laboratório de ensaios tecnológicos em Áreas...

ESTBarreiro IST/C2TN CETTL

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Relatório de estágio Laboratório de Ensaios Tecnológicos em Áreas Limpas

Instituto Politécnico de Setúbal - ESTBarreiro

Curso Especialização Tecnológica de Técnicas de Laboratório

Orientadoras: Doutora Sandra Cabo Verde Mestre Joana Madureira Mestre Cilene Vicente

Estagiário: João Pedro Vilar Ribeiro nº2010

7 de Abril de 2015 a 15 de Julho de 2015


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Índice Índice ..................................................................................................................................................................................... 2

Índice de figuras ............................................................................................................................................................... 3

Índice de tabelas ............................................................................................................................................................... 5

Índice de gráficos ............................................................................................................................................................. 5

Agradecimentos ................................................................................................................................................................ 6

Resumo ................................................................................................................................................................................. 7

Introdução ........................................................................................................................................................................... 8

Objetivos do estágio ....................................................................................................................................................... 9

Caracterização da empresa ........................................................................................................................................10

Cronograma do estágio ...............................................................................................................................................17

Tipificação das atividades desenvolvidas .............................................................................................................17

Sala de lavagem e descontaminação de material ........................................................................................17

Descontaminação do material ........................................................................................................................17

Lavagem de material ..........................................................................................................................................18

Laboratório de Química e preparação de meios ..........................................................................................18

Esterilização de material embalado, de vidro e pontas de micropipetas Calor húmido ........18

Esterilização de placas de Petri de vidro, colunas de filtração de águas e tubos de ensaio (Calor seco) .............................................................................................................................................................19

Preparação de soluções Químicas.................................................................................................................20

Preparação de soro fisiológico e água peptonada .................................................................................20

Preparação de placas com meio de cultura para prestação de serviços .......................................21

Medição da Carência Química de Oxigênio (CQO) em águas ...........................................................21

Determinação dos Sólidos Suspensos Totais em águas ......................................................................23

Leitura de dosímetros de rotina no espectrofotómetro (UV-1800 SHIMADZU UV SPECTROPHOTOMETER) ....................................................................................................................................23

Outros trabalhos desenvolvidos ....................................................................................................................24

Laboratório de Biologia Molecular .....................................................................................................................24

Leitura de absorvâncias no aparelho ELISA ...............................................................................................24

Laboratório de Microbiologia ..............................................................................................................................25

Preparação de stocks de culturas microbiológicas de referência ....................................................25

Descrição detalhada do trabalho desenvolvido ................................................................................................27

Toxicidade de compostos fenólicos ..................................................................................................................27

Introdução ...............................................................................................................................................................27

Protocolo Experimental .....................................................................................................................................30

Resultados/Tratamento de resultados ........................................................................................................36

Discussão de Resultados/Conclusões ..........................................................................................................39


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Conclusão ..........................................................................................................................................................................40

Bibliografia/Web grafia ................................................................................................................................................42

Anexos ................................................................................................................................................................................43

Meio TSA .......................................................................................................................................................................43

Procedimento ........................................................................................................................................................43

Meio TSB .......................................................................................................................................................................43

Procedimento ........................................................................................................................................................43

Meio MEA......................................................................................................................................................................44

Procedimento ........................................................................................................................................................44

Soro fisiológico 0.9% ...............................................................................................................................................44

Procedimento ........................................................................................................................................................44

Soro fisiológico 0.9% com 0.1% de Tween 80 ...............................................................................................44

Procedimento ........................................................................................................................................................44

Água peptonada ........................................................................................................................................................45

Procedimento ........................................................................................................................................................45

Mistura de compostos fenólicos 4, 2, 1 e 0.5mM .........................................................................................45

Procedimento ........................................................................................................................................................45

Solução de ácido sulfúrico 4 mol/L ...................................................................................................................46

Procedimento ........................................................................................................................................................46

Solução de ácido sulfúrico-sulfato de prata ..................................................................................................46

Procedimento ........................................................................................................................................................46

Solução padrão de dicromato de potássio [K2Cr2O7] = 0,040mol/L, contendo um sal de mercúrio (HgSO4) ......................................................................................................................................................46

Procedimento ........................................................................................................................................................46

Solução titulante de sulfato de amónio ferroso [(NH4)2Fe(SO4)2 2H2O] 0.12 mol/L; ...................47

Procedimento ........................................................................................................................................................47

Soluções padrão de hidrogenoftalato de potássio .....................................................................................47

Procedimento ........................................................................................................................................................47

Índice de figuras

Figura 1 - Instituto Superior Técnico (IST) ............................................................................................................10 Figura 2 - Planta do Campus Tecnológico e Nuclear ......................................................................................12 Figura 3 - Planta do LETAL .........................................................................................................................................16 Figura 4 - Descontaminação do material por autoclavagem. ......................................................................18


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Figura 5 - Lavagem de material ................................................................................................................................18 Figura 6 - Material esterilizado por calor húmido (autoclave Steri 21) ....................................................19 Figura 7 - Material esterilizado por calor seco (1).............................................................................................19 Figura 8 - Material esterilizado por calor seco (2).............................................................................................20 Figura 9 – Exemplos de soluções preparadas .....................................................................................................20 Figura 10 - Soluções químicas necessárias para a CQO .................................................................................21 Figura 11 - Amostras após 3h no Termoreactor e amostras antes (verde) e após titulação (vermelho/acastanhado) com solução de sulfato de amónio ferroso 0.12 mol/L ...............................22 Figura 12 - Placas de vidro com papel de filtro após filtração a vácuo ...................................................23 Figura 13 - Material necessário para a leitura de dosímetros no espectrofotómetro ........................24 Figura 14 – Exemplo dos enchimentos dos poços na microplaca..............................................................25 Figura 15 - Material microbiológico de referência e stocks realizados das mesmas..........................26 Figura 16 – Exemplo da estrutura química de um flavonóide .....................................................................28 Figura 17 – Exemplo da estrutura química de um ácido fenólico ..............................................................28 Figura 18 – Exemplo da estrutura química de um tanino ..............................................................................28 Figura 19 – Exemplo da estrutura química de um tocoferól ........................................................................28 Figura 20 – Estruturas químicas dos compostos fenólicos em estudo: A - Ácido Gálico; B - Ácido Protocatecuico; C - Ácido Siríngico; D - Ácido Vanílico .................................................................................29 Figura 21 - Câmara de irradiação da unidade experimental de 60Co, Precisa 22 .................................30 Figura 22 - Procedimento efetuado para a preparação da cultura saturada de P. flurescens. .......32 Figura 23 - Procedimento efetuado para se obter uma cultura com OD600 = 0.2 ...............................33 Figura 24 - Câmara de Neubauer ............................................................................................................................33 Figura 25 - P. fluorescences .......................................................................................................................................34 Figura 26 - Esquema das diluições da cultura com OD600 = 0.2 .................................................................34 Figura 27 - Culturas preparadas. ..............................................................................................................................35 Figura 28 - Tubos de 1.5 mL com soro para as diluições das 0h (1) e das 24h (2) ..............................36 Figura 29 - Exemplo do espalhamento em placa de TSA ..............................................................................36 Figura 30 - Placas de TSA preparadas....................................................................................................................43 Figura 31 - Soluções de compostos fenólicos preparadas e filtradas ......................................................45


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Índice de tabelas

Tabela 1 - Indicações para elaboração das soluções (Toxicidade) .............................................................34 Tabela 2- Valores de dosimetria para os dosímetros Amber X ...................................................................37 Tabela 3 - Contagens de bactérias nos dois quadrantes da câmara de Neubauer .............................37 Tabela 4 - Diluições necessárias para diluição obter a concentração desejada de 102 UFC. ..........37 Tabela 5 - Carga microbiana (UFC/mL) determinada para as culturas de Pseudomonas fluorescens com várias concentrações de soluções de compostos fenólicos irradiadas e não irradiadas (*c - contaminação). ................................................................................................................................................................38 Tabela 6 - Massas necessárias para a preparação das várias soluções de compostos fenólicos ...45 Tabela 7 - Massas necessárias para preparar as soluções padrão de hidrogenoftalato de potássio ...............................................................................................................................................................................................47

Índice de gráficos

Gráfico 1 - Carga microbiana das culturas de Pseudomonas fluorescens com soluções de compostos fenólicos a várias concentrações irradiadas e não irradiadas ..............................................38 Gráfico 2 - Densidades óticas das culturas de Pseudomonas fluorescens com soluções de compostos fenólicos a várias concentrações as amostras irradiadas e não irradiadas. ....................39


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Agradecimentos

“ O conhecimento faz-nos responsáveis”. O espaço limitado de agradecimentos não me permite verdadeiramente agradecer, como devia, a todas as pessoas que ao longo do meu estágio curricular/profissional me ajudaram, direta ou indiretamente, a cumprir os meus objetivos e a realizar mais esta etapa da minha formação académica. Desta forma, deixo apenas algumas palavras mas um sentido e profundo sentimento de reconhecido agradecimento. Em primeiro lugar, à minha Orientadora Mestre Cilene Vicente, docente da Escola Superior de Tecnologia do Barreiro, pela ajuda que me solicitou em contactar a empresa empregadora para a realização deste estágio e também por toda a ajuda prestada. Também muito importante, ao Instituto Superior Técnico e, em especial, à Doutora Fernanda Margaça e à Doutora Fátima Araújo do Centro de Ciências e Tecnologias Nucleares (C2TN) por me terem recebido no grupo e terem permitido a realização deste estágio num centro de investigação de tão elevada qualidade e exigência. A uma das minhas Orientadores do C2TN, Doutora Sandra Cabo Verde, por me ter proporcionado as condições necessárias para a realização deste trabalho. Agradeço também a sua simpatia, disponibilidade, ajuda e conhecimento transmitido. À mais importante, a melhor Orientadora do C2TN, Mestre Joana Madureira, sem tirar o lugar que excelentes pessoas ocuparam ao longo destes meses, tenho que prestar o maior agradecimento por todas as ofertas que me deu, ajudas, compreensão, carinho, conhecimento e por esta enorme experiência e oportunidade em fazer parte do seu projeto de investigação. Obrigado por teres estado ao meu lado e pela amizade que criámos, sem a tua enorme pessoa isto não tinha sido possível. À fofuxa, Mestre Andreia Pimenta, uma carinhosa colega de trabalho, tenho que dar também um especial obrigado pela paciência prestada nos primeiros dias de acolhimento e pela sua ajuda. Obrigado por todas as palavras e conhecimentos recebidos da tua parte, foste uma pessoa muito importante durante este percurso. À estudante Inês Santos, tenho também que agradecer com muito carinho toda a sua ajuda na realização de alguns trabalhos. Obrigado por todas as companhias, partilhas, amizade, alegria e boa disposição constante. Também à Helena Marcos e à Rita Melo, tenho que deixar um especial agradecimento por todas as ajudas e conhecimentos transmitidos. Uma equipa de trabalho espetacular, sem a qual nada seria possível. Às duas melhores pessoas do mundo, aos meus dois babes mais lindos do mundo, Inês Pires e André Figueiras, tenho que agradecer imenso. De uma maneira ou outra, estando longe ou perto, sempre me apoiaram e ouviram os meus desabafos ao longo deste período. Finalmente, à mais importante e a quem devo tudo, à minha mãe, um agradecimento enorme por tudo o que fez por mim, pelo constante apoio, zangas para me levantar da cama, carinho, força e incentivo que foram fundamentais na motivação, realização e conclusão deste estágio.


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Resumo

No âmbito do Curso de Especialização Tecnológica em Técnicas de Laboratório, foi realizado um estágio curricular no Laboratório de Ensaios Tecnológicos e Áreas Limpas (LETAL), do Centro de Ciências e Tecnologias Nucleares (Instituto Superior Técnico), com duração de 600 horas.

Com início a 7 de Abril de 2015 e fim a 15 de Julho de 2015, foram cumpridos todos os objectivos do estágio, acrescendo o apoio técnico a um projeto de trabalho de duas estudantes de Erasmus e a necessidade de voltar ao local do estágio após a terminação deste para a continuação dos ensaios de toxicidade de compostos fenólicos, de modo a validar os resultados obtidos.


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Introdução O presente estágio curricular realizou-se no âmbito do Curso de

Especialização Tecnológica em Técnicas de Laboratório da Escola Superior de Tecnologia do Barreiro. Esta instituição de ensino superior público está integrada no Instituto Politécnico de Setúbal e pretende formar técnicos capazes de responder às reais necessidades do país, conscientes da sua responsabilidade ética e deontológica e cientes da importância da reciclagem dos seus saberes. O Curso de Especialização Tecnológica em Técnicas de Laboratório destina-se a preparar um técnico especialista que, de forma autónoma ou integrada numa equipa, garanta a execução de análises químicas, biológicas e bioquímicas em laboratórios independentes ou integrados em empresas públicas ou privadas.

O estágio decorreu no Laboratório de Ensaios Tecnológicos em Áreas

Limpas (LETAL) do Centro de Ciências e Tecnologias Nucleares (C2TN). O LETAL é um laboratório multidisciplinar que dispõe de áreas controladas para análises microbiológicas e químicas de forma a avaliar os efeitos da radiação ionizante em produtos, integrado numa unidade de investigação do Instituto Superior Técnico.

Para o cumprimento deste trabalho, para além das regras de tratamento

de material de laboratório (descontaminação, lavagem, embalagem e esterilização) foi feita a introdução à preparação de meios de cultura, autoclavagem, espalhamento em placas de Petri e o seu respetivo armazenamento e controlo. Além disso, foi também realizada a manutenção de equipamento e controlo das folhas de registo dos equipamentos e reagentes, a verificação de stocks de material e reagentes e atualização das respetivas bases de dados. Foi ainda concedido o apoio à prestação de serviços, nomeadamente na avaliação dos parâmetros microbiológicos da qualidade do ar interior e validação da dose mínima de esterilização através da preparação do material e contagem das unidades formadoras de colónias, como também o apoio no sistema de gestão de qualidade do laboratório.

O trabalho realizado teve como principal objectivo avaliar a toxidade de

amostras de compostos fenólicos, antes e após irradiação com radiação gama (proveniente de uma fonte de cobalto-60). A toxicidade define-se como sendo o efeito tóxico causado por poluentes naturais ou sintéticos nos ecossistemas animal/humano, vegetal e microbiano. Os compostos fenólicos são substâncias que possuem anel aromático, com um ou mais substituintes hidroxilo, incluindo os seus grupos funcionais. A sua presença em águas residuais de indústrias, nomeadamente da indústria corticeira, está já comprovada em trabalhos


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realizados anteriormente [1][2][3]. Estes compostos, para além do seu potencial como antioxidantes, podem possuir uma toxicidade considerável. Por isso, torna-se importante e necessário estudar o efeito da radiação gama na toxicidade destes compostos, no sentido de avaliar os potenciais benefícios da radiação gama no tratamento de efluentes.

Objetivos do estágio

O principal objectivo do trabalho é avaliar a toxicidade de compostos fenólicos presentes em águas residuais de indústrias, antes e após irradiação com radiação gama.

No sentido de se preparar um especialista que garanta a execução de análises químicas, biológicas e bioquímicas em laboratórios, foi necessário a concretização de várias etapas secundárias, nomeadamente:

Elaboração de meios de cultura, sua autoclavagem, espalhamento em

placas de Petri, armazenamento e controlo de qualidade; Tratamento de material de laboratório (descontaminação e/ou

destruição, lavagem, embalagem e esterilização); Verificação de stocks de material e reagentes e atualização das

respetivas bases de dados; Apoio à prestação de serviços, especificamente na avaliação dos

parâmetros microbiológicos da qualidade do ar interior e validação da dose mínima de esterilização através da preparação do material e contagem das unidades formadoras de colónias;

Apoio no sistema de gestão de qualidade do laboratório.


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Caracterização da empresa

A fundação do Instituto Superior Técnico (IST) deu-se em 1911, fruto da divisão do Instituto Industrial e Comercial de Lisboa, com o diretor Engenheiro Alfredo Bensaúde, até 1922. Com o Engenheiro Duarte Pacheco, diretor do IST, deu-se início à construção do atual Campus Universitário da Alameda (Lisboa) [4].

Figura 1 - Instituto Superior Técnico (IST)

O Instituto tem como missão contribuir para o desenvolvimento da sociedade, promovendo um ensino superior de qualidade nas áreas da Engenharia, Arquitetura, Ciências e Tecnologia, com vertentes na graduação, pós-graduação e formação ao longo da vida, e potenciando as atividades de investigação, desenvolvimento e inovação [4]. A investigação no IST é feita por unidades:

Tecnologias de Informação e Comunicação; Ciências Básicas; Materiais, Microtecnologia e Nanociência; Engenharia e Tecnologia e Produção; Gestão de Tecnologia e Empreendedorismo; Energia, Ambiente e Mobilidade; Ciências da Vida Aplicadas.


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E em institutos:

Estas unidades e institutos estão enquadrados em grandes áreas de competência associados a desafios com um forte impacto na sociedade. As áreas são fortemente interdisciplinares e transversais a vários domínios da engenharia, ciência, tecnologia e arquitetura. As atividades de ID&I cobrem aspetos fundamentais, como também projetos aplicados com forte envolvimento da indústria [4].

A estrutura IST/Campus Tecnológico e Nuclear (IST/CTN), uma estrutura de ensino, investigação e prestação de serviços, mantém a mesma missão e atribuições que o extinto ITN, I.P., isto é, efetuar e promover a investigação científica e o desenvolvimento tecnológico, especialmente no domínio das ciências e técnicas nucleares, da proteção e segurança radiológica, bem como desenvolver ações de formação graduada e pós-graduada [5].

Campus Taguspark (Oeiras)

Campus Alameda (Lisboa)

Campus Tecnológico e Nuclear (Loures)

ESTBarreiro IST/ITN CETTL

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Figura 2 - Planta do Campus Tecnológico e Nuclear

ESTBarreiro IST/ITN CETTL

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Legenda: 1. Departamento de Apoio Geral

(DAG); 2. Biblioteca/Auditório; 3. Unidade de Ciências Químicas

e Radiofarmacêuticas (Bloco 1) (UCQR);

4. Unidade de Ciências Químicas e Radiofarmacêuticas (Bloco 2) (UCQR);

5. Unidade de Física e Aceleradores (UFA);

6. Unidade de reactores e segurança nuclear (URSN);

7. Refeitório; 8. Unidade de protecção e

segurança Radiológica (UPSR);

9. UPSR: Laboratório de Metrologia;

10. UPSR: Armazém; 11. UPSR: Armazém de produtos

radioactivos; 12. Unidade de Tecnologias de

Radiação (UTR) e Instalação de Radiação IonizanteS (IRIS);

13. Laboratório de Ensaios Tecnológicos em Áreas Limpas (LETAL);

14. Instalações da GNR; 15. Viaturas de serviço; 16. Oficinas: Anexos; 17. UCQR: Laboratórios; 18. Sub-estação; 19. Oficinas; 20. Depósito de água; 21. UCQR: Anexos; 22. UCQR: Instalação piloto; 23. Portaria.

O CTN, com infraestruturas únicas e capacidades experimentais extensas,

continua a atrair cientistas, engenheiros e grupos de investigação de todos os pontos do país e do estrangeiro, estabelecendo colaborações proveitosas para o aperfeiçoamento das várias áreas de especialização [5].

No CTN, atualmente existem duas unidades de investigação:

Centro de Ciências e Tecnologias Nucleares (C2TN); Instituto de Plasmas e Fusão Nuclear (IPFN).

O C2TN é uma estrutura transversal, com experiência comprovada em

Física Nuclear e Engenharia, Proteção Radiológica e Segurança Nuclear, Ciências Radiofarmacêuticas, Química e Radioquímica, Ciências dos Materiais, Técnicas Nucleares, Meio Ambiente e Patrimônio Cultural [6].


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A Unidade tem acesso a equipamento especializado e infraestruturas únicas no país, tais como:

Reator Nuclear de investigação; Aceleradores Tandem, Van der Graaff e Linear; Unidade de Radiação Gama, laboratórios de síntese e caracterização de

materiais, incluindo a baixas temperaturas e altos campos magnéticos; Instalações para síntese, caracterização e avaliação pré-clínica, de

compostos radioativos para imagiologia molecular e terapia seletiva com radionuclídeos e salas limpas para ensaios tecnológicos.

Este centro está organizado em seis grupos multidisciplinares, que

contribuem com os seus conhecimentos específicos para as várias áreas temáticas do centro:

Ciências Radiofarmacêuticas (CR); Engenharia e Técnicas Nucleares (ETN); Estado Sólido (ES); Proteção e Segurança Radiológica (PSR); Química dos Elementos f (QEf); Radiação, Elementos e Isótopos (REI).

O REI é um grupo multidisciplinar constituído por doze investigadores

doutorados em Química, Física, Geologia, Oceanografia, Microbiologia e Ciências de Conservação. Este grupo reúne especialistas em técnicas analíticas nucleares usadas para determinações elementares e isotópicas, tecnologias de radiações ionizantes e datação para se tornar uma equipa forte e competente em Ambiente, Património Cultural e Ciências dos Materiais [6].

As atividades desenvolvidas neste grupo focam-se em diferentes

aspetos:

Avaliação ambiental da poluição; Evolução e mudanças climáticas paleoambientais costeiras; Qualidade, proteção e gestão da água; Tratamento de efluentes; Proveniência, tecnologias de fabrico e quadro cronológico de artefactos

culturais (metais, esmaltes, vidros); Processamento de materiais por radiação ionizante para uso biomédico,

aplicações industriais e preservação de artefactos de património cultural.


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Principais infraestruturas e equipamentos utilizados:

Laboratório de Espectrometria de Fluorescência de Raios X; Laboratório de Espectrometria de Massa de Isótopos Leves; Laboratório de Datação por Radiocarbono; Laboratório de Trítio; Laboratório de Espectrometria de Massa ICP (Inductively Coupled Plasma)

/ Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC/ICP-MS); Laboratório de Ensaios Tecnológicos em Áreas Limpas (LETAL); Instalação de Radiação IonizanteS (IRIS); Laboratório de Caracterização de Polímeros.

O LETAL é um laboratório multidisciplinar, que dispõe de áreas

controladas para análise microbiológica e química dos efeitos das radiações ionizantes em produtos [7].

Este inclui:

Laboratório de Química e de preparação de meios de cultura; Laboratórios de Microbiologia e Biologia Molecular; Laboratório de Virologia - sala de pressão negativa, dedicada a proteger

o operador e o ambiente; Sala limpa - Uma sala de pressão positiva, que protege o produto a ser

manipulado (Ensaios de Esterilidade).

As atividades de pesquisa e desenvolvimento neste laboratório concentram-se na aplicação de tecnologia das radiações na melhoria de novos produtos (e.g. biomateriais, produtos farmacêuticos) e no desenvolvimento de novos processos, nomeadamente tratamento de efluentes, preservação de objetos de arte e conservação de alimentos [7].

O laboratório tem como outras atividades principais:

Educação: Supervisão de graduações, mestrados, doutoramentos e bolsas

de investigação. Visitas científicas, seminários e palestras; Comunidade científica: Publicações, participações em workshops e

conferências; Indústrias: Prestação de serviços: 1) Validação da Dose de Esterilização de

produtos farmacêuticos e 2) Avaliação dos parâmetros microbiológicos da Qualidade do Ar Interior; material de divulgação (brochuras), organização de workshops e participação em eventos [7].


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Figura 3 - Planta do LETAL

Legenda:

1. Escritório; 2. Sala das máquinas; 3. Casa de banho; 4. Sala de lavagem e descontaminação de material; 5. Laboratório de Química e preparação de Meios; 6. Estufas; 7. Laboratório de Biologia Celular e Molecular; 8. Laboratório de Microbiologia; 9. Laboratório de Virologia; 10. Laboratório de Ensaios de Esterilidade.


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Cronograma do estágio

Neste estágio com duração de 15 semanas foram planeadas nove atividades gerais, de acordo com o seguinte cronograma:

Semanas

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1. Apresentação das instalações e equipamentos e regras de funcionamento

2. Introdução à elaboração de meios de cultura

3. Regras para tratamento de material de laboratório

4. Manutenção de equipamentos e folhas de registo

5. Verificação de stocks de material e reagentes e actualização das respectivas bases de dados

6. Apoio à prestação de serviços do LETAL

7. Apoio no Sistema de Gestão de Qualidade do Laboratório

8. Avaliação da toxicidade de compostos fenólicos

9. Redação do Relatório Final

Tipificação das atividades desenvolvidas

O Laboratório de Ensaios Tecnológicos em Áreas Limpas (LETAL) é composto por cinco salas de laboratório e por outras salas auxiliares onde se realizam tarefas diferentes, que irão ser descritas de seguida.

Sala de lavagem e descontaminação de material

Descontaminação do material

A descontaminação do material é feita por autoclavagem (temperatura 121ºC durante 60 minutos). Para isso, é necessário fechar a torneira do esgoto e encher o tanque com água destilada até à marca. Usualmente, as placas de petri são autoclavadas dentro de dois sacos fechados e as tampas dos frascos são aliviadas. Depois, são colocados os cestos dentro do autoclave com as placas e os frascos. Quando atinge a temperatura ambiente, retiram-se os sacos para o lixo e os frascos são colocados na máquina de lavar.


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Figura 4 - Descontaminação do material por autoclavagem.

Lavagem de material

Antes do material ser colocado na máquina de lavar, é passado por água da torneira e são retiradas todas as etiquetas e outras identificações feitas. Após a conclusão do ciclo de lavagem, o material é retirado da máquina e colocado na bancada específica para secar. Quando estiver seco, o material é arrumado nos lugares respectivos ou esterilizado.

Figura 5 - Lavagem de material

Laboratório de Química e preparação de meios

Esterilização de material embalado, de vidro e pontas de micropipetas Calor húmido

Antes da esterilização de material é efetuada num autoclave dedicado a esse fim (Autoclave Steri 21), é necessário realizar o aquecimento da máquina. Para esterilizar o material, embala-se o material em manga de esterilização. Para o material de vidro faz-se uma folga na tampa dos frascos. Para esterilizar as pontas das micropipetas, enchem-se os suportes. É colocado um indicador específico para calor húmido para indicar que o material já foi esterilizado por


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calor húmido. O material é esterilizado no programa de materiais sensíveis (tempo de esterilização 3.5 minutos a uma temperatura de 134ºC). Material esterilizado: Pinças, eppendorfs, espátulas, frascos shot, erlenmeyers, colunas de filtração de águas, cabeça de MAS e gobelés de plástico.

Figura 6 - Material esterilizado por calor húmido (autoclave Steri 21)

Esterilização de placas de Petri de vidro, colunas de filtração de águas e tubos de ensaio (Calor seco)

Para esterilizar os tubos de ensaio, é necessário aliviar as tampas dos mesmos. As placas de petri de vidro e as colunas de filtração são cobertas com papel de alumínio. É colocado um indicador específico para calor seco de forma a indicar que o material foi esterilizado por calor seco. O material é colocado na estufa a 180ºC durante 2h.

Figura 7 - Material esterilizado por calor seco (1)


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Figura 8 - Material esterilizado por calor seco (2)

Preparação de soluções Químicas 1. Pesar a massa de composto necessária num gobelé; 2. Adicionar um pouco de água ultra pura para dissolução; 3. Transferir para um balão volumétrico de volume pretendido; 4. Perfazer o balão com água ultra pura.

Soluções preparadas:

Mistura quaternária de ácido gálico, protocatecuico, vanílico e siríngico - 4, 2, 1 e 0.5 mM;

Solução de ácido tânico - 0.1 e 1 mM; Solução de ácido gálico a 1 mM Solução de ácido protocatecuico a 1 mM Solução de ácido vanílico a 1 mM Solução de ácido siríngico a 1 mM

Figura 9 – Exemplos de soluções preparadas

Preparação de soro fisiológico e água peptonada Protocolos em anexo.


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Preparação de placas com meio de cultura para prestação de serviços

Protocolos em anexo. Meios de cultura sólidos: Meio Tryptone Soya Agar (TSA) e Meio Malt Extract Agar (MEA). Meio de cultura líquido: Meio Tryptone Soya Broth (TSB).

Medição da Carência Química de Oxigênio (CQO) em águas 1. Prepare as soluções necessárias (protocolos em anexo):

Solução de ácido sulfúrico 4 mol/L; Solução de ácido sulfúrico-sulfato de prata; Solução padrão de dicromato de potássio [K2Cr2O7] = 0,040 mol/L,

contendo um sal de mercúrio (HgSO4); Solução titulante de sulfato de amónio ferroso [(NH4)2Fe(SO4)2

2H2O] 0.12 mol/L; Indicador ferroína; Soluções padrão de hidrogenoftalato de potássio, a várias

concentrações com CQO conhecido:

Figura 10 - Soluções químicas necessárias para a CQO

2. Confirmar o título da solução titulante de sulfato de amónio ferroso: Medir 10 mL de solução de dicromato de potássio para um

erlenmeyer; Diluir com 100 mL de solução de ácido sulfúrico; Titular com a solução de sulfato de amónio ferroso, na presença de

2 gotas de ferroína. 3. Confirmar o protocolo usando o Termoreactor:

Lavar os tubos com a solução de ácido sulfúrico;

CQO (mgO2/L) 50 100 200 350 500 650 750 850 1000


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Colocar cada solução padrão de hidrogenoftalato de potássio no tubo e adicionar solução de digestão e a solução de ácido sulfúrico-sulfato de prata, nos seguintes volumes:

Tapar os tubos e homogeneizar a solução; Colocar os tubos no Termoreactor (HI 839800 COD REACTOR

HANNA instruments) pré-aquecido a 150ºC e sob refluxo durante 3h, colocando a cobertura protectora.

Arejar e homogeneizar os tubos de 30 em 30 minutos; No fim das 3h, arrefecer os tubos à temperatura ambiente num

suporte adequado; Destapar os tubos e transferir a solução para copos de precipitação; Adicionar 2 gotas de ferroína a cada uma das amostras e titular com

a solução de sulfato de amónio ferroso.

4. Para a determinação do CQO nas amostras, fazer o mesmo protocolo que no ponto 3, utilizando as seguintes amostras:

FBS é um suplemento para meio de cultura de células proveniente do soro

bovino fetal (do inglês, fetal bovine serum), tendo um elevado conteúdo em matéria orgânica.

5. Para cada um dos procedimentos (confirmação do protocolo e análise das

amostras), fazer ensaio em branco e 3 réplicas para cada amostra.

Figura 11 - Amostras após 3h no Termoreactor e amostras antes (verde) e após titulação (vermelho/acastanhado)

com solução de sulfato de amónio ferroso 0.12 mol/L

Amostras Água da Torneira Água Residual Água Residual Estéril FBS

Amostra

1.25 mL

Solução de digestão

0.75 mL 1.75 mL

Solução H2SO4-Ag2SO4


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Determinação dos Sólidos Suspensos Totais em águas 1. Pesar os vidros de relógio com papel de filtro; 2. Secar na estufa durante meia hora a 105ºC; 3. Colocar num excicador durante 10 minutos e depois pesar novamente; 4. Repetir os passos 1 ao 3 até os pesos estarem constantes; 5. Colocar o papel de filtro no funil de Buckner e amolecer com um pouco

de água destilada; 6. Filtrar 100 mL de cada uma das amostras (repetindo sempre o passo

anterior após mudança de amostra):

7. Após filtração concluída, retirar o papel de filtro e colocar no vidro de

relógio correspondente; 8. Repetir os passos 1 ao 3 até os pesos estarem constantes com uma

diferença inferiores a 0.5 mg; 9. As análises foram feitas em duplicado.

Figura 12 - Placas de vidro com papel de filtro após filtração a vácuo

Leitura de dosímetros de rotina no espectrofotómetro (UV-1800 SHIMADZU UV SPECTROPHOTOMETER)

As leituras dos dosímetros de rotina são realizadas no espectrofotómetro Shimadzu UV1800, nos comprimentos de onda 603 nm e 651 nm (para os dosímetros Amber Lote X: doses entre 1-30 kGy) e 640 nm (para os dosímetros Red perspex lote MP: doses superiores a 30 kGy). A espessura dos dosímetros é medida por um medidor de espessuras.

Amostras Água da Torneira Água Residual Água Residual Estéril FBS


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Figura 13 - Material necessário para a leitura de dosímetros no espectrofotómetro

Outros trabalhos desenvolvidos Preparação de álcool a 70% para enchimento de frascos nas várias salas

de laboratório, para desinfeção de mãos, bancadas e câmaras de fluxo laminar;

Preenchimento de folhas de registo de utilização de água Milli-Q, pesagens na balança, uso do espectrofotómetro e de preparação de placas de meio sólido.

Laboratório de Biologia Molecular

Leitura de absorvâncias no aparelho ELISA 1. Ligar o aparelho (ligado ao computador) de Elisa (EZ Read 800 Microplate

Reader biochrom); 2. Abrir o programa (Galapagos) e conectar; 3. Colocar a microplaca com as amostras no aparelho; 4. Programar o programa para leitura de absorvância com o comprimento

de onda de 620 nm; 5. Fazer a leitura; 6. Retirar a microplaca; 7. Desligar o aparelho e o computador.

Leitura realizada: A Figura 14 apresenta um exemplo de uma microplaca que foi utilizada para leitura de absorvâncias, com as amostras correspondentes de cada poço.


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Figura 14 – Exemplo dos enchimentos dos poços na microplaca

Legenda da microplaca: a) [A1 – H1] 100 µL meio TSB; b) [A2 – D2] 50 µL da solução do composto fenólico + 50 µL de meio TSB; c) [E2 – H2] 50 µL da solução de dicromato de potássio + 50 µL de meio TSB; d) [A3 – H9] 100 µL da cultura saturada de Pseudomonas fluorescens com

OD600=0.2; e) [A4 – D4] 100 µL da solução-mãe do composto fenólico; f) [A4 – D4] 100 µL da solução-mãe de dicromato de potássio 0.04 mol/L; g) A partir da fila nº4 até à fila nº9, fizeram-se diluições seriadas num fator

de 2, retirando 100 µL da fila anterior, homogeneizando e desprezando na fila nº9 os últimos 100 µL.

Fazer a leitura do OD620 no aparelho Elisa, nos seguintes tempos:

Laboratório de Microbiologia

Preparação de stocks de culturas microbiológicas de referência 1. Retirar as placas de Meio Tryptone Soya Agar (TSA) necessárias do

frigorífico e identificar cada uma com o microrganismo de referência correspondente;

2. Dependendo do material de referência (ansa ou microtubo) aplicar um dos seguintes procedimentos:

Tempos 0min 30min 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 24h


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3. Colocar na estufa a 37ºC durante 24 h; 4. No dia seguinte fazer uma nova passagem de cada um dos

microrganismos de referência; 5. Repetir duas vezes o ponto anterior, utilizando sempre a passagem

anterior para a realização da nova; 6. Após três passagens realizadas, encher para cada um dos microrganismos

de referência três microtubos com 0.5 mL de Glicerol e 0.5 mL de TSB e identificar cada um com caneta de acetato e fita-cola;

7. Para cada microrganismo, raspar todas as colónias da placa, e inocular nos três microtubos;

8. Os stocks microbianos são armazenados a -80ºC. Stocks de microrganismos: Escherichia coli (ATCC® 25922™), Staphylococcus epidermidis (ATCC® 12228™), Streptococcus pneumoniae (ATCC® 6305™), Candida albicans* (ATCC® 10231™), Enterococcus faecalis (ATCC® 29212™). * Esta levedura é colocada na estufa a 30ºC.

Figura 15 - Material microbiológico de referência e stocks realizados das mesmas

Realizar o esfregaço na placa de TSA

Cortar a ponta da ansa para um tubo com 5 mL de TSB

Ansas

Adicionar soro do kit da cultura

Colocar no banho-maria para dissolução

Inocular 0.1 mL em placa de TSA

Microtubo


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Descrição detalhada do trabalho desenvolvido

Toxicidade de compostos fenólicos

Introdução

A toxicidade é o parâmetro que caracteriza o grau de nocividade de qualquer substância para um organismo vivo ou para uma parte específica desse mesmo organismo. Indica-nos quão nociva é uma substância quando a mesma penetra no organismo por ingestão, inalação ou absorção cutânea. O efeito tóxico de qualquer substância depende da dose e/ou do sistema biológico de cada um [8].

Existe uma escala contínua de toxicidade com três níveis básicos [8]:

Substâncias essencialmente não tóxicas que podem ser consumidas numa dosagem de pelo menos dez vezes a mais do que normalmente são ingeridas;

Substâncias levemente tóxicas que podem ser consumidas numa dosagem de pelo menos três vezes a mais do que normalmente são ingeridas;

Substâncias tóxicas que podem causar efeitos nocivos significativos ou fatais se consumidos em quantidades pequenas até três vezes a dosagem usual. Os compostos fenólicos são estruturas químicas que apresentam grupos

hidroxilo e anéis aromáticos, responsáveis pelo poder antioxidante destes compostos. Os compostos fenólicos podem apresentar-se em formas simples ou de polímeros e podem ser naturais ou sintéticos [9]. Devido à grande variedade de combinações que acontecem na natureza, os compostos fenólicos apresentam uma diversidade estrutural, destacando-se os flavonóides, os ácidos fenólicos, os taninos e os tocoferóis [9].


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Flavonóides: Compostos de baixo peso molecular

que possuem estrutura básica formada por C6-C3-C6.

Ácidos fenólicos: Caracterizam-se pela presença de um anel benzénico, um grupo carboxílico e um ou mais grupo hidroxilo e/ou metoxilo na molécula que lhes conferem propriedades antioxidantes.

Taninos: Possuem peso molecular alto, constituem uma classe de polifenóis e são classificados em taninos hidrolisáveis e taninos condensáveis.

Tocoferóis: Compostos monofenólicos que estão agrupados em duas séries de compostos, os tocóis que apresentam uma cadeia saturada ligada ao anel e os tocotrienóis que possuem uma cadeia insaturada.

Figura 19 – Exemplo da estrutura química de um tocoferól

Os compostos fenólicos estão presentes em frutas, vegetais, chás e vinhos

e são vários os efeitos benéficos à saúde, uma vez que são uma fonte de antioxidantes. No entanto, existem vários estudos que comprovam os efeitos tóxicos dos compostos fenólicos no ambiente, mesmo em concentrações moderadas [10].

Os compostos usados neste estudo são o ácido gálico, o ácido

protocatecuico, o ácido vanílico e o ácido siríngico. Estes compostos estão referenciados na literatura como abundantes em águas de cozedura de cortiça [1][2][3].

Figura 16 – Exemplo da estrutura química de um flavonóide

Figura 17 – Exemplo da estrutura química de um ácido fenólico

Figura 18 – Exemplo da estrutura química de um tanino


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Figura 20 – Estruturas químicas dos compostos fenólicos em estudo: A - Ácido Gálico; B - Ácido Protocatecuico; C -

Ácido Siríngico; D - Ácido Vanílico

Os efluentes provenientes da indústria corticeira apresentam uma elevada

carga orgânica e uma elevada quantidade de compostos fenólicos. No sentido de se reproduzir em condições laboratoriais a matriz original, os estudos de toxicidade foram efetuados para uma mistura destes quatro compostos. Para estudar o efeito da concentração dos compostos na toxicidade, os ensaios foram realizados com diferentes concentrações (4, 2, 1 e 0.5 mM). Os efeitos da radiação gama na toxicidade dos compostos fenólicos foram avaliados por recurso a fonte de radiação gama de Cobalto-60. O impacto da radiação gama depende, essencialmente, do débito de dose e da dose absorvida. Ao interagir com a água, a radiação gama provoca a quebra das ligações covalentes das moléculas devido à transferência de energia do fotão, levando à formação de radicais livres e produtos moleculares que provocam alterações nas estruturas dos compostos [11].

A dose que o produto recebe é mensurável por cada lote de produto/solução tratada. Essa medida obedece a um sistema de dosimetria integrado no processo produtivo assumindo-se como um procedimento regular de medição [11]. O processo mais comum é o uso de dosímetros de rotina cujo sistema de matriz é alterado pela exposição à radiação, sendo o resultado obtido pelo escurecimento ou aumento da densidade óptica que nos indica a dose absorvida [11]. São usados dosímetros de rotina de polimetilmetacrilato (PMMA) com gamas de dose variável: dosímetro Red-Perspex (Harwell dosimeters) que pode ser utilizado numa gama de dose absorvida de 5 a 50 kGy e o Amber Perspex que pode ser usado numa gama de dose absorvida de 1 a 30 kGy [11].


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Figura 21 - Câmara de irradiação da unidade experimental de 60Co, Precisa 22

A toxicidade de compostos pode ser avaliada por diferentes métodos (e.g.

citotoxicidade, genotoxicidade, inibição de crescimento bacteriano), utilizando diferentes mecanismos e diferentes organismos controlo. Neste trabalho, a avaliação da toxicidade de soluções de compostos fenólicos foi realizada pelo método de inibição do crescimento utilizando a bactéria Pseudomonas fluorescens [12]. Este ensaio baseia-se na avaliação do efeito das amostras em estudo relativamente à taxa de crescimento bacteriano. O efeito é avaliado para uma população bacteriana em crescimento activo (numa fase exponencial), num meio rico em nutrientes (TSB) e sob condições de temperatura e tempo bem definidas (37ºC; 24 horas).

Protocolo Experimental Material: Gobelés; Frascos de vidro; Funis; Fita indicadora de autoclave; Fita indicadora de estufa; Espátulas; Balança (Kern) Balança (Sartorius) Agitadores magnéticos; Placa de aquecimento com agitação (Velp) Pipetas graduadas; Pipetador automático; Balões volumétricos; Seringa 5 mL;


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Filtros de 0.22 µL (Sartorius); Tubos eppendorf de 1.5 mL; Tubo de 50 mL; Suportes para tubos; Estufa (Memmert); Autoclave (Steri 21); Manga para esterilização; Selador; Placas de vidro; Pontas de micropipeta; Micropipetas; Ansas; Caixas de pétri; Banho-maria (Memmert); Luvas; Estufa a 37ºC (Memmert); Espectrofotómetro (UV-1800 Shimadzu) Células de espectrofotómetro de plástico; Espalhadores; Tubos de ensaio; Erlenmeyers; Vortex; Microscópio ótico Episcopic Fluorescent BA400 (MOTIC); Câmara de Neubauer; Lâminas e lamelas. Reagentes: TSA (OXOID); TSB (OXOID); Cloreto de sódio (Panreac); Ácido gálico (SIGMA-ALDRICH); Ácido vanílico (Fluka); Ácido siríngico (SIGMA-ALDRICH); Ácido protocatecuico (SIGMA-ALDRICH); Água ultra-pura (Millipore); Água destilada; Álcool a 70%; Óleo de emersão. Preparação das soluções: Meio Tryptone Soya Agar (TSA);


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Meio Tryptone Soya Broth (TSB); Meio Tryptone Soya Broth 2x concentrado (TSB 2x); Soro fisiológico 0.9%; Mistura de compostos fenólicos 4, 2,1 e 0.5 mM; Mistura de compostos fenólicos 4, 2,1 e 0.5 mM (Irradiados).

Procedimento:

1. Esterilizar o material necessário; 2. Preparar uma cultura saturada de Psedomonas fluorescens:

a) Incubar durante a noite a 37ºC com agitação.

P. fluorescens Repicagem para

meio sólido

Inoculação em

meio líquido

Suspensão saturada

de P. fluorescens

Figura 22 - Procedimento efetuado para a preparação da cultura saturada de P. flurescens.

Incubar durante a

noite a 37ºC com

agitação


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3. Retirar 1 mL da cultura saturada, adicionar a um erlenmeyer com 25 mL de meio TSB fresco e homogeneizar;

4. Incubar a 37ºC com agitação até atingir OD600 = 0.2: a) Para monitorizar a Densidade Ótica (OD) retirar alíquotas de meia em

meia hora para leitura no espectrofotómetro, usando como branco o mesmo meio que foi usado para fazer as culturas anteriores.

5. Através da câmara de Neubauer, contar as bactérias e determinar a concentração bacteriana (UFC/mL) da cultura com OD600 = 0,2:

a) Colocar 10 µL da cultura saturada em cada um dos poços (A e B) e

colocar uma lamela por cima dos poços;

Figura 24 - Câmara de Neubauer

b) Colocar a câmara de Neubauer no microscópio e adicionar uma gota

de óleo de emersão por cima da lamela;

A

B

Figura 23 - Procedimento efetuado para se obter uma cultura com OD600 = 0.2


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c) Proceder à focagem; d) Fazer a contagem de bactérias em cinco quadrantes no poço A e cinco

quadrantes no poço B;

Figura 25 - P. fluorescences

e) Calcular o nº de diluições necessárias para se obter a uma concentração bacteriana de 102 UFC/ml nos erlenmeyeres de incubação;

6. Preparar várias culturas (com base na última diluição realizada) conforme apresentado na Tabela 1:

Tabela 1 - Indicações para elaboração das soluções (Toxicidade)

Concentrações/Reagentes 0mM 0.5mM 1mM 2mM 4mM 0.5mM (I) 1mM (I) 2mM (I) 4mM (I)

TSB 2x (mL) 25 25 25 25 25 25 25 25 25

Água ultra-pura (mL) 25

Mistura de compostos fenólicos (mL)

25 25 25 25 25 25 25 25

Cultura (mL) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

* I – amostras irradiadas a 20 kGy na fonte experimental de Co-60, Precisa 22.

•Retirar 1 mL da cultura saturada

Colocar num tubo com 9 mL de soro

•Retirar 1 mL do tubo anterior


•Retirar 1 mL do tubo anterior


Figura 26 - Esquema das diluições da cultura com OD600 = 0.2


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Figura 27 - Culturas preparadas.

Legenda: 1. Controlo positivo e solução 0 mM; 2. Soluções 4, 2, 1 e 0.5 mM; 3. Soluções 4, 2, 1 e 0.5 mM irradiadas.

7. Inocular nas placas de TSA para contagem de Unidades Formadoras de

Colónias (UFC), nos seguintes tempos:

a) Para o tempo t=0h, preparar para cada amostra a diluição 10-1 da cultura em soro fisiológico estéril (retirar 100 µL para um tubo estéril de 1.5 mL com 900 µL de soro);

b) Para o tempo t=24h preparar para cada amostra as diluições 10-8 e 10-

9 da cultura em soro fisiológico estéril (retirar 100 µL para um tubo estéril de 1.5 mL com 900 µL de soro e fazer diluições seriadas até às diluições desejadas);

Tempos 0h 24h


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Figura 28 - Tubos de 1.5 mL com soro para as diluições das 0h (1) e das 24h (2)

Legenda: 1. Tubos de 1.5 mL com 900 µL de soro para as diluições das 0h; 2. Tubos de 1.5 mL com 900 µL de soro para as diluições das 24h.

h) Para cada diluição retirar 100 µL para inoculação em placa de TSA e

proceder ao espalhamento.

Resultados/Tratamento de resultados

A avaliação da toxicidade de soluções de compostos fenólicos foi realizada pelo método de inibição do crescimento utilizando a bactéria Pseudomonas fluorescens. O crescimento bacteriano nas culturas com as várias concentrações de uma mistura de compostos fenólicos, irradiada a 20 kGy e não irradiada, foi determinado por dois métodos: medição da densidade ótica a 600 nm e determinação da carga microbiana (UFC/mL).

Os resultados referentes à dosimetria de rotina das amostras irradiadas a

20 kGy estão representados na Tabela 2.

Figura 29 - Exemplo do espalhamento em placa de TSA


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0.1 mL

Tabela 2- Valores de dosimetria para os dosímetros Amber X

Dose estimada (kGy) Dose média absorvida

(Dm, kGy) Débito de dose médio

(DDm, kGy/h)

20 19.73 1.54 De seguida, apresentam-se os resultados obtidos na preparação da cultura

e na monitorização do crescimento bacteriano. As contagens referentes estimativa da concentração da cultura bacteriana

saturada através da câmara de Neubauer encontram-se detalhadas na Tabela 3.

Tabela 3 - Contagens de bactérias nos dois quadrantes da câmara de Neubauer

Número de células bacterianas

Q1 Q2 Q3 Q4 Q5

Poço A 8 2 9 1 3

Poço B 5 6 5 4 8

𝑈𝐹𝐶

𝑚𝐿=

𝑚é𝑑𝑖𝑎

2.5 × 10−7=

7.8

2.5× 107 = 3.12 × 107 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿

Média = Média dos 10 valores da tabela 2.5x10-7 = Fatores de redução de unidades

Com o valor de UFC/mL resultante, conseguem-se calcular as diluições necessárias para se obter a concentração desejada de 102 UFC na placa inoculada com 0.1 mL de cultura, como mostra a Tabela 4.

Tabela 4 - Diluições necessárias para diluição obter a concentração desejada de 102 UFC.

10-1 10-2 10-3 3.12x106 3.12x105 3.12x104

O protocolo descrito foi repetido duas vezes para avaliara reprodutibilidade dos resultados. A carga microbiana das culturas (UFC/mL) foi estimada com base no número de colónias em cada uma das placas inoculadas, a partir da fórmula seguinte.

102


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𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿 = 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙ó𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑚é𝑑𝑖𝑜

𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑑𝑜 𝑖𝑛ó𝑐𝑢𝑙𝑜×

1

𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜

Média = Média do número de colónias das duas réplicas de cada diluição inoculada nas placas de TSA. Volume de inóculo = 0.1mL

De seguida, foram calculadas os valores médios da carga microbiana

(UFC/mL) para cada uma das culturas com as várias concentrações de compostos fenólicos não-irradiadas e irradiadas, como mostra a Tabela 5.

Tabela 5 - Carga microbiana (UFC/mL) determinada para as culturas de Pseudomonas fluorescens com várias concentrações de soluções de compostos fenólicos irradiadas e não irradiadas (*c - contaminação).

t = 0h

Não irradiadas Irradiadas

0 mM 0.5 mM 1 mM 2 mM 4 mM 0.5 mM 1 mM 2 mM 4 mM

UFU/mL UFU/mL UFU/mL UFU/mL UFU/mL UFU/mL UFU/mL UFU/mL UFU/mL

1.50x101 2.50x101 1.15x102 4.50x101 3.25x101 1.50x101 1.08x102 1.00x101 4.00x101

t = 24h

Não irradiadas Irradiadas

0 mM 0.5 mM 1 mM 2 mM 4 mM 0.5 mM 1 mM 2 mM 4 mM

UFU/mL UFU/mL UFU/mL UFU/mL UFU/mL UFU/mL UFU/mL UFU/mL UFU/mL

1.91x1012 4.57x1012 2.37x1012 1.98x1012 9.75x1010 4.68x1011 5.43x1010 4.18x1011 *c

Os resultados obtidos da carga microbiana foram convertidos para Log10 e foi efetuada a diferença entre os tempos 24 h e 0 h (Gráfico 1) de forma a ser obtido um valor representativo do crescimento bacteriano.

Gráfico 1 - Carga microbiana das culturas de Pseudomonas fluorescens com soluções de compostos fenólicos a várias concentrações irradiadas e não irradiadas


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Não foi possível determinar o crescimento bacteriano para a cultura com a concentração mais elevada de compostos fenólicos (4 mM) irradiada a 20 kGy, uma vez que ocorreu uma contaminação nas placas inoculadas.

Paralelamente, foram também medidas as densidades óticas a 600 nm para cada uma das culturas de forma a monitorizar de uma forma mais rápida o crescimento bacteriano. Os resultados obtidos estão representados no Gráfico 2 e refletem a diferença entre as medições relativas ao tempo 24 h e ao tempo 0 h.

Gráfico 2 - Densidades óticas das culturas de Pseudomonas fluorescens com soluções de compostos fenólicos a várias concentrações as amostras irradiadas e não irradiadas.

Discussão de Resultados/Conclusões Conforme mencionado anteriormente, os ensaios da toxicidade de compostos fenólicos foram realizados pelo método de inibição do crescimento utilizando a bactéria Pseudomonas fluorescens. O crescimento bacteriano foi avaliado na presença de diferentes concentrações de uma mistura de compostos fenólicos, irradiada a 20 kGy e não irradiada, e determinado por dois métodos: medição da densidade ótica a 600 nm e determinação da carga microbiana (UFC/mL).

Os métodos utilizados para determinar o crescimento bacteriano parecem demonstrar o mesmo comportamento, apesar de não ter sido possível determinar o valor relativo à concentração 4 mM (20 kGy) uma vez que se observou contaminação nas placas inoculadas. Esta contaminação pode ter sido causada na preparação das placas ou durante a execução do protocolo, nomeadamente nas diluições com soro fisiológico ou na própria inoculação.


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Neste ensaio, uma toxicidade elevada é refletida por um menor crescimento bacteriano. Considerando os resultados obtidos (Gráficos 1 e 2), parece existir uma tendência decrescente de crescimento bacteriano com o aumento da concentração de compostos fenólicos. Isto sugere que para concentrações mais elevadas, a toxicidade das amostras é maior. Este facto é mais evidente para a concentração de 4 mM, sendo necessário aumentar a concentração de compostos para confirmar este resultado. Por outro lado, considerando o efeito da radiação gama, é possível observar que para as concentrações mais baixas (0.5 e 1 mM) as amostras irradiadas a 20 kGy parecem ter um efeito mais tóxico sobre a P. fluorescens. Analisando a concentração mais elevada (4 mM), é possível verificar um comportamento oposto. A amostra irradiada aparenta ser menos tóxica do que a amostra não irradiada. Já para uma concentração intermédia (2 mM) parece não haver variação entre a amostra irradiada e não irradiada.

Os diferentes comportamentos observados podem ser consequência da concentração dos produtos de degradação dos compostos fenólicos em estudo quando sujeitos ao tratamento por radiação gama. Provavelmente, a dose absorvida não é suficiente para degradar completamente os compostos numa concentração de 4 mM, mas poderá ser suficiente para obter uma degradação completa nas concentrações mais baixas.

Como trabalho futuro, será necessário repetir o protocolo para validar os resultados obtidos e complementar os resultados com ensaios de citotoxicidade que já estão a decorrer. Por outro, serão efetuadas análises por cromatografia líquida (HPLC) para avaliar a degradação por radiação gama dos compostos fenólicos selecionados e, assim, correlacionar melhor os resultados obtidos.

Conclusão

No fim do estágio profissional consigo fazer um balanço positivo de todos estes meses. Representa uma fase de grande crescimento para a minha formação pessoal e profissional, porque foi um momento de interação com a realidade laboratorial e de ampliação e aprofundamento dos conhecimentos teóricos e práticos.

O contacto com todos os profissionais do laboratório, com quem tive a

oportunidade de trabalhar e conviver, foi crucial no desenvolvimento do trabalho e na experiência que adquiri.


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Com tudo isto, posso dizer que foi com este estágio que tirei o melhor partido para me ajudar no meu futuro profissional. Fez com que me tornasse um melhor técnico de laboratório, com mais confiança e independência, permitindo auxiliar de forma mais eficaz todas as atividades laboratoriais.

No futuro, teria todo o gosto em exercer a função de técnico de

laboratório, porque poderia transmitir todos os conhecimentos adquiridos ao longo deste curso e estágio.


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Bibliografia/Web grafia

[1] M. Minhalma, M. N. Pinho (2001), Flocculation/Flotation/Ultrafiltration integrated process for the treatment of cork processing wastewaters. Environ. Sci. Technol., 35, 4916–4921. [2] Ana Fernandes, André Sousa, Nuno Mateus, Miguel Cabral, Victor de Freitas (2011), Analysis of phenolic compounds in cork from Quercus suber L. by HPLC–DAD/ESI–MS, Food Chemistry,125, 1398–1405. [3] Sónia A.O. Santos, Juan J. Villaverde, Andreia F. Sousa, Jorge F.J. Coelho, Carlos P. Neto, Armando J.D. Silvestre (2013), Phenolic composition and antioxidant activity of industrial cork by-products, Industrial Crops and Products, 47, 262–269. [4] https://tecnico.ulisboa.pt/ (acedido a 15 de Maio de 2015) [5] http://www.itn.pt/pt/pt_main.htm (acedido a 15 de Maio de 2015) [6] http://c2tn.tecnico.ulisboa.pt/ (acedido a 15 de Maio de 2015) [7] Doutora Sandra Cabo Verde, Apresentação Letal, Tecnologias da Radiação. [8] EPA: Technical Overview of Ecological Risk Assessment. [9] Joana Madureira, Estudo do efeito da radiação ionizante na capacidade antioxidante dos compostos presentes na água de processo da indústria corticeira, Lisboa 2011, Tese de Mestrado, FCT-UNL. [10] Huilun Chen, Jun Yao, Fei Wang, Yong Zhou, Ke Chen, Rensheng Zhuang, Martin M.F. Choi, Gyula Zaray (2010), Toxicity of three phenolic compounds and their mixtures on the gram-positive bacteria Bacillus subtilis in the aquatic environment, Science of the Total Environment, 408, 1043–1049. [11] Centro de Higienização por ionização de produtos, SA., CHIPKOMPENDIUM (Brochura informativa). [12] M. Paz, H. Muzio, A. Mendelson, A. Magdaleno, C. Tornello, N. Balbis, J. Moretton (2006), Ecotoxicological and genotoxic evaluation of Buenos Aires city (Argentina) hospital wastewater. J. Braz. Soc. Ecotoxicol., v. 1, n. 1, 1-6.

https://tecnico.ulisboa.pt/

http://www.itn.pt/pt/pt_main.htm

http://c2tn.tecnico.ulisboa.pt/


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Anexos

Meio TSA Procedimento

1. Colocar um erlenmeyer com 1 L de água ultra-pura e com um agitador magnético sobre uma placa de aquecimento com agitação;

2. Pesar 40 g de meio desidratado; 3. Introduzir o meio desidratado no erlenemyer e ferver, sempre com

agitação; 4. Repartir o volume em frascos de vidro shot; 5. Esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos, colocando papel

indicador em cada um dos frascos.

Figura 30 - Placas de TSA preparadas

Meio TSB Procedimento


2. Pesar 30 g de meio desidratado; 3. Introduzir o meio desidratado no erlenemyer e colocar em agitação até

completa dissolução; 4. Repartir o volume em frascos de vidro shot; 5. Esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos, colocando papel



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Meio MEA Procedimento


2. Pesar 50 g de meio desidratado; 3. Introduzir o meio desidratado no erlenemyer e ferver, sempre com

agitação; 4. Repartir o volume em frascos de vidro shot; 5. Esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos, colocando papel


Soro fisiológico 0.9% Procedimento


2. Pesar 9 g de cloreto de sódio; 3. Adicionar a massa pesada de cloreto de sódio no erlenemyer e colocar em

agitação até completa dissolução; 4. Após completa dissolução repartir o volume em frascos de vidro shot; 5. Esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos, colocando papel


Soro fisiológico 0.9% com 0.1% de Tween 80 Procedimento


2. Pesar 9 g de cloreto de sódio; 3. Adicionar a massa pesada de cloreto de sódio no erlenemyer e colocar em

agitação até completa dissolução; 4. Após completa dissolução adicionar 1 mL de Tween 80; 5. Repartir o volume em frascos de vidro shot; 6. Esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos, colocando papel



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Água peptonada Procedimento


2. Pesar 20 g de água peptonada desidratada; 3. Introduzir a água desidratada no erlenemyer e ligar a agitação; 4. Repartir o volume em frascos de vidro shot; 5. Esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos, colocando papel


Mistura de compostos fenólicos 4, 2, 1 e 0.5mM Procedimento

1. Pesar as massas necessárias conforme a Tabela 5.

Tabela 6 - Massas necessárias para a preparação das várias soluções de compostos fenólicos

Concentração/Reagentes 4mM 2mM 1mM 0,5mM

Ácido Gálico (mg) 68,048 34,024 17,012 8,506

Ácido Protocatecuico (mg) 61,648 30,824 15,412 7,706

Ácido Siríngico (mg) 79,268 39,634 19,817 9,9085

Ácido Vanílico (mg) 67,256 33,634 16,817 8,407

2. Juntar todos os reagentes num copo, passando alguma água ultra pura

por cada um; 3. Dissolver toda a massa de compostos; 4. Transferir para um balão volumétrico de 100 mL; 5. Perfazer o balão com água ultra pura; 6. Filtrar cada uma das soluções com uma seringa e um filtro de 0.22 µL

para tubos de 50 mL estéreis.

Figura 31 - Soluções de compostos fenólicos preparadas e filtradas


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Solução de ácido sulfúrico 4 mol/L Procedimento

1. Adicionar 500 mL de água a um balão volumétrico de 1 L; 2. Adicionar 220 mL de ácido sulfúrico; 3. Deixar arrefecer; 4. Perfazer e homogeneizar.

Solução de ácido sulfúrico-sulfato de prata Procedimento

1. Pesar 10 g de sulfato de prata; 2. Dissolver em 35 mL de água; 3. Transferir para um balão de 1 L; 4. Adicionar 965 mL de ácido sulfúrico; 5. Deixar arrefecer; 6. Perfazer e homogeneizar.

Solução padrão de dicromato de potássio [K2Cr2O7] = 0,040mol/L, contendo um sal de mercúrio (HgSO4) Procedimento

1. Pesar 40 g de sulfato de mercúrio; 2. Dissolver em 400 mL de água; 3. Transferir para um balão volumétrico de 1 L; 4. Adicionar 50 mL de ácido sulfúrico; 5. Arrefecer; 6. Pesar 5.884 g de dicromato de potássio, previamente seco a 105ºC durante

2h; 7. Transferir para o balão volumétrico; 8. Perfazer e homogeneizar.


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Solução titulante de sulfato de amónio ferroso [(NH4)2Fe(SO4)2 2H2O] 0.12 mol/L; Procedimento

1. Pesar 47 g de sulfato de amónio ferroso; 2. Dissolver em água; 3. Transferir para um balão volumétrico de 1 L; 4. Adicionar 20 mL de ácido sulfúrico; 5. Arrefecer; 6. Perfazer e homogeneizar.

Soluções padrão de hidrogenoftalato de potássio Procedimento

1. Para as várias concentrações, pesar a massa correspondente de Hidrogenoftalato de potássio previamente seco a 105ºC durante 2h conforme a Tabela 6.

Tabela 7 - Massas necessárias para preparar as soluções padrão de hidrogenoftalato de potássio

Concentrações (mgO2/L) 50 100 200 350 500 650 750 850 1000

Massa (g) 4.25 8.5 17.01 29.06 42.52 55.27 63.78 72.28 85.03

2. Dissolver em água; 3. Transferir para balões volumétricos de 100 mL; 4. Perfazer e homogeneizar.

laboratório de ensaios tecnológicos em Áreas...

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