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PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS POR MEIO DA

INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDE (ICSI)

LUIS FONSECA MATOS

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE

DARCY RIBEIRO

CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ

FEVEREIRO - 2004



LUIS FONSECA MATOS

Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Produção Animal.

Orientadores:

Prof. Dr. Reginaldo da Silva Fontes

Dr. Horst-Dieter Reichenbach

CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ

FEVEREIRO – 2004



Luis Fonseca Matos

Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Produção Animal.

Aprovada em 11 de fevereiro de 2004

Comissão examinadora:

___________________________________________________________________ Prof. ª Maria Clara Caldas Bussiere (Doutora, Fisiologia da Reprodução) - UENF

___________________________________________________________________ Prof. Francisco Aloizio Fonseca (Ph. D., Reprodução Animal) - UENF

Dr. Horst-Dieter Reichenbach (Ph. D., Reprodução Animal) - LFL (Orientador)

___________________________________________________________________ Prof. Reginaldo da Silva Fontes (Ph.D., Reprodução Animal) - UENF

(Orientador)

ii

Aos meus pais

DEDICO

iii

AGRADECIMENTOS

À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF) e ao

Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA), pelo oferecimento do

curso.

Ao Instituto Bávaro de Pesquisas Agropecuárias (LFL – Alemanha), pela

oportunidade e apoio para a realização das pesquisas.

À Fundação Estadual do Norte Fluminense (FENORTE), ao Serviço

Acadêmico de Intercâmbio Alemão (DAAD) e à Fundação Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão das bolsas

de estudo e intercâmbio.

Ao Instituto Goethe-Mannheim, pelo curso de alemão oferecido e pela

dedicação de seus funcionários aos estrangeiros.

Ao amigo e orientador Reginaldo da Silva Fontes, pela amizade, pelo

constante incentivo e pela credibilidade para realização da tese.

Ao amigo e orientador Dr. Horst-Dieter Reichenbach, pela amizade, pelo

importante auxílio nas dificuldades no dia-a-dia, durante o período de permanência

na Alemanha e pelo apoio no desenvolvimento da pesquisa científica.

Ao professor Angelo José Burla Dias, pela amizade e auxílio na correção da

tese.

À professora Célia Raquel Quirino, pelas orientações nas análises

estatísticas.

iv

Aos técnicos e colegas do Instituto Bávaro de Pesquisas Agropecuárias (LFL

- Alemanha), Myrian Weppert, Sérgio Machado, Christine Fuhrmann, Jördis Semmer,

Dr. Johannes Butikamp e Marc Boelhauve, pela amizade e apoio para a realização

das pesquisas.

Aos amigos, Georg Poettinger e Susi, pela amizade e auxílio nos problemas

do dia-a-dia.

A todos os colegas e professores do curso de pós-graduação, pelo convívio

e amizade.

A todos aqueles que, embora não tenham sido aqui citados, participaram

direta ou indiretamente na realização desta tese.

v

BIOGRAFIA

Luis Fonseca Matos, filho de Maria de Lourdes Fonseca Matos e Rubens

Matos do Couto, nasceu em 10 de novembro de 1974, na cidade do Rio de Janeiro,

RJ.

Concluiu o Curso Técnico de Química pela Escola Técnica Federal de

Campos, em 1992.

Em março de 1993, ingressou no curso de Medicina Veterinária da

Universidade Federal de Viçosa UFV/ MG, diplomando-se em dezembro de 1997.

Em março de 1998, foi admitido no curso de Mestrado em Produção Animal,

na Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos

Goytacazes, RJ, obtendo o título de Mestre em Produção Animal em fevereiro de

2000.

Foi admitido, em março de 2000, no curso de Pós-graduação em Produção

Animal, Doutorado, na área de Melhoramento Genético e Biotecnologia da

Reprodução, da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos

dos Goytacazes, RJ, submetendo-se à defesa de tese para conclusão do curso em

fevereiro de 2004.

vi

CONTEÚDO

TABELA DE ABREVIATURAS ................................................................................vii RESUMO ....................................................................................................................ix ABSTRACT ................................................................................................................xi

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................1 2. REVISÃO DE LITERATURA ..............................................................................3 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................20 4. TRABALHOS ....................................................................................................34

4.1 Preparo de oócito bovino para Injeção Intracitoplasmática de

Espermatozóide ...................................................................................35 4.2 Efeito do pré-tratamento espermático e da ativação oocitária no

desenvolvimento embrionário após a ICSI ..........................................59 4.3 Fertilização e desenvolvimento embrionário após a ICSI em oócitos

bovinos com piezo-manipulador ..........................................................84

5. CONCLUSÕES GERAIS ................................................................................111

vii

TABELA DE ABREVIATURAS

ANOVA Análise de variância

µg Micrograma

µl Microlitro

µm Micrômetro

µM Micromolar

ATAB Brometo de alquiltrimetilamônio

bAML Amelogenina bovina

bp Pares de base

BSA Albumina sérica bovina

CHX Ciclohexamida

CIV Cultivo in vitro

COC Complexo cumulus-oócito

CP Corpúsculo polar

CSF Fator citostático

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Ácido desoxirribonucléico

DTT Ditiotreitol

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

FSH Hormônio folículo estimulante

g Grama

GV Vesícula germinativa

GVBD Ruptura da vesícula germinativa

h Hora

HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfônico

viii

ICSI Injeção intracitoplasmática de espermatozóide

IP3 Inositol trifosfato

kDa Quilodalton

l Litro

LH Hormônio luteinizante

MAPK Proteína quinase ativada por mitógeno

mg Miligrama

MI, MII Metáfase I, Metáfase II

min Minuto

MIV Maturação in vitro

ml Mililitro

mm Milímetro

mM Milimolar

mPBS PBS modificado

MPF Fator promotor da meiose

MPM Meio de Parker modificado

ºC Graus Celsius

OCS Soro de vaca em estro

OPU Ovum Pick-up (aspiração folicular guiada por ultra-som)

p34cdc2 Subunidade catalítica do MPF de 34 kDa

PBS Tampão salina-fosfato

PCR Reação de polimerase em cadeia

PIV Produção in vitro

PK Proteinase K

PVP Polivinilpirrolidona

SDS Duodecilsulfonato de sódio

Seg. Segundos

SOF Fluido sintético de oviduto

TALP Tyrode Albumina-Lactato-Piruvato

TAMRA 6-Carboxitetrametilrodamina

TCM Meio de cultivo de tecido

xg Força gravitacional

6-DMAP 6-Dimetilaminopurina

ix

RESUMO

MATOS, Luis Fonseca. D. S., Universidade Estadual do Norte

Fluminense Darcy Ribeiro; fevereiro de 2004; Produção in vitro de

embriões bovinos por meio da Injeção Intracitoplasmática de

Espermatozóide (ICSI); Orientadores: Prof. Reginaldo da Silva Fontes e

Dr. Horst-Dieter Reichenbach.

O desenvolvimento e a aplicação de novas biotecnologias da reprodução na

produção animal, com a finalidade de intensificar a propagação de animais

geneticamente superiores, é de grande interesse econômico para a pecuária

brasileira. O congelamento de sêmen e a inseminação artificial têm sido usados

mundialmente nas últimas décadas, devido à sua simplicidade e a ótimos resultados,

como uma forma para a disseminação do potencial genético de machos de alto

valor. A transferência de embriões (TE) e a aspiração folicular (OPU), associada à

produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, também têm sido utilizadas com

sucesso nos últimos anos para a comercialização e propagação do material genético

feminino. Uma técnica alternativa à fertilização in vitro (FIV) convencional é a

Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide (ICSI), que consiste na injeção de

um único espermatozóide no interior do citoplasma do oócito com o auxílio de

micromanipuladores. A ICSI pode ser utilizada como uma importante ferramenta

para a produção de embriões quando poucos espermatozóides viáveis estão

x

disponíveis ou quando os espermatozóides apresentam baixa capacidade

fecundante, como por exemplo, no caso de sêmen pré-sexado. Outras aplicações da

ICSI incluem a reprodução de espécies em extinção e a produção de animais

transgênicos. Entretanto, diferentemente de humanos e de outras espécies de

mamíferos, não ocorre uma adequada ativação dos oócitos bovinos após a

microinjeção e poucos são os trabalhos que relatam o nascimento de bezerros após

a transferência de embriões bovinos obtidos por meio de ICSI. O presente estudo

teve por objetivo avaliar o efeito de diferentes metodologias de preparo de oócitos,

pré-tratamentos de espermatozóides, protocolos de ativação química de oócitos e

procedimentos de microinjeção no desenvolvimento embrionário após a ICSI em

oócitos bovinos. A taxa de formação de pronúcleos, clivagem e formação de

blastocistos de oócitos desnudados por diferentes protocolos foram comparadas

com aquelas obtidas por meio da FIV convencional. Os resultados do presente

estudo confirmam que, embora o desnudamento dos oócitos seja necessário para a

ICSI, este procedimento influencia negativamente a capacidade de desenvolvimento

dos embriões. Taxas aceitáveis de clivagem e de blastocistos podem ser obtidas

usando pré-tratamentos espermáticos combinados com diferentes protocolos de

ativação oocitária. Entretanto, os efeitos deletérios destes tratamentos no

desenvolvimento embrionário e fetal devem ser investigados em novos estudos. A

avaliação da fertilização por meio da sexagem e análise de microsatélites dos

embriões permitiu concluir que o uso do piezo-micromanipulador fornece taxas mais

altas de fertilização em relação à ICSI convencional, por garantir uma correta

microinjeção do espermatozóide. A viabilidade da produção in vitro de embriões

bovinos por ICSI-Piezo foi demonstrada no presente estudo. Contudo, mais estudos

são necessários para investigar os efeitos dos procedimentos envolvidos (maturação

in vitro, desnudamento e micromanipulação) nos eventos celulares que ocorrem

durante a fertilização, para melhorar os resultados em termos de gestações e

verificar a normalidade dos bezerros produzidos.

Palavras-chave: ativação oocitária, bovino, desnudamento, fertilização in vitro, ICSI,

Piezo-manipulador.

xi

ABSTRACT

The development and application of new biotechnologies of reproduction in

the animal production to improve the propagation of genetically valuable animals is of

great economic interest to Brazil’s cattle industry. Semen cryopreservation and

artificial insemination have been used worldwide in the last decades, due its

simplicity and excellent results, as a way to disseminate the genetic potential of

valuable male animals. Embryo transfer (ET) and ovum pick-up (OPU) associated to

the in vitro production technique (IVP), have been commercially applied with success

in the last years to the propagation of genetic material of superior females. An

alternative technique to the conventional “in vitro fertilization method” (IVF) is the

Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI). This technique consists of injecting only

one sperm inside the oocyte cytoplasm using micromanipulators. The ICSI can be

applied as an important tool to embryo production when only few viable sperms are

available or sperms shows low fertilization capacity, as for example, the ones derived

from sexed semen. Other applications include the dissemination of endangered

species and the production of transgenic animals. However, differently from human

beings and other mammals species, an adequate activation usually does not occur

following sperm microinjection into bovine oocytes, and there are only few reports of

calves born after transfer embryos obtained by ICSI. The aim of the present study

was to evaluate the influence of different methods of oocyte preparation, sperm

pretreatments, chemical activation protocols and microinjection procedures on

embryo development after ICSI into bovine oocytes. The pronuclei formation results

xii

and the cleavage and blastocyst rates with different denudation protocols were

compared to those of conventional IVF using denuded oocytes. The results of the

present study confirm that although the denudation is essential for ICSI, this

procedure negatively influences the embryo developmental capacity to blastocysts.

Acceptable cleavage and blastocyst rates could be obtained by sperm pretreatments

combined with different oocyte activation protocols. However, deleterious effects of

treatments on the embryonic and fetal development should be investigated in further

studies. The evaluation of the oocyte fertilization by embryo sexing or by

microsatellite analysis allowed us to conclude that the use of the piezo-

micromanipulator to the microinjection permits higher fertilization rates in comparison

to the conventional method, as a result of a correct sperm injection procedure. The

viability of in vitro production of bovine embryos by piezo-ICSI was showed in the

present study. However, further studies are necessary to investigate the effects of the

involved procedures (in vitro maturation, denuding and micromanipulation) on the

cellular events that occur during fertilization, in order to improve the results of

pregnancies and to verify the normality of produced calves.

Key words: bovine, denudation, ICSI, in vitro fertilization, oocyte activation, Piezo-

micromanipulator

1

1. INTRODUÇÃO

A fertilização in vitro (FIV) de oócitos bovinos é uma metodologia

estabelecida há alguns anos, com o nascimento do primeiro bezerro oriundo de FIV

em 1981, a partir de sêmem capacitado in vivo (Brackett et al., 1982). Já o

nascimento do primeiro bezerro a partir da maturação, fertilização e cultivo in vitro

(MIV, FIV e CIV) ocorreu em 1987 (Fukuda et al., 1990).

A produção de embriões in vitro (PIV) é uma biotecnologia que permite a

intensificação do uso de animais de alto valor genético. Alguns estudos têm

demonstrado a viabilidade do emprego da PIV em combinação com a aspiração

folicular guiada por ultra-som (OPU), com resultados comparáveis ou superiores

àqueles obtidos pela tecnologia tradicional de transferência de embriões (Kruip et

al., 1994, Troppmann, 2000; Merton et al., 2003). Contudo, as taxas médias de

blastocistos obtidos in vitro ainda não atingiram valores ideais para que esta

biotecnologia seja utilizada mais intensamente de forma comercial, devendo-se

levar em consideração que a qualidade e a viabilidade dos embriões obtidos por PIV

são inferiores a dos embriões obtidos in vivo (Reichenbach, 2003).

Uma técnica alternativa à FIV convencional é a Injeção Intracitoplasmática

de Espermatozóide (ICSI), que consiste na injeção de um único espermatozóide no

interior do citoplasma do oócito com auxílio de micromanipuladores, visando à sua

fertilização.

2

Em 1976, Uehara e Yanagimachi relataram que células espermáticas

humanas desenvolviam-se em pronúcleo masculino quando injetadas no citoplasma

de oócitos de hâmster. A partir de então, o nascimento de diversas espécies de

mamíferos por meio da ICSI tem sido relatado, incluindo coelhos (Hosoi et al.,

1988), camundongos (Kimura e Yanagimachi, 1995; Kuretake et al., 1996), suínos

(Martin, 2000; Probst et al., 2002), ovinos (Catt et al., 1996), eqüinos (Cochran et al.,

1998), primatas não-humanos (Hewitson, et al., 1999), humanos (Palermo et al.,

1992) e bovinos (Goto et al., 1990; Hamano et al., 1999; Horiuchi et al., 2002; Wei e

Fukui, 2002).

Uma vez que a ICSI permite o uso de espermatozóides imóveis, de baixa

capacidade fecundante ou disponíveis em número limitado (Heuwieser et al., 1992b),

esta técnica poderá ter grande aplicabilidade na reprodução da espécie bovina para

a FIV com espermatozóides pré-sexados (Hamano et al., 1999), na maximização do

uso de sêmen de alto valor (Oikawa et al., 2001) e para a produção de animais

transgênicos.

Devido à interdependência das diferentes etapas laboratoriais e da

variabilidade dos resultados da ICSI, o progresso desta tecnologia depende da

compreensão dos eventos celulares seguintes à introdução do espermatozóide,

como a ativação oocitária, a participação das estruturas espermáticas no processo

de fertilização e os fatores reguladores das divisões celulares iniciais, para que se

possa aumentar o número de embriões viáveis ao final do processo.

O presente estudo teve por objetivo identificar os métodos e tratamentos

mais adequados para a fertilização in vitro de oócitos bovinos por meio da ICSI,

visando a obter uma elevada taxa de embriões após o cultivo in vitro.

3

2. REVISÃO DE LITERATURA

Maturação oocitária

A maturação representa o estádio final da preparação do oócito para a

fecundação,no qual o oócito progride do estádio de Diplóteno a Metáfase II.

Mudanças estruturais e bioquímicas que ocorrem durante esse período são

necessárias para que o processo seja completo. O oócito completa a Meiose em

resposta ao pico pré-ovulatório de LH (Callesen et al., 1986) ou em decorrência de

sua remoção do folículo (Pincus e Enzmann, 1935).

A maturação oocitária pode ser dividida em maturação nuclear e maturação

citoplasmática, que devem ocorrer simultaneamente e que conferem aos oócitos a

capacidade de serem fecundados e ao mesmo tempo, realizarem o bloqueio da

polispermia durante a fertilização (Dode et al., 2000).

Os eventos nucleares iniciam-se com o rompimento do envoltório do núcleo

do oócito (quebra da vesícula germinativa – GVBD), quando o envelope nuclear e

sua porção interna, a rede fibrilar da lâmina, começam a se dissolver. Então, os

cromossomos condensam-se e os cinetócoros aparecem, com os microtúbulos

formando a placa metafásica da MI. A separação dos cromossomos homólogos e a

sua migrgação para os respectivos pólos ocorrem durante a Anáfase I. Durante a

telófase I, os cromossomos que se encontram em cada pólo são recobertos pela

membrana nuclear. A segunda divisão meiótica sem a replicação dos cromossomos

ocorre imediatamente e o oócito atinge a metáfase II (Kubelka et al., 1988).

4

Durante a maturação, também ocorrem importantes mudanças na

organização citoplasmática, tais como um contínuo desenvolvimento dos estoques

de lipídios, redução do aparelho de Golgi, aparecimento de vários ribossomos

adjacentes aos cromossomos, rearranjo das mitocôndrias e alinhamento dos

grânulos corticais próximos à membrana plasmática (Dieleman et al., 2002).

Fertilização e ativação oocitária

A ativação oocitária compreende a retomada da meiose desencadeada pela

fusão e penetração do espermatozóide durante a fertilização, resultando no

processo final da fertilização pela extrusão do segundo corpúsculo polar e formação

dos pronúcleos masculino e feminino (Rüsse e Sinowatz, 1991).

Durante a fertilização, o espermatozóide promove uma onda de

despolarização da membrana plasmática do oócito de mamíferos em MII, que leva a

uma alteração de sua permeabilidade com troca de Na+ extracelular por íons H+

intracelular. Estas mudanças estão relacionadas ao aumento intracelular dos íons de

cálcio livres (Ca+2), em uma série de picos, que têm um importante papel no

processo de ativação oocitária (Sun et al., 1992).

Duas hipóteses têm sido propostas para explicar o mecanismo pelo qual o

espermatozóide inicia a oscilação de Ca+2 (Whitaker e Swann, 1993). A primeira

hipótese sugere a presença de um receptor espermático na membrana plasmática

do oócito. Este receptor é postulado de ser um receptor G-proteína ou um receptor

tirosina-quinase acoplado a uma fosfoinositidase que, por sua vez, estimula a

produção de inositol-1,4,5-trisfosfato (IP3), um composto liberador de Ca+2. A

segunda hipótese propõe que o espermatozóide introduz no oócito, após a fusão

com a membrana, um fator solúvel que inicia as oscilações de Ca+2. Foi

demonstrado que a injeção de extrato de espermatozóide de várias espécies em

oócitos de mamíferos induz a ocorrência de repetidos picos de Ca+2, que são muito

próximos àqueles associados à fertilização (Swann, 1990, 1994; Wu et al., 1997).

Os eventos desencadeados pela ativação oocitária incluem a exocitose de

grânulos corticais, o decréscimo da atividade da histona H1-quinase, o reinício da

meiose, a extrusão do segundo corpúsculo polar, a formação de pronúcleos, a

síntese de DNA e a clivagem para o estádio de duas células (revisto por Mayes,

2002).

5

A mobilização de cálcio intracelular é seguida de um influxo do ambiente

extracelular. O cálcio promove modificacões das proteínas do oócito por estimulação

das vias de fosforilação, de desfosforilação ou por ativação de proteases. Cada

parte do ciclo celular é regulado pela ligação e subseqüente ativação de uma

proteína quinase, específica para uma ciclina complementar correspondente.

Os oócitos ovulados ou maturados in vitro encontram-se na sua maioria em

metáfase da segunda divisão meiótica (MII). Os oócitos são mantidos em MII pelo

MPF-Fator promotor da maturação (um dímero composto pela Ciclina B e pela

quinase p34cdc2) e por níveis elevados do CSF (Fator Citostático) (Motlik et al.,

1996). O fator citostático compreende diferentes componentes, entre eles a Proteína

c-mos ou a MAP-quinase (proteína associada a mitógeno). O aumento transitório de

cálcio intracelular, que ocorre seguindo a fertilização, promove a ativação da

calmodulina-quinase pela estimulação da calmodulina, resultando na destruição da

ciclina B e no decréscimo na atividade da quinase MPF, fazendo com que o oócito

saia da metáfase (Yang, 1994; Whitaker, 1996).

Descondensação espermática e formação de pronúcleos

Após a penetração do espermatozóide no citosplama do oócito, inicia-se a

descondensação do DNA e ocorre o aumento do volume da cabeça pela entrada de

líquido, desenvolvendo-se o pronúcleo masculino. Acredita-se que a

descondensação do espermatozóide esteja intimamente relacionada com o ciclo

celular do oócito e com o conteúdo de determinados fatores, sendo sugerida a

existência de um fator oocitário promotor da descondensação do núcleo do

espermatozóide (Sperm nuclear swelling factor - SNDF) (Ohsumi et al., 1986,

Dozotsev et al., 1997).

Após a extrusão do segundo corpúsculo polar, é formado, no oócito, o

pronúcleo feminino, com um conjunto haplóide de cromossomos. Possivelmente,

existem diferentes fatores para a formação do pronúcleo feminino e masculino

(Chian et al., 1992; Dorzotsev et al., 1995). Com a fusão dos dois pronúcleos e a

duplicação dos cromossomos maternos e paternos na placa equatorial, completa-se

o último processo da fertilização, dando início às divisões celulares para o

desenvolvimento embrionário inicial (Rüsse e Sinowatz, 1991).

6

Aplicações da ICSI

Reprodução assistida em medicina humana

Em humanos, a ICSI tem sido utilizada para o estudo básico dos eventos

celulares decorrente da interação de gametas durante a fertilização (Perreault et al.,

1988; Goto et al., 1990; Dorzotsev et al., 1997) e para pesquisas aplicadas, com

bons resultados no tratamento de subfertilidade masculina. Em 1992, Palermo et al.

obtiveram 5 gestações e o nascimento de 4 crianças após a transferência de

embriões produzidos por ICSI. Em média, taxas de fertilização em procedimentos de

rotina de ICSI em humanos situam-se em 70 %, aproximadamente (Payne et al.,

1995).

Intensificação do processo de produção de embriões in vitro

A ICSI pode ser empregada como uma importante ferramenta para a

produção in vitro de embriões de mamíferos. Uma grande vantagem da ICSI reside

na possibilidade de permitir o uso de espermatozóides que não seriam capazes de

fertilizar o oócito pela FIV convencional. A ICSI pode desta forma ser utilizada

quando um pequeno número de espermatozóides está disponível ou quando estes

se apresentam imóveis, sem cauda ou com lesões de membrana (Parrish et al.,

1986; Goto et al., 1991, 1993; Catt et al., 1996; Hamano et al., 1999).

A ICSI também torna possível a utilização de gametas masculinos em

estádios iniciais de desenvolvimento. O uso de espermátide ou núcleo de

espermátide para produção de blastocistos por meio da ICSI foi descrito em

algumas espécies de animais domésticos como camundongos (Kimura et al., 1998),

hâmster (Ogura e Yanagimachi, 1995), suínos (Kim et al., 1999) e bovinos (Goto et

al, 1996).

Associada à punção folicular (OPU) guiada por ultra-som para a produção in

vitro de embriões bovinos, a ICSI poderá ser utilizada como uma alternativa para que

sejam alcançadas altas taxas de desenvolvimento embrionário (Oikawa et al., 2001).

Além disso, a ICSI pode trazer aplicações promissoras no campo da reprodução de

animais em risco de extinção, onde a fertilização in vitro ainda não foi estabelecida

para a obtenção de bons resultados.

7

Contudo, na literatura, há relatos de que as taxas de clivagem e de

desenvolvimento embrionário de oócitos bovinos microinjetados são mais baixas que

as de outras espécies. Taxas de fertilização sem ativação química dos oócitos são

particularmente altas em humanos (40 a 70%) (Devroey et al., 1994; Lundin et al.,

1994), mas inferiores a 20% em alguns trabalhos realizados na espécie bovina

(Westhusin et al., 1984; Keefer et al., 1990; Goto, 1993). Assim, em contraste à

reprodução assistida em humanos, a ICSI em bovinos ainda não alcançou aplicação

prática, devido à baixa eficiência na produção de gestações e nascimentos por meio

desta técnica em relação à FIV convencional.

Produção de animais com sexo pré-determinado

Técnicas de separação espermática em frações enriquecidas em

espermatozóides X ou Y (Cran et al, 1995; Merton et al, 1997, Rens et al., 1998;

Johnson e Welch, 1999) vêm sendo desenvolvidas nos últimos anos, porém os

resultados até então obtidos têm sido insuficientes para a rotina na inseminação

artificial ou na fertilização in vitro, uma vez que parte dos espermatozóides sofre

perda da capacidade fecundante durante o processo de separação.

A associação da ICSI com a sexagem de espermatozóides também tem sido

objeto de estudo em bovinos, podendo vir a ser uma alternativa promissora para a

produção in vitro de embriões sexados de animais domésticos (Medvedev et al.,

1997; Hamano et al., 1999; Seidel et al., 1999). O controle da razão de nascimento

entre machos e fêmeas, obtendo-se animais de sexo selecionado de acordo com as

necessidades produtivas de cada setor, contribuirá para a intensificação do processo

de melhoramento genético ou produção comercial.

Produção de animais transgênicos

A ICSI tem sido aplicada com sucesso na produção de animais transgênicos

como camundongos (Perry et al., 1999), sendo o espermatozóide utilizado como o

carreador de fragmentos de DNA exógeno. Neste caso, o espermatozóide é tratado

para permeabilização da membrana por meios físicos ou químicos, antes da

incubação com plasmídeos de DNA, sendo as cabeças isoladas de espermatozóides

microinjetadas junto com o DNA exógeno para a fertilização dos oócitos (revisto por

Gandolfi et al., 2000).

8

Situação atual da ICSI em bovinos

Diferentemente de outras espécies, a ICSI com espermatozóides bovinos

raramente leva à sua descondensação e formação de pronúcleo durante o

subseqüente cultivo in vitro (Westhusin et al., 1984; Perreault et al., 1988; Catt e

Rhodes, 1995). Atualmente, pouco se sabe sobre os eventos celulares que ocorrem

no processo de fertilização de oócitos bovinos para que ocorra o correto

desenvolvimento embrionário após a ICSI. Até o momento, conforme a literatura

disponível, somente quatro trabalhos relatam o nascimento de bezerros após a

transferência de embriões bovinos obtidos por meio de ICSI (Tabela 1).

Tabela 1. Nascimento de animais após a transferência de embriões obtidos por meio da ICSI em oócitos bovinos

Referência: Blastocisto/ oócito

injetados (%)

Embriões /

receptoras

Taxa de

gestação (%)

Nº animais

nascidos.

Goto et al., 1990 9/ 115 (8) 2-4/ receptora 2/ 3 (67) 2

Hamano et al., 1999 63/ 909 (7) 48/ 48 10 / 48 (21) 10

Horiuchi et al., 2002 70/ 491 (14) 10/ 10 5/ 10 (50) 5

Wei e Fukui, 2002 54/ 238 (23) 8/ 7 4/ 7 (57) 5

Fatores que podem influenciar os resultados da ICSI

Inúmeros fatores podem afetar diretamente os resultados da ICSI, uma vez

que esta técnica envolve uma intensa manipulação dos oócitos, com constantes

mudanças de meio, deixando-os mais expostos a variações de pH e de temperatura.

Além disso, uma série de eventos que ocorrem durante a fertilização convencional,

necessários para a capacitação espermática, reação acrossomal, penetração do

espermatozóide e ativação dos oócitos bovinos, não ocorrem quando se realiza a

microinjeção do espermatozóide e, por isso, alguns procedimentos laboratoriais são

realizados na tentativa de simular tais eventos artificialmente.

9

Condições de maturação dos oócitos

Sabe-se que o tipo de maturação (in vivo vs in vitro) tem efeito direto na

competência dos oócitos para a FIV (Greve et al., 1987). Leibfried-Rutledge et al.

(1987) observaram que a formação de pronúcleo masculino foi significativamente

menor em oócitos maturados in vitro (69%) quando comparados com oócitos

maturados in vivo (88%). Da mesma forma, oócitos maturados in vivo são mais

facilmente ativados do que oócitos maturados in vitro, sem o uso de agentes

estimulantes, após a injeção de espermatozóides imobilizados (Heuwieser et al.,

1992a).

O aumento do tempo de maturação (de 18-22 h para 22-26 h) exerce um

efeito positivo nas taxas de ativação por agentes químicos ou de clivagem dos

oócitos fertilizados in vitro (Presicce e Yang; 1993; Shi et al., 1993). Esta maior

facilidade de ativação dos oócitos maturados por mais tempo estaria relacionada a

um “envelhecimento” do oócito, o que levaria a uma redução da atividade do MPF.

Contudo, com o aumento do período de maturação para 26 a 32 horas, podem

ocorrer danos ao citoesqueleto, que comprometem o posterior desenvolvimento

embrionário (Presicce e Yang, 1993; Chian et al., 1992).

A composição do meio utilizado para a maturação in vitro também é de

grande importância para que os oócitos venham adquirir competência para a

fertilização e desenvolvimento a blastocisto. Fatores químicos relacionados à

ativação oocitária e formação de pronúcleos são sintetizados no citoplasma do

oócito ou transferidos pelas células do cumulus durante a maturação (Mori et al.,

2000). Um exemplo dessas substâncias essenciais para os eventos celulares que

envolvem a maturação citoplasmática é a glutationa.

A glutationa é um tripeptídeo tiol, com importante papel de agente redutor,

que combate os danos oxidativos de radicais livres presentes no meio (De Matos e

Furnus, 2000). A concentração da glutationa citoplasmática varia de acordo com o

estádio do ciclo celular do oócito, ocorrendo um aumento de sua concentração

durante a maturação e um decréscimo algumas horas após a fertilização (Miyamura

et al., 1995). A concentração de glutationa do oócito pode ser aumentada através da

transferência direta pelas células do cumulus via junções Gap em oócitos de suínos

(Mori et al., 2000) ou pela transferência de compostos tiol como cistina, cisteína ou

beta-mercaptoetanol, que servem de precursores para síntese de glutationa

10

(Yoshida et al., 1993; Caamaño et al., 1996; Abeydeera et al., 1998; De Matos e

Furnus, 2000).

Embora a glutationa presente no interior do ovócito esteja supostamente

envolvida na formação do pronúcleo masculino pela redução de pontes dissulfídicas

do núcleo espermático durante a fertilização (Funahashi et al., 1994; Miyamura et al.,

1995; Sutovsky e Schatten, 1997), não se conhecem os efeitos da sua adição ao

meio de maturação de oócitos a serem submetidos à ICSI.

Preparo dos oócitos para a ICSI

Normalmente, as células do cumulus precisam ser retiradas dos oócitos

após a maturação para que os procedimentos de micromanipulação sejam

realizados de forma mais precisa. Contudo, sabe-se que a remoção das células do

cumulus antes da fertilização in vitro pode afetar negativamente a sua ocorrência

(Sirard, 1988; Hashimoto, 1998; Cox et al. 1993).

O efeito positivo da presença das células do cumulus durante as fases

iniciais de fertilização e de desenvolvimento embrionário in vitro pode ser decorrente

da ação direta no processo de capacitação espermática e reação acrossomal (Fukui,

1990) e da sua ação indireta de redução de radicais livres presentes no meio

(Hashimoto et al., 1998). Portanto, apesar de o processo de fertilização pela ICSI

não requerer a presença das células o cumulus para facilitar a penetração dos

espermatozóides, o método utilizado para o desnudamento pode ter efeitos

deletérios para o desenvolvimento embrionário, seja pela ação das enzimas

empregadas ou pela ação física utilizada para a remoção destas células.

Além do desnudamento, outro procedimento realizado para o preparo dos

oócitos para a micromanipulação é a centrifugação, que visa a tornar o citoplasma

mais claro, permitindo a observação da pipeta e do local de deposição do

espermatozóide durante a ICSI (Chung et al., 2001). Tem sido demonstrado que a

centrifugação tem pouco efeito deletério no desenvolvimento de zigotos (Wall et al.,

1985) podendo, porém, causar a ativação partenogenética dos oócitos quando

realizada a altas velocidades, acima de 10.000xg (Chung et al., 2001).

Os oócitos a serem submetidos à ICSI ou Transferência Nuclear (TN)

normalmente são previamente selecionados pela presença do primeiro corpúsculo

polar (CP) no espaço perivitelínico. A visualização do CP serve para a localização da

11

placa metafásica, seja para a introdução da pipeta para ICSI ou para a remoção do

material genético, no caso da TN (Palermo et al., 1996). A presença do primeiro CP

também serve de parâmetro para avaliação do sistema de maturação in vitro,

entretanto, esta seleção não é uma garantia de que os oócitos apresentam

competência para o desenvolvimento embrionário.

Pré-tramentos espermáticos

Os motivos exatos que levam às diferenças dos resultados na ICSI entre as

espécies não estão totalmente esclarecidos e supõe-se que estejam relacionados

com o grau de condensação dos espermatozóides e/ ou competência oocitária para

a descondensação destes.

Capacitação e reação acrossomal dos espermatozóides para ICSI

A capacitação e a reação acrossomal aparentemente não são processos

essenciais para o desenvolvimento de embriões após a ICSI (Hewieser et al., 1992).

Contudo a utilização de espermatozóides capacitados pode levar a taxas superiores

de fertilização (Westhusin et al., 1984). Componentes espermáticos que pela

fertilização normal não são introduzidos no ooplasma (enzimas acrossomais,

membrana plasmática do espermatozóide) podem prevenir a ativação completa do

oócito (Horiuchi et al., 2002).

Pré-tratamentos físicos de espermatozóides para ICSI

Em bovinos, a cromatina espermática encontra-se altamente condensada,

devido ao maior grau de substituição de histonas por protaminas, que apresentam

maior número de ligações dissulfídicas (Seligman et al., 1991, Katayose et al., 1999).

Foi descrito que o espermatozóide bovino descondensa-se com menor freqüência

quando submetido a agentes redutores em comparação ao espermatozóide de

outras espécies, necessitando de mais tempo para desenvolver-se em pronúcleo

masculino (Quian et al., 1996). A microinjeção em oócitos de hamster rapidamente

conduz à descondensação do núcleo de espermatozóides humanos, de

camundongo, chinchila e hamster, porém espermatozóides de rato e bovinos

descondensam-se mais dificilmente (Perreault et al, 1988).

12

Existem fortes evidências de que, em humanos e em outras espécies de

mamíferos, a ativação oocitária que ocorre nos oócitos microinjetados é mediada por

um fator espermático ativador do oócito (SAOAF), supostamente liberado após o

início da descondensação espermática (Tesarik et al., 1994, Rybouchkin et al., 1995;

Parrington et al., 1996).

A liberação do SAOAF estaria condicionada a danos da membrana

espermática que favoreceriam a sua liberação para o oócito, uma vez que não

ocorre na ICSI a fusão de membrana do espermatozóide e a membrana plasmática

do oócito (Swann et al., 1994). Acredita-se que o espermatozóide bovino tenha o

mesmo fator espermático (SAOAF) que os espermatozóides de outras espécies

(Parrington et al., 1996; Katayose et al., 1999), porém, é possível que a

concentração deeste fator varie entre as células ou que a sua liberação seja de

alguma forma comprometida em bovinos pela ICSI.

Dozortsev et al. (1997) propuseram, entretanto, a existência de um fator de

descondensação do núcleo espermático (SNDF), uma substância presente no oócito

com participação na descondensação do núcleo do espermatozóide após a sua

penetração. De forma semelhante ao mecanismo sugerido para a ação do SAOAF,

foi proposto que a membrana do espermatozóide deveria sofrer uma lesão parcial

antes da microinjeção, para o SNDF entrar em contato com o núcleo do

espermatozóide e, assim, ocorrer a liberação do SAOAF.

Um dos procedimentos mais utilizados para esta lesão é o toque ou a

quebra da cauda do espermatozóide com a pipeta de injeção. Acredita-se que o

espermatozóide móvel também possa causar o rompimento do fuso pela

movimentação da cauda. Devido à facilidade de descondensação dos

espermatozóides humanos e aos bons resultados obtidos por esta técnica, este tem

sido basicamente o tratamento dos espermatozóides mais utilizado quando se

realiza ICSI em oócitos humanos (Dorzotsev et al., 1995a,b).

Outros métodos mais agressivos para a lesão da membrana espermática

também vêm sendo realizados, obtendo-se bons resultados, incluindo a remoção

artificial do acrossoma e da cauda por sonicação (Keefer, 1989; Goto, 1993; Tateno

et al., 2000) e a lesão da membrana espermática por congelamento e

descongelamento antes da injeção (Parrish et al., 1986; Goto et al., 1990; Goto,

1993; Keefer et al., 1990).

13

Agentes químicos para pré-tratamentos de espermatozóides para ICSI

Além dos tratamentos físicos descritos anteriormente, tratamentos dos

espermatozóides com agentes químicos, tais como o ditiotreitol (DTT), também têm

resultado em melhoria das taxas de formação de pronúcleo e de clivagem dos

oócitos microinjetados (Rho et al., 1998a). Do mesmo modo, combinações do DTT

com substâncias de ação detergente, tais como o Triton X-100 ou o

alquiltrimetilamônio (ATAB), também têm sido testadas para aumentar o grau de

descondensação dos espermatozóides, porém com riscos de danos aos

cromossomos paternais (Hamano et al., 1999; Szcygiel e Ward, 2002).

Ativação oocitária

O sucesso da ICSI em bovinos é supostamente dependente da ativação

artificial apropriada do oócitos após a ICSI, uma vez que a microinjeção de

espermatozóide e a estimulação mecânica promovida pela introdução da pipeta de

injeção são insuficientes, em mais de 90 % dos casos, para levar à ativação dos

oócitos bovinos (Keefer et al., 1990).

A ativação de oócitos de mamíferos pode ser induzida por diversos

estímulos, incluindo corrente elétrica (Ware et al., 1989; Prochazka et al., 1993),

extratos espermáticos (Stice e Robl, 1990; Wu et al., 1998), ionóforos de cálcio

(Ware et al., 1989; Chen e Seidel, 1997; Katayose et al., 1999), etanol (Nagai, 1987;

Minamihashi et al., 1993; Horiuchi et al., 2002; Hamano et al., 1999), ionomicina

(Susko-Parrish et al., 1994), ciclohexamida (Yang et al., 1994; Presicce e Yang,

1994), 6-dimetil aminopurina (Fulka et al., 1991) e cloreto de estrôncio (Fraser, 1987;

Leal et al., 2000). Para ser considerado fisiológico, a estimulação do oócito deve

resultar na geração de Ca+2 e dar início a outros eventos associados à ativação.

Substâncias e agentes físicos empregados para a ativação oocitária

Pulsos elétricos

Por meio de pulsos elétricos ocorre uma alteração da permeabilidade da

membrana plasmática do oócito, que gera uma difusão de cálcio extracelular para o

interior do citoplasma. Ocorre, desta forma, um pico único de aumento do cálcio

intracelular, que promove o início da ativação (Zimmermann e Vienken, 1982).

14

Aparentemente, a concentração de cálcio extracelular tem uma grande

influência no aumento de cálcio intracelular induzido por pulsos elétricos, uma vez

que não apenas os parâmetros do campo elétrico, como também do meio

empregado, influenciam a amplitude do pico de cálcio (Fissore e Robl, 1992).

Entretanto, ao contrário de outras espécies animais, as células de bovinos

apresentam-se sensíveis aos pulsos elétricos, e um aumento dos parâmetros

elétricos pode facilmente causar danos ao fuso meiótico, levando a uma separação

anormal da cromatina, com a formação de vários pronúcleos (Soloy et al., 1997).

Etanol

O etanol induz a formação de um único pico de cálcio intracelular, de curta

duração, que promove a destruição do CSF, levando à ativação do oócito (Presicce

e Yang, 1994).

Taxas de ativação da ordem de 25% a 49% e clivagens de 31% foram

obtidas por Stojkovic et al. (1997) quando utilizaram etanol a 7% por 5 min para

ativação de oócitos bovinos. Um aumento da taxa de ativação para 99% foi obtido

por Yang et al. (1991), quando combinaram a ativação com etanol e a posterior

incubação dos oócitos com a ciclohexamida.

Ionóforos de cálcio

Ionóforos de cálcio são substâncias lipossolúveis que se ligam a certos íons,

transferindo-os através da membrana plasmática para o interior do oócito.

Ionóforo de cálcio Ca-I A23187

A molécula do Ca-I A23187 transporta ativamente 2 íons H+ do oócito para o

meio extracelular, gerando ao mesmo tempo uma corrente de íons Ca+2 para o

interior do oócito. Também é produzido um único pico de cálcio, que promove a

ativação de diversos processos proteolíticos dependentes de cálcio, causando a

degradação da ciclina B e a redução da atividade do MPF. Essa ação do Ca-I é

dependente do pH do meio utilizado, como também da concentração extracelular de

íons Ca+2 (Wang et al., 1998).

15

Normalmente, uma estimulação única do pico de cálcio não é suficiente em

oócitos jovens (maturados por 16-20 horas) para inibir uma nova síntese do MPF

(Yang et al., 1994; Wang et al., 1998) e melhores resutados de ativação são obtidos

quando o Ca-I é associado a outras substâncias que inibem a atividade do MPF

como a ciclohexamida (Suttner et al., 2000).

Ionomicina

A ionomicina é um ionóforo de cálcio que, de forma semelhante ao Ca-I,

promove a retomada da meiose. Porém, freqüentemente, a formação dos pronúcleos

e o desenvolvimento posterior são comprometidos por uma baixa estimulação

(Susko-Parrisch et al., 1994). O aumento do número de estimulações com

ionomicina em intervalos de 30 min promovem uma melhor ativação dos oócitos

(Rho et al., 1998a) e a combinação da ionomicina com a 6-DMAP promove altas

taxas de ativação e clivagem (Rho et al., 1998b).

Ciclohexamida

A ciclohexamida (CHX) é uma tetraciclina inibidora da síntese protéica de

células eucarióticas. Ela atua sobre a peptidiltransferase e interrompe a síntese

protéica pela inibição da elongação da cadeia peptídica do ribossomo 80S (Kubelka

et al., 1988; Sirard et al., 1998). Desta forma, uma nova síntese de CSF pelo oócito é

inibida e o MPF permanece inativado (Presicce et al., 1994). Contudo, uma ativação

inicial do oócito com substâncias que promovem a degradação prévia do CSF é

necessária antes da ação da CHX (Yang et al., 1994). A CHX é usada normalmente

por 3 a 5 horas para uma completa inativação do MPF e, aparentemente, a CHX não

inibe a extrusão do segundo corpúsculo polar como ocorre com a 6-

dimetilaminopurina (Soloy et al., 1997), sendo relatados nascimentos de bezerros

normais a partir de oócitos incubados com CHX durante a maturação in vitro (Saeki

et al., 1997)

6-dimetil-amino-purina

A 6-dimetil-amino-purina (6-DMAP) é um inibidor específico da fosforilação

protéica. O mecanismo pelo qual a 6-DMAP causaria a ativação seria pela

desfosforilação do MPF (fator promotor da meiose) ou de sua proteína relevante ou

16

ainda pela inibição da sua fosforilação (Liu e Wang, 1997).

Bons resultados de ativação de oócitos bovinos têm sido obtidos pela

combinação de ionóforo de cálcio ou ionomicina com 6-DMAP, sendo os efeitos

variáveis com o intervalo entre os tratamentos seqüenciais com estas substâncias

(Susko-Parrish et al., 1994; Rho et al., 1998a).

Entretanto, o uso de inibidores protéicos para a ativação oocitária pode

causar alterações do fuso meiótico, impedindo a extrusão do segundo corpúsculo

polar ou a singamia, acarretando alterações do cariótipo (King et al., 1988; Rho et

al., 1998b; Fukui et al., 1992; Winger et al., 1997).

Outras substâncias

Também é possível realizar a ativação dos oócitos com sais de estrôncio

(Sr+2). Em camundongos, Sr2+ induz respostas que são indistinguíveis daquelas

correspondentes às induzidas por Ca+2. O´Neill et al. (1991) também relataram que

meios de cultivo suplementados com Sr2+ têm boa capacidade de induzir a ativação

de oócitos ovulados de camundongos, com bom potencial de desenvolvimento dos

embriões partenogênicos. Leal et al. (2000) descreveram recentemente o uso de

estrôncio na ativação de oócitos bovinos associado a pulsos elétricos.

Outra alternativa de ativação exógena, mais próxima aos fenômenos

celulares fisiológicos, é a injeção de fatores espermáticos que induzem a ativação. A

injeção de preparados de espermatozóides dentro de oócitos de mamíferos mostrou

desencadear oscilações de cálcio, muito similares àquelas resultantes do processo

de fertilização. Wu et al. (1998) demonstraram que a injeção de frações

espermáticas também resulta em oscilações de cálcio capazes de iniciarem a

ativação oocitária normal.

Técnica de microinjeção

Um dos fatores mais importantes para o sucesso da ICSI é o método de

microinjeção do espermatozóide. O procedimento de microinjeção deve ser eficiente,

garantir uma alta taxa de sobrevivência dos oócitos injetados, com uma correta

deposição do epermatozóide no interior do oócito e ser de execução simplificada.

Diferentes meios de micromanipulação foram avaliados com relação aos

seus efeitos nos resultados da ICSI. Keefer et al (1990) não encontraram diferenças

17

quanto ao uso do meio TCM199-Hepes em relação ao meio Ham F10-bicarbonato.

A introdução de determinadas substâncias químicas, juntamente com o

espermatozóide no momento da ICSI, é outro ponto importante de discussão. A

polivinilpirrolidona (PVP) é uma substância comumente utilizada nos trabalhos de

ICSI para o preparo da suspensão de espermatozóides a serem microinjetados. A

PVP promove um aumento da viscosidade do meio, causando uma redução da

motilidade dos espermatozóides, para que estes possam ser aspirados ou

imobilizados pela pipeta. Além disso, a PVP reduz a aderência dos espermatozóides

nas paredes da pipeta, facilitando o procedimento de aspiração e deposição do

espermatozóide no oócito.

Acredita-se que a PVP não causa alterações celulares ou danos aos

cromossomos. Entretanto, foi comprovado que a PVP pode causar uma

estabilização da membrana do espermatozóide, o que afetaria a taxa de formação

de pronúcleo masculino ou ainda, quando injetada em maior quantidade, formar uma

gota ao redor do espermatozóide, isolando-o no interior do oócito e impedindo o seu

contato com substâncias do citoplasma do oócito, responsáveis pela sua

descondensação (Dorzotsev et al., 1995).

A temperatura na qual se realiza a micromanipulação também pode ter

efeitos significativos nos resultados da ICSI, principalmente com relação à taxa de

sobrevivência dos oócitos. Kimura e Yanagimachi (1995) concluíram que a redução

da temperatura do meio, que contém os oócitos durante a micromanipulação,

diminuiu a taxa de degeneração após a ICSI com um Piezo-micromanipulador em

oócitos de camundongos. Estes autores observaram que temperaturas de 25-37ºC

resultavam na formação de uma evaginação da membrana durante a retirada da

pipeta de injeção, o que causava a degeneração por perda de líquido e extrusão do

citoplasma. Temperaturas de 17-18ºC aumentavam a viscosidade do citoplasma do

oócitos, reduzindo a evaginação e permitindo um fechamento mais rápido do orifício

feito pela pipeta.

Na ICSI, é necessário posicionar o oócito com a pipeta de manutenção de

forma que o primeiro corpúsculo polar fique na posição “6 ou 12 horas”. Assim, evita-

se que a pipeta cause lesão à placa metafásica, uma vez que esta encontra-se na

maioria das vezes na região subjacente ao CP, o que causaria um distúrbio na

extrusão do segundo corpúsculo polar (Kimura e Yanagimachi , 1995; Payne, 1995).

18

Este é um procedimento corriqueiramente utilizado na maioria dos trabalhos de ICSI

(Payne et al., 1995).

Uma alternativa desse método descrita em humanos, quando se suspeita de

fragilidade da membrana plamática, é a fixação do oócito com o CP na posição de

9:00 h e a introdução da pipeta na posição 12:00 h, o que reduz a pressão para a

penetração da zona pelúcida. Posteriormente o oócito é girado, de forma que o CP

fique na posição de 12:00 h e a pipeta introduzida na membrana plasmática na

posição de 3:00 h.

O uso de diferentes equipamentos e materiais para a ICSI também tem

demonstrado diferenças nos resultados de sobrevivência e taxas de fertilização dos

oócitos. No método de microinjeção convencional, utiliza-se uma micropipeta de

vidro com um bisel em sua extremidade para facilitar a penetração na zona pelúcida.

Algumas pipetas também são confeccionadas com um afilamento na ponta do bisel,

em forma de “espinho”, para permitir uma maior capacidade de perfuração. Este

afilamento não é indispensável, porém, quando a pipeta não tem uma boa

capacidade de perfuração, os riscos de danos ao oócito são aumentados (Tocharus

et al., 1996). A escolha do diâmetro da extremidade da pipeta varia de acordo com o

diâmetro do espermatozóide da espécie em questão, mas a utilização de pipetas de

diâmetro reduzido proporcionam menores danos aos oócitos.

Para a penetração do citoplasma pela ICSI convencional, é realizada a

aspiração da membrana plasmática pela pipeta de injeção, visando a rompê-la e só

então a pipeta é introduzida mais profundamente para a liberação do

espermatozóide. Contudo, freqüentemente podem ocorrer erros neste procedimento,

causando lesões ao oócito ou uma deposição incorreta do espermatozóide no

espaço perivitelínico, pela falta de ruptura da membrana. Um equipamento

denominado atuador piezo-elétrico foi utilizado por Kimura e Yanagimachi (1995)

para ICSI, permitindo um aumento da taxa de sobrevivência de oócitos de

camundongos de 16% para 80% e da taxa de fertilização de 8% para 80%.

A ação deste equipamento baseia-se no efeito piezo-elétrico, que faz com

que a pipeta avance curtas distâncias (5µl) a uma alta velocidade. Estes pulsos

transmitidos à pipeta de injeção promovem um movimento pontual perfurando a zona

pelúcida e a membrana plasmática, com pouca distorção da célula (Kimura e

Yanagimachi, 1995). Posteriormente, esse equipamento foi empregado na ICSI em

19

humanos e bovinos, resultando em altas taxas de sobrevivência e formação de

pronúcleos, sem necessidade da aspiração do citoplasma para a deposição do

espermatozóide no interior do oócito (Huang et al., 1996; Yanagida et al., 1998;

Horiuchi et al., 2002).

Perspectivas da ICSI

Apesar das dificuldades encontradas para a realização da ICSI em bovinos,

quando em comparação com a ICSI em outras espécies, os resultados desta

tecnologia vêm melhorando nos últimos anos. Estudos básicos dos processos de

fertilização com comparação entre as espécies têm trazido respostas às questões

relacionadas com diferentes resultados obtidos para bovinos.

O processo atual de maturação in vitro dos oócitos a ser selecionados para a

microinjeção, certamente, precisa de modificações para permitir aos oócitos maior

competência para a fertilização e para o desenvolvimento embrionário. A realização

de tratamentos químicos e físicos dos espermatozóides para contornar deficiências

de formação do pronúcleo e a utilização de equipamentos mais eficientes para os

procedimentos de micromanipulação têm tornado os resultados mais satisfatórios.

Entretanto, devido ao grande número de etapas envolvidas, os gametas ainda

permanecem expostos a inúmeros agentes deletérios provenientes dos meios de

manipulação e de cultivo.

Danos moleculares como a fragmentação do DNA, que levariam a

alterações cromossomais e anomalias de compactação da cromatina espermática,

também podem estar relacionados com a baixa taxa de sucesso após a ICSI.

Técnicas capazes de avaliar a qualidade dos gametas, baseadas na integridade dos

espermatozóides e no estádio de maturação e competência dos oócitos, serão de

grande valor para o sucesso da ICSI.

Quando a metodologia da ICSI em bovinos estiver estabelecida, fornecendo

resultados satisfatórios como os da ICSI em humanos, conforme constatamos

atualmente, inúmeras linhas de pesquisa básica e aplicada da reprodução poderão

se beneficiar dessa tecnologia.

20

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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4. TRABALHOS

4.1 Preparo de oócito bovino para microinjeção de espermatozóide ..............35

4.2 Efeito do pré-tratamento espermático e da ativação oocitária no

desenvolvimento embrionário após a ICSI .............................................59

4.3 Fertilização e desenvolvimento embrionário após a ICSI em oócitos

bovinos com piezo-manipulador ..............................................................84

35

PREPARO DE OÓCITOS BOVINOS PARA INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDE (ICSI)

RESUMO

A remoção das células do cumulus dos complexos-cumulus-oócito (COCs) é

um procedimento necessário para a realização de algumas técnicas de

micromanipulação, tais como a Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide (ICSI)

e a Clonagem por Transferência Nuclear (TN). Contudo, este procedimento pode

comprometer os eventos celulares subseqüentes, necessários para o

desenvolvimento embrionário. O presente estudo teve por objetivo comparar os

efeitos de diferentes protocolos de desnudamento dos COCs e de outros

procedimentos empregados para a micromanipulação, tais como a centrifugação e a

seleção dos oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar, nos resultados da

fertilização in vitro (FIV), visando-se a alcançar altas taxas de desenvolvimento

embrionário in vitro. Na tentativa de melhorar as taxas de formação do pronúcleo e

de blastocistos, os efeitos da adição nos meios de maturação e de fertilização de

substâncias com conhecida capacidade de promover a descondensação in vitro de

espermatozóide, como a glutationa e o ditiotreitol (DTT), também foram avaliados.

Outros procedimentos, como a centrifugação e a seleção dos oócitos apresentando

o primeiro corpúsculo polar, também foram comparados. COCs obtidos de ovários

de matadouro foram maturados in vitro por 18-20 h, com ou sem adição de

glutationa ao meio de maturação, e submetidos a diferentes combinações de

tratamentos enzimáticos e físicos, como o uso da hialuronidase ou tripsina associada

à remoção das células do cumulus com auxílio de uma pipeta ou do vórtex. Outros

procedimentos, como a centrifugação dos oócitos desnudados, a seleção dos

oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar e a incubação com ditiotreitol

(DTT) após a fertilização também foram comparados. Oócitos não-desnudados

serviram como grupo controle. Todos os oócitos foram fertilizados in vitro com

sêmen de um mesmo touro, separado por “Swim-up”, na concentração de 2 x106

espermatozóides/ ml. Os oócitos foram retirados do meio de fertilização 18 h após a

36

FIV e cultivados em fluido sintético de oviduto (SOF) por nove dias. As taxas de

clivagem e de formação de blastocisto foram avaliadas nos dias d3 e d7-d9

(d0=FIV), respectivamente. A avaliação das taxas de formação de dois pronúcleos

mostrou não ter havido diferenças entre os grupos trratados e o grupo controle, com

taxas variando de 49% a 58% (P>0,05). Entretanto, embora a presença das células

do cumulus não seja absolutamente necessária para a fertilização de oócitos

bovinos, o desnudamento dos oócitos reduziu as taxas de desenvolvimento a

blastocisto de 40% do grupo controle para 33% a 14% entre os grupos desnudados.

O protocolo de desnudamento, associando o uso da hialuronidase para a remoção

das células com uma pipeta, mostrou-se um método prático e eficiente em relação

aos demais, fornecendo bons resultados. A adição de glutationa ao meio de

maturação afetou negativamente o desenvolvimento embrionário. Os resultados do

presente estudo confirmam a importância das células do cumulus para se alcançar

bons resultados de produção in vitro de embriões bovinos. Mais estudos são

necessários para a obtenção de elevadas taxas de fertilização e de desenvolvimento

embrionário em sistemas de cultivo sem a presença das células do cumulus.

Palavras-chave: bovino, células do cumulus, desnudamento, fertilização in vitro,

micromanipulação

ABSTRACT

The removal of cumulus cells from cumulus-oocyte-complexes (COCs) is

required for some micromanipulation techniques, such as Intracytoplasmic Sperm

Injection (ICSI) and Cloning by Nuclear Transfer (NT). However, this procedure may

compromise the subsequent cellular events necessary for fertilization and early

embryo development. The aim of the present study was to evaluate the effects of

different COCs treatments and denudation protocols on in vitro fertilization (IVF)

results, in order to obtain higher rates of in vitro embryo development. With the

objective to improve the pronuclei and blastocyst formation rates, the addition to the

fertilization and maturation medium of substances known to promote in vitro sperm

37

decondensation, such as glutathione and dithiothreitol (DTT) were also evaluated.

COCs recovered from slaughterhouse-derived ovaries were in vitro matured (18-

20h), with or without the presence of glutathione, and subsequently submitted to

different combinations of enzymatic (hyaluronidase or trypsin) and physical

treatments (vortexing or pippeting) for cumulus cells removal. Other procedures like

centrifugation, selection of oocytes presenting the first polar body after denudation

and incubation of oocytes with DTT after fertilization were also compared. Non-

denuded oocytes served as control. All oocytes were in vitro fertilized by the standard

method with frozen-thawed swim-up separated sperm (2 x106 spermatozoa/ ml). A

group of selected oocytes were also incubated with DTT after FIV. The oocytes were

removed from the fertilization medium 18 h after FIV and cultured in synthetic oviduct

fluid (SOF) for 9 days. Cleavage and blastocysts rates were recorded on d3 and d7-

d9 (d0=IVF), respectively. Comparison of two pronuclei formation rates showed that

no significant difference occurred among the treated and control groups, with

percentages of 49% to 58% (P>0,05). However, although the presence of cumulus

cells was not absolutely necessary for fertilization, the denudation protocols reduced

the blastocyst formation rates of from 40% (control group) to 33% -14% of the

denuded groups. The denudation protocol involving the use of hyaluronidase

associated to the pippeting of oocytes showed to be more practical and efficient than

the others, providing satisfactory results. Other procedures such as centrifugation or

DTT incubation of oocytes, had no detrimental effects and some cases resulted in

higher developmental rates in comparison to non-treated denuded oocytes. The

addition of glutathione to the maturation medium had negative effects on embryo

development. The results of the present study confirm the importance of the

presence of cumulus cells to achieve high bovine embryo in vitro production results.

Further studies are necessary to obtain higher fertilization and early embryo

developmental rates in culture systems without cumulus cells.

Key words: bovine, cumulus cell, denudation, in vitro fertilization, micromanipulation,

38

INTRODUÇÃO

A partir do nascimento do primeiro bezerro de fertilização in vitro (Brackett,

1982), a tecnologia de produção in vitro de embriões bovinos vem se desenvolvendo

continuamente, abrindo novas perspectivas para aumentar a eficiência reprodutiva a

partir de oócitos obtidos por aspiração direta dos ovários de animais abatidos ou

pela aspiração folicular guiada por ultra-som in vivo (OPU).

O avanço das pesquisas para que gametas e zigotos de mamíferos

pudessem ser mantidos por longos períodos no ambiente extracorpóreo, permitiram

a aplicação de técnicas de manipulação, que visam a contornar deficiências

reprodutivas ou a produção de indivíduos com características pré-determinadas.

Para a realização de algumas técnicas de micromanipulação como a Injeção

Intracitoplasmática do Espermatozóide (ICSI), Transferência Nuclear (TN) e a

produção de animais transgênicos, os oócitos precisam ser submetidos a

procedimentos como o desnudamento, centrifugação e seleção pela presença do

primeiro corpúsculo polar, antes de serem utilizados. O efeito desses procedimentos

no desenvolvimento embrionário dos oócitos micromanipulados é de fundamental

importância para o aumento de eficiência destas técnicas.

Sabe-se que as células do cumulus apresentam importantes funções no

processo de maturação oocitária, seja diretamente pela síntese e transferência de

moléculas para o interior dos oócitos através das “Gap junctions”, da secreção de

fatores solúveis ou ainda pela ação indireta de redução de radicais livres presentes

no meio (Hashimoto et al., 1998). As células do cumulus estão, desta forma,

envolvidas com a maturação citoplasmática necessária para os eventos celulares

que ocorrem na fertilização, tal como a formação do pronúcleo masculino (Sirard,

1988; Hashimoto, 1998; Cox et al. 1993), sendo o processo de maturação in vitro

comprometido pela remoção destas células (Liu et al., 1995; Zhang et al., 1995).

As células do cumulus também têm uma importante participação durante o

processo de fertilização, sendo demonstrado que, in vitro, essas células têm uma

função de selecionar e “atrair” quimicamente os espermatozóides (Chian et al.,

1996), além de induzir a capacitação espermática e a reação acrossomal em

bovinos (Fukui, 1990).

39

O desnudamento dos oócitos é realizado, para que estes possam ser

selecionados, manipulados ou microinjetados, sem que as células do cumulus

dificultem a visualização das estruturas dos oócitos ou venham aderir às

micropipetas (Van Steirteghem et al., 1995). Apesar do processo de fertilização pela

ICSI não requerer a presença destas células para facilitar a penetração dos

espermatozóides, o método utilizado para o desnudamento pode ter efeitos

deletérios para o desenvolvimento embrionário, seja pela ação das enzimas

empregadas ou pela ação física utilizada para a remoção das células (Van de Velde

et al., 1997).

Após a maturação in vitro e o desnudamento, os oócitos a serem submetidos

às técnicas de micromanipulação normalmente também são selecionados pela

presença do primeiro corpúsculo polar (CP) no espaço perivitelínico. A presença do

CP serve como parâmetro da maturação in vitro e, no caso da ICSI, a visualização

do CP é necessária para o posicionamento do oócito, de forma que a pipeta de

injeção penetre no citoplasma sem atingir o fuso meiótico (Van Steirteghem et al.,

1994; Palermo et al., 1996a).

A centrifugação é outro procedimento algumas vezes também empregado

para a ICSI, pois os oócitos bovinos maturados contêm grandes quantidades de

vacúolos e gotas de lipídio que dificultam a visualização da micropipeta no interior do

citoplasma. A centrifugação desloca rapidamente as gotas de lipídio para um dos

lados do oócito, tornando o citoplasma translúcido (Wall et al., 1985; Tatham et al.,

1996, Chung et al., 2001). Tem sido demonstrado que a centrifugação possui pouco

efeito deletério no desenvolvimento de zigotos, uma vez que as gotas de lipídio

redistribuem-se pelo citoplasma logo após a penetração do espermatozóide (Chung

et al., 2001), sendo descritos nascimentos de animais transgênicos provenientes de

oócitos centrifugados (Wall et al., 1985). A centrifugação pode causar, entretanto, a

ativação partenogenética dos oócitos quando realizada a altas velocidades, acima

de 10.000 xg (Chung et al., 2001).

No oócito, o processo de descondensação dos espermatozóides para a

formação do pronúcleo masculino envolve a redução das pontes dissulfídicas das

protaminas por um agente redutor, possivelmente, a glutationa (Calvin et al., 1986;

Perreault et al., 1988). A adição da glutationa ou de seus precursores (cisteamina e

cisteína e cistina), ao meio de maturação ou de fertilização, tem sido objeto de

40

estudo de alguns pesquisadores, na tentativa de aumentar as taxas de formação de

pronúcleo e de fertilização. Contudo, os resultados descritos têm sido contraditórios,

sendo o benefício da presença destas substâncias dependente principalmente da

composição do meio de maturação e da espécie animal envolvida (Yoshida et al.,

1993; Myamura et al., 1995; Sutovsky e Schatten, 1997; Yamauchi e Nagai, 1999).

A adição dessas substâncias, ao meio de maturação de oócitos a serem

micromanipulados, visando um aumento da concentração da glutationa

intracitoplasmática, pode ser uma alternativa para compensar baixas taxas de

descondensação do espermatozóide microinjetado na ICSI.

In vitro, inúmeros agentes redutores também têm capacidade de promover a

descondensação dos espermatozóides, incluindo o ditiotreitol (DTT), protease,

heparina, glutationa, SDS e altas concentrações de sal (Jager et al., 1990). O pré-

tratamento dos espermatozóides para ICSI em oócitos bovinos com DTT tem

resultado em melhores taxas de formação de pronúcleo masculino e de fertilização

(Perreault et al., 1987, Rho et al., 1998; Suttner et al., 2000), apesar da possibilidade

de danos aos cromossomos do pronúcleo paternal (Szcygiel e Ward, 2002).

Uma vez que poucos estudos foram feitos sobre o preparo de oócitos

bovinos para a micromanipulação e o emprego de substâncias químicas para o

aumento da formação de pronúcleos, os efeitos destes tratamentos, na competência

dos oócitos para a fertilização e no cariótipo dos zigotos produzidos, precisam ser

investigados.

O presente estudo teve por objetivo identificar o tratamento mais adequado

de desnudamento e de preparo de oócitos bovinos para micromanipulação visando a

uma elevada taxa de clivagem e ao desenvolvimento embrionário após a fertilização

in vitro.

41

MATERIAL E MÉTODOS

Delineamento experimental

O estudo compreendeu três experimentos. No experimento 1, diferentes

tratamentos enzimáticos e físicos para a remoção das células do cumulus

(desnudamento) e a seleção de oócitos bovinos foram comparados para avaliar os

seus efeitos nas taxas de desenvolvimento embrionário após a fertilização in vitro.

No experimento 2, foram avaliados os efeitos da adição de glutationa ao

meio de maturação, da centrifugação dos oócitos desnudados, da seleção dos

oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar e da incubação dos oócitos com

DTT após a fertilização, com o objetivo de melhorar as taxas de formação de

pronúcleos e o desenvolvimento embrionário dos oócitos desnudados.

No experimento 3, os mesmos procedimentos usados no experimento 2

foram empregados, avaliando-se os efeitos dos tratamentos nas taxas de clivagem e

de desenvolvimento embrionário.

Coleta, seleção e maturação in vitro dos oócitos

Ovários bovinos obtidos de matadouro foram mantidos em uma garrafa

térmica, à temperatura de 30 ºC em solução tampão-fosfato, com pH ajustado 7,4;

contendo 100 UI/ ml de penicilina e 100 UI/ ml de estreptomicina, durante o

transporte até o laboratório. Os folículos com diâmetro entre 2 a 8 mm, foram

aspirados com uma agulha descartável de 18G, acoplada a um tubo de centrífuga

de 50 ml, utilizando-se uma bomba de vácuo com pressão negativa de 120 mm Hg.

Após o repouso dos tubos por 10 minutos, o sedimento foi transferido para uma

placa de Petri para a recuperação e seleção dos complexos cumulus-oócitos

(COCs).

Foram selecionados COCs, com cumulus compacto, contendo pelo menos

três camadas celulares e com citoplasma de aparência homogênea segundo a

classificação de De Loos et al. (1989). Estes COCs foram lavados por três vezes em

meio de lavagem TCM199 -HEPES/ OCS (TCM-199 com 10% soro de vaca em

estro - OCS) e colocados (20 a 30 oócitos) em 400µl de meio MPM (modified

Parker´s medium), contendo 10% de OCS, 10 µg/ ml de FSH e antibióticos, em

42

placa de 4 poços, sendo o meio coberto com 400 µl de óleo mineral. A maturação foi

realizada em estufa de cultivo em atmosfera umidificada, com 5% de CO2 a 39ºC,

durante 18-20 horas.

Desnudamento e seleção dos oócitos

Após maturação in vitro, os COCs foram incubados em uma gota de 100 µl

de meio de desnudamento (TCM 199-HEPES com 1 mg/ ml de hialuronidase e 10%

de OCS) e passados por repetidas aspirações em uma pipeta de 100 µl para a

remoção das células do cumulus. Os oócitos desnudados foram lavados novamente

em meio de lavagem para remoção de todos os restos celulares e transferidos para

gotas de 20 µl de meio de micromanipulação (TCM199-HEPES acrescido de 4 mg

/ml de BSA), em uma tampa estéril de placa de Petri de 35 mm de diâmetro, sendo

adicionado óleo mineral para cobrir as gotas.

Os oócitos foram examinados sob microscópio óptico invertido, sob aumento

de 400x (Zeiss Axiovert 135). Aqueles oócitos de boa aparência, exibindo o primeiro

corpúsculo polar, foram selecionados utilizando uma micropipeta de vidro com

abertura interna da extremidade de cerca de 150 µm acoplada a um sistema de

micromanipulação (microinjetor CellTram Oil-Eppendorf AG e micromanipulador

TransferMan-Eppendorf AG, Alemanha).

Experimento 1

No primeiro experimento, diferentes métodos de desnudamento foram

avaliados, procurando-se encontrar um método simples e eficiente para a remoção

das células do cumulus. Após maturação in vitro, os oócitos foram submetidos ao

tratamento enzimático com hialuronidase (1 mg/ ml em meio TALP), ou tripsina (0,05

% em meio TALP), associado à remoção mecânica por pipetagem (passando-se os

oócitos por repetidas vezes pela ponteira de uma pipeta de 100µl sob controle

visual) ou com o uso do vórtex (velocidade máxima por 5 min. com MS1 Minishaker,

Fa. Ika Works, Wilmington, USA). Os oócitos desnudados foram lavados em meio

TCM199/ BSA (4 mg BSA/ ml) para remoção de todos os restos celulares e

fertilizados in vitro com ou sem a seleção posterior dos oócitos que apresentavam o

primeiro corpúsculo polar.

43

Para a seleção dos oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar, os

oócitos foram transferidos para gotas de 15 µl de TCM 199/ BSA + 4mg/ ml, cobertas

com óleo mineral, em uma tampa estéril de placa de petri de 35 mm de diâmetro. Os

que apresentavam boa aparência e o primeiro corpúsculo polar foram selecionados

utilizando uma micropipeta com abertura interna da extremidade de cerca de 150µm

acoplada a um sistema de micromanipulação (TransferMan- Eppendorf AG,

Alemanha), sob microscópio invertido (Axiovert 135, Zeiss Alemanha) com aumento

de 400x. Oócitos não-desnudados foram fertilizados diretamente após a maturação,

servindo como grupo controle.

Experimento 2.

Após a seleção do método utilizando hialuronidase combinada com a

pipetagem dos oócitos para o desnudamento, outros procedimentos foram avaliados

para se tentar melhorar os resultados da produção de embriões in vitro a partir de

oócitos desnudados.

Para se verificar a influência da centrifugação, antes da fertilização, no

desenvolvimento embrionário, oócitos foram centrifugados por cinco minutos a 7.000

xg por 5 min. A centrifugação é um procedimento realizado com o objetivo de

permitir uma melhor visualização da pipeta no interior do citoplasma e também

garantir o local de deposição do espermatozóide no interior do oócito, quando se

realiza a ICSI.

Para se estudar se a adição de glutationa ao meio de maturação promoveria

uma maior taxa de formação de pronúcleo masculino nos oócitos desnudados e,

conseqüentemente, maior taxa de clivagem e desenvolvimento embrionário, um

grupo de oócitos foi maturado separadamente, com a adição de glutationa ao meio

de maturação, na concentração final de 1 mM. Após 18-20 h de maturação, os

oócitos foram desnudados e as etapas seguintes (FIV/ CIV) seguiram como nos

demais grupos.

Experimento 3.

No experimento 3, os mesmos procedimentos usados no experimento 2

foram empregados, avaliando-se entretanto, os seus efeitos nas taxas de clivagem

(dia 3) e de desenvolvimento embrionário (dias 7-9).

44

Preparo dos espermatozóides e fertilização in vitro

Palhetas de sêmen congelado de um touro comprovadamente fértil e com

bons resultados em FIV foram descongeladas em banho-maria a 39ºC, por 30

segundos. Os espermatozóides viáveis foram separados pela técnica de "Swim-up"

por 1 hora em estufa (39ºC) em meio Sp-TALP (Meio de Tyrode com albumina-

lactato-piruvato) acrescido de BSA livre de ácidos graxos (6 mg/ml), penicilamina

(20 µM), hipotaurina (10 µM) e epinefrina (2 µM). A parte superior (0,5 ml) do

sobrenadante foi retirada e depositada em um outro tubo, sendo, em seguida,

centrifugada a 600 xg por 10 min. O sobrenadante foi descartado e uma alíquota de

5µl retirada para determinação da concentração espermática.

Os oócitos maturados foram fertilizados in vitro, com uma concentração

espermática de 2 x 106 espermatozóides/ ml a partir da suspensão de

espermatozóides preparada inicialmente. A fertilização foi realizada em 400 µl de

meio de fertilização (Fert-TALP + 6 mg BSA/ ml), em placas de 4 poços por 18 h em

estufa de cultivo a 39ºC com 5% de CO2.

Incubação dos oócitos fertilizados com DTT

Ainda tentando encontrar um método que proporcionasse uma melhoria dos

resultados da FIV, oócitos foram desnudados, fertilizados e oito horas após o início

da FIV, incubados em TCM/ OCS com 10 mM DTT por 15 min. Após este período de

incubação, os oócitos foram lavados novamente e recolocados em cultivo em Fert-

TALP acrescido de 6mg/ ml de BSA por mais 10 h.

Cultivo dos embriões

Após 8 horas de fertilização, os oócitos fertilizados foram desnudados e

lavados em gotas de 50 µl de meio TCM199 Hepes/ OCS com o auxílio de uma

pipeta de 100 µl, para a remoção das células do cumulus, restos celulares e

espermatozóides que não penetraram. Os oócitos fertilizados foram cultivados por

nove dias, em grupos separados por tratamento, em meio SOF suplementado com

10% de OCS e antibióticos, a 39ºC em atmosfera de umidade saturada, com 5% de

CO2, 5% de O2 e 90% de N2.

45

Avaliação da formação de pronúcleos

Para a avaliação da formação de pronúcleos, os zigotos foram fixados sob

lamínula 18 horas após o início da FIV, utilizando uma solução 3:1 etanol-ácido

acético por 24 horas a 4°C e, posteriormente, corados com 1% de Lacmóide em

45% de ácido acético. Os pronúcleos foram observados sob microscópio de fase

com 400x de aumento e os oócitos classificados como NA (Não-avaliável) ou pela

presença de 1PN (1 pronúcleo), 2PN (2 pronúcleos), 3PN (3 pronúcleos), D-SP

(espermatozóide descondensado) e (ND-SP) espermatozóide não-descondensado.

Avaliação das taxas de clivagem e do desenvolvimento embrionário

Os embriões foram examinados no terceiro dia de cultivo (d3) para o registro

da taxa de clivagem e entre o sétimo e nono dias de cultivo (d7-d9), para o registro

da taxa de formação de blastocisto por grupo.

A

B

Figura 1. Oócitos bovinos desnudados com um pronúcleo (A) e dois pronúcleos (B), após a fertilização in vitro (aumento de 400 x).

46

Análise estatística

Análises preliminares foram realizadas para cada uma das variáveis

estudadas incluindo o efeito de tratamento no modelo estatístico. Quando o

coeficiente de variação (CV) resultante da análise de variância foi alto (CV > 35%),

os dados foram transformados em raiz quadrada e testados novamente.

No modelo da análise final, as diferenças entre os resultados, em

porcentagem do número inicial de oócitos, foram analisadas pelo procedimento

ANOVA, SAS (1998), sendo as comparações entre as médias dos tratamentos

realizadas pelo teste de Duncan. Diferenças foram consideradas significativas

quando P<0,05.

O modelo estatístico empregado para a avaliação do efeito dos tratamentos

na Análise de Variância foi:

Y ijk = µµµµ + αααα i + eijk

Onde:

Y ijk = valor observado para a variável em estudo

µ = média geral

α i = efeito do i-ésimo nível do tratamento no valor observado Y ijk

eijk = erro associado a observação Y ijk

RESULTADOS

O primeiro experimento foi realizado para a avaliação do efeito de diferentes

tratamentos enzimáticos e físicos para a remoção das células do cumulus

(desnudamento) e do efeito da seleção de oócitos nas taxas de desenvolvimento

embrionário após a fertilização in vitro.

Foi observado que a taxa de formação de blastocistos foi significativamente

maior para o grupo controle 47% (P< 0,05), em relação a todos os grupos de oócitos

desnudados, confirmando a importância da presença das células do cumulus no

processo de fertilização.

47

Tabela 1. Efeito do protocolo de desnudamento e da seleção dos oócitos no

desenvolvimento in vitro de embriões bovinos

Tratamento Rep COC (n)

Clivagem d3 (%)

Blastocistos

d7-d9 (%)

Controle 9 228 178 (78)a 107 (47)a

Hialuronidase + vórtex 6 137 84 (62)b,c 28 (21)b

Hialuronidase + pipetagem 6 142 96 (68)a,b 37 (26)b

Hialuronidase + pipetagem + seleção CP 4 111 74 (66)a,b 27 (25)b

Tripsina + vórtex 6 140 84 (60)b,c 25 (17)b

Tripsina + pipetagem + seleção CP 4 92 45 (49)c 19 (21)b

Valores na mesma coluna com letras diferentes variam significativamente ANOVA (P<0,05).

Contudo, não houve diferença significativa quanto ao uso do vórtex ou da

pipeta para remoção das células do cumulus, quando os oócitos foram incubados

com hialuronidase em relação à taxa de clivagem (62% vs 68%) ou à taxa de

blastocisto (21% vs 26%), respectivamente (P>0,05). Também não foi observada

diferença nas taxas de blastocistos entre incubação com hialuronidase ou tripsina,

quando as células do cumulus foram retiradas com o vórtex (21% vs 17%,

respectivamente) (P> 0,05).

A seleção dos oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar não resultou

no aumento das maiores taxas de formação de blastocistos em relação aos demais

grupos, com taxas de blastocisto de 25%, para oócitos desnudados com

hialuronidase + pipetagem e de 21% para o desnudamento com tripsina +

pipetagem.

Apesar de não ter sido encontrada nenhuma diferença significativa entre os

métodos de desnudamento quanto às taxas de formação de blastocistos, os

protocolos envolvendo o uso da hialuronidase + pipetagem resultaram nas maiores

taxas de blastocisto em números absolutos e, devido à sua praticidade de execução,

foi o método escolhido para o desnudamento nos experimentos seguintes.

48

No segundo experimento, os efeitos de alguns procedimentos foram

avaliados na tentativa de melhorar os índices de desenvolvimento embrionário a

partir dos oócitos desnudados e verificar se os procedimentos empregados para a

micromanipulação, tais como a centrifugação e seleção do primeiro corpúsculo polar,

afetariam a fertilização.

Não foram observadas diferenças significativas nas porcentagens de oócitos

apresentando um pronúcleo (7% a 11%) ou de oócitos corretamente fertilizados,

apresentando 2PN (49% a 58%) entre os grupos de oócitos desnudados e o grupo

controle (P>0,05).

Estes resultados indicam que o desnudamento dos oócitos previamente à

fertilização e à centrifugação não tiveram efeitos negativos na taxa de penetração

dos oócitos e na formação do pronúcleo masculino. Entretanto, é interessante notar

que a maturação dos oócitos em presença de glutationa, a incubação em DTT ou a

seleção dos oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar não elevaram as

taxas de formação de pronúcleos em relação aos demais grupos (P<0,05).

Tabela 2. Efeito dos diferentes métodos de preparo de oócitos para micromanipulação e da adição de substâncias redutoras ao meio de maturação e fertilização nas taxas de formação de pronúcleo (PN) em oócitos bovinos após a FIV

Grupo / tratamento Rep. COC (n)

SA1

(%)

1 PN

(%)

2 PN

(%)

3PN

(%)

DSP2

(%)

NDSP3

(%)

FIV-controle 6 74 22 (30)a,b 7 (8)a 42 (57)a 3 (4)a,b 0 (0)b 0 (0)

Desn. + FIV 5 70 24 (33)a,b 5 (7)a 34 (49)a 4 (6)a 1 (1)b 2 (3)

Desn. + Cent. + FIV 5 68 12 (16)b 8 (12)a 38 (57)a 1 (1)a,b 7 (11)a 2 (3)

Desn. + FIV + DTT 5 73 22 (30)a,b 3 (4)a 40 (55)a 2 (3)a,b 5 (7)a,b 1 (1)

Glu + Desn. + FIV 5 72 19 (26)a,b 8 (11)a 42 (58)a 2 (3)a,b 2 (3)a,b 0 (0)

Desn+ CP+ Cent+ FIV+ DTT 5 73 28 (38)a 7 (9)a 37 (51)a 0 (0)b 0 (0)b 1 (1)

Valores na mesma coluna com letras diferentes variam significativamente ANOVA (P<0,05). 1SA: sem alteração (não-fertilizado), 2DSP: espermatozóide descondensado, 3NDSP: espermatozóide não-descondensado. Desn = desnudamento; Cent. = centrifugação; Glu = presença de glutationa no meio de maturação, CP = seleção dos oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar; DTT = incubação com DTT.

49

A porcentagem de oócitos em que foram encontrados espermatozóides não

descondensados foi inferior a 3% entre os grupos e a taxa de oócitos com

espermatozóides descondensados não ultrapassou a 10% entre os grupos

estudados (Tabela 2).

No experimento 3, os efeitos dos procedimentos realizados anteriormente no

experimento 2 (desnudamento, centrifugação, presença de glutationa no meio de

maturação, seleção dos oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar e

incubação com DTT) foram avaliados em relação à taxa de clivagem e de formação

de blastocistos.

Não houve diferença significativa nas taxas de clivagem ou de formação de

blastocisto dos oócitos desnudados não-centrifugados (47% e 24%) em comparação

aos oócitos que foram desnudados e centrifugados (47% e 28%) (P<0,05).

A maturação com glutationa, que anteriormente havia resultado na maior

taxa de formação de pronúcleo, resultou, neste experimento, em menores taxas de

clivagem e de formação de blastocisto (40% e 14%), indicando um efeito negativo no

desenvolvimento embrionário, nas condições utilizadas.

Tabela 3. Efeito dos diferentes métodos de preparo de oócitos para micromanipulação e da adição de substâncias redutoras ao meio de maturação e fertilização nas taxas de clivagem e de formação de blastocistos após a FIV

Grupo / tratamento Rep. COC (n)

Clivagem

d3 (%)

Blastocistos

d7-d9 (%)

Controle FIV- não desn. 5 75 59 (79)a 30 (40)a

Desn. + FIV 5 71 33 (47)c,d 17 (24)a,b

Desn. + Cent. + FIV 5 75 36 (47)b,c,d 20 (28)a

Desn. + FIV + DTT 5 81 48 (60)b,c 26 (33)a

Glu + Desn. + FIV 5 79 32 (41)d 11 (14)b

Desn. + CP + Cent + FIV + DTT 5 75 49 (65)a,b 23 (31)a


Desn = desnudamento; Cent. = centrifugação; Glu = presença de glutationa no meio de maturação, CP = seleção dos oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar; DTT = incubação com DTT

50

A incubação dos oócitos com DTT, oito horas após o início da FIV, resultou

em altas taxas de clivagem e de formação de blastocisto para os dois grupos: Desn.

+ FIV + DTT (60% e 33%) e Desn. + CP + Cent + FIV + DTT (65% e 31%).

O grupo no qual foram feitos todos os procedimentos para o preparo dos

oócitos (Desn. + CP + Cent + FIV + DTT) resultou na maior taxa de clivagem entre

os grupos de oócitos desnudados (65%; P<0,05), entretanto não foi observado

aumento da taxa de formação de blastocisto em relação ao grupo Desn. + FIV + DTT

(sem seleção dos oócitos) (31 vs 33%, respectivamente, P>0,05).

Apesar de não haver diferenças significativas entre os resultados da FIV de

oócitos do grupo controle (não-desnudados) e alguns grupos de oócitos

desnudados, em número absolutos, os resultados da FIV do grupo controle (79% de

clivagem e 40% de formação de blastocisto) foram superiores a todos os grupos de

oócitos desnudados (Tabela 3).

DISCUSSÃO

A maturação e a fertilização de oócitos desnudados resultam em baixas

taxas de clivagem e de desenvolvimento embrionário (Fukui et al., 1990; Zhang et

al., 1995; Kim et al., 1996; Landin-Alvarenga et al., 1999). Em bovinos, os resultados

quanto à participação das células do cumulus na fertilização são contraditórios.

Embora considere-se que in vivo, as células do cumulus sejam liberadas dos oócitos

dentro de 3 h no oviduto da fêmea bovina (Lorton e First, 1979), elas normalmente

são mantidas durante a maturação e fertilização in vitro nos protocolos

convencionais de produção de embriões in vitro. Cox et al. (1993) relataram que as

células do cumulus aumentam as taxas de fertilização somente quando estão

associadas com os oócitos e Lenz et al. (1982) demonstraram que, em bovinos,

alguns componentes do cumulus facilitam a reação acrossomal.

Os resultados do presente trabalho demonstraram claramente a importância

da presença das células do cumulus durante o processo de fertilização in vitro de

oócitos bovinos. Os oócitos desnudados após a maturação in vitro apresentaram

51

menores taxas de clivagem e de desenvolvimento embrionário que os oócitos do

grupo controle.

Behalova e Greve (1993) sugeriram que a presença das células do cumulus

protege contra a poliespermia, enquanto Hunter e Nichol (1988) relataram que a

condição do oócito e não a presença das células do cumulus, é que importa para a

fertilização monoespérmica.

A variação dos resultados quanto às taxas de poliespermia pode estar

relacionada às condições em que a FIV é realizada, principalmente com relação à

concentração espermática e ao tempo em que os espermatozóides permanecem em

contato com os oócitos (Chian et al., 1995). A taxa de formação de três pronúcleos

não foi superior a 6% para nenhum dos grupos, indicando que a taxa de

poliespermia ou da falta da extrusão do segundo corpúsculo polar aparentemente

não foi aumentada pelos procedimentos empregados.

Diferentemente de oócitos de camundongos, que podem apresentar um

endurecimento espontâneo da zona pelúcida (zona hardening), quando são

desnudados e cultivados reduzindo as taxa de fertilização (De Felici e Saracusa,

1982; Gianfortoni e Gulyas, 1985), os oócitos de bovinos paracem sofrer pouco ou

nenhum efeito de endurecimento da zona pelúcida, quando as células do cumulus

são removidas usando hialuronidase e o pipetagem (Chian et al., 1994; Chian et al.,

1995).

Embora não tenha sido encontrada diferença significativa quanto à taxa de

blastocisto no uso da hialuronidase em relação à tripsina, a hialuronidase permitiu o

desnudamento mais rápido e prático quando se fez a pipetagem, reduzindo

rapidamente a viscosidade do cumulus expandido.

A remoção das células do cumulus pela pipetagem apresentou resultado

melhor que o uso do vórtex, possivelmente por uma ação física menos agressiva

sobre os oócitos, uma vez que a pipetagem é controlada manualmente, com os

oócitos sob observação. A localização da placa metafásica pode ser alterada pelos

procedimentos de desnudamento, como no caso do uso do vórtex, e o corpúsculo

polar não servir desta forma como referência para a introdução da pipeta (Palermo et

al., 1996). Esta seria uma hipótese de como uma ação mecânica causada durante o

desnudamento poderia afetar negativamente o desenvolvimento embrionário.

Em humanos, normalmente o número de oócitos disponíveis para ICSI é

52

bem reduzido, portanto o desnudamento é feito individualmente. Diferentes

concentrações de hialuronidase foram testadas (80 a 760 UI/ ml) com pipetas de

diferentes diâmetros (250 a 1000µm) para redução das taxas de degeneração e

ativação partenogenética causada pela enzima (Van de Velde et al., 1997).

Neste trabalho, optou-se pelo uso de uma pipeta de 100µl, que permite o

desnudamento de um grande número de oócitos (até mais de 200) em uma gota de

50 µl de meio com hialuronidase, de forma simples, rápida e eficiente, com

observação dos oócitos sob uma lupa estereoscópia normalmente utilizada para a

manipulação de embriões.

Não foram encontradas diferenças significativas entre o uso do vórtex e da

pipeta para o desnudamento, porém o uso da pipeta sob controle visual permitiu a

observação da remoção das células, reduzindo o tempo de exposição dos oócitos à

hialuronidase ou tripsina e o acompanhamento individual dos oócitos, garantindo

que todos fossem desnudados.

Apesar da seleção dos oócitos desnudados apresentando o primeiro

corpúsculo polar não ter resultado em taxas de blastocistos mais elevadas em

relação aos grupos de oócitos não selecionados, este processo de seleção é

importante para experimentos que envolvem a micromanipulação, usando-se um

menor número de oócitos, de melhor qualidade, que sofreram o processo de

maturação.

Diferentemente de outros trabalhos que encontraram efeitos positivos da

adição da glutationa ou de seus precursores ao meio de maturação e cultivo

(Grupen et al., 1995; Luvoni et al., 1996), a adição de glutationa no meio de

maturação não promoveu o aumento esperado nas taxas de formação de

pronúcleos. Ao contrário, a adição da glutationa afetou negativamente o

desenvolvimento embrionário no presente trabalho. Estes resultados poderiam ser

explicados pela diferença de composição dos meios, uma vez que a ação da

glutationa seria mais significativa em meios sem soro ou livres de proteína, que

apresentam deficiência nos precursores de glutationa (cisteína e cistina). Kim et al.

(1999) demonstraram que a adição de glutationa ao meio de fertilização apresentou

efeitos que variaram de acordo com o touro utilizado na fertilização e também

conforme a concentração empregada (0,1; 1 e 10mM).

Pelos resultados encontrados neste trabalho, a centrifugação a 7000xg por 5

53

min não afetou a formação de pronúcleos ou o desenvolvimento embrionário após a

FIV. Entretanto, a centrifugação pode causar ativação partenogenética dos oócitos

quando realizada a altas velocidades, acima de 10.000xg (Chung et al., 2001), e

poucos estudos foram feitos sobre os efeitos da centrifugação no cariótipo dos

zigotos produzidos.

A incubação dos oócitos oito horas após a fertilização em 10 mM de DTT

não alterou significativamente as taxas de formação de pronúcleos. Contudo, houve

um aumento em números absolutos das taxas de clivagem e da formação de

blastocistos em relação aos grupos desnudados e não incubados com DTT.

Apesar de não ter sido estatisticamente significante, essa maior taxa de

formação de blastocistos, após a incubação com DTT, pode ser conseqüência de um

efeito redutor do DTT no meio, neutralizando agentes oxidantes e radicais livres

responsáveis por danos às estruturas celulares do oócito. Outras substâncias

redutoras, como o β-mercaptoetanol, também têm sido empregadas em diferentes

ocasiões (MIV, FIV CIV ou transporte) visando à redução de danos oxidativos nos

sistemas de cultivo in vitro, melhorando as taxas de desenvolvimento embrionário,

as taxas de eclosão e a qualidade dos embriões (Takahashi et al., 1996).

CONCLUSÕES

Os procedimentos de preparo dos oócitos bovinos para micromanipulação

como o desnudamento, centrifugação e seleção pela presença do corpúsculo polar

aparentemente não interferiram na penetração do espermatozóide e na formação

dos pronúcleos. Contudo, a clivagem e o desenvolvimento a blastocisto foram

afetadas negativamente, mostrando que, embora a presença das células do cumulus

não seja absolutamente necessária para a fertilização, o desnudamento resulta em

baixas taxas de desenvolvimento embrionário.

O protocolo de desnudamento, envolvendo o uso da hialuronidase associada

à remoção das células com uma pipeta, apresentou-se como um método simples e

eficiente em relação aos demais métodos. A adição de glutationa ao meio de

54

maturação e a incubação dos oócitos em DTT após a fertilização não melhoraram os

resultados da fertilização dos oócitos desnudados. Mais estudos são necessários

sobre como o benefício da presença das células do cumulus pode ser substituído

quando se utiliza oócitos desnudados.

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59

EFEITO DO PRÉ-TRATAMENTO ESPERMÁTICO E DA ATIVAÇÃO DE OÓCITOS

BOVINOS NO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO APÓS A INJEÇÃO

INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDE (ICSI)

RESUMO

A injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) é uma técnica

alternativa para o método de fertilização in vitro (FIV) convencional quando poucos

espermatozóides estão disponíveis ou quando estes apresentam baixa capacidade

de fertilização. O presente estudo teve por objetivo investigar os efeitos de diferentes

tratamentos espermáticos e os protocolos de ativação oocitária visando a melhorar a

eficiência da ICSI em oócitos bovinos. Oócitos maturados in vitro e desnudados

foram microinjetados com espermatozóides não-tratados ou pré-tratados. Os pré-

tratamentos consistiram da incubação com DTT, associado ou não com brometo de

alquiltrimetilamônio (ATAB), Triton X-100 ou após a lesão da membrana plasmática

pelo congelamento/ descongelamento sem crioprotetor. Os protocolos de ativação

oocitária envolveram o uso de etanol 7% ou cálcio ionóforo (Ca-I A23187) +

ciclohexamida (CHX) ou ionomicina (Ionom.) + 6-dimetilaminopurina (6-DMAP). As

taxas de formação de pronúcleo, de clivagem e de formação de blastocisto foram

registradas para a comparação dos tratamentos. Para verificar a correta fertilização

dos oócitos injetados, os embriões foram sexados utilizando a técnica de Reação de

Polimerase em Cadeia (PCR). Oócitos fertilizados pela FIV convencional e oócitos

ativados sem a microinjeção serviram de grupo controle. Entre os grupos de oócitos

não-ativados, baixas taxas de clivagem (3% - 5%) e de formação de blastocisto (0% -

1%) foram obtidas, sem efeitos positivos dos pré-tratamentos espermáticos (P>0,05).

A ativação química dos oócitos após a ICSI resultou em maiores taxas de clivagem

(33% - 58%) em relação aos grupos não-ativados (P<0,05), com o protocolo de

ativação com ionomicina + 6-DMAP fornecendo uma maior taxa de formação de

blastocisto em relação aos protocolos com etanol ou Ca-I + CHX (13% vs 3% vs 4%,

respectivamente)(P<0,05). Quando diferentes pré-tratamentos de espermatozóide

foram combinados com a ativação usando ionomicina + 6-DMAP, altas taxas de

60

clivagem foram obtidas (51% - 75%). Entretanto, não foram observadas diferenças

significativas na formação de blastocistos (P>0,05) entre os grupos de oócitos

ativados (não-injetado), injetados com espermatozóide controle e injetados com

espermatozóides pré-tratados, com taxas variando de 9% a 15% (P>0,05). Apesar da

produção bem-sucedida de blastocistos e blastocistos eclodidos por meio da ICSI no

presente estudo, nenhum dos embriões produzidos foi sexado como macho,

sugerindo a ocorrência de uma alta taxa de desenvolvimento partenogenético.

Palavras-chave: ativação oocitária, bovino, fertilização in vitro, ICSI, tratamento

espermático

ABSTRACT

Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI) is an alternative technique to the

conventional in vitro fertilization method (IVF), particularly when few sperm cells are

available or when sperm fertilization capacity is low. The present study was carried

out to investigate the effects of sperm pretreatments and oocyte activation protocols

in order to improve the results of ICSI into bovine oocytes. In vitro matured and

denuded oocytes were injected with non-treated (control) or pretreated sperm. Sperm

pretreatments consisted of incubation with dithiotreitol (DTT), alone or associated to

alkyltrimethylammonium bromide (ATAB), Triton X-100 or after membrane damage by

freezing/ thawing without cryoprotector. Chemical activation protocols involved the

incubation with ethanol 7%, calcium ionophor (Ca-I A23187) plus cyclohexamide

(CHX) or ionomycin plus 6-dimethylaminopurine. Pronuclei formation, cleavage and

blastocyst rates were registered to compare the treatments. To verify the correct

fertilization of the injected oocytes, embryos were sexed using the Polymerase Chain

Reaction technique (PCR). In vitro fertilized (conventional IVF) and non-injected

activated oocytes served as control groups. Among the non-activated groups, low

cleavage (3% - 5%) and blastocyst rates (0% - 1%) were obtained, with no positive

effect of the sperm pretreatments (P>0.05). Chemical activation of oocytes after ICSI

allowed higher cleavage rates (33% - 58%) in comparison to the non activated groups

61

(P<0.05), with the activation protocol using ionomicyn + 6-DMAP resulting the higher

blastocyst rate in comparison to the ethanol or CA-I + CHX protocols (13% vs 3% vs

4%, respectively)(P<0.05). When different sperm pretreatments were combined with

activation using ionomycin + 6-DMAP, high rates of cleavage were obtained (51% -

75%). However, no significant difference of blastocyst rate was observed among

activated (non-injected), control sperm and sperm pretreated injected groups, with

rates ranging from 9% to 15% (P>0.05). Despite the successfully production of

blastocysts and hatched blastocysts by ICSI in the present study, none of the

produced embryos was sexed as male, suggesting a high rate of parthenogenetic

development.

Key words: bovine, ICSI, in vitro fertilization, oocyte activation, sperm pretreatment

INTRODUÇÃO

Desde a primeira publicação sobre a Injeção intracitoplasmática (ICSI) em

oócitos de mamíferos por Uehara e Yanagimachi em 1976, a ICSI tem se

desenvolvido como uma técnica de grande interesse em diversos campos da

reprodução.

O nascimento de animais de diversas espécies de mamíferos por meio da

ICSI foi relatado por diversos autores, incluindo coelhos (Hosoi et al., 1988),

camundongos (Kimura e Yanagimachi, 1995; Kuretake et al., 1996), suínos (Martin,

2000; Probst et al., 2002), ovelhas (Catt et al., 1995), cavalos (Cochran et al., 1998),

(Hewitson, et al., 1999), humanos (Palermo et al., 1992) e bovinos (Goto et al., 1990;

Hamano et al., 1999; Horiuchi et al., 2002; Wei e Fukui, 2002).

Taxas de fertilização por meio da ICSI, sem ativação química dos oócitos,

são particularmente altas em humanos (40 a 60%, Devroey et al., 1994; Lundin et al.,

1994) mas, em bovines, foram descritas baixas taxas de ativação e de formação de

pronúcleo (menores que 20%), quando se realizou apenas a injeção de

espermatozóide sem tratamentos adicionais (Westhusin et al., 1984; Younis et al.,

1989; Goto et al., 1990; Keefer et al., 1990; Goto, 1993; Chen e Seidel , 1997; Rho et

al., 1998b, Li et al., 1999; Chung et al., 2000; Horiuchi et al, 2002).

62

Diversos fatores têm sido sugeridos para estas baixas taxas de formação de

pronúcleo e de ativação, incluindo a alta condensação dos espermatozóides bovinos

pelo maior número de pontes dissulfídicas (Seligman et al., 1991, Katayose et al.,

1999), as condições e tempo de maturação in vitro dos oócitos e possíveis erros da

técnica de microinjeção, devido à alta elasticidade da membrana plasmática do

oócito bovino (Katayose et al., 1999, Horiuchi et al., 2002).

Para compensar a baixa taxa de descondensação espermática, o efeito de

diferentes pré-tratamentos dos espermatozóides vem sendo estudado, incluindo

tratamentos químicos e físicos que visam à permeabilização da membrana do

espermatozóide, à indução da reação acrossomal e à descondensação do núcleo do

espermatozóide (Chen e Seidel, 1997; Rho et al., 1998b; Li et al., 1999; Suttner et

al., 2000). Sugere-se que a imobilização do espermatozóide e a permeabilização da

sua membrana sejam requisitos necessários para o acesso de um possível fator

oocitário de descondensação do espermatozóide injetado. (Swann et al., 1994).

A permeabilização da membrana do espermatozóide por meios físicos tem

resultado em um aumento das taxas de formação de pronúcleo masculino após a

ICSI em oócitos humanos (Dozortsev et al., 1995; Palermo et al., 1996). Danos à

membrana plasmática podem ser feitos por meio da imobilização física do

espermatozóide com a pipeta de injeção (Horiuchi et al., 2002), pelo congelamento e

descongelamento sem crioprotetores (Perreault et al., 1988; Catt e Rhodes, 1995;

Horiuchi et al., 2002), pelo corte da cauda com uma lanceta de vidro (Wei e Fukui,

2002), ou pela separação da cauda por sonicação (Hamano et al., 1999)

Além do pré-tratamento dos espermatozóides, diferentes protocolos de

ativação oocitária também têm sido utilizados em conjunto com a ICSI, na tentativa

de aumentar as taxas de fertilização após a ICSI em bovinos, incluindo o etanol

(Nagai, 1987; Hamano et al., 1999; Horiuchi et al., 2002), ionóforos de cálcio Ca-I

A23187 e ionomicina, sozinhos ou combinados com outras substâncias, inibidoras da

síntese protéica como a 6-dimetil aminopurina (Chen e Seidel, 1997; Katayose et al.,

1999), e a ciclohexamida (Suttner et al., 2000).

O presente trabalho teve por objetivo estudar os efeitos do pré-tratamento

espermático e da ativação química, na fertilização de oócitos bovinos por meio da

ICSI.

63

MATERIAL E MÉTODOS



térmica, à temperatura de 30ºC em solução tampão-fosfato, com pH ajustado 7,4;


transporte até o laboratório. Os folículos com diâmetro entre 2 a 8 mm foram



Após o repouso dos tubos por 10 min, o sedimento foi transferido para uma placa de

Petri, para a recuperação e para a seleção dos complexos cumulus-oócitos (COCs).


três camadas celulares e com citoplasma de aparência homogênea segundo a

classificação de De Loos et al. (1989). Esses COCs foram lavados por três vezes em




placa de 4 poços, sendo o meio coberto com 400 µl de óleo mineral. A maturação foi

realizada em estufa de cultivo em atmosfera umidificada, com 5% de CO2 a 39ºC,

durante 18-20 horas.







gotas de 20 µl de meio de micromanipulação (TCM199-HEPES acrescido de 4 mg

/ml de BSA), em uma tampa estéril de placa de Petri de 35 mm de diâmetro, sendo




corpúsculo polar, foram selecionados utilizando-se uma micropipeta de vidro com

64

abertura interna da extremidade de cerca de 150 µm, acoplada a um sistema de



Preparo dos espermatozóides


bons resultados em FIV foram descongeladas em banho-maria a 39ºC, por 30

segundos. Os espermatozóides viáveis foram separados pela técnica de "Swim-up"

por 1 hora em estufa (39ºC) em meio Sp-TALP (Meio de Tyrode com albumina-

lactato-piruvato) acrescido de BSA livre de ácidos graxos (6 mg/ml), penicilamina

(20 µM), hipotaurina (10 µM) e epinefrina (2 µM). A parte superior (0,5 ml) do

sobrenadante foi retirada e depositada em um outro tubo, sendo, em seguida,

centrifugada a 600 xg por 10 min. O sobrenadante foi descartado e uma alíquota de

5µl retirada para determinação da concentração espermática.

Tratamento dos espermatozóides para ICSI

Espermatozóides não tratados - controle

Para o preparo dos espermatozóides para ICSI, 20 µl do sedimento de

espermatozóides purificados anteriormente pelo método de “Swim-up” foram

transferidos para um tubo de centrífuga de 1 ml e 40 µl da solução de

polivinilpirrolidona (10% de PVP em solução salina 0,9%) foram adicionados para a

diluição dos espermatozóides. A concentração foi conferida a partir de uma pequena

gota sob microscópio de fase e, quando necessário, adicionava-se mais solução de

PVP, de forma que não houvesse excesso de espermatozóides. Estes

espermatozóides foram mantidos em estufa até o momento da ICSI, servindo como

controle.

Espermatozóides tratados com DTT.

O tratamento com ditiotreitol (DTT) consistiu na adição de 20 µl do

sedimento de espermatozóides a 1 ml de solução Sp-Talp contendo 5 mM de DTT,

seguida pela incubação à temperatura ambiente por 30 min. Após este período, os

espermatozóides foram lavados por duas vezes com Sp-Talp, centrifugados a 3.400

65

rpm por 10 min e, após a última lavagem, foi adicionada solução de PVP ao

sedimento, conforme descrito anteriormente.

Espermatozóides congelados/ descongelados e tratados com DTT

Os espermatozóides foram tratados como no procedimento anterior, porém,

para induzir a ruptura da membrana plasmática, foram previamente congelados e

descongelados em Sp-TALP sem crioprotetor em criotubos, por imersão direta em

nitrogênio líquido por 10 min e descongelados em banho-maria a 39ºC.

Espermatozóides tratados com ATAB + DTT

Os espermatozóides foram ressuspendidos em 1 ml de solução Sp-TALP

contendo 0,1% de alquiltrimetilamônio (ATAB) + 2 mM de DTT e mantidos por 30

min sob agitação leve. Em seguida, foram realizadas duas lavagens com Sp-Talp e,

após a última lavagem, foi adicionada solução de PVP, conforme descrito

previamente.

Espermatozóides tratados com Triton + DTT

Os espermatozóides foram ressuspendidos em 1 ml de solução Sp-TALP

contendo 0,1% de Triton X-100 + 2 mM de DTT e mantidos por 30 min. sob agitação

leve. Em seguida, foram realizadas duas lavagens com Sp-Talp e, após a última

lavagem, foi adicionada solução de PVP, conforme descrito previamente.

Técnica de Injeção intracitoplasmática de espermatozóide

Para injeção intracitoplasmática de espermatozóide, três gotas de 15µl de

meio de micromanipulação (TCM 199+ 4 mg BSA/ ml) foram feitas na tampa de uma

placa de Petri de 35 mm (Nunc., Naperville, IL). Próximo às duas primeiras, outras

duas gotas de 5 µl da suspensão de espermatozóides com PVP eram feitas. De sete

a oito oócitos foram colocados em duas gotas do meio, sendo a terceira gota de

meio utilizada para a lavagem ocasional da pipeta. Todas as gotas foram cobertas

com óleo mineral para evitar perda de líquido.

O equipamento de microinjeção consistiu de microinjetores CellTram Oil

(Eppendorf AG, Alemanha) para a manutenção do oócito e CellTram Vario

(Eppendorf AG, Alemanha) para microinjeção, micromanipuladores TransferMan

66

(Eppendorf AG, Alemanha) acoplados a um microscópio Zeiss Axiovert 135.

As pipetas de manutenção foram confeccionadas a partir de capilares

estéreis de borossilicato (1,0 mm de diâmetro externo e 0,75 mm de diâmetro

interno) esticados (25A, escala 4,5) em um estirador de pipetas (Bachoffer-

Alemanha) e cortadas com diâmetro externo de cerca de 120 mm e polidas em uma

microforja. As pipetas de microinjeção para ICSI (TransferTip Eppendorf nº

5175112.008) foram adquiridas prontas (Eppendorf AG, Alemanha), possuindo o

diâmetro interno de 7 µm e diâmetro externo de 9 µm.

O movimento do espermatozóide foi reduzido pela própria solução de PVP e

a imobilização realizada pela quebra da cauda do espermatozóide com a

micropipeta de injeção. O espermatozóide foi aspirado pela cauda e mantido na

extremidade da pipeta de injeção. Para o tratamento que utilizou espermatozóide

com a cauda cortada, uma lanceta de vidro foi confeccionada com o mesmo material

da pipeta de manutenção e, por meio de manipuladores, a lanceta foi pressionada

ou arrastada sobre a região final da peça intermediária da cauda do espermatozóide,

deixando uma porção de aproximadamente 5 µm junto à cabeça do espermatozóide.

A pipeta de injeção contendo o espermatozóide foi então transferida para a

gota onde estavam os oócitos a serem injetados e um oócito foi mantido pela pipeta

de manutenção por um dos lados, de forma que o corpúsculo polar ficasse na

posição de 6 ou 12 h.

Uma vez o oócito colocado na posição desejada e mantido por sucção, a

micropipeta de injeção foi introduzida pela zona pelúcida até quase o outro lado do

citoplasma e uma pequena quantidade de citoplasma foi aspirada para o interior da

pipeta, para causar a ruptura da membrana. O espermatozóide foi então

microinjetado, procurando-se injetar a menor quantidade possível de meio, sendo a

pipeta de injeção removida cuidadosamente e o oócito liberado da micropipeta.

O procedimento de microinjeção foi feito à temperatura ambiente (25°C).

Após a microinjeção, os oócitos foram lavados em TCM/ BSA e submetidos aos

diferentes métodos de ativação (Fig. 1).

67

A

B

Figura 1. ICSI em oócito bovino desnudado. (A) Penetração da micropipeta pela zona pelúcida. (B) Aspiração da membrana plasmática seguida da deposição do espermatozóide no interior do citoplasma (aumento de 400x). Corpúsculo polar encontra-se na posição 6 h.

Ativação dos oócitos após a microinjeção

Para a ativação dos oócitos foram realizados 3 protocolos:

1. Etanol 7%

Após a ICSI, os oócitos foram colocados em uma gota de 50 µl de TCM/

OCS contendo 7% de etanol por 5 min e, posteriormente, lavados por 3 vezes em

gotas de TCM/ BSA para remoção do etanol, seguindo-se então o cultivo em Fert-

TALP/ BSA por 18h.

2. Ionóforo de cálcio (CaI A23187) e ciclohexamida (CHX)

Os oócitos microinjetados foram incubados por 5 min em meio TCM/ OCS

contendo 5 µM de CaI A23187, lavados novamente em TCM/ OCS e cultivados por 4

h em meio SOF/ OCS para permitir a extrusão do segundo corpúsculo polar. Após

este período, os oócitos foram transferidos para 400µl de SOF/ OCS, contendo 5 µM

de CHX e mantidos em estufa por mais 3 h. Após este período, os oócitos foram

novamente lavados em TCM/ OCS, seguindo-se então o cultivo em em Fert-TALP/

BSA por 11 h.

68

3. Ionomicina e 6-DMAP

Os oócitos foram incubados em uma gota de 100 µl com 5 µM de ionomicina

em TCM/ BSA (4 mg/ ml) por 5 min e então 100 µl de TCM/ BSA (30 mg/ml) foram

adicionados a esta gota e deixados por 5 min, para cessar o processo de ativação.

Os oócitos foram então lavados em TCM/ OCS e cultivados por 4 h em meio TCM/

BSA para permitir a extrusão do segundo corpúsculo polar. Após este período, os

oócitos foram transferidos para uma gota de TCM/ BSA, com 1,9 mM DMAP e

mantidos em estufa por mais 3 h. Posteriormente, os oócitos foram novamente

lavados em TCM/ OCS, seguindo-se então o cultivo em Fert-TALP/ BSA por 11 h.

Fertilização in vitro

Parte dos oócitos maturados foram fertilizados in vitro, servindo como grupo

controle, com uma concentração espermática de 2 x 106 espermatozóides/ ml a

partir da suspensão de espermatozóides preparada inicialmente. A fertilização foi

realizada em 400 µl de meio de fertilização (Fert-TALP + 6 mg BSA/ ml), em placas

de 4 poços por 18 h em estufa de cultivo a 39ºC com 5% de CO2.


Após o período de fertilização, ativação ou ICSI, os oócitos foram lavados

em meio SOF + 10% de OCS para remoção de restos celulares e cultivados por

nove dias, em 400 µl de SOF + 10% de OCS e antibióticos, a 39ºC com 5% de CO2,

5% de O2 e 90% de N2. As taxas de clivagem e de formação de blastocisto foram

registradas nos dias, d3 e d7-d9, respectivamente.

Congelamento dos embriões

Os embriões foram lavados três vezes em tampão Kawasaki (20 mM Tris-

HCl pH 8,3; 1,5 mM MgCl2; 25 mM KCl, 0,5% (v/v) Tween 20; 0,1% PVP) e

transferidos para tubos de PCR com 5 µl do mesmo tampão. Os tubos foram

identificados e armazenados a –80°C até a sexagem.

69

Sexagem dos embriões produzidos por ICSI

Com o objetivo de se avaliar a fertilização dos embriões produzidos por meio

da ICSI, parte destes foi sexada pela técnica da reação de Polimerase em Cadeia

(PCR), utilizando um par de primers que amplifica a seqüência do gene da

amelogenina bovina (bAML), bAML-sense (5´AAA TTC TCT CAC AGT CCA AG´3) e

bAML-antisense (5´CAA CAG GTA ATT TTC CTT TAG´3), resultando em produtos

de diferentes comprimentos (Chen et al., 1999).

Embriões produzidos por FIV convencional foram utilizados como controle

para validação da técnica. Embriões apresentando a banda Y de 341bp,

apresentando ou não a banda de 467 bp, foram considerados machos e portanto

fertilizados. Embriões apresentando somente a banda de 467 bp foram considerados

não-machos, podendo ser fêmeas fertilizadas ou embriões não-fertilizados

(desenvolvimento partenogenético decorrente da ativação química).

Os embriões armazenados nos tubos de PCR foram descongelados à

temperatura ambiente por 5 min e, posteriormente, mantidos em gelo. Em seguida,

10 µl de solução de proteinase K (2 mg/ ml Proteinase-K em tampão Kawasaki)

foram adicionados a cada tubo para a dissolução da zona pelúcida e das

membranas celulares. Os tubos foram incubados a 60°C por 60 min e, em seguida,

a 95°C por 15 min, para a inativação da Proteinase-K. Após este período, os tubos

foram novamente recolocados em gelo.

Para amplificação do DNA, foi preparada uma mistura de PCR composta de

(volume por amostra) tampão PCR 10x (2,5 µl), mistura de desoxirribonucleotídeos-

trifosfato (dNTP´s) (2,5 µl), par de primers bAML (1,25 µl de cada), H2O (2,25 µl),

Taq-Polimerase HotStar (0,25 µl), embrião em tampão Kawasaki (15 µl), totalizando

um volume de 25 µl.

Antes do início da reação, a tampa do termociclador foi pré-aquecida a

105°C. O programa para a amplificação consistiu o programa das seguintes etapas :

(1) aquecimento a 94ºC por 15 min, para a desnaturação inicial, (2) 50 sega 94ºC

(desnaturação), (3) 1 min a 54ºC (anelamento), (4) 1 min a 72ºC (extensão)

resfriamanto a 4ºC. As etapas de 2 a 4 consistiam um ciclo e foram repetidas 38

vezes, seguindo então as etapas 8 a 9.

70

Após a realização da PCR, 7 µl de cada amostra foram misturados com 3 µl

de tampão de gel e depositados nos poços do gel de agarose (2,5% agarose com 3

µl/ 100 ml de brometo de etídio). Como padrão de peso molecular, foram utilizados

4µl de pUC19/ MspI (MBI Fermentas). A corrida foi realizada por 30 min sob campo

elétrico de 120V e as bandas de DNA visualizadas e fotografadas sob luz

ultravioleta.





os dados foram transformados para raiz quadrada e testados novamente.





quando P<0,05.

O modelo estatístico empregado para a avaliação do efeito dos tratamentos na

Análise de Variância foi:


Onde:


µ = média geral



71

RESULTADOS

Após a maturação in vitro e o desnudamento, aproximadamente 80% dos

oócitos apresentavam o primeiro corpúsculo polar, com uma grande variedade da

aparência do citoplasma. Para a seleção, descartaram-se os oócitos de aparência

muito claro e uniforme, com poucas granulações ou aqueles de citoplasma muito

heterogêneo com grânulos muito escuros.

Durante a microinjeção, 5-10% dos oócitos foram lesionados e descartados,

e o restante submetido aos protocolos de ativação e cultivado para a avaliação dos

tratamentos. No momento de transferência dos embriões para o meio de cultivo (18h

após a ICSI), os oócitos que se apresentavam degenerados (desidratados ou com

citoplasma extruído) foram descartados, mas computados no número total de oócitos

microinjetados.

Experimento 1

No primeiro experimento, foram estudados isoladamente os efeitos dos pré-

tratamentos espermáticos e dos protocolos de ativação dos oócitos microinjetados

estudou-se isoladamente nas taxas de clivagem e de formação de blastocistos após

ICSI.

O grupo controle de ICSI (sem pré-tratamento espermático e sem ativação

oocitária) apresentou uma baixa taxa de clivagem (4%) e não foi obtido nenhum

blastocisto. Também foram obtidas baixas taxas de clivagem (3% a 5%) e de

formação de blastocistos (0% a 1%) para os grupos onde não foi realizada ativaçao

oocitária, não havendo efeito positivo dos pré-tratamentos espermáticos (DTT, DTT

+ ATAB ou DTT + Triton-X100) em relação ao grupo não-tratado (P>0,05).

Quando oócitos foram ativados após a ICSI com os espermatozóides não-

tratados, foram obtidas maiores taxas de clivagem e de formação de blastocisto em

relação ao grupo controle. As menores taxas de clivagem e de formação de

blastocistos, após a ICSI, foram obtidas com os métodos de ativação com CaI +

CHX (36% e 4%) e com etanol 7% (33% e 3%).

72

Tabela 1. Efeito do pré-tratamento dos espermatozóides e da ativação oocitária nas

taxas de clivagem e formação de blastocistos após ICSI e FIV com oócitos desnudados

Pré-tratamento espermático

Fertilização Protocolo de

ativação Oócitos

injetados Repetições

Clivagem d3 (%)

Blastocistos d7-d9 (%)

- ICSI - 101 7 4 (4)a 0 (0)

DTT ICSI - 75 5 2 (3)a 0 (0)

DTT + ATAB ICSI - 76 5 2 (3)a 0 (0)

DTT+ Triton ICSI - 76 5 4 (5)a 1 (1)a

- ICSI CaI + CHX 104 7 37 (36)b 4 (4)a

- ICSI Etanol 7% 98 7 32 (33)b 3 (3)a

- ICSI Ion+ 6-Dmap 105 7 61 (58)c 14 (13)b

- FIV-D - 165 11 118 (71)d 51 (31)c

Valores na mesma coluna com letras diferentes diferem significativamente (P<0,05).

O protocolo de ativação que forneceu os melhores resultados de clivagem e

de formação de blastocistos foi com ionomicina + 6-DMAP (58% e 13%, P<0,05),

contudo estes resultados foram significativamente menores que os obtidos para a

FIV convencional de oócitos desnudados (71% e 31; P<0,05) (Tabela 1).

Experimento 2

De acordo com os resultados obtidos no primeiro experimento, o protocolo

de ativação com ionomicina + 6-DMAP forneceu os melhores resultados de clivagem

e de formação de blastocistos e, portanto, foi escolhido para a realização do

segundo experimento, no qual foi combinado com diferentes protocolos de pré-

tratamento espermático.

Quando foram realizadas as combinações de pré-tratamento espermático

com a ativação de ionomicina + 6-DMAP, as taxas de clivagens obtidas foram

superiores a 50% em todos os grupos, sendo que o grupo onde o espermatozóide

foi congelado e descongelado, seguindo a incubação com DTT antes da

microinjeção, resultou em baixas taxas de clivagem e de formação de blastocistos

(51% e 9%, respectivamente (Tabela 2).

73

Não houve diferenças significativas entre as taxas de formação de

blastocistos entre os grupos de oócitos microinjetados com espermatozóide não-

tratado (15%), espermatozóides incubados com DTT (15%), espermatozóides

congelados/ descongelados (C/D) e incubados com DTT (9%), espermatozóides

incubados com DTT + Triton X-100 (14%) e oócitos não-injetados ativados (13%). A

taxa de formação de blastocistos de FIV convencional de oócitos desnudados foi

significativamente superior à taxa dos demais grupos (42%, P<0,05).

Tabela 2. Efeito do pré-tratamento espermático em combinação com ativação

oocitária nas taxas de clivagem e de formação de blastocistos após ICSI

e FIV com oócitos desnudados

Pré-tratamento espermático Fertilização Ionom.

+ 6-DMAP Oócitos

injetados Repetições Clivagem d3 (%)

Blastocisto d7-d9 (%)

Controle ICSI + 73 5 50 (68)ab 11 (15)b

DTT ICSI + 72 5 46 (64)ab 11 (15)b

C/ D + DTT ICSI + 76 5 39 (51)b 7 (9)b

DTT + Triton ICSI + 72 5 54 (75)a 17 (14)b

- - + 76 5 55 (75)a 10 (13)b

- FIV - 133 9 105 (79)a 55 (42)a

Valores na mesma coluna com letras diferentes diferem significativamente (P<0,05).

A avaliação da fertilização dos embriões produzidos por ICSI foi realizada por

sexagem pelo método da PCR, a fim de se determinar a porcentagem de embriões

machos e comprovar desta forma, a ocorrência da fertilização.

O protocolo de amplificação por PCR da seqüência da amelogenina dos

embriões produzidos por FIV demonstrou-se eficiente para a sexagem dos embriões,

resultando em bandas nítidas e definidas de fragmentos do cromossomo X (467bp) e

Y (341 bp).

74

Os embriões de FIV sexados como machos apresentaram duas bandas,

sendo uma do cromossomo X (467bp) e a outra do cromossomo Y (341 bp),

embriões com apenas uma banda (467bp) foram classificados como não-machos

(Fig. 2).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 2. Fotografia de gel de agarose mostrando bandas X (467bp) e Y (341 bp), da seqüência da amelogenina bovina (bAML) de embriões de FIV, coradas com brometo de etídio, sob luz ultravioleta. Amostra 1= padrão de peso molecular (pUC19). Embriões nº 3, 6, 9 e 10: não-machos; embriões nº 2, 4, 5, 7, 8: machos.

Os embriões provenientes de ativação partenogenética deveriam apresentar

apenas a banda correspondente ao cromossomo “X” pela ausência de

espermatozóide. Os embriões de ICSI deveriam apresentar duas bandas quando

fertilizados por um espermatozóide Y e com uma banda quando fertilizados por

espermatozóide X ou provenientes de ativação partenogenética. Entretanto, nenhum

embrião de ICSI foi sexado como macho. (Fig. 3).

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Figura 3 . Fotografia de gel de agarose mostrando banda X (467bp), da seqüência da amelogenina bovina (bAML), coradas com brometo de etídio, sob luz ultravioleta. Amostra 11: padrão de peso molecular (pUC19). Embriões de ICSI: 12, 13, 14, 17, 18, 19 e 20. Embriões de ativação: 15 e 16.

467 bp

341bp

467 bp

75

Para embriões de FIV de oócitos não-desnudados, foi obtida uma

porcentagem de machos de 50% (8/16) e para os embriões de FIV de oócitos

desnudados de 33% (4/12). Dos 7 embriões partenogenéticos analisados, 7 (100%)

foram classificados como não-machos, indicando a ausência do cromossomo Y por

não terem sido fertilizados.

Todos os embriões produzidos por ICSI analisados também foram

classificados como não-machos 11/11 (100%), indicando que possivelmente nenhum

deles tenha sido fertilizado corretamente. Contudo, a ocorrência de embriões

fertilizados por ICSI com um espermatozóide X não pode ser descartada. Os

resultados de sexagem dos embriões por grupo de tratamento encontram-se

resumidos na Tabela 3.

Tabela 3. Sexagem dos embriões produzidos in vitro por FIV, ativação

partenogenética ou ICSI

Método de fertilização Método de ativação

Blastocistos examinados

Machos (%)

Não-macho (%)

FIV/ controle - 16 8 (50) 8 (50)

FIV/ oócitos desnudados - 12 4 (33) 8 (67)

- Ion. + 6-DMAP 7 0 (0) 7 (100)

ICSI Ion. + 6-DMAP 11 0 (0) 11 (100)

DISCUSSÃO

Para compensar a baixa taxa de descondensação espermática em bovinos,

vários trabalhos foram realizados avaliando-se o pré-tratamento dos

espermatozóides antes da ICSI, com agentes químicos redutores, visando à redução

das pontes dissulfídicas do núcleo do espermatozóide (Chen e Seidel, 1997; Rho et

al., 1998b; Li et al., 1999; Suttner et al., 2000). Desta forma, estes autores obtiveram

uma maior taxa de formação de pronúcleo e de clivagem dos oócitos microinjetados.

Os pré-tratamentos espermáticos realizados visando a danos à membrana

do espermatozóide utilizados no presente experimento (imobilização, congelamento/

76

descongelamento e corte da cauda) não resultaram em melhorias nos índices de

clivagem após a ICSI, mesmo com a incubação com DTT e, aparentemente, o

procedimento de congelamento/ descongelamento afetou negativamente o

desenvolvimento embrionário.

Apesar do tratamento com DTT promover descondensação dos

espermatozóides in vitro e resultar em maiores taxas de formação de pronúcleo após

a ICSI, o seu uso é discutível, uma vez que esse agente químico também pode inibir

a capacitação espermática por reduzir a fosforilação de proteínas espermáticas (De

Lamirande e Gagnon, 1998) e desestabilizar a cromatina espermática, o que levaria

a danos do genoma paternal (Suttner et al., 2000; Szcygiel e Ward, 2002).

Quando os oócitos microinjetados não foram submetidos à ativação química,

baixas taxas de clivagem foram obtidas, conforme relatado por outros pesquisadores

(Keefer et al., 1990; Goto, 1993, Katayose et al., 1999).

O tratamento com etanol a 7% pode promover a ativação de um maior

número de oócitos, porém os resultados têm sido contraditórios. Chen e Seidel

(1997) não obtiveram aumento do número de blastocistos formados a partir de

oócitos tratados com etanol 7%, em relação ao grupo não-ativado. Entretanto, o

nascimento de bezerros por esse método de ativação após a ICSI foi obtido por

Hamano et al. (1999) e por Horiuchi et al. (2002).

A ativação com CaI A23187 associada à CHX também tem resultado em

boas taxas de ativação, sem alterações marcantes do cariótipo dos embriões

produzidos. Suttner et al. (2000) observaram que 90% dos embriões produzidos por

ICSI utilizando ativação com CaI A23187 associada à CHX apresentavam um

cariótipo diplóide normal. A utilização desta combinação no presente trabalho não

resultou em uma satisfatória taxa de clivagem.

As maiores taxas de blastocistos produzidos por ativação oocitária após a

ICSI foram encontradas com a associação Ionomicina + 6-DMAP, estando de acordo

com os resultados de Rho et al., (1998b) e Suttner et al. (2000).

Entretanto, sabe-se que a 6-DMAP atua como um potente inibidor de

kinases, bloqueando a fosforilação protéica de forma irreversível. A 6-DMAP pode

causar alterações da placa metafásica, impedindo a extrusão do segundo corpúsculo

polar quando usada diretamente após a ativação com ionomicina (Rho et al., 1998a),

gerando embriões de cariótipo anormal em maior porcentagem que as taxas obtidas

77

com embriões de FIV convencional. Apesar da incubação por 4 h antes do uso da 6-

DMAP no presente experimento, para que a extrusão do segundo CP não fosse

bloqueada, os efeitos dessa substância nos eventos seguintes são desconhecidos.

Outras formas de ativação oocitária para o aumento da eficiência da ICSI

devem ser encontradas para que os riscos de alterações genéticas dos embriões

sejam reduzidos. A identificação e utilização de fatores espermáticos, visando a

promover a ativação oocitária de forma mais próxima à que ocorre fisiologicamente,

permitirá um grande avanço para o sucesso da ICSI. Wu et al. (1998) demonstraram

que a injeção de frações espermáticas de suínos em oócitos de camundongos

resultou em oscilações de cálcio muito similares àquelas resultantes do processo de

fertilização, capazes de iniciar a ativação oocitária normal.

Uma vez que a ativação química pode resultar na produção de embriões

partenogenéticos, sem a participação do espermatozóide microinjetado, a sexagem

dos embriões é uma alternativa para verificar a ocorrência de fertilização. Embriões

classificados como machos pela presença de fragmentos específicos do

cromossomo Y na amostra confirmam a fertilização dos embriões. Entretanto, para

embriões classificados como fêmeas não se pode afirmar se ocorreu ou não a

fertilização, e pressupõe-se que o número de fêmeas seria próximo ao número de

machos, pela relação de 50% das populações de espermatozóides X e Y.

Apesar do desenvolvimento a blastocisto e a obtenção de alguns blastocistos

eclodidos provenientes de ICSI, nenhum dos embriões de ICSI analisados foi

classificado como macho, sugerindo que, provavelmente, a maior parte dos embriões

foi proveniente de desenvolvimento partenogenético e de uma falha da fertilização.

Rho et al. (1998b) e Suttner et al. (2000) usaram esse método para determinar a

porcentagem de embriões bovinos fertilizados por ICSI e encontraram resultados de

33 e 57% de machos, respectivamente, para oócitos tratados com DTT e tratados

com o protocolo Ionomicina + 6-DMAP.

A falha de fertilização na ICSI pode ser devida a erros na técnica de

microinjeção, com a deposição do espermatozóide no espaço perivitelínico, à

expulsão do mesmo pelo oócito algumas horas após a microinjeção ou pela falta de

descondensação do espermatozóide para promover a formação do pronúcleo

masculino.

78

Recentemente, foi relatado o nascimento de bezerros a partir de embriões de

ICSI sem ativação química (Wei e Fukui, 2002). Estes autores utilizaram oócitos

maturados in vitro por um tempo mais prolongado (24-25h) e a microinjeção foi

realizada com o auxílio de um piezo-atuador, que garante uma deposição mais

precisa do espermatozóide, obtendo altas taxas de fertilização e nascimento de

bezerros de ICSI sem a ativação oocitária. Apesar desses autores terem

demonstrado a possibilidade da produção de embriões bovinos por ICSI de forma

mais segura e simplificada, abrindo novas perspectivas para o seu uso, os resultados

em termos de embriões produzidos por oócito injetado (22,7%) ainda precisam ser

melhorados.

CONCLUSÕES

A ativação com ionomicina + 6-DMAP resultou em taxas de clivagem

satisfatórias, mas o desenvolvimento embrionário após a ICSI foi aparentemente

afetado pelo procedimento de microinjeção ou devido à ausência de certas estruturas

espermáticas (no caso de apenas ativação). Além disso, não foi constatado nenhum

efeito positivo do pré-tratamento espermático em relação à microinjeção de

espermatozóides não tratados.

Apesar do desenvolvimento a blastocisto e da obtenção de alguns

blastocistos eclodidos provenientes de ICSI, nenhum dos embriões de ICSI

analisados foi classificado como macho, sugerindo que, provavelmente, a maior

parte dos embriões foi proveniente de desenvolvimento partenogenético, decorrente

da ativação química. Mais estudos sobre os eventos celulares do processo de

fertilização e da técnica de microinjeção são necessários para aumentar a eficiência

da ICSI em bovinos.

79


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84

FERTILIZAÇÃO E DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO APÓS INJEÇÃO

INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDE (ICSI) EM OÓCITOS BOVINOS

USANDO PIEZO-MICROMANIPULADOR

RESUMO

Nascimentos de bezerros provenientes da transferência de embriões

produzidos pela Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide (ICSI) têm sido

descritos nos últimos anos, porém os resultados da produção in vitro de embriões

bovinos por esta técnica ainda são baixos, quando comparados à fertilização in vitro

convencional. Enquanto a ICSI tem sido aplicada com sucesso em humanos, em

bovinos, os resultados obtidos são baixos, com altas taxas de oócitos não

fertilizados. Recentemente, foi descrito o uso de um equipamento denominado Piezo-

micromanipulador para a ICSI em bovinos, com resultados animadores. Este

equipamento tem se mostrado eficaz por facilitar a penetração da micropipeta na

zona pelúcida e na membrana plasmática do oócito, permitindo a obtenção de altas

taxas de fertilização dos oócitos. O presente trabalho teve por objetivo avaliar as

taxas de fertilização e o desenvolvimento embrionário após a ICSI em oócitos

bovinos, utilizando um Piezo-micromanipulador, com diferentes combinações de pré-

tratamento espermático e ativação química do oócito. Complexos cumulus-oócito

(COCs) obtidos de ovários de matadouro foram maturados in vitro (18-20h) e

desnudados, passando-os por uma pipeta na presença de hialuronidase. Os oócitos

com boa aparência, apresentando o primeiro corpúsculo polar foram selecionados e

centrifugados para o clareamnto do citoplasma, sendo então microinjetados com

espermatozóides sem pré-tratamento ou pré-tratados com ditiotreitol (DTT), com o

auxílio de um Piezo-micromanipulador (PiezoDrill, Burleigh). Após a microinjeção,

os oócitos foram ativados quimicamente com ionomicina e 6-dimetilaminopurina (6-

DMAP), visando a um aumento das taxas de clivagem. A eficiência do método de

microinjeção e os efeitos dos pré-tratamentos espermáticos e da ativação oocitária

foram avaliadas pelas taxas de formação de pronúcleos, sobrevivência, clivagem e

formação de blastocistos. A comprovação da fertilização dos embriões foi realizada

85

por comparação entre os microssatélites dos embriões obtidos e do sêmen utilizado.

O uso do Piezo-micromanipulador para a microinjeção permitiu a obtenção de altas

taxas de formação de 2 pronúcleos (49% - 64%). Contudo, quando realizada a

ativação oocitária após a ICSI, obteve-se uma alta taxa de formação de 3 pronúcleos

(25%), significativamente maior (P<0,05) que as taxas obtidas para os grupos de

oócitos microinjetados com espermatozóides do grupo controle ou tratados com DTT,

ou ainda, com o grupo de oócitos apenas ativados (6%, 4% e 0%, respectivamente).

A metodologia que resultou na maior taxa de formação de blastocistos após a ICSI

com o Piezo-micromanipulador foi a utilização do pré-tratamento espermático

combinado com a ativação oocitária (16%, P<0,05), enquanto as demais

metodologias, sem pré-tratamento espermático ou sem ativação oocitária, resultaram

em baixas taxas de clivagem (0% - 49%) e de formação de blastocistos (0% - 5%). A

análise de microssatélites dos embriões obtidos por ICSI revelou que a maior parte

dos embriões (mínimo de 84%) havia sido fertilizada pelo espermatozóide injetado.

Cinco embriões obtidos por ICSI foram transferidos para duas receptoras e uma

delas foi diagnosticada prenhe aos 45 dias de gestação, por palpação retal.

Entretanto esse animal abortou aproximadamente aos 60 dias. Tais resultados

mostram que o oócito bovino pode ser eficientemente fertilizado por meio da ICSI-

Piezo, porém mais estudos são necessários para aumentar a eficiência dessa

metodologia e investigar a viabilidade dos embriões produzidos.

Palavras-chave: embriões bovinos, ICSI, injeção intracitoplasmática de

espermatozóide, Piezo-micromanipulador.

ABSTRACT

Birth of calves by transfer of embryos produced by Intracytoplasmic Sperm

Injection have been reported in the last years. However, the results of in vitro

production of bovine embryos by this technique remain lower than those from

convencional in vitro fertilization (IVF). While this technique has been succesfully

applied in the assisted human reproduction, the results of ICSI to the in vitro

production of bovine embryos remain unsatisfactory, with high rates of unfertilizes

86

oocytes. The use of an equipment called Piezo-micromanipulator to the ICSI into

bovine oocytes was recently described with good perpectives. This equipment was

dedscribed to be efficient to facilitate the penetration of the micropippete into the

Zona Pelucida and into the plasmatic membrane, allowiing high fertilization rates. The

objective of the present study was to investigate the effects of different sperm

pretreatments associated to chemical oocyte activation and the use of a Piezo-

micromanipulator to the microinjection procedure, in order to improve the cleavage

and blastocyts rates after ICSI into bovine oocytes. Cumulus-oocyte complexes

(COCs) from slaughterhouse-derived ovaries were in vitro matured (18-20h) and

denuded passing then throught a pipette in presence of hyaluronidase. Oocytes with

good appearance, showing the first polar body, were selected and centrifuged to

clarify the cytoplasm. These oocytes were microinjected with non-treated (control) ou

dithiothreitol (DTT) pretreated sperms using a Piezo-micromanipulator (PiezoDrill,

Burleigh) in combination with chemical activation using ionomycin and 6-

dimethylaminopurine (6-DMAP), in order to improve the cleavage rates. The

efficiency of the microinjection method, the effects of sperm pretreatments and oocyte

activation were evaluated by the pronuclei formation, survival, cleavage and

blastocyst formation rates. To prove the fertilization of the ICSI produced embryos, a

comparative study was carried out using the amplification of microsatellite sequences

from embryos and sperm cells of the semen used for ICSI. The use of a Piezo-

micromanipulator resulted in high percentages of 2 pronucleus formation (48,6% to

64,0%). However, the chemical activation after ICSI resulted in a significant higher

porcentage of 3 pronuclei formation (P<0.05) in comparison to the groups of ICSI of

control sperm, ICSI of DTT-treated sperm or activation without ICSI (6%, 4% and 0%,

respectively). The method that resulted in the higher blastocyst rate after ICSI was

using sperm pre-treatment with DTT and exogenous activation (16%, P<0.05). The

other methods, with no sperm pretreatment or no chemical activation, resulted in

lower cleavage (0%-49%) and lower blastocyst rates (0%-5%). DNA analysis of ICSI-

produced embryos in comparison to the used semen revelead that most embryos (at

least 84%) were fertilized by the microinjected spermatozoa. Five embryos obtained

by the ICSI method using DTT-pretreated sperm plus oocyte activation were

transferred to two recipients heifers and one of them was diagnosed pregnant at day

45 by rectal palpation. However this recipient aborted around day 60. These results

87

confirm that bovine oocytes can be efficiently fertilized by Piezo-ICSI, however,

further studies involving the birth of live calves are needed about the viability of

embryos produced by DTT-treated sperm and activated oocytes.

Key words: bovine embryos, ICSI, intracytoplasmic sperm injection, in vitro

fertilization.

INTRODUÇÃO

O nascimento de bezerros provenientes da transferência de embriões

produzidos por ICSI tem sido descrito na literatura (Goto et al., 1990; Hamano et al.,

1999; Horiuchi et al., 2002; Wei e Fukui, 2002), porém os resultados da produção in

vitro de embriões bovinos por esta técnica ainda são baixos quando comparados à

fertilização in vitro convencional.

Esses resultados são, em sua maioria, conseqüência de inúmeros fatores

como a qualidade e técnica de preparo dos espermatozóides para a microinjeção, a

maturação oocitária e o emprego de ativação química dos oócitos.

Tratamentos químicos usando agentes redutores das pontes dissulfídicas,

como DTT, associados ou não a substâncias com ação detergente, também têm

resultado em maiores taxas de formação de pronúcleo e de desenvolvimento

embrionário após a ICSI, por promoverem a descondensação espermática (Rho et al,

1998b; Suttner et al., 2000).

A ativação dos oócitos de diferentes espécies pode ocorrer

espontaneamente durante as diferentes etapas laboratoriais para a ICSI, incluindo o

desnudamento, a centrifugação e a estimulação mecânica com a própria pipeta de

injeção (Keefer et al., 1990; Chung et al., 2001). Contudo, em bovinos esses

estímulos e o próprio espermatozóide injetado são, na maioria das vezes,

insuficientes, resultando em uma baixa ativação dos oócitos após a ICSI (Westhusin

et al., 1984; Perreault et al., 1988; Catt e Rhodes, 1995).

O uso de substâncias químicas como a ionomicina e a 6-Dimetilamipopurina

(6-DMAP) para a ativação do oócito microinjetado tem sido estudado, com a

obtenção de bons resultados em relação às taxas de clivagem e de formação de

88

blastocitos (Susko-Parrish et al., 1994; Rho et al., 1998a,b; Suttner et al., 2000).

Os procedimentos empregados para a técnica de microinjeção também

podem determinar o sucesso da produção de embriões, incluindo o tipo de

equipamento utilizado (como microscópios e manipuladores), o diâmetro e a forma

das micropipetas (Dozortsev et al., 1996; Tocharus et al., 1996), a habilidade do

operador (Gordts et al., 1995) e a forma de ruptura da membrana oocitária (Palermo

et al., 1996; Katayose et al., 1999).

Outro fator diretamente relacionado ao sucesso da ICSI é a correta

deposição do espermatozóide, sem que o processo de micromanipulação cause uma

alta taxa de degeneração dos oócitos. O método convencional de ICSI requer que

uma porção do citoplasma seja aspirada para o interior da pipeta, para que a

membrana seja rompida. A membrana de oócitos bovinos é elástica e, muitas vezes,

a aspiração pode não ser suficiente para a sua ruptura, incorrendo na deposição do

espermatozóide no espaço perivitelínico (Horiuchi et al., 2002).

Recentemente, o benefício da utilização do Piezo micromanipulador foi

descrito para ICSI em bovinos (Katayose et al., 1999; Horiuchi et al, 2002), com uma

eficácia bem superior ao método convencional de ICSI. O piezo micromanipulador

permite a abertura de um orifício na zona pelúcida de forma precisa e relativamente

segura. Penetrando com a pipeta por este orifício, a membrana plasmática é forçada

até quase o outro lado do oócito e, com alguns pulsos do piezo, um orifício também é

feito na membrana e esta retorna sobre a pipeta à sua posição original. Tal

procedimento garante a penetração da pipeta no interior do oócito para a deposição

do espermatozóide, com reduzidos danos à estrutura do gameta feminino.

O uso de equipamentos como o atuador piezo elétrico, acoplado ao sistema

de microinjeção, tem resultado em maiores taxas de sobrevivência (oócitos não

degenerados após a microinjeção) e de fertilização após a ICSI. Ao contrário do

método convencional de ICSI, no qual uma porção do citoplasma precisa ser

aspirada para o interior da pipeta para que a membrana seja rompida, o Piezo-

micromanipulador permite a penetração da pipeta pela membrana plasmática de

forma precisa e rápida, sem alterações significativas do citoplasma (Kimura e

Yanagimachi, 1995; Huang et al., 1996; Yanagida et al., 1998; Horiuchi et al., 2002).

O presente estudo teve por objetivo estudar os efeitos de diferentes

tratamentos espermáticos em combinação com ativação oocitária e da utilização de

89

um Piezo-micromanipulador para o procedimento de microinjeção, visando a

melhorar as taxas de clivagem e de formação de blastocistos após a ICSI em oócitos

bovinos.

MATERIAL E MÉTODOS

O estudo compreendeu dois experimentos. No experimento 1, os efeitos da

combinação do pré-tratamento dos espermatozóides com DTT e da ativação

oocitária com ionomicina e 6-DMAP foram comparados quanto às taxas de formação

de pronúcleos em oócitos microinjetados com o auxílio de um piezo-

micromanipulador, ou em oócitos que foram submetidos apenas à ativação.

No experimento 2, os oócitos foram microinjetados, utilizando-se diferentes

combinações de pré-tratamento espermático e de ativação oocitária e cultivados por

nove dias para avaliação das taxas de sobrevivência, clivagem e de formação de

blastocisto. A análise de DNA dos embriões produzidos nesse experimento foi

comparada à análise do sêmen utilizado, para a confirmação da fertilização.



térmica, à temperatura de 30ºC em solução tampão-fosfato, com pH ajustado 7,4;


transporte até o laboratório. Os folículos com diâmetro entre 2 a 8 mm foram



Após o repouso dos tubos por 10 min, o sedimento foi transferido para uma placa de

Petri para recuperação e seleção dos complexos-cumulus-oócitos (COCs).


três camadas celulares e com citoplasma de aparência homogênea, segundo a

classificação de De Loos et al. (1989). Estes COCs foram lavados por três vezes em



90


placa de quatro poços, sendo o meio coberto com 400 µl de óleo mineral. A

maturação foi realizada em estufa de cultivo em atmosfera umidificada, com 5% de

CO2 a 39ºC, durante 18-20 h.







gotas de 20 µl de meio de micromanipulação (TCM199-HEPES acrescido de 4 mg/

ml de BSA), em uma tampa estéril de placa de Petri de 35 mm de diâmetro, sendo




corpúsculo polar, foram selecionados, utilizando-se uma micropipeta de vidro com

abertura interna da extremidade de cerca de 150 µm, acoplada a um sistema de



Preparo dos espermatozóides


bons resultados em FIV foram descongeladas em banho-maria a 39ºC, por 30 seg.

Os espermatozóides viáveis foram separados pela técnica de "Swim-up" por 1 h em

estufa (39ºC) em meio Sp-TALP (meio de Tyrode com albumina-lactato-piruvato)

acrescido de BSA livre de ácidos graxos (6 mg/ ml), penicilamina (20 µM),

hipotaurina (10 µM) e epinefrina (2 µM). A parte superior (0,5 ml) do sobrenadante

foi retirada e depositada em outro tubo, sendo, em seguida, centrifugada a 600 xg

por 10 min. O sobrenadante foi descartado e uma alíquota de 5µl retirada para

determinação da concentração espermática.

91

Sistema de microinjeção

As pipetas de manutenção foram confeccionadas a partir de capilares

estéreis de borossilicato (1,0 mm diâmetro externo e 0,75 m diâmetro interno)

esticados (25A, escala 4,5) em um estirador de pipetas (Bachoffer-Alemanha) e

cortadas com diâmetro externo de cerca de 120 µm. A extremidade dessas pipetas

foi polida com calor em uma microforja para arredondamento da extremidade e,

posteriormente, uma dobra com ângulo de cerca de 35º foi feita a cerca de 1 mm da

extremidade, para permitir a utilização no sistema de micromanipulação.

As pipetas de microinjeção para ICSI foram estiradas da mesma forma

descrita anteriormente e a extremidade cortada com uma microforja em ângulo reto,

de forma a possuir o diâmetro interno de 7 µm e o diâmetro externo de 9 µm. A

ponta dessas pipetas não precisou ser esmerilhada para formar um bisel, uma vez

que os orifícios na zona pelúcida e na membrana oocitária são feitos com a

extremidade romba da micropipeta ao se utilizar o Piezo-manipulador, em

conseqüência dos pulsos de piezo produzidos.

A pipeta de microinjeção foi preenchida inicialmente com uma pequena

quantidade de Fluorinert (1-2 µl), seguida de uma quantidade mínima de mercúrio

com uma seringa de 1 ml (cerca de 1-2µ). A pipeta foi em seguida encaixada no

sistema de injeção, previamente preenchido com óleo mineral. Antes das injeções,

uma pequena quantidade do meio de micromanipulação foi aspirado para dentro das

pipetas de manutenção e de injeção e todo o sistema foi mantido em repouso por

alguns minutos para estabilização da pressão.

O sistema de micromanipulação foi composto de microinjetores CellTram Oil

(Eppendorf AG, Alemanha) para manutenção e CellTram Vario (Eppendorf AG,

Alemanha) para microinjeção, preenchidos com óleo mineral. Micromanipuladores

TransferMan (Eppendorf AG, Alemanha) e um piezo-manipulador (PiezoDrill,

Burgleigh) foram acoplados a um microscópio Axiovert 135 (Zeiss, Alemanha) para o

trabalho de microinjeção.

Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide - ICSI

Para cada repetição, grupos de 14 a 16 oócitos foram manipulados por

tratamento. Três gotas de 15 µl de meio de micromanipulação TCM199-HEPES

acrescido de 4 mg BSA/ ml foram feitas na tampa de uma placa de Petri de 35 mm

92

(Nunc., Naperville, IL). De 7 a 8 oócitos foram colocados em duas gotas de meio,

sendo a terceira utilizada para a lavagem da pipeta. Ao lado de cada uma destas

gotas, foram feitas outras três gotas de 5 µl da suspensão de espermatozóides

misturada à solução de polivinilpirrolidona 10% em solução salina a 0,9%. Óleo

mineral foi acrescentado de forma a cobrir completamente todas as gotas.

Um espermatozóide foi aspirado lateralmente pela pipeta de injeção de

forma que ficasse na extremidade externa da pipeta e alguns pulsos de piezo foram

dados para causar a sua imobilização. O espermatozóide foi então aspirado pela

cauda para dentro da pipeta e mantido na extremidade, sendo transferido para a

gota onde estavam os oócitos. Um oócito foi mantido pela pipeta de manutenção de

forma que o corpúsculo polar ficasse na posição de 6 ou 12 h.

A pipeta de injeção foi colocada em contato com a zona pelúcida e um

orifício era feito aplicando-se de 3 a 4 pulsos de piezo. O fragmento cortado da zona

pelúcida foi expulso da pipeta e o espermatozóide trazido para a extremidade. A

pipeta foi introduzida pelo orifício feito na zona pelúcida até próximo ao outro lado do

oócito e, através de mais um pulso de piezo, a membrana plasmática foi rompida e o

espermatozóide liberado no interior do citoplasma, procurando-se injetar a menor

quantidade possível de meio. Logo após a microinjeção, os oócitos foram lavados

novamente para remoção de restos celulares, seguindo-se a incubação ou ativação

(Fig.1).

A

B

Figura 1. ICSI-Piezo em oócito bovino centrifugado. Penetração da pipeta de injeção

pela zona pelúcida (A). Deposição do espermatozóide após perfuração da

membrana plasmática pela aplicação de pulsos de piezo (B).

93

Ativação dos oócitos

Os oócitos foram ativados em uma gota de 100µl de meio de

micromanipulação acrescido de 5 µM de ionomicina por 5 min e então foram

adicionados a esta gota 100µl de TCM/ BSA (30 mg/ ml), sendo os oócitos mantidos

em repouso por 5 min para interromper o processo de ativação. Os oócitos ativados

foram em seguida lavados em Fert-TALP (6 mg BSA/ ml) e incubados a 39ºC nesse

mesmo meio por 4 h para permitir a extrusão do segundo corpúsculo polar. Após

este período, os oócitos foram transferidos para uma gota de Fert-TALP, com 1,9

mM de 6-DMAP, e mantidos em estufa por mais 3 h. Após este período, os oócitos

foram novamente lavados e incubados em Fert-TALP, sob óleo mineral, por mais 10

h a 39ºC em estufa de CO2.

Fertilização in vitro

Parte dos oócitos maturados foram fertilizados in vitro, servindo como grupo

controle, com uma concentração espermática de 2 x 106 espermatozóides/ ml a

partir da suspensão de espermatozóides preparada inicialmente. A fertilização foi

realizada em 400 µl de meio de fertilização (Fert-TALP + 6 mg BSA/ ml), em placas

de 4 poços por 18 h em estufa de cultivo a 39ºC com 5% de CO2.

Avaliação da formação de pronúcleos e corpúsculos polares

Para a avaliação da formação de pronúcleos, oócitos que não se

apresentavam degenerados 18 h após a ICSI ou a ativação oocitária foram

colocados entre lâmina e lamínula e fixados com uma solução de etanol-ácido

acético (3:1), por 24 h a 4°C. Posteriormente, os oócitos foram corados com 1% de

lacmóide em 45% de ácido acético. Os pronúcleos foram observados sob

microscópio de contraste de fase sob aumento de 400x e classificados como NA

(nada observado), 1PN (1 pronúcleo), 2PN (2 pronúcleos), 3PN (3 pronúcleos), D-

SP (espermatozóide descondensado) e (ND-SP) espermatozóide não-

descondensado.(Fig.2).

94

A

B

Figura 2. Oócitos microinjetados com espermatozóides incubados em DTT,

apresentando 2 pronúcleos (A) e 3 pronúcleos (B), 18 h após a

ativação com ionomicina e 6-DMAP.


Para a produção de embriões, os oócitos fertilizados foram retirados do meio

de fertilização 8 h após o início da FIV ou da ICSI e lavados em meio SOF/ OCS

para remoção de restos celulares. O cultivo foi realizado por 9 dias, em 400 µl de

SOF suplementado com 10% de OCS e antibióticos, sob óleo mineral, a 39 ºC em

atmosfera de alta umidade, com 5% de CO2, 5% de O2 e 90% de N2.

Avaliação das taxas de sobrevivência, de clivagem e de desenvolvimento

embrionário

Foram considerados sobreviventes os oócitos que, 18 h após a

micromanipulação, não apresentavam sinais de degeneração, tais como a extrusão

de citoplasma, o aumento significativo do espaço perivitelínico devido à desidratação

ou a expansão da zona pelúcida em decorrência de excesso de meio microinjetado.

As taxas de sobrevivência, de clivagem e de formação de blastocisto foram

registradas nos dias d1, d3 e d7-d9, respectivamente.

Armazenamento dos embriões

Os embriões que se desenvolveram a blastocisto até o dia 9 foram lavados

três vezes em tampão Kawasaki (20 mM Tris-HCl pH 8,3; 1,5 mM MgCl2; 25 mM

95

KCl, 0,5% (v/ v) Tween 20; 0,1% PVP) e transferidos para tubos de PCR com 5 µl do

mesmo tampão e armazenados a –80°C para posterior análise de DNA.

Análise de microssatélites dos embriões produzidos por ICSI

A fim de se determinar se os embriões produzidos por ICSI foram realmente

provenientes da correta fertilização pelo espermatozóide microinjetado, foi

desenvolvido um estudo comparativo pela ampliação de seqüências de

microssatélites do DNA pela técnica da PCR dos embriões e do sêmen utilizado.

Como todos os embriões de ICSI e FIV foram fertilizados com o sêmen do mesmo

touro, os embriões de FIV convencional serviram de controle positivo para

fertilização, e os embriões produzidos pela ativação oocitária serviram de controle do

desenvolvimento partenogenético.

Preparo dos espermatozóides para análise de microssatélites

Uma palheta de sêmen congelado do mesmo touro utilizado para as

fertilizações in vitro e ICSI foi descongelada a 30ºC, por 30 seg, e o conteúdo

transferido para um tudo de 1,5 ml. Os espermatozóides foram lavados duas vezes

com 1ml de solução tampão TE (10 mMTris, 1 mM Na2EDTA; pH 7,5-8,0) por meio

de centrifugação (5.000 rpm, 10 min). Em seguida, foram adicionados ao tubo 180 µl

de solução tampão de proteinase K (20 mM Tris, 10 mM Na2EDTA, 10 mM NaCl), 5

µl de solução estoque de DTT (DTT 1M), 8 µl de solução estoque de proteinase K

(20 ng/ µl), 20 µl de SDS e incubados a 56ºC por 12 h. O DNA foi purificado com

DNA Mini Kit Qiajen e a concentração do DNA medida em um fotômetro

(BioPhotometer Eppendorf-Netheler-Hinz GmBH, Alemanha), para garantir que a

concentração da amostra não fosse inferior a 10 µg/ µl.

Preparo dos embriões para análise de microssatélites:

Os embriões foram descongelados a 30°C e lavados duas vezes em tampão

Kawasaki (Tris-HCl pH 8,3, 242 mg; MgCl2, 30 mg; KCl, 186 mg; Tween 20, 500 µl;

PVP, 100 mg; água deionizada q.s.p. 100 ml) + 0,1% PVP. Os embriões foram

então transferidos individualmente para tubos de PCR com 5 µl do mesmo tampão.

Para a dissolução da zona pelúcida e das membranas celulares, 10 µl de solução

PK (2 mg/ ml Proteinase-K em tampão Kawasaki) foram adicionados a cada tubo,

96

mantidos em gelo. Em seguida, os tubos foram incubados a 60°C por 60 min e

posteriormente, a 95°C/ 15 min, para inativação da Proteinase-K. Após esse

período, os tubos foram novamente recolocados em gelo.

Amplificação do DNA

A amplificação do DNA das amostras foi realizada em duas etapas,

consistindo de uma pré-amplificação seguida de uma reamplificação, utilizando os

primers (BM1824, BMS2113, ETH225 e TGLA227 - Metabion GmBH, Alemanha)

descritos na Tabela 1.

Tabela 1. Primers utilizados para a amplificação pelo método de PCR de

microssatélites de embriões produzidos in vitro e do sêmen utilizado para a

fertilização

Primer Cromossomo Seqüência do Primer (5' - 3') Referência

BM1824

(D1S34) 1

GAGCAAGGTGTTTTTCCAATC

CATTCTCCAACTGCTTCCTTG Bishop et al.,1994

ETH225

(D9S1) 9

GATCACCTTGCCACTATTTCCT

ACATGACAGCCAGCTGCTACT Steffen et al., 1993

BM2113

(D2S26) 2

GCTGCCTTCTACCAAATACCC

CTTCCTGAGAGAAGCAACACC Bishop et al., 1994

TGLA227

(D18S1) 18

CGAATTCCAAATCTGTTAATTTGCT

ACAGACAGAAACTCAATGAAAGCA Georges e Massey, 1992

Pré-amplificação

Para a pré-amplificação, foi preparada uma mistura de PCR composta de

tampão PCR 10x (2µl), mistura de desoxirribonucleotídeos-trifosfato (dNTP´s) (1 µl),

mistura de primers (4 µl), H2O (1,3 µl), Taq-Polimerase HotStar (0,2 µl), Solução Q (3

µl), MgCL2 (1µl), amostra de DNA (7,5 µl), totalizando um volume de 20 µl. A mistura

de primers foi composta de 0,5 µl de cada primer. O programa para a pré-

97

amplificação das amostras consistiu das seguintes etapas: (1) aquecimento a 95ºC

por 15 min para a desnaturação inicial, (2) 30 seg a 94ºC (desnaturação), (3) 1 min.

a 55ºC (anelamento) e (4) 1min e 20 seg a 74ºC (extensão). As etapas 2 a 4

consistiam um ciclo e foram repetidas 29 vezes. Ao final da pré-amplificação, a

temperatura foi reduzida para 4ºC.

Reamplificação:

Para a reamplificação, foram preparados 8µl por amostra de uma segunda

mistura de PCR composta de (volume por amostra) tampão PCR 10x (1 µl), mistura

de desoxirribonucleotídeos-trifosfato (dNTP´s) (0,5 µl), mistura de primers (1,4 µl),

H2O (3,1 µl), Taq-Polimerase HotStar (0,1 µl), Solução Q (1,5 µl), MgCL2 (0,5 µl).

Estes 8µl de mistura foram adicionados a 2 µl de cada amostra de DNA pré-

amplificada, totalizando um volume de 10µl. A mistura de primers foi composta de

0,2 µl de TGLA 227, 0,2 µl de BM 2113, 0,15 µl de ETH 225 e 0,15 µl de BM1824

(de cada primer corado e não-corado). O programa para a reamplificação das

amostras consistiu das seguintes etapas: (1) aquecimento a 95ºC por 15 min, para a

desnaturação inicial, (2) 30 seg a 94ºC (desnaturação), (3) 1 min a 50ºC

(anelamento) e (4) 1min 20 seg a 74ºC (extensão) e (5) 10 min a 74ºC (extensão

final dos produtos). Etapas de 2 a 4 consistiam um ciclo e foram repetidas 35 vezes.

Ao final da reamplificação, a temperatura foi reduzida para 4ºC, para a conservação

dos produtos.

Análise das seqüências amplificadas

Após a reamplificação, 3 µl de cada amostra foram diluídos com 15 µl de

água e 3 µl desta diluição foram misturados com 12 µl de TAMRA/ formamida (24 µl

de TAMRA + 760µl de formamida) e as amostras processadas por um analisador

genético (ABI Prisma 310 Genetic Analyser, UK) para comparação das seqüências

de microssatélites pelo programa GeneScanTT-35. Um ou dois picos foram

registrados para cada um dos primers, para as amostras de embriões,

correspondendo aos alelos amplificados, sendo a fertilização confirmada por

comparação com os alelos dos espermatozóides.

98

Transferência de embriões para receptoras

Cinco embriões obtidos por ICSI, usando-se a metodologia de pré-tratamento

espermático em combinação com ativação, foram transferidos para duas receptoras

e avaliadas por palpação retal aos 45 e 60 dias de gestação.





os dados foram transformados em raiz quadrada e testados novamente.





quando P<0,05.

O modelo estatístico empregado para a avaliação do efeito dos tratamentos

na Análise de Variância foi:


Onde:


µ = média geral



RESULTADOS

O experimento 1 avaliou os efeitos da combinação do pré-tratamento dos

espermatozóides com DTT em combinação com ativação oocitária, usando

ionomicina e 6-DMAP, nas taxas de formação de pronúcleos em oócitos

microinjetados ou nos que foram submetidos apenas à ativação.

99

A taxa de formação de um pronúcleo (1PN) entre todos os tratamentos de

oócitos microinjetados não foi maior que 6%, porém foi significativamente maior para

os oócitos não injetados que foram ativados (38%, P<0,05). Não houve diferenças

significativas das taxas de formação de 2 pronúcleos (2PN), entre os grupos de

oócitos microinjetados com espermatozóides não-tratados, espermatozóides tratados

com DTT e espermatozóides tratados + ativação (64% vs 49% vs 62%,

respectivamente). Contudo estas taxas foram superiores àquela obtida para oócitos

ativados (20%).

A taxa de formação de três pronúcleos foi significativamente maior no grupo

de oócitos microinjetados com espermatozóides tratados e ativados (25%, P<0,05)

em relação aos demais grupos. Baixas porcentagens de espermatozóides não

injetados, não-descondensados ou descondensados foram obtidas para todos os

grupos. Apesar de não ter sido feita a identificação dos pronúcleos masculinos, tais

resultados mostram uma alta porcentagem de oócitos microinjetados fertilizados,

havendo contudo, uma deficiência da extrusão do segundo corpúsculo polar em uma

parte significativa dos oócitos microinjetados e ativados (Tabela 2).

Tabela 2. Taxas de formação de pronúcleos (PN) e de descondensação do

espermatozóide após a ICSI por meio de piezo-micromanipulador,

usando diferentes combinações de pré-tratamentos do espermatozóide

e/ ou ativação oocitária

Tratamento Rep. COC (n)

SA1 (%)

1 PN (%)

2PN (%)

3PN (%)

SPND2 (%)

SPD3 (%)

SPNI4 (%)

ICSI SP-controle 6 66 11 (17)a 4 (5)a 43 (64)a 4 (6)a 2 (3) 1 (1) 1 (1)

ICSI SP-DTT 5 66 20 (29)a,b 4 (6)a 31 (49)a 3 (4)a 2 (3) 2 (3) 4 (6)

ICSI SP-DTT + ativação 5 43 1 (3)c 3 (6)a 27 (62)a 10 (25)b 2 (5) 0 (0) 0 (0)

Somente ativação 4 64 26 (41)b 25 (38) b 13 (20)b 0 (0)a 0 (0) 0 (0) 0 (0)

Valores na mesma coluna com letras diferentes variam significativamente ANOVA (P<0,05). 1SA: sem alteração, 2SPND: espermatozóide não-descondensado, 3SPD: espermatozóide

descondensado, 4SPNI: espermatozóide não-injetado

100

No segundo experimento, os oócitos foram submetidos a diferentes

protocolos de ICSI, com ou sem pré-tratamento espermático, em combinação com a

ativação química. Depois do cultivo dos oócitos por 9 dias, foi realizada a avaliação

das taxas de sobrevivência, de clivagem e de formação de blastocistos (Tabela 3).

Oócitos não-microinjetados e ativados serviram como grupo controle dos

resultados de ativação. Foram obtidas taxas de sobrevivência satisfatórias após a

ICSI, utilizando o Piezo-manipulador (67% a 89%). A ativação dos oócitos (sem a

microinjeção) resultou nas maiores taxas de clivagem e de formação de blastocisto

(83% e 23%, respectivamente).

Quando os oócitos foram microinjetados com espermatozóides não-tratados,

sem a realização da ativação química após a ICSI, não foi ocorreu a clivagem de

nenhum oócito e, conseqüentemente, nenhum blastocisto foi obtido. Os tratamentos

nos quais a ICSI foi realizada, apenas com pré-tratamento espermático ou com

ativação oocitária, também resultaram em baixas taxas de blastocistos (1% a 4%),

mesmo com a adição de DTT ao meio.

Tabela 3. Taxas de sobrevivência, de clivagem e de formação de blastocisto após a

ICSI, por meio de piezo-micromanipulador, usando diferentes

combinações de pré-tratamentos do espermatozóide com ou sem

ativação oocitária

Tratamento Rep. Oócitos

injetados (n)

Oócitos sobreviventes

(%)

Embriões clivados d3 (%)

Blastocistos d7-d9 (%)

Ativação 5 75 75 (100)a 62 (83)a 17 (23)a

ICSI Sp controle/ sem ativação 5 76 63 (83)abc 0 (0)b 0 (0)b

ICSI Sp controle/ com ativação 5 75 55 (73)bc 9 (12)bc 1 (1)b

ICSI Sp-DTT / sem ativação 5 75 67 (89)ab 42 (56)d 3 (4)b

ICSI Sp-DTT / com ativação 5 75 50 (67)c 39 (52)d 12 (16)a

ICSI Sp-DTT / + corte/ com ativação 5 75 62 (83)abc 37( 49)d 4 (5)b

ICSI Sp-controle/ com ativação + incub. DTT 5 75 51 (68)c 18 (24)c 3 (4)b


101

A combinação do pré-tratamento espermático com DTT e a ativação química

após a ICSI resultou na maior taxa de formação de blastocisto entre os grupos de

oócitos microinjetados (16%, P<0,05). O procedimento de corte da cauda do

espermatozóide afetou negativamente o desenvolvimento embrionário (P<0,05),

mesmo associando-se o pré-tratamento espermático com DTT e ativação química,

resultando em uma taxa de apenas 5% de blastocisto.

Todos os embriões analisados por FIV foram classificados como fertilizados

(100%) por apresentarem pelo menos um dos dois alelos igual ao do touro e não

serem homozigotos para os 4 primers.

Os embriões de partenogênese apresentaram-se homozigotos para os

quatro primers, podendo ou não os alelos serem idênticos ao do touro, sendo

classificados como não-fertilizados (100%). Contudo, entre estes embriões

partenogenéticos analisados, 3 deles apresentaram 2 alelos diferentes amplificados

para o Primer TGLA 227, mas todos foram homozigotos para os outros 3 primers.

Tabela 4. Exemplos de resultados da análise de microssatélites de embriões produzidos por FIV, ativação oocitária ou ICSI, em relação aos alelos amplificados dos espermatozóides empregados para fertilização

Primer/ Pico

BM 1824 BM 2113 ETH 225 TGLA 227 Amostra Tratamento

1 2 1 2 1 2 1 2 Obs

Espermatozóides 180 182 132 134 134 144 85 87

FIV-01 FIV 180 182 134 136 142 144 85 87 1F

ATIV-03 ATIVAÇÃO 178 178 132 132 134 134 91 91 2P

ICSI-09 ICSI + ATIV + incub. DTT 180 188 132 132 134 142 75 87 1F

ICSI-08 ICSI + SP-DTT + ATIV 180 180 128 128 134 134 75 75 3NF

1F = Fertilizado; 2P = partenogenético; 3NF = não-fertilizado (ICSI-partenogenético)

A análise do DNA dos embriões obtidos por ICSI, em comparação com o

sêmen utilizado, revelou que a maior parte dos embriões de ICSI (mínimo de 84,2%)

havia sido fertilizada pelo espermatozóide injetado. Um dos embriões de ICSI não

102

pôde ser classificado pela falta de amplificação para dois dos quatro primers, sendo

considerado como duvidoso.

Dois embriões de ICSI não apresentaram um dos alelos do touro para um

dos primers, porém foram considerados fertilizados por serem heterozigotos e

apresentarem um dos alelos do touro para os outros 3 primers. Outros dois embriões

de ICSI apresentaram-se homozigotos para ao 4 primers e foram classificados como

não-fertilizados (partenogenéticos) (Tabelas 4 e 5).

Tabela 5. Porcentagens de embriões classificados como fertilizados ou partenogenéticos após a FIV, ativação química e ICSI-Piezo pela análise de microssatélites

Grupo de tratamento-embrião analisado Blastocistos examinados

Fertilizados/ total (%)

Partenogenético ou duvidoso/ total (%)

FIV (controle) 18 18 (100) 0 (0)

Ativação química 17 0 (0) 17 (100)

ICSI (SP controle + ativação) 3 2 (67) 1 (33)

ICSI (Sp-DTT/ sem ativação) 2 2 (100) 0 (0)

ICSI (Sp-DTT Swim-up + ativação) 11 10 (91) 1 (9)

ICSI (Sp-DTT Swim-up + corte + ativação) 2 1 (50) 1 (50)

ICSI (Sp-controle + incub. DTT + ativação) 1 1 (100) 0 (0)

Total de embriões de ICSI 19 16 (84) 3 (16)

Transferência dos embriões

Cinco embriões obtidos por ICSI, usando-se a metodologia de pré-tratamento

espermático em combinação com ativação, foram transferidos por via transcervical

para duas receptoras sincronizadas sendo uma delas diagnosticada prenhe aos 45

dias de gestação, por palpação retal. Entretanto, um segundo exame deste animal

indicou a gestação havia sido interrompida, em decorrência de aborto,

aproximadamente aos 60 dias.

103

DISCUSSÃO

Tem sido descrito que a injeção intracitoplasmática de espermatózoide na

espécie bovina resulta em baixas taxas de fertilização e de desenvolvimento

embrionário.

Neste trabalho, não foi observado o aumento da taxas de formação de um ou

de 2 pronúcleos, quando foi realizado o pré-tratamento dos espermatozóides com

DTT, porém foram obtidas maiores taxas de clivagem e de formação de blastocisto.

Este fato pode estar relacionado à maior facilidade de liberação de um suposto

agente espermático promotor da ativação oocitária (SAOAF) (Tesarik et al., 1994) ou

ao aumento da permeabilidade do espermatozóide a um fator descondensador do

núcleo espermático (SNDF) (Ohsumi et al., 1996).

Não se conhece os efeitos do uso do DTT no desenvolvimento embrionário,

mas a sua combinação com substâncias detergentes como Triton X-100 ou brometo

de alquiltrimetilamônio (ATAB), pode causar alterações da integridade dos

cromossomos do espermatozóide (Szcygiel e Ward, 2002; Ward et al., 1999). A

degradação do DNA espermático também pode ocorrer quando o tempo após a

lesão da membrana até a injeção é muito prolongado. Substâncias adicionadas ao

meio de manipulação (EDTA, EGTA) poderiam manter a integridade do núcleo

espermático por horas, evitando a degradação por endonucleases (Tateno et al.,

2000; Szcygiel e Ward, 2002).

Diferentemente de Wei e Fukui (2002) que obtiveram bons resultados com o

corte da cauda do espermatozóide antes da microinjeção, nas nossas condições do

presente experimento, esse procedimento resultou em uma baixa taxa de formação

de blastocistos. Na prática, esse procedimento facilita a deposição do

espermatozóide no interior do oócitos, pois um menor volume de líquido é injetado

para a liberação do espermatozóide e, no momento de retirada da pipeta, o

espermatozóide permanece no local depositado sem que seja trazido juntamente

com a pipeta. Contudo, sabe-se que a ICSI de cabeças isoladas de espermatozóides

resulta em menores taxas de nascimento do que a injeção de espermatozóides

inteiros (Hamano et al., 1999).

104

Recentes estudos descreveram a importância das estruturas espermáticas

no processo de ativação dos oócitos e nos eventos intracelulares, nas fases iniciais

de desenvolvimento embrionário de mamíferos, seguindo à fertilização (Navara et al.,

1995; Sutovsky e Schatten, 1998; Hewitson, et al., 2000) e, possivelmente, a

remoção da cauda do espermatozóide pode levar a um comprometimento do

desenvovimento embrionário.

Na tentativa de contornar a baixa taxa de ativação oocitária em oócitos

bovinos após a ICSI, diferentes protocolos de ativação oocitária empregando

substâncias químicas também vêm sendo testados para que a eficiência da técnica

seja melhorada. O protocolo empregado no presente estudo, com o uso da

ionomicina e 6-DMAP, resultou em altas taxas de clivagem dos oócitos não

microinjetados e, quando em associação com o pré-tratamento espermático com

DTT, forneceu o melhor resultado de formação de blastocistos após a ICSI.

Os resultados obtidos neste trabalho foram semelhantes aos encontrados por

outros autores que compararam a ativação com ionomicina + 6-DMAP com outros

protocolos, envolvendo substância como etanol, Ionóforo de cálcio (Ca-I A23187),

sozinho ou associado à ciclohexamida, em diferentes tempos de exposição (Rho et

al., 1998a; Suttner et al., 2000). Contudo, os efeitos de tais substâncias no potencial

de desenvolvimento embrionário não são completamente conhecidos. A maioria dos

bezerros nascidos de ICSI foi obtida pela ativação dos oócitos microinjetados com

Ca-I A23187 (Goto et al., 1990) ou etanol a 7% (Hamano et al., 1999; Horiuchi et al.,

2002).

Sabe-se que a 6-DMAP pode causar alterações da placa metafásica,

impedindo a extrusão do segundo corpúsculo polar e, conseqüentemente, resultar

em anomalia de ploidia dos embriões. Rho et al. (1998a) avaliaram diferentes

regimes de ativação com ionomicina combinada com 6-DMAP e propuseram que um

intervalo de 3 h seria suficiente para a extrusão do segundo corpúsculo polar (>80%).

Apesar do intervalo de 4 h entre a incubação com ionomicina e a incubação com 6-

DMAP, para liberação do segundo corpúsculo polar, observou-se que mais de 25%

dos oócitos microinjetados e submetidos a este procedimento apresentavam três

corpúsculos polares.

Durante os experimentos, foi observado que algumas vezes ocorria uma

evaginação da membrana plasmática no momento de retirada da pipeta, que

105

resultava em permanência da abertura feita pela pipeta e degeneração posterior dos

oócitos. Nestes casos, a aspiração de uma pequena parte da membrana e o seu

estiramento passaram a ser suficientes para o fechamento desta abertura,

garantindo maior sobrevivência dos oócitos injetados. Em camundongos, Kimura e

Yanagimachi (1995) sugeriram o uso de temperaturas mais baixas de trabalho (17-

18ºC em vez de 27-37ºC), para evitar esta reversão da membrana.

Além dos fatores citados anteriormente, substâncias químicas utilizadas para

o procedimento de ICSI no presente trabalho como o PVP e o mercúrio também

podem influenciar negativamente os resultados de ICSI, porém seus efeitos são

discutíveis, dentro das condições de uso. É possível que a PVP presente na solução

de preparo do espermatozóide impeça o acesso de substâncias do oócitos isolando

o espermatozóide do resto do citoplasma, quando uma grande quantidade é injetada,

formando uma espécie de gota ao redor do espermatozóide.

Sabe-se que o mercúrio possui uma alta toxidade para as células de

mamíferos, podendo causar inúmeras alterações moleculares, contudo, da forma

como é utilizado na pipeta de injeção, possivelmente, não entra em contato com o

meio de manipulação e a contaminação é praticamente nula, quando o procedimento

é executado corretamente. Yanagida et al. (1998) relataram que uma concentração

de 0,6 µg/ l foi determinada na gota de injeção para ICSI quando usaram mercúrio

para prenchimento da pipeta de injeção, valor este muitas vezes inferior à

concentração de mercúrio presente no muco cervical de mulheres (220 µg/ l) e no

plasma seminal do homem (52,4 µg/ l).

Algumas pequenas falhas foram encontradas na realização da análise de

microssatélites, porém sem comprometimento para a interpretação dos resultados. A

causa exata desses erros não é determinada, podendo ser decorrente da

contaminação do material com DNA do meio ambiente, de fragmentos de DNA

provenientes do primeiro corpúsculo polar ou de células somáticas aderidas à zona

pelúcida e mesmo pela possível ocorrência de um alelo ectópico. Essa análise

possibilitou comparar seqüências de DNA amplificadas de embriões de ICSI com o

sêmen utilizado, com uma boa discriminação dos resultados. A associação dessa

metodologia com a biópsia de embriões poderá facilitar os estudos sobre os

processos de fertilização, além de permitir a caracterização genética e a avaliação

da normalidade dos embriões antes da sua transferência para as receptoras.

106

CONCLUSÕES

A utilização do Piezo-manipulador em combinação com o pré-tratamento do

espermatozóide com DTT e a ativação com ionomicina e 6-DMAP forneceu altas

taxas de formação de pronúcleos e de clivagem. Apesar de fornecer taxas razoáveis

de blastocistos, uma melhoria da técnica é necessária para se obter uma maior

eficiência do método.

A análise genética dos embriões por microssatélites mostrou-se adequada

para a avaliação da fertilização pelo método de ICSI usando o Piezo-

micromanipulador. Por meio desta análise, foi possível confirmar que a maior parte

dos embriões de ICSI foi realmente fertilizada pelos espermatozóides injetados

usando o Piezo-micromanipulador. Contudo, mais pesquisas sobre a viabilidade dos

embriões produzidos precisam ser realizadas, uma vez que as substâncias utilizadas

podem causar alterações do cariótipo ou da estrutura dos cromossomos.


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be necessary for the mouse paternal genome to participate in embryonic

development. Biol Reprod, 60: 702-706.

Wei H, Fukui Y. (2000) Births of calves derived from intracytoplasmic sperm

injection (ICSI) without exogenous oocyte activation treatment. Theriogenology,

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spermatozoa into bovine eggs. Theriogenology, 21: 274 (abstr.).

Yanagida K, Katayose H, Yazawa H, Kimura Y, Konnai K, Sato A. (1998) The

usefulness of piezo-micromanipulator in intracytoplasmic sperm injection in

humans. Hum Reprod, 14: 448-453.

111

5. CONCLUSÕES GERAIS

O presente estudo demonstrou que a microinjeção de espermatozóide é

uma técnica possível de ser utilizada para a produção de embriões bovinos in vitro,

obtendo-se no presente trabalho a taxa máxima de blastocistos após a ICSI de 16%.

Entretanto, os resultados obtidos no presente trabalho e na literatura (0 a 20%) são

insatisfatórios quando comparados com a fertilização in vitro convencional, por meio

da qual tem-se alcançado taxas de blastocistos em torno de 40%.

A produção in vitro de embriões por ICSI está ainda mais sujeita que a FIV a

fatores que podem afetar negativamente o desenvolvimento embrionário. Os

procedimentos de preparo dos oócitos para a micromanipulação, as condições de

maturação e cultivo, os tratamentos físicos e químicos dos gametas e o método de

microinjeção podem causar danos às estruturas e aos componentes celulares,

comprometendo os resultados da ICSI.

Mais estudos são necessários sobre os efeitos dos processos laboratoriais

envolvidos (maturação in vitro, desnudamento, ativação, micromanipulação e cultivo

embrionário) nos eventos celulares durante a fertilização e o desenvolvimento

embrionário, para que a ICSI torne-se uma técnica eficiente para a produção de

embriões de bovinos.

112

APÊNDICES

113

Tabela 1A: Lista dos reagentes usados

Produto Código Firma

Ác Acético A-6283 Sigma Aldrich, Alemanha

Ac citrico C- 0759 Sigma Aldrich, Alemanha

Ácido lático L-4388 Sigma Aldrich, Alemanha

Ácido pirúvico P-4562 Sigma Aldrich, Alemanha

Aminoácidos essenciais (MEM) 11140-035 (100 x) Gibco

Aminoácidos não-essenciais (BME) 11130-036 (50 x) Gibco

ATAB (Brometo de alquiltrimetilamônio) M-7635 Sigma Aldrich, Alemanha

Brometo de Etídio E-8751 Sigma Aldrich, Alemanha

BSA A-3311 Sigma Aldrich, Alemanha

BSA livre de ácidos graxos (lag) A-8806 Sigma Aldrich, Alemanha

CaCl2 . H2O C-7902 Sigma Aldrich, Alemanha

Ciclohexamida C-7698 Sigma Aldrich, Alemanha

Citrato de Sódio S-4146 Sigma Aldrich, Alemanha

Desoxiribonucleotídeos trifosfato (dNTP´s) 1969064 Roche, Alemanha

Ditiotreitol (DTT) D-9779 Sigma Aldrich, Alemanha

DMSO D-8418 Sigma Aldrich, Alemanha

D-Penicillamine P-4875 Sigma Aldrich, Alemanha

Epinefrina E-4875 Sigma Aldrich, Alemanha

Fluorinerte F-4758 FC-77 Sigma Aldrich, Alemanha

FSH - Ovagen (20 UI NIH-FSH-S1) Immunochemical Products, NZ

Giemsa G-4507 Sigma Aldrich, Alemanha

Glutaraldeído G-7776 Sigma Aldrich, Alemanha

Glutationa G-4251 Sigma Aldrich, Alemanha

HCl 1.09057.1000 Merck, Alemanha

Heparin a H-3149 Sigma Aldrich, Alemanha

Hepes H-6147 Sigma Aldrich, Alemanha

Hialuronidase H-3506 Sigma Aldrich, Alemanha

Hipotaurina H-1384 Sigma Aldrich, Alemanha

Ionóforo de cálcio Ca-I A-23187 C 7522 Sigma Aldrich, Alemanha

Ionomicina I- 0634 Sigma Aldrich, Alemanha

KCl P-5405 Sigma Aldrich, Alemanha

KH2PO4 P-5655 Sigma Aldrich, Alemanha

Lactato de sódio (60%) L-4263 Sigma Aldrich, Alemanha

L-Glutamina G-6392 Sigma Aldrich, Alemanha

114

Mercúrio 21545-7 Aldrich Chem. Co.

Metanol 1.06009.1000 Merck, Alemanha

MgCl2 .H2O M-2393 Sigma Aldrich, Alemanha

Na2HPO4 S-5136 Sigma Aldrich, Alemanha

Na2HPO4 x 7H2O S-9390 Sigma Aldrich, Alemanha

NaCl S-5886 Sigma Aldrich, Alemanha

NaH2PO4 x H2O S-9638 Sigma Aldrich, Alemanha

NaHCO3 S-5761 Sigma Aldrich, Alemanha

OCS (soro de vaca em estro) Coletado in vivo

Óleo mineral M-3516 Sigma Aldrich, Alemanha

Orceína O-7505 Sigma Aldrich, Alemanha

PBS em pó D-5652 Sigma Aldrich, Alemanha

Penicilamina P-5125 Sigma Aldrich, Alemanha

Penicilina P-4687 Sigma Aldrich, Alemanha

PMSF P-7626 Sigma Aldrich, Alemanha

Primers - Metabion, Alemanha

Protease P-8811 Sigma Aldrich, Alemanha

Proteinase K P-8044 Sigma Aldrich, Alemanha

PUC 19 DNA / MspI (HpaII) - MBI Fermentas, Alemanha

PVP-Polivinilpirrolidona PM 40.000 P-0930 Sigma Aldrich, Alemanha

Solução Q Quiagen, Alemanha

Streptomycin S-1277 Sigma Aldrich, Alemanha

Sulfato de gentamicina G-3632 Sigma Aldrich, Alemanha

Tampão PCR 10 x 27-0799 Amersham Pharmacia, Alemanha

Tamra-dUTP 401766 Applied Biosystem, Alemanha

Taq Polimerase 201205 Qiagen, Alemanha

TCM 199 F0615 Biochrom, Alemanha

Triton X-100 T-8787 Sigma Aldrich, Alemanha

Vermelho de fenol P-4633 Sigma Aldrich, Alemanha

6-DMAP (6-Dimetilaminopurina) D-2629 Sigma Aldrich, Alemanha

115

Tabela 2A: Composição das soluções de uso

Nome da solução Componentes Quantidades

Aceto-orceína

Ácido acético ....................................................... Etanol .................................................................. Orceína................................................................. Citrato de sódio....................................................

5 ml 5 ml 500 mg 50 mg

Cal A23187 (5 µM)

Ca-I A23187 estoque........................................... TCM 199-HEPES + 4 mg BSA/ ml......................

997,5 µl 1 ml

Ciclohexamida (10 µg/ ml)

CHX estoque ....................................................... Fert-TALP.............................................................

2,0 µl 0,5 ml

Fert-Talp - Meio de fertilização

Fert-Talp estoque................................................. BSA...................................................................... Piruvato estoque 1............................................... Heparina estoque.................................................

9,5 ml 60 mg 100 µl 250 µl

Hialuronidase (sol. desnudamento)

TCM 199-HEPES + 4 mg/ ml BSA ...................... Hialuronidase estoque………...............................

900 µl 100 µl

Ionomicina (5 µM)

Ionomicina estoque.............................................. TCM 199-HEPES + 4 mg/ ml de BSA .................

1 µl 1 ml

Meio de interrupção da ativação TCM 199-HEPES...........……............................... BSA .....................................................................

3 ml 90 mg

mPBS PBS...................................................................... BSA......................................................................

10 ml 40 mg

MPM (meio de maturação)

MPM..................................................................... OCS...................................................................... FSH estoque........................................................ Piruvato estoque 2…..………………….................

9 ml 1 ml 100 µl 100 µl

Solução de PVP 10% (Polivinilpirrolidona)

PVP............................................... ...................... Sol. NaCl 0,9% ....................................................

1 g 10 ml

116

SOF/ OCS (Meio de cultivo)

SOF estoque........................................................ OCS...................................................................... MEM..................................................................... BME...................................................................... Piruvato estoque 2...............................................

9 ml 1 ml 100 µl 200 µl 150 µl

Sp-TALP (Meio para Swim-up)

Sp-TALP estoque................................................. Piruvato estoque 1............................................... BSA...................................................................... Gentamicina estoque........................................... PHE estoque……………………………................ pH 7,35 - 7,4

9,5 ml 500 µl 60 mg 10 µl 10 µl

Coleta de oócitos TCM –199 HEPES

TCM 199-Hepes.................…............................. OCS.....................................................................

9 ml 1 ml

Etanol/ ác.acético (3:1)

Etanol................................................................... Ác. acético............................................................

30 ml 10 ml

6-DMAP 1,9 mM

Fert-Talp + 4 mg BSA/ ml ……............................ 6-DMAP estoque.....…....………………................

1 ml 10µl

Tabela 3A: Composição das soluções estoque

Nome do meio Componente Quantidade

6-DMAP estoque

6-DMAP........................................................... DMSO.............................................................

3,1 mg 100 µl

Ca-l A23187 estoque DMSO……...................................................... Ca-I A23187....................................................

475 µl 1 mg

Ciclohexamida estoque (2,5µg/ µl)

Etanol absoluto (99%) …………..................... Ciclohexamida………………………................

1 ml 25 mg

DTT estoque

Água Milli-Q ..……….....…………................... DTT .........................…………….....................

250 µl 35 mg

FSH estoque

FSH (Ovagen 20 U NIH-FSH-S1)……............ NaCl 0,9%……………..............………............

10 mg 10 ml

Gentamicina estoque

Gentamicina ……………………...................... NaCl 0,9% .…….......……...…….....................

250 mg 5 ml

117

Heparina estoque (200 µg/ ml) Heparina.......................................................... Fert-Talp Estoque...........................................

1 mg 5 ml

Ionomicina estoque (5 mM) DMSO……………………………......................

Ionomicina………………….............................. 268 µl 1 mg

MPM estoque (modified Parker`s Medium)

Ác lático........................................................... Água Milli-Q..................................................... TCM 199......................................................... L-Glutamina..................................................... NaHCO3.......................................................... Hepes.............................................................. Piruvato estoque 2.......................................... Gentamicina estoque...................................... (Osmolaridade. 280-300 mOsm)

300,0 mg 50,0 ml 500 ml 50 ,0 400 mg 700 mg 100 µl 550 µl

PHE-Estoque 10 µl em 10 ml Fert-talp ou Sp-Talp resultam em: Penicilamina (20 µM) Hipotaurina (10 µM) Epinefrina (2 µM)

Penicilamina..........……………………….....…. Hipotaurina estoque(10mg + 1000 ml H20)..... Epinefrina estoque(3,7 mg + 1000 ml H20)..... Água Milli-Q………........……………................

3 mg 100 µl 100 µl 800µl

Piruvato estoque 1 (para Sp-TALP e Fert-TALP)

Na-Piruvato..................................................... 0,9% NaCl.......................................................

11 mg 5 ml

Piruvato estoque 2 (para MPM e SOF)

Na-Piruvato ................................................... 0,9% NaCl.......................................................

230 mg 10 ml

SOF estoque

Água-Milli-Q.................................................... NaCl………………........................................... KCl………………............................................. KH2PO4………………...................................... CaCl2 x 2H2O………………............................. MgCl2 6H2O………………............................... NaHCO3………………..................................... Vermelho de fenol........................................... Glutamina estoque (200 mmol) ...................... Na-Lactato 60 % ............................................ pH 7,2 – 7,3 270–280 mOsmol

500 ml 3146 mg 267 mg 81 mg

123,9 mg 48,3 mg 1053 mg 0,7 mg 2,5 ml 235,3 µl

[LFM1] Comentário: l

118

Sp-TALP estoque

Aqua - Milli-q……...................………......... KCl………………........................................ NaHCO3………………................................ NaH2PO4 x H2O……......………….............. Hepes ……………..................................... Vermelho de fenol....…………...........……. Na-Lactato (60%).........................………… MgCl2 x 6 H2O………….............................. CaCl2 x H2O……..........……....................... 280 mOsmol

500 ml 115 mg 1045 mg 20 mg 1190 mg 5 mg 1,84 ml 155 mg 191,9 mg

Streptomicina estoque

Penicilina..................……………................ Streptomicina..................………................

250 mg 150,4 mg

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca do CCTA / UENF 014/2004

Matos, Luis Fonseca

Produção in vitro de embriões bovinos por meio da injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) / Luis Fonseca Matos. – 2004. 118 f. : il.

Orientador: Reginaldo da Silva Fontes Tese (Doutorado em Produção Animal) – Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Centro de Ciências e Tecnologias

luis fonseca matos - uenf · mpm meio de parker modificado ºc graus celsius ocs soro de vaca em...

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