanho de cada um dos

cromossomos em cM no mapa gerado pelo comando "force" está descrito na Tabela 3.

Tabela 3. Número e distribuição de marcadores SNP, tamanho de cada cromossomo e distância

média entre os marcadores nos mapas genético do feijoeiro-comum construído utilizando o OneMap a partir do comando "force" e "safe".

Cromossomo

Force

Safe

Nº de SNPs

Mapeados

Tamanho

(cM)

Distância

Média (cM)

Nº de

SNPs

Mapeados

Tamanho

(cM)

Distância

Média (cM)

Pv01 280 169,19 0,60 125 155,10 1,24

Pv02 185 318,58 1,72 78 199,25 2,55

Pv03 189 269,3 1,20 88 431,92 4,90

Pv04 230 421,64 1,83 67 216,48 3,23

Pv05 335 126,42 0,37 132 97,69 0,74

Pv06 120 84,65 0,70 47 76,44 1,62

Pv07 237 452,75 1,91 110 440,41 4,0

Pv08 167 490,19 2,93 70 425,68 6,08

Pv09 114 389,65 3,41 44 465,14 10,56

Pv10 28 611,31 21,83 11 461,73 41,97

Pv11 156 598,83 3,83 79 732,97 9,27

Total 2.041

851

36

Figura 4. Mapa genético dos marcadores por cromossomo evidenciando a saturação dos mapas de

cada um dos onze cromossomos do feijoeiro-comum de acordo com o software OneMap utilizando comando "safe".

O mapa genético obtido pelo programa MapDisto apresentou inicialmente

2.042 marcadores. Contudo, claramente alguns desses marcadores estavam visando a

distribuição dos demais ao longo de cada cromossomo. Após análise visual do mapa

gerado, os marcadores que distorciam o posicionamento dos demais em cada grupo foram

excluídos. Com isso, o mapa final apresentou 1.971 SNPs, com tamanho total de 890,8 cM

e distância média entre marcadores de 11,4 cM. A saturação e a distribuição dos

marcadores ao longo dos 11 cromossomos são apresentadas na Tabela 4. O número de

marcadores por grupo variou de 19 (Pv10) a 337 (Pv05). O tamanho dos cromossomos

variou de 45,4 cM (Pv09) a 102,4 cM (Pv05). A distância média entre marcadores em cada

cromossomo variou de 0,30 cM (Pv05) a 7,0(P10).

37

Tabela 4. Número e distribuição de marcadores SNP nos cromossomos, tamanho e distância média entre marcas no mapa genético do feijoeiro-comum construído usando a população de RILs Rudá × AND 277, com o auxílio do software MapDisto.

Grupo de Ligação Nº de SNPs Tamanho do Grupo (cM) Tamanho médio (cM)

Pv01 280 94,68 0,33

Pv02 170 69,75 0,41

Pv03 182 90,21 0,49

Pv04 227 91,58 0,40

Pv05 337 102,36 0,30

Pv06 118 49,32 0,41

Pv07 233 101,63 0,43

Pv08 166 98,12 0,59

Pv09 92 45,40 0,49

Pv10 19 70,25 7,0

Pv11 147 77,45 0,52

Total 1.971

Figura 5. Desenho dos marcadores por cromossomo evidenciando a saturação dos mapas gerados

no programa MapDisto em cada um dos onze cromossomos do feijoeiro-comum para estes marcadores.

38

Para a escolha do mapa mais adequado, ou seja, do conjunto de marcadores a

ser utilizado para a identificação de QTLs para resistência ao CBC foi realizado um estudo

de comparação dos mapas gerados. Foram utilizados os seguintes critérios: número de

SNPs mapeados, números de SNPs de comum mapeamento, número de SNPs com

ordenamento comum e porcentagem de SNPs com mapeamento comum, os critérios

utilizados estão descritos na Tabela 5. Tabela 5. Comparação dos mapas obtidos com o uso dos programas OneMap, com o comando

"safe", e MapDisto, com base no número de SNPs mapeados, número de SNPs comuns, e número e porcentagem de SNPs com ordenamento comum em cada cromossomo.

MapDisto OneMap

Cromossomo Nº de SNPs Nº de SNPs

nº de SNPs comuns

nº de SNPs de ordenamento

comum

% de SNPs com ordenamento comum

Pv-01 280 125 125 105 84% Pv-02 170 78 77 65 75% Pv-03 182 88 87 79 90% Pv-04 227 67 66 62 95% Pv-05 337 132 131 107 82% Pv-06 118 47 47 36 76% Pv-07 233 110 109 102 93% Pv-08 166 70 69 68 98% Pv-09 92 44 41 38 93% Pv-10 19 11 9 7 82% Pv-11 147 79 75 71 95% Total 1971 851

Os mapas genéticos são ferramentas básicas que orientam as análises de QTLs

e a identificação de genes de efeito principal. No feijoeiro-comum, em sua maioria, os

mapas existentes são baseados principalmente em marcadores como SCAR e SSR.

McConnel et al., (2010) construiu um mapa de ligação contendo 275 SNPs. Hanai et al.

(2010) desenvolveram uma mapa contendo 413 marcadores de DNA, entre SSR e AFLPs.

Considerando os três mapas de ligação construídos usando 2.041 marcadores

SNP e a população de RILs Rudá × AND 277 de 376 indivíduos, bem como a análise

comparativa apresentada na Tabela 5, o mapa construído a partir do programa MapDisto

mapeou um maior número de SNPs (1.971) cobrindo todos os 11 cromossomos do

feijoeiro-comum com confiança adequada no ordenamento de cada marca, resultando

assim em uma saturação satisfatória. Esse mapa foi então selecionado para as análises de

QTLs associados à resistência ao CBC.

39

4.3 ANÁLISES ESTATÍSTICAS DOS DADOS FENOTÍPICOS

Visando atender a um pressuposto importante para a análise de variância, foi

realizado teste de normalidade de Shapiro Wilk (Shapiro & Wilk, 1965), que evidenciou

que todos os dados de reação ao CBC utilizados possuíam distribuição normal. A Figura 6

apresenta histogramas que ilustram a distribuição normal destes dados. Tendo por base os

resultados obtidos com o teste de normalidade, os dados foram então utilizados sem

transformação nas análises estatísticas e genéticas seguintes. Os coeficientes de variação

(CV) variaram de 15,02% a 29,9%, os quais são aceitáveis por se tratarem de uma

característica de reação à doença, indicando adequada precisão dos experimentos e

confiabilidade dos resultados. Couto et al. (2008) estudando reação a mancha-angular e a

antracnose encontraram valores de CV% de 18,4% a 39%. Candida et al. (2009) avaliando

reação a murcha-de-fusarium no feijoeiro identificaram CV% de 13% a 24%.

Os resumos das análises de variância individuais nos dois ambientes de campo

e da casa de vegetação, bem como a análise de variância conjunta dos experimentos de

campo, encontram-se descritos nas Tabelas 6 e 7.

(A)

(B)

40

(C)

Figura 6. Histogramas representativos da distribuição normal dos dados dos experimentos de

campo conduzidos nas safras das águas de 2012 (A) e águas de 2014 (B), em Ponta Grossa-PR, e do experimento em casa de vegetação (C), conduzido na Embrapa Arroz e Feijão em 2015, em Santo Antônio de Goiás-GO.

Foi observada diferença significativa (P

41

Análise Conjunta FV GL SQ QM Tratamento (T) 399 2054,41 5,1 Ambientes (A) 1 179,95 170,95 T x A 399 2226,45 5,5** Erro efetivo médio 722 611,0 0,8463 GL - Grau de liberdade; SQ - Soma dos quadrados; QM - Quadrados médios; F - valor de. ** nível de significância de 0,01.

A análise de variância para o experimento em casa de vegetação apresentou

diferença significativa para a reação ao CBC (P

42

Tabela 7. Resumo da análise de variâncias dos graus de reação ao crestamento bacteriano comum da população de RILs Rudá × AND 277avaliada em ensaio de inoculação artificial em casa de vegetação na Embrapa Arroz e Feijão em 2015, Santo Antônio de Goiás, GO.

Fonte de Variação GL SQ QM Blocos 4 14,35 3,58 Experimentos (E) 3 358,805 119,06** Testemunhas (T) 1 10,50 10,56** T x E 3 2,68 0,89ns RILs/E 388 962,87 2,48** (T vs RILs)/E 4 5,46 1,36ns Resíduo 396 440,65 1,11 Total 799 1795,0

Média geral 3,52 Média dos RILs 3,52 Média dos genitores 3,81 CV% 29,90 GL - Grau de liberdade; SQ - Soma dos quadrados; QM - Quadrados médios; F - valor de teste de F. p-value - probabilidade de interpretação do teste de F. CV% - Coeficiente de variação. ** nível de significância de 0,01.

4.4 ANÁLISEDE QTL PARA RESISTÊNCIA AO CRESTAMENTO BACTERIANO

COMUM

Como resultado das análises de QTL para reação ao crestamento bacteriano

comum na população de RILs Rudá × AND 277 foram identificados QTLs em cinco

cromossomos distintos, os quais são descritos na Tabela 8. Esses QTLs foram identificados

com auxílio do programa QTLCartographer e estão representados na Figura 7.

43

Tabela 8. QTLs identificados para resistência ao crestamento bacteriano comum na população de RILs de feijoeiro-comum Rudá × AND 277.

QTL Pv Amb Nº SNPs

no intervalo

R² p-valor(F) Verossimilhança Lod Intervalo

cM

CBB1.2RA Pv01

Campo 2012 12 6,5% 0*** 12,3 - 29,2 6,0 39-50cM

Conjunta 18 6,4% 0*** 12,7 - 27,5 6,0 30-50cM

CBB1.3RA Casa de vegetação 22 4% 0*** 11,8 - 16,5 3,8 65-68cM

CBB2.5RA Pv02

Campo 2012 3 3% 0*** 12,1 - 13,1 2,8 80-83cM

CBB2.6RA Conjunta 1 4% 0** 12,7 - 15,1 3,2 70-80cM 3 3% 0*** 11,9 - 12,4 2,6 80-82cM

CBB7.6RA Pv07 Campo 2012 5 5% 0,01* 17,2 - 20,9 4,8 30-35cM

Conjunta 5 5% 0,01* 16,3 - 21,4 4,8 25-35cM

CBB9.3RA Pv09 Campo 2012 2 3% 0** 11,8 2,5 1-5cM

Conjunta 1 3% 0** 12,1 2,6 1-5cM CBB11.5RA

Pv11 Conjunta 1 3% 0** 11,8 2,5 28-30cM

CBB11.6RA 1 3% 0** 11,6 2,5 30-32cM CBB11.7RA Casa de

vegetação 3 3% 0** 11,8 - 12,3 2,7 18-20cM

CBB11.8RA 15 3% 0** 11,5 - 14,6 3,0 31-37cM Pv - Cromossomo Amb - Ambiente no qual o QTL foi identificado R² - % de representação do QTL para a característica resistência a doença.

Com base nos critérios: teste F significativo, LOD maior que 2,5 e

verossimilhança maior que 11,5 (by manual input) (Tabela 8 e 9), foram identificados 10

QTLs para resistência ao CBC na população de RILs Rudá × AND 277, nos cromossomos

Pv01, Pv02, Pv07, Pv09 e Pv11, nos ambientes safra das águas de 2012 em Ponta Grossa -

PR, e em casa de vegetação, em Santo Antônio de Goiás, GO.

As estimativas da variação fenotípica (R2) explicadas por cada QTL por indivíduo foram

determinadas também com auxílio do software QTLCarthographer. O R² variou de 3,0%

para os QTLs CBB11.5RA e CBB11.6RA a 6,5% para o QTL CBB1.2RA. O baixo valor de

R² é justificado pelo tamanho da população já que o cálculo é realizado com base no

número de indivíduos na população utilizada.

Para a seleção do QTL com maior eficiência, foram selecionados alguns

marcadores os quais foram identificados como mais próximos aos QTLs (Tabela 9).

44

Tabela 9. Marcadores identificados como mais próximos e potencialmente úteis para seleção assistida dos QTL identificados para resistência ao crestamento bacteriano comum na população de RILs Rudá × AND 277. QTL Pv Amb SNP R² LOD p-value

CBB1.2RA Pv01 Campo 2012 sc00033ln883062_534070_C_T_43412227 6,5% 6,0 0***

CBB1.2RA Pv01 Conjunta sc00033ln883062_534070_C_T_43412227 6,5% 6,0 0***

CBB1.3RA Pv01 Casa de Vegetação sc00710ln162950_119760_G_A_270773691 4,3% 3,8 0***

CBB2.5RA Pv02 Campo 2012 sc00159ln488287_373880_C_A_122528524 3,2% 2,8 0***

CBB2.5RA Pv02 Conjunta sc00159ln488287_373880_C_A_122528524 3,1% 3,2 0** CBB2.6RA Pv02 Conjunta sc00168ln474152_246994_G_A_126742670 4,9% 3,2 0**

CBB7.6RA Pv07 Campo 2012 sc00077ln670882_200394_T_C_76197535 5,2% 4,8 0,01*

CBB7.6RA Pv07 Conjunta sc00077ln670882_200394_T_C_76197535 5,1% 4,8 0,01*

CBB9.3RA Pv09 Campo 2012 sc00015ln1350335_1245880_A_G_25582156 3,2% 2,5 0**

CBB9.3RA Pv09 Conjunta sc00015ln1350335_1245880_A_G_25582156 3,1% 2,6 0** CBB11.5RA Pv11 Conjunta sc00298ln325414_135611_C_T_176522350 3,0% 2,5 0**

CBB11.6RA Pv11 Conjunta sc01255ln91404_89801_T_C_337451466 3,0% 2,5 0**

CBB11.7RA Pv11 Casa de Vegetação sc00568ln202252_166304_G_A_245100626 3,1% 2,5 0**

CBB11.8RA Pv11 Casa de Vegetação sc02337ln39483_14872_C_A_402497385 3,6% 2,7 0**

Pv - Cromossomo. Amb - Abiente R² - % da ca