juan diego rojas - biblioteca digital de teses e ... · infelizmente, no brasil, e na america...
TRANSCRIPT
Juan Diego Rojas
Prospecção de genes biossintéticos de policetídeos a partir de fungos isolados de cana-de-açúcar.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butanta/IPT para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia.
Área de concentração: Biotecnologia
Orientador: Prof. Dr. Gabriel Padilla
São Paulo 2010
RESUMO
Rojas JD. Prospecção de genes biossintéticos de policetídeos a partir de fungos
isolados de cana-de-açúcar. [tese (Doutorado em Biotecnologia)]. São Paulo (Brasil):
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2010.
Os Fungos endofíticos e rizosféricos têm chamado recentemente a atenção devido
às suas propriedades biotecnológicas. A partir de 280 isolados de cana-de-açúcar,
dezoito fungos ascomicetos foram avaliados quanto á presença de genes policetídeo
sintase (PKS) por meio da técnica do PCR. Estes fungos foram identificados
taxonomicamente por uma abordagem polifásica, classificando-os dentro de quatro
ordens e nove gêneros, onde espécies do gênero Penicillium foram as mais
predominantes. A avaliação da atividade biológica demonstrou a presença de
metabolitos com propriedades antibióticas quando enfrentados a micro-organimsos
patogênicos. Segundo a análise de correspondência múltipla, esta atividade poderia
estar associada com a local de isolamento dos fungos. Foram detectadas 36
seqüências similares a genes PKS a partir de 17 fungos, sendo 26 seqüências
relacionadas ao domínio conservado cetosintase (KS) e 10 seqüências relacionadas
ao domínio C-metiltransferase (CMT). A Análise felogenética do domínio KS,
conduzida pelo método de neighbor–joining, indicou que 16 seqüências se
acomodaram dentro do grupo monofilético dos PKS envolvidos na produção de
policetídeos não reduzidos, nos clados que representam a síntese de pigmentos de
conídios, aflatoxinas e melaninas. As outras 10 seqüências se acomodaram dentro
do grupo monofilético dos PKS envolvidos na produção de policetídeos reduzidos,
nos clados que representam a síntese de moléculas como a lovastatina, fumonisin,
compostos híbridos PKS-NRPS e de PKS vagamente caracterizados. A análise do
domínio CMT também apontou que as seqüências podiam se acomodaram em
grupos de PKS dependendo do grau de redução do policetídeo, todas as 10
seqüências se relacionaram com PKS envolvidos na produção de policetídeos
reduzidos. Analises dos modelos estruturais também demonstraram que as
seqüências estavam altamente relacionadas com estruturas protéicas da família das
enzimas de condensação, destacando a presença de uma hélice α característica
que carrega o resíduo de cisteína, responsável pela atividade de condensação.
Extratos orgânicos obtidos de cultivos dos fungos foram avaliados parar detectar a
presença de compostos tipo lovastatina, por meio de técnicas cromatográficas: em
CCDS, foram detectaram bandas com o mesmo deslocamento que a lovastatina
padrão a partir dos extratos de 10 dos fungos, mas apenas 6 destes extratos
confirmaram a presença de compostos com o mesmo tempo de retenção que a
lovastatina padrão quando analisados por CLAE. O isolado A. flavus CBMAI (1023)
foi selecionado para a realização de experimentos de produção a maior escala, onde
um composto de posivel origem policetidica foi isolado e parcilamente caracterizado.
Palavras-chave: Fungos endofíticos. Policetídeo sintase (PKS). Cetosintase (KS). C
metiltransferase (CMT). Policetídeos (PK). Lovastatina.
ABSTRACT
Rojas JD. Screening of polyketides biosynthetic genes from sugarcane-derived fungi.
[Ph.D. thesis (Biotechnology)] São Paulo (Brasil): Instituto de Ciências Biomédicas
da Universidade de São Paulo;2010.
Endophytic and rhizosphere fungi have called attention recently for their
biotechnological properties. From a group of 280 sugarcane-derived fungi, eighteen
ascomycota fungi, were assessed for the presence of polyketide synthase (PKS)
genes by PCR approaches. These fungi were identified taxonomically by a
polyphasic approach classifying into four orders and nine genus, where Penicillium
spp. where the most predominant. Biological activity tests showed the presence of
antibiotic metabolites against pathogenic microorganism and the relationship of this
activity might be linked with the fungal isolate location by multiple correspondence
analyses. 36 sequences similar to PKS genes fragments were detected from 17 of
these fungi, being 26 sequences related to ketosynthase (KS) conserved domain and
10 sequences related to C-methyltransferase (CMT) domain. A neighbor– joining
phylogenetic analysis of the KS domain showed that sixteen sequences fit on the
monophyletic group of PKS evolved with production of non reduced polyketides,
belonging to the clades responsible to conidial pigments, aflatoxins and melanins
synthesis. The other 10 sequences fit on the monophyletic group of PKS evolved
with the production of reduced polyketides, belonging to the clades that represent the
synthesis of lovastatin, PKS-NRPS compounds, fumonisin and with PKS that are
pour characterized. Analysis of the CMT domain also pointed that ten sequences fit
with groups of PKS depending on polyketide reduction grade, all of them related to
PKS evolved with the synthesis of reduced polyketides. Protein structural analysis
also pointed that these sequences are closely related with proteins from condensing
enzyme family, highlighting the presence of a characteristic α helix elbow that bears
the cysteine residue responsible for the condensation activity. The fungi were also
tested for their capacity of producing lovastatin compounds by chromatographic
techniques: on TLC were detected 10 bands with the same dislocation compared to a
lovastatin, but only 6 were confirmed by HPLC. The A. flavus CBMAI (1023) were
selected for upscale production experiments, where a compound of posivel
polyketide origin was isolated and partially characterized.
Keywords: Endophytic fungi. Polyketide synthase (PKS). Keto synthase (KS). C
methyltransferase (CMT). Polyketide (PK). Lovastatin.
1 INTRODUÇÃO
______________________________________________________________________ Introdução
24
1.1 JUSTIFICATIVA
O estudo dos fungos endofíticos, como fonte promissora de compostos ativos
com interesse farmacológico, vem tomando enorme destaque, na estratégia da
busca de novos compostos (Clardy e Walsh, 2004; Gunatilaka, 2006). A diminuição
da descoberta de novos compostos nos últimos anos, atingiu o mínimo número em
2004 com a introdução de 25 novas entidades químicas (Newman e Cragg, 2007).
Em função disso, torna-se uma necessidade premente a busca por novos fármacos
com amplo espectro que, possam lidar com o crescimento acelerado da população
mundial, o aumento da longevidade, o ressurgimento de doenças graves (e.g.,
tuberculose) e pandemias, e principalmente, com o incremento constante da
resistência microbiana aos antibióticos de rotina além da procura por fármacos
menos tóxicos (Strobel e Daisy, 2003; Waugh e Long, 2002).
Os micro-organismos endofíticos constituem uma parte significativa da
microbiota das plantas, ainda pouquíssima conhecida e explorada (Clardy e Walsh,
2004). Alguns poucos exemplos de literatura evidenciam o grande potencial de
exploração biotecnológica e alto valor agregado dos bioprodutos obtidos desta
associação (Strobel, 2003; Tan e Zou, 2001). Um exemplo é o taxol, um dos
importantes antitumorais que hoje, se sabe é produzido por uma espécie de fungo
endofítico isolado de cipreste (Taxus sp.), que representou vendas de mais 1.6
bilhões de dólares no 2000 (Stierle et al., 1993).
Entre os principais tipos de compostos analisados como novas entidades
químicas como os obtidos por síntese orgânica, química combinatória entre outros,
os produtos naturais são os que apresentam a maior diversidade química (Harvey,
2008). Além disso, os produtos naturais e seus derivados contribuíram com um 75%
das novas entidades químicas aprovadas pela FDA entre 1996 e 2006 (Butler, 2004;
Newman e Cragg, 2007).
Entre os produtos naturais, os policetídeos se destacam não somente por
apresentar diversidade nas suas estruturas químicas (Cox, 2007), mas também
porque compreendem uma fração significativa dos metabolitos microbianos que têm
sido identificados pelas suas atividades fisiológicas, e pelas importantes aplicações
comerciais que algumas destas moléculas têm atingido no mercado farmacológico
como antibacterianos (a eritromicina e a tetraciclina), imunusupressores (a
rapamicina e o ácido micofenôlico), agentes anticancerígenos (a doxorubicina e a
______________________________________________________________________ Introdução
25
daunorubicina), agentes antifúngicos (a anfotericina e a griseofulvina), produtos
veterinários (a avermectina) e anticolesterolémicos (estatinas) (Cane, 1997). Estes e
muitos outros compostos policetídicos têm movimentado o mercado global em
bilhões de dólares, representando 3% das vendas mundiais em 1998 para produtos
farmacêuticos sob prescrição, e se expandindo a mais de 10-20US$ bilhões anuais
(Firn, 2010; Roa e Leise, 2002; Strohl, 1997; Weissman, 2009), atraindo o
investimento das indústrias farmacêuticas tanto para pesquisa básica e aplicada nos
recentes anos, acompanhada pela ampla exploração da biologia molecular
responsável pela sua biosínteses. Hoje em dia, sabe-se que os policetídeos são
sintetizados por um sistema enzimático chamado de policetídeo sintase ou PKS (do
inglês polyketide synthase), e que a sua síntese é governada por um conjunto de
genes envolvidos desde sua formação e modificação até a sua regulação e própria
resistência, sendo responsável pela síntese de mais de dez mil moléculas
conhecidas. Apesar de que poucas enzimas PKS têm sido isoladas e
caracterizadas, é possível, mediante o uso de ferramentas da engenharia genética,
seqüenciar, clonar, isolar e expressar enzimas desta classe.
Infelizmente, no Brasil, e na America Latina, ainda existe uma dependência
total por fármacos desenvolvidos no exterior. Além dos aspectos de mercado e infra-
estrutura industrial nacional, existe uma escassez de profissionais capacitados para
desenvolvimento de projetos nesta área. Esta situação é ainda mais grave pela falta
de uma política clara de incentivo à pesquisa e desenvolvimento de fármacos.
Uma das maneiras de elevar a competitividade do país neste setor é o
aproveitamento racional e sustentado da rica biodiversidade brasileira. Assim,
aproveitando-se a diversidade de micro-organismos endofíticos e o conhecimento já
estabelecido no país pelas equipes atuantes na EMBRAPA e ESALQ/USP, que
estudam a interação endofítica em condições tropicais, aliado ao potencial
inexplorado para a biotecnologia, acreditamos que o Brasil possa efetivamente se
destacar no cenário internacional, com uma real contribuição em inovação e
descoberta de novos compostos bioativos para a indústria farmacêutica
internacional.
O presente projeto visa realizar uma prospecção dirigida a identificar genes
da biossíntese dos policetídeos, a partir de um conjunto de fungos filamentosos
endofitícos e de isolados da rizosfera de cana-de-açúcar. Como processo de
______________________________________________________________________ Introdução
26
seleção inicial, para a identificação de novos compostos policetídeos, optou-se
peloestudo das estatinas como alvo principal. Em estudos mais recentes, descobriu-
se que as estatinas também podem apresentar atividade antitumoral, destacando o
aumento da sobrevida dos pacientes e redução dos tumores. Esta atividade
antitumoral chamou nosso interesse motivando-nos em centrar os estudos para essa
classe de moléculas (Brown, 2007; Chan et al., 2003; Hindler et al., 2006).
Numa abordagem inicial, aproximadamente 300 amostras de DNA passaram
pela identificação de genes PKS, mediante o uso da técnica da reação de cadeia da
polimerase (ou PCR). Os iniciadores empregados reconheciam regiões conservadas
dos genes, responsáveis pela síntese de diferentes classes de policetídeos. A partir
desta abordagem foram selecionados dezoito isolados como material biológico de
estudo: (a) os isolados fúngicos foram identificados mediante técnicas morfológicas
e moleculares; (b) extratos orgânicos obtidos a partir destes fungos foram testados
contra micro-organismos patogênicos visando realizar uma caracterização do seu
possível potencial antibiótico; (c) as regiões conservadas dos genes PKS detectadas
foram analisadas filogenética e estruturalmente para entender sua possível função
na biossíntese de policetídeos; e por último, (d) foram produzidos extratos orgânicos
a partir de meios de cultura de produção visando a detecção de policetídeos,
comparando com lovastatinas comerciais para sua purificação e caracterização
estrutural.
O projeto, de cunho biotecnológico, reúne a competência dos laboratórios de
Genética de Streptomyces, Departamento de Microbiologia (ICB), que é
especializado no estudo de vias biossintéticas dos policetídeos antraciclinas
(antineoplásicos), e o Laboratório de Genética de Micro-organismos da ESALQ, que
construiu e disponibilizou a coleção de micro-organismos endofíticos.
______________________________________________________________________ Introdução
27
1.2 MARCO TEÓRICO
Esta revisão aborda o conhecimento cientifico em torno dos micro-organismos
endofíticos, especialmente fungos, por ser o material de estudo deste trabalho.
Trata-se, também, sobre os policetídeos, compreendendo os mecanismos
moleculares da sua biossíntese e diversidade estrutural. Por último, se enfoca as
estatinas, em especial a lovastatina, explorando sobre sua história, síntese,
produção e atividades biológicas, já que este é o policetídeo de maior interesse para
esta prospecção.
1.2.1 Micro-organismos endofíticos
Muitas definições têm-se aplicado ao termo endofítico (Lodewyckx et al.,
2002). Kloepper et al. (1992) os denominaram como aqueles organismos que se
encontram entre os tecidos internos da epiderme das plantas. Não obstante, como
muitos destes micro-organismos endofíticos podem se tornar patogênicos,
dependendo de certas condições e hospedeiros, James e Olivares (1997) ajustaram
a definição e concluíram que todas as bactérias e fungos que colonizam o interior
das plantas, incluindo patogênicos ativos e latentes, são considerados endofíticos.
Muitos autores atuais, porém, consideram micro-organismos endofíticos, geralmente
bactérias e fungos, como um conjunto de micro-organismos que habitam no interior
das plantas, sem causar aparentemente nenhum dano a seu hospedeiro, pelo
menos por um período do seu ciclo de vida (Bacon e Withe, 2000; Gunatilaka, 2006;
Petrini, 1991; Schulz, 2002; Tan e Zou, 2001; Wilson, 1995).
Pesquisadores brasileiros têm redefinido o termo “endofítico”, como todos
aqueles micro-organismos que podem ou não crescer em meio de cultura e que
habitam o interior de tecidos e órgãos vegetais sem causar prejuízos ao seu
hospedeiro e sem produzir estruturas externas visíveis, salientando que a
diferenciação entre endofítico, epífito (que habita sobre a superfície da planta) e
fitopatogéno (que causa doenças), está intrinsecamente relacionada no somente em
nível de adaptação e especificidade do hospedeiro, mas também do estágio
desenvolvimento em que se encontram os relacionados. Entre os estágios definidos
se destacam: virulência inata do micro-organismo, resposta de defesa da planta e as
______________________________________________________________________ Introdução
28
condições ambientais que abordam a relação (Azevedo et al., 2000; Azevedo e
Araujo, 2007).
Estes micro-organismos foram mencionados pela primeira vez no início do
século XIX por Darnel (Strobel, 2003; Tan e Zou, 2001), mas foi o botânico Barry em
1866, quem fez uma possível distinção entre os micro-organismos endofíticos e os
patogênicos das plantas. No final dos anos 70, verificou-se que, além de serem
habitantes internos das plantas, os micro-organismos endofíticos tinham
propriedades de interesse, tais como conferir proteção contra insetos praga, micro-
organismos patogênicos e mesmo contra herbívoros, e em muitos casos podem
produzir substâncias bioativas que podem estar envolvidas na relação simbiôntica
endofítico-hospedeiro. Sendo assim, durante as décadas passadas mais de 100
micro-organismos endofíticos foram cultivados e sujeitos a investigações detalhadas
apontando à caracterização química dos seus metabólitos e avaliação da sua
atividade biológica. Muitos dos metabólitos analisados apresentaram estruturas
novas com atividades biológicas interessantes, inibindo o crescimento de micro-
organismos resistentes os antibióticos de rotina, antifúngicos, antivirais, fitotoxicos,
entre outros (Gunatilaka, 2006). Ainda hoje, estudos recentes têm indicado que o
51% das substâncias com atividade biológica de micro-organismos endofíticos são
desconhecidos, comparadas com 38% das substancias novas de micro-organismos
provenientes do solo (Schulz, 2002).
Acredita–se que todas as plantas são hospedeiras de pelo menos um micro-
organismo endofítico, os quais incluem bactérias e fungos, que moram
primariamente no tecido debaixo das camadas de células epidérmicas sem
apresentar nenhum tipo de sintoma(Strobel et al., 2004). Estima-se que pode haver
mais de um milhão de espécies diferentes de micro-organismos endofíticos, no
entanto, apenas poucos deles foram descritos (Petrini, 1991).
É bem entendido que as infecções e a propagação provocadas pelos
endofíticos são pelo menos moderadas, porém, os tecidos da planta são
transitoriamente sadios. Esta relação endofítica pode ter sido desenvolvida quando
as plantas superiores começaram a aparecer na terra, milhões de anos atrás,
algumas evidências de associações de micróbios com plantas se tem descoberto em
tecidos fossilizados de folhas e caules (Zhang et al., 2006). Como resultado destas
longas associações, é possível imaginar que alguns destes micro-organismos
______________________________________________________________________ Introdução
29
dividiram sistemas genéticos produzindo-se a transferência de informação entre
eles, permitindo que os micro-organismos endofíticos tenham produzido
mecanismos mais rápidos de adaptação a mudanças ambientais, entre eles a
compatibilidade com a sua planta hospedeira (Strobel, 2003). Nesta associação
simbiótica, a planta hospedeira protege e alimenta o micro-organismo endofítico, o
qual, em retorno, produz metabólitos bioativos para aumentar o crescimento e
competitividade da planta e/ou brindar proteção contra patógenos e herbívoros
(Gunatilaka, 2006; Schulz e Boyle 2005). No entanto, se desconhece o verdadeiro
papel dos metabólitos bioativos na simbiose micro-organismo planta. Algumas
hipóteses ao respeito afirmam que, se um fungo endofítico é capaz de produzir
metabólitos in vitro, é porque, seguramente, tem alguma função natural. Todo o
complexo multienzimático requerido para a síntese do metabolito secundário não
seria mantido pelo micro-organismo sem algum efeito benéfico para sua
sobrevivência (Demain, 1999).
Por estes motivos, as plantas podem ser consideradas como micro-
ecossistemas complexos, nichos ecológicos, habitat específicos que podem ser
explorados por uma ampla variedade de bactérias e fungos (Azevedo et al., 2000).
Estes habitats não estão representados só pela superfície externa da planta, onde
bactérias epifíticas predominam, senão também por tecidos internos, em os quais
muitos micro-organismos podem penetrar e sobreviver. Dentro do micro-ecossistema
das plantas, tanto fungos quanto bactérias, podem interatuar e estabelecer um
equilíbrio. Esta distribuição foi observada pela primeira vez por Gardner et al.(1982),
que identificou bactérias presentes no xilema das raízes de um limoeiro da Flórida.
Pseudomonas (40%) e Enterobacter (20%) foram os gêneros predominantes,
enquanto que as restantes foram consideradas espécies raras. Não entanto, entre
os micro-organismos endofíticos, os fungos, na sua maioria constituída por
ascomicetes e fungos imperfeitos, representam uma das maiores e menos
exploradas diversidades, com uma estimativa de 1.5 x 106 espécies (Carroll, 1988).
Ao contrário de outras associações fúngicas, em comparação com fungos
micorrízicos, os fungos endófitos residem inteiramente dentro dos tecidos do
hospedeiro. Estes fungos são um grupo filogeneticamente diverso, sendo membros
do subreino dikarya (Arnold et al., 2007; Carroll, 1988; Girlanda et al., 2006; Schardl
______________________________________________________________________ Introdução
30
et al., 2004) sendo sua maioria pertencente ao filo ascomycota, e aguns poucos do
filo basidiomycota.
Os Fungos endofíticos são considerados tão ubíquos como associações
micorrízicas entre plantas das zonas temperadas (Carroll, 1988), sendo encontrados
em algas (Hawksworth e Rossmann, 1997), musgos (Schulz et al., 1993),
samambaias (Fisher, 1996), coníferas (Bernstein e Carroll, 1977; Legault et al.,
1988), monocotiledôneas (Frohlich et al., 2000; Rodrigues, 1994) e angiospermas
dicotiledôneas (Faeth e Hammon, 1997; Lodge et al., 1996; Rajagopal e
Suryanarayanan, 2000). Saikkonen et al. (1998) revisou vários estudos mostrando
que as plantas nas zonas temperadas pode abrigar dezenas de espécies de
endófitos, em quanto Aurnold et al. (2000) demostrartam que as angiospermas
tropicais possuem uma maior diversidade, tanto em numero como em espécies,
demonstrado uma notável riqueza de endófitos.
Atualmente, os endófitos podem ser subdivididos em dois grandes grupos
com base na variedade dos hospedeiros, no padrão de colonização, na transmissão
e na função ecológica (Rodriguez e Redman, 2008): (i) os endófitos clavicipitaceous
que infectam algumas gramas, (ii) e os endófitos não-clavicipitaceous que estão
divididos em 3 grupos funcionais distintos que podem ser recuperados de tecidos
assintomáticos de plantas não vasculares, samambaias, coníferas e angiospermas
No Brasil, a cana-de-açúcar, o cultivo com a maior importância econômica,
vem sendo foco de intensas investigações procurando vias para o melhoramento da
sua produtividade. Entre elas, diversas linhas de pesquisa envolvendo laboratórios
de diferentes áreas do conhecimento vêm analisando a população endofítica. Alguns
trabalhos de isolamento e análise da comunidade endofítica por técnicas
independentes de cultivo demonstraram uma alta predominância de espécies do
gênero Fusarium, Cladosporium, Epicoccum, Pestalotiopsis, Xylaria e Guignardia, e
numa menor freqüência espécies do gênero Penicillim, Asperguillus, Trichoderma,
Diaporthe e Leptosphaeria (Stuart et al., 2010).
Existem numerosos estudos que reportam que os micro-organismos
endofíticos podem conceder tolerância a condições de estresse a planta hospedeira
incluindo calor, salinidade, metais e aridez (Rodriguez et al., 2004). Têm-se
______________________________________________________________________ Introdução
31
observado que, sem a presença destes micro-organismos endofíticos, a planta é
incapaz de sobreviver neste habitat (Redman et al., 2002).
Além disso, outros estudos têm demonstrado a capacidade dos micro-
organismos endofíticos em aumentar a capacidade fitoremediadora de
contaminantes e de ter um papel importante para a fertilidade das plantas mediante
a solubilização de fosfatos e fixação de nitrogênio; servem como indicadores de
vitalidade; usados como agentes no controle biológico e bioherbicidas, já que
ocupam o mesmo nicho ecológico que os patogênicos; e produtores de antibióticos e
outros metabólitos secundários de interesse farmacológico. Por estas razões existe
um grande interesse no desenvolvimento do potencial biotecnológico na
fitoremedição e na produção sustentável de cultivos para a produção de biomassa e
biocombustiveis (Rodriguez et al., 2004; Ryan et al., 2008; Strobel, 2006)
1.2.2 Comunidade fúngica rizosférica
A rizosfera, considerada uma das zonas biológica mais ativa dentro do
ecossistema terrestre, é a região onde o solo e as raízes das plantasentram em
contato, contendo um ecossistema microbiano diferente ao encontrado no solo livre,
tanto no número de micro-organismos quanto à variedade de cepas representadas
(Smalla, 1998). Este nicho é altamente influenciado pela deposição de produtos das
raízes, composta por exudados, lisados, mucilagos, secreções, material celular
morto e incluindo alguns gases como o CO2 produzido na respiração (Lynch e
Whipps, 1990).
A rizosfera também é um ecossistema com interações ecológicas complexas
entre comunidades microbianas, onde processos antagônicos podem tomar lugar,
com a finalidade de interferir no crescimento e sobrevivência de micro-organismos
patógenicos, e impedir os processos de infecção às plantas (Chernin e Chet, 2002).
Entre os mecanismos responsáveis pelo antagonismo incluem-se: (i) antibiose,
inibição do crescimento por compostos antibióticos, toxinas ou compostos tenso-
ativos chamados biossurfactantes; (ii) a competição pelos espaços de colonização,
nutrientes e minerais; e (iii) o parasitismo, que implica a produção de enzimas
extracelulares degradadoras da parede celular dos patógenos, como a quitinase e a
1,3-glucanase (Bloemberg e Lugtenberg, 2001; Fravel, 1988; Whipps, 2001).
______________________________________________________________________ Introdução
32
A comunidade microbiana presente na rizosfera também influência no
crescimento e na supervivência da sua planta hospedeira, contribuindo não apenas
como biocontroladores de patógenos ou na indução de resistência sistêmica, mas
também na produção de substâncias estimulantes do crescimento das planta
(Hawksworth e Rossmann, 1997). Mesmo que nos últimos anos tenha se
desenvolvido ferramentas moleculares para analisar as estruturas das comunidades
fúngicas na rizosfera de uma ampla variedade de cultivos (Gomes et al., 2003;
Kowalchuk, 1999; Smit et al., 1999; Vandenkoornhuyse et al., 2002), pouco se sabe
sobre a função e a possível papel da diversidade fúngica observada em associação
nas raízes das plantas (Kowalchuk et al., 1997; Vandenkoornhuyse et al., 2002).
Como conseqüência da alta diversidade das cepas microbianas dentro da
rizosfera, a crença da existência de uma rica fonte de produtores de novos
metabolitos secundários vem emergindo (Berg et al., 2005). Mesmo que a
prospecção de metabólitos secundários átivos a partir de micro-organismos
rizosfericos não tenha recebido tanta atenção em comparação com os micro-
organismos endofíticos, recentes estudos vêm comprovando a alta produtividade na
produção destes compostos: Basil (2004) demonstrou que compostos antifúngicos
chegaram a ser isolados com maior freqüência de actinomicetos rizosféricos de
Artemisa tridentata comparado com a produção em bactérias isoladas de solo (Basil
et al., 2004); Gunatilaika et al., conseguiram isolar e caracterizar 41 metabólitos a
partir de nove fungos rizosfericos de plantas do deserto de Sonora, dos quais, 18
presentaram ser novas estruturas químicas (He et al., 2004; Wijeratne et al., 2003;
Zhan et al., 2004; Zhou et al., 2004).
1.2.3 Identificação e caracterização de fungos mediante técnicas moleculares
White et al.(1990) revolucionou o estudo e identificação de fungos mediante a
introdução e utilização de marcadores do rRNA para o amplificação de regiões do
rRNA nuclear e mitocondrial por meio da técnica do PCR.
Estes autores desenvolveram dois grupos de marcadores: (i) marcadores
altamente conservados que amplificam regiões da subunidade menor do rDNA,
utilizados em comparações filogenéticas para níveis taxonômicos amplos; (ii) e
marcadores que amplificam regiões de rápida evolução (ribosomal transcibed
______________________________________________________________________ Introdução
33
spacers (ITS).Esta última região apesar de ser transcrita, não codifica para nenhuma
função e são, portanto, adequados para acumular mutações neutras, tornando-os
alvos ideais para a diferenciação entre organismos estreitamente relacionados.
Estas aproximações moleculares têm sido amplamente empregadas na
identificação de fungos, especialmente para a distinção de cepas intimamante
relacionadas (Ward e Adams, 1998) e para geração de hipóteses sobre divergências
ancestrais evolutivas (Bruns et al., 1992; Wilmotte et al., 1993) Da mesma forma,
estes marcadores contribuíram na identificação de micro-organismos que não
possuem suficientes identificadores morfológicos, como no caso de alguns fungos
associados a plantas, entre eles rizosféricos e endofíticos (Anderson e Cairney,
2004; Kowalchuk, 1999).
1.2.4 Produtos naturais de micro-organismos endofíticos
Como destacado anteriormente, esta micro diversidade biológica não
somente implica variedade microbiana, mas também diversidade química nas
moléculas envolvidas, devido à inovação necessária para sobreviver em ambientes
restritos aonde a competição por espaço chega ser alta e as fontes de nutrientes
limitadas, condições que levam a que apressão seletiva esteja no seu maior
pico.Situações que criam a oportunidade de achar novas moléculas com alta
atividade biológica, sendo assim, dentro dos endofíticos (Strobel et al., 2004).
Segundo Schulz e Boyle (2002) e Strobel (2003), certos metabólitos
microbianos aparentemente são característicos de certos biotopos (região que
apresenta regularidade nas condições ambientais e nas populações animais e
vegetais), ambos em um nível de relacionamento do organismo e do meio ambiente,
assegurando que a procura de novos metabólitos secundários deve centrar-se em
organismos que habitam ambientes únicos. Os endofíticos são organismos que
habitam esses espaços nas plantas superiores, que podem situar se em muitos
ambientes não comuns, o que tornaria os endofíticos uma fonte sobre-saliente
dessas substâncias naturais.
As condições ambientais nas quais a planta hospedeira cresce, afeta a
população endofítica (Hata et al., 1998). Os micro-organismos endofíticos vêm
sendo isolados e estudados de uma ampla variedade de plantas ao redor do
______________________________________________________________________ Introdução
34
planeta, em especial de plantas de clima temperado. Schulz et al. em 1993 e 1995,
isolaram mais de 6500 endofíticos de todas as partes da plantas amostradas de
diversos habitats de clima temperado.,A maioria dos isolados pertence a gêneros
ubíquos, tais como Acremonium sp., Alternaria sp. Cladosporium sp. Coniothyrium
sp. Epicoccum sp., Fusarium sp., Genicolusporium sp., Phoma sp., Pleospora sp.,
entre outros.
Recentes investigações apontam que o isolamento de endofíticos a partir de
plantas de clima tropical poderia levar a uma diversidade muito mais interessante.
Strobel e Daisy (2003) afirmam que a mata de clima tropical e temperada são os
ecossistemas mais biologicamente diversos no planeta, abrigando mais de um 60%
da biodiversidade terrestre mundial. Bills et al. (2002) descreveu, baixo dados
estatísticos, uma diferenciação metabólica entre fungos endofíticos isolados de
regiões tropicais com aqueles de origem temperado, demonstrando que, não
somente os isolados de clima tropical produziam produtos naturais mais ativos, mais
também notou uma distinção significativa na produção de metabolitos ativos
dependente da região tropical. Estas observações sugeriram a importância da planta
hospedeira na influencia do metabolismo dos endofíticos.
Segundo as observações de Strobel (2003), é também muito importante a
seleção das plantas superiores hospedeiras para o isolamento dos endofíticos como
produtores de novas moléculas, já que existe uma grande quantidade de espécies
de plantas no mundo. Serão descritas algumas estratégias para limitar a busca e
isolar novos micro-organismos endofíticos:
1. Plantas de ambientes únicos, em especial aquelas que têm estratégias
incomuns para sua sobrevivência. Rhyncholacis penicillata, uma planta aquática,
que se encontra num sistema de rios no sul da Venezuela, tem que suportar um
ambiente hostil, recebendo as águas dos esgotos, onde muitos organismos
patogênicos podem atacar a planta, mas ainda a planta se mantêm aparentemente
sadia, possivelmente pela presença dos micro-organismos endofíticos. Foi isolada
uma cepa de Serratia marcenscens desta planta, que produz uma lactona
macrocíclica clorinada, chamada Oocydin A, com atividade contra fungos
oomycetais fitopatogênicos como Pythium spp. e Phytophyhora spp. (Strobel et al.,
2004).
______________________________________________________________________ Introdução
35
2. Plantas com referência etnobotânica, relacionadas com usos e aplicações
especificas, sobretudo para povos indígenas. Como exemplo, no Norte de Austrália
existe uma planta chamada “a vid da cobra”, Kennedia nigrinscans, utilizada por
aborígines desta região como planta medicinal para aliviar feridas, cortes profundas
e infecções. Desta planta se isolou um estreptomycete, designado como
Streptomyces NRRL 30562, com a capacidade de produzir peptídeos com alto
espectro antibacteriano contra bactérias Gram positivas e Gram negativas em
especial muitas cepas resistentes de antibióticos como Bacillus anthracis e
Mycobacterium tuberculosis. Estes peptídeos foram denominados Munumbycin A, B,
C e D (Castillo et al., 2002).
3. Plantas endêmicas que tenham uma alta longevidade, ou que tenham
ocupado certa porção de terra ancestral.
4. As florestas tropicais são os ecossistemas com maior biodiversidade no
planeta, cobrindo um 60% da biodiversidade terrestre no planeta. Em adição, cada
uma das 20-25 áreas identificadas como hot-spots de biodiversidade também
suportam um alto nível de plantas endêmicas, indicando que dentro delas exista um
grupo especifico de endofíticos que têm evoluído ao mesmo tempo. Dessa maneira,
plantas que crescem em sítios de alta biodiversidade, são propensas a hospedar
endofíticos com alta biodiversidade metabólica.
Para a indústria farmacológica, os endofíticos são muito atraentes por serem
novos candidatos de novas fontes de medicamentos, especialmente pelo fato de
serem micro-organismos e moléculas que estão presentes em organismos
superiores, o que provavelmente indicaria baixa toxicidade, aspecto que sempre tem
preocupado considerando a toxicidade que têm muitos dos fármacos empregados
em diversas terapias, tais como os tratamentos contra câncer (Azevedo, 2000).
O interesse recente pelos produtos naturais a partir dos micro-organismos
endofíticos vem se refletindo em diversas revisões e artigos científicos, revelando
na maioria dos casos a caracterização de moléculas novas (Guanatilaika, 2006). O
primeiro de eles publicado por Gusman e Vanhaelen (2000), descreve os
metabólitos secundários e suas atividades biológicas de 38 fungos endofíticos. A
partir de ai, revisões mais abrangentes têm sido publicadas como Tan e Zou (2001)
que descreveram 138 metabolitos secundários caracterizados de endofíticos. As
______________________________________________________________________ Introdução
36
revisões realizadas por Shulz et al. (2002), Stroble (2003 e 2004) revelam os
esforços realizados principalmente em seus próprios laboratórios.
Outros trabalhos na literatura ilustram a habilidade de alguns endofíticos, em
especial fungos, de produzir metabólitos próprios da planta hospedeira e que tiveram
uma importância farmacológica por apresentarem atividades biológicas atraentes.
Tan e Zou (2001) acreditam que a razão deste fato está relacionada a
recombinações genéticas do endofítico com seu hospedeiro durante o tempo
evolutivo da relação simbiótica.
O taxol ou paclitaxel, um diterpenoide (Tabela 1), é o composto mais famoso
sintetizado por um fungo endofítico, este fármaco é utilizado em diferentes
tratamentos de câncer tais como pulmão, mama, e ovários, e já representou em
2000 nos Estados Unidos vendas de até 1,6 bilhoes de dólares. Inicialmente o taxol
foi descoberto em 1967 pelos pesquisadores Monroe, Wall, Mansukh e Wani do
Research Triangle Institute que isolaram o composto da casca do teixo do Pacífico
(Taxus brevifolia). Uma planta conífera nativa do noroeste dos Estados Unidos
(Wani et al., 1971).
Já em 1990 Strobel et al. isolaram e identificaram o primeiro fungo endofítico
produtor de paclitaxel, este fungo isolado de T. brevifolia foi denominado Taxumyces
andreanae, que apresentou nos extratos de culturas um composto com o mesmo
espectro de massa que o paclitaxel. Estudos com marcações 14C demonstraram a
presença de paclitaxel no sobrenadante da cultura de T. andreanae (Stierleet al.,
1996).
______________________________________________________________________ Introdução
37
Tabela 1- Metabólitos produzidos pelos endofíticos e pela sua planta hospedeira Metabólito e
atividade biológica Fungo
Endofítico Planta
Hospedeira Referência
O
NH
OH
OO
O
O
O OH
OOH
H
O O
O O Taxol
Anticancerígeno
Taxumyces andreanae Taxus brevifolia Strobel et al.
2004
N
N
O
O
OHHCO2CH3
CHOOMe
H
OH
NH
N
CO2CH3
Vincristin
Anticancerígeno
Mycelia sterilia Catharanthus roseus
Yang et al. (2004)
OH
H
OH
O
H
O
O
HO Ácido giberélico
Gibberela fujikuroi Curcubita maxima Stowe e Yamaki
(1959)
O
O
O
OO
HOHH
O
OH
O
Tricoteceno macrociclico
Fusarium sp. Myrothecium sp.
Baccharis megapotamica
B. cordifolia
Trapp et al. (1998)
Continua
______________________________________________________________________ Introdução
38
Conclusão Metabólito e
atividade biológica Fungo
Endofítico Planta
Hospedeira Referência
O
OOH
ONN
Campetotecina Anticancerígeno
Fungo não identificado
Nothapodytes foetida
Puri et al.,(2005)
OO
OO
OHOH
MeO
OMeOMe
H
Podofilotoxina Anticancerígeno
Trametes hirsuta Podophylum hexandrum
Puri et al.,(2006)
Outras investigações foram feitas para a prospecção de outros produtores de
paclitaxel, fungos endofíticos isolados de teixo como Pestalotiopsis spp
demonstraram sintetizar o composto (Strobel, 2003) . Além do mais, espécies de
fungos endofíticos isoladas de plantas diferentes de teixos têm demonstrado
também a produção de paclitaxel, inferindo que a síntese deste composto não está
somente relacionada com os micro-organismos isolados de teixo, mas também em
plantas ao redor do mundo (Strobel et al., 2003). Acreditando que a presença deste
composto dentro de um organismo hospedeiro se deva a mecanismos de proteção
contra fungos patogênicos que possam causar doenças nestas plantas, tais como
Phytium spp. e Phytophthora spp., o qual comprovou que são os organismos
sensíveis a paclitaxel (Young et al., 1992).
Na atualidade se conhecem centenas de compostos como alcalóides,
terpenoides, flavonóides, esteróides, etc, que são produzidos pelos micro-
organismos endofíticos, muitos deles com propriedades bactericidas, antifúngicas,
antiparasitárias, antivirais, herbicidas, antioxidantes, agentes antidiabetes,
compostos imunosupressores e citotóxicos (Guo et al., 2008). A Tabela 2 apresenta
alguns compostos isolados de micro-organismos endofíticos.
______________________________________________________________________ Introdução
39
Tabela 2 - Atividade biológica de compostos isolados de micro-organismos endofíticos.
Metabólito e atividade biológica
Micro-organismo Endofítico
Planta Hospedeira Referência
Bactérias Endofíticas
C6H5
OO
OMe
MeO
5,7-dimethoxy-4-phenylcoumarin
Antifúngico
Streptomyces aureofaciens CMUAc130
Zingiber officinale Taechowisan et al. (2005)
N2H
OR2
R1
6 5
R1=H, R2CO2H, 5,6 dehydro
ácido 7-(4-aminophenyl)-
2,4-dimethyl-7- oxo-hept-5-enoico
Streptomyces griseus subsp.
(strain HKI0412) Kandelia candel Guan et al.
(2005)
munumbacins A-D Antibiótico
Streptomyces sp. NRRL 30562
Kennedia nigricans
Castillo et al. (2002)
kakadumycin A Antibiótico
Streptomyces sp. NRRL 30566
Grevillea pteridifolia
Castillo et al. (2003)
coronamycin Antibiótico
Streptomyces sp. MSU-2110 Monstera sp. Ezra et al. (2004)
OOOAc
CH3
ClO
CH3H
HH
H
H OHH
COOH
Oocydin A Antifúngico
Serratia marcescens
MSU-97
Rhyncholacis penicillata
Strobel et al. (2004)
Ecomycins Antimicrobiano
Pseudomonas viridiflava Grama Miller et al. (1998)
Fungos endofíticos
O
OH
H
H
OH
OCH3
H
brefeldin A
Antifúngico, antiviral, anticancerígeno
Aspergillus claVatus strain H-
037 Taxus mairei Wang et al.(2002)
Continua
______________________________________________________________________ Introdução
40
Continuação Metabólito e
atividade biológica Micro-organismo
Endofítico Planta
Hospedeira Referência
O CH3
OH OOMe
MeO
rubrofusarin B Citioxico
Aspergillus niger IFB-E003 Cynodon dactylon Song et al.
(2004a) O
O
O
OH
CH3
O
OMeMeOMeO
OMe
fonsecinone A
Citotóxico OH
CH3
O Co2CH3
H
OHOMe OMe
Monomethylsulochrin Antibacteriano
Aspergillus sp. (Strain #CY725) Cynodon dactylon Turner (1965)
OOMe
HOAc
Me
H
Me
Me
H
OAc
MeMe
HOOC
ácido helvólico Antibacteriano
OH
Ergosterol
Continua
______________________________________________________________________ Introdução
41
Continuação Metabólito e
atividade biológica Micro-organismo
Endofítico Planta
Hospedeira Referência
OH
OO
5α,8α-epidioxyergosterol
Aspergillus sp. (Strain #CY725) Cynodon dactylon Turner (1965);
O
OH
OHO
OHO
O
Phomol
Antibacteriano, antifúngico e antiinflamatório
Phomopsis sp. Erythrina crista-galli Weber (2004)
Ácido3-hydroxypropionico Nematicida
Phomopsis phaseoli Plantas tropicais Schwarz et al.
(2004)
R2CO2R1
OH
OH O Cytosporone A-B
A: R1=H, R2=-(CH2)6CH3 B: R1=-CH2CH3, R2=-(CH2)6CH3
Antifungicos e citotxico
Diaporthe sp. CR 146
Forsteronia spicata
Brady et al. (2000)
Continua
______________________________________________________________________ Introdução
42
Continuação Metabólito e
atividade biológica Micro-organismo
Endofítico Planta
Hospedeira Referência
NH
N
N
H H
NN
N
OH O
H
OH
alanditrypinone
Eupenicillium sp Murraya paniculata
Barros e Rodrigues-Filho
(2005)
N
N
H H
NN
N
OH O
H
O
alantryphenone
N
NN
N
OH O
H
alantrypinene
NH
N
N
H H
NN
N
OH O
H
OH
Alantryleunone
______________________________________________________________________ Introdução
43
Conclusão Metabólito e
atividade biológica Micro-organismo
Endofítico Planta
Hospedeira Referência
NH
R1"R2"OO
OH
OH CH3
O
OHOHOH
OH
Cerebroside R1=R2=CH2CH2
Fusaroside R1=R2=CH=CH
Fusarium sp. IFB-121 Quercus Variabilis Shu et al. (2004)
H
HOOC
HOOC ácido piliformico
Xylaria sp. No. 2508 Manguezal Lin et al. (2001)
OH
NH
O
OH
OMe
OMe
Peniprequinolone
Nematicida, acelerador del crescimento das raizes
Penicillium janczewskii
Prumnopitys andina Dai et al. (2001)
NN
SCH3 O
O
CH3
OHS
CH3
CH3
gliovictin
OH
H
OH
H
O
HCH3
H
mellein
1.2.5 Metabólitos secundários de micro-organismos
Os metabólitos secundários são compostos que não estão envolvidos nas
vias bioquímicas essenciais para o crescimento e reprodução do organismo, a
diferença dos metabólitos primários responsáveis pelo crescimento, representado
por processos como a síntese de proteínas, replicação do DNA e biossíntese de
ácidos graxos, entre outros. Os metabólitos secundários constituem uma enorme
família de compostos quimicamente diversos produzidos, geralmente, no início da
______________________________________________________________________ Introdução
44
idiofase (Demain, 1999). A verdadeira função destes compostos nos produtores
continua sendo incerta e muitas hipóteses têm sido levantadas para definir a papel
destes compostos na natureza (Cox e Glod, 2004).
O termo “metabolitos secundários” foi empregado pela primeira vez em 1891
por botânicos e fisiologistas vegetais na classificação de compostos que não tinham
nenhuma função obvia para a planta (corantes, fragrâncias) (Bu'Lock, 1961). Já a
mediados dos anos 60 os microbiologistas adotaram o termo para explicar produtos
bioativos microbianos em especial àqueles considerados como antibióticos (Bennett
e Ciegler, 1983; Bu'Lock, 1961).
As classes dos compostos químicos isolados de micro-organismos incluem
policetídeos, peptídeos não ribosomais, terpenos ou alcalóides. Estes compostos
são sintetizados, respectivamente, por complexos enzimáticos conhecidos como
policetídeo sintase (PKS), peptídeo não ribosomal sintetase (NRPS), terpeno sintase
(TS) e dimetilalil difosfato triptofano sintase (DMATS) (Collemare et al., 2008; Cox e
Glod, 2004). Os substratos para o PKS e NRPS são, respectivamente, moléculas de
acil coenzima A (geralmente malonilCoA e acetilCoA) e aminoácidos. O substrato
para DMATS e unidades dimetilalil fosfato, e os alcalóides são feitos de triptofano e
unidades de isopreno (Keller et al., 2005).
A descoberta da penicilina a partir de cepas de Penicillium sp., marcou o
começo do desenvolvimento de metabólitos secundários microbianos como a Era
dos antibióticos. Desde então mais de 10.000 metabólitos secundários de baixo
peso molecular (menos de 2.500 Da) tem sido isolados de várias espécies de micro-
organismos, especialmente actinomycetes e fungos filamentosos. O estudo químico
destes micro-organismos levou a identificação de vias biossintéticas destes produtos
naturais elucidando a complexidade do seu processo. Com o advento das
tecnologias de DNA recombinante, a biossíntese destes metabólitos tem sido
estudada em nível genético, colaborando para um melhor entendimento de sua
organização e isolamento de numerosos genes associados com a produção destes
metabólitos secundários (Cox e Glod, 2004 ).
Apesar de não saber com certeza o papel destes compostos para seus
organismos produtores, o homem tem se aproveitado da bioatividade destes
produtos para seu benefício próprio, especialmente como fármacos e produtos
______________________________________________________________________ Introdução
45
agropecuários. Por citar alguns exemplos de grande sucesso no mercado
farmacêutico estão os antibióticos eritromicina, vancomicina, tetraciclina e o
tiostrepton; o imunosupresor rapamicina; os anticancerígenos doxorubicina e taxol; e
as estatinas, que são reguladores dos níveis de colesterol no sangue, sendo
amplamente utilizadas no tratamento de doenças cardiovasculares.
Devido às recentes descobertas obtidas pelo seqüenciamento de genomas
inteiros, principalmente de Streptomyces e fungos filamentosos, é bem sabido que
os genes responsáveis pela síntese de metabólitos secundários encontram-se
agrupados no que se conhece como cluster gênicos (Keller et al., 2005; Weld et al.,
2006), revelando que a sua natureza é mais rica do esperada sendo responsáveis
no só pela sua formação, mas também pela suas modificações posteriores e
regulação (Sanchez et al., 2008).
Dois genomas do gênero Streptomyces, S. avermitilis (Omura et al., 2001) e
S. coelicolor (Bentley et al., 2002) e 55 genomas de fungos filamentosos têm sido
completados e um número similar está em processo de seqüenciamento. Desde o
ponto de vista biotecnológico na descoberta dos clusters responsáveis pela síntese
de metabólitos secundários, os genomas dos fungos filamentosos, em especial do
gênero Aspergillus tais como A. nidulans, A. fumigatus, A. oryzae e A. flavus,
apresentaram maior interesse não só por serem patogênicos produtores de
micotoxinas, mas também pelo seu potencial na área farmacológica (Misiek e
Hoffmeister, 2007). Como exemplo, o genoma do A. nidulans abriga 27 genes para
as PKS, 14 para os NRPS e 102 genes para as P450 monooxigenases (Galagan et
al., 2005). Análises dos clusters biossintéticos dos metabólitos secundários, dentro
do gênero Aspergillus, também demonstrou uma baixa homologia entre seus genes,
sugerindo que cada espécie é produtora de um conjunto único de compostos
relevantes para seu próprio desenvolvimento biológico e supervivência.
Outra grande revelação do seqüenciamento é que o número de cluster
biossintéticos é maior de aqueles metabólitos obtidos e caracterizados pelo seu
produtor (Sanchez et al., 2008), fato que está levando à criação de estratégias para
a excreção e produção destes clusters silenciados. Em consequência novas
tecnologias baseadas em engenharia genética estão sendo criadas para a indução
destes genes silenciados. Sendo assim, a expressão heteróloga sobre o controle de
______________________________________________________________________ Introdução
46
vetores especificamente desenhados com promotores definidos está sendo
otimizada para expressão destes clusters (Brakhage et al., 2008; Chiang et al.,
2009).
1.2.6 Policetídeos
Os policetídeos são um grupo de metabólitos secundários com diversas
estruturas e funções (Cox, 2007; Fujii et al., 1998; O'Hagan, 1991) (Figura 1). Mas
de um terço dos produtos naturais ou compostos derivados de produtos naturais
aprovados como fármacos entre 2005-2007 foram policetídeos. As estatinas são os
medicamentos contra doenças cardiovasculares mais bem sucedidos (Roberts,
1996; Shepherd, 2006); a eritromicina A, um macrolídeo antibacteriano, tem sido
utilizado em clínica durante mais de 50 anos (Washington e Wilson, 1985); inclusive
os novos enediynes, um novo tipo de policetídeo, estão entre os mais potentes
agentes anticancerígenos descobertos (Galm et al., 2005).
O termo “policetídeo” foi denominado aproximadamente ao mesmo tempo em
que o dos “metabólitos secundários” em 1907. O significado original foi outorgado
pelo químico John Norman Collie a partir de compostos que contem grupos
policetometilenos (CH2-CO)n e os seus derivados, pela perda ou adição de água ou
pelos processos decarboxilativos; foram identificados como contendo “múltiplos
grupos cetônicos”, como no caso da síntese de orcinol a partir de ácido
dehidroacético (Bentley e Bennett, 1999). A partir deste descobrimento pioneiro de
Collie, a área dos policetídeos vem aumentando significativamente, investigações
não somente vem acontecendo na elucidação das estruturas complicadas das
moléculas, mas também na caracterização das enzimas responsáveis pela sua
biossíntese (Staunton e Weissman, 2001).
___________________________________________________________________________________________________________________ Introdução
47
O
OO
OH O
A. LovastatinaAgente redutor de colesterol
OOH
O
NO
OH
H
OMeOMe
OMe
MeO
B. PederinAnticancerigeno
OOH
O
NO
OH
H
OMeOMe
OMe
MeO
C. Squalestatin S1Agente redutor de colesterol
OHO
OH
D. Ácido 6-metil salicilicoAntibiotico
OH
OH
OHO
E. ÁcidoorselinicoOHO
OH
F. Acido micolicocomponente de membrana
OH
O
O
OH
O
OH
O
O
O OH
O
N MeOH
OMe
Me
G. Eritromicina AAntibiotico
OH
O
O
OH
NaO3SOOH
OH
OH OH
O
O
O
O
O
OHOH
NaO3SO
O
O
O
O
O
OH
O
O
OH
O
O
OO
OO
OOO
O
OO
OO
O
O
O
O
OH
OH
OH
OHOH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH OH
OHOH
OH
OH
OH
H. MaiototoxinaCitotoxico
Figura 1 - Estruturas de policetídeos representativos e as suas bioatividades Fonte: Acoplado de Weissman (2009) Continua
___________________________________________________________________________________________________________________ Introdução
48
OOO
O
O
OH
MeO
OH
HH
H
H
HO2C
I. Monecin AAntibiotico
COOH
K. Acido EicosapentaenoicoComponente de membrana
OH
O
NH2
OHO
O
O
OH OHOH O OH
OHOH
OH
COOH
M. Anfotericina BAntifungico
O
O
OHOH
OH OH
L. YWA1pigmento
OHO
OH
OH
OH O
O
O
O
NH2OH
OMe
J. DoxorubicinaAnticancerigeno
OO
O
OH
O
O
OOH
OHNHMe
O
OOMe
N. NeocarzinoestatinaAntocancerigeno
Conclusão
______________________________________________________________________ Introdução
49
Em termos bioquímicos, estes compostos são sintetizados por um tipo
particular de proteínas, conhecidas como policetídeos sintases ou PKS (do inglês
polyketide synthase). Este complexo protéico consiste em vários sítios ativos
específicos, composto por três domínios básicos para a construção da molécula
policetídica: a ceto-sintase (KS), a proteína carregadora do acil (ACP) e a acil
transferase (AT). Estes domínios podem estar acompanhados de outros domínios ou
enzimas que modificam posteriormente a molécula policetídica (Menzella et al.,
2005; Schumann e Hertweck, 2006).
A síntese dos PK se assemelha com a síntese dos ácidos graxos, embora as
duas vias metabólicas tenham divergido numa fase inicial durante a evolução
(Hertweck, 2009). A síntese dos PK começa pela ligação de uma unidade acila (ex.
acetil-CoA ou malonil-CoA) à KS, conhecida como iniciadora (starter), enquanto a
AT transfere outras moléculas acilas ao grupo prostético do ACP. A KS continua
com as condensações descarboxilativas (Claisen) entre as moléculas acilas para
gerar a β-ceto-acil-ACP. Assim, este processo, repetidamente, origina cadeias com
múltiplos grupos ceto dentro da sua estrutura, molécula conhecida como os
policetídeos. (Menzella et al., 2005; Weissman, 2009).
Outros grupos podem participar no processamento da molécula policetídica,
especialmente, na redução do grupo β-ceto: a cetoredutase (KR) reduz o grupo β-
ceto estereospecificamente, a dehidratase (DH) converte o álcool (-OH) produzido
em C=C e a enoil redutase (ER) reduz o C=C a C-C (Reeves, 2003).
Segundo a conformação destes sítios ativos, referidos à disposição dos sítios
ativos dentro das proteínas e relacionadas com a analogia na síntese dos ácidos
graxos pela FAS (do inglês Fatty Acid synthase) (O’Hogan, 1991), os PKS se
classificam como: tipo I, tipo II e tipo III. A Tabela 3 apresenta as diferenças entre
estes três sistemas de PKS
O PKS tipo I, análogo com o FAS tipo I de fungos e vertebrados, se
caracteriza por ser uma grande proteína multifuncional onde seus sítios ativos estão
ligados ordenada e covalentemente. O PKS tipo II, análogo com a FAS tipo II de
bactérias, se caracteriza por ser um conjunto de proteínas monofuncionais, cada
uma com uma atividade própria e específica (Shen, 2003).
______________________________________________________________________ Introdução
50
Tabela 3 - Diferenças entre os diferentes sistemas de PKS
Tipo de PKS Tipo de produto Modo de ativação do substrato e unidades de substratos
Organismos
Modular I Reduzido ACP; varias unidades ampliadoras Bactéria Interativo I Aromáticos e
reduzidos ACP: malonil‐CoA como unidade ampliadora
Principalmente fungos, algumas bactérias
Interativo II Aromáticos ACP; malonil‐CoA como unidade ampliadora
Exclusivamente de bactérias
Interativo III Aromáticos Substrato‐CoA; malonil‐CoA como unidade ampliadora
Plantas, fungos e bactérias
PKS/NPKS híbrido
Híbridos ACP; malonil‐CoA e aminoácidos Bactérias (modular) Interativo (fungos)
______________________________________________________________________ Introdução
51
Mesmo que as duas vias metabólicas compartam similaridades na sua
enzimologia e na propagação das cadeias crescentes, constituem uma clara
diferença no ramo metabólico entre metabolismo primário e secundário. Os PKSs se
diferenciam das FASs, não somente pela sua habilidade de utilizar uma maior gama
de unidades na construção das moléculas, mas também pela formação de vários
comprimentos da cadeia policetídica. Mais importante, em quanto FAS catalisa um
ciclo redutivo completo depois do processo de elongação, em PKS os passos
redutivos são opcionais gerando um padrão de funcionalidade mais complexo
(Figura 2) (Hertweek, 2009).
Figura 2 - Mecanismos básicos envolvidos na síntese de ácidos graxos (A), e policetídeos
(B). Enz= Enzima
KS
KS
KS
KS
AT AT
AT AT
ACP
ACP
ACP
ACP
DH
DH KR
KR
ER
ER
R
SO
OH
S
O
O
OH
S
O
O
SH
SH
R
S
O
O
R
SO
R
S
O
O
-CO2
-CO2
Condensação de Claisen
Condensação de Claisen
R
S
OH
O
Enz
R
S
OH
O
Enz
R
SO
Enz
R
SO
Enz
R
SO
Enz
R
SO
Enz
R OH
O
Acido graxo
Processamento do B‐ceto requerido
R S
OOH
EnzPolicetídeos
No reduzidos ou reduzidos
Processamento do B‐cetoopcional
(opcional)(ou CoA)
A.
B.
______________________________________________________________________ Introdução
52
Os policetídeos sintetizados pelos PKS I podem ser montados mediante duas
vias diferentes. A primeira é conhecida como PKS modular, presente
primordialmente em bactérias, caracterizada por ser uma megaproteína dividida em
módulos consecutivos, polipeptídios que são utilizados para iniciar e ampliar a
cadeia de carbono. Os sítios ativos presentes em cada módulo são utilizados uma
única vez durante a síntese e determinam a escolha das unidades acilas iniciadoras
e as unidades ampliadoras, além do nível de redução da molécula dentro do módulo.
O comprimento da cadeia de carbono e a seqüência de passos para sintetizar o
policetídeo é determinado pelo número e ordem de módulos (Cortes et al., 1990;
Donadio et al., 1991) (Figura 3). A biossíntese destas moléculas é iniciada a partir
de uma unidade de propionil CoA e 6 unidades ampliadoras de metilmalonil CoA,
como no caso da 6-deoxieritronolide B (Cortes et al., 1990) (Figura 1G). Não
obstante, outras moléculas sintetizadas pelo sistema PKS I modular utilizam outras
unidades iniciadoras mais complexas: rapamicina, um imunosupressor sintetizado
por Streptomyces hygroscopicus, começa sua síntese com o ácido 3,4-
dihydroxycyclohexanecarboxílico como iniciador e 7 unidades de malonil CoA e 7
unidades de metilmalonil CoA como unidades ampliadoras (Motamedi et al., 1997).
Na síntese da avermectina a unidade iniciadora é 2-metilbutiril CoA, derivado de um
aminoácido (MacNeil et al., 1994).
Este sistema controla a biossíntese de vários antibióticos conhecidos, como a
eritromicina A (Figura 1G.) sintetizada pela 6-deoxieritronolide sintase ou DEBS em
Saccharopolyspora erythraea. O descobrimento da sua maquinaria genética remonta
as finais dos anos 80,. Dois laboratórios, um liderado por Peater Leadlay na
universidade de Cambridge exploraram os genes próximos ao gene de resistência
da eritromicina, ermE, descobrindo os genes ery; e o outro grupo liderado por
Leonard Katz do laboratório Abbott os quais conheciam uma região próxima ao gene
ermE, que quando mutada incapacitava a produção do 6-deoxieritronolide B.
Uma nova variante deste sistema PKS I modular tem sido exposta, conhecida
como trans-AT ou AT-less PKS, sendo que o domínio AT aparece como uma ou
várias proteínas independentes do módulo (também classificada como um híbrido
PKS II/ I) (Cheng et al., 2003; Piel, 2002). Uma característica distintiva destes PK
______________________________________________________________________ Introdução
53
trans-AT é a introdução de ramificações metilas ou etilas nos carbonos β centrais da
cadeia de carbono, como no caso da pederina (Figura 1B) (Weissman, 2009).
Figura 3 - Montagem dos policetideos: A. PKS tipo I modular 6-deoxieritronolide pelo PKS DEBS); B. PKS tipo I interativo Lovastatina; C. PKS tipo II Doxorubicina; D. PKS tipo III Nranginina chalcona.
Fonte: Modificado de Donadio et al. (1991) e Hertweck (2009).
Em contraste, a segunda via utiliza um sistema interativo, onde uma única
enzima multifuncional utiliza seus sítios ativos repetidamente para a síntese e
ampliação da cadeia de carbono a partir de acetato e malonato. No entanto, se
desconhece como um único grupo de sítios ativos controla o comprimento e o nível
de redução na síntese destas moléculas, comparado com o mecanismo empregado
pelo PKS tipo I modular. Entre as moléculas sintetizadas por meio deste sistema tipo
I interativo, são conhecidas a lovastatina (Figura 1A.) e o ácido 6-metilsalicilico
(Figura 1D.), entre outros (Schumann e Hertweck, 2006).
Este sistema de PKS tipo I interativo (iPKS), é objeto deste trabalho e está
presente primordialmente em fungos filamentosos do filo dos ascomicota. O PKS
fúngico consiste nos domínios básicos já mencionados (KS-AT-ACP). Em adição,
KSα KSβ
ACP
KS
KS
ER
AT DH MT KR
R
SO
ER S O
OH
OH
OH
O
O
O
O
H
8 MalonilCoASAM *
*
ACP LovB
Lovastatina
S
OH
O
CoASH
OH
S
O O O O
CoA
n
O
O OH
OH
3 MalonilCoA
NarangininaChalcona
LovCS
OOO
O
O O
O R
OO
OO OH O
Sug
OH
OHO O
OMe
Doxorubicina
AcilCoA9MalonilCoA
B.
A.
D.
C.
______________________________________________________________________ Introdução
54
algumas reações de redução dos grupos β-cetônicos são catalisados por domínios
ceto redutase (KR), dehidratase (DH) e enoil redutase (ER). Outros domínios podem
ser opções adicionais como as ciclases (CYC) (Fujii et al., 2001) e metiltransferases
(MT) (Hutchinson et al., 2000). Em contraste com as enzimas post-PKS com funções
de O- e N- metilação, a metilação do esqueleto de carbono do policetídeo é
realizada durante a construção da cadeia policetídica por um domínio intrínseco C-
MT (Nicholson et al., 2001).
Dependendo da arquitetura da proteína e da presença ou ausência dos
domínios adicionais, que processam o grupo β-cetônico, que darão a características
estruturais da molécula, os PKS fúngicos são agrupados em: não reduzidos (NR-
PKS) ou aromáticos, pela ausência dos domínios redutores e processadores do
grupo β-cetônico e presença de uma CYC; os parcialmente reduzidos (PR-PKS),
com presença apenas de dois domínios redutores (KR e DH) e os altamente
reduzidos (HR-PKS) pela presença de todo os domínios redutores e processadores
do grupo β-cetônico (Figura 4) (Schumann e Hertweck, 2006).
Figura 4 - Exemplos de NR-PKS (PksA, Pks1 e WA) PR-PKS (6MSAS) e HR-PKS (LDKS, MlcB, SQTKS, LNKS MlcA) e a sua respectiva arquitetura dos domínios
Fonte: Schumann e Hertweck (2006).
______________________________________________________________________ Introdução
55
Os policetídeos sintetizados pelos diferentes PKS fúngicos proporcionam
certas características químicas, dependendo da arquitetura dos seus domínios: por
exemplo: às moléculas sintetizadas por NR-PKS como o ácido orselínico (Figura
1H) e YwA1 (Figura 1K), não apresentam nenhum processamento de redução
durante sua biossíntese; as moléculas sintetizadas por PR-PKS como, o ácido 6-
metilsalicílico (6MSA) (Figura 1 D.), apresentam uma redução parcial, ou seja, uma
única ação dos domínios KR e DH; as moléculas sintetizadas por HR-PKS, como a
lovastatina (Figura 1A) e a esqualestatina (Figura 1C), apresentam um nível de
redução maior nas suas estruturas (Figura 3).
Recentes estudos filogenéticos baseados nas seqüências de aminoácidos do
domínio KS forneceram valiosas idéias sobre a relação evolutiva entre diferentes
tipos de PKS fúngicos(Bingle et al., 1999; Kroken et al., 2003; Nicholson et al.,
2001). Kroken et al. (2003) demonstraram que as seqüências de aminoácidos do
domínio KS fúngicos se agrupam em PKS envolvidos na síntese de moléculas
reduzidas e não-reduzidos, de acordo com o grau de redução dos seus policetídeos
sintetizados, ou seja, da presença ou ausência dos domínios adicionais. Os KS que
pertencem aos PKS envolvidos na síntese de policetídeos reduzidos se dividiram em
4 subclados: o clado I (lovastatina/citrinina dicetídeo-similares) se caracteriza por ter
a arquitetura dos domínios KS-AT-DH-(MT)-ER-KR- ACP, o clado II
(lovastatina/citrinina nonacetídeo-similares), se caracteriza por ter a arquitetura dos
domínios KS-AT-DH-(MT)-KR-ACP-(CON)-(AMP-ACP) (perda do domínio ER e
ganho de domínios de síntese de poliptídeos), o clado III (T-toxinas nonacetídeo-
similares) se caracteriza por ter a arquitetura dos domínios KS-AT-DH-ER-KR- ACP-
ACP (perda do domínio MT) e o clado IV (fumomisina-similares) que se caracteriza
por ter a arquitetura dos domínios KS-AT-DH-(MT)-ER-KR- ACP, igual ao do clado I,
porém, responsável pela síntese de policetídeos completamente diferentes.
Entre os KS que pertencem aos PKS envolvidos na síntese de policetídeos
não-reduzidos, também se dividiram em 4 subclados: o clado I (aflatoxinas/
esterigmatocistina e pigmentos não melanoides ) se caracteriza por ter a arquitetura
dos domínios KS-AT-ACP-(ACP)-CYC; o clado II (melaninas) se caracteriza por ter a
arquitetura dos domínios KS-AT-ACP-(ACP)-CYC. O clado III (não caracterizado)
apresenta a arquitetura dos domínios KS-AT-ACP-(ACP)-MT-(CYC) (ganho do
domínio MT em NR-PKS); e um clado basal entre o clado I e II (não caracterizado)
______________________________________________________________________ Introdução
56
que se caracteriza por ter a arquitetura dos domínios KS-AT-ACP-(ACP)-(CYC). A
Tabela 4. Apresenta algumas PKS com seu respectivo policetídeo que já foram
caracterizadas e descritas na literatura.
Em alguns casos, módulos do sistema PKS I podem estar acoplados a
módulos do sistema (sintetases peptídicas não-ribossomais) peptídeo não
ribosomais sintetases (NRPS do inglês nonribosomal peptide synthetase),
resultando na produção de metabólitos de natureza híbrida. Recentes descobertas
têm acoplado outros sistemas ao sistema tipo I: o primeiro deles, aparentemente um
híbrido de FAZ/PKS (Metz et al., 2001) gera ácidos graxos poli-insaturados (ou
PUFASs do inglês polyunsaturated fatty acids) em micróbios marinhos. Estes
metabólitos de C20+ fazem parte da membrana destes micro-organismos
concedendo adaptações especiais para este tipo de ambientes. Nesta biossíntese,
os ácidos graxos insaturados são derivados a partir de processos de elongações e
subseqüentes dessaturações de ácidos graxos saturados (Kaulmann e Hertweck,
2002). Os PUFAS PKSs já descritas, se diferenciam do PKS I interativo de fungos,
pelo seu mecanismo de síntese e pela organização dos sítios ativos contendo até
nove domínios ACP consecutivos (Jiang et al., 2008). O segundo sistema é
conhecido como PKSE (Van Lanen e Shen, 2008) que participa na formação da
classe dos policetídeos enediynas em bactérias, como a neocarzinoestatina (Figura
1J). O destaque destas moléculas está no seu núcleo insaturado compreendendo
dois grupos acetilenos conjugados a uma dupla ligação. O precursor do núcleo, o
poliênos, é montado via PKS I interativo, contendo um domínio ACP atípico ao
sistema I, ocupando uma posição diferente à encontrada no sistema PKS I típico. Há
também um domínio terminal atípico cuja função não tem sido designada. A
maturação do núcleo envolve adições de outras unidades como deoxi- e tio-
açúcares, as quais são responsáveis pelo ajuste da sua atividade biológica como um
potente anticancerígeno (como visto nas antraciclinas). (Moss et al., 2004;
Weissman, 2009).
____________________________________________________________________________________________________________________ Introdução
57
Tabela 4 - PKS fúngicos e seu arranjo na arquitetura dos domínios de diferentes metabolitos secundários PKS fúngico Origem Policetídeo Arquitetura dos domínios Referência
AflC A.flavus, A. parasiticus, Aflatoxina KS-AT-ACP-TE (Yu et al., 1995)
StcA A. nidulans Esterigmotosistin KS-AT-ACP-ACP-TE (Brown et al., 1996)
PksA Dothistroma septosporum Dothistromin KS-AT-ACP-ACP-ACP-CYC (Bradshaw et al., 2006)
WA A. nidulans Melaninas KS-AT-ACP-ACP-TE (Mayorga e Timberlake, 1992)
PKS1 C. lagenarium (Watanabe e Ebizuka, 2004)
PKSP A. fumigatus (Tsai et al., 1998)
PKS4 G. fujikuroi Bikaverina KS-AT-ACP-TE (Linnemannstons et al., 2002)
ZEA1 F. graminearum Zearalenona KS-AT-ACP-TE (Kim et al., 2005)
ZEA2 KS-AT-DH-ER-KR-ACP
PksN Nectria haematococca Pigmento peritecial KS-AT-ACP-ACP-TE (Graziani et al., 2004)
PksCT Monascus purpureus Citrinina KS-AT-ACP-MT (Shimizu et al., 2005)
CTB1 Cercospora nicotianae Cercosporina KS-AT-ACP-ACP-TE/CYC (Choquer et al., 2005)
LDKS A. terreus Lovastatina KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP (Kennedy et al., 1999)
LNKS KS-AT-DH-MT-(ER inativo)-KR-ACP-PSED
MlcA P. citrinum Compactina KS-AT-DH-(MT inativo)-KR-ACP-PSED (Abe et al., 2002)
MlcB KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP
SQTKS Phoma sp. Squalestatina KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP (Cox et al., 2004)
PKS1 C. heterostrophus T-toxina KS-AT-DH-ER-KR-MT-ACP (Baker et al., 2006; Yang et al., 1996)
PKS2 KS-AT-DH-ER-KR-ACP
FUM1 G. fujikuroi Fumonisina KS-AT-DH-ER-KR-ACP (Proctor et al., 2004)
PKSN Alternaria solani Alternapirona KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP (Fujii et al., 2005)
FusS F. graminearum, F. verticilloides Fusarin KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP-C-A-PCP-R (Song et al., 2004b)
Continua
____________________________________________________________________________________________________________________ Introdução
58
Conclusão PKS fúngico Origem Policetídeo Arquitetura dos domínios Referência
EqiS F. heterosporum Equisetina KS-AT-DH-MT-KR-ACP-C-A-PCP-R (Sims et al., 2005)
MSAS P. patulum, A. terreus Ácido 6-metilsalicilico
KS-AT-KR-ACP (Beck et al., 1990; Fujii et al., 1996)
PKS12 F. graminearum Aurofusarina KS-AT-ACP-TE (Malz et al., 2005)Malz et al.,2005
______________________________________________________________________ Introdução
59
A lovastatina é um policetídeo que faz parte da classe das estatinas, e que é
objeto de estudo deste trabalho, é sintetizada por duas enzimas PKSs, a lovastatina
dicetídeo síntase e a lovastatina nonaetídeo síntase (LDKS-LNKS) (Hendrickson et
al., 1999). Os primeiros estudos da biogênese da lovastatina foram realizados
empregando cepas de Aspergillus terreus e precursores marcados (Greenspan e
Yudkovitz, 1985; Moore e Hopke, 2001; Shiao e Don, 1987), os quais indicaram que
a via biossintética da lovastatina inicia-se a partir de unidades de acetato (4 e 8
carbonos), ligados um do outro, consecutivamente para formar duas cadeias
policetídicas. O grupo metila presente em algumas estatinas é derivado da
metionina, como ocorre freqüentemente em metabólitos de fungos, e é inserida na
estrutura antes da sua ciclização (Shiao e Don, 1987).
Depois de ocorrer às respectivas condensações das unidades de acetato à
cadeia principal de 8 carbonos, a molécula é fechada, e em algumas estatinas
esterificada com outra cadeia policetídica lateral, de 4 carbonos, no C8. Os átomos
de carbono presentes na cadeia principal são inseridos depois por uma oxidação
aeróbica mediante precursores desoxigenados (Greenspan e Yudeovitz 1985; Moore
e Hopke, 2001).
Investigações mais recentes sobre a cinética enzimática junto com a
regulação gênica e a expressão em A. terreus mutantes apontaram que o sistema
responsável pela biossíntese é uma policetídeo sintase multifuncional ou PKS. Esta
é composta por uma lovastatina nonacetideo sintase (LNKS), envolvida na ciclização
da cadeia principal para formar o anel hexahidro naftalénico levando ao composto
diidromonacolin L, que posteriormente é convertido em monacolin L e
sucessivamente em monacolin J; e uma dicetideo sintase (LDKS) envolvida na
transferência da cadeia metil butirica para a cadeia principal que leva à formação da
lovastatina.
A caracterização dos genes responsáveis pela síntese da LNKS e da LDKS
foi realizada por Hutchinson et al. (2000) e Kennedy et al. (1999), permitindo o
entendimento da estrutura da monacolin J e da lovastatina. O LNKS é produto do
gene lovB, que interage com a lovC, uma enoil redutase, para catalisar as primeiras
reações para a biossíntese da monacolin J. Nos passos finais da via biossintética da
lovastatina, o LDKS, sintetizado pelo gene lovF, interage com a lovD, a
______________________________________________________________________ Introdução
60
transesterase, para catalizar a ligação entre o ácido 2-metilbutírico e o monacolin J e
formar a molécula completa da lovastatina (Figura 5).
Figura 5 - Via biossintética da lovastatina. A. caracterização dos genes responsáveis pela síntese da LNKS e da LDKS B. Via hipotética da síntese da lovastatina mostrando a função de cada sitio ativo.
Fonte: Modificado de Kennedy (1999).
Finalmente foi demonstrada a função desconhecida do lovC por Aclair et
al.(2001), que utilizando mutantes no gene lovC, determinaram que a função da
proteína que este gene codifica é garantir a correta montagem da cadeia
nonacetidica pela proteína codificada pelo gene lovB. Em contraste, a formação da
cadeia dicetidica pelo gene lovF não precisa da proteína lovC, e esta não atua em
processo post PKS.
Outra importante característica da síntese da lovastatina foi à descoberta da
reação de Diels-Alder no fechamento do anel hexacetídeo na formação do sistema
bicíclico na molécula diidromonacolina L.
O sistema PKS tipo II está caracterizado por sintetizar policetídeos
aromáticos, principalmente em bactérias, formados por um conjunto de 5 a 10
CH3
HCH3
OHH
OHCOOH
CH3
HCH3
OHH
OHCOOH
CH3
HCH3
OHn
CH3
HCH3
OHH
OH
OH
COOH
CH3
HCH3
OH
OH
O
COOH
CH3
CH3
O
CH3
COSE
O
CH3
COSE
CH3
COSE
CH3
CH2COS-CoACOOH
CH3COS-CoA+
DihidromonacolinL MonacolinL Monacolin J lovastatinalovD
lovF
CH3COS-CoA
CH2COS-CoACOOH
+ ES
O
CH3
SE
CH3
O
SE
CH3
O
SEO
CH3
CH3
SEO
CH3
CH3CH3
OSE
CH3CH3 H
CH3
OH
SEO
KR, DH KR, DH KR, DH
ER,CMT
KR, DH
KR, DH, ER
Ciclizalção
KR, DH, ER
KR 2X
lovB + LovC
ORF1 ORF2 lovA lovB ORF5 lovC lovD ORF8 lovE ORF10
lovF ORF12 ORF13 ORF14 ORF15 ORF16 ORF17 ORF18
37 kb
64 kb
A.
B.
______________________________________________________________________ Introdução
61
proteínas individuais, cada uma codificada por um gene diferente. A síntese da base
de carbono do policetídeo precisa de três proteínas fundamentais, referidas como
PKS mínimo: a β-cetosintase (KSα), fator elongador da cadeia (CLF ou KSβ) e a
proteína carregadora do acil (ACP). A constituição da molécula é iniciada a partir de
precursores carboxilados, como acetato ou malonato, que é a molécula mais comum
usada como unidade iniciadora e grupos de malonil o metilmalonil como unidades
ampliadoras (Schneider, 2005). Como no exemplo da síntese da actinorodina por
uma cepa de Streptomyces coelicolor A3(2) (Hopwood, 1997), e a doxorubicina
(Figura 1L) por S. peucetius (Grimm et al., 1994). No entanto, alguns destes
sistemas podem utilizar diferentes unidades na iniciação ou elongação da molécula;
na síntese da oxitetraciclina não se tem certeza se a unidade iniciadora é malonato
ou malonamato em Streptomyces rimosus (Findlow et al., 2003). As outras enzimas
realizam as modificações estruturais como as redutases, aromatases, ciclases e
enzimas tailoring as quais dão origem a uma grande diversidade de compostos
(Moss et al., 2004).
O PKS do tipo III, o qual é uma extensão da classificação baseada em FAS,
está relacionado com as enzimas pertencentes à chalcona sintase (CHS) e estilbene
sintase (STS), os quais estão relacionados com a biossíntese de compostos como a
naringenin chalcone(Wilkinson e Micklefield, 2007). Inicialmente foram identificados
em plantas, mas recentes análises têm identificado estes genes em bactérias e
fungos filamentosos e, atualmente, já se conhecem mais de 15 ceto-sintases deste
sistema tipo III (Moore e Hopke, 2001). RppA foi à primeira PKS III descrita em
bactérias por Ueda et al., em 1995 a partir de cepas de Streptomyces griseus que
catalisa a formação de 1,3,6,8-tetrahidroxinaftaleno (THN) a partir de 5 moléculas de
malonil CoA.
A PKS III ou Chalcone-like synthase consiste numa proteína ceto-sintase de
aproximadamente 40-47 kDa que funciona como um homodímero, catalisando as
condenações usando unidades de acetato, independente a ACP, atuando
diretamente nos substratos acil CoA como unidades iniciadoras gerando produtos
aromáticos mono e bi cíclicos (Bangera e Thomashow, 1999; Funa et al., 1999;
Moore e Hopke, 2001). Neste sistema, a extensão da cadeia é freqüentemente
seguida de condensações e aromatizações intramoleculares dos intermediários
lineares, todo dentro do mesmo sítio ativo do único PKS (Austin e Noel, 2003). Este
______________________________________________________________________ Introdução
62
sistema baseia sua diversidade estrutural, não pela arquitetura dos sítios ativos
dentro do sistema PKS, mas sim pela variedade das unidades iniciadoras, do
número de passos de elongação (geralmente de 1 a 8), e do mecanismo de
ciclização (Weissman, 2009). A arquitetura simples deste sistema PKSIII tem
permitido um desenvolvimento acelerado dos mecanismos de ação destas enzimas.
Porém, muitas questões fundamentais ainda ficam sem resolver, particularmente em
quanto às variantes em fungos e bactérias, os quis são objeto de futuros estudo na
área dos PKS.
1.2.7 Estatinas
As doenças das artérias coronárias e lesões ateroscleróticas, relacionadas
com o risco de hipercolesterolemia, representam uma das principais causas de
morte nas últimas décadas. No metabolismo dos lipídios, em indivíduos saudáveis,
um terço do colesterol é derivado da dieta diária e os outros dois terços restantes
são sintetizados diretamente de precursores intracelulares em vários órgãos do
corpo (Alberts et al., 1980; Demain, 1999; Furberg, 1999). Estas razões tornaram o
controle da colesterogênesis um dos assuntos mais importantes para saúde pública,
e a busca por compostos que atuam inibindo a biossíntese do colesterol tornou-se
uma prioridade para diminuir os níveis deste composto no plasma.
O colesterol é um esteróide essencial para as membranas celulares e é o
componente para a biossíntese de ácidos biliares, para a absorção de gorduras e
vitaminas solúveis no intestino. O colesterol também está relacionado à biossíntese
de hormônios e é requerido para a produção de lipoproteínas de baixa densidade
pelos hepatócitos, os quais são responsáveis pelo transporte de gorduras para os
tecidos periféricos para um subseqüente metabolismo ou armazenamento (Alberts et
al., 1980; Alberts, 1988; Tobert, 1987).
A via de biossíntese do colesterol utiliza unidades de acetil-CoA como
iniciadores da síntese e envolve mais de 25 enzimas, onde o passo limitante é a
conversão de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) a mevalonato pela HMG-CoA
redutase (EC 1.1.1.34) (Figura 6). Os primeiros estudos na busca de inibidores da
síntese de colesterol levaram a compostos que inibem os últimos estágios da
síntese, como o triparanol, que bloqueia o penúltimo passo da biossíntese, inibindo a
______________________________________________________________________ Introdução
63
redução de desmosterol a colesterol, mas com a desvantagem que leva ao acúmulo
de esterol nos tecidos, com sérios efeitos laterais (Steinberg et al., 1961).
Figura 6 - Via Biosintética do colesterol e do ergosterol, alguns outros compostos produzidos a partir do farinesil difosfato
Fonte: Modificado de Chan et al. (2003).
Escaleno sintase é a primeira enzima específica no processo da síntese do
colesterol e catalisa a condensação de duas moléculas de farnesil difosfato (FPP)
para a formação do escaleno. Os primeiros análogos de FPP desenvolvidos, foram o
inibidor da escaleno síntase, embora necessite de especificidade e, dessa maneira,
pode potencialmente interferir em outras FPP transferases. Para aumentar a
especificidade, análogos da FPP e outros inibidores das enzimas envolvidas na
síntese de colesterol foram desenvolvidos, BMS-188494, ácido sulfônico farnesil
difosfato, demonstrou boa efetividade como droga anticolesterolémica (Patel, 2000).
Acetil CoA
Acetoacetil CoA
HMG-CoA
Mevalonato
Isopentilpirofosfato
Geranilpirofosfato
Farnesilpirofosfato
Esqueleno
Lanosterol
Colesterol Ergosterol
Ubiquinonas
Dolicol
Cadeia respiratoriammitocondrial
Sintesis deGlicoproteinas
+Proliferacao
ProteinasGeraniladas
ProteinasFernesiladas
Isoprenilacao deProteinas ligadoras
De GTP
Estatinas
______________________________________________________________________ Introdução
64
No entanto, os inibidores da HMG-CoA redutase, acumulavam HMG-CoA que
podiam ser metabolizado em compostos mais simples, sem a formação de algum
corpo lipídico que tivesse um anel esteroidal. As estatinas são uma classe de
moléculas que contêm uma estrutura policetídica, obtidos a partir de metabólitos
secundários de fungos ou de maneira sintética que podem inibir a atividade da
HMG-CoA sintase, tornando-a uma molécula mais estável para o tratamento
terapêutico no controle de colesterol endógeno(Alberts et al., 1980; Alberts, 1988;
Endo et al., 1985; Tobert, 1987)
1.2.8 Estrutura das estatinas
Existem diferentes tipos de estatinas disponíveis: as estatinas naturais
(Lovastatina e Pravastatina) obtidas diretamente por fermentação utilizando micro-
organismos produtores; as estatinas semi-sintéticas (simvastaina) e as sintéticas
(atorvastatina e fluvastatina). As estatinas naturais são muito similares em suas
estruturas, elas possuem uma porção basal policetídica comum: um sistema
composto por um anel naftaleno junto a uma β-hidroxilactona, no qual diferentes
cadeias de comprimentos variados podem ser ligadas no carbono 8 (C8 ou R1) e no
carbono 6 (C6 ou R2) Figura 7. Lovastatina (ou mevinolin, monacolin K, e Mevacor®
, Merck) contêm uma cadeia metil butirica em R1 e um grupo metil no R2, o qual não
está presente na estrutura da mevastatina (ou Compactina). A Pravastatina (ou
Eptastatin® e Pravachol®, Bristol-Myers Squibb/Sankyo) contém no R2 um grupo
hidroxil, Sinvastataina (ou Symnvinolin® e Zocor®, Merck) contém um grupo metil
adicional na cadeia lateral que se liga a R1.
Além destes compostos, muitos outros metabólitos relacionados com a
síntese de lovastaina e mevastatina têm sido isolados e caracterizados. Monacolin X
e M tem uma composição diferente na cadeia lateral ligada a R1. Monacolin J e L,
moléculas intermediárias na síntese da lovastatina necessitam da cadeia lateral
ligada a R1 substituídos por um grupo hidroxil ou um hidrogênio, respectivamente.
______________________________________________________________________ Introdução
65
Figura 7 - Estrutura das estatinas. A. Estrutura base (Anel naftaleno e a β-hidróxi lactona). B. Estruturas que diferenciam as estatinas no C8 (R1) e C6 (R2)
Fonte: modificado de Manzoni e Rollini, 2003
A estrutura das estatinas sintéticas atorvasatatin (Lipitor®, Parke-Davis),
fluvastatin (Lescol®, Novartis) e cerivasatatin (Baycol® e Lipobay®, Bayer) são
diferentes entre si e entre as estatinas naturais. Unicamente se assemelham na
fração homóloga do HMG-CoA, responsável pela inibição na via do mevalonato, e
comum em todas as estatinas. A fluvastatina, derivado da mevalolactona, foi a
primeira estatina sintética disponível no mercado (Levy et al., 1993), enquanto a
atorvastatina e a cerivastatina, derivados de piridina, são compostos de novas
gerações de estatinas (Bakker-Arkema et al., 1996).
1.2.9 Produção das estatinas
Desde 1970 as investigações na produção e isolamento de estatinas têm
indicado a possibilidade de obter-se uma ampla variedade de moléculas como
produtos finais, metabólitos intermediários ou produtos de processos de
R2
R1H
CH3
O
OH OA. B.
R1 R2
CH3
H
OH
Lovastatina
Mevastatina
Pravastatina
Simvastatina
Monacolina J
Monacolina L
Monacolina X
Monacolina M
O
O
CH3 H
O
O
CH3 H
O
O
CH3 H
O
O
CH3 H
O
O
CH3 H
O
O
CH3 CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
OH
H
______________________________________________________________________ Introdução
66
biotransformações. Algumas destas estatinas já foram produzidas mediante
processos fermentativos em grande escala (Barrios-Gonzalez e Miranda, 2010;
Manzoni e Rollini, 2002).
As estatinas naturais são produzidas principalmente por cepas de A. terreus
(Alberts et al., 1980; Greenspan e Yudkovitz, 1985) e por diferentes espécies do
gênero Monascus (Endo, 1979; Endo et al., 1985; Kimura et al., 1990; Komagata et
al., 1989; Shiao e Don, 1987), mas também existem relatos na literatura da produção
desta classe de compostos por outros gêneros de fungos filamentosos como
Penicillium (Endo et al., 1976; Hosobuchi et al., 1993), Doratomyces, Eupenicillum,
Gymnoascus, Hypomyces, Peacilomyces, Phoma, Trichoderma (Endo et al., 1986),
e Pleurotus (Gunde-Cimerman et al., 1993).
A lovastatina foi a primeira estatina a ser aprovada pela FDA em 1987, e
disponibilizada no mercado como agente anticolesterolêmico (Tobert, 1987);
entretanto a mevastatina (ML-236B) foi a primeira estatina a ser descoberta, isolada
em 1976 a partir de uma cepa de Penicillum citrinum pelo pesquisador Endo et al.
1976. Ao mesmo tempo, nos laboratórios Beecham foi isolada a mesma estatina a
partir de uma cepa de Penicillum brevicompactum (Brown et al., 1978).
Nos anos seguintes a lovastatina (conhecida como mevinolin) foi obtida a
partir de uma cepa de A. terreus isolada do solo no laboratório CIBE em Madrid,
Espanha (Alberts et al., 1980) e por outra cepa de M. ruber (conhecida como
monacolin K) por Endo em 1979. Em um programa de busca de cepas de fungos
produtores de estatinas foram testadas 124 cepas do gênero Monascus, sendo que
17 delas apresentaram produção de lovastatina, e dentre elas encontravam- se
espécies do tipo M. ruber, M. purpureus, M. pilosus, M. vitreus e M.pubigerus
(Negishi et al., 1986)
Outros estudos voltados à síntese e caracterização de compostos
relacionados à lovastatina, indicaram que algumas monacolinas são obtidas
principalmente por cepas de Monascus sp.. Monacolina J e L foram isoladas e
caracterizadas em culturas de M. ruber (Endo et al., 1985). Outras investigações
concentram-se no desenvolvimento de novas estatinas com melhores atividades
biológicas obtidas de modificações de estatinas já caracterizadas como a lovastatina
e a mevastatina. Foram testadas diferentes biotransformações a partir destas
______________________________________________________________________ Introdução
67
estatinas adicionadas diretamente no meio de cultura, resultando na obtenção da
pravastatina, uma estatina com particular interesse, já que apresentou melhores
resultados na inibição da síntese de colesterol in vitro em relação ao seu precursor,
a mevastatina (Endo, 1979; Watanabe et al., 1988). A pravastatina é obtida a partir
de um processo fermentativo de dois estágios, o primeiro consiste na produção da
mevastatina para depois ser biotransformada. A biotransformação consiste na β-
hidroxilação do C6 da mevastatina, pode ser realizada por diferentes espécies de
fungos e de Actinomycetos. Entre os micro-organismos destacados para a
biotransformação está o Mucor hiemalis, que obteve uma taxa de conversão entre o
30-90%, mas apresentou sensibilidade à mevastaina em concentrações de 0.05%
na forma lactona. Só foi atingida uma produção em maior escala quando Matsuoka
et al. (1989), obtiveram a pravastatina utilizando uma cepa de Streptomyces
carbophilus mediante um sistema enzimático que continha a citocromo P-450.
Outra série de estatinas foi obtida a partir de modificações químicas da cadeia
lateral da lovastatina situada no C8, de onde se obteve a simvastatina a partir de
processos semi-sintéticos, molecula que tem aplicações práticas na redução dos
níveis de colesterol no plasma sanguineo (Manzoni e Rollini, 2002).
O processo industrial para a produção da lovastatina foi implementado em
1980 a partir da cepa de A. terreus (Mevacor®, Merck). O desenvolvimento do
processo abarcou a análise de diferentes parâmetros fermentativos tais como a
homogeneidade do cultivo, efeitos de vários tipos de fontes de carbono, pH, aeração
e desenho dos mecanismos de agitação. O re-isolamento da cepa produtora junto
com o controle do pH e suplemento da fonte de carbono, em particular o glicerol,
produziu um aumento considerável em relação à produtividade inicial da lovastatina.
O aumento da escala de produção até 19000 litros revelou que a
transferência de oxigênio relacionada com a alta viscosidade do meio de cultivo é
uns dos fatores mais importantes na produtividade da lovastatina. Esta limitação foi
superada mediante a utilização de um impulsor mecânico mais eficiente com
aumento da força hidrodinâmica e redução da energia requerida com um 66% na
turbina Rushton (Gbewonyo et al., 1992).
______________________________________________________________________ Introdução
68
1.3 OBJETIVOS
Prospecção dirigida à identificação de genes da via biossintética dos
policetídeos em fungos endofíticos e de rizosfera isolados de cana-de-açúcar.
Para cumprir tal objetivo, foram planejadas as seguintes atividades:
1. Identificação dos isolados pela análise da região ITS1-5.8S- ITS2 do
rDNA 16S e por técnicas morfológicas macro e microscópicas.
2. Caracterização da atividade biológica contra bactérias, leveduras e
fungos filamentosos
3. Identificação dos genes PKS por meio da técnica do PCR.
4. Produção e purificação dos policetídeos.
4 Conclusões e perspectivas
______________________________________________________ Conclusões e perspectivas
170
O presente trabalho representa a primeira caracterização de genes PKS de
fungos derivados da cana-de-açúcar. Os resultados revelaram uma grande
diversidade de fungos endofíticos capazes de produzir policetídeos, que podem
eventualmente, ter funções distintas sobre a manutenção em ambientes tropicais.
Este trabalho abre novas perspectivas para o desenvolvimento de outros estudos
relativos ao potencial desses fungos na biossíntese de pigmentos, toxinas e/ou
compostos policetídicos ainda não descritos. Neste contexto, os fungos derivados da
cana-de-açúcar podem representar uma fonte promissora de recursos genéticos
microbianos a serem explorados pela biotecnologia farmacêutica, os setores
agrícolas e ambientais.
Os resultados mais relevantes do presente trabalho estão apresentados a
seguir:
O isolado CBMAI 1023 identificado como A. flavus, demonstrou capacidade
de produção de uma ampla variedade de metabolitos secundários, não só pelos
compostos detectados nas análises químicas, mas, também, nos seus níveis de
expressão gênica. Como perspectiva futura sugere-se a construção de novos
iniciadores, a avaliação de diversos meios e condições de cultura e, inclusive, a
expressão heteróloga de genes silenciados. Em relação ao composto 1, purificado
do caldo de fermentação, serão realizadas etapas de purificação para elucidar sua
estrutura e avaliar sua potencial atividade biológica.
O isolado CBMAI 1030 foi identificado como Sacharicola sp., corroborando
com resultados já descritos na literatura que mostra ser um micro-organismo isolado
somente de cana-de-açúcar . Este fato sugere que esta linhagem pode apresentar
características genéticas únicas, onde os genes PKS participariam em funções
fundamentais. Os genes PKS identificados neste trabalho não apresentaram
similaridade com genes já caracterizados, levando ás suposições de que estes
genes sintetizem novos tipos de PK. Como continuidade deste trabalho propõe- se
realizar análises mais detalhadas destes genes visando uma melhor caracterização.
O isolado CBMAI 1018 identificado como Trichoderma sp. apresentou as
atividades biológicas mais amplas, inibindo o crescimento de bactérias, leveduras e
fungos filamentosos, quando expostos aos extratos produzidos por este. Muitos
______________________________________________________ Conclusões e perspectivas
171
trabalhos têm reportado o isolamento de uma grande variedade de metabolitos
secundários de espécies de Trichoderma, entre eles alguns policetídeos. Contudo,
nenhum trabalho tem reportado a caracterização de genes PKS responsáveis pela
síntese destes compostos, tornando os genes PKS identificados neste trabalho
fortes candidatos para uma futura caracterização.
O isolado CBMAI 1029 pode representar uma nova espécie, considerando a
alta similaridade com fungos que ainda não foram identificados e a baixa
similaridade com fungos conhecidos, quando comparada sua seqüência com
aquelas depositadas nos bancos de dados. Além disso, a detecção de um suposto
novo gene PKS (seqüência de 33Nid) a partir deste fungo reforça esta hipótese. No
entanto, devem ser realizadas outras análises taxonômicas para confirmar seu
estado de nova espécie.
Os isolados 1028 e 1029 foram identificados como Epicoccum sp. nos quais
foram identificados genes PKS responsáveis pela síntese de melaninas. Este
resultado se destaca por ser o primeiro a descrever este fato. Sugere-se uma
caracterização mais aprofundada deste gene visando o interesse para a produção
de corantes de origem microbiana.
Os isolados identificados como P. jantinellum apresentaram características
morfológicas heterogêneas entre eles, corroborando com a literatura. Demonstrando
ser ainda uma espécie pouco caracterizada. No entanto, a identificação de genes
PKS pertencentes ao mesmo grupo (Figura 24), em especial aqueles distribuídos
dentro do clado III R-PKS, abre a possibilidade de incluir um novo sub-clado na
classificação dos PKS fúngicos, responsáveis por um tipo particular de PK especifico
do gênero Penicillium.
Referências
______________________________________________________________________ Referências
173
Abdi H, Valentin D. Multiple correspondence analysis. In: Salkind N, editor. Encyclopedia of measurement and statistics. Sage, Thousand Oaks, USA; 2007. p. 651–657. Abe Y, Ono C, Hosobuchi M, Yoshikawa H. Functional analysis of mlcR, a regulatory gene for ML-236B (compactin) biosynthesis in Penicillium citrinum. Mol Genet Genomics. 2002 Nov;268(3):352-361. Alberts AW, Chen J, Kuron G, Hunt V, Huff J, Hoffman C, et al. Mevinolin: a highly potent competitive inhibitor of hydroxymethylglutaryl-coenzyme A reductase and a cholesterol-lowering agent. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980 Jul;77(7):3957-3961. Alberts AW. Discovery, biochemistry and biology of lovastatin. Am J Cardiol. 1988 Nov 11;62(15):10J-15J. Almeida CV, Yara R, Almeida M. Fungos endofíticos isolados de ápices caulinares de pupunheira ultivada invivo e invitro. Pesq Agro Bras. Brasilia; 2005. p. 4670-4470. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5;215(3):403-410. Amnuaykanjanasin A, Punya J, Paungmoung P, Rungrod A, Tachaleat A, Pongpattanakitshote S, et al. Diversity of type I polyketide synthase genes in the wood-decay fungus Xylaria sp. BCC 1067. FEMS Microbiol Lett. 2005 Oct 1;251(1):125-136. Amnuaykanjanasin A, Phonghanpot S, Sengpanich N, Cheevadhanarak S, Tanticharoen M. Insect-specific polyketide synthases (PKSs), potential PKS-nonribosomal peptide synthetase hybrids, and novel PKS clades in tropical fungi. Appl Environ Microbiol. 2009 Jun;75(11):3721-3732. Anderson IC, Cairney JW. Diversity and ecology of soil fungal communities: increased understanding through the application of molecular techniques. Environ Microbiol. 2004 Aug;6(8):769-779. Ansari MZ, Sharma J, Gokhale RS, Mohanty D. In silico analysis of methyltransferase domains involved in biosynthesis of secondary metabolites. BMC Bioinformatics. 2008;9:454. Arnold AE, Henk DA, Eells RL, Lutzoni F, Vilgalys R. Diversity and phylogenetic affinities of foliar fungal endophytes in loblolly pine inferred by culturing and environmental PCR. Mycologia. 2007 Mar-Apr;99(2):185-206. Arnold K, Bordoli L, Kopp J, Schwede T. The SWISS-MODEL workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics. 2006 Jan 15;22(2):195-201. Arnould AE, Maynard Z, Gilbert GS, Coley PD, Kursar TA. Are tropical fungal endophytes hyperdiverse? Ecology Letters. 2000;3:267-274.
______________________________________________________________________ Referências
174
Arvas M, Kivioja T, Mitchell A, Saloheimo M, Ussery D, Penttila M, et al. Comparison of protein coding gene contents of the fungal phyla Pezizomycotina and Saccharomycotina. BMC Genomics. 2007;8:325. Atoui A, Dao HP, Mathieu F, Lebrihi A. Amplification and diversity analysis of ketosynthase domains of putative polyketide synthase genes in Aspergillus ochraceus and Aspergillus carbonarius producers of ochratoxin A. Mol Nutr Food Res. 2006 May;50(6):488-493. Auclair K, Kennedy J, Hutchinson CR, Vederas JC. Conversion of cyclic nonaketides to lovastatin and compactin by a lovC deficient mutant of Aspergillus terreus. Bioorg Med Chem Lett. 2001 Jun 18;11(12):1527-1531. Austin MB, Noel JP. The chalcone synthase superfamily of type III polyketide synthases. Nat Prod Rep. 2003 Feb;20(1):79-110. Azevedo JL. Microorganismos endofíticos. In: Melo IS, Azevedo JL, editors. Ecologia Microbiana. Jaguariuna, SP, Brazil.: EMBRAPA; 1998. p. 117-137. Azevedo JL, Maccheroni-Jr W, pereiro JO, Araujo WL. Endophytic microorganism: a review in insect control and recent advances on tropical plants. Elect J Biotec. 2000;3:1-36. Azevedo JL, Araujo WL. Diversity and applications of endophytic fungi isolated from tropical plants. In: Gabguli BN, Deshmukh SK, editors. Fungi: multifaced microbes. Boca Raton: CRC Press; 2007. p. 189-207 Bacon CW, Withe JF, editors. Microbial endophytes. New York; 2000. Bailey MJ, Lilley AK, Timms-Wilson TM, Spencer-Phillips PT. Microbial ecology of aerial plant surfaces. Cambridge: CAB International; 2006. Baker SE, Kroken S, Inderbitzin P, Asvarak T, Li BY, Shi L, et al. Two polyketide synthase-encoding genes are required for biosynthesis of the polyketide virulence factor, T-toxin, by Cochliobolus heterostrophus. Mol Plant Microbe Interact. 2006 Feb;19(2):139-149. Bakker-Arkema RG, Davidson MH, Goldstein RJ, Davignon J, Isaacsohn JL, Weiss SR, et al. Efficacy and safety of a new HMG-CoA reductase inhibitor, atorvastatin, in patients with hypertriglyceridemia. JAMA. 1996 Jan 10;275(2):128-133. Ballance DJ. Sequences important for gene expression in filamentous fungi. Yeast. 1986 Dec;2(4):229-236. Bangera MG, Thomashow LS. Identification and characterization of a gene cluster for synthesis of the polyketide antibiotic 2,4-diacetylphloroglucinol from Pseudomonas fluorescens Q2-87. J Bacteriol. 1999 May;181(10):3155-3163.
______________________________________________________________________ Referências
175
Barrios-Gonzalez J, Miranda RU. Biotechnological production and applications of statins. Appl Microbiol Biotechnol. 2010 Jan;85(4):869-883. Barros FAP, Rodrigues-Filho E. Four spiroquinazoline alkaloids from Eupenicillium sp. isolated as an endophytic fungus from leaves of Murraya paniculata (Rutaceae). Biochemical Systematics and Ecology. 2005;23 (3):257-268. Basil AJ, Strap JL, Knotek-Smith HM, Crawford DL. Studies on the microbial populations of the rhizosphere of big sagebrush ( Artemisia tridentata). J Ind Microbiol Biotechnol. 2004 Jul;31(6):278-288. Beck J, Ripka S, Siegner A, Schiltz E, Schweizer E. The multifunctional 6-methylsalicylic acid synthase gene of Penicillium patulum. Its gene structure relative to that of other polyketide synthases. Eur J Biochem. 1990 Sep 11;192(2):487-498. Benitez T, Rincon AM, Limon MC, Codon AC. Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains. Int Microbiol. 2004 Dec;7(4):249-260. Bennett JW, Ciegler A. Secondary metabolism and differentiation in fungi. New York: Marcel Dekker; 1983. Bentley R, Bennett JW. Constructing polyketides: from collie to combinatorial biosynthesis. Annu Rev Microbiol. 1999;53:411-446. Bentley SD, Chater KF, Cerdeno-Tarraga AM, Challis GL, Thomson NR, James KD, et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 2002 May 9;417(6885):141-147. Berg G, Zachow C, Lottmann J, Gotz M, Costa R, Smalla K. Impact of plant species and site on rhizosphere-associated fungi antagonistic to Verticillium dahliae kleb. Appl Environ Microbiol. 2005 Aug;71(8):4203-4213. Bernstein ME, Carroll GC. Internal fungi in old-growth Douglas firr foliage. Can J Botany. 1977;55:644-653. Bills G, Dombrowski A, Pelaez F, Polishook J, An Z. Tropical Mycology: Micromycetes;. Watling R, Frankland JC, Ainsworth AM, Issac S, Robinson CH, editors. New York: CABI Publishing; 2002. Bills G, Overy D, Genilloud O, Pelaez F. Contribution of pharmaceuticalantibiotics and secondary metabolite discoveery to the undersanding of microbial defence and antagonism In: White JM, Torres MS, editors. Defensive Mutualism in Microbial Symbiosis. Boca Raton: CRC press; 2009. Bingle LE, Simpson TJ, Lazarus CM. Ketosynthase domain probes identify two subclasses of fungal polyketide synthase genes. Fungal Genet Biol. 1999 Apr;26(3):209-223. Bloemberg GV, Lugtenberg BJ. Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria. Curr Opin Plant Biol. 2001 Aug;4(4):343-350.
______________________________________________________________________ Referências
176
Boddy L, Griffith GS. Role of endophytes and latent invasion in the development of decay communities in sapwood of angiospermous trees. Sydowia. 1989;41:41-73. Boerema GH, de Gruyter J, Noordeloos ME, Hamers MEC. Identification Manual: Differentiation of Specific and Infra-specific Taxa in Culture. Wallingford, Oxfordshire,UK: CABI Publishing; 2004. Bohnert HU, Fudal I, Dioh W, Tharreau D, Notteghem JL, Lebrun MH. A putative polyketide synthase/peptide synthetase from Magnaporthe grisea signals pathogen attack to resistant rice. Plant Cell. 2004 Sep;16(9):2499-2513. Bradshaw RE, Jin H, Morgan BS, Schwelm A, Teddy OR, Young CA, et al. A polyketide synthase gene required for biosynthesis of the aflatoxin-like toxin, dothistromin. Mycopathologia. 2006 May;161(5):283-294. Brady SF, Wagenaar MM, Singh MP, Janso JE, Clardy J. The cytosporones, new octaketide antibiotics isolated from an endophytic fungus. Org Lett. 2000 Dec 14;2(25):4043-4046. Brady SF, Bondi SM, Clardy J. The guanacastepenes: a highly diverse family of secondary metabolites produced by an endophytic fungus. J Am Chem Soc. 2001 Oct 10;123(40):9900-9901. Brakhage AA, Schuemann J, Bergmann S, Scherlach K, Schroeckh V, Hertweck C. Activation of fungal silent gene clusters: a new avenue to drug discovery. Prog Drug Res. 2008;66:1, 3-12. Brown AJ. Cholesterol, statins and cancer. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2007 Mar;34(3):135-141. Brown DW, Yu JH, Kelkar HS, Fernandes M, Nesbitt TC, Keller NP, et al. Twenty-five coregulated transcripts define a sterigmatocystin gene cluster in Aspergillus nidulans. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Feb 20;93(4):1418-1422. Brown MS, Faust JR, Goldstein JL, Kaneko I, Endo A. Induction of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase activity in human fibroblasts incubated with compactin (ML-236B), a competitive inhibitor of the reductase. J Biol Chem. 1978 Feb 25;253(4):1121-1128. Bruns TD, Vilgalys R, Barns SM, Gonzalez D, Hibbett DS, Lane DJ, et al. Evolutionary relationships within the fungi: analyses of nuclear small subunit rRNA sequences. Mol Phylogenet Evol. 1992 Sep;1(3):231-241. Bu'Lock JD. Intermediary metabolism and antibiotic synthesis. Adv Appl Microbiol. 1961;3:293-342. Butler MS. The role of natural product chemistry in drug discovery. J Nat Prod. 2004 Dec;67(12):2141-2153.
______________________________________________________________________ Referências
177
Cane DE. Introduction: Polyketide and Nonribosomal Polypeptide Biosynthesis. From Collie to Coli. Chem Rev. 1997 Nov 10;97(7):2463-2464. Carroll GC. Fungal endophytes in stems and leaves: from latent pathogen to mutualistic symbiont. Ecology. 1988;69:2-9. Castillo U, Harper JK, Strobel GA, Sears J, Alesi K, Ford E, et al. Kakadumycins, novel antibiotics from Streptomyces sp NRRL 30566, an endophyte of Grevillea pteridifolia. FEMS Microbiol Lett. 2003 Jul 29;224(2):183-190. Castillo UF, Strobel GA, Ford EJ, Hess WM, Porter H, Jensen JB, et al. Munumbicins, wide-spectrum antibiotics produced by Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigriscans. Microbiology. 2002 Sep;148(Pt 9):2675-2685. Center for Integrated Fungal Research. Aspergillus flavus Genome Sequencing Project. 2005 [updated 2005; cited 2010 Febereiro]; Available from: http://www.aspergillusflavus.org/genomics/. Chan KK, Oza AM, Siu LL. The statins as anticancer agents. Clin Cancer Res. 2003 Jan;9(1):10-19. Cheng YQ, Tang GL, Shen B. Type I polyketide synthase requiring a discrete acyltransferase for polyketide biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Mar 18;100(6):3149-3154. Chernin L, Chet I. Microbial enzymes in biocontrol of plant pathogens and pests. In: Burns R, Dick R, editors. Enzymes in the environment: activity, ecology, and applications. New York: Marcel Dekker; 2002. Chiang YM, Lee KH, Sanchez JF, Keller NP, Wang CC. Unlocking fungal cryptic natural products. Nat Prod Commun. 2009 Nov;4(11):1505-1510. Chooi YH, Stalker DM, Davis MA, Fujii I, Elix JA, Louwhoff SH, et al. Cloning and sequence characterization of a non-reducing polyketide synthase gene from the lichen Xanthoparmelia semiviridis. Mycol Res. 2008 Feb;112(Pt 2):147-161. Choquer M, Dekkers KL, Chen HQ, Cao L, Ueng PP, Daub ME, et al. The CTB1 gene encoding a fungal polyketide synthase is required for cercosporin biosynthesis and fungal virulence of Cercospora nicotianae. Mol Plant Microbe Interact. 2005 May;18(5):468-476. Clardy J, Walsh C. Lessons from natural molecules. Nature. 2004 Dec 16;432(7019):829-837. Cleveland TE, Yu J, Bhatnagar D, Chen Z-Y, Brown RL, Chang P-K, et al. Progress in Elucidating the Molecular Basis of the Host Planta Aspergillusflavus Interaction, a Basis for Devising Strategies to Reduce Aflatoxin Contamination in Crops. Journal of Toxicology: Toxin Reviews. 2004;23(2):345 - 380.
______________________________________________________________________ Referências
178
Cleveland TE, Yu J, Fedorova N, Bhatnagar D, Payne GA, Nierman WC, et al. Potential of Aspergillus flavus genomics for applications in biotechnology. Trends Biotechnol. 2009 Mar;27(3):151-157. Collemare J, Billard A, Bohnert HU, Lebrun MH. Biosynthesis of secondary metabolites in the rice blast fungus Magnaporthe grisea: the role of hybrid PKS-NRPS in pathogenicity. Mycol Res. 2008 Feb;112(Pt 2):207-215. Corrado M, Rodrigues KF. Antimicrobial evaluation of fungal extracts produced by endophytic strains of Phomopsis sp. J Basic Microbiol. 2004;44(2):157-160. Cortes J, Haydock SF, Roberts GA, Bevitt DJ, Leadlay PF. An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin-producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea. Nature. 1990 Nov 8;348(6297):176-178. Cosgrove L, McGeechan PL, Handley PS, Robson GD. Effect of biostimulation and bioaugmentation on degradation of polyurethane buried in soil. Appl Environ Microbiol. 2010 Feb;76(3):810-819. Cox RJ, Glod F. Fungal Polyketide Synthases in the information age. In: Tkacz JS, Lange L, editors. Advances in fungal biotechnology for industry, agriculture, and medicine. New York: Plenum Publisher; 2004. p. 69-96. Cox RJ, Glod F, Hurley D, Lazarus CM, Nicholson TP, Rudd BA, et al. Rapid cloning and expression of a fungal polyketide synthase gene involved in squalestatin biosynthesis. Chem Commun (Camb). 2004 Oct 21(20):2260-2261. Cox RJ. Polyketides, proteins and genes in fungi: programmed nano-machines begin to reveal their secrets. Org Biomol Chem. 2007 Jul 7;5(13):2010-2026. Crowe F. Fungal diversity and plant roots. Science. 2002 Jun 14;296(5575):1969; author reply 1969. Dai J, Carte BK, Sidebottom PJ, Sek Yew AL, Ng S, Huang Y, et al. Circumdatin G, a new alkaloid from the fungus Aspergillus ochraceus. J Nat Prod. 2001 Jan;64(1):125-126. Demain AL. Pharmaceutically active secondary metabolites of microorganisms. Appl Microbiol Biotechnol. 1999 Oct;52(4):455-463. Deshmukh S, Huckelhoven R, Schafer P, Imani J, Sharma M, Weiss M, et al. The root endophytic fungus Piriformospora indica requires host cell death for proliferation during mutualistic symbiosis with barley. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Dec 5;103(49):18450-18457. Donadio S, Staver MJ, McAlpine JB, Swanson SJ, Katz L. Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis. Science. 1991 May 3;252(5006):675-679.
______________________________________________________________________ Referências
179
Dong JW, Chen WD, Crane JL. Phylogenetic studies of the Leptosphaeriaceae, Pleosporaceae and someother Loculoascomycetes based on nuclear ribosomal DNA sequences. Mycol Res. 1998;102:151–156. Eaton DL, Groopman JD. Toxicology of aflatoxins : human health veterinary and agriculture significance. . Academic Press; 1994. Emsley P, Lohkamp B, Scott WG, Cowtan K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010 Apr;66(Pt 4):486-501. Endo A, Kuroda M, Tsujita Y. ML-236A, ML-236B, and ML-236C, new inhibitors of cholesterogenesis produced by Penicillium citrinium. J Antibiot (Tokyo). 1976 Dec;29(12):1346-1348. Endo A. Monacolin K, a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species. J Antibiot (Tokyo). 1979 Aug;32(8):852-854. Endo A, Hasumi K, Negishi S. Monacolins J and L, new inhibitors of cholesterol biosynthesis produced by Monascus ruber. J Antibiot (Tokyo). 1985 Mar;38(3):420-422. Endo A, Hasumi K, Yamada A, Shimoda R, Takeshima H. The synthesis of compactin (ML-236B) and monacolin K in fungi. J Antibiot (Tokyo). 1986 Nov;39(11):1609-1610. Endo A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 1992 Nov;33(11):1569-1582. Eriksson OE, Hawksworth DL. Saccharicola, a new genus for two Leptosphaeria species on sugar cane Mycologia. 2003;95(3):426-433. Ezra D, Castillo UF, Strobel GA, Hess WM, Porter H, Jensen JB, et al. Coronamycins, peptide antibiotics produced by a verticillate Streptomyces sp. (MSU-2110) endophytic on Monstera sp. Microbiology. 2004 Apr;150(Pt 4):785-793. Faeth SH, Hammon KE. Fungal endophytes in oak trees : longterm patterns of abundance and association with leafminers. Ecology. 1997;78:810-819. Farrell R. RNA methodologies. 4th ed. York: ElSevier; 2010. Favaro LC. Diversidade e interacao de Epicoccum spp. com cana-de-açúcar (Saccharum offficinarum, L.) [tese (Doutorado em Agronomia)]. Piracicaba (Brasil): Universidade de São Paulo, escola Superior de Agricultura "Luiz de Quiroz"; 2009. Fedorova ND, Khaldi N, Joardar VS, Maiti R, Amedeo P, Anderson MJ, et al. Genomic islands in the pathogenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus. PLoS Genet. 2008 Apr;4(4):e1000046.
______________________________________________________________________ Referências
180
Ferrer JL, Jez JM, Bowman ME, Dixon RA, Noel JP. Structure of chalcone synthase and the molecular basis of plant polyketide biosynthesis. Nat Struct Biol. 1999 Aug;6(8):775-784. Findlow SC, Winsor C, Simpson TJ, Crosby J, Crump MP. Solution structure and dynamics of oxytetracycline polyketide synthase acyl carrier protein from Streptomyces rimosus. Biochemistry. 2003 Jul 22;42(28):8423-8433. Firn R. The main classes of NP's - only a few pathways lead to the majority of NPs. Nature's chemicals: the natural products that shaped our world. New York: Oxford university Press; 2010. Fisher PJ. Survival and spread of the endophyte Stagonosporapteridiicola in Pteridium aquilinum, other ferns and some ¯owering plants. New Phytol. 1996;132:119±122. Fravel DR. Role of antibiosis in the biocontrol of plant diseases. Phytopathology. 1988;26:75–91. Frohlich J, Hyde KD, Petrini O. Endophytic fungi associated with palms. Mycol Res. 2000;104:1202-1212. Fujii I, Ono Y, Tada H, Gomi K, Ebizuka Y, Sankawa U. Cloning of the polyketide synthase gene atX from Aspergillus terreus and its identification as the 6-methylsalicylic acid synthase gene by heterologous expression. Mol Gen Genet. 1996 Nov 27;253(1-2):1-10. Fujii I, Watanabe A, Mori Y, Ebizuko Y. Structures and Functional Analyses of Fungal Polyketide Synthase Genes. Actinomycetologica. 1998;12(1):1-14. Fujii I, Watanabe A, Sankawa U, Ebizuka Y. Identification of Claisen cyclase domain in fungal polyketide synthase WA, a naphthopyrone synthase of Aspergillus nidulans. Chem Biol. 2001 Feb;8(2):189-197. Fujii I, Yoshida N, Shimomaki S, Oikawa H, Ebizuka Y. An iterative type I polyketide synthase PKSN catalyzes synthesis of the decaketide alternapyrone with regio-specific octa-methylation. Chem Biol. 2005 Dec;12(12):1301-1309. Funa N, Ohnishi Y, Fujii I, Shibuya M, Ebizuka Y, Horinouchi S. A new pathway for polyketide synthesis in microorganisms. Nature. 1999 Aug 26;400(6747):897-899. Furberg CD. Natural statins and stroke risk. Circulation 87. 1999;99:185-188. Galagan JE, Calvo SE, Cuomo C, Ma LJ, Wortman JR, Batzoglou S, et al. Sequencing of Aspergillus nidulans and comparative analysis with A. fumigatus and A. oryzae. Nature. 2005 Dec 22;438(7071):1105-1115. Galgoczy L, Papp T, Lukacs G, Leiter E, Pocsi I, Vagvolgyi C. Interactions between statins and Penicillium chrysogenum antifungal protein (PAF) to inhibit the
______________________________________________________________________ Referências
181
germination of sporangiospores of different sensitive Zygomycetes. FEMS Microbiol Lett. 2007 May;270(1):109-115. Galm U, Hager MH, Van Lanen SG, Ju J, Thorson JS, Shen B. Antitumor antibiotics: bleomycin, enediynes, and mitomycin. Chem Rev. 2005 Feb;105(2):739-758. Gardes M, Bruns TD. ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes--application to the identification of mycorrhizae and rusts. Mol Ecol. 1993 Apr;2(2):113-118. Gardner JM, Feldman AW, Zablotowicz RM. Identity and behavior of xylem-residing bacteria in rough lemon roots of Florida citrus trees. Appl Environ Microbiol. 1982 Jun;43(6):1335-1342. Gbewonyo K, Hunt G, Buckland B. Interactions of cell morphology and transport processes in the lovastatin fermentation. Bioproc and Biosyst Eng. 1992;8:1-7. Gensheimer M, Mushegian A. Chalcone isomerase family and fold: no longer unique to plants. Protein Sci. 2004 Feb;13(2):540-544. Girlanda M, Selosse MA, Cafasso D, Brilli F, Delfine S, Fabbian R, et al. Inefficient photosynthesis in the Mediterranean orchid Limodorum abortivum is mirrored by specific association to ectomycorrhizal Russulaceae. Mol Ecol. 2006 Feb;15(2):491-504. Gomes NC, Fagbola O, Costa R, Rumjanek NG, Buchner A, Mendona-Hagler L, et al. Dynamics of fungal communities in bulk and maize rhizosphere soil in the tropics. Appl Environ Microbiol. 2003 Jul;69(7):3758-3766. Graziani S, Vasnier C, Daboussi MJ. Novel polyketide synthase from Nectria haematococca. Appl Environ Microbiol. 2004 May;70(5):2984-2988. Greenacre M. Correspondence Analysis in Practice. Boca Raton: Chapman Hall; 2007. Greenspan MD, Yudkovitz JB. Mevinolinic acid biosynthesis by Aspergillus terreus and its relationship to fatty acid biosynthesis. J Bacteriol. 1985 May;162(2):704-707. Grimm A, Madduri K, Ali A, Hutchinson CR. Characterization of the Streptomyces peucetius ATCC 29050 genes encoding doxorubicin polyketide synthase. Gene. 1994 Dec 30;151(1-2):1-10. Grube M, Blaha J. On the phylogeny of some polyketide synthase genes in the lichenized genus Lecanora. Mycol Res. 2003 Dec;107(Pt 12):1419-1426. Guan SH, Sattler I, Lin WH, Guo DA, Grabley S. p-Aminoacetophenonic acids produced by a mangrove endophyte: Streptomyces griseus subsp. J Nat Prod. 2005 Aug;68(8):1198-1200.
______________________________________________________________________ Referências
182
Guimaraes DO, Borges WS, Kawano CY, Ribeiro PH, Goldman GH, Nomizo A, et al. Biological activities from extracts of endophytic fungi isolated from Viguiera arenaria and Tithonia diversifolia. FEMS Immunol Med Microbiol. 2008 Jan;52(1):134-144. Gunatilaka AA. Natural products from plant-associated microorganisms: distribution, structural diversity, bioactivity, and implications of their occurrence. J Nat Prod. 2006 Mar;69(3):509-526. Gunde-Cimerman N, Plemenitas A, Cimerman A. Pleurotus fungi produce mevinolin, an inhibitor of HMG CoA reductase. FEMS Microbiol Lett. 1993 Nov 1;113(3):333-337. Guo B, Wang Y, Sun X, Tang K. Bioactive natural products from endophytes: a review. Prikl Biokhim Mikrobiol. 2008 Mar-Apr;44(2):153-158. Gusman J, Vanhaelen M. Endophytic fungi: An underexploited source of biologically active secondary metabolites. Recent Res Dev Phytochem. 2000;4:187−206. Hajjaj H, Duboc P, Fay LB, Zbinden I, Mace K, Niederberger P. Aspergillus oryzae produces compounds inhibiting cholesterol biosynthesis downstream of dihydrolanosterol. FEMS Microbiol Lett. 2005 Jan 1;242(1):155-159. Hall TA. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl Acids Symp Ser. 1999;41:95-98. Hanlin RT, Menezes M. Gêneros ilustrados de ascomicetos. Recife-PE: UFRPE; 1996. Harman GE. Overview of Mechanisms and Uses of Trichoderma spp. Phytopathology. 2006 Feb;96(2):190-194. Harvey AL. Natural products in drug discovery. Drug Discov Today. 2008 Oct;13(19-20):894-901. Hata K, Futai K, Tsuda M. Seasonal and needle age-dependent changes of the endophytic mycobiota in Pinus thunbergii and Pinus densiflora needles. Canadian Journal of Botany. 1998;76:245-250. Hawksworth DL, Rossmann AY. Where are all the undescribedfungi? Phytopathology. 1997;87:888–891. He J, Wijeratne EM, Bashyal BP, Zhan J, Seliga CJ, Liu MX, et al. Cytotoxic and other metabolites of Aspergillus inhabiting the rhizosphere of Sonoran desert plants. J Nat Prod. 2004 Dec;67(12):1985-1991. Hendrickson L, Davis CR, Roach C, Nguyen DK, Aldrich T, McAda PC, et al. Lovastatin biosynthesis in Aspergillus terreus: characterization of blocked mutants, enzyme activities and a multifunctional polyketide synthase gene. Chem Biol. 1999 Jul;6(7):429-439.
______________________________________________________________________ Referências
183
Henson JM, Butler MJ, Day AW. The dark sede of the mycelium: Melanins of Phytopathogenic Fungi. Annu Rev Phytopathol. 1999;37:447-471. Hertweck C. The biosynthetic logic of polyketide diversity. Angew Chem Int Ed Engl. 2009;48(26):4688-4716. Hindler K, Cleeland CS, Rivera E, Collard CD. The role of statins in cancer therapy. Oncologist. 2006 Mar;11(3):306-315. Hopwood DA. Genetic Contributions to Understanding Polyketide Synthases. Chem Rev. 1997 Nov 10;97(7):2465-2498. Hosobuchi M, Kurosawa K, Yoshikawa H. Application of computer to monitoring and control of fermentation process: Microbial conversion of ML-236B Na to pravastatin. Biotechnol Bioeng. 1993 Sep 20;42(7):815-820. Howard RJ, Ferrari MA, Roach DH, Money NP. Penetration of hard substrates by a fungus employing enormous turgor pressures. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Dec 15;88(24):11281-11284. Huang W, Jia J, Edwards P, Dehesh K, Schneider G, Lindqvist Y. Crystal structure of beta-ketoacyl-acyl carrier protein synthase II from E.coli reveals the molecular architecture of condensing enzymes. EMBO J. 1998 Mar 2;17(5):1183-1191. Hutchinson CR, Kennedy J, Park C, Kendrew S, Auclair K, Vederas J. Aspects of the biosynthesis of non-aromatic fungal polyketides by iterative polyketide synthases. A Van Leeuw J Microb. 2000 Dec;78(3-4):287-295. Jaklitsch WM. European species of Hypocrea Part I. The green-spored species. Stud Mycol. 2009;63:1-91. Jakobisiak M, Bruno S, Skierski JS, Darzynkiewicz Z. Cell cycle-specific effects of lovastatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 May 1;88(9):3628-3632. James K, Olivares FL. Infection and colonization of sugar cane and other Graminaceous plants by endophytic diazotrophs. critical Reviw in Plant Science. 1997;17:77-119. Jiang H, Zirkle R, Metz JG, Braun L, Richter L, Van Lanen SG, et al. The role of tandem acyl carrier protein domains in polyunsaturated fatty acid biosynthesis. J Am Chem Soc. 2008 May 21;130(20):6336-6337. Kagan RM, Clarke S. Widespread occurrence of three sequence motifs in diverse S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases suggests a common structure for these enzymes. Arch Biochem Biophys. 1994 May 1;310(2):417-427. Kaiser WJ, Ndimande BN, Hawksworth DL. Leaf-scorch disease of sugar cane in Kenya caused by a new species of Leptosphaeria. Mycologia. 1979;71:479-492.
______________________________________________________________________ Referências
184
Kaldau GA, Yates IE. Evidence for Fusarium endophytes in cultivated and wild plants. In: Bacom CW, White JFJ, editors. Microbial Endophytes. New York: Marcel Dekker; 2010. Katz JE, Dlakic M, Clarke S. Automated identification of putative methyltransferases from genomic open reading frames. Mol Cell Proteomics. 2003 Aug;2(8):525-540. Kaulmann U, Hertweck C. Biosynthesis of polyunsaturated fatty acids by polyketide synthases. Angew Chem Int Ed Engl. 2002 Jun 3;41(11):1866-1869. Keller NP, Turner G, Bennett JW. Fungal secondary metabolism - from biochemistry to genomics. Nat Rev Microbiol. 2005 Dec;3(12):937-947. Kelley LA, Sternberg MJ. Protein structure prediction on the Web: a case study using the Phyre server. Nat Protoc. 2009;4(3):363-371. Kemami Wangun HV, Hertweck C. Epicoccarines A, B and epipyridone: tetramic acids and pyridone alkaloids from an Epicoccum sp. associated with the tree fungus Pholiota squarrosa. Org Biomol Chem. 2007 Jun 7;5(11):1702-1705. Kennedy J, Auclair K, Kendrew SG, Park C, Vederas JC, Hutchinson CR. Modulation of polyketide synthase activity by accessory proteins during lovastatin biosynthesis. Science. 1999 May 21;284(5418):1368-1372. Khaldi N, Collemare J, Lebrun MH, Wolfe KH. Evidence for horizontal transfer of a secondary metabolite gene cluster between fungi. Genome Biol. 2008;9(1):R18. Kim YT, Lee YR, Jin J, Han KH, Kim H, Kim JC, et al. Two different polyketide synthase genes are required for synthesis of zearalenone in Gibberella zeae. Mol Microbiol. 2005 Nov;58(4):1102-1113. Kimura K, Komagata D, Murakawa S, Endo A. Biosynthesis of monacolins: conversion of monacolin J to monacolin K (mevinolin). J Antibiot (Tokyo). 1990 Dec;43(12):1621-1622. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J Mol Evol. 1980 Dec;16(2):111-120. Klein DA, Paschke MW. Filamentous fungi: the indeterminate lifestyle and microbial ecology. Microb Ecol. 2004 Apr;47(3):224-235. Kloepper JW, Schippers B, Bakker PAHM. Proposed elimination of the term endorhizosphere. Phytopathology. 1992;82:726-727. Komagata D, Shimada H, Murakawa S, Endo A. Biosynthesis of monacolins: conversion of monacolin L to monacolin J by a monooxygenase of Monascus ruber. J Antibiot (Tokyo). 1989 Mar;42(3):407-412.
______________________________________________________________________ Referências
185
Komon-Zelazowska M, Bissett J, Zafari D, Hatvani L, Manczinger L, Woo S, et al. Genetically closely related but phenotypically divergent Trichoderma species cause green mold disease in oyster mushroom farms worldwide. Appl Environ Microbiol. 2007 Nov;73(22):7415-7426. Kowalchuk GA, Gerards S, Woldendorp JW. Detection and characterization of fungal infections of Ammophila arenaria (marram grass) roots by denaturing gradient gel electrophoresis of specifically amplified 18s rDNA. Appl Environ Microbiol. 1997 Oct;63(10):3858-3865. Kowalchuk GA. New perspectives towards analysing fungal communities in terrestrial environments. Curr Opin Biotechnol. 1999 Jun;10(3):247-251. Kroken S, Glass NL, Taylor JW, Yoder OC, Turgeon BG. Phylogenomic analysis of type I polyketide synthase genes in pathogenic and saprobic ascomycetes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Dec 23;100(26):15670-15675. Kubicek CP, Komon-Zelazowska M, Druzhinina IS. Fungal genus Hypocrea/Trichoderma: from barcodes to biodiversity. J Zhejiang Univ Sci B. 2008 Oct;9(10):753-763. Kumar JK, Sinha AK. Resurgence of natural colourants: a holistic view. Nat Prod Res. 2004 Feb;18(1):59-84. Kumar MS, Kumar PM, Sarnaik HM, Sadhukhan AK. A rapid technique for screening of lovastatin-producing strains of Aspergillus terreus by agar plug and Neurospora crassa bioassay. J Microbiol Methods. 2000 Mar;40(1):99-104. Kumar S, Nei M, Dudley J, Tamura K. MEGA: a biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences. Brief Bioinform. 2008 Jul;9(4):299-306. Kupfer DM, Drabenstot SD, Buchanan KL, Lai H, Zhu H, Dyer DW, et al. Introns and splicing elements of five diverse fungi. Eukaryot Cell. 2004 Oct;3(5):1088-1100. Langfelder K, Streibel M, Jahn B, Haase G, Brakhage AA. Biosynthesis of fungal melanins and their importance for human pathogenic fungi. Fungal Genet Biol. 2003 Mar;38(2):143-158. Lee T, Yun SH, Hodge KT, Humber RA, Krasnoff SB, Turgeon GB, et al. Polyketide synthase genes in insect- and nematode-associated fungi. Appl Microbiol Biotechnol. 2001 Jul;56(1-2):181-187. Legault D, Dessureault M, Laflamme G. Mycoflore des aiguilles de Pinus banksiana et Pinus resinosa I. Champignons endophytes. can J Botany. 1988;67:2052-2060. Leslie JF, Pearson CA, Nelson PE, Toussoun TA. Fusarium spp. from Corn, Sorghum, and Soybean Fields in the Central and Eastern United States. Phytopathology. 1990;80:343-350.
______________________________________________________________________ Referências
186
Leslie JF, Sumerell BA. The Fusarium laboratory manual. Ames: Blackwell Publishing; 2006. Levy RI, Troendle AJ, Fattu JM. From phenotypes to genotypes: a remarkable quarter century. A quarter century of drug treatment of dyslipoproteinemia, with a focus on the new HMG-CoA reductase inhibitor fluvastatin. Circulation 87. 1993;suppl 4:III45–III53. Lin T, Lin X, Lu C, Hu Z, Huang W, Huang Y, et al. Secondary Metabolites of Phomopsis sp. XZ-26, an Endophytic Fungus from Camptotheca acuminate. European Journal of Organic Chemistry. 2009;2009(18):2975-2982. Lin Y, Wu X, Feng S, Jiang G, Luo J, Zhou S, et al. Five unique compounds: xyloketals from mangrove fungus Xylaria sp. from the South China Sea coast. J Org Chem. 2001 Sep 21;66(19):6252-6256. Linnemannstons P, Schulte J, del Mar Prado M, Proctor RH, Avalos J, Tudzynski B. The polyketide synthase gene pks4 from Gibberella fujikuroi encodes a key enzyme in the biosynthesis of the red pigment bikaverin. Fungal Genet Biol. 2002 Nov;37(2):134-148. Lodewyckx C, Vangrosveld J, Porteous F. Endophytic Bacteria and their Potential Applications. Critical Reviw in Plant Science 2002;21:583-606. Lodge DJ, Fisher PJ, Sutton BC. Endophytic fungi of Manilkara bidentata leaves in Puerto Rico. Mycologia. 1996;88:733-738. Lynch JM, Whipps JM. Substrate flow in the rhizosphere. Plant Soil. 1990;129:1-10. Machida M, Asai K, Sano M, Tanaka T, Kumagai T, Terai G, et al. Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae. Nature. 2005 Dec 22;438(7071):1157-1161. Macia-Vicente JG, Jansson HB, Mendgen K, Lopez-Llorca LV. Colonization of barley roots by endophytic fungi and their reduction of take-all caused by Gaeumannomyces graminis var. tritici. Can J Microbiol. 2008 Aug;54(8):600-609. MacNeil DJ, Occi JL, Gewain KM, MacNeil T. Correlation of the avermectin polyketide synthase genes to the avermectin structure. Implications for designing novel avermectins. Ann N Y Acad Sci. 1994 May 2;721:123-132. Macreadie IG, Johnson G, Schlosser T, Macreadie PI. Growth inhibition of Candida species and Aspergillus fumigatus by statins. FEMS Microbiol Lett. 2006 Sep;262(1):9-13. Maehara S, Simanjuntak P, Ohashi K, Shibuya H. Composition of endophytic fungi living in Cinchona ledgeriana (Rubiaceae). J Nat Med. 2010 Apr;64(2):227-230.
______________________________________________________________________ Referências
187
Malz S, Grell MN, Thrane C, Maier FJ, Rosager P, Felk A, et al. Identification of a gene cluster responsible for the biosynthesis of aurofusarin in the Fusarium graminearum species complex. Fungal Genet Biol. 2005 May;42(5):420-433. Manzoni M, Rollini M. Biosynthesis and biotechnological production of statins by filamentous fungi and application of these cholesterol-lowering drugs. Appl Microbiol Biotechnol. 2002 Apr;58(5):555-564. Mapari SA, Meyer AS, Thrane U. Evaluation of Epicoccum nigrum for growth, morphology and production of natural colorants in liquid media and on a solid rice medium. Biotechnol Lett. 2008 Dec;30(12):2183-2190. Marinho AMR, Rodrigues-Filho E, Ferreira AG, Santos LS. C25 Steroid epimers produced by Penicillium janthinellum. Journal of the Brazilian Chemical Society. 2005;16:1342-1346. Martin JL, McMillan FM. SAM (dependent) I AM: the S-adenosylmethionine-dependent methyltransferase fold. Curr Opin Struct Biol. 2002 Dec;12(6):783-793. Mathieu M, Zeelen JP, Pauptit RA, Erdmann R, Kunau WH, Wierenga RK. The 2.8 A crystal structure of peroxisomal 3-ketoacyl-CoA thiolase of Saccharomyces cerevisiae: a five-layered alpha beta alpha beta alpha structure constructed from two core domains of identical topology. Structure. 1994 Sep 15;2(9):797-808. Matsuoka T, Miyakoshi S, Tanzawa K, Nakahara K, Hosobuchi M, Serizawa N. Purification and characterization of cytochrome P-450sca from Streptomyces carbophilus. ML-236B (compactin) induces a cytochrome P-450sca in Streptomyces carbophilus that hydroxylates ML-236B to pravastatin sodium (CS-514), a tissue-selective inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase. Eur J Biochem. 1989 Oct 1;184(3):707-713. Mayer KM, Ford J, Macpherson GR, Padgett D, Volkmann-Kohlmeyer B, Kohlmeyer J, et al. Exploring the diversity of marine-derived fungal polyketide synthases. Can J Microbiol. 2007 Feb;53(2):291-302. Mayorga ME, Timberlake WE. The developmentally regulated Aspergillus nidulans wA gene encodes a polypeptide homologous to polyketide and fatty acid synthases. Mol Gen Genet. 1992 Nov;235(2-3):205-212. Menezes CB, Bonugli-Santos RC, Miqueletto PB, Passarini MR, Silva CH, Justo MR, et al. Microbial diversity associated with algae, ascidians and sponges from the north coast of Sao Paulo state, Brazil. Microbiol Res. 2009 Oct 28. Menzella HG, Reid R, Carney JR, Chandran SS, Reisinger SJ, Patel KG, et al. Combinatorial polyketide biosynthesis by de novo design and rearrangement of modular polyketide synthase genes. Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1171-1176. Metsa-Ketela M, Halo L, Munukka E, Hakala J, Mantsala P, Ylihonko K. Molecular evolution of aromatic polyketides and comparative sequence analysis of polyketide
______________________________________________________________________ Referências
188
ketosynthase and 16S ribosomal DNA genes from various streptomyces species. Appl Environ Microbiol. 2002 Sep;68(9):4472-4479. Metz JG, Roessler P, Facciotti D, Levering C, Dittrich F, Lassner M, et al. Production of polyunsaturated fatty acids by polyketide synthases in both prokaryotes and eukaryotes. Science. 2001 Jul 13;293(5528):290-293. Miller CM, Miller RV, Garton-Kenny D, Redgrave B, Sears J, Condron MM, et al. Ecomycins, unique antimycotics from Pseudomonas viridiflava. J Appl Microbiol. 1998 Jun;84(6):937-944. Misiek M, Hoffmeister D. Fungal genetics, genomics, and secondary metabolites in pharmaceutical sciences. Planta Med. 2007 Feb;73(2):103-115. Montesinos E, Bonaterra A, Badosa E, Frances J, Alemany J, Llorente I, et al. Plant-microbe interactions and the new biotechnological methods of plant disease control. Int Microbiol. 2002 Dec;5(4):169-175. Moore BS, Hopke JN. Discovery of a new bacterial polyketide biosynthetic pathway. Chembiochem. 2001 Jan 8;2(1):35-38. Moss SJ, Martin CJ, Wilkinson B. Loss of co-linearity by modular polyketide synthases: a mechanism for the evolution of chemical diversity. Nat Prod Rep. 2004 Oct;21(5):575-593. Motamedi H, Cai SJ, Shafiee A, Elliston KO. Structural organization of a multifunctional polyketide synthase involved in the biosynthesis of the macrolide immunosuppressant FK506. Eur J Biochem. 1997 Feb 15;244(1):74-80. Negishi S, Cai-Huang Z, Hasumi K, Murakawa S, Endo A. Productivity of monacolin K(mevinolin)in the genus Monascus. Journal of Fermentation and Bioengineering. 1986;64:509-512. Newman DJ, Cragg GM. Natural products as sources of new drugs over the last 25 years. J Nat Prod. 2007 Mar;70(3):461-477. Nicholson TP, Rudd BA, Dawson M, Lazarus CM, Simpson TJ, Cox RJ. Design and utility of oligonucleotide gene probes for fungal polyketide synthases. Chem Biol. 2001 Feb;8(2):157-178. O'Hagan D. Fungal and plant polyketides. In: O'Hagan D, editor. The Polyketide Metabolites. ed. New York: Ellis Horwood; 1991. p. 65-110. Olsen JG, Kadziola A, von Wettstein-Knowles P, Siggaard-Andersen M, Larsen S. Structures of beta-ketoacyl-acyl carrier protein synthase I complexed with fatty acids elucidate its catalytic machinery. Structure. 2001 Mar 7;9(3):233-243. Omura S, Ikeda H, Ishikawa J, Hanamoto A, Takahashi C, Shinose M, et al. Genome sequence of an industrial microorganism Streptomyces avermitilis: deducing the
______________________________________________________________________ Referências
189
ability of producing secondary metabolites. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Oct 9;98(21):12215-12220. Patel RN. Microbial/enzymatic synthesis of chiral drug intermediates. Adv Appl Microbiol. 2000;47:33-78. Pelaez F, Collado J, Arenal F, Basilio A, Cabello MT, Diez Matas JB, et al. Endophytic fungi from plants living on gypsum soils as a source of secondary metabolites with antimicrobial activity. Mycol Res. 1889;102(o6):755-761. Pereira JO, Carneiro-Vieira ML, Azevedo JL. Endophytic fungi from Musa acuminata and their reintroduction into axenic plants. World J Microb Biot. 1999;15:37-40. Petrini O. Fungal endophyte of tree leaves. In: Andrews JHSS, editor. Microbial Ecology of leaves. New York: Spring-verlag; 1991. p. 179-197. Phillips AJL. The plant pathogenic genus Phomopsis and its teleomorph (Diaporthe): Development and application of morphological, biological and phylogenetic species concepts. 2010[database on the Internet]. Available from: http://www.crem.fct.unl.pt/botryosphaeria_site/personal_web_page.htm. [cited 2010 jun 21]. Piel J. A polyketide synthase-peptide synthetase gene cluster from an uncultured bacterial symbiont of Paederus beetles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Oct 29;99(22):14002-14007. Pitt J. The Genus Penicillium and Its Teleomorphic States Eupenicillium and Taloromyces. London: Academic Press; 1979. Pitt J, Hocking AD. Fungi and Food Spoilage. 2d ed. Cambridge: BLACKIE ACADEMICS & PROFESSIONAL; 1997. Prasannarai K, Sridhar KR. Diversity and abundance of higher marine fungi on woody substrates along the west coast of India. Current Science. 2001;81(3):304-311. Proctor RH, Plattner RD, Brown DW, Seo JA, Lee YW. Discontinuous distribution of fumonisin biosynthetic genes in the Gibberella fujikuroi species complex. Mycol Res. 2004 Jul;108(Pt 7):815-822. Puri SC, Verma V, Amna T, Qazi GN, Spiteller M. An endophytic fungus from Nothapodytes foetida that produces camptothecin. J Nat Prod. 2005 Dec;68(12):1717-1719. Puri SC, Nazir A, Chawla R, Arora R, Riyaz-Ul-Hasan S, Amna T, et al. The endophytic fungus Trametes hirsuta as a novel alternative source of podophyllotoxin and related aryl tetralin lignans. J Biotechnol. 2006 Apr 20;122(4):494-510. Quilliam RS, Jones DL. Fungal root endophytes of the carnivorous plant Drosera rotundifolia. Mycorrhiza. 2010 Jun;20(5):341-348.
______________________________________________________________________ Referências
190
Rajagopal K, Suryanarayanan TS. Isolation of endophytic fungi from leaves of neem (Azadirachta indica A. Juss.). Curr Science. 2000;78:1375-1377. Ramirez C. Manual and atlas of the Penicillia. New York: Elsevier Biomedical Press; 1982. Rao M, Mishra C, Gaikwad S, Srinivasan MC. Release of cellulases from Penicillium janthinellum. Biotechnol Bioeng. 1986 Jan;28(1):129-132. Redman RS, Sheehan KB, Stout RG, Rodriguez RJ, Henson JM. Thermotolerance generated by plant/fungal symbiosis. Science. 2002 Nov 22;298(5598):1581. Reeves CD. The enzymology of combinatorial biosynthesis. Crit Rev Biotechnol. 2003;23(2):95-147. Reino J, Guerrero R, Galan R, Collado I. Secondary metabolites from species of the biocontrol agent Trichoderma. Phytochem Rev. 2008(7):89-123. Rekab D, del Sorbo G, Reggio C, Zoina A, Firrao G. Polymorphisms in nuclear rDNA and mtDNA reveal the polyphyletic nature of isolates of Phomopsis pathogenic to sunflower and a tight monophyletic clade of defined geographic origin. Mycol Res. 2004 Apr;108(Pt 4):393-402. Roa NN, Leise A. Stereoselective synthesis before the advent of genetic enginneering. In: Dingermann TH, Steinhilber D, Folkers G, editors. Molecular biology in medicinal chemistry: John Wiley and Sons; 2002. p. 400. Roberts WC. The underused miracle drugs: the statin drugs are to atherosclerosis what penicillin was to infectious disease. Am J Cardiol. 1996 Aug 1;78(3):377-378. Rodrigues KF. The foliar endophytes of the Amazonian palm Euterpe oleracea. Mycologia. 1994;86:376-385. Rodriguez R, Redman R. More than 400 million years of evolution and some plants still can't make it on their own: plant stress tolerance via fungal symbiosis. J Exp Bot. 2008;59(5):1109-1114. Rodriguez RJ, Redman RS, Henson JM. The role of fungal symbioses in the adaptation of plants to high stress environments. Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change. 2004;9:261–272. Rodriguez RJ, White JF, Jr., Arnold AE, Redman RS. Fungal endophytes: diversity and functional roles. New Phytol. 2009;182(2):314-330. Roze LV, Linz JE. Lovastatin triggers an apoptosis-like cell death process in the fungus Mucor racemosus. Fungal Genet Biol. 1998 Nov;25(2):119-133. Rubini MR, Silva-Ribeiro RT, Pomella AW, Maki CS, Araujo WL, Dos Santos DR, et al. Diversity of endophytic fungal community of cacao (Theobroma cacao L.) and
______________________________________________________________________ Referências
191
biological control of Crinipellis perniciosa, causal agent of Witches' Broom Disease. Int J Biol Sci. 2005;1(1):24-33. Ryan RP, Germaine K, Franks A, Ryan DJ, Dowling DN. Bacterial endophytes: recent developments and applications. FEMS Microbiol Lett. 2008 Jan;278(1):1-9. Saikkonen K, Faeth SH, Helander M, Sullivan TJ. Fungal endophytes: a continuum of interactions with host plants. Annu Rev Ecol Syst. 1998;29:319-343. Saikkonen K, Wali P, Helander M, Faeth SH. Evolution of endophyte-plant symbioses. Trends Plant Sci. 2004 Jun;9(6):275-280. Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol. 1987 Jul;4(4):406-425. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning a laboratory manual. Second edition ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989. Samiee SM, Moazami M, Haghighi S, Mohseni FA, Mirdamadi S, Bakhtiari MR. Screening of Lovastatin Production by Filamentous Fungi. Iran Biom J. 2003;7(1):29-33. Samuels GJ, Dodd SL, Lu BS, Petrini O, Schroers HJ, Druzhinina IS. The Trichoderma koningii aggregate species. Stud Mycol. 2006;56:67-133. Sanchez JF, Chiang YM, Wang CC. Diversity of polyketide synthases found in the Aspergillus and Streptomyces genomes. Mol Pharm. 2008 Mar-Apr;5(2):226-233. Saraswathy A, Hallberg R. Mycelial pellet formation by Penicillium ochrochloron species due to exposure to pyrene. Microbiol Res. 2005;160(4):375-383. Schardl CL, Leuchtmann A, Spiering MJ. Symbioses of grasses with seedborne fungal endophytes. Annu Rev Plant Biol. 2004;55:315-340. Schmitt I, Martin MP, Kautz S, Lumbsch HT. Diversity of non-reducing polyketide synthase genes in the Pertusariales (lichenized Ascomycota): a phylogenetic perspective. Phytochemistry. 2005 Jun;66(11):1241-1253. Schmitt I, Kautz S, Lumbsch HT. 6-MSAS-like polyketide synthase genes occur in lichenized ascomycetes. Mycol Res. 2008 Feb;112(Pt 2):289-296. Schneider G. Enzymes in the biosynthesis of aromatic polyketide antibiotics. Curr Opin Struct Biol. 2005 Dec;15(6):629-636. Schulz B, Wanke U, Dreager S, Aust HJ. Endophytes from herbaceous plants and shrubs: effectiveness of surface sterilisation methods. Mycol Res. 1993;97:1447-1450.
______________________________________________________________________ Referências
192
Schulz B, Sucker J, Aust HJ, krohn K, Ludewing K, jones PG, et al. Biologically active secondary metabolitesvof endophytic Pezicula species. Mycol Res. 1995;99:1007-1015. Schulz B, Boyle C. The endophytic continuum. Mycol Res. 2005 Jun;109(Pt 6):661-686. Schulz B, Boyle, C., Draeger, S., Ro¨ mmert, A.-K. & Krohn, K. Endophytic fungi: a source of biologically active secondary metabolites. Mycol Res. 2002;1006:996-1004. Schumann J, Hertweck C. Advances in cloning, functional analysis and heterologous expression of fungal polyketide synthase genes. J Biotechnol. 2006 Aug 5;124(4):690-703. Schuster A, Schmoll M. Biology and biotechnology of Trichoderma. Appl Microbiol Biotechnol. 2010 Jul;87(3):787-799. Schwarz M, Kopcke B, Weber RW, Sterner O, Anke H. 3-hydroxypropionic acid as a nematicidal principle in endophytic fungi. Phytochemistry. 2004 Aug;65(15):2239-2245. Seshime Y, Juvvadi PR, Fujii I, Kitamoto K. Discovery of a novel superfamily of type III polyketide synthases in Aspergillus oryzae. Biochem Biophys Res Commun. 2005 May 27;331(1):253-260. Shedbalkar U, Dhanve R, Jadhav J. Biodegradation of triphenylmethane dye cotton blue by Penicillium ochrochloron MTCC 517. J Hazard Mater. 2008 Sep 15;157(2-3):472-479. Shen B. Polyketide biosynthesis beyond the type I, II and III polyketide synthase paradigms. Curr Opin Chem Biol. 2003 Apr;7(2):285-295. Shepherd J. Who should receive a statin these days? Lessons from recent clinical trials. J Intern Med. 2006 Oct;260(4):305-319. Shiao MS, Don HS. Biosynthesis of mevinolin, a hypocholesterolemic fungal metabolite, in Aspergillus terreus. Proc Natl Sci Counc Repub China B. 1987 Jul;11(3):223-231. Shimizu T, Kinoshita H, Ishihara S, Sakai K, Nagai S, Nihira T. Polyketide synthase gene responsible for citrinin biosynthesis in Monascus purpureus. Appl Environ Microbiol. 2005 Jul;71(7):3453-3457. Shindia AA. Mevinolin production by some fungi. Folia Microbiol (Praha). 1997;42(5):477-480. Shu RG, Wang FW, Yang YM, Liu YX, Tan RX. Antibacterial and xanthine oxidase inhibitory cerebrosides from Fusarium sp. IFB-121, an endophytic fungus in Quercus variabilis. Lipids. 2004 Jul;39(7):667-673.
______________________________________________________________________ Referências
193
Sims JW, Fillmore JP, Warner DD, Schmidt EW. Equisetin biosynthesis in Fusarium heterosporum. Chem Commun (Camb). 2005 Jan 14(2):186-188. Singh MP, Janso JE, Luckman SW, Brady SF, Clardy J, Greenstein M, et al. Biological activity of guanacastepene, a novel diterpenoid antibiotic produced by an unidentified fungus CR115. J Antibiot (Tokyo). 2000 Mar;53(3):256-261. Smit E, Leeflang P, Glandorf B, van Elsas JD, Wernars K. Analysis of fungal diversity in the wheat rhizosphere by sequencing of cloned PCR-amplified genes encoding 18S rRNA and temperature gradient gel electrophoresis. Appl Environ Microbiol. 1999 Jun;65(6):2614-2621. Song JL, Lyons CN, Holleman S, Oliver BG, White TC. Antifungal activity of fluconazole in combination with lovastatin and their effects on gene expression in the ergosterol and prenylation pathways in Candida albicans. Med Mycol. 2003 Oct;41(5):417-425. Song YC, Li H, Ye YH, Shan CY, Yang YM, Tan RX. Endophytic naphthopyrone metabolites are co-inhibitors of xanthine oxidase, SW1116 cell and some microbial growths. FEMS Microbiol Lett. 2004a Dec 1;241(1):67-72. Song Z, Cox RJ, Lazarus CM, Simpson TT. Fusarin C biosynthesis in Fusarium moniliforme and Fusarium venenatum. Chembiochem. 2004b Sep 6;5(9):1196-1203. St Leger RJ, Screen SE, Shams-Pirzadeh B. Lack of host specialization in Aspergillus flavus. Appl Environ Microbiol. 2000 Jan;66(1):320-324. Staunton J, Weissman KJ. Polyketide biosynthesis: a millennium review. Nat Prod Rep. 2001 Aug;18(4):380-416. Steinberg D, Avigan J, Feigelson EB. Effects of Triparanol (Mer-29) on Cholesterol Biosynthesis and on Blood Sterol Levels in Man. J Clin Invest. 1961 May;40(5):884-893. Stierle A, Strobel G, Stierle D. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of Pacific yew. Science. 1993 Apr 9;260(5105):214-216. Stokes PM, Lindsay JE. Copper tolerance and accumulation in Penicillium ochro-chloron isolated from copper-plating solution. Mycologia. 1979 Jul-Aug;11(4):796-806. Stowe BB, Yamaki T. Gibberellins: stimulants of plant growth. Science. 1959;129:807-816. Strobel G. Endophytic as sources of bioactive products. Microbes and Infections. 2003;5:535-544. Strobel G, Daisy B. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products. Microbiol Mol Biol Rev. 2003 Dec;67(4):491-502.
______________________________________________________________________ Referências
194
Strobel G, Daisy B, Castillo U, Harper J. Natural products from endophytic microorganisms. J Nat Prod. 2004 Feb;67(2):257-268. Strobel G. Harnessing endophytes for industrial microbiology. Curr Opin Microbiol. 2006 Jun;9(3):240-244. Strohl WB. Industrial Antibiotics: today and the future. In: DeKker M, editor. Biotechnology of antibiotics. 2nd ed. New York; 1997. Stuart RM. Communidade de fungos endofíticos associados à cana-de-açúcar convencional egeneticamente modificada [dissertação (Mestrado em Agronomia)]. Piracicaba (Brasil): Universidade de São Paulo, Escola Superior de Agronomia "Luiz de Quiroz"; 2006. Stuart RM, Romao AS, Pizzirani-Kleiner AA, Azevedo JL, Araujo WL. Culturable endophytic filamentous fungi from leaves of transgenic imidazolinone-tolerant sugarcane and its non-transgenic isolines. Arch Microbiol. 2010 Apr;192(4):307-313. Swiss Institute of Bionformatics. Swiss-model. [database on the Internet]. Available from: http://swissmodel.expasy.org/. [cited 2010 Febereiro]. Taechowisan T, Lu C, Shen Y, Lumyong S. Secondary metabolites from endophytic Streptomyces aureofaciens CMUAc130 and their antifungal activity. Microbiology. 2005 May;151(Pt 5):1691-1695. Tan RX, Zou WX. Endophytes: a rich source of functional metabolites. Nat Prod Rep. 2001 Aug;18(4):448-459. The Medical School Charite Berlin. SRAP. 2004[database on the Internet]. Available from: http://www.charite.de/bioinf/strap. [cited 2009 Maço]. Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Curr Protoc Bioinformatics. 2002 Aug;Chapter 2:Unit 2 3. Tobert JA. New developments in lipid-lowering therapy: the role of inhibitors of hydroxymethylglutaryl-coenzyme A reductase. Circulation. 1987 Sep;76(3):534-538. Tokuoka M, Seshime Y, Fujii I, Kitamoto K, Takahashi T, Koyama Y. Identification of a novel polyketide synthase-nonribosomal peptide synthetase (PKS-NRPS) gene required for the biosynthesis of cyclopiazonic acid in Aspergillus oryzae. Fungal Genet Biol. 2008 Dec;45(12):1608-1615. Trapp SC, Hohn TM, McCormick S, Jarvis BB. Characterization of the gene cluster for biosynthesis of macrocyclic trichothecenes in Myrothecium roridum. Mol Gen Genet. 1998 Feb;257(4):421-432. Tsai HF, Chang YC, Washburn RG, Wheeler MH, Kwon-Chung KJ. The developmentally regulated alb1 gene of Aspergillus fumigatus: its role in modulation of conidial morphology and virulence. J Bacteriol. 1998 Jun;180(12):3031-3038.
______________________________________________________________________ Referências
195
Turner WB. The production of trypacidin and monomethylsulochrin by Aspergillus fumigatus. J Chem Soc Perkin 1. 1965 Sep:6658-6659. Tuttobello L, Foppen FH, Carilli A. Growth and Pigmentation of Epicoccum nigrum in Submerged Culture. Appl Microbiol. 1969 Jun;17(6):847-852. Van der Aa HA, Noordeloos ME, de Gruyter J. Species concepts in some larger genera of the Coelomycetes. Stud Mycol. 1990;32:3-19. Van Lanen SG, Shen B. Biosynthesis of enediyne antitumor antibiotics. Curr Top Med Chem. 2008;8(6):448-459. Vandenkoornhuyse P, Baldauf SL, Leyval C, Straczek J, Young JP. Extensive fungal diversity in plant roots. Science. 2002 Mar 15;295(5562):2051. Vaz AB, Mota RC, Bomfim MR, Vieira ML, Zani CL, Rosa CA, et al. Antimicrobial activity of endophytic fungi associated with Orchidaceae in Brazil. Can J Microbiol. 2009 Dec;55(12):1381-1391. Vega FE, Posada F, Peterson SW, Gianfagna TJ, Chaves F. Penicillium species endophytic in coffee plants and ochratoxin A production. Mycologia. 2006 Jan-Feb;98(1):31-42. Wang J, Huang Y, Fang M, Zhang Y, Zheng Z, Zhao Y, et al. Brefeldin A, a cytotoxin produced by Paecilomyces sp. and Aspergillus clavatus isolated from Taxus mairei and Torreya grandis. FEMS Immunol Med Microbiol. 2002 Sep 6;34(1):51-57. Wani MC, Taylor HL, Wall ME, Coggon P, McPhail AT. Plant antitumor agents. VI. The isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia. J Am Chem Soc. 1971 May 5;93(9):2325-2327. Ward DM, Adams TH. Analysis of ribosomal DNA sequences of Polymyxa species and related fungi and the development of genus-and species-specific PCR primers. Mycological Research. 1998;102:965–974. Washington JA, 2nd, Wilson WR. Erythromycin: a microbial and clinical perspective after 30 years of clinical use (1). Mayo Clin Proc. 1985 Mar;60(3):189-203. Watanabe A, Ebizuka Y. Unprecedented mechanism of chain length determination in fungal aromatic polyketide synthases. Chem Biol. 2004 Aug;11(8):1101-1106. Watanabe Y, Ito T, Shiomi M, Tsujita Y, Kuroda M, Arai M, et al. Preventive effect of pravastatin sodium, a potent inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, on coronary atherosclerosis and xanthoma in WHHL rabbits. Biochim Biophys Acta. 1988 Jun 15;960(3):294-302. Waugh AC, Long PF. Prospects for generating new antibiotics. Sci Prog. 2002;85(Pt 1):73-88.
______________________________________________________________________ Referências
196
Weber D, Sterner O, Anke T, Gorzalczancy S, Martino V, Acevedo C. Phomol, a new antiinflammatory metabolite from an endophyte of the medicinal plant Erythrina crista-galli. J Antibiot (Tokyo). 2004 Sep;57(9):559-563. Weissman KJ. Introduction to polyketide biosynthesis. Methods Enzymol. 2009;459:3-16. Weld RJ, Plummer KM, Carpenter MA, Ridgway HJ. Approaches to functional genomics in filamentous fungi. Cell Res. 2006 Jan;16(1):31-44. Westwood FR, Bigley A, Randall K, Marsden AM, Scott RC. Statin-induced muscle necrosis in the rat: distribution, development, and fibre selectivity. Toxicol Pathol. 2005;33(2):246-257. Whipps JM. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere. J Exp Bot. 2001 Mar;52(Spec Issue):487-511. White TJ, T.D. B, Lee S, Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal DNA genes for phylogenies. In: Innis MA, Gelfand DH, Snisky JJ, White TJ, editors. PCR protocols: a guide to methods and applications. New York: Academic Press; 1990. p. 312-315. Wijeratne EM, Turbyville TJ, Zhang Z, Bigelow D, Pierson LS, 3rd, VanEtten HD, et al. Cytotoxic constituents of Aspergillus terreus from the rhizosphere of Opuntia versicolor of the Sonoran Desert. J Nat Prod. 2003 Dec;66(12):1567-1573. Wilkinson B, Micklefield J. Mining and engineering natural-product biosynthetic pathways. Nat Chem Biol. 2007 Jul;3(7):379-386. Wilmotte A, van der Peer Y, Goris A, Chapelle S, de Baere R, Nelissen B, et al. Evolutionary relationships among higher fungi inferred from small ribosomal subunit RNA sequence analysis. Systematic and Applied Microbiology. 1993;16:436–444. Wilson D. Endophyte - the evolution of a term, and clarification of its use and definition. Oikos. 1995;73:274-276. Wiyakrutta S, Sriubolmas N, Panphut W, Thongon N, Danwisetkanjana K, Ruangrungsi N, et al. Endophytic fungi with anti-microbial, anti-cancer and antimalarial activities isolated from Thai medicinal plants. World J Microb Biot. 2004;20:265-272. Xu L, Zhou L, Zhao J, Li J, Li X, Wang J. Fungal endophytes from Dioscorea zingiberensis rhizomes and their antibacterial activity. Lett Appl Microbiol. 2008 Jan;46(1):68-72. Xue C, Li T, Deng Z, Fu H, Lin W. Janthinolide A-B, two new 2,5-piperazinedione derivatives from the endophytic Penicillium janthinellum isolated from the soft coral Dendronephthya sp. Pharmazie. 2006 Dec;61(12):1041-1044.
______________________________________________________________________ Referências
197
Yang G, Rose MS, Turgeon BG, Yoder OC. A polyketide synthase is required for fungal virulence and production of the polyketide T-toxin. Plant Cell. 1996 Nov;8(11):2139-2150. Yang X, Zhang L, Guo B, Guo S. Preliminary study of a vincristine-producing endophytic fungus isolated from leaves of Catharanthus roseus. Zhongcaoyao. 2004;35(1):79-81. Young DH, Michelotti EL, Swindell CS, Krauss NE. Antifungal properties of taxol and various analogues. Experientia. 1992 Sep 15;48(9):882-885. Yu J, Chang PK, Cary JW, Wright M, Bhatnagar D, Cleveland TE, et al. Comparative mapping of aflatoxin pathway gene clusters in Aspergillus parasiticus and Aspergillus flavus. Appl Environ Microbiol. 1995 Jun;61(6):2365-2371. Yu J, Whitelaw CA, Nierman WC, Bhatnagar D, Cleveland TE. Aspergillus flavus expressed sequence tags for identification of genes with putative roles in aflatoxin contamination of crops. FEMS Microbiol Lett. 2004 Aug 15;237(2):333-340. Zhan J, Wijeratne EM, Seliga CJ, Zhang J, Pierson EE, Pierson LS, 3rd, et al. A new anthraquinone and cytotoxic curvularins of a Penicillium sp. from the rhizosphere of Fallugia paradoxa of the Sonoran desert. J Antibiot (Tokyo). 2004 May;57(5):341-344. Zhang AW, Riccioni L, Pedersen WL, Kollipara KP, Hartman GL. Molecular Identification and Phylogenetic Grouping of Diaporthe phaseolorum and Phomopsis longicolla Isolates from Soybean. Phytopathology. 1998 Dec;88(12):1306-1314. Zhang HW, Song YC, Tan RX. Biology and chemistry of endophytes. Nat Prod Rep. 2006 Oct;23(5):753-771. Zhou GX, Wijeratne EM, Bigelow D, Pierson LS, 3rd, VanEtten HD, Gunatilaka AA. Aspochalasins I, J, and K: three new cytotoxic cytochalasans of Aspergillus flavipes from the rhizosphere of Ericameria laricifolia of the Sonoran Desert. J Nat Prod. 2004 Mar;67(3):328-332.