manual diagnostico laboratorial raiva 2008

MINISTRIO DA SADE

BrasliaDF2008

Manual de Diagnstico Laboratorial da

RaivaM

anual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Disque Sade0800 61 1997

Biblioteca Virtual em Sade do Ministrio da Sadewww.saude.gov.br/bvs

Secretaria de Vigilncia em Sadewww.saude.gov.br/svs

Secretaria deVigilncia em Sade

9 788533 41454 9

ISBN 978-85-334-1454-9

Ministrio da sadesecretaria de Vigilncia em sade

departamento de Vigilncia epidemiolgica

Manual de Diagnstico Laboratorial da

RaivaBraslia dF

2008

srie a. normas e Manuais tcnicos

2008 Ministrio da sade.todos os direitos reservados. permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde que citada a fonte e que no seja para venda ou qualquer fim comercial.a responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens desta obra da rea tcnica.a coleo institucional do Ministrio da sade pode ser acessada, na ntegra, na Biblioteca Virtual em sade do Ministrio da sade: http://www.saude.gov.br/bvso contedo desta e de outras obras da editora do Ministrio da sade pode ser acessado na pgina: http://www.saude.gov.br/editora

srie a. normas e Manuais tcnicos

tiragem: 1. edio 2008 500 exemplares

Elaborao, distribuio e informaes:Ministrio da sadesecretaria de Vigilncia em sadedepartamento de Vigilncia epidemiolgicaCoordenao-Geral de Laboratrios de sade Pblicaesplanada dos Ministrios, bloco G, edifcio sede, 1. andarCeP: 70058-900 Braslia dFE-mail: [email protected] page: http://www.saude.gov.br/svs

Colaborao:a redao deste manual, que se iniciou com a participao de diversos profissionais da rede de Laboratrios de diagnstico de raiva do Brasil, s foi finalizada com a efetiva participao dos pesquisadores do Laboratrio de referncia nacional, instituto Pasteur. a CGLaB agradece a colaborao de todos.

editora Msdocumentao e informaosia trecho 4, lotes 540/610CeP: 71200-040, Braslia dFtels.: (61) 3233 1774/2020; Fax: (61) 3233 9558E-mail: [email protected] page: www.saude.gov.br/editora

impresso no Brasil / Printed in Brazil

Ficha Catalogrfica

Brasil. Ministrio da sade. secretaria de Vigilncia em sade. departamento de Vigilncia epidemio lgica.

Manual de diagnstico Laboratorial da raiva / Ministrio da sade, secretaria de Vigilncia em sade, departamento de Vigilncia epidemiolgica. Braslia: editora do Ministrio da sade, 2008.

108 p. : il. (srie a. normas e Manuais tcnicos).

isBn 978-85-334-1454-9

1. raiva/diagnstico. 2. tcnicas de diagnstico e procedimentos. 3. Vrus da raiva. i. ttulo. ii. srie.

nLM WC 550Catalogao na fonte Coordenao-Geral de documentao e informao editora Ms os 2008/0013

Ttulos para indexao:em ingls: Guide of Laboratorial diagnosis of rabiesem espanhol: Manual de diagnstico en Laboratorio de la rabia

Equipe editorial:normalizao: Cinthia Kikuchireviso: Lilian alves assuno e Paulo Henrique de CastroCapa, projeto grfico e diagramao: Marcus Monici

Sumrio

ApresentAo ______________________________________________7

CAptulo 1 A rAivA ___________________________________________91.1 Distribuio geogrfica ______________________111.2 Principais caractersticas do vrus da raiva ________121.3 Patogenia _________________________________161.4 Imunidade anti-rbica _______________________181.5 Epidemiologia ______________________________191.6 Anticorpos monoclonais como instrumento de

vigilncia epidemiolgica_____________________211.7 Estudos genticos com o vrus rbico ____________241.8 Sintomatologia______________________________25

1.8.1 Humanos _____________________________251.8.2 Ces __________________________________261.8.3 Gatos _________________________________271.8.4 Bovinos _______________________________271.8.5 Outros animais domsticos _______________281.8.6 Animais silvestres _______________________28

CAptulo 2 BiossegurAnA ____________________________________292.1 Classes de risco biolgico _____________________312.2 Medidas bsicas de biossegurana _____________32

CAptulo 3 ColheitA e envio dAs AmostrAs pArA diAgnstiCo lABorAtoriAl _353.1 Colheita do material _________________________373.2 Necropsia __________________________________38

3.2.1 Materiais para necropsia _________________383.2.1.1 Equipamentos de proteo

individual ________________________383.2.1.2 Instrumentais _____________________38

3.3 Colheita da amostra _________________________393.4 Acondicionamento e preparo da amostra para

encaminhamento ___________________________433.5 Sugesto de informaes para a ficha de

remessa de amostras para o laboratrio de diagnstico de raiva _________________________44

CAptulo 4 diAgnstiCo lABorAtoriAl ____________________________454.1 Tcnica histolgica (colorao de Sellers) _________47

4.1.1 Materiais necessrios ____________________474.1.1.1 Equipamentos ____________________474.1.1.2 Reagentes _______________________474.1.1.3 Materiais diversos _________________474.1.1.4 Corante _________________________48

4.1.2 Colorao _____________________________494.1.3 Leitura ________________________________51

4.2 Tcnica de imunofluorescncia direta ___________524.2.1 Materiais necessrios ____________________53

4.2.1.1 Equipamentos ____________________534.2.1.2 Reativos _________________________534.2.1.3 Materiais diversos _________________534.2.1.4 Procedimentos ___________________54

4.2.2 Leitura das lminas ______________________554.2.3 Preparo do CVS (Challenge Virus Standard) ___564.2.4 Titulao do CVS (trabalho) ______________564.2.5 Preparo do CCN (crebros de camundongos

normais) ______________________________574.2.6 Titulao do conjugado anti-rbico ________574.2.7 Avaliao do conjugado _________________59

4.3 Prova para isolamento do vrus rbico em camundongos (prova biolgica) _______________604.3.1 Materiais necessrios ____________________61

4.3.1.1 Equipamentos ____________________614.3.1.2 Reativos _________________________614.3.1.3 Materiais diversos _________________61

4.3.2 Procedimentos _________________________624.3.3 Inoculao em camundongos _____________62

4.4 Prova para Isolamento do Vrus Rbico em Cultivo Celular ___________________________________ 654.4.1 Materiais necessrios ____________________65

4.4.1.1 Equipamentos ____________________654.4.1.2 Reativos _________________________664.4.1.3 Materiais diversos _________________66

4.4.2 Procedimentos _________________________67

4.5 Tipificao antignica pela tcnica de imunofluorescncia indireta com anticorpos monoclonais _______________________________694.5.1 Materiais necessrios ____________________70

4.5.1.1 Equipamentos ____________________704.5.1.2 Reativos _________________________704.5.1.3 Materiais diversos _________________714.5.1.4 Procedimentos ___________________71

CAptulo 5 soroneutrAlizAo _________________________________755.1 Avaliao sorolgica para raiva _________________79

5.1.1 Colheita do soro ________________________805.2 Soroneutralizao em cultura de clulas _________80

5.2.1 Materiais necessrios ____________________805.2.1.1 Equipamentos ____________________805.2.1.2 Materiais diversos _________________815.2.1.3 Reativos _________________________81

5.2.2 Procedimentos _________________________815.2.3 Colorao com conjugado fluorescente _____825.2.4 Leitura ________________________________82

5.3 Soroneutralizao em camundongos ____________835.3.1 Diluio do soro a ser testado e do

soro-padro ___________________________835.3.2 Diluio do vrus desafio _________________845.3.3 Inoculao e observao dos camundongos _855.3.4 Clculos segundo Reed & Mench _________85

CAptulo 6 logAritmos _______________________________________876.1 Conceitos bsicos _____________________________896.2 Operaes com logaritmos _____________________896.3 Cologaritmo _________________________________916.4 Estrutura de logaritmo decimal __________________916.5 Obteno de antilogaritmos ____________________92

CAptulo 7 mtodo de reed-menCh (r & m) ______________________93

CAptulo 8 tAmpes e solues _________________________________97

refernCiAs ______________________________________________ 101

7Manual de diagnstico Laboratorial da raiva

Apresentao

o diagnstico laboratorial da raiva de fundamental importn-cia para o tratamento profiltico humano ps-exposio, mediante a aplicao de imunobiolgicos especficos, e para a adoo de me-didas visando ao controle da doena nas populaes de animais do-msticos, evitando a ocorrncia de epizootias com a identificao das reas com circulao viral.

a avaliao sorolgica dos anticorpos anti-rbicos com a so-roneutralizao permite o acompanhamento da proteo conferida pela vacina em indivduos expostos ao vrus da raiva, acidentalmen-te ou por razes de trabalho, evitando riscos da ocorrncia de novos casos da enfermidade.

outras contribuies importantes do laboratrio de diagns-tico so a anlise antignica dos vrus isolados e o estudo genmi-co. a anlise antignica tem contribudo para o estudo comparativo das variantes do vrus da raiva, por meio da utilizao de anticorpos monoclonais. tal caracterizao tem sido muito til para que se en-tenda a epidemiologia da raiva humana em situaes em que no h evidncias de exposio ao vrus, em regies onde a raiva canina est sob controle, e tambm para integrar a vigilncia epidemiolgica no mbito dos laboratrios de diagnstico, na compreenso dos novos ciclos epidemiolgicos da raiva identificados no pas.

a anlise genmica permite que se estabelea a relao evolu-tiva das variantes e a distribuio espacial e temporal de cada uma delas. a padronizao dos procedimentos nos laboratrios que rea-lizam o diagnstico essencial para garantir a qualidade dos resul-tados obtidos. este manual tem o objetivo de promover tal padro-nizao de procedimentos de rotina da rede de laboratrios, com a atualizao dos profissionais que atuam nas diferentes instituies da referida rea.

Ministrio da Sade

Captulo 1

A raiva

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Manual de diagnstico Laboratorial da raiva

a raiva uma antropozoonose transmitida ao homem pela ino-culao do vrus da raiva, contido na saliva de animais infectados, prin-cipalmente por meio de mordeduras. trata-se de uma encefalite aguda, que leva as vtimas ao bito em praticamente 100% dos casos, sendo uma das mais antigas doenas conhecidas. ainda nos dias atuais, a rai-va representa um srio problema de sade pblica e produz grandes preju zos econmicos pecuria.

1.1 Distribuio geogrficaa distribuio da raiva mundial, com cerca de 40.000 a 70.000

mortes ao ano, quase todas em pases em desenvolvimento. atualmen-te, as nicas regies cuja populao animal no est infectada com rai-va so: nova Zelndia, nova Guin, Japo, Hawai, taiwan, oceania, Finlndia, islndia, a parte continental da noruega, sucia, Portugal, Grcia e algumas ilhas das antilhas e do atlntico. aps mais de 115 anos do desenvolvimento da vacina anti-rbica, por Louis Pasteur, a rai-va persiste em algumas regies sob a forma epidmica. a razo mais importante para que tal fato ocorra a multiplicidade de reservatrios domsticos ou silvestres da raiva.

na sia, na frica e na amrica Latina, os ces continuam sen-do os mais importantes reservatrios, e a raiva humana permanece como um grave problema de sade pblica.

nos pases nos quais foi possvel o controle da raiva nos animais domsticos urbanos, os casos em humanos diminuram; porm, os animais silvestres representam um srio desafio a ser vencido. em raposas, a raiva tem se mostrado endmica, tanto na europa como na amrica do norte. outros animais silvestres, como os cangambs, guaxinins e morcegos, na amrica do norte, tm assumido enorme importncia, porm os dados de ocorrncia refletem principalmente a ateno que tem sido dada raiva nesses animais, o que no vem acontecendo no restante do mundo. algum xito vem sendo obtido, atualmente, no controle da raiva silvestre, com a utilizao de vaci-nas de vrus atenuados ou de vacinas recombinantes.

na amrica Latina, os morcegos hematfagos, principalmente o Desmodus rotundus, constituem-se nos principais transmissores

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secretaria de Vigilncia em sade

para os animais de interesse econmico, embora os ces tenham sido os principais transmissores da raiva humana at o ano de 2003. ou-tras espcies de morcegos tambm vm desempenhando importante papel na transmisso da raiva. a partir de 2004, os morcegos he-matfagos se tornaram o principal transmissor da raiva na amrica Latina e, em particular, no Brasil.

Quando se consideram os prejuzos econmicos causados pela raiva, devem ser computados, alm das mortes dos animais de inte-resse econmico, os prejuzos indiretos, como a quebra da produ-o leiteira e da carne, a depreciao do couro dos animais, pelos freqentes ataques dos morcegos hematfagos, e o dano econmico pelas horas perdidas por homem nos tratamentos anti-rbicos, bem como o prprio custo dos tratamentos.

1.2 Principais caractersticas do vrus da raivaa raiva uma doena que acomete mamferos, em geral, e

causada por um vrus rna da ordem Mononegavirales, famlia Rhab-doviridae, gnero Lyssavirus e espcie Rabies virus (raBV). na famlia Rhabdoviridae, existe um amplo nmero de espcies de vrus que in-fectam animais vertebrados (mamferos, peixes e rpteis), invertebra-dos e plantas, o que demonstra a grande diversidade desses vrus.

a famlia Rhabdoviridae possui trs gneros que infectam ma-mferos:

Vesiculovirus: vrus da estomatite vesicular e vrus relacionados.

Lyssavirus: vrus da raiva e aparentados ao vrus da raiva.

Ephemerovirus: vrus da febre efmera dos bovinos.alm desses trs gneros, h outros trs:Novirhabdovirus (que infecta peixes) e cytorhabdovirus e nucle-

orhabdovirus (que infectam plantas e invertebrados).o estudo do vrus da raiva, que at a dcada de 70 era consi-

derado uma unidade antignica, teve grandes avanos a partir da dcada de 80, com a utilizao de anticorpos monoclonais.

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o gnero Lyssavirus possui, atualmente, sete espcies distintas. Quatro delas podem ser relacionadas da seguinte forma:

(1) Rabies virus (raBV), o vrus clssico da raiva, que infecta mamferos terrestres, morcegos hematfagos e morcegos no-hema-tfagos das amricas e pertence ao gentipo 1;

(2) Lagos bat virus (LBV) ou gentipo 2, que o vrus isolado de morcegos frugvoros (Eidolon helvum, Micropterus pusillus e Epo-morphorus wahlbergi) da regio dos Lagos (nigria);

(3) Mokola virus (MoKV) ou gentipo 3, que foi isolado de mussanharos (Crocidura sp) de humanos, tambm da nigria, e de felinos do Zimbabwe e da etipia; e

(4) Duvenhage virus (dUVV) ou gentipo 4, isolado de mor-cegos insetvoros (miniopterus schereibersii e nycteris thebaica) e hu-manos da frica do sul e Zimbabwe.

a partir da dcada de 80, verificou-se que tais vrus (gentipos 2, 3 e 4), denominados vrus relacionados ou aparentados ao vrus da raiva, pareciam estar mais difundidos do que se sups inicialmente. naquela poca, foram isoladas vrias cepas de vrus do continente eu-ropeu com caractersticas similares aos vrus relacionados. Mais estu-dos realizados posteriormente permitiram a classificao de mais dois gentipos ou duas espcies: o European bat lyssavirus 1 (eBLV1), que agrupou os isolamentos do gnero Eptesicus; e o European bat lyssa-virus 2 (eBLV2), que agrupou os isolamentos do gnero Myotis. esses foram denominados, respectivamente, gentipos 5 e 6.

na dcada de 90, foi isolada na austrlia, de um morcego fru-gvoro (Pteropus alecto), uma nova cepa, denominada Australian bat lyssavirus, classificada como gentipo 7.

Mais recentemente, em 2003, foram descritas novas variantes isoladas de morcegos insetvoros do Kirguisto, do tadijkisto e da rssia, tendo sido apresentada proposta para que eles sejam classi-ficados como novos gentipos do gnero Lyssavirus. tais vrus so denominados Aravan virus, isolado no Kirguisto, em 2003, a par-tir de morcego insetvoro (Myotis blythi); Khujand virus, isolado no tadijkisto, em 2001, tambm de morcego insetvoro; e outras duas

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variantes isoladas na rssia, uma da cidade de irkutsk, denominada Irkut virus, a partir de um morcego Murina leucogaster, e a outra ob-tida na regio das montanhas do Cucaso, denominada West cauca-sian bat virus (WCBV), isolada a partir de um morcego Miniopterus schreibersi.

ressalta-se que, at o presente, o nico Lissavrus no isolado de quirpteros foi o gentipo 3 (Mokola virus) e somente o gentipo 1 foi encontrado no continente americano e no Caribe.

todos os Lyssavirus, vrus rbicos ou aparentados, possuem rna de fita simples, polaridade negativa, linear, no segmentado, com 11.932 nucleotdeos e PM = 4,6 x 106 daltons.

o vrus da raiva pode ser dividido em duas pores: o ribonu-cleocapsdeo e o envelope. o ribonucleocapsdeo possui o rna e trs protenas: a nucleoprotena (n), que est associada ao rna viral; a protena L, que uma rna polimerase rna dependente (respons-vel pela transcrio e pela replicao do rna viral), e a protena P (ns ou M1), que uma fosfoprotena. o envelope constitudo de duas protenas: a glicoprotena (G) e a protena matrix (M ou M2).

a protena mais importante e mais conhecida a glicoprotena (G), responsvel pela induo de anticorpos neutralizantes, pela esti-mulao das clulas t e pela adsoro entre vrus e clula. a resposta imune especfica ao vrus da raiva possui dois componentes: a me-diada por anticorpos e a mediada por clulas. alm da glicoprotena (G), a nucleoprotena (n) tem importante papel na resposta imune, visto que, mediante uma interao, age na resposta imune celular.

destaca-se que uma boa relao n/G, na suspenso antignica destinada vacina, o ideal para a obteno de uma boa vacina anti-rbica.

no que diz respeito morfologia, o vrus da raiva apresenta a forma de um projtil, com uma das extremidades plana e a outra arredondada. seu comprimento mdio de 180nm e o dimetro m-dio de 75nm. as espculas do envelope, de glicoprotena, possuem 9nm. na sua constituio qumica, a partcula viral completa possui de 2 a 3% de cido ribonuclico (rna), 67% de protenas, 26% de lipdeos e 3% de carboidratos.

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o vrus da raiva sensvel aos solventes de lipdeos (sabo, ter, clorofrmio e acetona), ao etanol a 45-70%, aos preparados iodados e aos compostos de amnio quaternrio. outras relevantes proprie-dades so a resistncia dessecao, assim como aos congelamentos e descongelamentos sucessivos, a relativa estabilidade a um pH entre 5-10 e a sensibilidade s temperaturas de pasteurizao e luz ultra-violeta. inativado a 60oC, em 35 segundos; a 4oC, se mantm infec-tivo por dias; a -70oC ou liofilizado (4oC), se mantm durante anos.

o vrus da raiva muito sensvel aos agentes fsicos e qumicos, sendo possvel a sua inativao em poucos minutos pela ao de ci-dos e bases fortes, luz solar, alteraes de PH e temperatura e raios ultravioleta.

a adsoro entre vrus e clula feita pela glicoprotena, em uma ligao especfica (receptor celular anti-receptor viral). o vrus penetra nas clulas por um processo de endocitose. Uma vez dentro das clulas, o ribonucleocapsdeo liberado dentro do citoplasma, onde o rna negativo se replica, dando origem ao rna mensageiro (ciclo de transcrio primria), que codifica as cinco protenas e os novos genomas, que so encapsidados e, no nvel das membranas celulares, so liberados por brotamento.

a glicoprotena, como j foi dito, tem papel importante na penetrao do vrus na clula, tendo tambm importante papel na imunidade humoral e na celular, pela ativao de linfcitos t (hel-per) e citocinas.

a fosfoprotena interage com a nucleoprotena no processo de encapsidao, e a protena matrix muito importante na fase de ma-turao viral.

a polimerase (protena L) rna dependente tem mltiplas atividades enzimticas: na sntese do rna, na metilao, na fosfori-lao, etc.

importante tambm fazer distines entre os vrus rbicos cls-sicos, o vrus de rua e o vrus fixo. a denominao vrus de rua utilizada para cepas isoladas de animais infectados em ciclos de trans-misso natural. tais cepas caracterizam-se por um perodo de incuba-o varivel, s vezes bastante prolongado, ao contrrio das cepas deno-

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minadas vrus fixos, que apresentam um perodo de incubao curto, geralmente de quatro a sete dias.

1.3 Patogeniaa patogenia da raiva semelhante em todas as espcies de

mamferos. o vrus se replica no local da inoculao, inicialmente nas clulas musculares ou nas clulas do tecido subepitelial, at que atinja concentrao suficiente para alcanar as terminaes nervo-sas, sendo este perodo de replicao extraneural responsvel pelo perodo de incubao relativamente longo da raiva.

nas junes neuromusculares, o vrus rbico, por meio da gli-coprotena, se liga especificamente ao receptor nicotnico da ace-tilcolina. aps essa fase, os vrus atingem os nervos perifricos, se-guindo um trajeto centrpeto, em direo ao sistema nervoso central (snC). o vrus segue o fluxo axoplasmtico retrgrado e o transpor-te clula a clula. estima-se que o genoma viral tenha um desloca-mento de 25 a 50mm por dia, at chegar ao sistema nervoso central. a distribuio do vrus rbico no homognea no snC e, por tal razo, a poro de eleio para encaminhamento ao laboratrio de diagnstico varia de espcie para espcie. as regies mais habitu-almente atingidas so: o hipocampo, o tronco cerebral e as clulas de Purkinje, no cerebelo. Muitas vezes, os sintomas esto associados com a localizao anatmica no crebro.

nos ruminantes suspeitos de raiva, deve ser feita a colheita de todo o encfalo ou, de preferncia, de fragmentos do sistema nervo-so (crtex, cerebelo e hipocampo ou corno de amon) de ambos os hemisfrios. nos eqdeos, deve-se enviar, tambm, o bulbo e frag-mentos das pores inicial, medial e terminal da medula espinhal. nos ces, a poro de eleio o corno de amon ou o hipocampo. ressalta-se que, na coleta de amostras de todas as espcies (domsti-cas ou silvestres), deve ser encaminhada poro da medula.

a partir da intensa replicao no snC, o vrus da raiva segue em direo centrfuga, disseminando-se atravs do sistema nervo-so perifrico e autnomo para diferentes rgos (pulmes, corao, rins, bexiga, tero, testculos, folculo piloso, etc.) e glndulas sali-vares, sendo eliminado pela saliva. a disseminao possibilita que

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o vrus atinja, tambm, terminaes nervosas sensoriais do tecido cutneo da cabea e do pescoo, onde se pode demonstrar a presen-a de antgeno viral. Por tal razo, utiliza-se a bipsia de tecido des-sa regio como mtodo de diagnstico ante-mortem. o vrus rbico pode localizar-se tambm na retina e no epitlio da crnea.

a viremia tem sido documentada em modelos experimentais, sendo fugaz e temporria, mas no h evidncias de que tenha im-portncia significativa durante o processo de disseminao viral.

em ces e gatos, a saliva pode ter maior concentrao de vrus do que o prprio snC. em herbvoros, no entanto, a concentrao de vrus eliminado pela saliva baixa.

as leses histopatolgicas so as incluses de negri, que so patognomnicas para a raiva. a sua ausncia, porm, no invalida o diagnstico da raiva, tendo em vista que nos episdios de evoluo rpida, com perodo de incubao curto e bito precoce, pode no haver tempo suficiente para o aparecimento das incluses. tal fato tem sido observado, com freqncia, no diagnstico laboratorial da raiva em eqdeos. outra leso observada deve-se formao de va-colos, que conferem ao sistema nervoso o aspecto espongiforme.

a via nasal e particularmente as clulas neuroepiteliais olfati-vas podem ser uma via alternativa de penetrao viral.

Mais recentemente, nos estados Unidos e na alemanha, foi verificada a transmisso entre humanos mediante transplantes de rgos slidos.

o perodo de incubao da raiva extremamente varivel e depen-de, fundamentalmente, da concentrao do inculo viral e da distncia entre o local do ferimento e o crebro. de igual forma, est relacionado com a extenso, a gravidade e o tamanho da ferida causada pelo animal agressor. o perodo que vai desde o momento em que o agente penetra no organismo at o aparecimento da sintomatologia clnica. Pode variar, em mdia, de 20 a 90 dias, em humanos e animais.

o perodo de transmissibilidade o perodo em que existe a possibilidade de transmisso do agente infeccioso de um organismo a outro. Varia de espcie a espcie, mas, em todos os animais, inclu-sive nos seres humanos, precede ao aparecimento da sintomatologia

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e perdura durante o quadro clnico, at a morte. tal perodo foi bas-tante estudado em ces e gatos, sendo, na grande maioria das vezes, de cerca de dois a quatro dias antes do surgimento dos sintomas no animal, at sua morte, que ocorre geralmente cinco dias aps.

1.4 Imunidade anti-rbicaao contrrio de muitos vrus que causam infeco aguda, o

vrus da raiva ultrapassa as defesas imunes do hospedeiro, por um longo perodo, devido ao seu extremo neurotropismo, isto , a pro-duo de anticorpos anti-rbicos em indivduos infectados s ocorre tardiamente, com freqncia apenas quando surgem os primeiros sintomas.

ao penetrar nos neurnios, o vrus da raiva torna-se protegido da ao dos anticorpos, das clulas do sistema imune e da ao dos interferons, responsveis pela resposta imune inespecfica. os inter-ferons so protenas de baixo peso molecular extremamente impor-tantes no incio da infeco, que podem atuar inibindo diretamente a replicao viral (e, assim, a sua disseminao) ou induzindo as reaes das clulas imunes. o vrus da raiva capaz de induzir a produo de interferons antes de sua migrao para o sistema nervoso central.

as clulas apresentadoras de antgeno (macrfagos, clulas dendrticas, clulas de Langerhans, etc.), quando entram em contato com o vrus da raiva, fagocitam-no e o processam para apresenta-o s clulas imunes. tal apresentao fundamental ativao dos linfcitos t auxiliares, que vo produzir diferentes citocinas. estas ativam diferentes clulas implicadas na eliminao direta do vrus ou de clulas infectadas e auxiliam a produo de anticorpos pelos linfcitos B.

a estimulao dos linfcitos B para a produo de anticorpos, na infeco natural, s se d aps o aparecimento dos sintomas clni-cos. a possibilidade de neutralizao da capacidade infecciosa viral s se d, portanto, aps a invaso do sistema nervoso central e, neste momento, a doena j adquiriu uma forma irreversvel. o ttulo de anticorpos neutralizantes permanece baixo at a fase terminal da doena e atinge seu pico prximo morte da vtima.

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o papel principal dos anticorpos o de bloquear o vrus ex-tracelular antes que ele encontre o receptor das clulas musculares, limitando sua propagao no nvel do local de infeco e sua pro-gresso para o sistema nervoso central.

a resposta imune celular , talvez, o mecanismo mais impor-tante da resposta imune ao vrus da raiva. os linfcitos t participam da proteo de diferentes maneiras: (1) estimulando, por intermdio dos linfcitos t auxiliares, as clulas B para que produzam anticor-pos; (2) como efetoras de imunidade, na forma de clulas t citotxi-cas, lisando clulas infectadas; (3) induzindo a sntese de substncias mediadoras da estimulao de diferentes clulas; e (4) como clulas de memria imunolgica.

1.5 Epidemiologiaa raiva uma enfermidade que ocorre de maneira endmica

em diversos pases. suas formas epidemiolgicas obedecem a uma diviso didtica, sendo que as mais conhecidas so a raiva urbana e a raiva rural.

a raiva urbana transmitida principalmente de co para co. o vrus mantido primariamente na populao canina; porm, ou-tros animais domsticos urbanos so freqentemente infectados. os ces, como j foi dito, so os importantes transmissores da raiva para o homem. esta forma um grave problema de sade pblica, devido ao estreito relacionamento entre as pessoas e seus animais de com-panhia.

a raiva rural mantida no campo pelo morcego hematfago (desmodus rotundus), que o reservatrio do vrus rbico no am-biente rural. dessa forma, o morcego transmite o vrus para dife-rentes espcies de animais domsticos, como bovinos, eqinos, ca-prinos, etc.

o nmero de casos de raiva em herbvoros, confirmados labo-ratorialmente, tem tido, nos ltimos anos, um acrscimo de maneira preocupante em algumas regies, devido principalmente intensa proliferao dos morcegos hematfagos e crescente dificuldade de controle de suas populaes.

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a transmisso do vrus da raiva feita, geralmente, por meio da saliva de um animal infectado para outro, embora outras vias se-jam relatadas (membranas mucosas: olhos, nariz, boca), aerossis e transplante de crnea. em quirpteros, as transmisses transplacen-trias e transmamrias tambm j foram relatadas.

J foi relatada a transmisso da doena em cavernas com gran-des populaes de morcegos, para humanos e animais, por via aer-gena, bem como em laboratrios de produo e vacina.

o ciclo areo da raiva tem, atualmente, uma grande importn-cia para a manuteno do vrus em uma rea geogrfica. as diferen-tes espcies de morcegos, hematfagos ou no, so susceptveis ao vrus, com possibilidade de transmiti-lo e de apresentar sintomato-logia, que sempre evolui para a morte.

o ciclo silvestre representado pela raiva nas espcies de ma-mferos silvestres terrestres, com nfase nos candeos silvestres. em nosso meio, a real importncia desse ciclo no , ainda, bem conhe-cida, razo pela qual se torna indispensvel a implementao de pro-gramas de vigilncia epidemiolgica.

os estudos realizados com amostras isoladas nos ltimos anos, no Brasil, permitiram a proposio de um ciclo epidemiolgico da raiva, no qual h uma estreita inter-relao entre os quatro ciclos clssicos.

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Figura 1. Ciclos epidemiolgicos da raiva

Fonte: instituto Pasteur.

1.6 Anticorpos monoclonais como instrumento de vigilncia epidemiolgica

Com a finalidade de caracterizar o vrus da raiva, a organizao Pan-americana da sade (opas) criou um consrcio de instituies com reconhecido conhecimento tcnico-cientfico (Consrcio de La-boratrios de referncia para a raiva) com os seguintes objetivos: fortalecer a vigilncia da raiva nas amricas; otimizar a capacidade de diagnstico; harmonizar os mtodos e unificar os critrios de in-terpretao dos resultados utilizados nos diferentes laboratrios.

embora os mtodos sorolgicos que utilizam anticorpos poli-clonais permitam diferenciar o vrus da raiva dos outros Lyssavirus, eles s conseguem estabelecer ligeiras diferenas entre os subtipos do vrus clssico da raiva. os mtodos de caracterizao antignica e gentica permitem a identificao das variantes responsveis por epi-sdios e por casos individuais tanto de humanos como de animais.

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os anticorpos monoclonais permitem anlises antignicas comparativas das variantes do vrus da raiva. a reatividade deter-minada com a utilizao de um painel de anticorpos monoclonais especficos para eptopos da nucleoprotena viral e visualizada pela colorao fluorescente. o painel de anticorpos monoclonais anti-nucleoprotena tem se mostrado adequado tanto para possibilitar a mxima diferenciao entre os vrus da raiva importantes, do ponto de vista da sade pblica, como para a distribuio e a transmisso entre as diferentes espcies selvagens.

a caracterizao das variantes tem sido muito til tambm para que se entenda a epidemiologia da raiva humana, sobretudo nas situa-es em que no h evidncias de exposio ao vrus, como, por exem-plo, em regies onde a raiva canina esteja controlada.

o uso exclusivo de anticorpos monoclonais, no entanto, apre-senta certas limitaes. Por exemplo, a diversidade das variantes pre-sentes em morcegos no hematfagos no totalmente explicada com os anticorpos monoclonais existentes. a anlise genmica , evidentemente, mais adequada, pois proporciona informaes mais detalhadas sobre a relao evolutiva dos isolados, as mudanas es-paciais e temporais que se podem produzir e a semelhana entre os isolados.

dependendo dos objetivos da anlise e do grau de relao das variantes, prefervel a anlise das seqncias totais ou parciais do gene n, altamente conservado; do gene G, de divergncia interme-diria; ou do gene P e da regio intergnica G-L, altamente diver-gentes.

a anlise gentica se realiza mediante a reao de polimeriza-o em cadeia e a anlise dos produtos da amplificao.

a aplicao da tipificao antignica e gentica na vigilncia da raiva na amrica Latina e no Caribe essencial para melhorar os atuais programas de controle da doena. o conhecimento da fonte de novos focos de raiva canina e a identificao das espcies silves-tres que mantm os ciclos silvestres de transmisso da raiva pos-sibilitam uma melhor utilizao dos recursos de sade pblica.

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na atualidade, o CdC (de atlanta, Usa), como Centro Co-laborador da organizao Mundial da sade para a investigao e a referncia da raiva, que proporciona aos pases da amrica Latina o painel de oito anticorpos monoclonais anti-n. o uso do mesmo painel tem a vantagem de permitir a comparao dos resultados ob-tidos por diferentes grupos de pesquisa.

no Brasil, o instituto Pasteur de so Paulo vem utilizando tal tcnica, que tem permitido determinar a distribuio geogrfica das variantes antignicas do vrus da raiva, descrever novas variantes e identificar variantes conhecidas em novos hospedeiros, informaes muito teis para a vigilncia epidemiolgica da raiva no Brasil.

tm sido demonstradas algumas limitaes da anlise antig-nica com um pequeno nmero de anticorpos monoclonais, visto que pequenos erros na interpretao de uma reao positiva ou negati-va com um dos anticorpos monoclonais podem proporcionar um padro antignico diferente, o que poderia conduzir identificao incorreta de um reservatrio ou de um novo padro de reao. Por tal razo, a tipificao antignica, quando fornece resultados inespe-rados, deve ser complementada com o seqenciamento gentico.

no Brasil, foram encontradas quatro variantes: variante 2, pr-pria dos ces; variante 3, prpria do morcego hematfago Desmodus rotundus; variante 4, prpria do morcego insetvoro Tadarida brasi-liensis; e variante 6, prpria do morcego insetvoro Lasiurus cinereus.

Foram encontradas tambm diversas outras variantes, que foram denominadas no compatveis com o painel de monoclonais estabe-lecido para estudos das cepas isoladas nas amricas, com especial destaque para uma nova variante isolada em sagis do tufo branco (Callithrix jacchus) e em humanos, nos estados do Cear e do Piau, bem como outras isoladas em morcegos insetvoros.

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1.7 Estudos genticos com o vrus rbico a tipificao gentica de uma determinada amostra de vrus

rbico pode ser feita com a determinao da seqncia de um pe-queno segmento de seu genoma e a comparao da seqncia com outras derivadas de diversas amostras de vrus rbico, disponveis em bancos de dados internacionais, como, por exemplo, o GenBank.

Para tanto, o primeiro passo a ser cumprido amplificar, em uma escala de bilhes de vezes, o segmento de eleio e isol-lo do material gentico pertencente a outros microorganismos presentes na amostra ou mesmo ao prprio hospedeiro do qual se colheu a amostra. a amplifica-o conseguida por meio de uma reao desenvolvida no incio dos anos 80 e que ficou conhecida como reao em cadeia pela polimerase (PCr), na qual uma enzima que sintetiza cadeias de dna (dna-polimerase), a partir de um dna molde, presente na amostra, faz cpias de um deter-minado segmento de dna, cujas localizao e extenso so determina-das por um par de cadeias curtas de dna sintetizadas artificialmente em laboratrio, par denominado primers, que ir reagir de modo especfico, nica e exclusivamente com o gene ou o agente de interesse.

Ciclos de temperaturas permitem que o dna-polimerase monte cpias do segmento delimitado pelos primers por meio da insero das bases nitrogrenadas a, G, t, C. ao final da reao, o fragmento de dna amplificado pode ser observado por eletroforese em gel de agarose, quando aparece como uma banda de precipitao de dna de um tamanho esperado.

tal resultado , por si s, suficiente para que se determine a pre-sena de vrus rbico, mas no permite que se observe a composio do dna amplificado em termos de seqncias de nucleotdeos. as-sim, para que se atinja esse nvel de disseco, o material amplificado submetido a uma segunda reao bioqumica, a reao de seqencia-mento de dna, mediante a adio de bases a, t, G e C modificadas e marcadas com cores. Uma vez terminada a reao, o equipamen-to conhecido como seqenciador de dna capaz de ler as cores e apresent-las, finalmente, sob a forma de uma seqncia de dna que pode, agora, ser utilizada para a tipificao molecular por meio da construo de uma rvore filogentica, uma representao grfica das relaes existentes entre diversas amostras de vrus rbico.

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Uma questo fundamental na tipificao molecular reside na escolha do segmento ou do gene a ser focalizado. no vrus rbico, so encontrados cinco genes, um para cada uma das protenas: n para a nucleoprotena, P para a fosfoprotena, M para a protena de matriz, G para a glicoprotena e L para a rna-polimerase. desses genes, a menor variabilidade encontrada no n: por exemplo, sabe-se que a similaridade dos aminocidos codificados por tal gene de 98 a 99,6% em amostras fixas. isso torna o gene n o alvo de eleio para a tipificao molecular de uma dada amostra de vrus rbico: o gene n to conservado e estvel que pequenas variaes encontra-das em sua seqncia sero compartilhadas por variantes que tm caractersticas em comum, como, por exemplo, o hospedeiro (mor-cego, co, etc.), o ciclo de transmisso (silvestre, areo, rural ou urba-no), a regio de onde provm a amostra ou mesmo a poca em que a amostra foi detectada.

a tipificao antignica, por meio da imunofluorescncia in-direta, com utilizao de anticorpos monoclonais, uma tcnica especfica, sensvel e extremamente rpida, mas impossvel de ser realizada em amostras com volume muito pequeno, autolisadas ou em decomposio avanada, alm de ter um poder discriminatrio limitado, desvantagens que podem, seguramente, ser contornadas com a tipificao molecular.

1.8 Sintomatologiaa sintomatologia varia conforme o animal infectado. assim,

sero apresentadas consideraes sobre a sintomatologia em huma-nos, ces, gatos, outros animais domsticos e animais silvestres.

1.8.1 Humanos o perodo de incubao, na maioria dos casos, de 2 a 12 se-

manas, podendo variar de 10 dias at 4 a 6 anos. durante o perodo de incubao, o paciente apresenta-se absolutamente assintomtico. a maior ou menor durao do perodo pode depender da dose de vrus injetada pela mordedura, do lugar desta e da gravidade da le-so, sendo mais longo o perodo quanto mais distante do sistema nervoso central localizar-se a leso.

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a doena inicia-se com alteraes de comportamento, sensao de angstia, cefalia, pequena elevao de temperatura, mal-estar e alte-raes sensoriais imprevistas, com freqncia relacionadas ao local da mordedura. o paciente costuma sentir dor e irritao na regio lesio-nada. na fase seguinte, de excitao, surge hiperestesia de uma extrema sensibilidade luz e ao som, dilatao das pupilas e aumento da saliva-o. Conforme a doena progride, surgem espasmos nos msculos da deglutio e a bebida recusada por contraes musculares. a disfun-o de deglutio observa-se na maioria dos doentes, muitos dos quais apresentam contraes espasmdicas laringofarngeas simples viso de um lquido e se abstm de deglutir a sua prpria saliva (hidrofobia). tambm podem ser observados espasmos dos msculos respiratrios e convulses generalizadas. a fase de excitao pode ser predominante at a morte ou ser substituda por uma fase de paralisia generalizada. em alguns casos, a fase de excitao muito curta e, em quase todo o curso da doena, predomina a sintomatologia paraltica. tal fato ocorre, principalmente, quando a espcie transmissora o morcego. a doena dura de dois a seis dias ou mais e quase sempre termina com a morte, que atribuda falncia das funes vegetativas centrais bsicas e, mui-tas vezes, ocorre em funo da miocardite rbica concomitante.

a raiva em animais manifesta-se de duas formas: a raiva furiosa e a raiva paraltica ou muda, de acordo com a sintomatologia nervo-sa apresentada.

1.8.2 Ceso perodo de incubao , em geral, de 15 dias a 2 meses. na

fase prodrmica, os animais apresentam mudana de comportamen-to, escondem-se em locais escuros ou mostram uma agitao inusi-tada. a excitabilidade reflexa fica exaltada e o animal se sobressalta ao menor estmulo. observa-se a ocorrncia de anorexia, irritao ou prurido na regio de penetrao do vrus e uma ligeira elevao da temperatura. aps um a trs dias, ficam acentuados os sintomas de excitao. o co se torna agressivo, com tendncia a morder obje-tos, outros animais, o homem (inclusive o seu proprietrio) e morder a si mesmo, muitas vezes provocando graves ferimentos. a salivao torna-se abundante, uma vez que o animal incapaz de deglutir sua saliva, em virtude da paralisia dos msculos da deglutio. H alte-

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rao do seu latido, que se torna rouco ou bitonal, devido paralisia parcial das cordas vocais. os ces infectados pelo vrus rbico tm propenso de abandonar suas casas e percorrer grandes distncias, durante a qual podem atacar outros animais, disseminando, dessa maneira, a raiva. na fase final da doena, freqente observar con-vulses generalizadas, que so seguidas de incoordenao motora e paralisia do tronco e dos membros.

a forma muda se caracteriza por predomnio de sintomas do tipo paralticos, sendo a fase de excitao extremamente curta ou imperceptvel. a paralisia comea pela musculatura da cabea e do pescoo; o animal apresenta dificuldade de deglutio e suspeita-se de engasgo, quando ento seu proprietrio tenta ajud-lo, expondo-se infeco. a seguir, vm a paralisia e a morte.

1.8.3 Gatosna maioria das vezes, a doena do tipo furioso, com sintoma-

tologia semelhante raiva canina.Observao: especial ateno se deve dar a outras sintomato-

logias que podem ocorrer quando a raiva em ces e gatos for trans-mitida por morcegos, fato que vem ocorrendo em algumas regies do pas.

1.8.4 Bovinosna raiva transmitida por morcegos hematfagos (Desmodus

rotundus), o perodo de incubao geralmente mais longo, com va-riao de 30 a 90 dias ou at mais. a sintomatologia predominante da forma paraltica. os animais infectados se afastam do rebanho, apresentam as pupilas dilatadas e os plos eriados. possvel obser-var, tambm, lacrimejamento, catarro nasal e movimentos anormais das extremidades posteriores. os acessos de fria so raros, poden-do se observar, no entanto, inquietao, tremores musculares e hi-persensibilidade no local da mordedura, de modo que os animais podem at provocar autodilaceraes. Com a evoluo da doena, observam-se contraes tnico-clnicas e incoordenao motora; os animais apresentam dificuldade de deglutio e param de ruminar. os sinais de paralisia aparecem entre o segundo e terceiro dia aps o

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incio dos sintomas, sendo a durao da doena, geralmente, de dois a cinco dias.

1.8.5 Outros animais domsticosa sintomatologia da raiva em eqdeos, ovinos e caprinos bas-

tante semelhante dos bovinos. depois de um perodo de excitao com durao e intensidade variveis, apresentam sintomas paralticos, que dificultam a deglutio e provocam incoordenao das extremi-dades. Muitos animais apresentam alterao de comportamento e realizam a ingesto de objetos estranhos. em sunos, a enfermidade inicia-se, geralmente, com sintomas de excitabilidade. os animais se apresentam agressivos, semelhana do que ocorre nos ces.

1.8.6 Animais silvestresa raiva ocorre naturalmente em muitas espcies de candeos

e outros mamferos. Com base em estudos epidemiolgicos, consi-dera-se que os lobos, as raposas, os coiotes e os chacais so os mais susceptveis. os morcegos (hematfagos ou no hematfagos), os mapaches e as mangostas apresentam um grau menor de suscep-tibilidade. a sintomatologia dos candeos silvestres , na maioria das vezes, do tipo furiosa, semelhante dos ces.

nos morcegos pode ocorrer uma fase de excitabilidade seguida de paralisia, principalmente das asas, o que faz que esses animais dei-xem de voar. deve-se suspeitar, portanto, de morcegos (hematfagos ou no) encontrados em locais e horas no habituais e que no sejam capazes de se desviar de obstculos interpostos sua trajetria.

Biossegurana

Captulo 2

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2.1 Classes de risco biolgicoConsideram-se agentes de risco biolgico as bactrias, os fungos,

os parasitas e os vrus, entre outros. tais agentes podem ser distribu-dos em quatro classes de risco, segundo alguns critrios:

patogenicidadedomicroorganismoinfectante;

concentrao; volume; virulncia; formao de aerossis; modos de transmisso; disponibilidade de medidas profilticas e de tratamentos efi-

cazes; endemicidade.Para a manipulao dos microorganismos pertencentes a cada

uma das quatro classes de risco, devem ser atendidos alguns requisitos de segurana, conforme o nvel de conteno necessrio.

o nvel de biossegurana 1 adequado aos laboratrios que efetuam tcnicas bsicas e envolvam agentes bem caracterizados, ou seja, que apresentam escasso risco individual e comunitrio, com pouca probabilidade de provocar enfermidades humanas ou enfer-midades de importncia veterinria nos animais.

o nvel de biossegurana 2 destinado ao trabalho com mi-croorganismos que apresentam risco individual moderado e risco comunitrio limitado. nos laboratrios so manipulados agentes pa-tognicos que podem provocar enfermidades humanas ou enfermi-dades animais, mas que tm poucas probabilidades de acarretar um risco grave para o pessoal de laboratrio, a comunidade, os animais e o meio ambiente.

o nvel de biossegurana 3 o que tem risco individual elevado e baixo risco comunitrio. Manipulam-se neste nvel agentes patog-nicos que podem provocar enfermidades humanas ou animais graves, podendo se propagar de uma pessoa infectada a outra.

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o nvel de biossegurana 4 aplicvel para laboratrios onde so manipulados microorganismos que apresentam elevado risco individual e comunitrio: trata-se de agentes patognicos que po-dem provocar enfermidades graves nas pessoas, nos animais e ainda podem se propagar facilmente de um indivduo a outro, direta ou indiretamente, sem que haja profilaxia ou tratamento.

2.2 Medidas bsicas de biosseguranaem consonncia com a classe de risco dos microorganismos

manipulados, os laboratrios devem estabelecer um programa de biossegurana que ter por finalidade aperfeioar e disciplinar os trabalhos, objetivando minimizar os riscos mediante a execuo de efetiva preveno de acidentes. de acordo com as diretrizes Gerais para o trabalho em Conteno com Material Biolgico do Minist-rio da sade, os Rhabdovirus, incluindo o vrus da raiva (amostras de vrus fixo), esto classificados como classe de risco 2, e os Rhabdovi-rus vrus da raiva (amostras de rua) esto classificados como classe de risco 3.

algumas prticas tipo padro e especiais so aplicveis aos agentes designados para o nvel de biossegurana 2:

nunca pipetar com a boca; devem ser utilizados dispositivos mecnicos.

no comer, beber ou fumar na rea de trabalho do laboratrio. no armazenar alimentos nem bebidas nas reas de trabalho. no aplicar maquiagem, nem usar adereos. Usar os equipamentos de proteo individual, como aventais

ou jalecos, protetores faciais, mscaras, culos de proteo, luvas, sapatilhas descartveis, entre outros.

Limitarourestringiroacessoaolaboratrio.

Proibiraentradadecrianasnareadetrabalhodolaboratrio.

Nopermitiraentradadeanimaisquenotenhamrelaocom os trabalhos que estejam sendo realizados.

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Realizarcuidadosamentetodososprocedimentos,afimdeminimizar a criao de borrifos ou aerossis.

Descontaminarassuperfciesde trabalhocomagentesde-sinfetantes adequados ao final do trabalho e aps qualquer vazamento ou borrifada de material vivel.

Lavarasmosapsamanipulaodemateriaisviveis,apsa remoo das luvas e antes de sair do laboratrio.

Colocar,naentradadolaboratrio,osmboloderiscobiolgico.

Descontaminarosresduosproduzidosantesquesejamdes-cartados. os materiais que devem ser descontaminados fora do prprio laboratrio devero ser colocados em recipientes prova de vazamentos e hermeticamente fechados, para que sejam transportados.

Utilizarcabinesdeseguranabiolgica,mantidasdemanei-ra adequada, sempre que sejam realizados procedimentos com elevado potencial de criao de aerossis ou quando al-tas concentraes ou grandes volumes do agente infeccioso forem manipulados.

Descartarosmateriaisperfurocortantes(taiscomoagulhas,lminas, lamnulas, tubos quebrados e outros materiais utili-zados) em recipientes de paredes rgidas, devidamente iden-tificados.

Assegurar-sedequeassadasdeemergnciaseencontremlivres de obstculos.

Manterextintoresparadiferentestiposdefogo,comseucor-respondente controle peridico, assim como ter o nmero de telefone dos bombeiros em lugar visvel.

Manteraobrigatoriedadedavacinaoanti-rbicapreventi-va para todo o pessoal de laboratrio e controlar periodica-mente o ttulo de anticorpos neutralizantes.

Colheita e envio das amostras para diagnstico laboratorial

Captulo 3

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3.1 Colheita do materiala raiva uma doena que se apresenta de forma varivel nas

diferentes espcies de mamferos, razo pela qual todo animal sus-peito deve ter o sistema nervoso central coletado e enviado, em con-dies adequadas, ao laboratrio de diagnstico, para a confirmao de uma suspeita clnica. o laboratrio de diagnstico dever receber amostras em bom estado de conservao, devidamente identificadas e com ficha de remessa de material suficientemente elucidadora.

o material para diagnstico laboratorial dever ser encami-nhado da seguinte maneira:

a) material de animais silvestres: os animais devero ser enca-minhados inteiros, de forma a permitir sua perfeita identi-ficao;

B) material de ces e gatos: dever ser encaminhado com a cabe-a inteira ou com o sistema nervoso central coletado;

C) material de bovinos, eqdeos e outros: dever ser encami-nhado com o sistema nervoso central coletado.

importante, em ces e carnvoros silvestres, a realizao do diagnstico diferencial da raiva e da cinomose. entre bovinos, a ne-cessidade do estabelecimento de um sistema de vigilncia epidemio-lgica da encefalopatia espongiforme dos bovinos (eeB) possibilita que as amostras negativas para raiva, em especial o tronco enceflico, sejam encaminhadas para os laboratrios credenciados pelo Minist-rio da agricultura, Pecuria e abastecimento.

semelhana do que ocorre com a espcie bovina, um diagns-tico negativo para raiva em eqinos que apresentaram sintomas de en-cefalites, de igual forma, exige o direcionamento dessas amostras para o diagnstico diferencial da encefalomielite eqina tipos leste, oeste e venezuelana e, mais recentemente, para febre do nilo ocidental.

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3.2 Necropsiaa sala de necropsia deve ser localizada em rea de circulao res-

trita e, se possvel, prxima rea de acondicionamento dos resduos slidos de sade. necessrio que as carcaas ou as cabeas dos ani-mais sejam colocadas em sacos apropriados para resduos infectantes e colocadas em cmara fria (-20oC) at o seu recolhimento para a inci-nerao, quando no for possvel sua descontaminao no local.

o necropsista dever ser imunizado e devidamente treinado, para a perfeita coleta do sistema nervoso central ou de seus fragmen-tos, e dever embalar corretamente o material, para que este chegue ao laboratrio em condies de ser processado e no apresente, du-rante o transporte, risco s pessoas que o manipulem.

3.2.1 Materiais para necropsia:

3.2.1.1 Equipamentos de proteo individual: toucas/gorros;

protetorfacial;

mscara;

culosdeproteo;

batascirrgicas;

aventallongooleado,deborrachaoumaterialsimilar;

luvasdeborrachacompunholongo;

botasdeborracha.

3.2.1.2 Instrumentais: morsaparacontenoadequadadacabeadoanimal;

bisturi;

facadedissecao;

serradearcoelminasparasubstituio;

cinzel;

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tesourascirrgicasdepontaretaecurva;

pinasdedissecao(dentederato);

pedradeafiar.

observao: as serras eltricas so desaconselhadas, pois pro-duzem aerossis.

3.3 Colheita da amostraPara a adequada colheita do material para o diagnstico da rai-

va, a cabea do animal deve ser fixada e os passos ilustrados a seguir devem ser obedecidos.

Figura 2. Fixao da cabea do animal para colheita do SNC

Fonte: instituto Pasteur

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Figura 3. Corte da linha mediana da caixa craniana: ao longo da linha mdia do crnio, faz-se um corte, dos olhos

at a base do crnio, que atravesse a pele e as fscias

Figura 4. Dissecao dos msculos da cabea: rebatem-se os msculos e tecidos at que se exponha a calota craniana



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Figura 5. Cortes da caixa craniana: com a serra, fazem-se dois cortes, do formen occipital ao osso frontal

Figura 6. Com a serra, fazem-se cortes longitudinais, rebatendo o osso com o cinzel e deixando o encfalo exposto



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Figura 7. Com a pina de dissecao e a tesoura se extrai o encfalo inteiro

Figura 8. Extrao completa do encfalo



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3.4 Acondicionamento e preparo da amostra para encaminhamento

a amostra deve ser encaminhada ao laboratrio em condies de refrigerao, se a previso de envio for de at 24 horas. o material deve ser colocado em um frasco com tampa de rosca, de boca larga e de capacidade maior do que o tamanho da amostra. o recipiente deve ser hermeticamente fechado, de maneira a no haver vazamento de fluidos e contaminao dos manipuladores. o frasco deve ser iden-tificado de maneira clara e visvel e ser colocado em isopor com gelo suficiente para manter a amostra refrigerada durante o transporte.

nos casos em que a previso de envio situar-se entre 24 a 48 horas, a amostra deve ser congelada e embalada da mesma forma j relatada.

em regies onde houver dificuldades para manter as amostras congeladas ou sob refrigerao, estas devem ser colocadas em uma mistura de glicerina a 50%, com salina estril tamponada, observan-do-se os procedimentos j citados em relao ao vazamento e ve-dao do frasco.

na embalagem externa, deve constar o nome do laboratrio de destino, com seu endereo completo, bem como o rgo remetente e seu endereo.

a amostra deve ser acompanhada de uma ficha de remessa com os dados epidemiolgicos.

Observao: para que o resultado laboratorial permita a r-pida adoo de aes de controle, as amostras coletadas de animais suspeitos devem ser rapidamente encaminhadas ao laboratrio de diagnstico.

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3.5 Sugesto de informaes para a ficha de remessa de amostras para o laboratrio de diagnstico de raiva

Modelo de ficha de remessa de amostras

Solicitao de exame laboratorial para diagnstico de raiva

remetente:________________________________________________________endereo:_________________________________________________________Cidade:__________________________________estado:___________________telefone: ( )_____________________________ramal:___________________Fax: ( )__________________________________________________________E-mail:____________________________________________________________

Identificao do animal:

data da coleta:____________________________________________________espcie: ( ) co ( ) gato ( ) bovino ( ) eqino ( ) outra__________________raa:_____________________sexo:_______ Cor:__________ idade:_________ ( ) Morcego (espcie)___________________Hora da coleta:________________Local da coleta:__________________________________( ) Vivo ( ) MortoProcedncia do animal:______________________________________________Proprietrio ou responsvel:__________________________________________endereo: _________________________________________________________Bairro:__________________________________telefone: ( )________________Cidade:_____________________________estado:________________________Vacinao anti-rbica: ( ) sim ( ) no n. de doses___________H pessoas agredidas ou que tiveram contato: ( ) sim ( ) no quantas:____sacrificado: ( ) sim ( ) nosinais anteriores:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

__________________________________responsvel pela solicitao

Observao: por favor, preencha a ficha com letra de forma e coloque a identificao nas amostras.

endereo para o envio da amostra: alameda rodrigues, 416 Cerqueira Csar, so Paulo (sP) CeP: 01418-000.

Diagnstico laboratorial

Captulo 4

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Quando a amostra chegar ao laboratrio, esta deve ser registrada de acordo com os critrios do setor de recepo de cada laboratrio.

4.1 Tcnica histolgica (colorao de Sellers)Consiste na colorao de impresses de diferentes pores do

sistema nervoso central com o corante de sellers e na pesquisa (por meio de microscopia tica comum) da presena de incluses patog-nomnicas da infeco rbica denominadas corpsculos de negri, que so concentraes de protenas virais que se localizam no cito-plasma da clula infectada.

as impresses de fragmentos do tecido nervoso devem ser fei-tas levemente em uma rea de 3cm2. as mesmas pores utilizadas para a impresso devem ser reservadas para a prova biolgica (em camundongos ou clulas). tal tcnica, quando realizada por profis-sional experiente, proporciona uma sensibilidade de at 90%.

4.1.1 Materiais necessrios4.1.1.1 Equipamentos: microscpiopticocomum.

4.1.1.2 Reagentes: lcoolmetlicoabsoluto;

azuldemetileno;

fucsinabsica;

leodeimerso.

4.1.1.3 Materiais diversos: lminasdevidroparamicroscopia;

placasdePetri;

esptulasdemadeira;

papis de filtro;

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tesourasepinas;

suportesparacolorao.

4.1.1.4 Corante:

Soluo-me:

azul de metileno: 10g de azul de metileno + 1.000ml de lcool metlico.

Fucsina bsica: 5g de fucsina bsica + 500ml de lcool metlico.

Preparo do corante de sellers:

2 partes da soluo de azul de metileno + 1 parte da soluo de fucsina bsica.

aps a mistura das duas solues, o corante deve ser envasado em frasco mbar com tampa esmerilhada. deixe-o maturar por 48 horas.

AjustesdocorantedeSellers:

a) aps a maturao, convm realizar uma colorao de prova.

B) se a impresso ficar avermelhada, devem ser adicionadas gotas da soluo de azul de metileno.

C) se os corpsculos de negri aparecerem com uma cor casta-nha e as clulas com um azul muito intenso, deve-se fazer o ajuste com gotas da soluo de fucsina bsica.

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4.1.2 Colorao

Quando a amostra for conservada em glicerina, os decalques produzidos sero insatisfatrios, por causa das dificuldades na ade-rncia. Para se retirar a glicerina do tecido nervoso, necessria sua lavagem com salina, agitando-se suavemente o preparo com movi-mentos rotatrios. a lavagem dever ser repetida sucessivas vezes.

a) Prepare lminas com impresses de fragmentos de hipo-campo, cerebelo, crtex e medula (figura 9). as impresses devem ser extremamente finas e, quando houver necessida-de, o excesso pode ser retirado com papel filtro.

B) submerja as lminas no corante de sellers por aproximada-mente cinco segundos (figura 10).

C) Lave as lminas, rapidamente, em gua corrente e seque-as temperatura ambiente (figura 11).

Figura 9. Preparo de impresses do sistema nervoso central em lminas


50


Figura 10. Imerso da lmina no corante de Sellers

Figura 11. Lavagem da lmina em gua corrente



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4.1.3 Leituraos corpsculos de negri (figura 12) so encontrados princi-

palmente no corno de amon (hipocampo), nas clulas de Purkinje do cerebelo e na medula. eles podem estar presentes, tambm, em um grande nmero de rgos, porm nestas estruturas geralmen-te apresentam pequeno tamanho. tais incluses so acidfilas, com granulaes basfilas.

o corante de sellers demonstra os corpsculos de negri dife-renciados com colorao arroxeada e estrutura interna azul-escura no citoplasma celular, que corado em rosa.

Quando o tecido cerebral est em decomposio, geralmente a impresso torna-se avermelhada ou azulada; porm, os corpsculos de negri mantm sua colorao.

a utilizao da colorao de sellers permite a realizao de um diagnstico diferencial entre raiva e cinomose, visto que a infeco pelo vrus da cinomose determina a formao de incluses de Lentz (figura 13), que so intracitoplasmticas ou intranucleares e basfilas e possuem estrutura homognea. ressalta-se que o vrus que causa a cinomose pertence famlia Paramyxoviridae, gnero Morbillivirus.

Figura 12. Incluses de Negri no citoplasma de neurnios infectados pelo vrus da raiva e no meio extracelular


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Figura 13. Incluses de Lentz no neurnio infectado pelo vrus da cinomose

4.2 Tcnica de imunofluorescncia diretaa tcnica de imunofluorescncia direta com utilizao de an-

ticorpos fluorescentes (imunoglobulinas anti-rbicas marcadas com isotiocianato de fluorescena = conjugado anti-rbico) se constitui em um mtodo rpido, sensvel e especfico de diagnosticar a infec-o rbica em susceptveis. a prova se baseia no exame microscpico de impresses de fragmentos de tecido nervoso tratados com con-jugado especfico e submetidos luz ultravioleta. o antgeno rbico, reagindo com o conjugado e iluminado com luz ultravioleta (com-primento de onda de 260 nanmetros), emite uma luz esverdeada fluorescente.

a sensibilidade da imunofluorescncia depende do espcime (espcie animal e grau de autlise) e da experincia do profissional de diagnstico.


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4.2.1 Materiais necessrios4.2.1.1 Equipamentos: microscpiodeimunofluorescncia;

estufabacteriolgica;

centrfugarefrigerada;

geladeira;

freezer a -200C; balana;

destilador;

timer.

4.2.1.2 Reativos: conjugadoanti-rbico;

CVS(challenge virus standard); crebrodecamundongonormal(sadio);

acetonaPA;

glicerinaPA;

cloretodesdio(NaCL);

fosfatodepotssiomonobsico(KH2Po4); fosfatodepotssiodibsico(K2HPo4); penicilinaeestreptomicinaougentamicina;

soronormaldecoelhooudeeqinonoimunizadoscontraa raiva.

4.2.1.3 Materiais diversos: pinaspequenas;

tesouraspequenas;

lminas de vidro com extremidades foscas;

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lamnulas;

pipetasdiversas;

tubosdiversos;

estantesparatubos;

papeldefiltro;

esptulasdemadeira;

cmaramida;

coplin(suporteparalminas).

4.2.1.4 Procedimentos: Identifiqueaslminas.

Cortefragmentosdasdiferentesporesdosistemanervosocentral (snC).

Toqueligeiramenteofragmentonalmina,fazendodoises-paos de aproximadamente 1,5cm2 cada, com impresses na mesma lmina.

observaes:a) Para ces e gatos, recomenda-se fazer impresses do corno

de amon (hipocampo). Para herbvoros e animais silvestres, utilize fragmentos da medula, do cerebelo e do corno de amon para as impresses.

B) Utilize os fragmentos para o preparo do inculo destinado prova biolgica.

Deixesecaralminaporaproximadamente15a30minutos.

Fixealmina,nomnimodurante30minutos,emacetonaa-20C contida em coplin (este e a acetona devem ser manti-dos permanentemente em congelador).

Retirealminadaacetonaedeixe-aescorreresecar.

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Apsasecagem,casonoutilizeaslminasprpriasparaIF,faa um crculo em torno das impresses com esmalte, para reter o conjugado.

Cubraaimpressomaisprximadaidentificaocomadi-luio a (crebro de camundongo normal + conjugado pre-viamente titulado) e a impresso mais distante com a dilui-o B (CVs + conjugado previamente titulado).

Incubeaslminaspor30minutosa37Cemcmaramida.

Enxgeaslminascomsoluosalinatamponada(pHen-tre 7,2 a 7,5), deixando-as por duas vezes submersas em sali-na durante dez minutos.

Enxgeaslminascomguadestilada,paraevitaraforma-o de cristais durante a secagem.

Sequeaslminas.

Adicioneumagotadeglicerinatamponada(pHem8,5).

Coloquelamnulasnasduasimpresses,AeB.

Estemesmoprocedimentodeveserfeitocomaslminasdecontrole (material positivo e negativo para raiva). o mate-rial utilizado para controle positivo deve ser o crebro de camundongos infectados com material de rua ou a prpria amostra original positiva.

4.2.2 Leitura das lminasnas lminas com a presena do antgeno podero ser obser-

vadas estruturas de cor verde-ma dotadas de brilho intenso. os tamanhos destas incluses podem ser variados: algumas so peque-nas (chamadas de areia ou poeira antignica) e outras apresentam o tamanho comparvel ao dos corpsculos de negri.

observao: no devero ser observadas incluses fluorescen-tes nas impresses com a diluio B (CVs + conjugado). tal proce-dimento importante para determinar a especificidade do teste e evitar o falso-positivo.

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4.2.3 Preparo do CVS (Challenge Virus Standard) Prepareumadiluioquecontenha1.000DL50/mL do vrus-

semente. Inocule0,03mL,via intracerebral,emcamundongosde21

dias com peso de 11 a 14 gramas. Coleteosistemanervosocentraldoscamundongosquando

a maioria deles estiver em fase final de paralisia (de cinco a seis dias).

Prepareumasuspensoa20%comodiluentedevrus.

Centrifugue o preparo, em condies de refrigerao, a2.500g durante dez minutos.

Coloquealquotasemfrascosapropriados,deacordocomarotina laboratorial.

Mantenhaopreparoemcondiesdecongelamento,deprefe-rncia a -70oC.

observao: o ttulo do CVs produzido no dever ser infe-rior a 105,0 dL50 / 0,03mL, lembrando-se que o ttulo de um 105,0 dL50/0,03mL significa que nesta diluio (1:100.000) temos 1dL50.

4.2.4 Titulao do CVS (trabalho)todo lote de CVs trabalho produzido dever ser titulado, para

que se verifique a viabilidade do produto.exemplo: Apartir da suspenso 1:5 (20%)do lote deCVS trabalho

produzido, faa uma diluio 1:2 e depois diluies suces-sivas de 1:10.

Inoculedezcamundongospordiluio(de11a14gramasou recm-nascidos) a partir da diluio 10-5,0 a 10-8,0.

Observeosanimaisinoculadospor15dias,anotandoon-mero de animais mortos.

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Calcule o ttulodo vruspormeiodomtododeReed&Mench.

4.2.5 Preparo do CCN (crebros de camundongos normais) Coleteosistemanervosocentraldecamundongossadios.

Prepareumasuspensoa20%comodiluentedevrus.

Centrifugueopreparo,emcondiesderefrigerao,a2.500g,durante dez minutos.

Coloquealquotasemfrascosapropriados,deacordocomarotina laboratorial.

Mantenhaopreparoemcondiesdecongelamento,deprefe-rncia a -70oC.

4.2.6 Titulao do conjugado anti-rbico Diluaoconjugado,conformeorecomendadopelolaborat-

rio produtor. Preparelminascommaterialpositivocomasidentificaes

das diluies que devem ser testadas. Prepareseparadamentediluiesduplasdoconjugadocom

CVs e CCn. Deixeopreparoreagir,temperaturaambiente,poraproxi-

madamente 15 minutos. Coreaslminas,conformedescritonatcnicadeimunofluo-

rescncia direta. Paramelhoravaliao,utilizeemcadadiluioumalmina

preparada com material negativo, alm das positivas.Quando o ttulo do conjugado anti-rbico, sugerido pelo labo-

ratrio produtor, for maior ou igual a 1:100, sugere-se que seja rea-lizada uma diluio inicial de 1:10 com soluo salina tamponada para iniciar a titulao (tal diluio poder ser aproveitada depois de estabelecido o ttulo ideal).

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sugestes de diluies para titulao:

1.) inicie a diluio em 1:2 (conjugado anti-rbico 1:10 e Cn/CVs) e continue com diluies seriadas em 1:2.

Conjugado 1:10 100l 100l 100l 100l + + + + + Cn 100l 100l 100l 100l

Conjugado 1:10 100l 100l 100l 100l + + + + + CVs 100l 100l 100l 100ldiluies 20 40 80 160


Conjugado 1:10 100l 100l 100l 100l + + + + + Cn 200l 100l 100l 100l

Conjugado 1:10 100l 100l 100l 100l + + + + + CVs 200l 100l 100l 100ldiluies 30 60 120 240


Conjugado 1:10 50l 100l 100l + + + + Cn 100l 100l 100l

Conjugado 1:10 50l 100l 100l + + + + CVs 100l 100l 100l diluies 50 100 200

1:2

1:2

1:2

1:2

1:2

1:2

1:2

1:2

1:2

1:2

1:2

1:2

1:2

1:2

1:2

1:2

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4.2.7 Avaliao do conjugado observe as lminas microscopia de fluorescncia. determine a diluio ideal, observando a presena de incluses,

sua intensidade de colorao e a inexistncia de colorao ines-pecfica (no campo com CCn + conjugado) e a total ausncia de incluses (no campo com CVs + conjugado).

a diluio determinada ser o ttulo de uso do conjugado. Man-tenha o estoque do conjugado anti-rbico acondicionado de acordo com as recomendaes do laboratrio produtor.

Figura 14. Lmina com impresso de corno de Amon de animal infectado pelo vrus da raiva corado

com conjugado anti-rbico fluorescente


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Figura 15. Lmina com impresso de cerebelo de animal infectado com o vrus da raiva corado

com conjugado anti-rbico fluorescente

4.3 Prova para isolamento do vrus rbico em camundongos (prova biolgica)

os animais de laboratrio tm sido utilizados ao longo dos anos nos estudos de anatomia, fisiologia, imunologia, virologia e outros, procedimento que tem permitido importantes avanos no desenvol-vimento da cincia e da tecnologia. a definio mais simplificada de um biotrio a de uma instalao que atenda s exigncias do bem-estar e da sade dos animais que sero criados ou mantidos. tais exigncias, alm do aspecto fsico, se devem aos procedimentos e ao manejo dos animais. atualmente, os animais utilizados em experi-mentos ou para fins de diagnstico devem atender a parmetros de qualidade gentica e sanitria, uma vez que podem ser considerados reagentes biolgicos e, como tal, os resultados dos experimentos so afetados em razo da qualidade de cada espcie animal utiliza-da. existe em mbito mundial toda uma legislao especfica para o uso de animais em experimentao. entretanto, o Brasil no possui uma legislao que efetivamente regule a criao e o uso de animais


61


para a pesquisa e o ensino em mbito nacional. apesar disso, na conduta de cada indivduo que trabalha com animais que deve haver a conscientizao de minimizar a utilizao, a dor, o sofrimento e o estresse dos animais.

o animal de eleio para o isolamento o camundongo albino suo, por ser um dos mais sensveis ao vrus rbico. o animal utili-zado deve ser de boa procedncia e apresentar bom estado sanitrio, com idade e peso adequados.

4.3.1 Materiais necessrios4.3.1.1 Equipamentos:

cabinedeseguranabiolgica;

centrfugarefrigeradacomcaapasdesegurana;

geladeira;

freezer (-20oC);balana;

destiladorousistemadepurificaodegua;

timer.4.3.1.2 Reativos:

guadestilada;

cloretodesdio(NaCl);

fosfatodepotssiomonobsico(KH2Po4);fosfatodepotssiodibsico(K2HPo4);penicilinaeestreptomicinaougentamicina;

soronormaldecoelhooudeeqino,noimunizadoscontra a raiva, ou soro fetal bovino.

4.3.1.3 Materiais diversos:gralepistilo;

tubosparacentrfuga;

62


suportesparatubos;

tesourasepinascirrgicas;

micropipetas e ponteiras para volumes de 200 a5000uL;

gaiolasparamanutenodecamundongos;

bebedourosparacamundongos;

raopeletizada,prpriaparacamundongos;

maravalha.

4.3.2 Procedimentos

Preparo da suspenso a 20% para inoculao Pese1gramadosdiferentesfragmentosdoSNC,macere-oem

gral estril e adicione ao preparo 4mL de diluente de vrus. Centrifugueopreparode2.000a3.000gdurante15minutos.

Retireosobrenadante.

Mantenhaopreparoemrefrigerao(de2a8C)parainocul-lo em camundongos, no mesmo dia, por via intracerebral (iC).

4.3.3 Inoculao em camundongos RealizeasinoculaesICemcamundongoslactentesdeat

5 dias (0,01mL por animal) ou em camundongos de 21 dias de idade com 11 a 14 gramas de peso (0,03mL por animal).

Preparefichasdeidentificaoedeleituradasamostrasquedevem ser inoculadas.

Inoculede8a10camundongosporamostra.

Realizealeituradoscamundongosinoculadosdiariamentepor 21 dias, no caso de amostras de ces e gatos, e no mnimo 30 dias, no caso de amostras de herbvoros e animais silves-tres.

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Anote,nasfichasdeleitura,arelaodosanimaismortos,do-entes e sacrificados. Colete todos os animais mortos a partir do quinto dia da inoculao e os submeta prova de iFd.

Paraainoculao,deveroserutilizadas,preferencialmente,seringas descartveis de 1mL que permitam a dosagem de 0,03mL e agulhas de calibre 13x4,5, no mximo.

Aofinaldaprova,osanimaisdeverosersacrificadoscoma utilizao de equipamentos adequados eutansia de ani-mais ou mediante a inalao de ter etlico ou clorofrmio, observando-se as boas prticas laboratoriais.

observao:1. as amostras originais recebidas para o diagnstico labora-

torial devero ser guardadas em congelador (freezer) at o trmino das provas.

2. os animais inoculados devem ser mantidos em observao em rea ou local prprio (biotrio de experimentao ou infectrio) separado das demais dependncias do laboratrio. no devem ser mantidos na rea de criao animal.

inicialmente, em 1975, as clulas BHK-21 foram utilizadas em muitos laboratrios na rotina de diagnstico, porm no apresenta-ram a mesma sensibilidade dos camundongos para a prova de isola-mento do vrus da raiva. as clulas de neuroblastoma, identificadas na American Type Culture Collection (atCC) como CCL 131, so utilizadas, atualmente, em muitos pases para o diagnstico da raiva. tal linhagem celular sensvel ao vrus de rua, sem nenhum grau de adaptao. a replicao do vrus da raiva nestas clulas revelada pela tcnica de anticorpos fluorescentes. o resultado do teste pode ser obtido a partir de 18 horas de incubao da mistura clulas + vrus (um ciclo de replicao do vrus nas clulas); porm, a leitura realizada, geralmente, aps 48 horas.

este teste to sensvel como a inoculao em camundongos e, uma vez existindo a unidade de cultivo celular no laboratrio, um teste mais econmico do que o realizado em camundongos, pois fornece resultados com maior rapidez.

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Figura 16. Camundongo inoculado com amostra positiva para raiva apresentando aerofobia

Figura 17. Camundongo inoculado com amostra positiva para a raiva apresentando paralisia



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4.4 Prova para Isolamento do Vrus Rbico em Cultivo Celular

Utilizado no diagnstico laboratorial da raiva como um se-gundo teste para confirmao dos resultados obtidos pela tcnica de imunofluorescncia direta, em casos de suspeita de raiva em ani-mais, a tcnica de isolamento e identificao viral com utilizao de clulas de neuroblastoma de camundongo (n2a) e anticorpos fluorescentes (imunoglobulinas anti-rbicas marcadas com isotio-cianato de fluorescena = conjugado anti-rbico) um mtodo mais rpido, simples e de custo menos elevado de isolamento do vrus da raiva. a tcnica se baseia na inoculao de suspenses de sistema nervoso central (snC) em placas utilizando clulas, seguida pelo exame microscpico da clula tratada com conjugado especfico e submetida luz ultravioleta. o antgeno rbico, reagindo com o conjugado e iluminado com luz ultra (comprimento de onda de 260 nanmetros), emite uma luz esverdeada fluorescente.

a sensibilidade da tcnica depende do uso de clula com boa morfologia, da experincia do profissional na realizao da tcnica e, principalmente, da leitura das placas.

4.4.1 Materiais necessrios4.4.1.1 Equipamentos:

cabinedeseguranabiolgicaclasseA,IItipo;

incubadoradeCO2 a 37C; microscpiodefluorescnciainvertido;

microscpioticoinvertido;

pipetadorautomticoparapipetasdevidro;

bombadevcuo;

banhomariapara56C;

geladeira;

freezer a -20C;

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agitadormagntico;

sistemadepurificaodegua(Milli-Q);

balanaanaltica.

4.4.1.2 Reativos:guadestilada;

tripsinaa0,2%eversenea0,02%(ATV);

aminocidosnoessenciais;

antibitico(sulfatodegentamicina);

dimethiylsulfoxide(DMSO);

conjugadoanti-rbico;

acetonaa80%;

glicerinatamponada;

reagenteparapreparodasoluosalinatamponada;

dihidrogenofosfatodesdio(NaH2Po4.H2o); di-sdiohidrogniofosfatododecahidrato

(na2HPo4.12H20); cloretodesdio(NaCl).

4.4.1.3 Materiais diversos:garrafasdeplstico;

microplacasde96wells;

micropipetadoresmulticanais(8)de20-200l;

pipetasdevidroponteiras;

tubosde1,5mLparaalicotaraminocidosegentamicina;

tuboscnicosdeplsticode50mLparaalicotarsorofe-tal bovino e atV;

becker.

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4.4.2 ProcedimentosPreparo das suspenses do SNC Prepareumasuspensodetecidocerebrala20%-0,6gde

tecido + 2,4mL de diluente (1ml de gentamicina e 20ml de soro fetal bovino, completando o preparo com quantidade suficiente para 1000ml de soluo fisiolgica a 0,85%).

Deixeoantibiticoagirpor1hora.

Centrifugueopreparopor30minutosem3000rpm(1400g)a 4C.

Separeo sobrenadante como suspensopara a inoculaoem clula.

Preparo da suspenso celular Clulas N2a mantidas no laboratrio so resuspensas em

10mL de meio (5x105 clulas/mL) contendo 10% de soro fetalbovino,30Ldeantibitico(gentamicina)acrescidode30Ldeaminocido.

Preparo da placa Emcada3orifciosdaplaca,inocule1suspensodeamostra

dequirptero,adicionando40Lpororifcio(paraasuspen-so ficar na concentrao de 4%). Juntamente com as amos-tras de rotina, tambm sero aplicados na placa um controle positivo (amostra fixa CVs) e controles negativos (somente clula e outro com crebro normal de camundongo Cn).

Em seguida, adicione160Ldemeiode cultura contendo30Ldeantibitico [3X]e30Ldeaminocidoparacada10ml de meio preparado.

Deve-sehomogeneizaromaterialadicionadonaplaca.

Emcadaorifciodaplaca,adicione100Ldasuspensoce-lular (com meio preparado igual etapa citada), na qual a clula mantida com repiques sucessivos no laboratrio.

Incubeaplacaa37CemcmaramidacomCO2 a 5% por 96 horas.

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Apsessetempo,removaomaterialdaplacautilizandoumabomba de suco.

Fixeasclulasemacetonageladaa80%(200uLpororifcio)e incube o preparo por 15 minutos em banho de gelo (a ace-tona deve ser mantida permanentemente em congelador).

Desprezeaacetona.

Sequeosorifciosdaplaca.

Acrescente40Ldoconjugadoanti-rbico(previamentetitu-lado) por orifcio e incube o preparo a 37C por 60 minutos.

Desprezeoconjugado.

Enxgeaplacaporsubmerso,3vezes,emsoluosalinatamponada pH 7,4.

Enxgeaplacaporsubmerso,3vezes,emguadestilada.

Sequeaplaca.

Adicione 50L de glicerina tamponada (pH 8,5) em cadaorifcio.

Leitura das placas

Examineasplacasemmicroscpioinvertidodeluzultravio-leta.

Nosorifcioscompresenadeantgenopoderoserobserva-das estruturas de cor verde-ma, dotadas de brilho intenso. o tamanho das incluses pode ser variado: algumas so peque-nas, chamadas de areia ou poeira antignica, e outras apresen-tam o tamanho comparvel ao dos corpsculos de negri.

observaesno devero ser observadas incluses fluorescentes nos ori-

fcios contendo os controles negativos (Cn e somente clula); este procedimento importante para determinar a especificidade do teste e evitar o falso positivo. no controle positivo (CVs), devero

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ser observadas incluses fluorescentes, sendo este procedimento im-portante para determinar tambm a especificidade do teste e evitar falso negativo.

todo o procedimento de repique celular e inoculao das sus-penses em clula deve ser realizado dentro de cabine de segurana biolgica classe a ii, exclusiva para cada um desses procedimentos. todos os materiais utilizados devem ser estreis.

4.5 Tipificao antignica pela tcnica de imunofluorescncia indireta com anticorpos monoclonais

os centros colaboradores da oMs, da opas e de instituies privadas disponibilizam, para a tipificao antignica, vrios painis de anticorpos monoclonais. Cada um dos painis tem poder de re-soluo diferente e, em funo disso, h a necessidade de adoo de um nico painel para uma regio.

o Centro Pan-americano de Zoonoses (Cepanzo)/opas e o Centers of Disease Control and Prevention (CdC), em atlanta (eUa), realizaram estudos com amostras virais isoladas nos diferentes pases das amricas durante o perodo de 1987 a 1992. Com tais dados, os referidos rgos selecionaram um painel reduzido, composto de oito anticorpos monoclonais, que permite detectar as cepas mais comuns de raiva da amrica Latina.

todos os anticorpos monoclonais foram preparados pela imu-nizao de camundongos com amostras vacinais era/sad e devem ser titulados com esses vrus ou com vrus CVs. Para os laborat-rios de diagnstico encaminhado 1mL da diluio 1:10 de cada um dos oito anticorpos monoclonais, sendo que o ttulo de trabalho dos anticorpos , aproximadamente, 1:1000. Cada um deles deve ser diludo a 1:100 em emem, com 10% de soro fetal bovino, 25mm de tampo hepes e 1mm de azida sdica. essas diluies so estveis por um ano a 4oC.

a partir dessa soluo estoque, devem ser testadas diluies se-riadas de cada um dos anticorpos monoclonais (por exemplo: 1:500; 1:1000; 1:1500) para determinar, de acordo com cada laboratrio, a diluio de trabalho. esta diluio ideal de trabalho ser estabelecida

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como a diluio na qual a intensidade de brilho seja de 3+ a 4+ para cada anticorpo monoclonal.

as lminas preparadas para o estudo das amostras devem ser providenciadas a partir do cultivo de clulas de neuroblastoma mu-rino ou de decalques a partir de crebros de camundongos infecta-dos com a amostra em teste.

decalques em lminas de amostras originais de snC podero ser utilizados desde que apresentem distribuio de antgeno rbico em 75% a 100% dos campos pesquisados por meio da iFd. ressalta-se que alguns anticorpos monoclonais podem produzir resultados variveis em decalques preparados com amostras originais de snC.

4.5.1 Materiais necessrios

4.5.1.1 Equipamentos:

microscpiodeimunofluorescncia;

estufabacteriolgica;

geladeira;

freezer (a -200C);

timer.

4.5.1.2 Reativos:

paineldeoitoanticorposmonoclonais(Mcl);

conjugadoanti-camundongo;

acetonaPA;

glicerinaPA;

cloretodesdio(NaCL);

fosfatodepotssiomonobsico(KH2Po4);

fosfatodepotssiodibsico(K2HPo4);

meiodecultura(MEM).

71


4.5.1.3 Materiais diversos:

pinaspequenas;

tesouraspequenas;

lminasdevidromarcadascomextremidadesfoscas;

lamnulas;

pipetasdiversas;

estantesparatubos;

papeldefiltro;

cmaramida;

coplin (suporte para lminas).

4.5.1.4 Procedimentos:

Preparequatrolminascomdoiscamposdeleituraouoitolminas com um s campo.

Mantenha-astemperaturaambientepor30minutos.

FixeaslminasemacetonaPAa-20oC por quatro horas ou durante toda a noite (recomenda-se a utilizao de lminas j demarcadas para iF).

Retire-asdaacetonaedeixe-assecarpor15minutos.

1. etapa

Coloque15ldadiluiodetrabalhodecadaumdosoitoanticorpos monoclonais em cada decalque.

Identifiqueaslminascomonmerodecadaanticorpomo-noclonal (1, 4, 9, 10, 12, 15, 18 e 19).

Incubeaslminasa37oC, por 30 minutos, em cmara mida.

Retire-asdaestufaelavecadalminautilizandopissetacomPBs 0,01M, pH 7,6. esta fase deve ser realizada com o m-

72


ximo cuidado, para que no haja transferncia de um an-ticorpo monoclonal de um decalque para outro, quando se utilizar dois ou mais por lmina.

Lavecadadecalqueduasvezes.

DeixeaslminassubmersasemPBS(0,01M,pH7,6)pordezminutos.

Seque-asparaaprximaetapa.

2. etapa Coloqueemcadadecalquecercade25a30ldeconjugado

anti-camundongo diludo de acordo com ttulo j estabele-cido pelo laboratrio.

Incubeosdecalquesa37oC por 30 minutos. Retiree laveosdecalquesconformeoprocedimentoante-

rior. RetireaslminasdoPBSepasse-asemguadestilada.

Sequeemonteaslminascomg

manual diagnostico laboratorial raiva 2008

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