larissa silva zane expressÃo de hla-g e hla-g5 em...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
LARISSA SILVA ZANE
EXPRESSÃO DE HLA-G E HLA-G5 EM PACIENTES COM SÍNDROME DE PARRY-ROMBERG
VITÓRIA
2015
LARISSA SILVA ZANE
EXPRESSÃO DE HLA-G E HLA-G5 EM PACIENTES COM SÍNDROME DE PARRY-ROMBERG
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Flavia de Paula Co-orientadora: Prof.ª Dr.ª Flavia Imbroisi Valle Errera
VITÓRIA 2015
LARISSA SILVA ZANE
EXPRESSÃO DE HLA-G E HLA-G5 EM PACIENTES COM SÍNDROME DE PARRY-ROMBERG
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espirito Santo, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia.
Apresentada em 27 de outubro de 2015.
________________________________ Prof.ª Dr.ª Flavia de Paula
Universidade Federal do Espírito Santo
________________________________ Prof.ª Dr.ª Flavia Imbroisi Valle Errera Escola Superior de Ciências da Santa
Casa de Misericórdia de Vitória
_______________________________ Prof.ª Dr.ª Daniela Amorim Melgaço Guimarães do Bem
Universidade Federal do Espírito Santo
______________________________ Prof.ª Dr.ª Maria Rita dos Santos e Passos Bueno
Universidade de São Paulo
VITÓRIA 2015
Dedico este trabalho à minha filha Moana, luz que guia meu caminho ∞
AGRADECIMENTOS
Meus sinceros agradecimentos a todos que colaboraram direta e indiretamente para
a realização deste trabalho, em especial à minha família, principalmente minha mãe,
que sempre me apoiou em todas as minhas decisões, torcendo incondicionalmente
pelo meu sucesso.
Ao meu marido, que está sempre do meu lado, pelo amor e parceria.
À minha filha Moana, que é de onde eu tiro forças todos os dias para seguir em
frente e fazer minha vida ter sentido, por entender que a mamãe precisava estudar
na maioria das vezes em que ela queria brincar.
À minha orientadora, Dr.ª Flavia de Paula, que me aceitou como orientanda e
sempre acreditou em mim, me incentivou e me ajudou muito.
À minha co-orientadora, Dr.ª Flavia Errera, que gentilmente me orientou durante o
mestrado com toda sua paciência, compreensão e dedicação. Me fez crescer
profissionalmente e amar ainda mais a pesquisa.
À Prof.ª Dr.ª Maria Rita dos Santos e Passos Bueno, pela oportunidade única de
realizar esse trabalho e vivenciar a verdadeira ciência 24 horas por dia em seu
laboratório e por ter supervisionado meu estágio técnico científico.
À todos os pacientes que participaram e seus familiares.
Aos pesquisadores e funcionários do Laboratório de Genética do Desenvolvimento
– Centro de Estudos do Genoma Humano, IB-USP, principalmente ao Felipe Ishiy,
pela ajuda constante, à Naila Lourenço, pelas coletas realizadas, à Simone Ferreira
e Andressa Morales, pela ajuda com as células, ao Gerson, a May e ao Lucas, pelos
ensinamentos. Ao Dr. Rodrigo Dornelles, Dr. Nivaldo Alonso e Dr. Luiz Alexandre
Tissiani, do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo, pela colaboração.
Aos colegas de mestrado, professores e funcionários do Programa de Pós-
Graduação em Biotecnologia – UFES, pela agradável convivência.
Aos membros da banca, Dr.ª Maria Rita dos Santos e Passos Bueno e Dr.ª Daniela
Amorim Melgaço Guimarães do Bem, por aceitarem o convite.
Aos amigos do Laboratório de Genética e Biologia Molecular da EMESCAM,
Luciana, Luiz Antônio, Andréia, Cristiane, Prof.ª Lucia, em especial às minhas
amigas de todos os dias Iara e Josi, e à minha amiga de longa data, Marcela.
À Agatha, pela amizade, parceria e por toda ajuda no desenvolvimento deste
trabalho. Você foi fundamental para tudo dar certo!
À Maressa, pela ajuda e boa vontade em me ensinar a analisar os dados.
Às agências de apoio e financiamento: CAPES, FAPES e FAPESP.
‘’Dê o primeiro passo de fé. Você não precisa ver todos os
degraus da escada. Apenas dê o primeiro passo.’’
Martin Luther King
RESUMO
A Síndrome de Parry-Romberg (SPR) ou Atrofia hemifacial progressiva (HFA) é uma
doença rara (1:250.000 a 1:700.000), de causa desconhecida, caracterizada por
atrofia unilateral da face, acometendo pele, tecidos moles, músculos e tecidos
ósseos subjacentes de forma lenta, progressiva e autolimitada. A patogênese da
SPR é heterogênea, parece ser sobreposta à da esclerodermia linear, mas ainda
não é totalmente compreendida. Infecções virais, traumas, atividade neurológica e
autoimunidade têm sido propostos para explicar a etiologia da SPR. Tendo por base
o mecanismo inflamatório e autoimune proposto como uma das causas para SPR e
do gene HLA-G estar envolvido em algumas doenças inflamatórias e autoimunes, o
objetivo deste trabalho é verificar se os níveis de expressão das isoformas HLA-G e
HLA-G5 diferem entre pacientes com SPR e controles. Células tronco mesenquimais
derivadas de tecido adiposo (ASCs) foram isoladas de gordura obtida por
lipoaspiração tanto dos pacientes (n=9), antes do uso para lipoenxertia autóloga com
fins terapêuticos, quanto dos controles (n=9), nesse caso para fins estéticos. O RNA
total foi isolado das ASCs e a técnica de PCR quantitativa em Tempo Real foi
utilizada para avaliar a expressão das isoformas HLA-G (membranar) e HLA-G5
(solúvel) do gene HLA-G. A análise estatística foi feita através do teste não
paramétrico de Mann-Withney. Foi observado que as ASCs dos pacientes com SPR
apresentaram menor expressão relativa de HLA-G - isoforma de membrana (p =
0,000), mas não de HLA-G5 – isoforma solúvel (p = 0,387). O HLA-G é uma
molécula imunomoduladora associada à doenças inflamatórias e autoimunes,
portanto esse trabalho mostra, pela primeira vez, que baixos níveis de expressão de
HLA-G em pacientes com SPR podem estar relacionados à supressão da resposta
imunológica, levando a uma autoagressão. Estudos adicionais verificando a
reprodutibilidade desse resultado são necessários para melhor compreensão da
importância do HLA-G e dos mecanismos moleculares envolvidos na etiologia da
SPR, para melhorar estratégias de diagnóstico precoce e abrir perspectivas
terapêuticas visando o aumento da atividade imunossupressora por meio do
estímulo ao aumento da expressão de HLA-G nesses pacientes.
Palavras-chave: Síndrome de Parry-Romberg. Atrofia hemifacial progressiva.
HLA-G. HLA-G5.
ABSTRACT
The Parry-Romberg Syndrome (PRS) or Progressive hemifacial atrophy (HFA) is a
rare disorder (1:250,000 to 1:700,000), of unknown etiology, characterized by
unilateral atrophy of the face, affecting the skin, soft tissues, muscles and bone, in
slow, progressive and self-limited form. The pathogenesis of SPR is heterogeneous,
seems to be associated with linear scleroderma, but it is not totally understood. Viral
infections, trauma, neurological activity and autoimmunity have been proposed to
explain the etiology of SPR. Based on the inflammatory mechanism and proposed
autoimmune as a cause for SPR and HLA-G gene being involved in some
inflammatory and autoimmune diseases, the aim of this study is to verify if the
expression levels of the isoforms HLA-G and HLA-G5 differs between patients with
SPR and controls. Mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (ASCs) were
isolated from fat obtained by liposuction from patients (n = 9) prior to use for fat
grafting autologous therapeutic purposes, and from controls (n = 9), in this case for
aesthetic purposes. Total RNA was isolated from ASCs and quantitative PCR Real
time was used to analyse the expression of the isoforms HLA-G (membrane) and
HLA-G5 (soluble) of the HLA-G gene. Statistical analysis was performed using the
nonparametric test of Mann-Whitney. It was observed that the ASCs from patients
with PRS had lower relative expression of HLA-G - membrane isoform (p = 0.000),
but not HLA-G5 - soluble isoform (p = 0.387). HLA-G is an immunomodulatory
molecule associated with inflammatory and autoimmune diseases, so this study
shows for the first time, that low levels of HLA-G expression in patients with SPR
may be related to suppression of the immune response, leading to a autoimune.
Additional studies verifying the reproducibility of this result are needed to better
understand the importance of HLA-G and the molecular mechanisms involved in the
etiology of SPR, to improve early diagnosis strategies and open therapeutic
perspectives aimed the increasing immunosuppressive activity by stimulating the
increase HLA-G expression in these patients.
Key words: Parry-Romberg Syndrome. Progressive hemifacial atrophy.
HLA-G. HLA-G5.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Hemiatrofia facial direita em uma menina de 8 anos............................16
Figura 2 – Paciente com SPR................................................................................16
Figura 3 – Paciente com atrofia da hemiface esquerda, incluindo olho, dentes e
língua ....................................................................................................................18
Figura 4 – Pacientes com Esclerodermia Linear ‘’em golpe de sabre’’.................19
Figura 5 – Aspecto da SPR em mulher de 38 anos antes (esquerda) e depois
(direita) da lipoenxertia autóloga………………………………………………………23
Figura 6 – Genes do HLA localizados no braço curto do cromossomo 6……..….26
Figura 7 – Organização do gene HLA-G……………………………..……….……...28
Figura 8 – Esquema das sete isoformas do gene HLA-G......................................29
Figura 9 – Estrutura proteica das isoformas HLA-G1, HLA-G2, HLA-G5 e
HLA-G6…………………………………………………………………………..……….30
Figura 10 - Expressão relativa de HLA-G no grupo afetado e no grupo controle
(p = 0,000)..............................................................................................................40
Figura 11 - Expressão relativa de HLA-G5 no grupo afetado e no grupo controle
(p = 0,387)..............................................................................................................41
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Comparação entre LSCS e SPR em relação aos achados
clínicos.......................................................................................................................20
Tabela 2 – HLA-G relacionado à algumas doenças inflamatórias e imunológicas....32
Tabela 3 – Sequência dos primers utilizados na RT qPCR para medir os níveis de
transcrição dos genes alvos estudados e dos genes endógenos controles……..….37
Tabela 4 – Dados da expressão relativa de HLA-G e HLA-G5 em pacientes e
controles....................................................................................................................39
Tabela 5 - Estatística descritiva da expressão relativa de HLA-G e HLA-G5 em
pacientes e controles.................................................................................................39
LISTA DE SIGLAS
ACTB Actin beta
AR Artrite reumatóide
AS Espondilite anquilosante (do inglês Ankylosing spondylitis)
ASCs Células tronco derivadas de tecido adiposo (do inglês adipose tissue
derived stem cells)
BD Doença de Behçet (do inglês Behçet’s disease)
CA Califórnia CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CAPPESQ Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa
CEGH Centro de Estudos do Genoma Humano
cDNA DNA complementar (do inglês complementary DNA)
Ct Cycle threshold
CTL Linfócitos T citotóxios (do inglês cytotoxic T cell)
DMEM-F12 Dulbecco’s modified Eagle medium-F12
DNA Ácido desoxirribonucleico (do inglês Deoxyribonucleic acid)
EMESCAM Escola Superior de Ciências da Santa Casa de Misericórdia de Vitória
FAPES Fundação de Amparo à Pesquisa do Espírito Santo
FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
FBS Soro fetal bonivo (do inglês fetal bovine serum)
HC-FMUSP Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de
São Paulo
HLA Antígeno leucocitário humano (do inglês human leukocyte antigen)
HFA Atrofia hemifacial progressiva (do inglês hemifacial atrophy
progressive)
HPRT1 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1
IB/USP Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo
IL Interleucina
IMGT ImMuno GeneTics project
IFNγ Interferon gamma
KD Doença de Kawasaki (do inglês Kawasaki disease)
KIR Receptores tipo imunoglobulina de células killer (do inglês killer cell
immunoglobulin like receptors)
LILR Receptores de leucócito tipo imunoglobulina (do inglês leukocyte
immunoglobulin like receptors)
LSCS Esclerodermia linear em Golpe de Sabre (do francês sabre cut)
MHC Complexo Principal de Histocompatibilidade (do inglês major
histocompatibility complex)
mL Mililitros
µL Microlitros
MSC Células tronco mesenquimais (do inglês mesenchymal stem cell)
MVEC Células endoteliais microvasculares (do inglês microvascular
endothelial cells)
Ng Nanogramas
NK Natural Killer
OMIM Online Mendelian Inheritance in Man
PB Pares de bases
PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Reação em Cadeia da Polimerase (do inglês Polymerase chain
reaction)
PLA Células de lipoaspiração processadas (do inglês processed lipoaspirate
cells)
RNA Ácido ribonucleico (do inglês Ribonucleic acid)
RNAm RNA mensageiro
RPM Rotações por minuto
RT qPCR Transcriptase Reversa PCR quantitativa em Tempo Real (do inglês
Reverse transcription real time quantitative PCR)
SLE Lúpus eritomatoso sistêmico (do inglês Systemic lupus erythematosus)
SNP Polimorfismo de Nucleotídeo Único (do inglês single nucleotide
polymorphism)
SPR Síndrome de Parry-Romberg
SSc Esclerose Sistêmica (do inglês Systemic Sclerosis)
TBP TATA box binding protein
TH Linfócitos T auxiliares (do inglês T helper cells)
UFES Universidade Federal do Espírito Santo
USA Estados Unidos da América (do inglês United States of America)
UTR Região não traduzida (do inglês untranslated region)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................15
1.1 Caracterização da Síndrome de Parry-Romberg...........................15 1.1.1 Etiologia...............................................................................20 1.1.2 Diagnóstico..........................................................................21 1.1.3 Tratamento...........................................................................22 1.1.4 Patogênese..........................................................................24
1.2 Sistema Imunológico........................................................................24 1.2.1 Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC).......25 1.2.2 Antígeno Leucocitário Humano G (HLA-G).......................27
2 OBJETIVOS.......................................................................................................33
2.1 Objetivo geral.....................................................................................33 2.2 Objetivos específicos........................................................................33
3 METODOLOGIA................................................................................................34
3.1 Casuística...........................................................................................34 3.2 Obtenção de células tronco mesenquimais a partir de tecido adiposo.....................................................................................................34 3.3 Extração de RNA e Síntese de cDNA...............................................35 3.4 PCR quantitativa em Tempo Real (RT-qPCR).................................35 3.5 Análise Estatística.............................................................................37
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.........................................................................38
4.1 Resultados Clínicos...........................................................................38 4.2 Resultados Moleculares....................................................................38 4.3 Discussão...........................................................................................42
5 CONCLUSÕES..................................................................................................45
6 REFERÊNCIAS..................................................................................................51
ANEXO I ...............................................................................................................57
15
1 INTRODUÇÃO
A atrofia hemifacial progressiva (HFA, do termo em inglês hemifacial atrophy
progressive, OMIM 141300) foi descrita primeiramente por Parry em 1825 e melhor
estudada por Romberg em 1846, sendo, por isso, também denominada Síndrome de
Parry-Romberg (SPR) (OMIM 141300) (PEREIRA et al., 2007). Trata-se de uma
doença rara. Sua real incidência não é bem conhecida, pois muitas vezes não é
diagnosticada ou então é mal diagnosticada, o que dificulta afirmar sua frequência.
Alguns autores estimam que a doença pode afetar 1 em 250.000 (SUSSER e
CHAPMAN, 2003) até 1 em 700.000 (CASTRO-GOVEA et al., 2012) pessoas na
população em geral. Nos estudos de casos descritos na literatura, a SPR parece
acometer mais frequentemente mulheres do que homens, em uma proporção de
aproximadamente 3:1 a 3:2 (SUSSER e CHAPMAN, 2003; MOKO, MISTRY e
CHALAIN, 2003; TERENZI et al., 2005; CASTRO-GOVEA et al., 2012; EL-KEHDY,
ABBAS e RUBEIZ, 2012; CHOKAR et al., 2014).
1.1 Caracterização clínica da Síndrome de Parry-Romberg
A SPR caracteriza-se por atrofia unilateral da face, geralmente acometendo pele,
tecidos moles, músculos e tecidos ósseos subjacentes (figura 1). A atrofia é lenta,
progressiva e autolimitada. A gravidade e os sintomas específicos da doença são
altamente variáveis de uma pessoa para outra. O sintoma característico é a atrofia
de vários tecidos da hemiface, incluindo gordura, pele, tecido conjuntivo, músculos,
e em alguns casos, osso (figura 2) (PEREIRA et al., 2007; EL-KEHDY, ABBAS e
RUBEIZ, 2012).
16
Figura 1- Hemiatrofia facial direita em uma menina de 8 anos. Fonte: PEREIRA et al., 2007.
Figura 2 – Paciente com SPR. A: Hemiface normal. B: Hemiface afetada. Fonte: RANGARE et al., 2011.
Outras manifestações clínicas têm sido relatadas na literatura, como dores de
cabeça frequente, dores na face, problemas oculares e visuais (figura 3), e até
convulsões (CHOKAR et al., 2014). Ansiedade e depressão podem acompanhar o
quadro, possivelmente pela aparência facial que causa. É tipicamente restrita a um
17
lado da face, mas em alguns casos raros, ambos os lados são afetados.
Ocasionalmente pode também envolver membros, como braço, tronco e perna (EL-
KEHDY, ABBAS e RUBEIZ, 2012). O quadro 1 mostra o espectro fenotípico geral da
doença.
Quadro 1 – Espectro fenotípico da SPR. Fonte: OMIM 141300 (Disponível em: <http://omim.org/clinicalSynopsis/141300?highlight=romberg%20parry>. Acesso em 15 de outubro de 2015).
Categoria Subcategoria Características Herança Casos isolados
Cabeça e pescoço
Face Um lado afetado
Orelhas Pequenas
Olhos
Enoftalmia
Perda de gordura periorbital
Blefarofimose
Blefaroptose
Ptose
Lagoftalmia
Boca Atrofia do lábio
Atrofia da língua
Dentes Retardo na erupção
Maloclusão
Esqueleto Crânio Cifose basilar
Corpo curto e ramo da mandíbula
Pele, unhas e cabelo Cabelo Alopecia
Poliose Músculos e tecidos moles Atrofia muscular da face
Neurológicos Sistema Nervoso Central
Síndrome de Horner
Neuralgia trigeminal
Ataxia
Enxaqueca
Variados
Maioria dos casos é esporádica
Início na infância ou adulto jovem Atrofia do lado esquerdo é mais frequente
18
Figura 3 – Paciente com atrofia da hemiface esquerda, incluindo olho, dentes e língua. Fonte: KAYA et al., 2014.
Em alguns casos, uma "linha" pode formar-se na zona onde as alterações atróficas
de um lado da face encontram a pele normal não afetada do outro lado da face. Esta
linha varia muito e pode ocorrer tanto na vertical quanto na diagonal na testa. A pele
afetada é espessa e endurecida (esclerose). Esta condição pode ser referida como
Esclerodermia Linear "em golpe de sabre" (OMIM 141300, LSCS, do francês "sabre
cut") (figura 4) e pode ocorrer por si só como um achado isolado (SUSSER e
CHAPMAN, 2003). A relação exata de LCSC e SPR não é totalmente compreendida,
mas fica claro que os dois comumente coexistem (TERENZI et al., 2005;
TOLKACHJOV, PATEL e TOLLEFSON, 2015).
19
Figura 4 – A e B: pacientes com Esclerodermia Linear ‘’em golpe de sabre’’. Fonte: EL-KEHDY, ABBAS E RUBEIZ, 2012.
A SPR é considerada por alguns autores um tipo de esclerodermia (LAPRESLE e
DESI, 1982; AUVINET et al., 1989; LEHMAN, 1992; STONE, 2003; ANDERSON et
al., 2005; EL-KEHDY, ABBAS e RUBEIZ, 2012; CHOKAR et al., 2014). A Esclerose
Sistêmica (SSc, do inglês systemic sclerosis), um tipo de esclerodermia, é uma
doença do tecido conjuntivo de etiologia desconhecida com envolvimento de
múltiplos órgãos e manifestações clínicas heterogêneas. As manifestações clínicas e
patológicas da doença são o resultado de três processos distintos: (1)
anormalidades do sistema imune inato e adaptativo, levando à produção de
autoanticorpos e autoimunidade, (2) células endoteliais microvasculares (MVEC, do
inglês microvascular endothelial cells) e vasculopatia fibroproliferativa de pequenos
vasos, e (3) disfunção dos fibroblastos levando a um excessivo acúmulo de
colágeno e de componentes da matriz na pele, vasos sanguíneos e órgãos internos.
As manifestações da doença variam de envolvimento limitado da pele com mínimo
envolvimento sistêmico (cutânea limitada) a envolvimento generalizado da pele
acompanhado de envolvimento de órgãos internos (cutânea difusa) (PATTANAIK et
al., 2015).
Vários estudos têm tentado distinguir SPR de LSCS com base em critérios clínicos e
histopatológicos (BLASZCZYK e JABLONSKA, 1999; OROZCO-COVARRUBIAS et
al., 2002; BLASZCZYK et al., 2003). A maioria dos casos não tem distinção clara, é
discutido por vários autores e é cada vez mais consistente a ideia de que essas
condições façam parte do espectro da mesma doença (BLASZCZYK e
20
JABLONSKA, 1999; JABLONSKA e BLASZCZYK, 2005, TOLKACHJOV, PATEL e
TOLLEFSON, 2015). A tabela 1 mostra uma comparação geral entre LSCS e SPR.
Tabela 1 – Comparação entre LSCS e SPR em relação aos achados clínicos
Esclerodermia Linear em golpe de sabre Síndrome de Parry-Romberg
Características clínicas
- Endurecimento cutâneo/esclerose - Atrofia paramediana
- Esclerose do couro cabeludo, testa - Nenhum endurecimento de pele
- Hiperpigmentação - Atrofia pode estender-se pelo rosto inteiro
- Alopecia (couro cabeludo/sobrancelha)
Características histopatológicas
- Esclerose dérmica - Esclerose dérmica
- Infiltrados celulares mononucleares - Atrofia de gordura
- Atrofia anexial - Diminuição de estruturas anexiais
- Infiltrados celulares mononucleares
Associações extracutâneas
- Atrofia de tecido subcutâneo, gordura, músculos
e estruturas osteocartilaginosas
- Atrofia e deformidade de língua, dentes e gengiva
- Neuropatia cranial
- Perda da visão
Fonte: TOLKACHJOV, PATEL e TOLLEFSON, 2015 (traduzida e adaptada)
1.1.1 Etiologia
A SPR frequentemente se inicia durante a primeira ou segunda década de vida
(PEREIRA et al., 2007), entretanto há alguns casos descritos na literatura em
indivíduos com mais de 40 anos (VEDVYAS e URBANEK, 2013; MOKO, MISTRY e
CHALAIN, 2003; PAULA et al., 2014).
A causa da doença é desconhecida. No entanto, sabe-se que a maioria dos casos é
esporádica, embora alguns casos raros familiais tenham sido relatados
(ANDERSON et al., 2005). Diversos mecanismos têm sido propostos para explicar o
aparecimento da doença, incluindo inflamação do sistema nervoso simpático,
21
infecções virais ou bacterianas, inflamação no cérebro ou nas meninges, traumas –
cerca de 24% a 34% dos pacientes com SPR apresentam um histórico, seja por
traumas cirúrgicos, como tireoidectomia, extração dentária ou trauma obstétrico;
anormalidades na formação dos vasos sanguíneos (angiogênese), hereditariedade
ou por causas autoimunes (AYNACI et al., 2001; SUSSER e CHAPMAN, 2003;
ALENCAR et al., 2011; EL-KEHDY, ABBAS e RUBEIZ, 2012). A SPR como uma
manifestação de esclerodermia é proposta por causa da similaridade histológica e
coexistência frequente nos mesmos indivíduos (EL-KEHDY, ABBAS e RUBEIZ,
2012; TOLKACHJOV, PATEL e TOLLEFSON, 2015).
1.1.2 Diagnóstico
O diagnóstico da SPR geralmente é difícil, principalmente no início da doença. Ele é
feito com base na identificação de sintomas característicos, uma história detalhada
do paciente, avaliação clínica completa e uma variedade de testes específicos, que
são feitos dependendo de quais sintomas estão presentes e quais surgiram primeiro.
Por exemplo, imagens de ressonância magnética podem ser usadas em indivíduos
com sintomas neurológicos; exames microscópicos (biópsia) de tecidos da pele
afetados podem ser usados em pacientes com LSCS (SUSSER e CHAPMAN,
2003).
A progressão da atrofia pode variar bastante. Alguns autores afirmam que o tempo
de duração da doença varia de 2 a 20 anos, antes de estabilizar (EL-KEHDY,
ABBAS e RUBEIZ, 2012; CHOKAR et al., 2014). A atrofia facial pode progredir
lentamente ao longo de muitos anos até parar. Se a atrofia para durante a
progressão, pode ocasionalmente reativar mais tarde durante a vida, mas isso é
raro. Em alguns casos, a atrofia pode progredir indefinidamente. Em outros, quando
a atrofia começa em uma idade precoce, a progressão parece acelerar mais
rapidamente do que quando ela começa mais tarde na vida (SUSSER e CHAPMAN,
2003).
O estágio final da deformação depende da duração da doença. É fundamental o
22
acompanhamento do quadro clínico. A condição compromete não somente a parte
estética, mas também a funcionalidade da face, afetando movimentos e expressões
faciais (EL-KEHDY, ABBAS e RUBEIZ, 2012).
Guerrerosantos et al. (2007), dividem os pacientes em quatro grupos (pacientes tipo
1, 2, 3 e 4), de acordo com a extensão da atrofia facial, para melhor escolha do
tratamento.
O diagnóstico diferencial inclui esclerodermia localizada, síndrome de Rasmussen,
microsomia hemifacial, síndrome de Goldenhar, paralisia facial idiopática,
lipodistrofia congênita de Berardinelli-Seip e lipodistrofia parcial adquirida. Os
pacientes com lesões na face, como por exemplo queimaduras, necrose de gordura
e deformidades congênitas também devem ser considerados (OLDSTONE, 1998).
1.1.3 Tratamento
Geralmente, o tratamento oferecido para a síndrome visa à melhora do aspecto
estético. Uma variedade de técnicas cirúrgicas têm sido utilizadas para melhorar a
aparência facial nos indivíduos afetados. Enxertos com gordura, cartilagem, injeções
de silicone e implantes inorgânicos são utilizados na correção da atrofia (KAYA et
al., 2014). As taxas de sucesso destas opções cirúrgicas são altamente variáveis.
Guerrerosantos et al. (2007), sugerem que a classificação quanto ao tipo de atrofia
seria importante na escolha da opção cirúrgica para cada paciente. O tratamento
clínico da doença com imunossupressores ou outras medicações também utilizadas
na esclerodermia, como a cloroquina e o calcipotriol, é discutido por vários autores,
todavia, ainda não há evidências científicas para utilização desse tipo de medicação
na SPR (ALENCAR et al., 2011).
O tratamento cirúrgico não é recomendado até que as mudanças atróficas cessem
ou, ao menos estabilizem, e o grau de deformidade facial resultante seja
estabelecido. O monitoramento pode ser feito por fotografias médicas tiradas
periodicamente para comparação (SUSSER e CHAPMAN, 2003). Existem diversas
alternativas sugeridas para correção dos defeitos da face, como os diferentes tipos
23
de enxertos: dérmico, cartilaginoso, ósseo ou gorduroso (ALENCAR et al., 2011).
A correção estética mais preconizada para a SPR é a lipoenxertia autóloga. Essa
técnica tem como vantagens melhor custo-benefício, melhor textura da pele e
contornos e expressões faciais mais naturais. A lipoenxertia é baseada na reposição
do tecido que foi perdido em função da atrofia (figura 5) (COLEMAN, 1999).
Segundo Alencar et al. (2011), a preferência por enxertos autólogos se dá pelo
menor risco de rejeição tecidual e, consequentemente, menor reação inflamatória
local e sistêmica que possibilitariam a perda do enxerto ou outras comorbidades ao
paciente. Os enxertos autólogos de tecido gorduroso são os mais utilizados. Tecido
gorduroso é modelável, tem boa disponibilidade e fácil acesso.
Figura 5 – Aspecto da SPR em mulher de 38 anos antes (esquerda) e depois (direita) da lipoenxertia autóloga. Fonte: ALENCAR et al., 2011.
24
1.1.4 Patogênese
A patogênese da SPR é heterogênea e ainda não é totalmente compreendida. É
possível que a causa e o desenvolvimento da doença sejam diferentes de uma
pessoa para outra (EL-KEHDY, ABBAS e RUBEIZ, 2012). A principal teoria é de que
a SPR é uma doença autoimune. Isto é suportado pela presença de outras
condições autoimunes, tais como Lúpus Eritematoso Sistêmico (SLE, do inglês
Systemic lupus erythematosus), Miopatia generalizada e Artrite Reumatóide (AR) em
alguns pacientes com SPR (PONIECKI, BERNACKA e HRYSZKO, 1971; RODDI et
al., 1994). Outra teoria sobre a patogênese da SPR, como na morféia, que é
considerada uma variante da esclerodermia localizada, é a disfunção vascular.
Alterações vasculares podem alterar a produção de colágeno e a proliferação de
matriz extracelular (SARTORI-VALINOTTI, TOLLEFSON e REED, 2013). Etiologia
infecciosa também têm sido proposta na patogênese da SPR, apesar de nenhum
estudo ter sido capaz de demonstrar esta teoria (TOLKACHJOV, PATEL e
TOLLEFSON, 2015). As infecções pela bactéria Borrelia burgdorferi (SOMMER et
al., 2006) também são citadas como fator etiológico da doença.
O cuidado deve ser usado na interpretação destes dados, pois como essas são
ocorrências relativamente comuns, pode haver um equívoco na definição da
etiologia da doença. Em resumo, a patogênese da SPR ainda não é completamente
compreendida, no entanto, uma combinação de fatores autoimunes é o que melhor
parece explicá-la (TOLKACHJOV, PATEL e TOLLEFSON, 2015).
1.2 Sistema Imunológico
O sistema imunológico é constituído por uma intrincada rede de órgãos, células e
moléculas e tem por finalidade manter a homeostase do organismo, combatendo as
agressões em geral. Em um estado normal, o sistema imunológico produz
anticorpos, cuja função principal é proteger o organismo de eventuais ataques, por
vírus, bactérias, células cancerígenas e quaisquer outros corpos estranhos. Estes
25
agentes agressores, chamados de antígenos, são capazes de determinar a
produção de anticorpos (ABBAS, LICHTMAN e PILLAI, 2012; SOUZA et al., 2010).
Nas doenças autoimunes, o sistema imunológico perde a capacidade de distinguir
os antígenos das suas próprias células, passando a direcionar anticorpos contra o
próprio organismo, o que leva a uma autoagressão. Estes autoanticorpos formam
complexos imunológicos que vão aumentando nos diversos tecidos, dependendo do
tipo da doença autoimune, causando lesões graves em órgãos/sistemas específicos,
ou sobre o organismo de forma geral (SOUZA et al., 2010; ABBAS, LICHTMAN e
PILLAI, 2012). Os genes relacionados às funções imunológicas do organismo estão
localizados no Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC, do inglês major
histocompatibility complex).
1.2.1 Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) O MHC é composto por um conjunto de genes altamente polimórficos, denominados
complexo HLA (antígeno leucocitário humano, do inglês human leukocyte antigen), e
compreende mais de 120 genes funcionais, dos quais cerca de 20% estão
associados à imunidade (CRUVINEL et al., 2010). Uma característica única entre as
moléculas de HLA é formar multímeros (VEIT e CHIES, 2009). O MHC no ser
humano está localizado no braço curto do cromossomo 6 (figura 6), e os genes
podem ser reunidos em 3 grupos, denominados genes de classe I, II e III. Os de
classe I codificam as moléculas clássicas de histocompatibilidade HLA-A, B e C, os
de classe II as moléculas clássicas HLA-DR, DQ e DP. Já os genes de classe III,
embora estejam incluídos dentro do MHC, não codificam moléculas de
histocompatibilidade, e sim outras moléculas, que podem ou não fazer parte do
sistema imune. As proteínas C4 e C2 da via clássica, o fator B da via alternativa do
complemento, os fatores de necrose tumoral, a proteína do choque térmico e as
enzimas 21-hidroxilase são moléculas incluídas na região de classe III
(FERNANDES et al., 2003). A associação entre doenças autoimunes e genes do
MHC reflete o papel importante dessas moléculas no direcionamento da resposta
imune (CRUVINEL et al., 2010).
26
Figura 6 – Genes do HLA localizados no braço curto do cromossomo 6. Fonte: WESTOVER et al., 2011.
O estudo sobre a função dos genes relacionados ao sistema imune é uma área que
vem despertando interesse crescente. Durante muito tempo, os genes do MHC de
classe I e II, principais responsáveis pelo processo de rejeição de transplantes
alogênicos, geraram grande volume de publicações sobre seus papéis nos
processos autoimunes que caracterizam essas doenças. Na década de 1980, a
descoberta de genes do MHC que não compartilhavam alto grau de polimorfismo
levantou questionamentos sobre sua utilidade fisiológica (HUGHES e NEI, 1989).
Segundo Brenol et al. (2012), a partir de 1990, essas questões começaram a ser
respondidas com a identificação do HLA-G (antígeno leucocitário humano G, do
inglês human leukocyte antigen G), na interface feto-placentária, expresso na
superfície de trofoblastos. Constatou-se que além de o HLA-G ser responsável pela
proteção do feto contra a resposta imune da mãe, essa molécula estava relacionada
a processos de imunorregulação importantes em transplantes, tumores e infecções
virais, bem como em doenças inflamatórias (CRUVINEL et al., 2010).
27
1.2.2 Antígeno Leucocitário Humano - G (HLA-G)
O HLA-G (OMIM 142871) é uma molécula não clássica do MHC de classe I, com
expressão tanto por meio de isoformas solúveis quanto acopladas à superfície de
membranas (BRENOL et al., 2012). O gene HLA-G localiza-se na região
cromossômica 6p21.3 (PORRAS-DORANTES e GARCIA-ORTIZ, 2014), apresenta
baixo polimorfismo em sua região codificadora, tem padrão de expressão limitado
em condições saudáveis, altamente restrita a determinados tecidos – além de ser
expresso em tecidos fetais, como as células do trofoblasto, é constitutivamente
expresso apenas no timo em adultos, córnea, ilhotas pancreáticas e precursores de
células endoteliais e eritróides (BRENOL et al., 2012).
A organização do gene HLA-G é similar aos dos genes HLA de classe Ia, possuindo
oito exons que codificam um peptídio sinal (exon 1), o domínio α1 (exon 2), o
domínio α2 (exon 3), o domínio α3 (exon 4), o domínio transmembrana (exon 5), a
cauda citoplasmática (exons 6 e 7) e uma região não traduzida (exon 8) (figura 7)
(KIRISITS, KUNZ e GILL, 1991). Possui 50 alelos descritos até o momento e
codifica 16 proteínas diferentes, de acordo com o banco de dados IMGT/HLA, visto
em setembro de 2015 (<http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html>. Acesso em 10 de
setembro de 2015).
28
Figura 7 – Organização do gene HLA-G. Fonte: HUNT, 2006.
As proteínas de HLA-G podem ocorrer em sete diferentes isoformas (quatro ligadas
à membrana: G1, G2, G3 e G4, e três formas solúveis: G5, G6 e G7 (figura 8), e são
geradas por splicing alternativo (CAROSSELA et al., 2003). HLA-G1 é a isoforma
completa. Nas isoformas G5, G6 e G7, os domínios transmembrana e o
citoplasmático não são traduzidos, resultando em formas solúveis (PAUL et al.,
2000). Devido a uma mutação, o HLA-G apresenta uma cauda citoplasmática que é
menor que as existentes nos HLA-A, B e C (GERAGHTY, KOLLER e ORR, 1987).
Essa característica tem implicações importantes para a expressão do HLA-G, já que
proporciona uma expressão mais prolongada de HLA-G na superfície celular em
comparação com as moléculas clássicas de HLA (PARK et al., 2001).
Existem argumentos convincentes de que o HLA-G desempenhe papel importante
na regulação do sistema imunológico: (1) o HLA-G é capaz de ligar-se a vários tipos
de receptores, alguns dos quais são amplamente distribuídos entre as células do
sistema imunológico; (2) o HLA-G pode exercer efeitos tolerogênicos de longo prazo
por meio da geração de moléculas supressoras; e (3) mesmo as células que não
transcrevem HLA-G podem tornar-se temporariamente HLA-G positivas, adquirindo
um perfil imunossupressor por meio de um fenômeno chamado trogocitose, que é
uma forma de contato entre as células levando à troca de partes de membranas e
moléculas associadas. Neste caso acontece a captação intercelular de HLA-G pela
incorporação de fragmentos de membrana que expressam essa molécula (VEIT,
29
VIANNA e CHIES, 2010).
Figura 8 – Esquema das sete isoformas do gene HLA-G. Fonte: RIZZO et al., 2013.
Várias células supressoras relacionadas ao HLA-G foram identificadas. Células T
HLA-G+ podem ser induzidas por meio de aloestimulação e produzir HLA-G5 solúvel.
Segundo BRENOL et al. (2012), esta propriedade imunossupressora é partilhada
pelas proteínas HLA-G1 e HLA-G5 (LeMAOULT, ROUAS-FREISS e CAROSELLA,
2005). Segundo Rizzo et al. (2014), HLA-G1 e HLA-G5 representam as principais
isoformas expressas e investigadas de HLA-G e atualmente são consideradas as
principais isoformas funcionais.
A proteína HLA-G5 possui três domínios extracelulares (α1, α2 e α3) e pode estar
associada com microglobulina β2 de cadeia leve, assim como HLA-G1 (figura 9). A
proteína HLA-G6 não possui o domínio α2, assim como HLA-G2, e pode ser
expressa como homodímeros de cadeias pesadas (CAROSELLA et al., 1999).
30
Figura 9 – Estrutura proteica das isoformas HLA-G1, HLA-G2, HLA-G5 e HLA-G6. Fonte:
CAROSELLA et al., 1999.
O HLA-G exerce seus efeitos imunorregulatórios pela ligação a receptores
específicos em diferentes tipos de células imunológicas (HUGHES e NEI, 1989). O
complexo de receptor de leucócitos inclui duas famílias de genes polimórficos:
receptores tipo imunoglobulina (LILR, do inglês leukocyte immunoglobulin like
receptors) e receptores tipo imunoglobulina de células Killer (KIR, do inglês killer cell
immunoglobulin like receptors). Dentre as moléculas LILR, o LILR1 e o LILR2 são
receptores inibitórios que reconhecem todas as moléculas HLA classe I. O LILR1 é
expresso pelas células B, algumas células T e células Natural Killer (NK), e todos os
monócitos, enquanto que o LILR2 é específico de linhagens mielóides. Existem
evidências de que LILRB1 e LILRB2 ligam-se ao HLA-G (WILLCOX, THOMAS e
BJORKMAN, 2003; SHIROISHI et al., 2006). O receptor KIR2DLA (CD158d) é um
membro da família KIR que também liga HLA-G. A sinalização por esse receptor
ocorre de maneira diferente dos receptores LILR: após sua ligação ao receptor, o
HLA-G solúvel é internalizado em endossomos. Essa sinalização resulta, de forma
interessante, em uma resposta pró-inflamatória e pró-angiogênica, com importantes
funções em locais de expressão do ligante, como na interface materno-fetal durante
as fases iniciais da gestação (RAJAGOPALAN, 2010).
31
Recentemente foi demonstrado que o HLA-G é fator determinante para as funções
imunomoduladoras das Células Tronco Mesenquimais (MSC, do inglês,
mesenchymal stem cells) que são células encontradas na medula óssea, tecido
adiposo e cordão umbilical, capazes de se diferenciar em várias linhagens, como
osteoblastos, condroblastos e adipócitos. MSCs possuem fortes propriedades
imunorreguladoras, pois secretam vários fatores imunossupressores. Com relação
ao efeito de HLA-G nas células imunes, foram observadas propriedades inibitórias
comuns entre MSCs e HLA-G (SELMANI et al., 2009).
É cada vez mais evidente que a molécula HLA-G pode ser capaz de exercer ação
direta e sustentada no sistema imunológico por meio de seus efeitos
imunorregulatórios, indução de células supressoras e trogocitose (BRENOL et al.,
2012).
Todas as suas características contribuem para o crescente interesse cientifico nessa
molécula, algumas das quais são de vital importância nas funções biológicas do
HLA-G, caracterizadas principalmente pela indução de tolerância imunológica (VEIT
e CHIES, 2009).
Coletivamente, os resultados que emergem da literatura confirmam a importância da
molécula HLA-G na patogênese e progressão de doenças e infecções de base
inflamatória e imunológica (tabela 2), inclusive em uma forma de SSc (WASTOWSKI
et al. 2009), destacando a relevância da sua investigação com o objetivo de
desenvolver novas estratégias terapêuticas, marcadores clínicos e modelo de estudo
(RIZZO et al., 2014).
32
Tabela 2 – HLA-G relacionado à algumas doenças inflamatórias e imunológicas.
Doença HLA-G Método Referência
Lúpus
Mais frequente nos afetados PCR - polimorfismo Catamo et al., 2015
Associado à susceptibilidade da doença PCR - polimorfismo / meta análise Lee, Bae e Song, 2015
Menor expressão em afetados Citometria Monsiváis-Urenda, 2011
Menor expressão em afetados Citometria e Imunohistoquímica Rosado et al., 2008
Artrite reumatóide
Associado à susceptibilidade da doença PCR – polimorfismo Catamo et al., 2014
Associado à doença Elisa, citometria, PCR - polimorfismo Rizzo et al., 2013
Associado à doença PCR - polimorfismo Verbruggen et al., 2006
Esclerose sistêmica
Mais frequente nos afetados Imunohistoquímica Wastowski et al., 2009
Filhos de mães com SSc não apresentaram Multiplex PCR Picard et al., 2013
níveis elevados
Sua associação com a SSc foi sugerida por Wastowski et al. (2009), em estudo
realizado no Brasil, onde foi verificado que pacientes que apresentavam maior
expressão de HLA-G em biópsias de pele afetada, possuíam melhor prognóstico da
doença, enquanto que aqueles que possuíam baixa expressão, tinham uma piora
significativa no quadro clínico. Isso demonstra que o HLA-G é fator protetor em
condições patológicas, devido às suas características imunossupressoras.
Posteriormente esses achados foram confirmados por Picard et al. (2012) e Favoino
et al. (2015).
Assim, o HLA-G torna-se um candidato em potencial para exercer influência na
expressão clínica de diversas doenças caracterizadas por alterações inflamatórias e
imunológicas, dentre elas, a SPR.
A SPR é uma doença com muitos relatos de casos descritos, porém não há na
literatura estudos que demonstram a sua relação com a expressão de HLA-G e HLA-
G5. O advento da Biologia Molecular com técnicas capazes de identificar
marcadores genéticos e mecanismos moleculares relacionados com as vias e
funções dessas moléculas certamente trará grandes benefícios para a elaboração
de novas estratégias preventivas e terapêuticas. Além disso, a caracterização dos
mecanismos moleculares envolvidos na SPR é uma importante ferramenta na
compreensão da etiologia e patogênese da doença. A identificação de novos
mecanismos moleculares relacionados com as vias e funções dessas moléculas são
necessários para melhorar estratégias de diagnóstico e tratamento da doença.
33
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a expressão de HLA-G e HLA-G5 na Síndrome de Parry-Romberg.
2.2 Objetivos específicos
• Analisar os níveis de expressão de transcritos dos genes HLA-G e HLA-G5
em células tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo de pacientes e
controles;
• Verificar se há diferença na expressão de transcritos dos genes HLA-G e
HLA-G5 em células tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo entre
pacientes e controles.
34
3 METODOLOGIA
3.1 Casuística
A amostra foi constituída por 18 indivíduos, sendo nove indivíduos afetados pela
SPR e nove indivíduos sem SPR. Os indivíduos afetados foram submetidos à
cirurgia reparadora (lipoenxertia autóloga) para reconstrução facial e amostras de
tecido adiposo foram coletadas para o estabelecimento de culturas de células tronco
em projeto anterior aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa (CAPPESQ 1069/08).
As células estavam armazenadas no Biobanco do Centro de Estudos do Genoma
Humano (CEGH) e foram utilizadas no presente trabalho.
A amostra controle foi constituída por nove indivíduos saudáveis que foram
submetidos à cirurgia plástica e/ou lipoaspiração, com fins estéticos, no Hospital das
Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FMUSP),
cujas células também estavam armazenadas no Biobanco do CEGH.
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de
Biociências da Universidade de São Paulo (IB/USP 44667315.3.0000.5464 anexo I).
Essa linha de pesquisa foi proposta pela pesquisadora M.R.S. Passos-Bueno, a qual
gentilmente nos convidou para conduzir a parte experimental.
3.2 Obtenção de células tronco mesenquimais a partir de tecido adiposo
Após coleta de fragmentos de tecido adiposo, tanto na cirurgia reparadora dos
pacientes, quanto na lipoaspiração dos controles, sob condições seguras e
assépticas, foram estabelecidas culturas de MSCs, seguindo o Protocolo de Aguena
et al. (2012), com modificações: obtenção de 5mL de tecido adiposo de
lipoaspiração; lavagem com PBS 1x (Phosphate Buffered Saline) (Sigma-Aldrich®);
35
transferência para tubo estéril de 50mL; remoção e descarte do PBS; adição de 3mL
de solução de colagenase 0,075% (tipo IA, Sigma-Aldrich®); incubação a 37ºC por
30 minutos; adição de 3mL de DMEM-F12 (Dulbecco’s modified Eagle medium)
(Invitrogen, CA, USA) mais Soro bovino fetal 10% (FBS, do inglês fetal bovine
serum) (Invitrogen, CA, USA) para neutralização da colagenase; centrifugação a
1500rpm por 1 minuto; seleção do infranadante e transferência para um novo tubo;
centrifugação a 1300rpm por 5 minutos para obtenção de pellet de PLA cells (células
de lipoaspiração processadas, do inglês processed lipoaspirate cells); ressuspensão
do pellet em DMEM-F12 + FBS 15%; contagem das células e armazenamento em
meio DMEM-F12 com FBS 15%, L-glutamina 1% e antibiótico 1%. Essas amostras
foram congeladas em nitrogênio líquido até o isolamento do RNA total.
3.3 Extração de RNA e Síntese de cDNA
As células tronco mesenquimais provenientes de tecido adiposo foram expandidas e
posteriormente, o RNA total foi extraído utilizando o kit NucleoSpin RNA II®
(Macherey-Nagel), seguindo instruções do fabricante. O RNA total foi quantificado
no equipamento NanoDrop® ND-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, USA) e sua
integridade foi avaliada em eletroforese de gel de agarose (1%). O cDNA foi
sintetizado a partir de 10µL de RNA total (2000ng) utilizando o kit SuperScript™ II
Reverse Transcriptase (Invitrogen™), seguindo instruções do fabricante, e
armazenado a -80ºC até a realização da PCR quantitativa em tempo real (RT
qPCR).
3.4 PCR quantitativa em Tempo real (RT qPCR)
A RT qPCR realiza a quantificação dos ácidos nucléicos de maneira precisa e com
maior reprodutibilidade, porque determina valores durante a fase exponencial da
reação. A emissão dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumenta na
36
proporção direta da quantidade de produto da PCR. Sendo assim, os valores da
fluorescência são gravados durante cada ciclo e representam a quantidade de
produto amplificado. Dentre as vantagens desta técnica em relação a PCR
convencional estão a facilidade na quantificação, maior sensibilidade, maior
precisão, reprodutibilidade e acurácia, velocidade da análise, melhor controle de
qualidade no processo e menor risco de contaminação (NOVAIS e PIRES-ALVES,
2004).
A análise da expressão gênica foi realizada por RT qPCR, pelo método de SYBR®
Green. Como genes alvos foram avaliados: HLA-G e HLA-G5 e como genes
controles endógenos, foram utilizados o TBP (TATA box binding protein), o ACTB
(actin beta) e o HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1). Um total de 2µl
de cada amostra de cDNA foi misturada a 4µl de primer específico (Forward e
Reverse), 10µl de SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) e 4µl de
água DNase/RNase-free para um volume final de 20µl. As reações de RT qPCR
foram realizadas em duplicatas utilizando ABI Prism 7500 Fast Sequence Detection
System (Applied Biosystems).
A sequência dos primers dos genes controles endógenos e dos genes alvos estão
listados na tabela 3. O Ct (Cycle threshold) foi definido como o número do ciclo em
que um aumento significativo no sinal da fluorescência foi detectado pela primeira
vez. Os dados obtidos foram analisados pelos valores de Ct, que foram convertidos
em expressão relativa de acordo com o método de 2-∆∆CT (LIVAK e SCHMITTGEN,
2001).
37
Tabela 3 – Sequência dos primers utilizados na RT qPCR para medir os níveis de transcrição dos genes alvos estudados e dos genes endógenos controles.
Todas as sequências estão no sentido 5’ – 3’
Todos os experimentos foram realizados no Laboratório de Genética do
Desenvolvimento – CEGH, IB/USP.
3.5 Análise Estatística
Os dados foram resumidos através de medidas da estatística descritiva, como
média, desvio padrão e mediana. As análises estatísticas foram realizadas utilizando
o teste não paramétrico de Mann-Whitney, devido ao tamanho amostral. Foi adotado
um nível de significância de 5% (p < 0,05).
Gene Primer Foward Primer Reverse HLA-G
HLA-G5
ACTB
TBP
HPRT1
GAA GAG GAG ACA CGG AAC ACC A
GTC CTT GCA GCT GTA GTC ACT G
TGA AGT GTG ACG TGG ACA TC
GTG ACC CAG CAT CAC TGT TTC
TGA CAC TGG CAA AAC AAT GC
TCG CAG CCA ATC ATC CAC TGG A
CGT GAG AGA CAC ATT AGA GCC CTG
GGA GGA GCA ATG ATC TTG AT
GCA AAC CAG AAA CCC TTG CG
GGT CCT TTT CAC CAG CAA GCT
38
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Resultados clínicos
A amostra de pacientes com SPR, cujas células foram analisadas quanto à
expressão de transcritos gênicos HLA-G e HLA-G5, foi composta por um grupo
heterogêneo de nove indivíduos, contendo sete mulheres, com média de idade de
29 anos (variando de 21 a 38 anos) e dois homens, com média de idade de 27 anos
(variando de 25 a 29 anos). Todos os casos foram esporádicos.
O grupo controle foi composto por nove indivíduos, que foram submetidos à cirurgia
plástica e/ou lipoaspiração e o tecido adiposo foi coletado para compor as amostras
controles de células do Biobanco do CEGH. Este grupo também foi heterogêneo,
contendo oito mulheres com média de idade de 44 anos (variando de 27 a 71 anos)
e um homem, com idade de 38 anos.
4.2 Resultados Moleculares
Os dados gerados pela RT qPCR para expressão de HLA-G e HLA-G5 em afetados
e controles estão ilustrados na tabela 4. A expressão relativa de transcritos do gene
HLA-G em afetados variou de 1,21 a 10,03, sendo a média de 4,65 (+- 3,26) e
mediana de 3,03. No grupo controle, a expressão relativa de HLA-G variou de 6,70 a
22,23, sendo a média de 14,48 (+- 4,64) e mediana de 14,64. A expressão relativa
de transcritos do gene HLA-G5 em afetados variou de 2,67 a 20,05, sendo a média
de 6,04 (+-5,41) e mediana de 4,36. E no grupo controle, a expressão relativa de
HLA-G5 variou de 1,98 a 28,41, sendo a média de 10,59 (+-9,01) e mediana de 9,22
(tabela 5).
39
Tabela 4 – Dados da expressão relativa de HLA-G e HLA-G5 em pacientes e controles.
ExpressãorelativadeHLA-G ExpressãorelativadeHLA-G5PacientesNº Pacientes Controles Pacientes Controles
1 3,025921803 15,21963264 2,66679499 11,276217412 1,856946475 14,6815598 5,388763729 28,412615953 8,401835225 20,20500197 2,956642287 9,2183276034 7,112855494 22,2258958 6,554274654 21,129895775 5,839396603 13,23637908 4,360489758 12,014837436 2,040867198 6,695364618 3,826434603 2,7180971937 10,02815868 12,59433403 20,05120063 3,7942810418 2,365979285 10,8284783 3,28344735 4,8043549419 1,210905184 14,63793723 5,3027427 1,982377192
Tabela 5 – Estatística descritiva da expressão relativa de HLA-G e HLA-G5 em pacientes e controles.
Mínimo Máximo Média Mediana Desvio padrão
Expressão relativa HLA-G Pacientes 1,21 10,03 4,65 3,03 3,26
Controles 6,70 22,23 14,48 14,64 4,64
Expressão relativa HLA-G5 Pacientes 2,67 20,05 6,04 4,36 5,41
Controles 1,98 28,41 10,59 9,22 9,01
Foi observado que o grupo de pacientes com SPR apresentou menor expressão
relativa de HLA-G quando comparado ao grupo controle (p = 0,000) (figura 10). Para
a expressão de HLA-G5, apesar da mediana ter sido menor no grupo afetado, não
houve diferença significativa (p = 0,387) (figura 11).
40
Figura 10 – Expressão relativa de HLA-G no grupo afetado e no grupo controle (p = 0,000).
41
Figura 11 – Expressão relativa de HLA-G5 no grupo afetado e no grupo controle (p = 0,387).
42
4.3 Discussão
Com o intuito de verificar se o HLA-G, assim como demonstrado por Wastowski et
al. (2009) na SSc, é também associado à SPR, nós estudamos células tronco
obtidas de tecido adiposo de pacientes e controles e verificamos que a expressão de
HLA-G, mas não de HLA-G5, foi menor no grupo de pacientes, quando comparado
ao grupo controle. Este é o primeiro trabalho que mostra associação dessa molécula
com a SPR.
Em nosso estudo o gênero mais afetado foi o feminino, assim como observado por
diversos autores, que reportaram a proporção de 3:1 a 3:2 (SUSSER e CHAPMAN,
2003; MOKO, MISTRY e CHALAIN, 2003; TERENZI et al., 2005; CASTRO-GOVEA
et al., 2012; EL-KEHDY, ABBAS e RUBEIZ, 2012; CHOKAR, et al., 2014). A média
de idade dos nossos casos foi de 28 anos. Com frequência, a faixa etária mais
afetada situa-se entre a primeira e segunda década de vida, quando a atrofia se
inicia (ANDERSON et al., 2005; PEREIRA et al., 2007; EL-KEHDY, ABBAS e
RUBEIZ, 2012). Porém, a média de idade apresentada pelos nossos pacientes é a
do momento da intervenção terapêutica, e não a idade em que a atrofia começou,
uma vez que não foi possível o acesso ao quadro clínico e nível de progressão da
doença de cada indivíduo, fator limitante em nosso estudo. Muito provavelmente
esses pacientes começaram a apresentar alterações atróficas entre a primeira ou
segunda década de vida, já que segundo El-Kehdy, Abbas e Rubeiz (2012); Chokar,
et al. (2014), o tempo de progressão da doença varia de 2 a 20 anos.
Alguns autores acreditam que a SPR não pode ser considerada um tipo de
esclerodermia (OROZCO-COVARRUBIAS et al., 2002; KAYA, et al., 2014). No
entanto, evidências mais recentes sugerem, com base em achados clínicos e
histopatológicos, que as duas condições são sobrepostas (LAPRESLE e DESI,
1982; AUVINET et al., 1989; LEHMAN, 1992; STONE, 2003; ANDERSON et al.,
2005; EL-KEHDY, ABBAS e RUBEIZ, 2012; CHOKAR et al., 2014).
Em um estudo de 13 casos de LSCS e 9 casos de SPR, os indivíduos foram
avaliados retrospectivamente por meio de fotos e lâminas histopatológicas. Os
autores demonstraram que as principais diferenças clínicas entre as duas condições
43
foram: esclerose cutânea (presente em 8/13 de LSCS e 0 em SPR);
hiperpigmentação e alopecia em LSCS, contra total envolvimento hemifacial e
alterações oculares em SPR. No entanto, no exame histopatológico houve uma
sobreposição significativa de fibrose do tecido conjuntivo, que foi observada em
todos os casos de LSCS e em 2/9 dos casos de SPR. Atrofia anexial foi observada
em 11/13 de LSCS e 3/9 de SPR, enquanto que os infiltrados de células
mononucleares estavam presentes em todas as biópsias de LSCS e 6/9 de SPR
(OROZCO-COVARRUBIAS et al., 2002). Outro estudo no qual 71 indivíduos com
LSCS e SPR foram acompanhados durante um período de 20 anos, demonstrou que
o padrão clínico morfológico da apresentação da doença mudou progressivamente
de tal forma que as diferenças claras entre as duas condições desapareceram com o
tempo (JABLONSKA e BLASZCZYK, 2005). Em um outro estudo que avaliou
indivíduos com LSCS e SPR, os autores concluíram que estas duas condições estão
associadas. Dos 28 pacientes com SPR, 71,4% apresentavam esclerose facial, e
53,6% apresentavam LSCS. Além disso, eles demonstraram que dos 41 pacientes
com LSCS, 36,6% também tinham SPR. Histologicamente, as amostras de biópsia
de pacientes com SPR que não apresentavam esclerose cutânea mostraram
resultados consistentes com morféia (TOLLEFSON e WITMAN, 2007). Vários
estudos anteriores apresentaram resultados semelhantes (ARCHAMBAULT e
FROMM, 1932; SOMMER et al., 2006). Em resumo, embora possa haver algumas
características que distinguem LSCS de SPR, achados clínicos e histopatológicos
podem muitas vezes se sobrepor em um mesmo paciente, assumindo dessa
maneira que LSCS e SPR se encontram no mesmo espectro da doença.
Na SSc, Wastowski et al., (2009) detectaram, por imunohistoquímica, pela primeira
vez, a presença de moléculas de HLA-G em biópsias de pele em 12 de 21 casos
(57%), enquanto que no grupo de 28 controles, nenhum indivíduo apresentou a
molécula. Dentre os casos, os pacientes que apresentaram moléculas de HLA-G nas
biópsias de pele foram associados a um melhor prognóstico da doença, comparados
com aqueles que não apresentaram HLA-G (9 em 21). Isso sugere um papel
modulador protetor de HLA-G na SSc, assim como observado em outras doenças
inflamatórias crônicas (ARACTINGI et al., 2001; KHOSROTEHRANI et al., 2001).
Até então, nenhum estudo havia sido feito demostrando a relação de HLA-G e HLA-
G5 com SPR.
44
O HLA-G é uma molécula não clássica do MHC de classe I, caracterizada
primeiramente pela sua expressão na interface materno-fetal. Desde sua descrição,
em citotrofoblastos, esta molécula tem atraído muita atenção devido às suas
propriedades de tolerância imunológica. Estas propriedades fizeram do HLA-G um
alvo atrativo em diferentes situações em que a tolerância imunológica está
envolvida, como a gravidez e suas complicações, transplante, câncer, infecções
virais, bem como em doenças inflamatórias e autoimunes (KHOSROTEHRANI et al.,
2001; ARACTINGI et al., 2001; WIENDL et al., 2005; REBMANN et al., 2007; VEIT e
CHIES, 2009). Em condições fisiológicas, HLA-G é expresso em tecidos específicos
e níveis alterados são relatados em algumas doenças, devido ao seu envolvimento
na regulação do sistema imunológico durante a autoimunidade (RIZZO et al., 2014).
Segundo Rizzo et al. (2014); Tolkachjov, Patel e Tollefson (2015), é interessante
notar que as doenças cutâneas inflamatórias apresentam uma baixa expressão de
moléculas de HLA-G com relação aos controles e isto poderia gerar autoimunidade.
Um dos pontos cruciais para o desenvolvimento da tolerância imunológica é a
capacidade do sistema imune elaborar estratégias para neutralizar as células T auto
reativas. Nesse contexto, HLA-G tem sido apontado como a molécula que pode
prevenir as etapas das reações imunológicas. Assim, parece que HLA-G em baixa
ou alta expressão, pode não só atuar como uma molécula imunossupressora e
benéfica, mas pode também sustentar uma estimulação imunológica desequilibrada
e autoimunidade.
Embora os mecanismos que regulam a produção de HLA-G não sejam bem
elucidados, vários fatores relacionados com a função imunológica têm sido
implicados, incluindo as citocinas, especialmente a IL-10 (Interleucina 10), condições
de estresse, como hipóxia ou choque térmico, e medicamentos, como as drogas
imunossupressivas, principalmente os glicocorticóides (WASTOWSKI et al., 2009).
A IL-10 induz a expressão de HLA-G na superfície de monócitos e, por sua vez, o
HLA-G solúvel parece estimular a expressão de IL-10 em células mononucleares de
sangue periférico. É possível que a IL-10 e o HLA-G atuem em conjunto na
imunossupressão de processos inflamatórios in vivo e sejam fatores importantes na
suscetibilidade e no curso de doenças inflamatórias, como no caso da SPR e nas
esclerodermias (BRENOL et al., 2012). É importante ressaltar que provavelmente,
ao longo da progressão da doença, os pacientes estudados tenham feito uso de
45
glicocorticóides.
Por causa de sua função imunossupressora, a atuação do HLA-G tem sido
investigada em vários contextos (LUQUE et al., 2006), inclusive na rejeição pós
transplante, sendo que quanto maior a expressão de HLA-G, menor é a rejeição à
transplantes cardíacos (LILA et al., 2007) e renais (CRISPIM et al., 2008).
As infecções por Borrelia burgdorferi (SOMMER et al., 2006) e alguns vírus tem sido
associadas à SPR. Sabe-se que nas infecções virais, a indução da expressão de
HLA-G por células infectadas foi proposta como mecanismo que ajuda o vírus a
escapar das defesas do hospedeiro (TRIPATHI e AGRAWAL, 2007). O HLA-G
parece estar implicado no escape viral imunológico a partir de células NK. As
proteínas de HLA-G são expressas por células infectadas por vírus como um
mecanismo para evitar o controle do sistema imune do hospedeiro, impedindo a
ativação das células T e células NK. O principal desafio seria bloquear a produção
de HLA-G na infecção viral, de modo a permitir o reconhecimento por células do
sistema imunológico (RIZZO et al., 2014). Na literatura não há descrição de nenhum
vírus específico relacionado à SPR, mesmo sendo citado como possível fator
etiológico da doença.
Em nosso estudo verificamos a expressão de transcritos dos genes HLA-G e HLA-
G5 em MSCs provenientes de tecido adiposo dos pacientes operados no HC-
FMUSP, uma vez que durante cirurgia reparadora, parte da amostra de gordura é
utilizada para o enxerto e outra parte descartada. Tecido adiposo tem sido utilizado
nas últimas décadas como um enxerto autólogo em diversas circunstâncias, como
reconstrução do tecido danificado devido a queimaduras, reconstrução craniofacial
devido a defeitos congênitos ou traumas, câncer e outros tumores, bem como por
razões estéticas. Embora esta abordagem seja considerada bem-sucedida, a
necessidade de várias intervenções cirúrgicas para alcançar o resultado pretendido
não é aconselhável. Atualmente uma das expectativas é melhorar a sobrevida do
tecido adiposo pela combinação de transplante de gordura e terapia com MSCs
(AGUENA et al., 2012).
As MSCs são encontradas em uma variedade de tecidos, incluindo medula óssea,
46
pele e tecido adiposo. Podem ser facilmente isoladas a partir da fração do estroma
vascular do tecido adiposo por procedimento cirúrgico simples, repetidamente, em
grandes quantidades e, em alguns casos, sob anestesia local, e além disso, podem
ser facilmente expandidas in vitro. MSCs apresentam propriedades regenerativas,
primeiramente pela sua capacidade de diferenciação em múltiplas linhagens e
potente capacidade imunomoduladora. Elas inibem a proliferação de células T e
inibem a maturação de células dendríticas. Estas propriedades fazem das MSCs
promissoras para uma diversidade de aplicações clínicas, como por exemplo, para a
prevenção e tratamento de doenças autoimunes e rejeição de transplantes de
medula óssea. O efeito imunossupressor das MSCs tem sido atribuído a diferentes
fatores imunossupressores, que incluem indoleamina 2,3-dioxigenase, óxido nítrico,
interleucinas e HLA-G. Estas características fornecem informações importantes
sobre a função imunossupressora das MSCs para uma melhor aplicação no
tratamento de distúrbios do sistema imunológico (LISIANYI, 2013).
O impacto esperado com a terapia com tecido adiposo, particularmente com o uso
de Células Tronco derivadas de Tecido Adiposo (ASCs, do inglês adipose tissue
derived stem cells), é que as células tronco possam potencialmente melhorar a
neovascularização, inativar parcialmente a resposta inflamatória e imunológica,
devido à sua capacidade imunossupressora (AGUENA et al., 2012).
Observamos que a expressão de HLA-G5, embora tenha sido menor no grupo
afetado, não teve diferença significativa quando comparada ao grupo controle.
Segundo LeMaoult, Rouas-Freiss e Carosella (2005), quando a expressão de HLA-
G1 foi comparada à expressão de HLA-G5 nas células do trofoblasto em seu estudo,
do ponto de vista diagnóstico, observou-se que não há distinção entre as duas
isoformas, uma vez que possuem propriedades inibidoras semelhantes, mas o que
de fato importa para distinguir uma situação normal de uma patológica é a presença
ou ausência de formas solúveis ou secretadas de HLA-G, o que corrobora com
nossos resultados. A ausência de associação com HLA-G5, uma isoforma solúvel,
pode indicar que as alterações inflamatórias e imunológicas da SPR se expressam
de forma restrita.
47
A tolerância induzida pelas proteínas derivadas do HLA-G é a função melhor
documentada desse gene em células do sistema imune. Nessa função, são incluídos
efeitos como diminuição da atividade citotóxica, migração, viabilidade celular,
proliferação e produção de Interferon gamma (IFNγ), células NK; regulação da
produção de citocinas por células mononucleares e linfócitos T citotóxicos (CTL);
supressão da citotoxicidade e viabilidade dos CTLs; inibição da proliferação e
indução de fenótipo supressivo em linfócitos T auxiliares (TH); alteração da
maturação e da capacidade estimulatória de células dendríticas (HUNT, 2006; LE
BOUTEILLER, TABIASCO e PARINAUD, 2007; PISTOIA et al., 2007; CAROSELLA
et al., 2008; BARICORDI et al., 2008).
De uma forma geral, sabe-se que HLA-G inibe fortemente a atuação das células T e
células NK por seu papel imunossupressor, sendo assim, baixos níveis de HLA-G
sugerem que as funções dessas células não estão sendo bloqueadas, levando ao
ataque e desenvolvimento de condições patológicas relacionadas à doenças
inflamatórias e autoimunes (FAVOINO et al., 2015), provavelmente assim como
acontece na SPR.
O gene HLA-G é caracterizado por poucos polimorfismos, dentre os quais um tem
sido relatado com mais frequência e importância: uma deleção ou inserção (del-/del+)
de uma sequência de 14 pares de base (pb) no exon 8 na região 3’ não traduzida (3’
UTR, do inglês untranslated region), o qual regula a transcrição e estabilidade do
RNAm do HLA-G (FAVOINO et al., 2015). Segundo Hviid et al. (2003), alelos que
possuem a inserção de 14pb vêm sendo associados com uma menor produção de
RNAm para a maioria das isoformas ligadas à membrana e solúveis. Vários estudos
demonstram evidências na relação deste polimorfismo com algumas doenças
imunomediadas.
Os níveis de HLA-G ou o polimorfismo del-/del+ foram avaliados em relação a
atividade clínica de: (1) Artrite Reumatóide, onde alguns autores (VERBRUGGEN et
al., 2006; RIZZO et al., 2013) encontraram níveis significativamente mais baixos de
HLA-G em pacientes quando comparados a indivíduos saudáveis, o que pode
indicar um estado de supressão imunológica diminuída, permitindo o
desenvolvimento de processos autoimunes que levam à AR; (2) Lúpus Eritomatoso
Sistêmico, cujo estudo de Rosado et al. (2007), demonstrou que pacientes com SLE
48
apresentaram baixa expressão de HLA-G, porém um pouco maior do que um grupo
saudável de indivíduos, podendo explicar a amplificação da atividade imune e
manutenção de lesões cutâneas nesses pacientes; (3) Espondilite Anquilosante (AS,
do inglês Ankylosing Spondylitis), que é um tipo de inflamação que afeta os tecidos
conjuntivos, de causa desconhecida, caracterizando-se pela inflamação das
articulações. Zhang et al. (2013), encontraram baixas concentrações de HLA-G no
plasma de pacientes com a doença, comparando com indivíduos saudáveis. A
diferença significativa na expressão de HLA-G em AS sugere que esta molécula está
envolvida na origem da doença; e em algumas doenças autoinflamatórias, como (4)
Doença de Behçet (BD, do inglês Behçet’s disease), caracterizada como uma
doença inflamatória crônica, de causa desconhecida, que produz, de forma
recorrente, feridas dolorosas na boca, bolhas na pele, úlceras genitais e inflamação
das articulações, podendo também inflamar os olhos, vasos sanguíneos, sistema
nervoso e trato gastrointestinal. O estudo de Park et al. (2007), verificou que o
polimorfismo del-/del+ aumenta o risco de BD e pode resultar em um desequilíbrio de
funções linfocitárias, que podem culminar com o desenvolvimento de BD; e (5)
Doença de Kawasaki (KD, do inglês Kawasaki disease), que trata-se de uma
vasculite aguda e multissistêmica que compromete vasos de médio calibre
(CASTRO, COSTA e URBANO, 2009). Kim et al. (2008), verificaram um
Polimorfismo de Nucleotídeo Único (SNP, do inglês single nucleotide polymorphism)
(C/A) no gene HLA-G associado com KD. Os resultados indicam que HLA-G pode
desempenhar um papel crucial na susceptibilidade à KD.
Uma análise interessante seria testar a expressão de HLA-G no próprio tecido
afetado de pacientes com SPR, além da genotipagem para verificar se os
polimorfismos citados acima estão presentes na nossa casuística e se podem estar
associados à baixa expressão de HLA-G, e consequentemente, o desenvolvimento
da SPR. Experimentos em andamento estão sendo desenvolvidos para avaliar a
expressão de HLA-G no sangue de pacientes com SPR.
Nenhum estudo anterior demonstra a relação da expressão de HLA-G e HLA-G5
com a SPR, bem como sua expressão em ASCs, se fazendo este um estudo
original. Uma limitação do presente trabalho foi o tamanho reduzido da casuística,
uma vez que se trata de uma síndrome rara. Portanto se faz necessário mais
pesquisa com maior caráter exploratório, prospectiva, conduzida em um número
49
maior de pacientes, para uma melhor compreensão dessa relação, podendo dessa
forma, se tornar um marcador da progressão da doença, bem como as ASCs se
tornarem modelo de estudo e estratégia terapêutica para a SPR.
50
5 CONCLUSÕES
O presente estudo foi o primeiro a avaliar a contribuição dos genes HLA-G e HLA-
G5 em pacientes com SPR. A baixa expressão de HLA-G verificada em pacientes
pode estar relacionada ao mecanismo de menor tolerância imunológica e portanto,
maior agressão tecidual na SPR, ao contrário da expressão de HLA-G5, que não foi
diferente entre pacientes e controles.
Embora mais estudos sejam necessários para compreender os mecanismos
associados com a função e regulação de HLA-G na etiologia da SPR, os resultados
obtidos abrem perspectivas promissoras para o diagnóstico precoce e para
proposição de modelos terapêuticos visando o aumento da expressão de HLA-G
nesses pacientes tão logo iniciem os primeiros sinais da doença.
51
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ANEXO I
Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa do IB/USP 44667315.3.0000.5464