leb ii protocolos trabalho 1

IST Laboratrio de Engenharia Biolgica II

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T1 - OPERAO DE UM FERMENTADOR LABORATORIAL PARA

PRODUO DE UMA PROTENA RECOMBINANTE INTRACELULAR,

CITOCROMO b5, POR CLULAS DE Escherichia coli

(2 sesses de laboratrio)

1. Objectivos

O presente trabalho tem por objectivo proporcionar um primeiro contacto com a

operao de um fermentador, a unidade operacional central da maioria dos processos

biotecnolgicos que tm por base a produo de biomassa activa (crescimento celular).

Adicionalmente, pretende-se produzir um caldo fermentativo a utilizar nos trabalhos

subsequentes, T2 a T4.

2. Introduo

Nas primeiras fases do desenvolvimento laboratorial de um processo de

produo de biomassa e/ou produto metablico, a operao de crescimento celular

habitualmente levada a cabo em frascos de incubao, normalmente de vidro, com

volumes de meio que raramente ultrapassam os 2 litros. Aqui, a esterilizao prvia do

meio e do prprio frasco de incubao efectuada colocando-os no interior de uma

autoclave e a inoculao feita transferindo uma poro de cultura de uma rampa ou

placa de Petri com meio slido directamente para o meio de crescimento, aps

autoclavagem e arrefecimento. A homogeneizao do contedo do frasco assegurada

por colocao deste num agitador com movimento orbital ou de vai-vem. Este agitador

est normalmente contido numa cmara de temperatura controlada, que permite manter

os frascos agitados temperatura desejada para o crescimento celular. O mesmo efeito

de agitao responsvel pelo fornecimento de oxignio cultura, por transferncia

atravs interface que separa o lquido do ar contido nos frascos de incubao. Esta

transferncia promovida utilizando-se uma razo volume de meio/volume de frasco

geralmente inferior a 0,2 e, em certos casos, utilizando frascos com anteparas, que

aumentam a turbulncia no lquido. A renovao da fase gasosa no frasco assegurada

pela utilizao de rolhas de material permevel a gases (p. ex., algodo hidrfobo).

Qualquer medida da qualidade da cultura em incubao (valor de pH, concentrao de

biomassa ou de solutos no meio, concentrao de oxignio dissolvido, temperatura)

envolve normalmente a interrupo da incubao para colheita de amostras do caldo e

sua posterior anlise. A adio de agentes de controlo de pH s pode ser feita nestas

ocasies.


2

Quando o mesmo processo efectuado escala industrial, em fermentadores

com volumes operacionais que podem ultrapassar a centena de m3, as condies

operacionais so necessariamente diferentes1. O vaso reaccional normalmente de ao

inox e esterilizado no local em que est instalado, por injeco de vapor de gua a alta

presso no seu interior. A inoculao feita a partir de um fermentador mais pequeno

(10-20% do volume de fermentao, em regra) em que a cultura foi desenvolvida at

um ponto avanado da fase exponencial de crescimento. Este pr-fermentador pode ter

sido, por sua vez, inoculado a partir de um fermentador ainda mais pequeno (dito de

sementeira). Nestes fermentadores em escala industrial, a homogeneizao

assegurada por um sistema de agitao mecnica interno, com um ou mais andares de

turbinas (exceptuam-se os fermentadores tipo air-lift). O fornecimento de oxignio

conseguido atravs de uma corrente de ar comprimido, introduzida no seio do lquido

por intermdio de uma tubagem de ao perfurada. Esta corrente de ar filtrada entrada

e sada do fermentador, para excluir contaminaes. A concentrao de oxignio

dissolvido medida continuamente por um elctrodo esterilizado, imerso no meio, e

controlada por actuaes na vlvula de admisso de ar comprimido e na velocidade de

rotao das turbinas de agitao. A temperatura do meio medida por uma sonda

(termopar) contida numa manga imersa no meio e controlada pela passagem de fluidos

(normalmente gua) de aquecimento ou de arrefecimento numa camisa que envolve a

parede lateral do fermentador. O valor de pH medido em contnuo por um elctrodo

esterilizado imerso no meio e controlado por adio de solues concentradas de cido

ou base, a partir de reservatrios esterilizados, ligados ao fermentador principal. A

formao de espuma detectada por uma sonda colocada no topo da parte interior do

fermentador e anulada pela alimentao controlada de um agente oleoso anti-espuma

estril. Todo este processo opera com aquisio de dados e controlo automtico por um

sistema computorizado SCADA (Supervisory Control And Data Acquisition). Em

paralelo, podem ser colhidas amostras do caldo de fermentao, para anlises off-line,

sem interrupo do processo, por intermdio de uma vlvula de amostragem estril.

Um fermentador laboratorial pretende duplicar as condies descritas no

pargrafo anterior, numa escala pequena. Deste modo, permite-se a continuao dos

estudos de desenvolvimento do processo, sem custos demasiado altos, possibilitando

uma previso mais correcta do comportamento da fermentao quando ela for operada

em escala industrial (scale-up). Um esquema simplificado de um fermentador

laboratorial dado na Figura 1. Fermentadores laboratoriais com volumes at 5-10 litros

so ainda esterilizados no interior de autoclaves, sendo necessrio prever sistemas

rpidos de acoplagem/desacoplagem para o motor de agitao, para as entradas/sadas

de ar, gua de arrefecimento e solues de controlo de pH e de espuma, e para as

conexes de sondas e elctrodos unidade de controlo. escala laboratorial, o controlo


3

da temperatura pode utilizar uma manga ou camisa de circulao de gua fria, para o

arrefecimento, recorrendo normalmente a uma resistncia elctrica, para o aquecimento.

A etapa de pr-fermentao realizada em frasco de incubao.

No presente trabalho, ser proporcionada a oportunidade de manipular os

sistemas acima descritos, para um fermentador laboratorial, incluindo as fases de

preparao para esterilizao, calibrao de elctrodos, montagem aps esterilizao,

inoculao e acompanhamento da fermentao propriamente dita.

Figura 1 - Esquema simplificado de um fermentador laboratorial; C - unidades de controlo; B -

bombas.

3. O caso em estudo - produo de citocromo b5 recombinante

O citocromo b5 faz parte de um complexo enzimtico que catalisa a insaturao

de cidos gordos. Trata-se de uma protena de membrana constituda por uma nica

cadeia polipeptdica (13.600 Da de peso molecular) e cuja estrutura terciria apresenta

dois domnios distintos. Um deles de natureza globular e hidroflica, contendo o grupo

heme que est envolvido em reaces de oxidao, e o outro de natureza hidrfoba,


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sendo responsvel pela ligao da protena membrana do retculo endoplsmico. O

domnio hidroflico do citocromo b5 de rato foi clonado em Escherichia coli (TB1)

atravs da sntese de novo do gene e da sua introduo no plasmdeo pUC 13, o que

permite a sua produo por fermentao em elevadas concentraes2 (at 8% da

protena total intracelular). Com este vector, esta estirpe de E. coli resistente a

ampicilina. Assim, este antibitico includo no meio de crescimento, evitando o

desenvolvimento de estirpes de E. coli que no tenham o vector e de outros

contaminantes eventualmente presentes no fermentador aps esterilizao.

Pretende-se operar o fermentador para quantificar a produo de biomassa e de

citocromo b5, ao longo do tempo, num processo de crescimento descontnuo (batch),

nas condies operacionais impostas. Esta experincia seria subsequentemente repetida

para diferentes conjuntos de condies operacionais, identificando-se assim as variveis

relevantes e o seu efeito, e possibilitando-se a seleco das melhores opes a utilizar

no scale-up para as escalas piloto e industrial. O processo de crescimento em batch

inclui as fases usuais, i.e., latncia/arranque, crescimento exponencial, estacionria e de

lise ou decaimento. Com a inoculao a partir de uma pr-cultura colhida na sua fase de

crescimento exponencial, pretende-se minimizar a durao da fase de latncia, que

representa um desperdcio da capacidade produtiva do fermentador. Por outro lado,

pretende-se identificar o instante da fermentao em que se atinge a produtividade

mxima, em termos de biomassa e/ou em termos de citocromo b5. O prolongamento da

fermentao para l deste instante s se justificar caso proporcione valores mais

elevados de concentrao de biomassa ou citocromo, que facilitem as etapas

subsequentes de recuperao e purificao. Assim, importante o traado das curvas de

produo em toda a sua extenso (todas as fases, at lise). Com estas, possvel a

determinao de valores para a taxa especfica de crescimento (fase exponencial) e

respectivo tempo de duplicao (equaes 1 e 2, respectivamente), e para a

produtividade em biomassa e em citocromo b5 (equaes 3 e 4, respectivamente):

ft

X

X.ln

0

= para >> kd (Eq. 1)

2ln

=dt (Eq. 2)

Pf

biomassa

rtt

XP

+= (Eq. 3)

Pf

citocromocitocromo

rtt

CP

+= (Eq. 4)


5

em que X e X0 so as concentraes de biomassa ao tempo de fermentao tf e

logo aps a inoculao (tf = 0), e kd so as taxas especficas de crescimento e de morte da biomassa, respectivamente, td o tempo de duplicao da cultura, tP o tempo

necessrio para a preparao do fermentador, entre duas fermentaes sucessivas,

Ccitocromo a concentrao de citocromo b5 atingida ao tempo tf, Prbiomassa e Pr

citocromo so

as produtividades do processo em biomassa e em citocromo b5, respectivamente,

atingidas ao tempo tf.

4. Procedimento experimental

4.1. Meio de cultura e inculo

A composio do meio de fermentao a seguinte (em gua destilada):

Peptona 10 g/L

Extracto de levedura 5 g/L

Glucose 10 g/L

NaCl 5 g/L

Ampicilina 100 mg/L

O meio preparado em trs fraces:

a) Dado que a ampicilina termolbil, tem que ser esterilizada por filtrao, em

soluo concentrada (100 g/L, em gua destilada), e adicionada ao restante

meio somente aps este ter sido esterilizado e arrefecido at temperatura

ambiente. Esta soluo fornecida na aula, j preparada e esterilizada, em

tubos eppendorf.

b) Para evitar reaces de acastanhamento, a glucose esterilizada parte, por

autoclavagem, em soluo concentrada (200 g/L, em gua destilada) e

adicionada ao restante meio aps arrefecimento.

c) O restante meio, contendo peptona, extracto de levedura e NaCl,

esterilizado dentro do fermentador, por autoclavagem, sendo suplementado

com as fraces a) e b), aps arrefecimento.

Os volumes de meio a utilizar nos dois tipos de fermentador a operar neste

trabalho so de 1200 e 1500 mL, para os fermentadores Minifors e Fermac,

respectivamente. Estes volumes correspondem soma das fraces b) [5%] + c) [95%],

desprezando-se a contribuio por parte da fraco a) [0,1%].

O inculo desenvolvido num frasco do tipo kitasato, num volume de meio

igual a 10% do volume de meio do fermentador. Uma vez que no fcil controlar o

valor de pH na incubao em frasco, o inculo crescido em meio sem glucose, para


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evitar a acumulao excessiva de cidos orgnicos. O meio para o inculo , assim,

constitudo pelas fraces a), b) e c) nas mesmas propores do meio de fermentao,

excepto que a fraco b) substituda por gua destilada.

4.2. Preparao dos fermentadores

Neste trabalho sero utilizados fermentadores de 2 litros (volume til mximo de

1,8 L), modelos Minifors (Infors, Sua; www.infors-ht.com) ou Fermac 320

(Electrolab, Reino Unido, www.electrolab.biz).

4.2.1. Introduo ao sistema de fermentao

O vaso de fermentao de vidro, assente num sistema de suporte. A tampa do

vaso em ao inox e nela esto suportados todos os acessrios operacionais (ao inox),

nomeadamente: o tubo de arejamento perfurado na parte inferior, o orifcio de sada de

gases encimado por um condensador arrefecido a gua, as anteparas ou chicanas

internas, a serpentina de arrefecimento (modelo Fermac), o tubo de recolha de amostras,

a manga que ir conter o sensor de temperatura, vrios tubos para a entrada de solues,

o eixo de rotao com as turbinas de agitao e os orifcios de montagem dos elctrodos

de oxignio dissolvido, de pH e de deteco de espuma. Recomenda-se um exame

atento do vaso, para identificao prvia de todos estes elementos.

A unidade de controlo apresenta visores para visualizao de dados, um teclado

para introduo de valores operacionais e para seleco dos modos de visualizao,

bombas peristlticas para a alimentao de solues, um circuito de admisso de ar

comprimido (vindo de um circuito local) com vlvula e um rotmetro (medida e

regulao manual do caudal), um circuito de admisso de gua de arrefecimento, com

distribuio para o condensador e para a serpentina, um circuito elctrico que alimenta a

camisa de aquecimento por resistncia elctrica, e suportes para os frascos que contm

as solues a alimentar (cido, base, anti-espuma). Recomenda-se um exame atento da

unidade, para identificao prvia de todos estes elementos.

4.2.2. Sensores e sua calibrao

O sensor de temperatura encontra-se ligado unidade de controlo e no ser

sujeito a calibrao (identific-lo).

O elctrodo de pH disponibilizado imerso em gua destilada. A sua calibrao

efectuada a dois pontos, com recurso a solues-padro a valores de pH de 7,00 e

4,00, fora do vaso de fermentao, antes da esterilizao. Para tal, o elctrodo deve ser


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acoplado unidade de controlo e sujeito ao procedimento de calibrao indicado pelo

fabricante.

O elctrodo de oxignio dissolvido disponibilizado imerso em gua destilada.

A sua calibrao efectuada em duas etapas. O ponto zero da escala (% de saturao)

calibrado fora do vaso de fermentao, antes da esterilizao, utilizando uma soluo de

sulfito de sdio (agente redutor, 50 mM) e sulfato de cobre (catalisador, 1 mM),

preparada no momento ( fornecido um copo com os dois reagentes, j doseados para

dissoluo em 100 mL de gua destilada). O elctrodo deve ser acoplado unidade de

controlo (localizar previamente o ponto de ligao) e sujeito ao procedimento de

calibrao especificado para o modelo de fermentador em uso. O ponto 100 da escala de

saturao calibrado com o elctrodo imerso no meio j esterilizado, imediatamente

antes da inoculao, ajustando por alguns minutos a velocidade de agitao a 700 rpm e

o caudal de arejamento a um ponto prximo do mximo da escala do rotmetro

(saturao do meio em oxignio) e seguindo o procedimento indicado pelo fabricante.

O sensor de espuma no ser utilizado. A formao de espuma ser controlada

por alimentao manual de um mnimo de agente anti-espuma (leo de silicone), por

meio de uma seringa ligada a um dos tubos de alimentao.

4.2.3. Preparao e esterilizao do vaso e acessrios

Na preparao do fermentador para autoclavagem, devem ser efectuadas as

seguintes operaes:

- Preparar a fraco c) do meio de fermentao, ajustar-lhe o valor de pH a perto de

7,0 se necessrio (por adio de NaOH ou HCl) e introduzi-la no fermentador, com

o auxlio de um funil.

- Montar os elctrodos (lavados com gua destilada) nos respectivos orifcios da

tampa (enroscar com cuidado, sem apertar demasiado); desligar os cabos de ligao

dos elctrodos unidade de controlo; envolver os topos dos elctrodos em folha de

alumnio.

- Localizar os topos dos tubos de arejamento e de recolha de amostras e acoplar-lhes

os troos de tubagem de silicone respectivos, a seringa de recolha e o filtro de ar,

como esquematizado na Figura 1; colocar pinas de Hoffman nos troos indicados e

fech-las; colocar algodo hidrfobo na sada do filtro de ar (desacoplada do

rotmetro) e cobri-la com folha de alumnio; envolver o filtro e a seringa em folha

de alumnio.


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- Tapar o orifcio da manga do sensor de temperatura com algodo hidrfobo e folha

de alumnio; o sensor no esterilizado.

- Ligar, a um dos tubos de admisso de solues, um troo de tubagem ligado a uma

seringa contendo 2-3 mL de leo de silicone; envolver a seringa em folha de

alumnio.

- Cobrir os restantes tubos de admisso de solues com folha de alumnio.

- Tapar a ponta da tubagem ligada sada do condensador com algodo hidrfobo e

folha de alumnio.

- Desacoplar os tubos de admisso de gua de arrefecimento, caso estejam acoplados

unidade de controlo.

- Desacoplar a camisa elctrica de aquecimento, caso esteja acoplada ao vaso de

fermentao (a camisa no autoclavada).

- Desacoplar o motor de agitao, caso este esteja acoplado; cobrir o topo do eixo de

agitao com folha de alumnio.

- Encher os recipientes de alimentao de cido e base com solues a 2N de HCl e

NaOH, respectivamente; fech-los com as tampas correspondentes e ligar-lhes os

troos de tubagem que passaro pelas bombas (no modelo Minifors, as tubagens

vo a autoclavar junto com as peas de montagem nas bombas); tapar a ponta solta

de cada tubagem com algodo e folha de alumnio; colocar uma pina de Hoffman

bem fechada nesta tubagem, junto ao extremo solto.

- Preparar o meio para o inculo (sem a ampicilina, ver parte 4.1), introduzi-lo num

frasco tipo kitasato de 250-500 mL e tap-lo com rolha de algodo e folha de

alumnio; na tubuladura lateral do frasco, ligar um troo de tubagem munido de

uma pea de unio de dimetro compatvel com um dos tubos de admisso de

solues no vaso de fermentao (ou com o tubo de amostragem); tapar a pea com

algodo e folha de alumnio; colocar uma pina de Hoffman no troo de tubagem e

fech-la.

- Preparar a fraco b) do meio de fermentao (soluo de glucose, ver parte 4.1)

num balo erlenmeyer de 250 mL e tap-lo com rolha de algodo e folha de

alumnio.

- Reunir 10 seringas autoclavveis de 10 mL, envolver a ponta de cada uma em folha

de alumnio e coloc-las num copo autoclavvel coberto com folha de alumnio.

Todos os elementos acima descritos so autoclavados em conjunto, a 1,1 bar e

121C, durante 20 minutos.


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4.3. Preparao do inculo

O frasco kitasato com o meio de inculo autoclavado e arrefecido

suplementado, chama, com o volume adequado de soluo de ampicilina estril. O

meio assim completo inoculado a partir de colnias retiradas duma placa de Petri

recente (fornecida na aula) e incubado a 37C, com agitao orbital a 200 rpm, durante

cerca de 12 h.

4.4. Arranque da fermentao

As condies operacionais a implementar na fermentao so as dadas na Tabela

1. A temperatura e o pH sero controlados a valores fixos, previamente determinados

como adequados para a produo de citocromo b5 pela presente estirpe. Condies de

limitao do crescimento pelo oxignio so favorveis sntese deste produto2. Procura-

se obter estas condies estabelecendo um caudal de arejamento limitado (valor fixo,

entre 0,5 e 1 vvm) e controlando a concentrao de oxignio dissolvido a um valor (set-

point do sistema de controlo) o mais prximo possvel de 2% (escala de saturao),

actuando na velocidade de agitao (entre os limites de 130 e 600 rpm).

Tabela 1. Condies operacionais na fermentao

Parmetro operacional Set-point (ou limites de controlo)

Temperatura

pH

Taxa de arejamento

37 C

7,00 0,05

0,5 - 1,0 vvm (valor fixo)

Concentrao de oxignio dissolvido 2,0 % da saturao

Limites de variao da velocidade de agitao mnimo: 130 rpm

mximo: 600 rpm

Antes da inoculao, so efectuadas as seguintes operaes:

- Arrefecimento dos elementos autoclavados, at temperatura ambiente.

- Ligao das tubagens de admisso de gua de arrefecimento (serpentina,

condensador) aos pontos respectivos na unidade de controlo; abertura da torneira da

rede de gua (se estiver fechada).


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- Ligao da tubagem de admisso de ar ao filtro e abertura da pina colocada no

troo de ligao ao tubo perfurado; abertura da vlvula da rede de ar comprimido,

se estiver fechada.

- Acoplagem do motor de agitao.

- Imerso da extremidade da tubagem de sada de ar num recipiente contendo uma

soluo de hipoclorito comercial (lixvia) diluda 1:2, para preveno de

contaminaes.

- Colocao da camisa elctrica de aquecimento volta do vaso de fermentao.

- Introduo do sensor de temperatura na respectiva manga.

- Ligao dos cabos entre os elctrodos e a unidade de controlo.

- Ligao (power on) da unidade de controlo, se estiver desligada.

- Ligao da funo de controlo da temperatura, introduo do valor de set-point e

colocao em servio (posio on), para que o meio seja aquecido at temperatura

de fermentao.

- Ligao das tubagens dos recipientes de cido e base s bombas (unidade de

controlo) e aos tubos de admisso de solues ao fermentador ( chama) (retirar as

pinas de Hoffman).

- Ferragem das bombas de admisso de cido e de base, se necessrio.

- Ligao da funo de controlo do pH, introduo do valor de set-point e colocao

em servio (posio on), para que o pH do meio seja ajustado, se necessrio, ao

valor de fermentao.

- Ligao das funes de arejamento e agitao e procedimento de calibrao do

elctrodo de oxignio ao ponto 100 da escala de saturao (ver parte 4.2.2);

suspenso do arejamento e ajuste da velocidade de agitao a 200 rpm.

- Introduo dos valores de set-point e limites de controlo das variveis operacionais

(Tabela 1, oxignio dissolvido e agitao) na unidade de controlo.

O frasco kitasato contendo a cultura de inculo retirado da estufa de incubao

e suplementado, chama, com as partes a) (soluo de ampicilina) e c) (soluo de

glucose) do meio de fermentao. Igualmente chama, a tubuladura lateral do kitasato

ligada a um dos tubos de entrada de solues no fermentador. A suspenso de inculo

suplementada cuidadosamente transferida para o interior do fermentador e o tubo

utilizado fechado com a pina. O arejamento ligado e o seu caudal ajustado no

rotmetro, ao valor operacional. So colocadas em servio (posio on) as funes de


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controlo de variveis que ainda estiverem desligadas. A fermentao tem incio neste

instante.

4.5. Amostragem e mtodos analticos

4.5.1. Amostragem

So retiradas amostras de cerca de 4-5 mL, de uma forma assptica ( chama),

utilizando a seringa de amostragem (substituda por uma nova em cada amostragem) ao

longo da fermentao, para determinao das concentraes de biomassa e de citocromo

b5. As amostragens ocorrem ao tempo de incio da fermentao e a cada 30 minutos at

s 2 h de fermentao (5 amostras). So retiradas ainda mais 2-3 amostras no dia

seguinte (entre as 18 e as 24 horas de fermentao). Em cada amostragem, so anotados

os valores das variveis operacionais e uma breve descrio de qualquer ocorrncia

digna de registo. A fermentao terminada cerca de 24 horas aps a inoculao, com

recolha do caldo para posterior processamento.

4.5.2. Determinao da concentrao de biomassa

A concentrao de biomassa determinada por medio da densidade ptica de

cada amostra a 600 nm, contra um branco de gua destilada. Sempre que necessrio, as

amostras so diludas em tampo fosfato (20 mM, pH 7,0, fornecido na aula). A

densidade ptica obtida convertida em teor de biomassa (peso seco) atravs da curva

de calibrao fornecida (Apndice I). Todas as medies devem ser feitas em duplicado.

4.5.3. Determinao da concentrao de citocromo b5

A concentrao de citocromo b5 determinada de acordo com os seguintes

passos:

Centrifugao das amostras (2 1,5 mL, em tubos eppendorf) a 10.000 rpm

(8.900g) durante 8 minutos. Remoo cuidadosa dos sobrenadantes e

ressuspenso das clulas depositadas em tampo fosfato (20 mM, pH 7,0), at

perfazer o volume inicial.

Ruptura das clulas por sonicao de 3 mL de suspenso celular, num tubo de vidro

grosso mantido em gelo. Os ultrassons sero produzidos num sonicador Bandelin

modelo Sonopuls HD 3200 (www.bandelin.com/datenblaetter/labor_e.pdf ; a partir

da pg. 16), munido de um transdutor UW3200 e de uma ponta MS73, durante um

tempo total de 3 minutos, interrompidos periodicamente para controlo da


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temperatura em valores de refrigerao. O ciclo ser de 10s on e 5s off, a uma

potncia de 30 W.

Centrifugao da suspenso de fragmentos celulares (2 1,5 mL, em tubos

eppendorf) a 14.000 rpm (17.500g), durante 30 minutos, e recuperao muito

cuidadosa da soluo de citocromo sobrenadante (Ateno: mesmo a ressuspenso

de uma nfima quantidade de fragmentos celulares causadora de interferncias no

passo seguinte).

Leitura directa (se possvel, seno diluir com gua destilada) da absorvncia do

sobrenadante a 410 nm, contra gua destilada, e determinao da concentrao de

citocromo b5 no homogenato celular, por aplicao da lei de Lambert-Beer (vide

Apndice II). O coeficiente de extino molar do citocromo b5 a este comprimento

de onda 410 = 130 mM-1

cm-1

.

As trs ltimas etapas deste procedimento so efectuadas j na sesso do

Trabalho 2.

5. Informaes a anotar no caderno de laboratrio

Preparar uma tabela em que so registados, para cada amostra:

- A identificao da amostra (1, 2, ...).

- O dia e a hora em que a amostra foi recolhida.

- O valor do tempo de fermentao, a partir do instante de inoculao.

- Os valores das variveis operacionais, medidos na altura da amostragem

(temperatura, pH, oxignio dissolvido, velocidade de agitao, caudal de ar

alimentado).

- Quaisquer observaes pertinentes.

Preparar uma outra tabela em que so registados, para cada uma das mesmas

amostras atrs registadas:

- A identificao da amostra e respectivos duplicados (p.ex., a, b).

- O factor de diluio utilizado na leitura da densidade ptica a 600 nm.

- O valor da densidade ptica medida a 600 nm.

- O factor de diluio utilizado na leitura da absorvncia a 410 nm, aps sonicao e

centrifugao.

- O valor da absorvncia medida a 410 nm.


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- Quaisquer observaes pertinentes

Nos cabealhos das tabelas, indicar os nomes das variveis, as unidades em que

so medidas e a preciso da medida.

Elaborar uma lista com as seguintes informaes, indicando, para os valores

numricos, as unidades e preciso das medidas:

- A marca e o modelo do sistema de fermentao usado.

- O valor do volume de lquido adicionado.

- As marcas e modelos de equipamentos auxiliares utilizados (espectrofotmetro e

sonicador).

Para todos os reagentes usados (incluindo os utilizados na preparao das

solues disponibilizadas), anotar a sua marca, referncia e grau de pureza.

6. Elaborao do resumo alargado (relatrio)

O resumo alargado (relatrio) deste trabalho dever conter:

1) Uma introduo breve a explicar o objectivo do trabalho e os mtodos usados.

2) Uma descrio do procedimento experimental, de forma resumida, incluindo

os valores das variveis operacionais e as caractersticas do fermentador e dos reagentes

usados.

3) Tabelas com os valores medidos para cada amostra (listados acima)

acrescidos de colunas adicionais com os valores calculados de concentraes de

biomassa e de citocromo b5, bem como os valores de teor de citocromo b5 na biomassa.

4) Uma representao grfica da evoluo das concentraes de biomassa e de

citocromo b5 no fermentador, ao longo do tempo do ensaio, bem como da evoluo dos

valores de produtividade em biomassa e em citocromo; para os dois ltimos, fazer uma

estimativa fundamentada do valor de tP.

5) Uma representao grfica dos valores de ln(X/X0) em funo do tempo de

fermentao, para determinao do valor de .

6) A indicao dos valores e td, bem como dos valores de produtividade mxima para a biomassa e para o citocromo b5, com os respectivos tempos de

fermentao associados.

7) Um breve comentrio aos valores experimentais medidos e calculados, bem

como s circunstncias em que decorreu o trabalho, em concluso.


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7. Bibliografia

1. Fonseca, M. M. e Teixeira, J. A. (2007), Reactores Biolgicos Fundamentos e

Aplicaes, Lidel, Lisboa.

2. Belo, I. e Mota, M. (1998), Batch and fed-batch cultures of E. coli TB1 at different

oxygen transfer rates - Effect of stirring and oxygen partial pressures on cell growth

and cytochrome b5 production, Bioprocess Engineering, 18: 451-455.

8. Apndices


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Local de realizao: Laboratrio 7.6.1, Piso 7, Torre Sul.

Docente orientadora: Helena Pinheiro

Docente assistente: Lusa Davies

Tcnico assistente: Ricardo Pereira

Contactos: Torre Sul, Piso 8, Gabinete 8.6.19

ext. 3125 / [email protected]

leb ii protocolos trabalho 1

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