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KÁTIA REGINA FELIZARDO VASCONCELOS
ASSOCIAÇÃO ENTRE LESÕES DE CÁRIE DENTÁRIA E DEFEITOS DO
DESENVOLVIMENTO DO ESMALTE COM O ÍNDICE DE MASSA CORPORAL E COM
POLIMORFISMOS NOS GENES QUE CODIFICAM AS METALOPROTEINASES
8, 13 E 20, EM CRIANÇAS DE MANAUS - AM
Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo para a obtenção do título de Doutor em Ciências.
Programa: Odontopediatria.
Área de Concentração: Odontopediatria.
ORIENTADOR: PROF. DR. PAULO NELSON FILHO
CO-ORIENTADORA: PROFA. DRA. RAQUEL ASSED BEZERRA SEGATO
VERSÃO CORRIGIDA
Ribeirão Preto 2018
AUTORIZAÇÃO PARA REPRODUÇÃO
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio
convencional ou eletrônico para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
KÁTIA REGINA FELIZARDO VASCONCELOS
FICHA CATALOGRÁFICA
Vasconcelos, Kátia Regina Felizardo
Associação entre lesões de cárie dentária e defeitos do desenvolvimento do esmalte com o índice de massa corporal e com polimorfismos nos genes que codificam as metaloproteinases 8, 13 e 20, em crianças de Manaus - AM. Ribeirão Preto, 2018.
98p. : il.; 30 cm
Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FORP-USP) – Área de concentração: Odontopediatria. Versão Corrigida da Tese. A versão original se encontra disponível na Unidade que aloja o Programa.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Nelson Filho Co-orientadora: Profa. Dra. Raquel Assed Bezerra Segato
1. Metaloproteinase 8 da Matriz. 2. Metaloproteinase 13 da Matriz. 3.
Metaloproteinase 20 da Matriz. 4. Cárie Dentária. Polimorfismo Genético. 5. Esmalte dentário.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Vasconcelos KRF. Associação entre lesões de cárie dentária e defeitos do
desenvolvimento do esmalte com o índice de massa corporal e com polimorfismos
nos genes que codificam as metaloproteinases 8, 13 e 20, em crianças de Manaus
- AM.
Tese de Doutorado apresentada à Faculdade
de Odontologia de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo para a obtenção do
título de Doutor em Ciências Programa:
Odontopediatria.
Área de Concentração: Odontopediatria.
Data da defesa: _____/____/____
BANCA EXAMINADORA
Prof(a). Dr(a).: ______________________________________________________________
Julgamento: _____________________ Assinatura: _________________________________
Prof(a). Dr(a).: ______________________________________________________________
Julgamento: _____________________ Assinatura: _________________________________
Prof(a). Dr(a).: ______________________________________________________________
Julgamento: _____________________ Assinatura: _________________________________
Prof(a). Dr(a). Paulo Nelson Filho – Orientador e Presidente da Banca Examinadora
Assinatura: ____________________________
DADOS CURRICULARES
KÁTIA REGINA FELIZARDO VASCONCELOS
Nascimento 21 de julho de 1969 – Manaus/AM.
Filiação José Felizardo de Souza.
Valda Pereira da Costa.
1987-2005
Curso de Graduação em Odontologia.
Universidade Federal do Amazonas – UFAM/AM.
1998-1999
Curso de Especialização em Odontopediatria.
Associação Brasileira de Odontologia – Secção do Amazonas/AM.
2004-2006
Curso de Pós-Graduação em Patologia Tropical, nível Mestrado.
Universidade Federal do Amazonas – UFAM/AM – Dissertação:
“Avaliação in vitro da atividade antibacteriana de um cimento
obtido da associação do óleo-resina in natura da Copaifera
multijuga ao óxido de zinco e ao hidróxido de cálcio frente aos
Streptococcus mutans e Streptococcus sanguis. Orientadora:
Profa. Dra. Maria Fulgência Costa Lima Bandeira.
2004-atualmente
Docente nas disciplinas de Odontopediatria e Saúde Bucal
Coletiva, Faculdade do Amazonas-IAES.
2016-2018 Curso de Pós-Graduação em Odontopediatria, nível Doutorado
(DINTER) - tese: Associação entre lesões de cárie dentária e
defeitos do desenvolvimento do esmalte com o índice de massa
corporal e com polimorfismos nos genes que codificam as
metaloproteinases 8, 13 e 20, em crianças de Manaus – AM.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Nelson Filho. Co-orientadora: Profa.
Dra. Raquel Assed Bezerra Segato. Faculdade de Odontologia de
Ribeirão Preto – USP.
DEDICATÓRIA
A Deus...
Qυе nos criou e foi criativo nesta tarefa.
Sеυ fôlego dе vida еm mіm mе fоі sustento
е mе dеυ coragem para questionar realidades
е propor sempre υm novo mundo dе possibilidades.
Pela oportunidade de mais uma conquista!
“Mas graças a Deus, que nos dá a vitória por meio de nosso Senhor Jesus Cristo”.
1 Coríntios 15:57
Ao meu orientador Prof. Dr. Paulo Nelson-Filho...
Que abraçou comigo esse sonho e sempre me incentivou.
Abdicou de seu valioso tempo para me orientar em cada passo desse trabalho.
Por ter me recebido e sempre me mostrado o caminho correto a ser seguido,
de forma única, admirável e exemplar. Desejo poder contribuir com a ciência
e com o universo acadêmico com a mesma ética e entusiasmo que me transmitiu.
Obrigada pela paciência! Eu tenho muito orgulho de ser sua aluna.
À Profa. Dra. Érika Calvano Küchler...
Pela dedicação, pelo apoio e por todas as oportunidades a mim concedidas.
Mesmo com a distância, muito obrigada por estar sempre presente, e disposta a me
ajudar. Você é um exemplo de profissional. Agradeço à Deus por ter te colocado em meu
caminho e grata a você pela forma generosa com que sempre me ajudou!
À minha co-orientadora, Profa. Dra. Raquel Assed Bezerra Segato...
Por toda a sua colaboração e oportunidades proporcionadas.
Você transmite muito otimismo e alegria, motivando a mim e a todos ao seu redor!
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Aos meus amados pais...
José Felizardo de Souza (in memorian) e Valda Pereira da Costa
Apesar de não terem tanto estudo, sempre me incentivaram no caminho da conquista
acadêmica. Por me proporcionarem condições para realizar os meus sonhos. Por serem
meus exemplos de vida e minha inspiração. O meu amor é tão grande quanto a gratidão
que eu sinto por ser filha de vocês!
Às minhas amadas filhas...
Karen Chrystina Felizardo Vasconcelos e Karine Rebeca Felizardo Vasconcelos
Por todo o amor e compreensão nesses meus anos de estudo. Pela paciência durante
minhas horas de ausência, que abdicaram da minha presença e mesmo assim estiveram
sempre me incentivando. Por serem minhas fontes de motivação. Amo muito vocês!
À minha dupla...
Silvane e Silva Evangelista
Por sempre me dar força e me apoiar em todos os momentos. Pela motivação e paciência.
Saiba que sem o seu incentivo eu não chegaria tão rápido ao final dessa jornada. Pela
alegria de viver que contagia todos à sua volta. Por sempre trazer luz, otimismo e uma
palavra amiga. Agradeço ao meu bondoso Deus por ter colocado você em meu caminho
nesse momento. Obrigada por fazer parte dessa conquista de uma forma tão presente,
minha amiga!
A todos os meus familiares e amigos...
Que sempre torceram por mim e que também fazem parte dessa vitória. Eu me sinto
muito abençoada e grata por ter tantas pessoas maravilhosas ao meu redor!
“A minha família é benção do Senhor
Me ensina a tratar minha família com amor
Edifica minha casa para o teu louvor
A minha família é um presente do Senhor
Te agradeço pela minha família
e por tua presença no meu lar
Te agradeço pelo pão de cada dia
que o Senhor nunca deixou faltar”
Regis Danese
(Família)
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
À Profa. Dra. Léa Assed Bezerra da Silva,
Por todas as oportunidades a mim concedidas e pela grande contribuição na minha
formação acadêmica. Obrigada por todos os ensinamentos. É uma honra poder contar
com a sua ajuda e experiência. Obrigado por me permitir realizar o Doutorado na USP
(DINTER). Você é um exemplo de amor e respeito à profissão!
Ao Dr. Alberto Tadeu do Nascimento Borges e Dra. Zobélia Maria de Souza Lopes,
Pela oportunidade da docência e por confiarem em meu trabalho. Vocês são exemplos de
profissionais completos e generosos, sempre dispostos a ajudar. Aprendi muito com vocês
durante todos esses anos de IAES - Instituto Amazônia de Ensino Superior. Obrigada por
essa chance do Doutorado. Deus abençoe vocês!
À Aluna de Doutorado Juliana Arid,
Pela receptividade e por sua ajuda valiosa em várias etapas dessa caminhada. Obrigada por
todo o apoio, sempre com tanto carinho. Você foi essencial.
À amiga Rafaela Cardoso de Sá,
Porque eu não conheço pessoa mais doce, delicada e gentil. Obrigada por me receber com
tanto carinho na disciplina de Odontopediatria, sempre com tanta generosidade e afeto.
Desejo sempre estar ao seu lado para continuarmos aprendendo juntas e compartilhando
momentos tão agradáveis!
À Dra. Priscilla Coutinho Romualdo,
Obrigada por sua generosidade todas as vezes que precisei. Saiba que seu auxílio e dicas
foram muito úteis nessa trajetória.
AGRADECIMENTOS
À Universidade de São Paulo, na pessoa do atual Reitor, Prof. Dr. Vahan Agopyan,
e do Vice-Reitor, Prof. Dr. Antonio Carlos Hernandes.
À Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, na
pessoa da atual Diretora, Profa. Dra. Léa Assed Bezerra da Silva, e do Vice-Diretor, Prof. Dr.
Arthur Belém Novaes Júnior.
À Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Odontopediatria da Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, na pessoa da Coordenadora,
Profa. Dra. Raquel Assed Bezerra Segato e da Vice-Coordenadora Profa. Dra. Léa Assed
Bezerra da Silva.
Aos professores da disciplina de Odontopediatria da Faculdade de Odontologia de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, que sempre me receberam muito bem:
Profa. Dra. Aldevina Campos de Freitas, pela forma generosa e alegre que sempre
me acolheu.
Profa. Dra. Alexandra Mussolino de Queiroz, exemplo de amor e dedicação à
Odontopediatria. Obrigada pela simpatia e por todos os ensinamentos transmitidos.
Profa. Dra. Andiara De Rossi Daldegan, por estar sempre disposta a ajudar.
Prof. Dr. Fabrício Kitazono de Carvalho, por ser sempre tão receptivo e carinhoso
todas as vezes que conversamos.
Profa. Dra. Maria Cristina Borsatto, pelo carinho e atenção.
Profa. Dra. Kranya Victoria Díaz Serrano, pela alegria e pela receptividade com que
me acolheu quando estive em Ribeirão Preto. Obrigada pelos ensinamentos e pelas
palavras de incentivo e motivação.
Profa. Dra. Maria da Conceição Pereira Saraiva, professora da Disciplina de
Epidemiologia. Obrigada, professora, por ter me atendido com tanto carinho e atenção.
Ao Prof. Dr. Alberto Consolaro, por todos os ensinamentos transmitidos durante a
Pós-Graduação, com tanta dedicação e generosidade.
Aos alunos do Programa de Pós-Graduação em Odontopediatria da Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto – USP, níveis Mestrado e Doutorado, e aos alunos do
DINTER (Doutorado Interinstitucional) entre a Faculdade do Amazonas – IAES (Instituto
Amazônia de Ensino Superior) e o Programa de Pós-Graduação em Odontopediatria da
Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto - a Universidade de São Paulo pela
convivência agradável pelas experiências e conhecimentos compartilhados.
Aos Funcionários do Departamento de Clínica Infantil da Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto - USP, Filomena Leli Placciti, Matheus Morelli Zanela, Dra.
Carolina Paes Torres Mantovani, Dr. Francisco W.G. de Paula e Silva, Dra. Marília Pacífico
Lucisano Politi, Marco Antônio dos Santos, Fátima Aparecida Jacinto Daniel, Fátima
Aparecida Rizoli e Rosemary Alves, por todo o apoio oferecido.
À Nilza Letícia Magalhães, por toda a ajuda nas atividades laboratoriais deste
trabalho, pela disponibilidade e pelos momentos de convivência agradável que
compartilhamos. Pela grande simpatia, dedicação e paciência. Obrigada por toda a ajuda!
À Micheli Cristina Leite Rovanholo, por estar sempre disposta a ajudar e tirar
minhas dúvidas. Pela simpatia e pela convivência agradável. Muito obrigada por tudo!
À Faculdade do Amazonas – IAES (Instituto Amazônia de Ensino Superior), na
pessoa de sua Diretora, Dra. Zobélia Maria de Souza Lopes, e do Coordenador do curso, Dr.
Alberto Tadeu do Nascimento Borges, pela oportunidade de cursar o DINTER (Doutorado
Interinstitucional) com o Programa de Pós-Graduação em Odontopediatria da Faculdade
de Odontologia de Ribeirão Preto - a Universidade de São Paulo.
Aos funcionários e professores da Faculdade do Amazonas – IAES, pelo convívio
diário e pela ajuda inestimável nessa etapa.
Às amigas, Profa. Sidinéia Feitoza de Jesus e Profa. Alice Gomes de Carvalho Ramos,
pelos momentos de alegria e cumplicidade que compartilhamos. Obrigada pela confiança,
pelo carinho e por todo o apoio.
“Não é sobre ter
Todas as pessoas do mundo pra si
É sobre saber que em algum lugar
Alguém zela por ti
É sobre cantar e poder escutar
Mais do que a própria voz
É sobre dançar na chuva de vida
Que cai sobre nós
É saber se sentir infinito
Num universo tão vasto e bonito
É saber sonhar
E, então, fazer valer a pena cada verso
Daquele poema sobre acreditar
Não é sobre chegar no topo do mundo
E saber que venceu
É sobre escalar e sentir
Que o caminho te fortaleceu
É sobre ser abrigo
E também ter morada em outros corações
E assim ter amigos contigo
Em todas as situações
A gente não pode ter tudo
Qual seria a graça do mundo se fosse assim?
Por isso, eu prefiro sorrisos
E os presentes que a vida trouxe
Pra perto de mim”
Ana Vilela
(Trem Bala)
Trabalho com parte laboratorial desenvolvida no Laboratório de
Histologia, Biologia Molecular e Cultura de Células do Departamento de Clínica Infantil da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo.
RESUMO
Vasconcelos, KRF. Associação entre lesões de cárie dentária e defeitos do desenvolvimento do esmalte com o índice de massa corporal e com polimorfismos nos genes que codificam as metaloproteinases 8, 13 e 20, em crianças de Manaus - AM. Ribeirão Preto, 2018. 98p. Tese [doutorado]. Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. O objetivo do presente estudo foi avaliar a associação entre lesões de cárie dentária e defeitos do desenvolvimento do esmalte (DDEs) com o índice de massa corporal e com polimorfismos nos genes que codificam as metaloproteinases 8, 13 e 20, em uma população de crianças amazônicas. A amostra foi constituída de 221 crianças, com idade entre 9 e 12 anos, de ambos os gêneros, matriculadas em quatro escolas públicas da cidade de Manaus - Amazonas. Durante o exame clínico foram obtidos os índices CPO-D e/ou ceo-d, dados referentes aos DDEs e dados antropométricos (peso e altura). Os responsáveis responderam a um questionário sobre hábitos de higiene bucal e dieta. Amostras de saliva foram coletadas como fonte de DNA genômico e, por meio do método Taqman, por PCR em tempo real, realizou-se a genotipagem das regiões rs17099443 e rs3765620 no gene que codifica a MMP8; rs478927 e rs2252070 no gene que codifica a MMP13; e rs1784418 no gene que codifica a MMP20. Os dados foram submetidos à análise estatística empregando os testes de Shapiro-Wilk, ANOVA, Tukey, Qui-quadrado, Exato de Fisher e a razão de chance, com nível de significância de 5%. De acordo com os resultados obtidos verificou-se que, nas crianças com baixo peso, a média de lesões de cárie dental foi 1,00 (DMP 1,00), nas eutróficas a média de lesões de cárie dental foi de 1,57 (DMP 2,00), nas com sobrepeso, a média foi de 1,44 (DMP 1,86) e nas crianças obesas foi de 3,12 (DMP 2,63). Crianças obesas apresentaram mais lesões de cárie que as crianças eutróficas e com sobrepeso (p<0,05). Nos genes que codificam MMP8, MMP13 e MMP20 os alelos polimórficos foram observados em maior frequência nos indivíduos com experiência de cárie, com associação significativa apenas para o polimorfismo rs478927 no gene que codifica a MMP13 (p=0,043). Com relação aos DDE, os alelos polimórficos foram observados em maior frequência nos genes que codificam MMP8, MMP13 e MMP20, com associação significativa apenas para o polimorfismo rs478927 no gene que codifica a MMP13 (p=0,005). Para o gene que codifica MMP13, houve diferença significativa na distribuição dos genótipos entre os grupos controle e DDE (p=0,017). Com base nos parâmetros analisados e nos resultados obtidos, foi possível concluir que, em crianças de Manaus-AM, as lesões de cárie estiveram associadas com obesidade, e que houve associação entre o polimorfismo genético (rs478927) no gene que codifica a MMP13 com presença de lesões de cárie e DDEs. Palavras-chave: Metaloproteinase 8 da Matriz. Metaloproteinase 13 da Matriz. Metaloproteinase 20 da Matriz. Cárie Dentária. Polimorfismo Genético. Esmalte dentário.
ABSTRACT
Vasconcelos, KRF. Vasconcelos, KRF. Association between dental caries lesions and developmental enamel defects with body mass index and with polymorphisms in genes encoding metalloproteinases 8, 13 and 20 in children from Manaus - AM. Ribeirão Preto, 2018. 98p. Tese [doutorado]. Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. The objective of the present study was to evaluate the association between dental caries lesions and developmental enamel defects (DED) with body mass index and polymorphisms in gene encoding matrix metalloproteinases 8, 13 and 20 in a population of Amazonian children. The sample consisted of 221 children, aged between 9 and 12 years, of both genders, regularly enrolled in four public schools in the city of Manaus, Amazonas State, Brazil. During the clinical examination, the researchers recorded DMFT and/or dmft indexes, DED data and anthropometric data (weight and height). Parents/caregivers answered a questionnaire about children´s oral hygiene habits and diet. Saliva samples were collected as a source of genomic DNA and, using TaqMan real-time PCR, genotyping was performed of regions rs17099443 and rs3765620 in the gene encoding MMP8; rs478927 and rs2252070 in the gene encoding MMP13; and rs1784418 in the gene encoding MMP20. Data were submitted to statistical analysis using the Shapiro-Wilk, ANOVA, Tukey, Qui-quadrado, Exato de Fisher and odds ratio tests, with a significance level of 5%. According to the results, it was found that, in children with low weight, the mean number of dental caries lesions was 1.00 (SD 1.00); in the eutrophic children the mean was 1.57 (SD 2.00); in the overweight children, the mean was 1.44 (SD 1.86) and in obese children the mean was 3.12 (SD 2.63). Obese children had more dental caries lesions than eutrophic and overweight children (p<0.05). In the genes encoding MMP8, MMP13 and MMP20, the polymorphic alleles were observed more frequently in individuals with caries experience, with a significant association only for rs478927 polymorphism in the gene encoding MMP13 (p=0.043). With respect to DED, the polymorphic alleles were observed more frequently in the genes encoding MMP8, MMP13 and MMP20, with a significant association only for the rs478927 polymorphism in the gene encoding MMP13 (p=0.005). There was a significant difference in the distribution of genotypes between the control and DED groups (p = 0.017) for the gene encoding MMP13. Based on the analyzed parameters and the obtained results, it was possible to conclude that in children from Manaus-AM, caries lesions are associated with obesity, and that there was an association between gene polymorphism (rs478927) in the gene encoding MMP13 with presence of caries lesions and DED. Key Words: Matrix Metalloproteinase 8. Matrix Metalloproteinase 13. Matrix Metalloproteinase 20. Dental caries. Gene Polymorphism. Dental enamel.
SUMÁRIO
1. .............................................................................................................. 25 INTRODUÇÃO
2. .............................................................................................................. 35 PROPOSIÇÃO
.................................................................................................. 39 3. MATERIAL E MÉTODOS
.............................................................................................................. 47 4. RESULTADOS
................................................................................................................ 57 5. DISCUSSÃO
............................................................................................................... 67 6. CONCLUSÃO
................................................................................................................. 71 REFERÊNCIAS
......................................................................................................................... 85 ANEXO
.................................................................................................................... 91 APÊNDICES
1. Introdução
Introdução | 27
1. INTRODUÇÃO
De acordo com a American Public Health Association, o estado nutricional de
um indivíduo pode ser definido como a condição de saúde, influenciada pelo
consumo e utilização de nutrientes (American Public Health Association, 1995; Rossi
et al., 2008). Devido ao seu caráter multifatorial, o estado nutricional demonstra,
indiretamente, uma relação com o nível de atendimento de necessidades básicas
como alimentação, saneamento, acesso a serviços de saúde, renda e educação,
sendo um importante instrumento para a verificação da evolução das condições de
saúde e de vida da população (Pinho et al., 2010; Santos et al., 2018).
Paralelamente, sabe-se que o crescimento e desenvolvimento infantil são
sensíveis indicadores das condições de saúde e de nutrição de uma população.
Fatores ambientais como condições socioeconômicas, condições sanitárias, controle
de doenças infecciosas, renda mínima, nível de educação, industrialização e
urbanização são fatores importantes, que podem bloquear a expressão plena do
potencial genético individual (Nascimento et al., 2010). Nos últimos anos, tem sido
verificado um aumento da prevalência de excesso de peso, simultaneamente à
redução dos quadros de desnutrição. Por essa razão, a importância do conhecimento
da realidade de cada população deve ser enfatizada, para que se viabilize o
planejamento e o desenvolvimento de programas de prevenção e/ou de intervenção
voltados à população infantil (Foschini e Campos, 2010).
O Índice de Massa Corporal (IMC) expressa a relação entre o peso da criança
em relação à sua estatura ao quadrado (Ministério da Saúde, 2011). O IMC, em
crianças, modifica-se significativamente com a idade, apresentando um expressivo
aumento durante a primeira infância, diminuindo na fase pré-escolar e voltando a
aumentar na adolescência e no adulto jovem. Quando utilizado em crianças, o IMC
deve ser controlado pela idade e pelo sexo (WHO, 2006).
As alterações no estado nutricional podem ocasionar alterações no IMC,
resultando em baixo peso, sobrepeso e obesidade. A obesidade é uma doença
crônica caracterizada pelo excesso de gordura corporal, resultante do desequilíbrio
crônico entre o consumo alimentar e o gasto energético (Beraldo et al., 2004;
Mendonça e Anjos, 2004; Velasquez-Melendez et al., 2004; Peixoto et al., 2006),
28 | Introdução
enquanto o sobrepeso constitui uma proporção relativa de peso maior que a
desejável para a altura, sendo ambos de etiologia multifatorial, com influência de
fatores biológicos, psicológicos e sócio-econômicos (Giugliano e Carneiro, 2004). A
obesidade e o sobrepeso apresentam caráter epidêmico e prevalência crescente,
tanto em países desenvolvidos quanto em desenvolvimento (Júlíusson et al., 2010;
Maggio et al., 2013; Cunningham et al., 2014; Dégi et al., 2014).
A obesidade infantil tem sido cada vez mais observada mundialmente, como
um problema de saúde pública, sendo habitualmente associada com um risco
aumentado para morbidades físicas e psicossociais (National Task Force on the
Prevention and Treatment of Obesity, 2000). Por outro lado, a desnutrição ocorre
quando há deficiência no consumo de proteínas e nutrientes, que geram energia
necessária para a realização das funções do organismo (de Onis e Blossner, 2000;
Shils et al., 2016), podendo originar perda de peso e déficit de crescimento (Batista,
2003). Na literatura específica, a associação entre IMC e lesões de cárie tem sido
demonstrada por alguns autores (Almerich-Torres et al., 2016; Farsi et al., 2016;
Farsi e Elkhodary, 2017; Krishna et al., 2017), enquanto outros não evidenciaram
essa relação (Silva et al., 2016; Khadri et al., 2018; Paisi et al., 2018). Revisões
sistemáticas da literatura com metanálise (Carson et al., 2018; Chen et al., 2018)
apresentam resultados contraditórios. Portanto, apesar do grande número de
estudos investigando a associação entre essas condições em muitas populações, os
resultados são inconclusivos, justificando a realização de estudos adicionais a esse
respeito.
O esmalte dentário, tecido no qual a lesão de cárie se inicia, também pode
ser afetado por Defeitos do Desenvolvimento do Esmalte (DDEs), em função de
alterações no desenvolvimento dentário que ocorrem no período da amelogênese. Os
DDEs são comuns na população e caracterizados como alterações na estrutura do
esmalte ou perda local de sua translucidez. Essas anomalias se originam por fatores
que interferem na mineralização, podendo ter origem local, sistêmica e/ou genética
(Nikiforuk e Fraser, 1981). Existem dois tipos de DDEs: a hipoplasia do esmalte
(defeito quantitativo), que é a formação insuficiente da matriz orgânica do esmalte,
resultante de danos nos ameloblastos; e a hipomineralização (defeito qualitativo),
Introdução | 29
que é a alteração na cor/translucidez do esmalte (Aine et al., 2000; Diniz et al.,
2011).
A complexidade da etiologia dos DDEs e das lesões de cárie é indiscutível,
pois diversos fatores locais e sistêmicos são relevantes. Nos DDEs, fatores como
traumas dentofaciais (Hilgemberg et al., 2012) e fatores genéticos (Jeremias et al.,
2013) podem estar envolvidos. Já a etiologia da cárie dentária compreende diversos
fatores (microbiológicos, genéticos, sociais, comportamentais e ambientais, entre
outros), que podem interagir e contribuir para a gênese e desenvolvimento da lesão
cariosa (Bretz et al., 2005; Fisher Owens et al., 2007). Os fatores genéticos do
hospedeiro podem influenciar na capacidade tampão e pH da saliva, na morfologia
dental e na composição do esmalte, desempenhando papel fundamental no
desenvolvimento das lesões de cárie (Moreira et. al., 2007). Cabe ressaltar que a
amelogênese é um processo complexo que envolve diversos mecanismos
moleculares (Cobourne et al., 2004). Alterações nesses mecanismos podem acarretar
em DDEs, bem como em maior suscetibilidade à carie dental.
A contribuição dos fatores genéticos nas alterações citadas tem se destacado
a partir de estudos em modelos animais e estudos epidemiológicos em humanos.
Dentre os estudos com animais, alterações em regiões do cromossomo 17 (Suzuki et
al., 1998) e regiões dos cromossomos 1, 2, 7 e 8 (Nariyama et al., 2004) mostraram
estar associadas a uma maior susceptibilidade à cárie, em ratos. Entretanto, as
maiores evidências deste componente genético têm sido demonstradas por meio de
estudos com gêmeos (Boraas et al., 1988; Conry et al., 1993; Bretz et al., 2005).
Gêmeos monozigóticos compartilham genes idênticos, enquanto gêmeos dizigóticos,
assim como irmãos, compartilham a metade de seus genes segregados.
Considerando que o meio ambiente comum pode contribuir para o desenvolvimento
da cárie, gêmeos monozigóticos e dizigóticos criados separadamente logo após o
nascimento foram avaliados e o resultado da estimativa de hereditariedade para o
índice de cárie foi considerado moderadamente forte, em torno de 40% (Conry et al.,
1993). Outro estudo com gêmeos criados juntos também sugeriu que fatores
genéticos podem contribuir para a variação na experiência de cárie, com estimativas
variando entre 45 a 64% (Bretz et al., 2005).
30 | Introdução
Deeley et al., (2008) avaliaram polimorfismos em genes relacionados à
formação do esmalte dentário em indivíduos com baixa e alta experiência de cárie.
Observaram que o alelo polimórfico no gene AMELX foi associado à alta experiência
de cárie em indivíduos da Guatemala. Outro estudo com crianças da Turquia sugeriu
que variações nos genes AMBN, AMELX e TUFT1, envolvidos na formação do
esmalte, seriam capazes de modificar a suscetibilidade a cárie (Patir, Seymen et al.,
2008). Genes relacionados ao fluxo salivar e às preferências alimentares também já
foram estudados e um locus de proteção para cárie dentária no cromossomo X foi
identificado, fato este que poderia explicar as diferenças entre os sexos na
freqüência desta doença (Vieira et al., 2008).
Em 2006, Lee et al. publicaram um estudo relatando grande quantidade de
colágeno tipo I, fosfoforina e sialoproteína dentinária (DSP) em dentes com lesões de
cárie, o que mostra a síntese pelos odontoblastos tanto de colágeno quanto destas
duas proteínas não-colagenolíticas, adjacente à lesão de cárie dentinária,
demonstrando que a DSP assim como fosfoforina podem facilitar a rápida
mineralização durante a formação de dentina reacionária ou reparativa.
Alternativamente, a DSP pode agir como um ativador para as Metaloproteinases da
Matriz Extracelular (MMPs) (Lee et al., 2006).
As MMPs formam uma família de enzimas com identidade estrutural, porém
geneticamente distintas, que degradam a matriz extracelular (Bonnans et al. 2014;
Jain, Bahuguna, 2015). Estas proteases constituem uma classe de endopeptidases,
que degradam proteínas por clivagem das ligações peptídeas e desempenham
importante função na fisiologia e patologia dos tecidos. Nos processos normais, estas
enzimas participam da remodelação tecidual, da cicatrização de feridas,
embriogênese, apoptose, reações de defesa imunológica do hospedeiro e
reprodução. Também participam da patogênese de muitas doenças como em
diversas condições inflamatórias envolvendo injúria tecidual, doenças pulmonares,
doenças de pele, doenças cardíacas, doenças oftálmicas, artrites, artroses e câncer
(Sternlicht e Werb, 2001; Visse e Nagase, 2003). Dentre os diferentes papéis
atribuídos às MMPs no ambiente bucal estão vários eventos durante a odontogênese,
além da participação no desenvolvimento de processos patológicos, tais como as
doenças periodontais, as doenças pulpares inflamatórias e as lesões de cárie
Introdução | 31
(Hannas et al., 2007).
As MMPs são principalmente sintetizadas na forma latente de zimogênios
inativos (pró-MMPS) e requerem a ligação de um íon zinco ao seu sítio catalítico e a
clivagem de um domínio pró-peptídeo para tornar-se cataliticamente competentes.
Entre os 25 membros já identificados, 24 estão presentes no genoma de mamíferos
e mais especificamente, 23 em humanos (Sorsa et al., 2006; Hannas et al., 2007). A
atividade das MMPs é controlada por mudanças no equilíbrio entre a expressão e
síntese destas enzimas e seus principais inibidores endógenos, os inibidores teciduais
de metaloproteinases da matriz (TIMPs). A expressão destas enzimas é controlada
pela ativação de pró-enzimas, e pela inibição da sua atividade pelos TIMPs. Muitas
MMPs são ativadas fora das células por outras MMPs ativadas ou proteinases serinas
(Egeblad e Werb, 2002).
As MMPs dos vertebrados podem ser divididas em grupos, incluindo as
colagenases, as gelatinases, as estromelisinas, as matrilisinas, as tipo-membrana e
outras MMPs. As colagenases (MMP1, MMP8 e MMP13) clivam especificamente o
colágeno intersticial tipo I, II e III e outras moléculas da matriz extracelular.
Algumas outras MMPs não são classificadas dentre as citadas (MMP11, MMP12,
MMP19, MMP20, MMP22, MMP23 e MMP28) e possuem funções distintas (Visse e
Nagase, 2003).
No processo da lesão de cárie, ocorre a desmineralização da parte inorgânica
dos tecidos dentais, principalmente a hidroxiapatita, por ácidos produzidos pelas
bactérias. Neste processo, após a parte mineral da dentina ser dissolvida, esta expõe
a matriz orgânica deste tecido que continua a ser decomposto por enzimas
bacterianas (Featherstone, 2008). No entanto, os micro-organismos não são os
únicos responsáveis pela degradação do colágeno (Tjäderhane et al., 1998). Estudos
demonstram que as MMPs provenientes do hospedeiro desempenham um importante
papel na progressão da lesão de cárie, destruindo a matriz orgânica da dentina
(Tjäderhane et al., 1998; Sulkala et al., 2001; Hannas et al., 2007).
Durante a dentinogênese, proteínas como o colágeno são sintetizadas e
secretadas pelos odontoblastos, e após a sua organização estrutural na camada da
pré-dentina, a mineralização ocorre por deposição de cristais de hidroxiapatita. A
dentinogênese e a mineralização são fenômenos complexos que requerem o controle
32 | Introdução
de atividade enzimática extracelular. Muitas proteinases, pertencentes principalmente
às MMPs, tem importante participação nestes processos (Tjäderhane et al., 2001).
As MMPs parecem ter um grande papel na modulação da matriz dentinária,
antes e durante a progressão da lesão de cárie. Embora o mecanismo relacionado à
expressão das MMPs não esteja totalmente claro, elas participam da organização da
matriz orgânica da dentina, antes da mineralização. Os efeitos diferenciais de TGF-ß
na expressão do RNA mensageiro (mRNA) das MMPs e a síntese de proteínas,
indicam que os fatores de crescimento podem ter um papel importante na maturação
da matriz por meio da regulação das MMPs sintetizadas nos odontoblastos. Além
disso, as MMPs participam da organização das fibras de colágeno na camada da pré-
dentina, degradando as fibrilas que não vão ser incorporadas na matriz orgânica. As
metaloproteinases também podem ser necessárias para desnaturar o colágeno tipo
III, a partir da pré-dentina. Este colágeno é um componente abundante nas matrizes
de tecidos moles, mas não é normalmente observado em osso ou na dentina, e sua
remoção pode ser essencial para a mineralização adequada. Naturalmente, outras
proteínas presentes na pré-dentina necessitam ser removidas, e as MMPs podem
estar envolvidas também nestes processos (Tjäderhane et al., 2001).
De acordo com a literatura, a dentina humana contém a MMP2 (Martin de
Las Heras et al., 2000; Boushell et al., 2008), a MMP8 (Sulkala et al., 2007), a MMP9
(Mazzoni et al., 2007, Mazzoni et al., 2009) e a MMP3 (Boukpessi et al., 2008).
Embora a MMP8 tenha sido descrita como a principal MMP na dentina humana, pode
estar principalmente envolvida na organização da matriz orgânica, antes da
mineralização da dentina. A MMP13 tem a capacidade de destruir colágeno tipo II
com uma eficiência 6 a 10 vezes maior que os tipos I e III e apresenta uma atividade
de gelatinase 40 vezes mais forte que a MMP8 (Knauper et al. 1996).
Segundo Tannure et al. (2012a), as variações genéticas na MMP13 poderiam
contribuir para a susceptibilidade à cárie dentária. Por outro lado, Sulkala et al.
(2002) sugeriram que pode existir uma influência da MMP-20 na organização da
matriz dentinária, antes e durante a mineralização in vivo, concluindo que a
desmineralização ou degradação da matriz orgânica da dentina é necessária para a
MMP20 poder ser liberada da mesma, o que poderia ocorrer, por exemplo, durante a
progressão da lesão de cárie dentinária. Portanto, a MMP8, também conhecida como
Introdução | 33
colagenase-2; e a MMP13, também conhecida como colagenase-3, degradam
componentes da matriz extracelular, como colágenos, gelatinas e fibronectina
(Sulkala et al., 2004; Hannas et al., 2007; Maciejczyk et al., 2016). A MMP20 é
também conhecida como enamelisina e degrada amelogenina, a qual é a maior
proteína da matriz do esmalte (Sulkala et al., 2004; Hannas et al., 2007; Jain,
Bahuguna, 2015; Maciejczyk et al., 2016).
Em 2011, Nascimento et al. encontraram uma maior expressão das MMPs
salivares em pacientes com lesões ativas de cárie, quando comparadas com as de
pacientes com lesões crônicas, além de observarem também um leve aumento das
MMPs salivares com o aumento da profundidade das lesões (Tjäderhane et al.,
1998). Sorsa et al. (2004), demonstraram a contribuição de ambas as formas pró e
ativas de MMP8, MMP2 e MMP9 no processo de lesão de cárie.
De acordo com Chaussain-Miller et al. (2006), a inibição das MMPs por vários
inibidores e particularmente por uma substância natural (TIMP), pode ser um
potencial caminho terapêutico para evitar a progressão de lesões de cárie na
dentina. Além disso, as MMPs têm uma importante função no desenvolvimento do
esmalte, permitindo uma troca ordenada de matriz orgânica com mineral, criando
uma camada de esmalte mais dura, menos porosa e sem manchas (Lu et al., 2008).
Muitos estudos propuseram que as MMPs apresentam um importante papel na
degradação da estrutura do colágeno e na propagação da lesão de cárie (Chaussain-
Miller et al., 2006; Hannas et al., 2007; Shimada et al., 2009; Vidal et al., 2014; Jain
e Bahuguna, 2015; Mazzoni et al. 2015; Maciejczyk et al., 2016; Altinci et al. 2017;
Lewis et al. 2017).
Tendo em vista que estudos prévios sugeriram que polimorfismos genéticos
nos genes que codificam as MMPs estão associados com experiência de cárie
(Tannure et al., 2012a, Tannure et al., 2012b, Antunes et al., 2016; Karayasheva et
al., 2016; Filho et al., 2017), e levando em consideração que a genética pode
desempenhar um importante papel na susceptibilidade aos DDEs, seria plausível
hipotetizar que polimorfismos nos genes que codificam as metaloproteinases da
matriz poderiam estar associados com cárie dental e DDEs, em diferentes
populações. Polimorfismos de nucleotídeo único ou SNPs, do inglês Single nucleotide
polymorphisms, são polimorfismos de DNA onde somente uma base é alterada,
34 | Introdução
coexistindo alelos múltiplos em determinados locus em, no mínimo, 1% de uma
população. Os SNPs, dispersos por todo o genoma, ocorrem em regiões codificadoras
e não codificadoras. Nos polimorfismos de regiões codificadoras pode ocorrer uma
substituição de um aminoácido na seqüência proteica podendo levar a modificações
estruturais e funcionais na proteína, com potencial efeito biológico. Alguns SNPs
classificados como não codificadores podem modificar a estrutura e estabilidade do
RNA mensageiro e afetar a quantidade de proteína produzida. Outro tipo de
polimorfismo, também importante, é aquele localizado em regiões promotoras, pois é
capaz de alterar a expressão do gene (Chasman e Adams, 2001).
No entanto, apesar desses conhecimentos, até o momento a associação
entre cárie dentária e IMC é controversa e há pouca informação disponível na
literatura específica sobre a associação entre lesões de cárie dental e defeitos do
desenvolvimento do esmalte com polimorfismos nos genes que codificam as
metaloproteinases, em crianças, justificando a realização de estudos nessa área.
2. Proposição
Proposição | 37
2. PROPOSIÇÃO
Objetivo Geral
O objetivo geral do presente estudo foi avaliar se existe associação entre
lesões de cárie dental e defeitos do desenvolvimento do esmalte com o índice de
massa corporal e com polimorfismos nos genes que codificam as MMP8, MMP13 e
MMP20, em crianças de Manaus - AM.
Objetivos específicos
- Avaliação da associação entre os polimorfismos genéticos em MMP8,
MMP13 e MMP20 com lesões de cárie dentária.
- Avaliação da associação entre os polimorfismos genéticos em MMP8,
MMP13 e MMP20 com defeitos do desenvolvimento do esmalte.
- Avaliação da associação entre lesões de cárie dentária e índice de massa
corporal.
3. Material e M étodos
Material e Métodos | 41
3. MATERIAL E MÉTODOS
O presente estudo foi submetido à apreciação pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da Universidade do Estado do Amazonas – UEA (CAAE:
39129614.3.0000.5016; Parecer: 923.569 – Anexo A), tendo sido aprovado. Os
participantes da pesquisa e os responsáveis foram informados sobre a pesquisa e
foram incluídos no estudo após lerem e assinarem o Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (TCLE) e o Termo de Assentimento (Apêndices A e B).
A amostra foi constituída por 221 crianças de ambos os gêneros, com idade
entre 9 e 12 anos, matriculadas em 4 Escolas Públicas do município de Manaus - AM
(Escola Municipal Thomas Meirelles, Escola Municipal Paula Frassinetti, Centro
Educacional de Tempo Integral Áurea Pinheiro Braga e Escola Estadual de Tempo
Integral Gilberto Mestrinho).
Participantes portadores de síndromes, sistemicamente comprometidos,
biologicamente relacionados e usuários de aparelhos ortodônticos fixos ou removíveis
foram considerados inelegíveis para a participação neste estudo.
Anamnese e obtenção de dados sobre higiene bucal e dieta
Durante a anamnese foram coletados dados sócio-demográficos, ambientais
e culturais dos participantes na pesquisa e de seus cuidadores/responsáveis.
Informações referentes aos hábitos de higiene bucal (escovação e uso de fio dental),
uso/exposição a fluoretos (uso de dentifrício fluoretado e uso de enxaguatório bucal
com flúor) e dieta também foram coletadas, utilizando uma ficha específica
(Apêndice C).
Levantamento do índice de cárie
Uma equipe composta por 2 cirurgiões-dentistas (odontopediatras)
participaram do processo de calibração, no qual um examinador experiente em
levantamentos epidemiológicos (gold-standard) procedeu as etapas de treinamento
teórico e prático, com o objetivo de minimizar as variações e uniformizar os critérios
adotados. O índice Kappa inter-examinador obtido foi maior que 0,8.
42 | Material e Métodos
O levantamento do índice de cárie foi realizado sob luz artificial, utilizando-se
espátulas de madeira (abaixadores de língua), espelho bucal plano nº5 (Golgran, São
Paulo – SP, Brasil) e sonda do tipo ball point (Golgran, São Paulo – SP, Brasil),
preconizada pela Organização Mundial da Saúde (WHO, 2013), com o examinador
sentado à frente do participante da pesquisa. O diagnóstico de lesões de cárie, tanto
na dentição mista quanto na permanente, foi baseado na detecção de lesões no
estágio de cavitação, utilizando-se o índice ceod e/ou CPOD. Desta forma, foram
obtidos 2 grupos de crianças: livres de cárie e com lesões de cárie (onde somou-se
os índices obtidos).
Avaliação dos defeitos do desenvolvimento do esmalte (DDEs)
Para o diagnóstico dos DDEs foram utilizados os critérios do Índice
Modificado para o Desenvolvimento dos Defeitos do Esmalte (Modified DDE Index)
(FDI), apresentados na tabela 1.
Tabela 1 - Caracterização dos defeitos do desenvolvimento do esmalte (DDEs) Opacidade Difusa Espessura normal, branca e sem limites nítidos
Opacidade Demarcada Espessura normal, podendo ser branca, creme, amarelada ou castanha, com delimitação nítida
Hipoplasia Ponto ou linha horizontal, com superfície rugosa à sondagem Adaptado de: Passos IA, Costa JDMC, Melo JM, Forte FDS, Sampaio FC. Defeitos do esmalte: etiologia, características clínicas e diagnóstico diferencial. Rev Inst Ciênc Saúde. 2007; 25(2):187-92.
Após efetuar o levantamento dos DDEs, foram formados 2 grupos: crianças
livres de DDE (controle) e crianças com DDE.
Obtenção das medidas antropométricas
A altura de cada criança foi determinada em centímetros (cm), empregando
fita antropométrica (T87-2 WISO, São Paulo – SP, Brasil). O peso, em quilogramas
(Kg), foi avaliado utilizando-se um aparelho de pesagem (Balança Accumed Balmaz
Analógica, Rio de Janeiro – RJ, Brasil) (Silva et al., 2016). O Índice de Massa
Corporal (IMC) z-score foi calculado pelo Pediatric Z-Score Calculator do Hospital de
Crianças da Filadélfia (http://zscore.research.chop.edu/index.php), usando as
variáveis individuais altura, peso, idade e gênero. O status nutricional foi classificado
Material e Métodos | 43
conforme parâmetros definidos pela Organização Mundial da Saúde (WHO, 2006),
conforme pode ser observado na tabela 2.
Tabela 2 - Classificação do status nutricional, com base no IMC z-escore
Status Nutricional IMC z-score Percentil Baixo peso <-2 <3 Eutrófico ≥ -2 e ≤ +1 ≥ 3 e ≤85 Sobrepeso > +1 e ≤ +2 > 85 e ≤ 97 Obeso +2 > 97
IMC: Índice de Massa Corporal.
Avaliação dos polimorfismos genéticos
Coleta do material biológico
Amostras de saliva foram coletadas como fonte de DNA genômico, com base
em protocolo previamente publicado (Kuchler et al., 2012.) e foram armazenadas,
processadas e analisadas no Laboratório de Biologia Molecular do Departamento de
Clínica Infantil da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto – Universidade de São
Paulo. Cada criança realizou um bochecho com 5mL de solução salina, durante 1
minuto. Todo o volume do bochecho foi acondicionado em tubos para centrífuga
(Cralplast, São Paulo – SP, Brasil) de 15mL, mantidos a -20°C. Cada tubo contendo a
suspensão salivar foi centrifugado a 550G durante 10 minutos, para sedimentação do
pellet de células. O sobrenadante foi descartado em hipoclorito de sódio a 2,5% e o
pellet ressuspendido em 1mL de tampão de extração (TE) (Tris-HCl 10 mM, pH 7,8;
EDTA 5 mM; SDS 0,5%). Posteriormente, o material biológico foi transferido para um
tubo de 1,5mL e congelado a -20°C, até o momento da extração do DNA.
Extração do DNA
As amostras foram descongeladas e incubadas com 100ng/mL de Proteinase
K em banho-maria a 56°C overnight, e submetidas a processos de precipitação,
utilizando-se 400µL de solução de acetato de amônio a 10M. A seguir, todos os tubos
foram agitados manualmente por 5 minutos e centrifugados por 15 minutos (12000
rpm). O sobrenadante foi dividido em dois tubos de 700µL cada. O mesmo volume
de álcool isopropílico gelado (700µL) foi adicionado em cada tubo e agitado
44 | Material e Métodos
manualmente de maneira vigorosa. Foi observada a formação de "nuvem de DNA”
em cada tubo, que posteriormente foi centrifugada por 20 minutos, a 12000 rpm. A
seguir, o sobrenadante foi descartado cuidadosamente para não deslocar o pellet de
DNA, e 1mL de etanol a 70% gelado foi adicionado e centrifugado por 15 minutos, a
12000 rpm. Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e o tubo foi aberto e
emborcado em papel por 30 minutos, para secar e para evaporar o excesso de
etanol a 70%. O pellet de DNA foi ressuspendido em 50µL de TE e, em seguida,
congelado a -20°C.
Avaliação da quantidade e da pureza do DNA
A concentração e a pureza do DNA foram determinadas por densidade óptica
em espectrofotômetro (NanoDrop®2000c-Thermo Fisher Scientific, Walthan,
Massachusetts, EUA) utilizando-se 2µL do material extraído. A concentração de DNA
foi avaliada em um comprimento de onda de 260nm. A razão entre os valores
obtidos nos comprimentos de onda 260nm e 280nm foi usada para estimar a pureza
do DNA genômico. Somente as amostras de DNA com razão 260/280 acima de 1,8
foram incluídas neste estudo.
Seleção dos polimorfismos genéticos e genotipagem
Foram selecionados polimorfismos potencialmente candidatos ao estudo da
suscetibilidade à cárie dentária e defeitos do desenvolvimento do esmalte. Assim,
optou-se por SNPs funcionais, por serem capazes de influenciar a expressão gênica,
aumentando ou diminuindo a quantidade final da proteína codificada por aquele
gene (Shastry, 2003). Optou-se também por polimorfismos previamente associados a
patologias e alterações do desenvolvimento dentário na população brasileira (Tabela
3).
Material e Métodos | 45
Tabela 3 - Características genéticas dos polimorfismos selecionados para o estudo
Gene Sequência de
Referência Tipo de alteração Global MAF*
MMP8 rs17099443 Intron variante 0,34 MMP8 rs3765620 T [Thr] > I [Ile] 0,34 MMP13 rs478927 Intron variante 0,36 MMP13 rs2252070 upstream variant 0,36 MMP20 rs1784418 Intron Variante 0,42
Fonte de informação: dbSNP de: https://www.ncbi.nlh.nih.gov/snp/ * MAF: Minor Allele Frequency (Freqüência do Alelo Menor)
O método utilizado para as reações foi o de TaqMan (Ranade et al., 2001),
com sondas específicas para a distinção alélica. As sondas TaqMan baseiam-se na
identificação da base com uso de sondas marcadas com fluoróforos. Além do primer,
um par de sondas se anela sobre uma pequena seqüência de nucleotídeos que
contém o polimorfismo, sendo cada uma específica para um dos alelos, o polimórfico
e o tipo selvagem. As sondas apresentam um fluoróforo que absorve a energia
luminosa emitida pelo termociclador (Applied Biosystem, Califórnia, EUA), que se
dissipa na forma de luz e calor, em comprimento de onda diferente do original. Essa
fluorescência é, então, detectada pelo aparelho.
A reação de PCR em tempo real foi realizada em um volume final de 3µL
{4ng de DNA/reação, 1,5µL de TaqMan PCR master mix, 0,075 de SNP assay-by
Design (Applied Biosystems-Foster City, CA) e água deionizada q.s.p.}. Para
amplificação, 40 ciclos de 95oC foram realizados por 10 minutos, 92ºC por 15
segundos e 60ºC por 1 minuto.
Análise estatística
Os dados foram analisados utilizando-se os programas Epi Info 7 e Graph
Pad Prism 5.0 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA). O nível de
significância adotado foi de 5%.
Para a avaliação da associação entre lesões de cárie e IMC, o teste Shapiro–
Wilk foi usado para verificar a normalidade dos dados. Os testes ANOVA e Tukey
foram utilizados como meios para comparação entre os grupos de eutróficos, baixo
peso, sobrepeso e obesos.
46 | Material e Métodos
Para a avaliação da associação entre os polimorfismos nos genes que
codificam as MMP8, MMP13 e MMP20 com lesões de cárie e DDEs, os dados foram
tabulados e analizados utilizando os testes do Qui-quadrado ou exato de Fisher e a
razão de chance foi usada para comparar a distribuição dos alelos e genótipos entre
os grupos “com lesão de cárie” e “livres de cáries” e entre os grupos “com DDE” e
“sem DDE” (controle). Todas as análises foram executadas em um modelo recessivo,
dominante e aditivo. O equilíbrio Hardy-Weinberg foi avaliado utilizando o teste Qui-
quadrado para cada polimorfismo.
4. Resultados
Resultados | 49
4. RESULTADOS
Avaliação da associação entre lesões de cárie e IMC
Das 221 crianças selecionadas, 24 não compareceram na data da obtenção
do peso e da altura, sendo excluídas desta fase do estudo. Portanto, foram
estudadas 197 crianças, das quais 122 (61,9%) dentição mista e 75 (38,1%)
apresentavam dentição permanente. Oitenta e uma crianças (41,1%) eram livres de
cárie. A média de idade foi 10,27 anos e a média do IMC foi de 19,28 (DP=4,16),
sendo que todos os escores de IMC ficaram entre 12,7 e 35,74. O z-escore das
crianças avaliadas foi de -3,77 a 2,56, e o percentil de <1 a >99. Cinco crianças
(2,5%) tinham baixo peso; 127 (64,5%) eram eutróficas; 49 (24,9%) tinham
sobrepeso; e 16 (8,1%) eram obesas.
As características da população estudada encontram-se apresentadas na
tabela 4.
Tabela 4 - Características da população estudada
Gênero n(%) Masculino 96 (48,7%) Feminino 101 (51,3%) Idade Média (DP) 10,27 (0,90%) Variação 9-12 Cáries Média (DP) 1,67 (2,05) Variação 0-11 DMP: Desvio Médio Padrão.
Os hábitos de higiene bucal e informações dietéticas das crianças avaliadas
estão apresentadas na tabela 5. Não foi observada diferença estatisticamente
significante entre esses aspectos e as diferentes categorias de IMC (p>0,05).
50 | Resultados
Tabela 5 - Hábitos de higiene bucal e informações dietéticas das crianças avaliadas Escova os dentes antes de dormir? n(%) Não 18 (9,2%) Sim 175 (89,7%) Às vezes 2 (1%) Consome doces? Não 137 (69,9%) Sim 59 (30,1%) Quantas vezes escova os dentes por dia? 1 vez 4 (2,1%) 2 vezes 60 (30,8%)
3 ou mais vezes 131 (67,2%) Faz uso de bochecho? Não 135 (68,9%) Sim 61 (31,1%) Usa fio dental? Não 75 (38,3%) Às vezes 103 (52,6%) Todos os dias 18 (9,2%)
A figura 1 apresenta o índice de cárie distribuído de acordo com o status
nutricional. Nas crianças com baixo peso, a média de lesões de cárie dental foi 1,00
(DMP 1,00), nas crianças eutróficas a média de lesões de cárie dental foi de 1,57
(DMP 2,00), nas com sobrepeso a média foi de 1,44 (DMP 1,86) e nas crianças
obesas foi de 3,12 (DMP 2,63). Crianças obesas tiveram mais lesões de cárie que as
crianças eutróficas e com sobrepeso (p<0,05).
Figura 1 - Distribuição de lesões de cárie dental, de acordo com o status nutricional
* Diferença estatística significante.
Resultados | 51
Associação entre polimorfismos genéticos em MMP8, MMP13 e MMP20
com lesões de cárie e DDE
Das 221 amostras obtidas das crianças que participaram do estudo, 5 foram
perdidas, por apresentar pouca quantidade de DNA, restando um total de 216, sendo
que 108 (50%) das crianças eram meninos e 108 (50%) meninas. Cento e trinta e
uma crianças (60,7%) tinham pelo menos um dente com lesão de cárie. Crianças
livres de cárie compreenderam 85 (39,3%) do total da amostra. O índice ceo-D/CPO-
D foi de 0 a 8. Oitenta e sete (40,3%) das crianças tinham dentição mista e 129
(59,7%) tinham dentição permanente. Quarenta e três (19,9%) das crianças
apresentavam DDE em pelo menos um dente. O número de dentes afetados por DDE
foi de 0 a 9. Nenhuma criança apresentou fluorose dental. Lesões de cárie e DDEs
não estavam associados com o gênero (p>0,05).
A tabela 6 apresenta a distribuição dos genótipos e alelos entre os grupos
livres de cárie e com experiência de cárie. O polimorfismo rs478927 na MMP13
estava associado com experiência de cárie, no modelo recessivo (TT x CC+CT) e TT
aumentou a chance de ter lesões de cárie (OR=1,8, CI95% 1,0-3,3; p=0,047).
Carrear o alelo T também aumentou a chance de apresentar lesões de cárie
(OR=1,5, CI95% 1,0-2,2; p=0,043). Os outros polimorfismos estudados não
apresentaram associação com lesões de cárie (p>0,05).
Tabela 6 - Genótipo e distribuição alélica dos polimorfismos nos genes que codificam MMP8, MMP13 e MMP20, em crianças livres de cárie e com lesão de cárie
*: indica que houve diferença estatisticamente significante RC: média de Razão de Chance IC: média de Intervalo de Confiança.
Gene/
polimorfismo Grupos Genótipo n (%) p-valor Alelo n (%) p-valor RC (95%IC)
MMP8
rs17099443
CC CG GG
0,488
C G
0,375 0,83 (0,56 – 1,24) Com lesão de cárie 25 (19,23) 46 (35,38) 59 (45,39) 96 (36,92) 164 (63,08)
Livres de cárie 22 (25,88%) 26 (30,59%) 37 (43,53%) 70 (41,18%) 100 (57,82%)
MMP8
rs3765620
GG GA AA
0,126
G A
0,277 1,25 (0,83 – 1,88) Com lesão de cárie 40 (33,90%) 39 (33,05%) 39 (33,05%) 119 (50,42%) 117 (49,58%)
Livres de cárie 17 (22,07%) 35 (45,45%) 25 (32,48%) 69 (44,80%) 85 (55,20%)
MMP13
rs478927
CC CT TT
0,139
C T
0,043* 0,65 (0,44 – 0,98) Com lesão de cárie 31 (25,41%) 38 (31,14%) 53 (43,45%) 100 (40,98%) 144 (59,02%)
Livres de cárie 25 (32,05%) 30 (38,46%) 23 (29,49%) 80 (51,28%) 76 (48,72%)
MMP13
rs2252070
CC CT TT
0,659
C T
0,380 0,82 (0,53 – 1,27) Com lesão de cárie 12 (9,677%) 45 (36,30%) 67 (54,03%) 69 (24,82%) 179 (75,18%)
Livres de cárie 9 (11,25%) 33 (41,25%) 38 (47,5%) 51 (31,87%) 109 (68,13%)
MMP20
rs1784418
TT TC CC
0,504
T C
0,479 0,86 (0,58 – 1,28) Com lesão de cárie 39 (30%) 46 (35,38%) 45 (34,62%) 124 (47,69%) 136 (52,31%)
Livres de cárie 25 (30,12%) 35 (42,17%) 23 (27,71%) 85 (51,20%) 81 (48,80%)
Resultados | 53
A tabela 7 apresenta a distribuição dos genótipos e alelos entre crianças com
DDE e sem DDE (grupo controle). No polimorfismo rs478927 na MMP13 o genótipo
estava associado com DDE no modelo aditivo (p=0,017) e, também, no modelo
recessivo (TT x CC+CT) e TT aumentou a chance de ter DDE (OR=2,7, CI95% 1,3-
5,5; p=0,004). Na análise da distribuição dos alelos, carrear o alelo T também
aumentou a chance de apresentar DDE (OR=2,0, CI95% 1,2-3,4; p=0,005). Os
outros polimorfismos estudados não apresentaram associação com DDE (p>0,05).
Tabela 7 - Genótipo e distribuição alélica dos polimorfismos nos genes que codificam MMP8, MMP13 e MMP20, em crianças com DDE (defeitos de desenvolvimento do esmalte) e sem DDE (controle)
Gene/
polimorfismo Grupos Genótipo n (%) p-valor Alelo n(%) p-valor RC (95%IC)
MMP8
rs17099443
CC CG GG
0,817
C G
0,585 1,14 (0,70 – 1,87) Controle 38 (22,09%) 59 (34,30%) 75 (43,61%) 135 (39,24%) 209 (60,76%)
DDE 9 (20,93%) 13 (30,23%) 21 (48,84%) 31 (36,05%) 55 (63,95%)
MMP8
rs3765620
GG GA AA
0,339
G A
0,101 0,65 (0,39 – 1,09) Controle 43 (27,22%) 60 (37,97%) 55 (34,81%) 146 (46,20%) 170 (53,80%)
DDE 14 (37,84%) 14 (37,84%) 9 (24,32%) 42 (56,76%) 32 (43,24%)
MMP13
rs478927
CC CT TT
0,017*
C T
0,005* 2,06 (1,22 – 3,48)
Controle 48 (30%) 59 (36,87%) 53 (33,13%) 155 (48,44%) 165 (51,56%)
DDE 8 (20%) 9 (22,5%) 23 (57,5%) 25 (31,25%) 55 (68,75%)
MMP13
rs2252070
CC CT TT
0,333
C T
0,130 2,12 (1,19 – 3,80) Controle 19 (11,58%) 64 (39,03%) 81 (49,39%) 102 (31,10%) 226 (68,90%)
DDE 2 (5%) 14 (35%) 24 (60%) 18 (22,5%) 62 (77,5%)
MMP20
rs1784418
TT TC CC
0,085
T C
0,496 0,84 (0,52 – 1,36) Controle 47 (27,48%) 71 (41,52%) 53 (31%) 165 (48,25%) 177 (51,75%)
DDE 17 (40,48%) 10 (23,81%) 15 (35,71%) 44 (52,38%) 40 (47,62%)
*: indica que houve diferença estatisticamente significante RC: média de Razão de Chance IC: média de Intervalo de Confiança.
Resultados | 55
A análise da comparação de crianças com ambas as condições (lesão de
cárie e DDE) com crianças livres de cárie e sem DDE demonstrou uma forte
associação com o polimorfismo rs478927 na MMP13 (p=0,001) no modelo aditivo.
No modelo recessivo (TT x CC+CT), crianças que carrearam o genótipo TT tinham
aproximadamente seis vezes mais chance de ter a ocorrência concomitante dessas
duas condições (OR=5,8, CI95% 2,1-15,8; p=0,0003).
5. Discussão
Discussão | 59
5. DISCUSSÃO
Associação entre IMC e lesões de cárie
O presente estudo foi realizado na cidade de Manaus, capital do estado do
Amazonas, que é uma grande cidade no Norte do Brasil e a sexta economia do país
(IBGE, 2010). Esses aspectos sócioeconômicos de Manaus provavelmente refletem a
prevalência de cárie observada nesse trabalho, no qual quase metade das crianças
estudadas estavam livres de cárie e a média de dentes cariados, perdidos e
obturados foi de 1,67. Resultados similares foram observados no último
levantamento efetuado no Brasil, em 2010 (Brasil, 2011), que evidenciou que 44%
das crianças brasileiras estavam livres de cárie aos 12 anos, e nessa idade o ceo-
d/CPO-D foi de 2,34 nas crianças de Manaus. Em relação à água de abastecimento
público na cidade de Manaus, somente a partir de 2015 a concentração de fluoreto
presente na água começou a ser ajustada, alcançando cerca de 80% da população
(Rede Vigifluor, 2017). Esse fato pode explicar porque, no presente estudo,
nenhuma criança foi diagnosticada com fluorose.
Alterações no estilo de vida e na dieta tem sido aceleradas em função da
industrialização, urbanização, desenvolvimento econômico e mercado globalizado em
muitas regiões, incluindo Manaus. Essas mudanças no estilo de vida e dieta têm sido
impactantes sobre a nutrição e saúde bucal, principalmente em função do alto
consumo de carboidratos e pouca atividade física, particularmente entre os jovens.
Como resultado, a prevalência de crianças obesas aumentou muito, em todas as
partes do mundo, tornando-se um grande problema de saúde pública, com
consequências graves (Cole et al., 2000). De acordo com dados da Fiocruz de 2017,
no Brasil, 15% das crianças são obesas (Fiocruz, 2017). Embora a associação entre
IMC e cárie dental seja inconclusiva (Silva et al., 2016; Khadri et al., 2018; Paisi et
al., 2018), alguns autores demostraram uma associação entre cárie dental e
obesidade em crianças (González et al., 2013; Aluckal et al., 2016; Almerich-Torres
et al., 2016; Farsi et al., 2016; Farsi e Elkhodary, 2017; Krishna et al., 2017). No
presente estudo essa associação também foi observada, em crianças de Manaus.
É bem conhecido que obesidade e cárie dental apresentam alguns fatores de
risco comuns, tais como alta ingestão de calorias e uso de dietas cariogênicas (Silva-
60 | Discussão
Sanigorski et al., 2011). Contudo, nesse estudo não foi encontrada associação entre
o consumo de doces, cárie dental e obesidade. Isso talvez possa ser atribuído ao fato
de que os dados foram obtidos por meio de informações subjetivas, fornecidas pelos
pais, cuja capacidade de reprodução das informações sobre hábitos de dieta pode
não ser adequada ou sub-dimensionada.
No presente estudo, quando analisou-se IMC e presença de lesão de cárie,
observou-se que as crianças obesas de Manaus tiveram mais lesões de cárie dental
que as crianças eutróficas e com sobrepeso, corroborando com os achados de
Almerich-Torres et al. (2016), Farsi et al. (2016), Farsi e Elkhodary (2017) e Krishna
et al. (2017). Entretanto, outros autores não demonstraram essa relação (Silva et al.,
2016; Khadri et al., 2018; Carson, 2018; Paisi et al., 2018). Alguns estudos recentes
não encontraram uma associação entre cárie dental e obesidade, quando avaliaram a
cárie precoce da infância (Aluckal et al., 2016; Krishna et al., 2017) e cárie dental em
crianças e adolescentes (Almerich-Torres et al., 2016; Farsi et al., 2016; Guizar et al.,
2016; Liang et al., 2016; Farsi e Elkhodary, 2017; Krishna et al., 2017; Kumar et al.,
2017; Quadri et al., 2017), evidenciando que essa associação pode ser variável, de
acordo com a população avaliada.
De acordo com o Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CCPD), a
obesidade na infância tem efeitos imediatos e a longo prazo sobre a saúde oral e
geral (Petersen, 2004). No presente estudo verificou-se que crianças obesas de
Manaus apresentam um maior número de lesões de cárie dentária que aquelas com
baixo peso, o que evidencia a necessidade de implementar estratégias para melhorar
os cuidados com a saúde, incluindo atenção nutricional e odontológica para os
escolares.
A associação entre desnutrição (baixo peso) e cárie dental também vem
sendo relatada. Crianças brasileiras com baixo peso (Soares et al., 2017) e crianças
indianas (Aluckal et al., 2016) têm grande quantidade de cárie precoce da infância.
Aos 12 anos meninos sauditas com baixo peso tiveram duas vezes mais risco de
desenvolver cárie dental (Bhayat et al., 2016). Resultados semelhantes foram
também observados em crianças indígenas (Chauhan et al., 2016), no qual a cárie
dental severa aumenta com a gravidade da desnutrição. No presente estudo, apenas
Discussão | 61
2,5% das crianças tinham baixo peso, o que não permitiu uma conclusão mais
fundamentada, em função do pequeno número de indivíduos com essa condição.
Associação entre polimorfismos nos genes que codificam MMP8, MMP13 e
MMP20 com lesões de cárie e DDE
Pesquisas de associação são instrumentos para a identificação de variantes
genéticas que predispõem a doenças complexas e multifatoriais (Li et al., 2006). O
objetivo é verificar se um determinado genótipo ou alelo de um gene candidato está
associado à alteração permitindo, assim, a identificação de genes que podem estar
envolvidos com o fenótipo em questão. Estes estudos podem ser realizados
avaliando famílias de indivíduos afetados ou avaliando indivíduos não relacionados
entre si (Farrall e Holder, 1992), como foi realizado no presente trabalho. Os estudos
com indivíduos não relacionados biologicamente são mais comumente utilizados por
permitirem um recrutamento de maior número de indivíduos, sem a necessidade de
incluir seus familiares.
No presente estudo, foram utilizados os índices ceo-d e CPO-D, preconizados
pela Organização Mundial de Saúde (WHO, 1997), empregados em estudos prévios
sobre associações entre polimorfismos genéticos e cárie dentária (Slayton et al.,
2005; Deeley et al., 2008; Patir et al., 2008; Lips et al., 2017; Oliveira et al., 2018).
No estudo de Slayton et al. (2005), a amostra foi composta por crianças de 3 a 5
anos e lesões de cárie incipientes (manchas brancas) foram consideradas durante a
avaliação. A metodologia empregada no estudo de Patir et al. (2008) foi semelhante,
entretanto somente lesões cavitadas foram consideradas durante o exame clínico.
Em um estudo realizado por Deeley et al. (2008), os autores estratificaram a amostra
em indivíduos com baixa experiência de cárie e indivíduos com alta experiência de
cárie na dentição permanente e as lesões de mancha branca ativa não foram
consideradas. No estudo de Tannure et al. (2011) a amostra foi estratificada em dois
grupos principais (com e sem experiência de cárie), e não consideraram as manchas
brancas. No presente estudo, optou-se por estratificar a amostra em dois grupos:
com e sem lesões de cárie. Apesar das manchas brancas ativas serem consideradas
a primeira manifestação clínica da doença cárie, nesta pesquisa optou-se por não
considerá-la durante o exame clínico. Desta maneira, o critério de diagnóstico
62 | Discussão
adotado não levou em conta o diagnóstico precoce de lesões de cárie, uma vez que
considerou-se a presença de lesão de cárie somente quando foram observadas
lesões cavitadas.
No presente estudo objetivou-se também avaliar a contribuição genética na
etiologia das lesões de cárie. Vários fatores de confusão que poderiam interferir nos
resultados foram controlados na população de Manaus estudada, pois apresenta
hábitos culturais, dieta e higiene bucal semelhantes. Com relação à exposição aos
fluoretos, supõe-se que devido à localização geográfica das escolas e da residência
das crianças, todos tinham o benefício de consumir água de abastecimento público
fluoretada. Além disso, todos os indivíduos que compuseram a amostra desta
pesquisa faziam uso de dentifrício fluoretado.
Com relação à fase laboratorial para a análise da variação no DNA, no
presente estudo foi a selecionada a técnica de PCR em Tempo Real. Esta técnica
trata-se de uma variação da PCR convencional, onde ocorre uma amplificação
enzimática de uma seqüência específica de DNA, com a finalidade de se obter
milhões de cópias desta. Optou-se ainda em utilizar o sistema Taqman®, proposto
por Ranade et al. (2001) que apresenta alta especificidade. Dentre as vantagens do
uso do PCR em tempo real em relação ao convencional destacam-se a automatização
e rapidez do método, uma vez que a análise na eletroforese em gel de agarose é
dispensada (Valarini et al., 2011). O método Taqman® consiste na utilização de
sondas fluorescentes alelo-específicas, que combinam as etapas de amplificação e
detecção dos alelos em uma única etapa e elimina a necessidade de procedimentos
adicionais para a determinação do genótipo. A fluorescência é medida durante a
reação de PCR e os genótipos inferidos a partir desses valores. Assim, o método
Taqman® elimina viés por erro de interpretação, pois os genótipos são gerados
automaticamente, sem interferência da análise humana. Esta é uma técnica de custo
elevado, devido à necessidade de se usar um equipamento especial com filtros para
detecção de fluorescências em diferentes comprimentos de onda e do alto custo das
sondas fluorescentes (Ranade et al., 2001). Entretanto, a simplicidade da técnica e a
confiabilidade dos resultados consagraram o método Taqman® como uma
importante ferramenta para o estudo de associação de diversos genes com
alterações e doenças complexas.
Discussão | 63
Para a avaliação da associação com a lesão de cárie e DDEs na amostra
estudada, no presente estudo optou-se por selecionar polimorfismos em genes
envolvidos no desenvolvimento do esmalte e no processo carioso. Foram
selecionados polimorfismos funcionais nas regiões promotoras dos genes que
codificam MMP8, MMP13 e MMP20, que afetam a fase de transcrição. A síntese
proteica se dá em duas fases: transcrição e tradução. A transcrição é o processo pelo
qual a informação genética é transmitida do DNA para o RNA e inicia-se quando a
enzima catalisadora da síntese de RNA se liga à região promotora. A tradução é o
segundo evento na síntese proteica, consistindo na transmissão da informação
genética do RNA mensageiro para a síntese de um polipeptídeo (Robinson e Borges-
Osório, 2006).
A MMP8 foi selecionada, pois tem despertado interesse por ser encontrada
em várias doenças inflamatórias, como periodontite, bronquite, asma e artrite.
Também, tem sido demonstrado exercer uma inesperada atividade anti-inflamatória
defensiva e protetora contra o espalhamento do câncer de pele e doença
inflamatória pulmonar, provavelmente por processar citocinas anti-inflamatórias e
quimiocinas, bem como regular a apoptose de células inflamatórias e a resposta
imune (Lauer-Fields et al., 2002; Balbín et al., 2003; Owen et al., 2004; Gueders et
al., 2005). Já o gene MMP-13 leva a um aumento da transcrição do gene nos
indivíduos portadores do alelo selvagem A e foi associado à artrite reumatóide
(Rodriguez-Lopez, Perez-Pampin et al., 2006).
O polimorfismo rs1784418 no gene MMP20 localiza-se na região de íntron 1,
região não-codificadora que é transcrita, porém não traduzida. A MMP20 foi
selecionada, devido a esse polimorfismo já ter sido analisado na população brasileira
e ter apresentado um desequilíbrio entre indivíduos afetados e não afetados pela
agenesia dentária (Kuchler et al., 2011).
Sabe-se que a cárie dentária é considerada uma doença de caráter
multifatorial. Pesquisas têm buscado evidências de um componente genético na sua
etiologia por meio de estudos com genes envolvidos no desenvolvimento do esmalte
dentário (Deeley et al., 2008; Patir et al., 2008; Piekoszewska-Ziętek et al., 2017).
Já foi evidenciada a influência dos fatores genéticos na estrutura do esmalte,
por exemplo, pela observação de pacientes portadores de distúrbios ligados aos
64 | Discussão
cromossomos sexuais. Foi demonstrado que indivíduos 47, XXX possuem o esmalte
mais espesso que indivíduos normais, enquanto que indivíduos 45, X, portadores da
síndrome de Turner, possuem esmalte com menor espessura (Alvesalo et al., 1987).
Porém, durante a formação do esmalte, diferentes proteinases, secretadas
pelos ameloblastos, são expressas exercendo funções importantes, porém distintas.
Estas enzimas modificam e/ou degradam proteínas da matriz extracelular e,
consequentemente, afetam a interação entre as proteínas e o desenvolvimento dos
cristais de hidroxiapatita (Simmer e Hu, 2002). Assim, estudos têm sugerido que as
MMPs apresentam uma função primordial no controle e na progressão da lesão
cariosa, tanto em esmalte como em dentina (Dung et al., 1995; Tjaderhane et al.,
1998; Karayasheva et al., 2016; Filho et al., 2017).
Adicionalmente, as MMPs têm demonstrado um importante papel na
formação do esmalte e dentina, na progressão da cárie e na degradação da camada
híbrida (Slayton et al., 2005; Deeley et al., 2008; Patir et al., 2008; Nascimento et
al., 2011; Niu et al., 2011). Interessantemente, o presente trabalho determinou
evidências de que o polimorfismo genético rs478927 na MMP13 é funcional e
apresenta um importante papel na formação do esmalte e, mais tarde, no
estabelecimento da lesão de cárie.
É importante destacar que a associação entre cárie dentária e DDE também
tem sido observada por vários pesquisadores. Uma recente metanálise mostrou que
indivíduos com DDE apresentam duas vezes mais chance de ter experiência de cárie
na dentição permanente (Vargas-Ferreira et al., 2015). É possivel que essas duas
condições tenham alguns fatores etiológicos comuns, e aqui nós propusemos que a
MMP13 possa ser um fator genético comum para o risco de ambas lesões de cárie e
DDEs.
Estudo prévio realizado com crianças e adolescentes brasileiros do Rio de
Janeiro demonstrou que o polimorfismo genético rs2252070 na MMP13 estava
associado com experiencia de cárie (Tannure et al., 2012a). Também, o polimorfismo
genético rs2252070 na MMP13 não estava associado com o risco de desenvolver
fluorose dental (Kuchler et al., 2017). No entanto, esse mesmo polimorfismo, no
presente estudo, não estava associado com lesão de cárie nem com DDE em
crianças de Manaus.
Discussão | 65
Investigações epidemiológicas genéticas têm algumas limitações obvias. O
presente estudo não avaliou os mecanismos da expressão das MMPs avaliadas,
durante a formação do esmalte. Contudo, baseado em nossos resultados, é possível
verificar que a MMP13 apresenta um importante papel no desenvolvimento do
esmalte. Um estudo realizado com modelos animais demonstrou que a MMP13 é
expressa durante o estágio de botão do desenvolvimento dental (Morris-Wilman et
al., 2000). Assim, a variação na expressão de MMP13 em humanos devido aos alelos
polimórficos pode produzir um esmalte com alterações no fenótipo, o qual pode
abranger um fenótipo de DDE. Esse esmalte alterado pode ser mais susceptivel à
cárie dentária, apesar de não apresentar nenhuma outra alteração clínica óbvia.
Estudos prévios têm demonstrado que genes envolvidos no desenvolvimento do
esmalte estão associados com susceptibilidade à cárie dentária (Piekoszewska-Ziętek
et al., 2017) e DDE (Jeremias et al., 2013; Jeremias et al., 2016). Nosso estudo
evidencia que o polimorfismo rs478927 na MMP13 está envolvido em ambas as
condições.
Assim, no presente estudo foi evidenciado que o polimorfismo genético
rs478927 em MMP13 está associado com lesão de cárie e DDE, em crianças, e que
os demais polimorfismos avaliados em MMP8 e MMP20 não estavam associados com
essas condições.
De acordo com a literatura, outros polimorfismos em MMP20 foram
associados com uma variedade de condições e alterações do esmalte, tais como
desmineralização do esmalte em um modelo de biofilme com Streptococcus mutans
(Pang et al., 2017), cárie precoce na infância (Antunes et al., 2016) e
hipomineralização do esmalte (Jeremias et al., 2016). Uma meta-análise recente
concluiu que o polimorfismo rs1784418 na MMP20 comportou-se como protetor
contra a cárie dentária, porém esses efeitos foram mais marcantes em certas
populações (Filho et al., 2017), o que provavelmente explica a falta de associação no
presente estudo, com a MMP20.
Embora polimorfismos genéticos em MMP8 nunca tenham sido associados
com cárie dentária em humanos, polimorfismos nesses genes são candidatos para
estudo da etiologia da doença cárie, devido ao seu papel importante. A atividade da
MMP8 é importante na desmineralização da dentina, durante progressão da lesão de
66 | Discussão
cárie (Hedenbjörk-Lager et al., 2016) e, também, pacientes com lesões de cárie tem
níveis elevados de MMP-8 na saliva (Hedenbjörk-Lager et al., 2015). No presente
estudo, ambos os polimorfismos estudados em MMP8 não estavam associados com
lesões cárie. No entanto, é possivel que outros polimorfismos nesses genes tenham
um papel na suscetibilidade individual à cárie dentária.
Finalizando, ressalta-se que os progressos no conhecimento da biologia
molecular e do genoma humano forneceram evidências de que a maioria das
doenças humanas é influenciada por alterações em estruturas genéticas (Valarini et
al., 2011). Pesquisas que avaliam a contribuição genética a diferentes patologias
estão sendo realizados e, dentre estas, os estudos de polimorfismos tem se
destacado na literatura mundial. O conhecimento das MMPs juntamente com a
identificação de indivíduos que carreiam alelos polimórficos permitiria sua utilização
como marcadores possibilitando, assim, a identificação de indivíduos mais
susceptíveis a determinadas patologias. Existe ainda um interesse crescente no
desenvolvimento de pesquisas de inibidores biológicos de MMPs, que possam ser
utilizados com sucesso e segurança na clínica odontológica (Navarro et al., 2006;
Gawron et al., 2018; Gho et al., 2018).
Deve ser enfatizado que, em função da ausência de trabalhos publicados na
literatura específica avaliando a associação entre polimorfismos nos genes que
codificam as MMPs, em crianças acometidas pela doença cárie e por defeitos do
desenvolvimento do esmalte, a discussão mais aprofundada dos resultados torna-se
impossibilitada.
6. Conclusão
Conclusão | 69
6. CONCLUSÃO
Com base nas metodologias empregadas e nos resultados obtidos no
presente estudo, pôde-se concluir que:
- Lesões de cárie estão associadas com obesidade.
- Houve associação entre o polimorfismo genético rs478927 em MMP13
com lesões de cárie e defeitos do desenvolvimento do esmalte.
R eferências
Referências | 73
REFERÊNCIAS Aine L, Backström MC, Mäki R, Kuusela AL, Koivisto AM, Ikonen RS, et al. Enamel defects in primary and permanent teeth of children born prematurely. J Oral Pathol Med. 2000; 29(8):403-9.
Almerich-Torres T, Montiel-Company JM, Bellot-Arcís C, Almerich-Silla JM.
Relationship between caries, body mass index and social class in Spanish children. Gac Sanit. 2016.
Altinci P, Seseogullari-Dirihan R, Can G, Pashley D, Tezvergil-Mutluay A. Zinc Inhibits Collagenolysis by Cathepsin K and Matrix Metalloproteinases in Demineralized Dentin Matrix. Caries Res 2017; 51:576–581.
Aluckal E, Anzil K, Baby M, George EK, Lakshmanan S, Chikkanna S. Association between Body Mass Index and Dental Caries among Anganwadi Children of Belgaum City, India. J Contemp Dent Pract. 2016 Oct 1; 17(10):844-848.
Alvesalo L, Tammisalo E, et al. 47, XXX females, sex chromosomes, and tooth crown structure. Hum Genet, v.77, n.4, Dec, p.345-8. 1987.
American Public Health Association. APHA policy statement 1995-11: The environment and children’s health; 1995. Available at: http://www.apha.org/advocacy/policy/policysearch/default.htm?id=106. Accesso em 15/08/2017.
Antunes LA, Antunes LS, Küchler EC, Lopes LB, Moura A, Bigonha RS, Abreu FV, Granjeiro JM, de Amorim LM, Paixão IC: Analysis of the association between polymorphisms in MMP2, MMP3, MMP9, MMP20, TIMP1, and TIMP2 genes with white spot lesions and early childhood caries. Int J Paediatr Dent 2016; 26:310-9.
Balbín M, Fueyo A, Tester AM, Pendás AM, Pitiot AS, Astudillo A, Overall CM, Shapiro SD, López-Otín C. Loss of collagenase-2 confers increased skin tumor susceptibility to male mice. Nat Genet. 2003; 35(3):252-7.
Batista FM. Alimentação, nutrição e saúde. In: Rouquayrol MZ, Almeida Filho N. Epidemiologia e saúde. 6a ed. Rio de Janeiro: Medsi p. 389-414; 2003.
Beraldo FC, Vaz IML, Naves MMV. Nutrição, Atividade Física e Obesidade em Adultos: Aspectos Atuais e Recomendações para Prevenção e Tratamento. Revista Médica de Minas Gerais. Goiânia. 2004; 14(1):57-62.
Bhayat A, Ahmad MS, Fadel HT. Association between body mass index, diet and dental caries in Grade 6 boys in Medina, Saudi Arabia. East Mediterr Health J. 2016 Dec 12; 22(9):687-693.
Bonnans C, Chou J, Werb Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014; 15(12):786-801.
74 | Referências
Boraas JC, Messer LB, et al. A genetic contribution to dental caries, occlusion, and morphology as demonstrated by twins reared apart. J Dent Res. 1988 Sep; 67 (9):1150-5.
Boukpessi T, Menashi S, Camoin L, Tencate JM, Goldberg M, Chaussain-Miller C. The effect of stromelysin-1 (MMP-3) on non-collagenous extracellular matrix proteins of demineralized dentin and the adhesive properties of restorative resins.Biomaterials. 2008; 29: 4367-4373.
Boushell LW, Kaku M, Mochida Y, Bagnell R, Yamauchi M. Immunohistochemical localization of matrixmetalloproteinase-2 in human coronal dentin. Archives of Oral Biology. 2008; 53:109–116.
Brasil. Ministério da Saúde (MS). Projeto SB Brasil 2010: resultados principais. Brasília: MS; 2011.
Bretz WA, Corby PM, et al. Dental caries and microbial acid production in twins. Caries Res. 2005 May-Jun; 39 (3): 168-72.
Carson SJ. No consistent association found between dental caries and body mass index in children. Evid Based Dent. 2018 Jun; 19(2):38-39.
Chasman D, Adams RM. Predicting the functional consequences of non-synonymous single nucleotide polymorphisms: structure-based assessment of amino acid variation. J Mol Biol. 2001 Mar 23; 307 (2):683-706.
Chauhan A, Nagarajappa S, Dasar PL, Mishra P. Association of body mass index with dental caries among malnourished tribal children of Indore division. Clujul Med. 2016 Oct 20; 89(4):542-547.
Chaussain-Miller C, Fioretti F, Goldberg M, Menashi S. The Role of Matrix Metalloproteinases (MMPs) in Human Caries. Journal of Dental Research. 2006; 85 (1):22-32.
Chen D, Zhi Q, Zhou Y, Tao Y, Wu L, Lin H. Association between Dental Caries and BMI in Children:A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Res. 2018; 52(3):230-245.
Cobourne MT, Miletich I, Sharpe, PT. Restriction of sonic hedgehog signalling during early tooth development. Development 2004; 131(12):2875-2885.
Cole TJ, Bellizzi MC, Flegal KM, et al. Establishing a standard definition for child overweight and obesity worldwide: international survey. BMJ. 2000; 320:1240–3.
Conry JP, Messer LB, et al. Dental caries and treatment characteristics in human twins reared apart. Arch Oral Biol. 1993 Nov; 38 (11): 937-43.
Cunningham SA, Kramer MR, Narayan KM. Incidence of childhood obesity in the United States. N Engl J Med. 2014; 370(5):403-11.
Referências | 75
De Onis M, Frongillo EA, Blössner M- Is malnutrition declining? An analysis of changes in levels of child malnutrition since 1980. Bull World Health Organ. 2000; 78(10):1222-33.
Deeley K, Letra A, et al. Possible association of amelogenin to high caries experience in a Guatemalan-Mayan population. Caries Res. 2008; 42(1): 8-13.
Dégi AA, Kis E, Kerti A, Cseprekál O, Szabó AJ, Reusz GS. Prevalence of obesity and metabolic changes after kidney transplantation: Hungarian pediatric cohort study. Transplant Proc. 2014; 46:2160–3.
Diniz MB, Coldebella CR, Zuanon ACC, Cordeiro RCL. Alterações orais em crianças prematuras e de baixo peso ao nascer: a importância da relação entre pediatras e odontopediatras. Rev. Paul. Pediatr. 2011 Set; 29(3):449-55.
Dung SZ, Gregory RL, et al. Effect of lactic acid and proteolytic enzymes on the release of organic matrix components from human root dentin. Caries Res. 1995;29(6); 483-9.
Egeblad M, Werb Z. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression.Nature Reviews. Cancer. 2002; 2(3); 161-174.
Farrall M, Holder S. Familial recurrence-pattern analysis of cleft lip with or without cleft palate. Am J Hum Genet. 1992 Feb; 50(2): 270-7.
Farsi DJ, Elkhodary HM. The prevalence of overweight/obesity in high school adolescents in Jeddah and the association of obesity association with dental caries. Ann Saudi Med. 2017; 37(2): 114-121.
Farsi DJ., Heba Elkhodary M, Merdad LA, Farsi NMA, Alaki SM, Alamoudi NM, Bakhaidar HA, Alolayyan MA. Prevalence of obesity in elementary school children and its association with dental caries. Saudi Med J 2016; 37 (12): 1387-1394.
FDI. A review of the developmental defects of enamel index (DDE index). Commission on Oral Health, Research & Epidemiology. Report of an FDI Working Group. Int Dent J. 1992 Dec; 42(6): 411-26.
Featherstone JDB. Dental caries: a dynamic disease process. Australian Dental Journal. 2008; 53: 286–291.
Filho AV, Calixto MS, Deeley K, Santos N, Rosenblatt A, Vieira AR. MMP20 rs1784418 Protects certain populations against caries. Caries Res. 2017; 51:46-51.
FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz. Disponível em: www.fiocruz.br/biosseguranca/Bis/infantil/obesidade-infantil.htm. Acesso em: 15 de setembro de 2017.
Fisher-Owens SA1, Gansky SA, Platt LJ, Weintraub JA, Soobader MJ, Bramlett MD, Newacheck PW. Influences on children's oral health: a conceptual model. Pediatrics. 2007 Sep; 120(3):e510-20.
76 | Referências
Foschini RLA, Campos JADB. Indicadores antropométricos do estado nutricional de pré-escolares em Araraquara, SP. Alim Nutr 2010; 21(3): 349-55.
Gawron K, Ochała-Kłos A, Nowakowska Z, Bereta G, Łazarz-Bartyzel K, Grabiec AM, Plakwicz P, Górska R, Fertala A, Chomyszyn-Gajewska M, Potempa J. TIMP-1 association with collagen type I overproduction in hereditary gingival fibromatosis. Oral Dis. 2018 Jul 10.
Gho WG, Choi Y, Park KH, Huh JK. Expression of collagenases (matrix metalloproteinase-1, 8, 13) and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 of retrodiscal tissue in temporomandibular joint disorder patients. J Korean Assoc Oral Maxillofac Surg. 2018 Jun;44(3):120-127.
Giugliano R, Carneiro EC. Fatores associados à obesidade em escolares. J Pediatr, Rio de Janeiro. 2004; 80(1):17-22.
González Muñoz M, Adobes Martín M, González de Dios J. Systematic review about dental caries in children and adolescents with obesity and/or overweight.Nutr Hosp. 2013 Sep-Oct;28(5):1372-83.
Gueders MM, Balbin M, Rocks N, Foidart JM, Gosset P, Louis R, Shapiro S, Lopez-Otin C, Noël A, Cataldo DD. Matrix metalloproteinase-8 deficiency promotes granulocytic allergen-induced airway inflammation. J Immunol. 2005; 175(4):2589-97.
Guizar JM, Muñoz N, Amador N, Garcia G. Association of Alimentary Factors and Nutritional Status with Caries in Children of Leon, Mexico. Oral Health Prev Dent. 2016; 14(6):563-569.
Hannas AR, Pereira JC, Granjeiro JM, Tjardeharne L. The role matrix metalloproteinases in the oral environment. Acta Odontologica Scandinavica. 2007; 65 (1): 1-13.
Hedenbjörk-Lager A, Hamberg K, Pääkkönen V, Tjäderhane L, Ericson D: Collagen degradation and preservation of MMP-8 activity in human dentine matrix after demineralization. Arch Oral Biol. 2016; 68: 66-72.
Hedenbjörk-Lager A, Bjørndal L, Gustafsson A, Sorsa T, Tjäderhane L, Åkerman S, Ericson D: Caries correlates strongly to salivary levels of matrix metalloproteinase-8. Caries Res. 2015; 49:1-8.
Hilgemberg VM; Ditterich RG; Baldani MH. Defeitos de esmalte não fluoróticos em dentes permanentes e sua relação com fatores perinatais e nutricionais. Rev. Odontol. UNESP. 2012 mar/abr; 41(2): 125-32.
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE). Censo Brasileiro de 2010. Rio de Janeiro: IBGE, 2012.
Jain A; Bahuguna, R. Role of matrix metalloproteinases in dental caries, pulp and periapical inflammation: An overview. J. Oral Biol. Craniofac. Res. 2015, 5, 212–218.
Referências | 77
Jeremias F, Koruyucu M, Küchler EC, Bayram M, Tuna EB, Deeley K, Pierri RA, Souza JF, Fragelli CM, Paschoal MA, Gencay K, Seymen F, Caminaga RM, dos Santos-Pinto L, Vieira AR: Genes expressed in dental enamel development are associated with molar-incisor hypomineralization. Arch Oral Biol. 2013; 58:1434-42.
Jeremias F1, Pierri RA, Souza JF, Fragelli CM, Restrepo M, Finoti LS, Bussaneli DG, Cordeiro RC, Secolin R, Maurer-Morelli CV, Scarel-Caminaga RM, Santos-Pinto L: Family-Based Genetic Association for Molar-Incisor Hypomineralization. Caries Res. 2016; 50: 310-8.
Júlíusson PB, Eide GE, Roelants M, Waaler PE, Hauspie R, Bjerknes R. Overweight and obesity in Norwegian children: Prevalence and socio- demographic risk factors. Acta Paediatr. 2010; 99:900–5.
Karayasheva D, Glushkova M, Boteva E, Mitev V, Kadiyska T: Association study for the role of Matrix metalloproteinases 2 and 3 gene polymorphisms in dental caries susceptibility. Arch Oral Biol 2016; 68:9-12.
Khadri FA, Gopinath VK, Hector MP, Davenport ES. Evaluating the risk factors that link obesity and dental caries in 11-17-year-old school going children in the United Arab Emirates. Eur J Dent. 2018 Apr-Jun; 12(2):217-224.
Knauper V, Will H, Lopez-Otin C, Smith B, Atkinson SJ, Stanton H, et al. Cellular mechanisms for human procollagenase-3 (MMP-13) activation. Evidence that MT1-MMP (MMP-14) and gelatinase a (MMP-2) are able to generate active enzyme. J Biol Chem. 1996; 271:17124-31.
Krishna HV, Manaswini E, Kumar VY, Bellamkonda P, Bhargava AK, Jaidupally RR. Association between nutritional status and early childhood caries in Indian children. J Int Soc Prevent Communit Dent. 2017; 7:131-5.
Kuchler EC, Menezes R, et al. MMP1 and MMP20 contribute to tooth agenesis in humans. Arch Oral Biol. 2011 May; 56 (5): 506-11.
Küchler EC, Tannure PN, Falagan-Lotsch P, Lopes TS, Granjeiro JM, Amorim LMF: Buccal cells DNA extraction to obtain high quality human genomic DNA suitable for polymorphism genotyping by PCR-RFLP and Real-Time PCR. J Appl Oral Sci. 2012; 20:467-471.
Küchler EC, Tannure PN, Oliveira DS, Charone S, Nelson-Filho P, Silva RA, Costa MC, Antunes LS, Calasans Maia MD, Antunes LA: Polymorphisms in genes involved in enamel development are associated with dental fluorosis. Arch Oral Biol. 2017; 76:66-69.
Kumar S, Kroon J, Lalloo R, Kulkarni S, Johnson NW. Relationship between body mass index and dental caries in children, and the influence of socio-economic status. Int Dent J. 2017 Apr; 67(2):91-97.
Lauer-Fields JL, Juska D, Fields GB. Matrix metalloproteinases and collagen catabolism.Biopolymers. 2002; 66(1):19-32.
78 | Referências
Lee HL, Liu J, Clarkson BH, Lin CP, Godovikova V, Ritchie HH. Dentin-pulp complex response to carious lesions.Caries Research. 2006; 40: 256-264.
Lewis DD, Shaffer JR, Feingold E, et al. Genetic Association of MMP10, MMP14, and MMP16 with Dental Caries. International Journal of Dentistry. 2017.
Li M, Boehnke M, et al. Efficient study designs for test of genetic association using sibship data and unrelated cases and controls. Am J Hum Genet. 2006 May; 78(5): 778-92.
Liang JJ1, Zhang ZQ2, Chen YJ1, Mai JC3, Ma J4, Yang WH5, Jing J6. Dental caries is negatively correlated with body mass index among 7-9 years old children in Guangzhou, China. BMC Public Health. 2016 Jul 26; 16: 638.
Lips A, Antunes LS, Antunes LA, Abreu JGB, Barreiros D, Oliveira DSB, Batista AC, Nelson-Filho P, Silva LABD, Silva RABD, Alves GG, Küchler EC. Genetic Polymorphisms in DEFB1 and miRNA202 Are Involved in Salivary Human β-Defensin 1 Levels and Caries Experience in Children. Caries Res. 2017; 51(3):209-215.
Lu Y, Papagerakis P, Yamakoshi Y, Hu JC, Bartlett JD, Simmer JP. Functions of KLK4 and MMP-20 in dental enamel formation: Caries Biol Chem. 2008; 389:695-700.
Maciejczyk M, Pietrzykowska A, Zalewska A, Knaś M, Daniszewska I. The Significance of Matrix Metalloproteinases in Oral Diseases. Adv Clin Exp Med. 2016; 25(2): 383–390.
Maggio AB, Saunders Gasser C, Gal-Duding C, Beghetti M, Martin XE, Farpour- Lambert NJ. BMI changes in children and adolescents attending a specialized childhood obesity center: A cohort study. BMC Pediatr. 2013; 13:216.
Martin-De Las Heras S, Valenzuela A, Overall CM. The matrix metalloproteinase gelatinase A in human dentine.Archives of Oral Biology. 2000; 45(9): 757-65.
Mazzoni A, Mannello F, Tay FR, Tonti GA, Papa S, Mazzotti G, Di Lenarda R, Pashley DH, Breschi L. Zymographic analysis and characterization of MMP-2 and -9 forms in human sound dentin. Journal of Dental Research. 2007; 86 (5): 436-440.
Mazzoni A, Pashley DH, Tay FR, Gobbi P, Orsini G, Ruggeri A, Carrilho M, Tjaderhane L, Di Lenarda R, Breschi L. Immunohistochemical identification of MMP-2 and MMP-9 in human dentin: Correlative FEI-SEM/TEM analysis. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 2009; 88(3):697- 703.
Mazzoni A, Tjäderhane L, Checchi V, Di Lenarda R, Salo T, Tay FR, Pashley DH, Breschi L. Role of Dentin MMPs in Caries Progression and Bond Stability. Journal of Dental Research. 2015; 94 (2): 241–251.
Mendonça, PC, Anjos, AL. Aspectos das práticas alimentares e da atividade física como determinantes do crescimento do sobrepeso/obesidade no Brasil. Caderno de saúde Pública. Rio de Janeiro. 2004; 20(3).
Referências | 79
Ministério da Saúde. Orientações para coleta e armazenamento de dados antropométricos em serviços de saúde – Norma Técnica do sistema de Vigilância Alimentar e Nutricional – SISVAN. Brasília; 2011.
Moreira M, Polleto MM, Vicente VA. Fatores determinantes na epidemiologia e transmissibilidade da doença cárie. Revista Odonto Ciência 2007; 22(56):181-185.
Morris-Wiman J, Burch H, Basco E: Temporospatial distribution of matrix metalloproteinase and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases during murine secondary palate morphogenesis. Anat Embryol. 2000; 202:129-41.
Nariyama M, Shimizu K, et al. Identification of chromosomes associated with dental caries susceptibility using quantitative trait locus analysis in mice. Caries Res. 2004 Mar-Apr; 38(2): 79-84.
Nascimento FD, Minciotti CL, Geraldeli S, Carrilho MR, Pashley DH., Tay FR, Nader HB, Salo T, Tjäderhane L, Tersariol ILS. Cysteine Cathepsins in Human Carious Dentin. Journal of Dental Research. 2011; 90(4): 506-511.
Nascimento VG, Bertoli JC, Bertoli LMQ, Feferbaun R, Abreu LC, Leone C. Tendência secular de crescimento em pré-escolares, Brasil. Rev Bras Cresc e Desenv Hum. 2010; 20(2): 199-207.
National Task Force on the Prevention and Treatment of Obesity. Overweight, obesity, and health risk. Arch Intern Med. 2000; 160:898–904.
Navarro VP, Nelson-Filho P, et al. A participação das metaloproteinases da matriz nos processos fisiopatológicos da cavidade bucal. Rev Odont Unesp, v.35, n.4, p.233-238. 2006.
Nikiforvk G, Fraser D. The etiology enamel hypoplasia: a unifying concept. J Pediatr. 1981; 98(1):888-93.
Niu LN, Zhang L, Jiao K, et al: Localization of MMP-2, MMP-9, TIMP-1, and TIMP-2 in human coronal dentine. J Dent. 2011; 39: 536-42.
Oliveira DSB, Segato RAB, Oliveira S, Dutra ALT, Santos ASD, Praxedes ADN, Belém LC, Antunes LA, Lips A, Nelson-Filho P, da Silva LAB, Alves GG5, Antunes LS, Küchler EC. Association between genetic polymorphisms in DEFB1 and microRNA202 with caries in two groups of Brazilian children. Arch Oral Biol. 2018 Aug; 92:1-7.
Owen CA, Hu Z, Lopez-Otin C, Shapiro SD. Membrane-bound matrix metalloproteinase-8 on activated polymorphonuclear cells is a potent, tissue inhibitor of metalloproteinase-resistant collagenase and serpinase. J Immunol. 2004; 172(12):7791-803.
Paisi M, Kay E, Kaimi I, Witton R, Nelder R, Potterton R, Lapthorne D. Obesity and caries in four-to-six year old English children: a cross-sectional study. BMC Public Health. 2018 Feb 17; 18(1):267.
80 | Referências
Pang L, Zhi Q, Zhuang P, Yu L, Tao Y, Lin H1: Variation in Enamel Formation Genes Influences Enamel Demineralization In Vitro in a Streptococcus mutans Biofilm Model. Front Physiol 2017; 8: 1-11.
Passos IA, Costa JDMC, Melo JM, Forte FDS, Sampaio FC. Defeitos do esmalte: etiologia, características clínicas e diagnóstico diferencial. Rev Inst Ciênc Saúde 2007; 25(2):187-92.
Patir A, Seymen F, et al. Enamel formation genes are associated with high caries experience in Turkish children. Caries Res. 2008; 42 (5): 394-400.
Peixoto MR, Benício MH, Latorre MR, Jardim PC. Waist circumference and body mass index as predictors of hypertension. Arq Bras Cardiol. 2006; 87(4):462-70.
Petersen PE. Challenges to improvement of oral health in the 21st century--the approach of the WHO Global Oral Health Programme. Int Dent J. 2004 Dec;54(6 Suppl 1):329-43.
Piekoszewska-Ziętek P, Turska-Szybka A, Olczak-Kowalczyk D: Single Nucleotide Polymorphism in the Aetiology of Caries: Systematic Literature Review. Caries Res 2017; 51:425-435.
Pinho CPS, Silva JEM, Silva ACG, Araújo NNA, Fernandes CE, Pinto FCL. Avaliação antropométrica de crianças em creches do município de Bezerros, PE. Rev Paul Pediatr. 2010; 28(3): 315-21.
Quadri MF, Hakami BM, Hezam AA, Hakami RY, Saadi FA, Ageeli LM, Alsagoor WH, Faqeeh MA, Dhae MA. Relation between Dental Caries and Body Mass Index-for-age among Schoolchildren of Jazan City, Kingdom of Saudi Arabia. J Contemp Dent Pract. 2017 Apr 1; 18(4):277-282.
Ranade K, Chang M-S, Ting C-T, Pei D, Hsiao C-F, Olivier M, et al. High-throughput genotyping with single nucleotide polymorphisms. Genome Res. 2001; 11(7):1262–8.
Rede Vigifluor. Disponível em: www.cecol.fsp.usp.br/1501703765_Boletim/20Rede/20Vigifluor/201-2017.pdf. Acesso em: 20 de setembro de 2017.
Robinson W, Borges-Osório M. Genética para Odontologia. Porto Alegre: Artmed Editora SA. 2006. 392.
Rodriguez-Lopez J, Perez-Pampin E, et al. Regulatory polymorphisms in extracellular matrix protease genes and susceptibility to rheumatoid arthritis: a case-control study. Arthritis Res Ther. 2006; 8(1): R1.
Rossi l, Caruso L, Galante AP. Avaliação Nutricional: Novas Perspectivas. São Paulo: Roca, 2008.
Referências | 81
Santos PS, Mazzeti CMS, Franco MCP, Santos NLGOS, Conde WL, Leite MS, Pimenta AM. Estado nutricional e condições ambientais e de saúde de crianças Pataxó, Minas Gerais, Brasil. Cad. Saúde Pública 2018; 34(6).
Shastry BS. SNPs and haplotypes: genetic markers for disease and drug response (review). Int J Mol Med. 2003 Mar; 11(3): 379-82.
Shils ME, Olson JA, Moshe S. Modern nutrition in health and disease. 11a ed. Manole: Lippincott, Williams and Wilkins; 2016.
Shimada Y, Ichinose S, Sadr A, Burrow MF, Tagami J. Localization of matrix metalloproteinases (MMPs-2, 8, 9 and 20) in normal and carious dentine: Aust Dent J. 2009; 54:347-54.
Silva RA, Barreiros D, Oliveira S, da Silva LA, Nelson-Filho P, Küchler EC. Association Between Body Mass Index and Caries Experience in Brazilian Children and Adolescents. J Dent Child (Chic). 2016 Sep 15; 83(3):146-151.
Silva-Sanigorski AM, Waters E, Calache H, et al. Splash!: a prospective birth cohort study of the impact of environmental, social and family-level influences on child oral health and obesity related risk factors and outcomes. BMC Public Health. 2011; 11: 505.
Simmer JP, Hu JC. Expression, structure, and function of enamel proteinases. Connect Tissue Res. 2002; 43 (2-3): 441-9.
Slayton RL, Cooper ME, Marazita ML. Tuftelin, mutans streptococci, and dental caries susceptibility. J Dent Res. 2005 Aug; 84(8):711-4.
Soares ME, Ramos-Jorge ML, de Alencar BM, Oliveira SG, Pereira LJ, Ramos-Jorge J. Influence of masticatory function, dental caries and socioeconomic status on the body mass index of preschool children. Arch Oral Biol. 2017 Sep; 81:69-73.
Sorsa T, Tjaderhane L, Konttinen YT, Lauhio A, Salo T, Lee HM, et al. Matrix metalloproteinases: contribution to pathogenesis, diagnosis and treatment of periodontal inflammation. Ann Med. 2006; 38: 306-21.
Sorsa T, Tjäderhane L, Salo T. Matrix metalloproteinases (MMPs) in oral diseases. Oral Dis. 2004; 10: 311–318.
Sternlicht MD, Werb Z. How matrix metalloproteinases regulate cell behavior.Annual Review of Cell Developmental Biology. 2001; 17: 463-516.
Sulkala M, Larmas M, Sorsa T, Salo T, Tjäderhane L. The localization of matrix metalloproteinase-20 (MMP-20, enamelysin) in mature human teeth. Journal of Dental Research. 2002; 81(9): p. 603-7.
Sulkala M, Paakkonen V, Larmas M, Salo T, Tjaderhane L: Matrix metalloproteinase-13 (MMP-13, collagenase-3) is highly expressed in human tooth pulp. Connect Tissue Res. 2004; 45: 231-7.
82 | Referências
Sulkala M, Tervahartiala T, Sorsa T, Larmas M, Salo T, Tjaderhane L. Matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) is the major collagenase in human dentin. Archives of Oral Biology. 2007; 52(2):121-127.
Sulkala M, Wahlgren J, Larmas M, Sorsa T, Teronen O. Salo, T. The effects of MMP inhibitors on human salivary MMP activity and caries progression in rats.Journal of Dental Research. 2001; 80(6):1545-1549.
Suzuki N, Kurihara Y, et al. Dental caries susceptibility in mice is closely linked to the H-2 region on chromosome 17. Caries Res. 1998: 32(4): 262-5.
Tannure PN, Küchler EC, Falagan-Lotsch P, Amorim LM, Raggio Luiz R, Costa MC, Vieira AR, Granjeiro JM. MMP13 polymorphism decreases risk for dental caries. Caries Res 2012a; 46:401-407.
Tannure PN, Küchler EC, Lips A, Costa Mde C, Luiz RR, Granjeiro JM, Vieira AR: Genetic variation in MMP20 contributes to higher caries experience. J Dent. 2012b; 40:381-6.
Tannure PN. Associação entre polimorfismos nas metaloproteinases da matriz extracelular e seu inibidor e a cárie dentária. Tese (Doutorado em Odontopediatria) – Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ. 2011.
Tjäderhane L, Larjava H, Sorsa T, Uitto VJ, Larmas M, Salo T. The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions.Journal of Dental Research. 1998; 77(8): 1622-1629.
Tjäderhane L, Palosaari H, Wahlgren J, Larmas M, Sorsa T, Salo T. Human Odontoblast Culture Method: The Expression of Collagen and Matrix Metalloproteinases. Advances in Dental Research. 2001; 15: 55-58.
Valarini N, Doi RK, et al. Biologia molecular na odontologia: métodos comumente utilizados na cariologia. Odontol Clin-Cient. 2011; 10(1):19-23.
Vargas-Ferreira F, Salas MM, Nascimento GG, Tarquinio SB, Faggion CM Jr, Peres MA, Thomson WM, Demarco FF: Association between developmental defects of enamel and dental caries: A systematic review and meta-analysis. J Dent. 2015; 43: 619-28.
Velásquez-Meléndez G, Pimenta AM, Kac G. Epidemiologia do sobrepeso e da obesidade e seus fatores determinantes em Belo Horizonte (MG), Brasil: estudo transversal de base populacional. Rev Panam Salud Publica. 2004; 16(5):308-14.
Vidal CMP, Tjäderhane L, Scaffa PM, Tersariol IL, Pashley D; Nader HB, Nascimento FD, Carrilho MR. Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries- affected Dentin. J Dent Res. 2014; 93(3): 269-274.
Vieira A R, Marazita ML, et al. Genome-wide scan finds suggestive caries loci. J Dent Res. 2008 May; 87(5): 435-9.
Referências | 83
Visse R, Nagase H. Matrix Metalloproteinases and Tissue Inhibitors of Metalloproteinases: Structure, Function, and Biochemistry. Circulation Research. 2003; 92: 827-839.
WHO (World Health Organization). Oral Health Surveys. Basic Methods. 5a ed. Geneva: WHO; 2013.
WHO Multicentre Growth Reference Study Group. WHO Child Growth Standards: Length/height-for-age, weight-for-age, weight-for-length, weight-for-height and body mass index- for-age: Methods and development. Geneva: World Health Organization. 2006.
WHO. Genebra: Oral health surveys: basic methods.WHO 1997.
World Health Organization. WHO Growth Child Standards based on length/height, weight and age. Acta Pediatr. 2006; Supl.450:76-85.
Anexo
Anexo | 87
ANEXO A - APROVAÇÃO DO PROJETO PELO COMITE DE ÉTICA EM PESQUISA
88 | Anexo
Anexo | 89
A pêndices
Apêndices | 93
APÊNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (Resolução 466/2012 – Conselho Nacional de Saúde)
Nós, pós-graduandas Kátia Regina Felizardo Vasconcelos e Silvane e Silva Evangelista doutorandas da Universidade de São Paulo (FORP/USP), responsáveis pelo projeto “Estudo da etiologia das patologias e alterações orais de crianças e adolescentes”, convido você _________________________________________________________________, a participar do referido projeto de pesquisa, que será realizado sob orientação do Prof. Paulo Nelson Filho e da Profa. Dra. Erika Calvano Kuchler, Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto (FORP/USP). Este termo consta de 2 vias idênticas, que serão assinadas por todos os pesquisadores e por você, participante de pesquisa. Uma via ficará com você e a outra será arquivada pelo pesquisador. Esse trabalho tem como objetivo avaliar a saliva e os dentes dos alunos das Escola Municipal Thomás Meirelles e Escola Municipal Paula Frassinetti. Para tanto será necessário que seja realizado um exame clínico do paciente e que o mesmo faça um bochecho com soro fisiológico e depois cuspa.
Você e o participante de pesquisa virão ao Consultório Odontológico das Escolas, para realização da pesquisa onde será coletada a saliva no dia da consulta. Você está sendo esclarecido que esta pesquisa pode oferecer incômodos, como desconforto ao cuspir e aumento de permanência na Escola no dia da consulta ao dentista.
Os participantes da pesquisa não terão ganhos diretos com os resultados da mesma, mas terão como benefício orientação sobre técnica de higiene bucal e limpeza. A participação de vocês nesta pesquisa é muito importante, pois os resultados encontrados poderão trazer vários benefícios à ciência e ajudar outras pessoas. Não será oferecido nenhum tipo de pagamento pela participação de vocês na pesquisa, sendo que, todo o atendimento ao participante de pesquisa será gratuito. A sua identidade, bem como a do participante de pesquisa serão mantidos em segredo, mas participando da pesquisa você autoriza que os resultados obtidos sejam divulgados e publicados em revistas científicas e terá, por parte dos pesquisadores, a garantia do sigilo (segredo) que garantem a privacidade de vocês.
Você terá total liberdade para pedir maiores esclarecimentos antes e durante o desenvolvimento da pesquisa.
Se tiver alguma dúvida poderá entrar em contato com o pesquisador para pedir qualquer informação (Kátia Regina Felizardo Vasconcelos – Rua Maceió no 864, fone: 92 3584-6068).
Suas reclamações e/ou insatisfações relacionadas à sua participação na pesquisa poderão ser comunicadas por escrito à secretaria da Faculdade do Amazonas-IAES (92) -35846066, horário de atendimento das 8h às 12h, de segunda a sexta-feira, devendo conter seu nome que será mantido em sigilo.
A participação de vocês não é obrigatória, e vocês poderão desistir a qualquer momento, retirando sua autorização. A não autorização deste trabalho não trará nenhum prejuízo a vocês, bem como a sua relação com o pesquisador ou com a Escola. Eu__________________________________________,portador RG____________________, CPF_______________________,residente a _____________________, número_______, na cidade de Manaus, no estado do Amazonas, telefone____________.Declaro que li, compreendi e concordo com o presente Termo, por isso assino este documento de livre e espontânea vontade. Manaus,____ de _____________ de 20____.
_____________________________________________________________ Assinatura do responsável legal pelo participante da pesquisa
__________________________________ ________________________________________ P. G. Silvane e Silva Evangelista P. G. Kátia Regina Felizardo Vasconcelos CPF: 708.623.462-15 CPF: 314.234.852-20 __________________________________ ________________________________________ Profa. Dra. Erika Calvano Kuchler Prof. Dr. Paulo Nelson Filho CPF: 056.387.897-58 CPF: 156.200.398-46 Pesquisadora orientadora Pesquisador Responsável
94 | Apêndices
APÊNDICE B - TERMO DE ASSENTIMENTO
TERMO DE ASSENTIMENTO (Resolução nº 466/2012 CNS)
Nós, Pós-graduandas Kátia Regina Felizardo Vasconcelos e Silvane e Silva Evangelista e Prof° Dr.
Paulo Nelson Filho e Profa. Dra. Érika Calvano Kuchler, pesquisadores responsáveis pelo projeto " Estudo da etiologia das patologias e alterações orais de criancas e adolescentes" estamos convidando o (a) participante da pesquisa_____________________________________________________________,sob responsabilidade de________________________________________________________, RG:__________________________, CPF _______________________a participar desse projeto.
O objetivo do estudo será: − Avaliar se o índice de massa corporal está associado com cárie e se as metaloproteinases de
matriz (MMPs) estão associadas com cárie e defeitos do desenvolvimento do esmalte. − Esse trabalho é importante e poderá ser publicado em jornais, revistas e/ou congressos no país
e no exterior. − O bochecho com soro fisiológico não vai prejudicar a saúde do participante da pesquisa. − Haverá acompanhamento do participante durante toda a pesquisa. − O participante terá liberdade de não participar da pesquisa, assim como parar de participar,
sem que ele seja prejudicado. − Há garantia de indenizações, caso ocorram danos diretos ou indiretos, imediatos ou tardios
sofridos no decorrer da participação da pesquisa. Os pesquisadores se comprometem a prestar assistência, apesar desse estudo oferecer risco mínimo à saúde geral do participante da pesquisa.
Declaro que fui devidamente esclarecido (a), de forma oral e escrita e estou certo de que esta pesquisa tem como pesquisadores responsáveis Prof° Dr. Paulo Nelson Filho e Profa. Dra. Érika Calvano Kuchler (92) 35846066. Assino este documento de livre e espontânea vontade, estando ciente (certo) do seu conteúdo. Declaro que li, compreendi e concordo com o presente Termo, por isso assino este documento.
Nome da criança: ________________________________________________ Assinatura: ______________________________________________________ P. G. Silvane e Silva Evangelista P. G. Kátia Regina Felizardo Vasconcelos CPF: 708.623.462-15 CPF: 314.234.852-20 __________________________________ ________________________________________ Profa. Dra. Erika Calvano Kuchler Prof. Dr. Paulo Nelson Filho CPF: 056.387.897-58 CPF: 156.200.398-46 Pesquisadora orientadora Pesquisador Responsável
Assinatura do responsável legal pelo participante da pesquisa CPF: _________________________ RG: __________________________
Nome da criança: _______________________________________________. Assinatura: _____________________________________________________.
Apêndices | 95
APÊNDICE C - FICHA DE ANAMNESE E EXAME BUCAL
Nome da criança:___________________________________________________________
Data nasc.:____/____/_____ Sexo: F( )M( ) Cor da criança: ______________
Endereço:________________________________________________________________
Bairro:_________________________Cidade:_________________UF:_____
CEP:________________ Tel.:______________ Cel.:_____________
Trab:______________Recado:_____________
Mãe:____________________________________Idade:_____cor:
__________Escolaridade:____________
Pai:_____________________________________Idade_____ cor:__________
Escolaridade:____________
Número de irmãos:_______ Número de irmãs:________
Idades:____________________________
2.HISTÓRIA MÉDICA A MÃE DURANTE A GRAVIDEZ (GESTAÇÃO):
A mãe durante a gravidez recebeu acompanhamento pré-natal? ( )Sim ( )Não
a) A mãe durante a gravidez fumou? ( )Sim ( )Não
b) A mãe durante a gravidez fez uso de Vitaminas? ( )Não ( ) Não Sabe ( )Sim
Quais?______________________________
c) A mãe durante a gravidez fez uso de cálcio? ( )Não ( ) Não Sabe (
)Sim: Qual?____________________
d) A mãe durante a gravidez fez uso de algum remédio? ( )Não ( ) Não Sabe
( )Sim: Quais?____________________
A criança tem algum problema de saúde? ( ) Não ( )Sim:
Qual?__________________________________________________
(ex: Asma, bronquite, herpes labial,
A criança já foi ao dentista antes? ( )Sim ( )Não
3. HÁBITOS DE DIETA: A criança mamou no peito (Leite materno/amamentação natural)? ( )Sim ( )Não ( )
não sabe Até quando?______________
Tomou mamadeira?( )Sim ( )Não ( ) Não sabe
Mamadeira com o que? ________________ Até quando?_____________
Consome muito doce entre as refeições? ( )Não ( )Sim
96 | Apêndices
Já usou chupeta? ( )Não ( )Sim; Qual a frequência? ( )muito ( ) mais ou menos ( )
pouco; Até que idade?______________
Já chupou o dedo?( )Não ( )Sim; Qual a frequência? ( )muito ( ) mais ou menos ( )
pouco; Até que idade?______________
Já roeu unha? ( )Não ( )Sim; Qual a frequência? ( )muito ( ) mais ou menos ( )
pouco; Até que idade?______________
Faz algum barulho rangendo os dentes? ( )Não ( )Sim; ( )Durante o dia ( )Durante a
noite ( )Dia e noite; Até que idade?_____
4. HÁBITOS DE HIGIENE: Quem escova o dente do seu filho ( )ele mesmo ( ) responsável (pai, mãe)
( )tanto a criança quanto o responsável
Quantas vezes a criança escova os dentes por dia?___________ Escova antes de
dormir? ( )Não ( )Sim
Usa fio dental? ( ) Não ( ) Sim: ( ) De vez em quando ( ) Todo dia
5. USO DE FLUORETOS: A pasta de dentes que seu filho usa é: ( ) de adulto ( ) infantil Marca da pasta de
dentes:______________________
Seu filho ingere a pasta de dentes? ( )Não ( )Sim
Seu filho faz bochechos: ( ) não ( ) sim Marca: ____________________
Quem prescreveu__________
EXAME CLÍNICO: Mordida Aberta anterior: ( ) Ausente ( ) Leve ( ) Moderada ( ) Grave
Mordida Cruzada posterior( ) Ausente ( )Unilateral ( ) Bilateral Mordida Cruzada
anterior: ( ) Ausente ( ) Presente Quais
dentes?____________________________________________
Apêndices | 97
MAXILA
17 27
16 26
15/55 25/65
14/54 24/64
13/53 23/63
12/52 22/62
11/51 21/61
MANDÍBULA
37 47
36 46
35/75 45/85
34/74 44/84
33/73 43/83
32/72 42/82
31/71 41/81
Peso:__________________________Altura:______________________
98 | Apêndices
APÊNDICE D - TRABALHOS ENVIADOS/ACEITO PARA PUBLICAÇÃO
Vasconcelos KRF; Evangelista SS; Segato RAB; Oliveira S; Dutra ALT; Santos AS; Praxedes
ADN; Belém LC; Silva LAB; Nelson-Filho P; Küchler EC. ASSESSING THE ASSOCIATION
BETWEEN DENTAL CARIES AND NUTRITIONAL STATUS IN CHILDREN FROM THE
BRAZILIAN AMAZON REGION. International Journal of Clinical Pediatric Dentistry
- Manuscript ID: JPJ1780211217JCP - (artigo aceito para publicação).
Vasconcelos KRF, Evangelista SS, Arid J, Dutra ALT, Oliveira SS, Vieira AR, Segato RAB, Silva
LAB, Kuchler EC, Nelson–Filho P. GENETIC POLYMORPHISM IN MMP13 IS
ASSOCIATED WITH DENTAL CARIES AND DEVELOPMENTAL DEFECT OF ENAMEL
IN CHILDREN FROM THE AMAZON REGION OF BRAZIL – (artigo em fase de
redaçāo final).
Evangelista SS; Vasconcelos KRF; Xavier TA; Oliveira S; Dutra ALT; Nelson-Filho P; Silva
LAB; Segato RAB; Queiroz AM; Erika Calvano Küchler EC. TIMING OF PERMANENT
TOOTH EMERGENCE IS ASSOCIATED WITH OVERWEIGHT AND OBESE CHILDREN
FROM THE BRAZILIAN AMAZON REGION. Brazilian Dental Journal. Manuscript ID:
BDJ-2018-2230 (artigo submetido).
Arid J; Oliveira DB; Evangelista SS; Vasconcelos KRF; Dutra ALT; Oliveira SS; Queiroz AM;
Nelson-Filho P; Vieira AR; Küchler EC. ESTROGEN RECEPTOR ALPHA AND GROWTH
HORMONE RECEPTOR AND DEVELOPMENTAL DEFECT OF ENAMEL. International
Journal of Paediatric Dentistry. Manuscript IJPD-05-18-6765 (artigo submetido).