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Juan Diego Rojas Prospecção de genes biossintéticos de policetídeos a partir de fungos isolados de cana-de-açúcar. Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butanta/IPT para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia Orientador: Prof. Dr. Gabriel Padilla São Paulo 2010

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Juan Diego Rojas

Prospecção de genes biossintéticos de policetídeos a partir de fungos isolados de cana-de-açúcar.

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butanta/IPT para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia.

Área de concentração: Biotecnologia

Orientador: Prof. Dr. Gabriel Padilla

São Paulo 2010

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RESUMO

Rojas JD. Prospecção de genes biossintéticos de policetídeos a partir de fungos

isolados de cana-de-açúcar. [tese (Doutorado em Biotecnologia)]. São Paulo (Brasil):

Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2010.

Os Fungos endofíticos e rizosféricos têm chamado recentemente a atenção devido

às suas propriedades biotecnológicas. A partir de 280 isolados de cana-de-açúcar,

dezoito fungos ascomicetos foram avaliados quanto á presença de genes policetídeo

sintase (PKS) por meio da técnica do PCR. Estes fungos foram identificados

taxonomicamente por uma abordagem polifásica, classificando-os dentro de quatro

ordens e nove gêneros, onde espécies do gênero Penicillium foram as mais

predominantes. A avaliação da atividade biológica demonstrou a presença de

metabolitos com propriedades antibióticas quando enfrentados a micro-organimsos

patogênicos. Segundo a análise de correspondência múltipla, esta atividade poderia

estar associada com a local de isolamento dos fungos. Foram detectadas 36

seqüências similares a genes PKS a partir de 17 fungos, sendo 26 seqüências

relacionadas ao domínio conservado cetosintase (KS) e 10 seqüências relacionadas

ao domínio C-metiltransferase (CMT). A Análise felogenética do domínio KS,

conduzida pelo método de neighbor–joining, indicou que 16 seqüências se

acomodaram dentro do grupo monofilético dos PKS envolvidos na produção de

policetídeos não reduzidos, nos clados que representam a síntese de pigmentos de

conídios, aflatoxinas e melaninas. As outras 10 seqüências se acomodaram dentro

do grupo monofilético dos PKS envolvidos na produção de policetídeos reduzidos,

nos clados que representam a síntese de moléculas como a lovastatina, fumonisin,

compostos híbridos PKS-NRPS e de PKS vagamente caracterizados. A análise do

domínio CMT também apontou que as seqüências podiam se acomodaram em

grupos de PKS dependendo do grau de redução do policetídeo, todas as 10

seqüências se relacionaram com PKS envolvidos na produção de policetídeos

reduzidos. Analises dos modelos estruturais também demonstraram que as

seqüências estavam altamente relacionadas com estruturas protéicas da família das

enzimas de condensação, destacando a presença de uma hélice α característica

que carrega o resíduo de cisteína, responsável pela atividade de condensação.

Extratos orgânicos obtidos de cultivos dos fungos foram avaliados parar detectar a

presença de compostos tipo lovastatina, por meio de técnicas cromatográficas: em

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CCDS, foram detectaram bandas com o mesmo deslocamento que a lovastatina

padrão a partir dos extratos de 10 dos fungos, mas apenas 6 destes extratos

confirmaram a presença de compostos com o mesmo tempo de retenção que a

lovastatina padrão quando analisados por CLAE. O isolado A. flavus CBMAI (1023)

foi selecionado para a realização de experimentos de produção a maior escala, onde

um composto de posivel origem policetidica foi isolado e parcilamente caracterizado.

Palavras-chave: Fungos endofíticos. Policetídeo sintase (PKS). Cetosintase (KS). C

metiltransferase (CMT). Policetídeos (PK). Lovastatina.

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ABSTRACT

Rojas JD. Screening of polyketides biosynthetic genes from sugarcane-derived fungi.

[Ph.D. thesis (Biotechnology)] São Paulo (Brasil): Instituto de Ciências Biomédicas

da Universidade de São Paulo;2010.

Endophytic and rhizosphere fungi have called attention recently for their

biotechnological properties. From a group of 280 sugarcane-derived fungi, eighteen

ascomycota fungi, were assessed for the presence of polyketide synthase (PKS)

genes by PCR approaches. These fungi were identified taxonomically by a

polyphasic approach classifying into four orders and nine genus, where Penicillium

spp. where the most predominant. Biological activity tests showed the presence of

antibiotic metabolites against pathogenic microorganism and the relationship of this

activity might be linked with the fungal isolate location by multiple correspondence

analyses. 36 sequences similar to PKS genes fragments were detected from 17 of

these fungi, being 26 sequences related to ketosynthase (KS) conserved domain and

10 sequences related to C-methyltransferase (CMT) domain. A neighbor– joining

phylogenetic analysis of the KS domain showed that sixteen sequences fit on the

monophyletic group of PKS evolved with production of non reduced polyketides,

belonging to the clades responsible to conidial pigments, aflatoxins and melanins

synthesis. The other 10 sequences fit on the monophyletic group of PKS evolved

with the production of reduced polyketides, belonging to the clades that represent the

synthesis of lovastatin, PKS-NRPS compounds, fumonisin and with PKS that are

pour characterized. Analysis of the CMT domain also pointed that ten sequences fit

with groups of PKS depending on polyketide reduction grade, all of them related to

PKS evolved with the synthesis of reduced polyketides. Protein structural analysis

also pointed that these sequences are closely related with proteins from condensing

enzyme family, highlighting the presence of a characteristic α helix elbow that bears

the cysteine residue responsible for the condensation activity. The fungi were also

tested for their capacity of producing lovastatin compounds by chromatographic

techniques: on TLC were detected 10 bands with the same dislocation compared to a

lovastatin, but only 6 were confirmed by HPLC. The A. flavus CBMAI (1023) were

selected for upscale production experiments, where a compound of posivel

polyketide origin was isolated and partially characterized.

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Keywords: Endophytic fungi. Polyketide synthase (PKS). Keto synthase (KS). C

methyltransferase (CMT). Polyketide (PK). Lovastatin.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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1 INTRODUÇÃO

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1.1 JUSTIFICATIVA

O estudo dos fungos endofíticos, como fonte promissora de compostos ativos

com interesse farmacológico, vem tomando enorme destaque, na estratégia da

busca de novos compostos (Clardy e Walsh, 2004; Gunatilaka, 2006). A diminuição

da descoberta de novos compostos nos últimos anos, atingiu o mínimo número em

2004 com a introdução de 25 novas entidades químicas (Newman e Cragg, 2007).

Em função disso, torna-se uma necessidade premente a busca por novos fármacos

com amplo espectro que, possam lidar com o crescimento acelerado da população

mundial, o aumento da longevidade, o ressurgimento de doenças graves (e.g.,

tuberculose) e pandemias, e principalmente, com o incremento constante da

resistência microbiana aos antibióticos de rotina além da procura por fármacos

menos tóxicos (Strobel e Daisy, 2003; Waugh e Long, 2002).

Os micro-organismos endofíticos constituem uma parte significativa da

microbiota das plantas, ainda pouquíssima conhecida e explorada (Clardy e Walsh,

2004). Alguns poucos exemplos de literatura evidenciam o grande potencial de

exploração biotecnológica e alto valor agregado dos bioprodutos obtidos desta

associação (Strobel, 2003; Tan e Zou, 2001). Um exemplo é o taxol, um dos

importantes antitumorais que hoje, se sabe é produzido por uma espécie de fungo

endofítico isolado de cipreste (Taxus sp.), que representou vendas de mais 1.6

bilhões de dólares no 2000 (Stierle et al., 1993).

Entre os principais tipos de compostos analisados como novas entidades

químicas como os obtidos por síntese orgânica, química combinatória entre outros,

os produtos naturais são os que apresentam a maior diversidade química (Harvey,

2008). Além disso, os produtos naturais e seus derivados contribuíram com um 75%

das novas entidades químicas aprovadas pela FDA entre 1996 e 2006 (Butler, 2004;

Newman e Cragg, 2007).

Entre os produtos naturais, os policetídeos se destacam não somente por

apresentar diversidade nas suas estruturas químicas (Cox, 2007), mas também

porque compreendem uma fração significativa dos metabolitos microbianos que têm

sido identificados pelas suas atividades fisiológicas, e pelas importantes aplicações

comerciais que algumas destas moléculas têm atingido no mercado farmacológico

como antibacterianos (a eritromicina e a tetraciclina), imunusupressores (a

rapamicina e o ácido micofenôlico), agentes anticancerígenos (a doxorubicina e a

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daunorubicina), agentes antifúngicos (a anfotericina e a griseofulvina), produtos

veterinários (a avermectina) e anticolesterolémicos (estatinas) (Cane, 1997). Estes e

muitos outros compostos policetídicos têm movimentado o mercado global em

bilhões de dólares, representando 3% das vendas mundiais em 1998 para produtos

farmacêuticos sob prescrição, e se expandindo a mais de 10-20US$ bilhões anuais

(Firn, 2010; Roa e Leise, 2002; Strohl, 1997; Weissman, 2009), atraindo o

investimento das indústrias farmacêuticas tanto para pesquisa básica e aplicada nos

recentes anos, acompanhada pela ampla exploração da biologia molecular

responsável pela sua biosínteses. Hoje em dia, sabe-se que os policetídeos são

sintetizados por um sistema enzimático chamado de policetídeo sintase ou PKS (do

inglês polyketide synthase), e que a sua síntese é governada por um conjunto de

genes envolvidos desde sua formação e modificação até a sua regulação e própria

resistência, sendo responsável pela síntese de mais de dez mil moléculas

conhecidas. Apesar de que poucas enzimas PKS têm sido isoladas e

caracterizadas, é possível, mediante o uso de ferramentas da engenharia genética,

seqüenciar, clonar, isolar e expressar enzimas desta classe.

Infelizmente, no Brasil, e na America Latina, ainda existe uma dependência

total por fármacos desenvolvidos no exterior. Além dos aspectos de mercado e infra-

estrutura industrial nacional, existe uma escassez de profissionais capacitados para

desenvolvimento de projetos nesta área. Esta situação é ainda mais grave pela falta

de uma política clara de incentivo à pesquisa e desenvolvimento de fármacos.

Uma das maneiras de elevar a competitividade do país neste setor é o

aproveitamento racional e sustentado da rica biodiversidade brasileira. Assim,

aproveitando-se a diversidade de micro-organismos endofíticos e o conhecimento já

estabelecido no país pelas equipes atuantes na EMBRAPA e ESALQ/USP, que

estudam a interação endofítica em condições tropicais, aliado ao potencial

inexplorado para a biotecnologia, acreditamos que o Brasil possa efetivamente se

destacar no cenário internacional, com uma real contribuição em inovação e

descoberta de novos compostos bioativos para a indústria farmacêutica

internacional.

O presente projeto visa realizar uma prospecção dirigida a identificar genes

da biossíntese dos policetídeos, a partir de um conjunto de fungos filamentosos

endofitícos e de isolados da rizosfera de cana-de-açúcar. Como processo de

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seleção inicial, para a identificação de novos compostos policetídeos, optou-se

peloestudo das estatinas como alvo principal. Em estudos mais recentes, descobriu-

se que as estatinas também podem apresentar atividade antitumoral, destacando o

aumento da sobrevida dos pacientes e redução dos tumores. Esta atividade

antitumoral chamou nosso interesse motivando-nos em centrar os estudos para essa

classe de moléculas (Brown, 2007; Chan et al., 2003; Hindler et al., 2006).

Numa abordagem inicial, aproximadamente 300 amostras de DNA passaram

pela identificação de genes PKS, mediante o uso da técnica da reação de cadeia da

polimerase (ou PCR). Os iniciadores empregados reconheciam regiões conservadas

dos genes, responsáveis pela síntese de diferentes classes de policetídeos. A partir

desta abordagem foram selecionados dezoito isolados como material biológico de

estudo: (a) os isolados fúngicos foram identificados mediante técnicas morfológicas

e moleculares; (b) extratos orgânicos obtidos a partir destes fungos foram testados

contra micro-organismos patogênicos visando realizar uma caracterização do seu

possível potencial antibiótico; (c) as regiões conservadas dos genes PKS detectadas

foram analisadas filogenética e estruturalmente para entender sua possível função

na biossíntese de policetídeos; e por último, (d) foram produzidos extratos orgânicos

a partir de meios de cultura de produção visando a detecção de policetídeos,

comparando com lovastatinas comerciais para sua purificação e caracterização

estrutural.

O projeto, de cunho biotecnológico, reúne a competência dos laboratórios de

Genética de Streptomyces, Departamento de Microbiologia (ICB), que é

especializado no estudo de vias biossintéticas dos policetídeos antraciclinas

(antineoplásicos), e o Laboratório de Genética de Micro-organismos da ESALQ, que

construiu e disponibilizou a coleção de micro-organismos endofíticos.

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1.2 MARCO TEÓRICO

Esta revisão aborda o conhecimento cientifico em torno dos micro-organismos

endofíticos, especialmente fungos, por ser o material de estudo deste trabalho.

Trata-se, também, sobre os policetídeos, compreendendo os mecanismos

moleculares da sua biossíntese e diversidade estrutural. Por último, se enfoca as

estatinas, em especial a lovastatina, explorando sobre sua história, síntese,

produção e atividades biológicas, já que este é o policetídeo de maior interesse para

esta prospecção.

1.2.1 Micro-organismos endofíticos

Muitas definições têm-se aplicado ao termo endofítico (Lodewyckx et al.,

2002). Kloepper et al. (1992) os denominaram como aqueles organismos que se

encontram entre os tecidos internos da epiderme das plantas. Não obstante, como

muitos destes micro-organismos endofíticos podem se tornar patogênicos,

dependendo de certas condições e hospedeiros, James e Olivares (1997) ajustaram

a definição e concluíram que todas as bactérias e fungos que colonizam o interior

das plantas, incluindo patogênicos ativos e latentes, são considerados endofíticos.

Muitos autores atuais, porém, consideram micro-organismos endofíticos, geralmente

bactérias e fungos, como um conjunto de micro-organismos que habitam no interior

das plantas, sem causar aparentemente nenhum dano a seu hospedeiro, pelo

menos por um período do seu ciclo de vida (Bacon e Withe, 2000; Gunatilaka, 2006;

Petrini, 1991; Schulz, 2002; Tan e Zou, 2001; Wilson, 1995).

Pesquisadores brasileiros têm redefinido o termo “endofítico”, como todos

aqueles micro-organismos que podem ou não crescer em meio de cultura e que

habitam o interior de tecidos e órgãos vegetais sem causar prejuízos ao seu

hospedeiro e sem produzir estruturas externas visíveis, salientando que a

diferenciação entre endofítico, epífito (que habita sobre a superfície da planta) e

fitopatogéno (que causa doenças), está intrinsecamente relacionada no somente em

nível de adaptação e especificidade do hospedeiro, mas também do estágio

desenvolvimento em que se encontram os relacionados. Entre os estágios definidos

se destacam: virulência inata do micro-organismo, resposta de defesa da planta e as

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condições ambientais que abordam a relação (Azevedo et al., 2000; Azevedo e

Araujo, 2007).

Estes micro-organismos foram mencionados pela primeira vez no início do

século XIX por Darnel (Strobel, 2003; Tan e Zou, 2001), mas foi o botânico Barry em

1866, quem fez uma possível distinção entre os micro-organismos endofíticos e os

patogênicos das plantas. No final dos anos 70, verificou-se que, além de serem

habitantes internos das plantas, os micro-organismos endofíticos tinham

propriedades de interesse, tais como conferir proteção contra insetos praga, micro-

organismos patogênicos e mesmo contra herbívoros, e em muitos casos podem

produzir substâncias bioativas que podem estar envolvidas na relação simbiôntica

endofítico-hospedeiro. Sendo assim, durante as décadas passadas mais de 100

micro-organismos endofíticos foram cultivados e sujeitos a investigações detalhadas

apontando à caracterização química dos seus metabólitos e avaliação da sua

atividade biológica. Muitos dos metabólitos analisados apresentaram estruturas

novas com atividades biológicas interessantes, inibindo o crescimento de micro-

organismos resistentes os antibióticos de rotina, antifúngicos, antivirais, fitotoxicos,

entre outros (Gunatilaka, 2006). Ainda hoje, estudos recentes têm indicado que o

51% das substâncias com atividade biológica de micro-organismos endofíticos são

desconhecidos, comparadas com 38% das substancias novas de micro-organismos

provenientes do solo (Schulz, 2002).

Acredita–se que todas as plantas são hospedeiras de pelo menos um micro-

organismo endofítico, os quais incluem bactérias e fungos, que moram

primariamente no tecido debaixo das camadas de células epidérmicas sem

apresentar nenhum tipo de sintoma(Strobel et al., 2004). Estima-se que pode haver

mais de um milhão de espécies diferentes de micro-organismos endofíticos, no

entanto, apenas poucos deles foram descritos (Petrini, 1991).

É bem entendido que as infecções e a propagação provocadas pelos

endofíticos são pelo menos moderadas, porém, os tecidos da planta são

transitoriamente sadios. Esta relação endofítica pode ter sido desenvolvida quando

as plantas superiores começaram a aparecer na terra, milhões de anos atrás,

algumas evidências de associações de micróbios com plantas se tem descoberto em

tecidos fossilizados de folhas e caules (Zhang et al., 2006). Como resultado destas

longas associações, é possível imaginar que alguns destes micro-organismos

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dividiram sistemas genéticos produzindo-se a transferência de informação entre

eles, permitindo que os micro-organismos endofíticos tenham produzido

mecanismos mais rápidos de adaptação a mudanças ambientais, entre eles a

compatibilidade com a sua planta hospedeira (Strobel, 2003). Nesta associação

simbiótica, a planta hospedeira protege e alimenta o micro-organismo endofítico, o

qual, em retorno, produz metabólitos bioativos para aumentar o crescimento e

competitividade da planta e/ou brindar proteção contra patógenos e herbívoros

(Gunatilaka, 2006; Schulz e Boyle 2005). No entanto, se desconhece o verdadeiro

papel dos metabólitos bioativos na simbiose micro-organismo planta. Algumas

hipóteses ao respeito afirmam que, se um fungo endofítico é capaz de produzir

metabólitos in vitro, é porque, seguramente, tem alguma função natural. Todo o

complexo multienzimático requerido para a síntese do metabolito secundário não

seria mantido pelo micro-organismo sem algum efeito benéfico para sua

sobrevivência (Demain, 1999).

Por estes motivos, as plantas podem ser consideradas como micro-

ecossistemas complexos, nichos ecológicos, habitat específicos que podem ser

explorados por uma ampla variedade de bactérias e fungos (Azevedo et al., 2000).

Estes habitats não estão representados só pela superfície externa da planta, onde

bactérias epifíticas predominam, senão também por tecidos internos, em os quais

muitos micro-organismos podem penetrar e sobreviver. Dentro do micro-ecossistema

das plantas, tanto fungos quanto bactérias, podem interatuar e estabelecer um

equilíbrio. Esta distribuição foi observada pela primeira vez por Gardner et al.(1982),

que identificou bactérias presentes no xilema das raízes de um limoeiro da Flórida.

Pseudomonas (40%) e Enterobacter (20%) foram os gêneros predominantes,

enquanto que as restantes foram consideradas espécies raras. Não entanto, entre

os micro-organismos endofíticos, os fungos, na sua maioria constituída por

ascomicetes e fungos imperfeitos, representam uma das maiores e menos

exploradas diversidades, com uma estimativa de 1.5 x 106 espécies (Carroll, 1988).

Ao contrário de outras associações fúngicas, em comparação com fungos

micorrízicos, os fungos endófitos residem inteiramente dentro dos tecidos do

hospedeiro. Estes fungos são um grupo filogeneticamente diverso, sendo membros

do subreino dikarya (Arnold et al., 2007; Carroll, 1988; Girlanda et al., 2006; Schardl

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et al., 2004) sendo sua maioria pertencente ao filo ascomycota, e aguns poucos do

filo basidiomycota.

Os Fungos endofíticos são considerados tão ubíquos como associações

micorrízicas entre plantas das zonas temperadas (Carroll, 1988), sendo encontrados

em algas (Hawksworth e Rossmann, 1997), musgos (Schulz et al., 1993),

samambaias (Fisher, 1996), coníferas (Bernstein e Carroll, 1977; Legault et al.,

1988), monocotiledôneas (Frohlich et al., 2000; Rodrigues, 1994) e angiospermas

dicotiledôneas (Faeth e Hammon, 1997; Lodge et al., 1996; Rajagopal e

Suryanarayanan, 2000). Saikkonen et al. (1998) revisou vários estudos mostrando

que as plantas nas zonas temperadas pode abrigar dezenas de espécies de

endófitos, em quanto Aurnold et al. (2000) demostrartam que as angiospermas

tropicais possuem uma maior diversidade, tanto em numero como em espécies,

demonstrado uma notável riqueza de endófitos.

Atualmente, os endófitos podem ser subdivididos em dois grandes grupos

com base na variedade dos hospedeiros, no padrão de colonização, na transmissão

e na função ecológica (Rodriguez e Redman, 2008): (i) os endófitos clavicipitaceous

que infectam algumas gramas, (ii) e os endófitos não-clavicipitaceous que estão

divididos em 3 grupos funcionais distintos que podem ser recuperados de tecidos

assintomáticos de plantas não vasculares, samambaias, coníferas e angiospermas

No Brasil, a cana-de-açúcar, o cultivo com a maior importância econômica,

vem sendo foco de intensas investigações procurando vias para o melhoramento da

sua produtividade. Entre elas, diversas linhas de pesquisa envolvendo laboratórios

de diferentes áreas do conhecimento vêm analisando a população endofítica. Alguns

trabalhos de isolamento e análise da comunidade endofítica por técnicas

independentes de cultivo demonstraram uma alta predominância de espécies do

gênero Fusarium, Cladosporium, Epicoccum, Pestalotiopsis, Xylaria e Guignardia, e

numa menor freqüência espécies do gênero Penicillim, Asperguillus, Trichoderma,

Diaporthe e Leptosphaeria (Stuart et al., 2010).

Existem numerosos estudos que reportam que os micro-organismos

endofíticos podem conceder tolerância a condições de estresse a planta hospedeira

incluindo calor, salinidade, metais e aridez (Rodriguez et al., 2004). Têm-se

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observado que, sem a presença destes micro-organismos endofíticos, a planta é

incapaz de sobreviver neste habitat (Redman et al., 2002).

Além disso, outros estudos têm demonstrado a capacidade dos micro-

organismos endofíticos em aumentar a capacidade fitoremediadora de

contaminantes e de ter um papel importante para a fertilidade das plantas mediante

a solubilização de fosfatos e fixação de nitrogênio; servem como indicadores de

vitalidade; usados como agentes no controle biológico e bioherbicidas, já que

ocupam o mesmo nicho ecológico que os patogênicos; e produtores de antibióticos e

outros metabólitos secundários de interesse farmacológico. Por estas razões existe

um grande interesse no desenvolvimento do potencial biotecnológico na

fitoremedição e na produção sustentável de cultivos para a produção de biomassa e

biocombustiveis (Rodriguez et al., 2004; Ryan et al., 2008; Strobel, 2006)

1.2.2 Comunidade fúngica rizosférica

A rizosfera, considerada uma das zonas biológica mais ativa dentro do

ecossistema terrestre, é a região onde o solo e as raízes das plantasentram em

contato, contendo um ecossistema microbiano diferente ao encontrado no solo livre,

tanto no número de micro-organismos quanto à variedade de cepas representadas

(Smalla, 1998). Este nicho é altamente influenciado pela deposição de produtos das

raízes, composta por exudados, lisados, mucilagos, secreções, material celular

morto e incluindo alguns gases como o CO2 produzido na respiração (Lynch e

Whipps, 1990).

A rizosfera também é um ecossistema com interações ecológicas complexas

entre comunidades microbianas, onde processos antagônicos podem tomar lugar,

com a finalidade de interferir no crescimento e sobrevivência de micro-organismos

patógenicos, e impedir os processos de infecção às plantas (Chernin e Chet, 2002).

Entre os mecanismos responsáveis pelo antagonismo incluem-se: (i) antibiose,

inibição do crescimento por compostos antibióticos, toxinas ou compostos tenso-

ativos chamados biossurfactantes; (ii) a competição pelos espaços de colonização,

nutrientes e minerais; e (iii) o parasitismo, que implica a produção de enzimas

extracelulares degradadoras da parede celular dos patógenos, como a quitinase e a

1,3-glucanase (Bloemberg e Lugtenberg, 2001; Fravel, 1988; Whipps, 2001).

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A comunidade microbiana presente na rizosfera também influência no

crescimento e na supervivência da sua planta hospedeira, contribuindo não apenas

como biocontroladores de patógenos ou na indução de resistência sistêmica, mas

também na produção de substâncias estimulantes do crescimento das planta

(Hawksworth e Rossmann, 1997). Mesmo que nos últimos anos tenha se

desenvolvido ferramentas moleculares para analisar as estruturas das comunidades

fúngicas na rizosfera de uma ampla variedade de cultivos (Gomes et al., 2003;

Kowalchuk, 1999; Smit et al., 1999; Vandenkoornhuyse et al., 2002), pouco se sabe

sobre a função e a possível papel da diversidade fúngica observada em associação

nas raízes das plantas (Kowalchuk et al., 1997; Vandenkoornhuyse et al., 2002).

Como conseqüência da alta diversidade das cepas microbianas dentro da

rizosfera, a crença da existência de uma rica fonte de produtores de novos

metabolitos secundários vem emergindo (Berg et al., 2005). Mesmo que a

prospecção de metabólitos secundários átivos a partir de micro-organismos

rizosfericos não tenha recebido tanta atenção em comparação com os micro-

organismos endofíticos, recentes estudos vêm comprovando a alta produtividade na

produção destes compostos: Basil (2004) demonstrou que compostos antifúngicos

chegaram a ser isolados com maior freqüência de actinomicetos rizosféricos de

Artemisa tridentata comparado com a produção em bactérias isoladas de solo (Basil

et al., 2004); Gunatilaika et al., conseguiram isolar e caracterizar 41 metabólitos a

partir de nove fungos rizosfericos de plantas do deserto de Sonora, dos quais, 18

presentaram ser novas estruturas químicas (He et al., 2004; Wijeratne et al., 2003;

Zhan et al., 2004; Zhou et al., 2004).

1.2.3 Identificação e caracterização de fungos mediante técnicas moleculares

White et al.(1990) revolucionou o estudo e identificação de fungos mediante a

introdução e utilização de marcadores do rRNA   para o amplificação de regiões do

rRNA nuclear e mitocondrial por meio da técnica do PCR.

Estes autores desenvolveram dois grupos de marcadores: (i) marcadores

altamente conservados que amplificam regiões da subunidade menor do rDNA,

utilizados em comparações filogenéticas para níveis taxonômicos amplos; (ii) e

marcadores que amplificam regiões de rápida evolução (ribosomal transcibed

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 ______________________________________________________________________  Introdução

33  

spacers (ITS).Esta última região apesar de ser transcrita, não codifica para nenhuma

função e são,  portanto, adequados para acumular mutações neutras, tornando-os  

alvos ideais para a diferenciação entre organismos estreitamente relacionados.  

Estas aproximações moleculares têm sido amplamente empregadas na

identificação de fungos, especialmente para a distinção de cepas intimamante

relacionadas (Ward e Adams, 1998) e para geração de hipóteses sobre divergências

ancestrais evolutivas (Bruns et al., 1992; Wilmotte et al., 1993) Da mesma forma,

estes marcadores contribuíram na identificação de micro-organismos que não

possuem suficientes identificadores morfológicos, como no caso de alguns fungos

associados a plantas, entre eles rizosféricos e endofíticos (Anderson e Cairney,

2004; Kowalchuk, 1999). 

1.2.4 Produtos naturais de micro-organismos endofíticos

Como destacado anteriormente, esta micro diversidade biológica não

somente implica variedade microbiana, mas também diversidade química nas

moléculas envolvidas, devido à inovação necessária para sobreviver em ambientes

restritos aonde a competição por espaço chega ser alta e as fontes de nutrientes

limitadas, condições que levam a que apressão seletiva esteja no seu maior

pico.Situações que criam a oportunidade de achar novas moléculas com alta

atividade biológica, sendo assim, dentro dos endofíticos (Strobel et al., 2004).

Segundo Schulz e Boyle (2002) e Strobel (2003), certos metabólitos

microbianos aparentemente são característicos de certos biotopos (região que

apresenta regularidade nas condições ambientais e nas populações animais e

vegetais), ambos em um nível de relacionamento do organismo e do meio ambiente,

assegurando que a procura de novos metabólitos secundários deve centrar-se em

organismos que habitam ambientes únicos. Os endofíticos são organismos que

habitam esses espaços nas plantas superiores, que podem situar se em muitos

ambientes não comuns, o que tornaria os endofíticos uma fonte sobre-saliente

dessas substâncias naturais.

As condições ambientais nas quais a planta hospedeira cresce, afeta a

população endofítica (Hata et al., 1998). Os micro-organismos endofíticos vêm

sendo isolados e estudados de uma ampla variedade de plantas ao redor do

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 ______________________________________________________________________  Introdução

34  

planeta, em especial de plantas de clima temperado. Schulz et al. em 1993 e 1995,

isolaram mais de 6500 endofíticos de todas as partes da plantas amostradas de

diversos habitats de clima temperado.,A maioria dos isolados pertence a gêneros

ubíquos, tais como Acremonium sp., Alternaria sp. Cladosporium sp. Coniothyrium

sp. Epicoccum sp., Fusarium sp., Genicolusporium sp., Phoma sp., Pleospora sp.,

entre outros.

Recentes investigações apontam que o isolamento de endofíticos a partir de

plantas de clima tropical poderia levar a uma diversidade muito mais interessante.

Strobel e Daisy (2003) afirmam que a mata de clima tropical e temperada são os

ecossistemas mais biologicamente diversos no planeta, abrigando mais de um 60%

da biodiversidade terrestre mundial. Bills et al. (2002) descreveu, baixo dados

estatísticos, uma diferenciação metabólica entre fungos endofíticos isolados de

regiões tropicais com aqueles de origem temperado, demonstrando que, não

somente os isolados de clima tropical produziam produtos naturais mais ativos, mais

também notou uma distinção significativa na produção de metabolitos ativos

dependente da região tropical. Estas observações sugeriram a importância da planta

hospedeira na influencia do metabolismo dos endofíticos.

Segundo as observações de Strobel (2003), é também muito importante a

seleção das plantas superiores hospedeiras para o isolamento dos endofíticos como

produtores de novas moléculas, já que existe uma grande quantidade de espécies

de plantas no mundo. Serão descritas algumas estratégias para limitar a busca e

isolar novos micro-organismos endofíticos:

1. Plantas de ambientes únicos, em especial aquelas que têm estratégias

incomuns para sua sobrevivência. Rhyncholacis penicillata, uma planta aquática,

que se encontra num sistema de rios no sul da Venezuela, tem que suportar um

ambiente hostil, recebendo as águas dos esgotos, onde muitos organismos

patogênicos podem atacar a planta, mas ainda a planta se mantêm aparentemente

sadia, possivelmente pela presença dos micro-organismos endofíticos. Foi isolada

uma cepa de Serratia marcenscens desta planta, que produz uma lactona

macrocíclica clorinada, chamada Oocydin A, com atividade contra fungos

oomycetais fitopatogênicos como Pythium spp. e Phytophyhora spp. (Strobel et al.,

2004).

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 ______________________________________________________________________  Introdução

35  

2. Plantas com referência etnobotânica, relacionadas com usos e aplicações

especificas, sobretudo para povos indígenas. Como exemplo, no Norte de Austrália

existe uma planta chamada “a vid da cobra”, Kennedia nigrinscans, utilizada por

aborígines desta região como planta medicinal para aliviar feridas, cortes profundas

e infecções. Desta planta se isolou um estreptomycete, designado como

Streptomyces NRRL 30562, com a capacidade de produzir peptídeos com alto

espectro antibacteriano contra bactérias Gram positivas e Gram negativas em

especial muitas cepas resistentes de antibióticos como Bacillus anthracis e

Mycobacterium tuberculosis. Estes peptídeos foram denominados Munumbycin A, B,

C e D (Castillo et al., 2002).

3. Plantas endêmicas que tenham uma alta longevidade, ou que tenham

ocupado certa porção de terra ancestral.

4. As florestas tropicais são os ecossistemas com maior biodiversidade no

planeta, cobrindo um 60% da biodiversidade terrestre no planeta. Em adição, cada

uma das 20-25 áreas identificadas como hot-spots de biodiversidade também

suportam um alto nível de plantas endêmicas, indicando que dentro delas exista um

grupo especifico de endofíticos que têm evoluído ao mesmo tempo. Dessa maneira,

plantas que crescem em sítios de alta biodiversidade, são propensas a hospedar

endofíticos com alta biodiversidade metabólica.

Para a indústria farmacológica, os endofíticos são muito atraentes por serem

novos candidatos de novas fontes de medicamentos, especialmente pelo fato de

serem micro-organismos e moléculas que estão presentes em organismos

superiores, o que provavelmente indicaria baixa toxicidade, aspecto que sempre tem

preocupado considerando a toxicidade que têm muitos dos fármacos empregados

em diversas terapias, tais como os tratamentos contra câncer (Azevedo, 2000).

O interesse recente pelos produtos naturais a partir dos micro-organismos

endofíticos vem se refletindo em diversas revisões e artigos científicos, revelando

na maioria dos casos a caracterização de moléculas novas (Guanatilaika, 2006). O

primeiro de eles publicado por Gusman e Vanhaelen (2000), descreve os

metabólitos secundários e suas atividades biológicas de 38 fungos endofíticos. A

partir de ai, revisões mais abrangentes têm sido publicadas como Tan e Zou (2001)

que descreveram 138 metabolitos secundários caracterizados de endofíticos. As

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 ______________________________________________________________________  Introdução

36  

revisões realizadas por Shulz et al. (2002), Stroble (2003 e 2004) revelam os

esforços realizados principalmente em seus próprios laboratórios.

Outros trabalhos na literatura ilustram a habilidade de alguns endofíticos, em

especial fungos, de produzir metabólitos próprios da planta hospedeira e que tiveram

uma importância farmacológica por apresentarem atividades biológicas atraentes.

Tan e Zou (2001) acreditam que a razão deste fato está relacionada a

recombinações genéticas do endofítico com seu hospedeiro durante o tempo

evolutivo da relação simbiótica.

O taxol ou paclitaxel, um diterpenoide (Tabela 1), é o composto mais famoso

sintetizado por um fungo endofítico, este fármaco é utilizado em diferentes

tratamentos de câncer tais como pulmão, mama, e ovários, e já representou em

2000 nos Estados Unidos vendas de até 1,6 bilhoes de dólares. Inicialmente o taxol

foi descoberto em 1967 pelos pesquisadores Monroe, Wall, Mansukh e Wani do

Research Triangle Institute que isolaram o composto da casca do teixo do Pacífico

(Taxus brevifolia). Uma planta conífera nativa do noroeste dos Estados Unidos

(Wani et al., 1971).

Já em 1990 Strobel et al. isolaram e identificaram o primeiro fungo endofítico

produtor de paclitaxel, este fungo isolado de T. brevifolia foi denominado Taxumyces

andreanae, que apresentou nos extratos de culturas um composto com o mesmo

espectro de massa que o paclitaxel. Estudos com marcações 14C demonstraram a

presença de paclitaxel no sobrenadante da cultura de T. andreanae (Stierleet al.,

1996).

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 ______________________________________________________________________  Introdução

37  

Tabela 1- Metabólitos produzidos pelos endofíticos e pela sua planta hospedeira Metabólito e

atividade biológica Fungo

Endofítico Planta

Hospedeira Referência

O

NH

OH

OO

O

O

O OH

OOH

H

O O

O O Taxol

Anticancerígeno

Taxumyces andreanae Taxus brevifolia Strobel et al.

2004

N

N

O

O

OHHCO2CH3

CHOOMe

H

OH

NH

N

CO2CH3

Vincristin

Anticancerígeno

Mycelia sterilia Catharanthus roseus

Yang et al. (2004)

OH

H

OH

O

H

O

O

HO Ácido giberélico

Gibberela fujikuroi Curcubita maxima Stowe e Yamaki

(1959)

O

O

O

OO

HOHH

O

OH

O

Tricoteceno macrociclico

Fusarium sp. Myrothecium sp.

Baccharis megapotamica

B. cordifolia

Trapp et al. (1998)

Continua

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 ______________________________________________________________________  Introdução

38  

Conclusão Metabólito e

atividade biológica Fungo

Endofítico Planta

Hospedeira Referência

O

OOH

ONN

Campetotecina Anticancerígeno

Fungo não identificado

Nothapodytes foetida

Puri et al.,(2005)

OO

OO

OHOH

MeO

OMeOMe

H

Podofilotoxina Anticancerígeno

Trametes hirsuta Podophylum hexandrum

Puri et al.,(2006)

Outras investigações foram feitas para a prospecção de outros produtores de

paclitaxel, fungos endofíticos isolados de teixo como Pestalotiopsis spp

demonstraram sintetizar o composto (Strobel, 2003) . Além do mais, espécies de

fungos endofíticos isoladas de plantas diferentes de teixos têm demonstrado

também a produção de paclitaxel, inferindo que a síntese deste composto não está

somente relacionada com os micro-organismos isolados de teixo, mas também em

plantas ao redor do mundo (Strobel et al., 2003). Acreditando que a presença deste

composto dentro de um organismo hospedeiro se deva a mecanismos de proteção

contra fungos patogênicos que possam causar doenças nestas plantas, tais como

Phytium spp. e Phytophthora spp., o qual comprovou que são os organismos

sensíveis a paclitaxel (Young et al., 1992).

Na atualidade se conhecem centenas de compostos como alcalóides,

terpenoides, flavonóides, esteróides, etc, que são produzidos pelos micro-

organismos endofíticos, muitos deles com propriedades bactericidas, antifúngicas,

antiparasitárias, antivirais, herbicidas, antioxidantes, agentes antidiabetes,

compostos imunosupressores e citotóxicos (Guo et al., 2008). A Tabela 2 apresenta

alguns compostos isolados de micro-organismos endofíticos.

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 ______________________________________________________________________  Introdução

39  

Tabela 2 - Atividade biológica de compostos isolados de micro-organismos endofíticos.

Metabólito e atividade biológica

Micro-organismo Endofítico

Planta Hospedeira Referência

Bactérias Endofíticas

C6H5

OO

OMe

MeO

 5,7-dimethoxy-4-phenylcoumarin

Antifúngico

Streptomyces aureofaciens CMUAc130

Zingiber officinale Taechowisan et al. (2005)

N2H

OR2

R1

6 5

 R1=H, R2CO2H, 5,6 dehydro

ácido 7-(4-aminophenyl)-

2,4-dimethyl-7- oxo-hept-5-enoico

Streptomyces griseus subsp.

(strain HKI0412) Kandelia candel Guan et al.

(2005)

munumbacins A-D Antibiótico

Streptomyces sp. NRRL 30562

Kennedia nigricans

Castillo et al. (2002)

kakadumycin A Antibiótico

Streptomyces sp. NRRL 30566

Grevillea pteridifolia

Castillo et al. (2003)

coronamycin Antibiótico

Streptomyces sp. MSU-2110 Monstera sp. Ezra et al. (2004)

OOOAc

CH3

ClO

CH3H

HH

H

H OHH

COOH

Oocydin A Antifúngico

Serratia marcescens

MSU-97

Rhyncholacis penicillata

Strobel et al. (2004)

Ecomycins Antimicrobiano

Pseudomonas viridiflava Grama Miller et al. (1998)

Fungos endofíticos

O

OH

H

H

OH

OCH3

H

brefeldin A

Antifúngico, antiviral, anticancerígeno

Aspergillus claVatus strain H-

037 Taxus mairei Wang et al.(2002)

Continua

 

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 ______________________________________________________________________  Introdução

40  

Continuação Metabólito e

atividade biológica Micro-organismo

Endofítico Planta

Hospedeira Referência

O CH3

OH OOMe

MeO

rubrofusarin B Citioxico

Aspergillus niger IFB-E003 Cynodon dactylon Song et al.

(2004a) O

O

O

OH

CH3

O

OMeMeOMeO

OMe

fonsecinone A

Citotóxico OH

CH3

O Co2CH3

H

OHOMe OMe

Monomethylsulochrin Antibacteriano

Aspergillus sp. (Strain #CY725) Cynodon dactylon Turner (1965)

OOMe

HOAc

Me

H

Me

Me

H

OAc

MeMe

HOOC

ácido helvólico Antibacteriano

OH

Ergosterol

Continua

  

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 ______________________________________________________________________  Introdução

41  

Continuação Metabólito e

atividade biológica Micro-organismo

Endofítico Planta

Hospedeira Referência

OH

OO

5α,8α-epidioxyergosterol

Aspergillus sp. (Strain #CY725) Cynodon dactylon Turner (1965);

O

OH

OHO

OHO

O

Phomol

Antibacteriano, antifúngico e antiinflamatório

Phomopsis sp. Erythrina crista-galli Weber (2004)

Ácido3-hydroxypropionico Nematicida

Phomopsis phaseoli Plantas tropicais Schwarz et al.

(2004)

R2CO2R1

OH

OH O Cytosporone A-B

A: R1=H, R2=-(CH2)6CH3 B: R1=-CH2CH3, R2=-(CH2)6CH3

Antifungicos e citotxico

Diaporthe sp. CR 146

Forsteronia spicata

Brady et al. (2000)

Continua

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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 ______________________________________________________________________  Introdução

42  

Continuação Metabólito e

atividade biológica Micro-organismo

Endofítico Planta

Hospedeira Referência

NH

N

N

H H

NN

N

OH O

H

OH

alanditrypinone

Eupenicillium sp Murraya paniculata

Barros e Rodrigues-Filho

(2005)

N

N

H H

NN

N

OH O

H

O

alantryphenone

N

NN

N

OH O

H

alantrypinene

NH

N

N

H H

NN

N

OH O

H

OH

Alantryleunone

 

 

 

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 ______________________________________________________________________  Introdução

43  

Conclusão Metabólito e

atividade biológica Micro-organismo

Endofítico Planta

Hospedeira Referência

NH

R1"R2"OO

OH

OH CH3

O

OHOHOH

OH

 Cerebroside R1=R2=CH2CH2

Fusaroside R1=R2=CH=CH

Fusarium sp. IFB-121 Quercus Variabilis Shu et al. (2004)

H

HOOC

HOOC ácido piliformico

Xylaria sp. No. 2508 Manguezal Lin et al. (2001)

OH

NH

O

OH

OMe

OMe

Peniprequinolone

Nematicida, acelerador del crescimento das raizes

Penicillium janczewskii

Prumnopitys andina Dai et al. (2001)

NN

SCH3 O

O

CH3

OHS

CH3

CH3

gliovictin

OH

H

OH

H

O

HCH3

H

mellein

1.2.5 Metabólitos secundários de micro-organismos

Os metabólitos secundários são compostos que não estão envolvidos nas

vias bioquímicas essenciais para o crescimento e reprodução do organismo, a

diferença dos metabólitos primários responsáveis pelo crescimento, representado

por processos como a síntese de proteínas, replicação do DNA e biossíntese de

ácidos graxos, entre outros. Os metabólitos secundários constituem uma enorme

família de compostos quimicamente diversos produzidos, geralmente, no início da

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 ______________________________________________________________________  Introdução

44  

idiofase (Demain, 1999). A verdadeira função destes compostos nos produtores

continua sendo incerta e muitas hipóteses têm sido levantadas para definir a papel

destes compostos na natureza (Cox e Glod, 2004).

O termo “metabolitos secundários” foi empregado pela primeira vez em 1891

por botânicos e fisiologistas vegetais na classificação de compostos que não tinham

nenhuma função obvia para a planta (corantes, fragrâncias) (Bu'Lock, 1961). Já a

mediados dos anos 60 os microbiologistas adotaram o termo para explicar produtos

bioativos microbianos em especial àqueles considerados como antibióticos (Bennett

e Ciegler, 1983; Bu'Lock, 1961).

As classes dos compostos químicos isolados de micro-organismos incluem

policetídeos, peptídeos não ribosomais, terpenos ou alcalóides. Estes compostos

são sintetizados, respectivamente, por complexos enzimáticos conhecidos como

policetídeo sintase (PKS), peptídeo não ribosomal sintetase (NRPS), terpeno sintase

(TS) e dimetilalil difosfato triptofano sintase (DMATS) (Collemare et al., 2008; Cox e

Glod, 2004). Os substratos para o PKS e NRPS são, respectivamente, moléculas de

acil coenzima A (geralmente malonilCoA e acetilCoA) e aminoácidos. O substrato

para DMATS e unidades dimetilalil fosfato, e os alcalóides são feitos de triptofano e

unidades de isopreno (Keller et al., 2005).

A descoberta da penicilina a partir de cepas de Penicillium sp., marcou o

começo do desenvolvimento de metabólitos secundários microbianos como a Era

dos antibióticos. Desde então mais de 10.000 metabólitos secundários de baixo

peso molecular (menos de 2.500 Da) tem sido isolados de várias espécies de micro-

organismos, especialmente actinomycetes e fungos filamentosos. O estudo químico

destes micro-organismos levou a identificação de vias biossintéticas destes produtos

naturais elucidando a complexidade do seu processo. Com o advento das

tecnologias de DNA recombinante, a biossíntese destes metabólitos tem sido

estudada em nível genético, colaborando para um melhor entendimento de sua

organização e isolamento de numerosos genes associados com a produção destes

metabólitos secundários (Cox e Glod, 2004 ).

Apesar de não saber com certeza o papel destes compostos para seus

organismos produtores, o homem tem se aproveitado da bioatividade destes

produtos para seu benefício próprio, especialmente como fármacos e produtos

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 ______________________________________________________________________  Introdução

45  

agropecuários. Por citar alguns exemplos de grande sucesso no mercado

farmacêutico estão os antibióticos eritromicina, vancomicina, tetraciclina e o

tiostrepton; o imunosupresor rapamicina; os anticancerígenos doxorubicina e taxol; e

as estatinas, que são reguladores dos níveis de colesterol no sangue, sendo

amplamente utilizadas no tratamento de doenças cardiovasculares.

Devido às recentes descobertas obtidas pelo seqüenciamento de genomas

inteiros, principalmente de Streptomyces e fungos filamentosos, é bem sabido que

os genes responsáveis pela síntese de metabólitos secundários encontram-se

agrupados no que se conhece como cluster gênicos (Keller et al., 2005; Weld et al.,

2006), revelando que a sua natureza é mais rica do esperada sendo responsáveis

no só pela sua formação, mas também pela suas modificações posteriores e

regulação (Sanchez et al., 2008).

Dois genomas do gênero Streptomyces, S. avermitilis (Omura et al., 2001) e

S. coelicolor (Bentley et al., 2002) e 55 genomas de fungos filamentosos têm sido

completados e um número similar está em processo de seqüenciamento. Desde o

ponto de vista biotecnológico na descoberta dos clusters responsáveis pela síntese

de metabólitos secundários, os genomas dos fungos filamentosos, em especial do

gênero Aspergillus tais como A. nidulans, A. fumigatus, A. oryzae e A. flavus,

apresentaram maior interesse não só por serem patogênicos produtores de

micotoxinas, mas também pelo seu potencial na área farmacológica (Misiek e

Hoffmeister, 2007). Como exemplo, o genoma do A. nidulans abriga 27 genes para

as PKS, 14 para os NRPS e 102 genes para as P450 monooxigenases (Galagan et

al., 2005). Análises dos clusters biossintéticos dos metabólitos secundários, dentro

do gênero Aspergillus, também demonstrou uma baixa homologia entre seus genes,

sugerindo que cada espécie é produtora de um conjunto único de compostos

relevantes para seu próprio desenvolvimento biológico e supervivência.

Outra grande revelação do seqüenciamento é que o número de cluster

biossintéticos é maior de aqueles metabólitos obtidos e caracterizados pelo seu

produtor (Sanchez et al., 2008), fato que está levando à criação de estratégias para

a excreção e produção destes clusters silenciados. Em consequência novas

tecnologias baseadas em engenharia genética estão sendo criadas para a indução

destes genes silenciados. Sendo assim, a expressão heteróloga sobre o controle de

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 ______________________________________________________________________  Introdução

46  

vetores especificamente desenhados com promotores definidos está sendo

otimizada para expressão destes clusters (Brakhage et al., 2008; Chiang et al.,

2009).

1.2.6 Policetídeos

Os policetídeos são um grupo de metabólitos secundários com diversas

estruturas e funções (Cox, 2007; Fujii et al., 1998; O'Hagan, 1991) (Figura 1). Mas

de um terço dos produtos naturais ou compostos derivados de produtos naturais

aprovados como fármacos entre 2005-2007 foram policetídeos. As estatinas são os

medicamentos contra doenças cardiovasculares mais bem sucedidos (Roberts,

1996; Shepherd, 2006); a eritromicina A, um macrolídeo antibacteriano, tem sido

utilizado em clínica durante mais de 50 anos (Washington e Wilson, 1985); inclusive

os novos enediynes, um novo tipo de policetídeo, estão entre os mais potentes

agentes anticancerígenos descobertos (Galm et al., 2005).

O termo “policetídeo” foi denominado aproximadamente ao mesmo tempo em

que o dos “metabólitos secundários” em 1907. O significado original foi outorgado

pelo químico John Norman Collie a partir de compostos que contem grupos

policetometilenos (CH2-CO)n e os seus derivados, pela perda ou adição de água ou

pelos processos decarboxilativos; foram identificados como contendo “múltiplos

grupos cetônicos”, como no caso da síntese de orcinol a partir de ácido

dehidroacético (Bentley e Bennett, 1999). A partir deste descobrimento pioneiro de

Collie, a área dos policetídeos vem aumentando significativamente, investigações

não somente vem acontecendo na elucidação das estruturas complicadas das

moléculas, mas também na caracterização das enzimas responsáveis pela sua

biossíntese (Staunton e Weissman, 2001).

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 ___________________________________________________________________________________________________________________  Introdução

47  

O

OO

OH O

A. LovastatinaAgente redutor de colesterol

OOH

O

NO

OH

H

OMeOMe

OMe

MeO

B. PederinAnticancerigeno

OOH

O

NO

OH

H

OMeOMe

OMe

MeO

C. Squalestatin S1Agente redutor de colesterol

OHO

OH

D. Ácido 6-metil salicilicoAntibiotico

OH

OH

OHO

E. ÁcidoorselinicoOHO

OH

F. Acido micolicocomponente de membrana

OH

O

O

OH

O

OH

O

O

O OH

O

N MeOH

OMe

Me

G. Eritromicina AAntibiotico

OH

O

O

OH

NaO3SOOH

OH

OH OH

O

O

O

O

O

OHOH

NaO3SO

O

O

O

O

O

OH

O

O

OH

O

O

OO

OO

OOO

O

OO

OO

O

O

O

O

OH

OH

OH

OHOH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH OH

OHOH

OH

OH

OH

H. MaiototoxinaCitotoxico

Figura 1 - Estruturas de policetídeos representativos e as suas bioatividades Fonte: Acoplado de Weissman (2009) Continua

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 ___________________________________________________________________________________________________________________  Introdução

48  

OOO

O

O

OH

MeO

OH

HH

H

H

HO2C

I. Monecin AAntibiotico

COOH

K. Acido EicosapentaenoicoComponente de membrana

OH

O

NH2

OHO

O

O

OH OHOH O OH

OHOH

OH

COOH

M. Anfotericina BAntifungico

O

O

OHOH

OH OH

L. YWA1pigmento

OHO

OH

OH

OH O

O

O

O

NH2OH

OMe

J. DoxorubicinaAnticancerigeno

OO

O

OH

O

O

OOH

OHNHMe

O

OOMe

N. NeocarzinoestatinaAntocancerigeno

Conclusão

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 ______________________________________________________________________  Introdução

49  

Em termos bioquímicos, estes compostos são sintetizados por um tipo

particular de proteínas, conhecidas como policetídeos sintases ou PKS (do inglês

polyketide synthase). Este complexo protéico consiste em vários sítios ativos

específicos, composto por três domínios básicos para a construção da molécula

policetídica: a ceto-sintase (KS), a proteína carregadora do acil (ACP) e a acil

transferase (AT). Estes domínios podem estar acompanhados de outros domínios ou

enzimas que modificam posteriormente a molécula policetídica (Menzella et al.,

2005; Schumann e Hertweck, 2006).

A síntese dos PK se assemelha com a síntese dos ácidos graxos, embora as

duas vias metabólicas tenham divergido numa fase inicial durante a evolução

(Hertweck, 2009). A síntese dos PK começa pela ligação de uma unidade acila (ex.

acetil-CoA ou malonil-CoA) à KS, conhecida como iniciadora (starter), enquanto a

AT transfere outras moléculas acilas ao grupo prostético do ACP. A KS continua

com as condensações descarboxilativas (Claisen) entre as moléculas acilas para

gerar a β-ceto-acil-ACP. Assim, este processo, repetidamente, origina cadeias com

múltiplos grupos ceto dentro da sua estrutura, molécula conhecida como os

policetídeos. (Menzella et al., 2005; Weissman, 2009).

Outros grupos podem participar no processamento da molécula policetídica,

especialmente, na redução do grupo β-ceto: a cetoredutase (KR) reduz o grupo β-

ceto estereospecificamente, a dehidratase (DH) converte o álcool (-OH) produzido

em C=C e a enoil redutase (ER) reduz o C=C a C-C (Reeves, 2003).

Segundo a conformação destes sítios ativos, referidos à disposição dos sítios

ativos dentro das proteínas e relacionadas com a analogia na síntese dos ácidos

graxos pela FAS (do inglês Fatty Acid synthase) (O’Hogan, 1991), os PKS se

classificam como: tipo I, tipo II e tipo III. A Tabela 3 apresenta as diferenças entre

estes três sistemas de PKS

O PKS tipo I, análogo com o FAS tipo I de fungos e vertebrados, se

caracteriza por ser uma grande proteína multifuncional onde seus sítios ativos estão

ligados ordenada e covalentemente. O PKS tipo II, análogo com a FAS tipo II de

bactérias, se caracteriza por ser um conjunto de proteínas monofuncionais, cada

uma com uma atividade própria e específica (Shen, 2003).

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 ______________________________________________________________________  Introdução

50  

Tabela 3 - Diferenças entre os diferentes sistemas de PKS

Tipo de PKS  Tipo de produto  Modo de ativação do substrato e unidades de substratos 

Organismos  

Modular I  Reduzido  ACP; varias unidades ampliadoras  Bactéria Interativo I  Aromáticos e 

reduzidos ACP: malonil‐CoA como unidade ampliadora 

Principalmente fungos, algumas bactérias 

Interativo II  Aromáticos  ACP; malonil‐CoA como unidade ampliadora 

Exclusivamente de bactérias 

Interativo III  Aromáticos  Substrato‐CoA; malonil‐CoA  como unidade ampliadora 

Plantas, fungos e bactérias 

PKS/NPKS híbrido 

Híbridos  ACP; malonil‐CoA  e aminoácidos  Bactérias (modular) Interativo (fungos) 

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 ______________________________________________________________________  Introdução

51  

Mesmo que as duas vias metabólicas compartam similaridades na sua

enzimologia e na propagação das cadeias crescentes, constituem uma clara

diferença no ramo metabólico entre metabolismo primário e secundário. Os PKSs se

diferenciam das FASs, não somente pela sua habilidade de utilizar uma maior gama

de unidades na construção das moléculas, mas também pela formação de vários

comprimentos da cadeia policetídica. Mais importante, em quanto FAS catalisa um

ciclo redutivo completo depois do processo de elongação, em PKS os passos

redutivos são opcionais gerando um padrão de funcionalidade mais complexo

(Figura 2) (Hertweek, 2009).

Figura 2  - Mecanismos básicos envolvidos na síntese de ácidos graxos (A), e policetídeos

(B). Enz= Enzima 

KS 

KS 

KS 

KS 

AT AT

AT AT

ACP 

ACP 

ACP 

ACP 

DH 

DH  KR 

KR 

ER 

ER 

R

SO

OH

S

O

O

OH

S

O

O

SH

SH

R

S

O

O

R

SO

R

S

O

O

-CO2

-CO2

Condensação de Claisen

Condensação de Claisen

R

S

OH

O

Enz

R

S

OH

O

Enz

R

SO

Enz

R

SO

Enz

R

SO

Enz

R

SO

Enz

R OH

O

Acido graxo

Processamento do B‐ceto requerido

R S

OOH

EnzPolicetídeos

No reduzidos ou reduzidos

Processamento do B‐cetoopcional

(opcional)(ou CoA)

A.

B.

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 ______________________________________________________________________  Introdução

52  

Os policetídeos sintetizados pelos PKS I podem ser montados mediante duas

vias diferentes. A primeira é conhecida como PKS modular, presente

primordialmente em bactérias, caracterizada por ser uma megaproteína dividida em

módulos consecutivos, polipeptídios que são utilizados para iniciar e ampliar a

cadeia de carbono. Os sítios ativos presentes em cada módulo são utilizados uma

única vez durante a síntese e determinam a escolha das unidades acilas iniciadoras

e as unidades ampliadoras, além do nível de redução da molécula dentro do módulo.

O comprimento da cadeia de carbono e a seqüência de passos para sintetizar o

policetídeo é determinado pelo número e ordem de módulos (Cortes et al., 1990;

Donadio et al., 1991) (Figura 3). A biossíntese destas moléculas é iniciada a partir

de uma unidade de propionil CoA e 6 unidades ampliadoras de metilmalonil CoA,

como no caso da 6-deoxieritronolide B (Cortes et al., 1990) (Figura 1G). Não

obstante, outras moléculas sintetizadas pelo sistema PKS I modular utilizam outras

unidades iniciadoras mais complexas: rapamicina, um imunosupressor sintetizado

por Streptomyces hygroscopicus, começa sua síntese com o ácido 3,4-

dihydroxycyclohexanecarboxílico como iniciador e 7 unidades de malonil CoA e 7

unidades de metilmalonil CoA como unidades ampliadoras (Motamedi et al., 1997).

Na síntese da avermectina a unidade iniciadora é 2-metilbutiril CoA, derivado de um

aminoácido (MacNeil et al., 1994).

Este sistema controla a biossíntese de vários antibióticos conhecidos, como a

eritromicina A (Figura 1G.) sintetizada pela 6-deoxieritronolide sintase ou DEBS em

Saccharopolyspora erythraea. O descobrimento da sua maquinaria genética remonta

as finais dos anos 80,. Dois laboratórios, um liderado por Peater Leadlay na

universidade de Cambridge exploraram os genes próximos ao gene de resistência

da eritromicina, ermE, descobrindo os genes ery; e o outro grupo liderado por

Leonard Katz do laboratório Abbott os quais conheciam uma região próxima ao gene

ermE, que quando mutada incapacitava a produção do 6-deoxieritronolide B.

Uma nova variante deste sistema PKS I modular tem sido exposta, conhecida

como trans-AT ou AT-less PKS, sendo que o domínio AT aparece como uma ou

várias proteínas independentes do módulo (também classificada como um híbrido

PKS II/ I) (Cheng et al., 2003; Piel, 2002). Uma característica distintiva destes PK

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 ______________________________________________________________________  Introdução

53  

trans-AT é a introdução de ramificações metilas ou etilas nos carbonos β centrais da

cadeia de carbono, como no caso da pederina (Figura 1B) (Weissman, 2009).

 

Figura 3 - Montagem dos policetideos: A. PKS tipo I modular 6-deoxieritronolide pelo PKS DEBS); B. PKS tipo I interativo Lovastatina; C. PKS tipo II Doxorubicina; D. PKS tipo III Nranginina chalcona.

Fonte: Modificado de Donadio et al. (1991) e Hertweck (2009).

Em contraste, a segunda via utiliza um sistema interativo, onde uma única

enzima multifuncional utiliza seus sítios ativos repetidamente para a síntese e

ampliação da cadeia de carbono a partir de acetato e malonato. No entanto, se

desconhece como um único grupo de sítios ativos controla o comprimento e o nível

de redução na síntese destas moléculas, comparado com o mecanismo empregado

pelo PKS tipo I modular. Entre as moléculas sintetizadas por meio deste sistema tipo

I interativo, são conhecidas a lovastatina (Figura 1A.) e o ácido 6-metilsalicilico

(Figura 1D.), entre outros (Schumann e Hertweck, 2006).

Este sistema de PKS tipo I interativo (iPKS), é objeto deste trabalho e está

presente primordialmente em fungos filamentosos do filo dos ascomicota. O PKS

fúngico consiste nos domínios básicos já mencionados (KS-AT-ACP). Em adição,

KSα KSβ

ACP 

KS

KS

ER

AT       DH   MT           KR

R

SO

ER S O

OH

OH

OH

O

O

O

O

H

8 MalonilCoASAM *

*

ACP  LovB

Lovastatina

S

OH

O

CoASH

OH

S

O O O O

CoA

n

O

O OH

OH

3 MalonilCoA

NarangininaChalcona

LovCS

OOO

O

O O

O R

OO

OO OH O

Sug

OH

OHO O

OMe

Doxorubicina

AcilCoA9MalonilCoA

B.

A.

D.

C.

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 ______________________________________________________________________  Introdução

54  

algumas reações de redução dos grupos β-cetônicos são catalisados por domínios

ceto redutase (KR), dehidratase (DH) e enoil redutase (ER). Outros domínios podem

ser opções adicionais como as ciclases (CYC) (Fujii et al., 2001) e metiltransferases

(MT) (Hutchinson et al., 2000). Em contraste com as enzimas post-PKS com funções

de O- e N- metilação, a metilação do esqueleto de carbono do policetídeo é

realizada durante a construção da cadeia policetídica por um domínio intrínseco C-

MT (Nicholson et al., 2001).

Dependendo da arquitetura da proteína e da presença ou ausência dos

domínios adicionais, que processam o grupo β-cetônico, que darão a características

estruturais da molécula, os PKS fúngicos são agrupados em: não reduzidos (NR-

PKS) ou aromáticos, pela ausência dos domínios redutores e processadores do

grupo β-cetônico e presença de uma CYC; os parcialmente reduzidos (PR-PKS),

com presença apenas de dois domínios redutores (KR e DH) e os altamente

reduzidos (HR-PKS) pela presença de todo os domínios redutores e processadores

do grupo β-cetônico (Figura 4) (Schumann e Hertweck, 2006).

 

Figura 4 - Exemplos de NR-PKS (PksA, Pks1 e WA) PR-PKS (6MSAS) e HR-PKS (LDKS, MlcB, SQTKS, LNKS MlcA) e a sua respectiva arquitetura dos domínios

Fonte: Schumann e Hertweck (2006).  

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 ______________________________________________________________________  Introdução

55  

Os policetídeos sintetizados pelos diferentes PKS fúngicos proporcionam

certas características químicas, dependendo da arquitetura dos seus domínios: por

exemplo: às moléculas sintetizadas por NR-PKS como o ácido orselínico (Figura

1H) e YwA1 (Figura 1K), não apresentam nenhum processamento de redução

durante sua biossíntese; as moléculas sintetizadas por PR-PKS como, o ácido 6-

metilsalicílico (6MSA) (Figura 1 D.), apresentam uma redução parcial, ou seja, uma

única ação dos domínios KR e DH; as moléculas sintetizadas por HR-PKS, como a

lovastatina (Figura 1A) e a esqualestatina (Figura 1C), apresentam um nível de

redução maior nas suas estruturas (Figura 3).

Recentes estudos filogenéticos baseados nas seqüências de aminoácidos do

domínio KS forneceram valiosas idéias sobre a relação evolutiva entre diferentes

tipos de PKS fúngicos(Bingle et al., 1999; Kroken et al., 2003; Nicholson et al.,

2001). Kroken et al. (2003) demonstraram que as seqüências de aminoácidos do

domínio KS fúngicos se agrupam em PKS envolvidos na síntese de moléculas

reduzidas e não-reduzidos, de acordo com o grau de redução dos seus policetídeos

sintetizados, ou seja, da presença ou ausência dos domínios adicionais. Os KS que

pertencem aos PKS envolvidos na síntese de policetídeos reduzidos se dividiram em

4 subclados: o clado I (lovastatina/citrinina dicetídeo-similares) se caracteriza por ter

a arquitetura dos domínios KS-AT-DH-(MT)-ER-KR- ACP, o clado II

(lovastatina/citrinina nonacetídeo-similares), se caracteriza por ter a arquitetura dos

domínios KS-AT-DH-(MT)-KR-ACP-(CON)-(AMP-ACP) (perda do domínio ER e

ganho de domínios de síntese de poliptídeos), o clado III (T-toxinas nonacetídeo-

similares) se caracteriza por ter a arquitetura dos domínios KS-AT-DH-ER-KR- ACP-

ACP (perda do domínio MT) e o clado IV (fumomisina-similares) que se caracteriza

por ter a arquitetura dos domínios KS-AT-DH-(MT)-ER-KR- ACP, igual ao do clado I,

porém, responsável pela síntese de policetídeos completamente diferentes.

Entre os KS que pertencem aos PKS envolvidos na síntese de policetídeos

não-reduzidos, também se dividiram em 4 subclados: o clado I (aflatoxinas/

esterigmatocistina e pigmentos não melanoides ) se caracteriza por ter a arquitetura

dos domínios KS-AT-ACP-(ACP)-CYC; o clado II (melaninas) se caracteriza por ter a

arquitetura dos domínios KS-AT-ACP-(ACP)-CYC. O clado III (não caracterizado)

apresenta a arquitetura dos domínios KS-AT-ACP-(ACP)-MT-(CYC) (ganho do

domínio MT em NR-PKS); e um clado basal entre o clado I e II (não caracterizado)

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 ______________________________________________________________________  Introdução

56  

que se caracteriza por ter a arquitetura dos domínios KS-AT-ACP-(ACP)-(CYC). A

Tabela 4. Apresenta algumas PKS com seu respectivo policetídeo que já foram

caracterizadas e descritas na literatura.

Em alguns casos, módulos do sistema PKS I podem estar acoplados a

módulos do sistema (sintetases peptídicas não-ribossomais) peptídeo não

ribosomais sintetases (NRPS do inglês nonribosomal peptide synthetase),

resultando na produção de metabólitos de natureza híbrida. Recentes descobertas

têm acoplado outros sistemas ao sistema tipo I: o primeiro deles, aparentemente um

híbrido de FAZ/PKS (Metz et al., 2001) gera ácidos graxos poli-insaturados (ou

PUFASs do inglês polyunsaturated fatty acids) em micróbios marinhos. Estes

metabólitos de C20+ fazem parte da membrana destes micro-organismos

concedendo adaptações especiais para este tipo de ambientes. Nesta biossíntese,

os ácidos graxos insaturados são derivados a partir de processos de elongações e

subseqüentes dessaturações de ácidos graxos saturados (Kaulmann e Hertweck,

2002). Os PUFAS PKSs já descritas, se diferenciam do PKS I interativo de fungos,

pelo seu mecanismo de síntese e pela organização dos sítios ativos contendo até

nove domínios ACP consecutivos (Jiang et al., 2008). O segundo sistema é

conhecido como PKSE (Van Lanen e Shen, 2008) que participa na formação da

classe dos policetídeos enediynas em bactérias, como a neocarzinoestatina (Figura

1J). O destaque destas moléculas está no seu núcleo insaturado compreendendo

dois grupos acetilenos conjugados a uma dupla ligação. O precursor do núcleo, o

poliênos, é montado via PKS I interativo, contendo um domínio ACP atípico ao

sistema I, ocupando uma posição diferente à encontrada no sistema PKS I típico. Há

também um domínio terminal atípico cuja função não tem sido designada. A

maturação do núcleo envolve adições de outras unidades como deoxi- e tio-

açúcares, as quais são responsáveis pelo ajuste da sua atividade biológica como um

potente anticancerígeno (como visto nas antraciclinas). (Moss et al., 2004;

Weissman, 2009).

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 ____________________________________________________________________________________________________________________ Introdução

57  

Tabela 4 - PKS fúngicos e seu arranjo na arquitetura dos domínios de diferentes metabolitos secundários PKS fúngico Origem Policetídeo Arquitetura dos domínios Referência

AflC A.flavus, A. parasiticus, Aflatoxina KS-AT-ACP-TE (Yu et al., 1995)

StcA A. nidulans Esterigmotosistin KS-AT-ACP-ACP-TE (Brown et al., 1996)

PksA Dothistroma septosporum Dothistromin KS-AT-ACP-ACP-ACP-CYC (Bradshaw et al., 2006)

WA A. nidulans Melaninas KS-AT-ACP-ACP-TE (Mayorga e Timberlake, 1992)

PKS1 C. lagenarium (Watanabe e Ebizuka, 2004)

PKSP A. fumigatus (Tsai et al., 1998)

PKS4 G. fujikuroi Bikaverina KS-AT-ACP-TE (Linnemannstons et al., 2002)

ZEA1 F. graminearum Zearalenona KS-AT-ACP-TE (Kim et al., 2005)

ZEA2 KS-AT-DH-ER-KR-ACP

PksN Nectria haematococca Pigmento peritecial KS-AT-ACP-ACP-TE (Graziani et al., 2004)

PksCT Monascus purpureus Citrinina KS-AT-ACP-MT (Shimizu et al., 2005)

CTB1 Cercospora nicotianae Cercosporina KS-AT-ACP-ACP-TE/CYC (Choquer et al., 2005)

LDKS A. terreus Lovastatina KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP (Kennedy et al., 1999)

LNKS KS-AT-DH-MT-(ER inativo)-KR-ACP-PSED

MlcA P. citrinum Compactina KS-AT-DH-(MT inativo)-KR-ACP-PSED (Abe et al., 2002)

MlcB KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP

SQTKS Phoma sp. Squalestatina KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP (Cox et al., 2004)

PKS1 C. heterostrophus T-toxina KS-AT-DH-ER-KR-MT-ACP (Baker et al., 2006; Yang et al., 1996)

PKS2 KS-AT-DH-ER-KR-ACP

FUM1 G. fujikuroi Fumonisina KS-AT-DH-ER-KR-ACP (Proctor et al., 2004)

PKSN Alternaria solani Alternapirona KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP (Fujii et al., 2005)

FusS F. graminearum, F. verticilloides Fusarin KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP-C-A-PCP-R (Song et al., 2004b)

Continua

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 ____________________________________________________________________________________________________________________ Introdução

58  

Conclusão PKS fúngico Origem Policetídeo Arquitetura dos domínios Referência

EqiS F. heterosporum Equisetina KS-AT-DH-MT-KR-ACP-C-A-PCP-R (Sims et al., 2005)

MSAS P. patulum, A. terreus Ácido 6-metilsalicilico

KS-AT-KR-ACP (Beck et al., 1990; Fujii et al., 1996)

PKS12 F. graminearum Aurofusarina KS-AT-ACP-TE (Malz et al., 2005)Malz et al.,2005

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 ______________________________________________________________________  Introdução

59  

A lovastatina é um policetídeo que faz parte da classe das estatinas, e que é

objeto de estudo deste trabalho, é sintetizada por duas enzimas PKSs, a lovastatina

dicetídeo síntase e a lovastatina nonaetídeo síntase (LDKS-LNKS) (Hendrickson et

al., 1999). Os primeiros estudos da biogênese da lovastatina foram realizados

empregando cepas de Aspergillus terreus e precursores marcados (Greenspan e

Yudkovitz, 1985; Moore e Hopke, 2001; Shiao e Don, 1987), os quais indicaram que

a via biossintética da lovastatina inicia-se a partir de unidades de acetato (4 e 8

carbonos), ligados um do outro, consecutivamente para formar duas cadeias

policetídicas. O grupo metila presente em algumas estatinas é derivado da

metionina, como ocorre freqüentemente em metabólitos de fungos, e é inserida na

estrutura antes da sua ciclização (Shiao e Don, 1987).

Depois de ocorrer às respectivas condensações das unidades de acetato à

cadeia principal de 8 carbonos, a molécula é fechada, e em algumas estatinas

esterificada com outra cadeia policetídica lateral, de 4 carbonos, no C8. Os átomos

de carbono presentes na cadeia principal são inseridos depois por uma oxidação

aeróbica mediante precursores desoxigenados (Greenspan e Yudeovitz 1985; Moore

e Hopke, 2001).

Investigações mais recentes sobre a cinética enzimática junto com a

regulação gênica e a expressão em A. terreus mutantes apontaram que o sistema

responsável pela biossíntese é uma policetídeo sintase multifuncional ou PKS. Esta

é composta por uma lovastatina nonacetideo sintase (LNKS), envolvida na ciclização

da cadeia principal para formar o anel hexahidro naftalénico levando ao composto

diidromonacolin L, que posteriormente é convertido em monacolin L e

sucessivamente em monacolin J; e uma dicetideo sintase (LDKS) envolvida na

transferência da cadeia metil butirica para a cadeia principal que leva à formação da

lovastatina.

A caracterização dos genes responsáveis pela síntese da LNKS e da LDKS

foi realizada por Hutchinson et al. (2000) e Kennedy et al. (1999), permitindo o

entendimento da estrutura da monacolin J e da lovastatina. O LNKS é produto do

gene lovB, que interage com a lovC, uma enoil redutase, para catalisar as primeiras

reações para a biossíntese da monacolin J. Nos passos finais da via biossintética da

lovastatina, o LDKS, sintetizado pelo gene lovF, interage com a lovD, a

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 ______________________________________________________________________  Introdução

60  

transesterase, para catalizar a ligação entre o ácido 2-metilbutírico e o monacolin J e

formar a molécula completa da lovastatina (Figura 5).

 

Figura 5  - Via biossintética da lovastatina. A. caracterização dos genes responsáveis pela síntese da LNKS e da LDKS B. Via hipotética da síntese da lovastatina mostrando a função de cada sitio ativo.

Fonte: Modificado de Kennedy (1999).

Finalmente foi demonstrada a função desconhecida do lovC por Aclair et

al.(2001), que utilizando mutantes no gene lovC, determinaram que a função da

proteína que este gene codifica é garantir a correta montagem da cadeia

nonacetidica pela proteína codificada pelo gene lovB. Em contraste, a formação da

cadeia dicetidica pelo gene lovF não precisa da proteína lovC, e esta não atua em

processo post PKS.

Outra importante característica da síntese da lovastatina foi à descoberta da

reação de Diels-Alder no fechamento do anel hexacetídeo na formação do sistema

bicíclico na molécula diidromonacolina L.

O sistema PKS tipo II está caracterizado por sintetizar policetídeos

aromáticos, principalmente em bactérias, formados por um conjunto de 5 a 10

CH3

HCH3

OHH

OHCOOH

CH3

HCH3

OHH

OHCOOH

CH3

HCH3

OHn

CH3

HCH3

OHH

OH

OH

COOH

CH3

HCH3

OH

OH

O

COOH

CH3

CH3

O

CH3

COSE

O

CH3

COSE

CH3

COSE

CH3

CH2COS-CoACOOH

CH3COS-CoA+

DihidromonacolinL MonacolinL                    Monacolin J                                        lovastatinalovD

lovF

CH3COS-CoA

CH2COS-CoACOOH

+ ES

O

CH3

SE

CH3

O

SE

CH3

O

SEO

CH3

CH3

SEO

CH3

CH3CH3

OSE

CH3CH3 H

CH3

OH

SEO

KR, DH KR, DH KR, DH

ER,CMT

KR, DH

KR,        DH, ER

Ciclizalção

KR,        DH, ER

KR         2X

lovB + LovC

ORF1          ORF2        lovA lovB ORF5   lovC lovD ORF8        lovE ORF10

lovF ORF12    ORF13            ORF14  ORF15      ORF16     ORF17    ORF18

37 kb

64 kb

A.

B.

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 ______________________________________________________________________  Introdução

61  

proteínas individuais, cada uma codificada por um gene diferente. A síntese da base

de carbono do policetídeo precisa de três proteínas fundamentais, referidas como

PKS mínimo: a β-cetosintase (KSα), fator elongador da cadeia (CLF ou KSβ) e a

proteína carregadora do acil (ACP). A constituição da molécula é iniciada a partir de

precursores carboxilados, como acetato ou malonato, que é a molécula mais comum

usada como unidade iniciadora e grupos de malonil o metilmalonil como unidades

ampliadoras (Schneider, 2005). Como no exemplo da síntese da actinorodina por

uma cepa de Streptomyces coelicolor A3(2) (Hopwood, 1997), e a doxorubicina

(Figura 1L) por S. peucetius (Grimm et al., 1994). No entanto, alguns destes

sistemas podem utilizar diferentes unidades na iniciação ou elongação da molécula;

na síntese da oxitetraciclina não se tem certeza se a unidade iniciadora é malonato

ou malonamato em Streptomyces rimosus (Findlow et al., 2003). As outras enzimas

realizam as modificações estruturais como as redutases, aromatases, ciclases e

enzimas tailoring as quais dão origem a uma grande diversidade de compostos

(Moss et al., 2004).

O PKS do tipo III, o qual é uma extensão da classificação baseada em FAS,

está relacionado com as enzimas pertencentes à chalcona sintase (CHS) e estilbene

sintase (STS), os quais estão relacionados com a biossíntese de compostos como a

naringenin chalcone(Wilkinson e Micklefield, 2007). Inicialmente foram identificados

em plantas, mas recentes análises têm identificado estes genes em bactérias e

fungos filamentosos e, atualmente, já se conhecem mais de 15 ceto-sintases deste

sistema tipo III (Moore e Hopke, 2001). RppA foi à primeira PKS III descrita em

bactérias por Ueda et al., em 1995 a partir de cepas de Streptomyces griseus que

catalisa a formação de 1,3,6,8-tetrahidroxinaftaleno (THN) a partir de 5 moléculas de

malonil CoA.

A PKS III ou Chalcone-like synthase consiste numa proteína ceto-sintase de

aproximadamente 40-47 kDa que funciona como um homodímero, catalisando as

condenações usando unidades de acetato, independente a ACP, atuando

diretamente nos substratos acil CoA como unidades iniciadoras gerando produtos

aromáticos mono e bi cíclicos (Bangera e Thomashow, 1999; Funa et al., 1999;

Moore e Hopke, 2001). Neste sistema, a extensão da cadeia é freqüentemente

seguida de condensações e aromatizações intramoleculares dos intermediários

lineares, todo dentro do mesmo sítio ativo do único PKS (Austin e Noel, 2003). Este

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 ______________________________________________________________________  Introdução

62  

sistema baseia sua diversidade estrutural, não pela arquitetura dos sítios ativos

dentro do sistema PKS, mas sim pela variedade das unidades iniciadoras, do

número de passos de elongação (geralmente de 1 a 8), e do mecanismo de

ciclização (Weissman, 2009). A arquitetura simples deste sistema PKSIII tem

permitido um desenvolvimento acelerado dos mecanismos de ação destas enzimas.

Porém, muitas questões fundamentais ainda ficam sem resolver, particularmente em

quanto às variantes em fungos e bactérias, os quis são objeto de futuros estudo na

área dos PKS.

1.2.7 Estatinas

As doenças das artérias coronárias e lesões ateroscleróticas, relacionadas

com o risco de hipercolesterolemia, representam uma das principais causas de

morte nas últimas décadas. No metabolismo dos lipídios, em indivíduos saudáveis,

um terço do colesterol é derivado da dieta diária e os outros dois terços restantes

são sintetizados diretamente de precursores intracelulares em vários órgãos do

corpo (Alberts et al., 1980; Demain, 1999; Furberg, 1999). Estas razões tornaram o

controle da colesterogênesis um dos assuntos mais importantes para saúde pública,

e a busca por compostos que atuam inibindo a biossíntese do colesterol tornou-se

uma prioridade para diminuir os níveis deste composto no plasma.

O colesterol é um esteróide essencial para as membranas celulares e é o

componente para a biossíntese de ácidos biliares, para a absorção de gorduras e

vitaminas solúveis no intestino. O colesterol também está relacionado à biossíntese

de hormônios e é requerido para a produção de lipoproteínas de baixa densidade

pelos hepatócitos, os quais são responsáveis pelo transporte de gorduras para os

tecidos periféricos para um subseqüente metabolismo ou armazenamento (Alberts et

al., 1980; Alberts, 1988; Tobert, 1987).

A via de biossíntese do colesterol utiliza unidades de acetil-CoA como

iniciadores da síntese e envolve mais de 25 enzimas, onde o passo limitante é a

conversão de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) a mevalonato pela HMG-CoA

redutase (EC 1.1.1.34) (Figura 6). Os primeiros estudos na busca de inibidores da

síntese de colesterol levaram a compostos que inibem os últimos estágios da

síntese, como o triparanol, que bloqueia o penúltimo passo da biossíntese, inibindo a

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 ______________________________________________________________________  Introdução

63  

redução de desmosterol a colesterol, mas com a desvantagem que leva ao acúmulo

de esterol nos tecidos, com sérios efeitos laterais (Steinberg et al., 1961).

 

Figura 6  - Via Biosintética do colesterol e do ergosterol, alguns outros compostos produzidos a partir do farinesil difosfato

Fonte: Modificado de Chan et al. (2003).  

Escaleno sintase é a primeira enzima específica no processo da síntese do

colesterol e catalisa a condensação de duas moléculas de farnesil difosfato (FPP)

para a formação do escaleno. Os primeiros análogos de FPP desenvolvidos, foram o

inibidor da escaleno síntase, embora necessite de especificidade e, dessa maneira,

pode potencialmente interferir em outras FPP transferases. Para aumentar a

especificidade, análogos da FPP e outros inibidores das enzimas envolvidas na

síntese de colesterol foram desenvolvidos, BMS-188494, ácido sulfônico farnesil

difosfato, demonstrou boa efetividade como droga anticolesterolémica (Patel, 2000).

Acetil CoA

Acetoacetil CoA

HMG-CoA

Mevalonato

Isopentilpirofosfato

Geranilpirofosfato

Farnesilpirofosfato

Esqueleno

Lanosterol

Colesterol Ergosterol

Ubiquinonas

Dolicol

Cadeia respiratoriammitocondrial

Sintesis deGlicoproteinas

+Proliferacao

ProteinasGeraniladas

ProteinasFernesiladas

Isoprenilacao deProteinas ligadoras

De GTP

Estatinas

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 ______________________________________________________________________  Introdução

64  

No entanto, os inibidores da HMG-CoA redutase, acumulavam HMG-CoA que

podiam ser metabolizado em compostos mais simples, sem a formação de algum

corpo lipídico que tivesse um anel esteroidal. As estatinas são uma classe de

moléculas que contêm uma estrutura policetídica, obtidos a partir de metabólitos

secundários de fungos ou de maneira sintética que podem inibir a atividade da

HMG-CoA sintase, tornando-a uma molécula mais estável para o tratamento

terapêutico no controle de colesterol endógeno(Alberts et al., 1980; Alberts, 1988;

Endo et al., 1985; Tobert, 1987)

1.2.8 Estrutura das estatinas

Existem diferentes tipos de estatinas disponíveis: as estatinas naturais

(Lovastatina e Pravastatina) obtidas diretamente por fermentação utilizando micro-

organismos produtores; as estatinas semi-sintéticas (simvastaina) e as sintéticas

(atorvastatina e fluvastatina). As estatinas naturais são muito similares em suas

estruturas, elas possuem uma porção basal policetídica comum: um sistema

composto por um anel naftaleno junto a uma β-hidroxilactona, no qual diferentes

cadeias de comprimentos variados podem ser ligadas no carbono 8 (C8 ou R1) e no

carbono 6 (C6 ou R2) Figura 7. Lovastatina (ou mevinolin, monacolin K, e Mevacor®

, Merck) contêm uma cadeia metil butirica em R1 e um grupo metil no R2, o qual não

está presente na estrutura da mevastatina (ou Compactina). A Pravastatina (ou

Eptastatin® e Pravachol®, Bristol-Myers Squibb/Sankyo) contém no R2 um grupo

hidroxil, Sinvastataina (ou Symnvinolin® e Zocor®, Merck) contém um grupo metil

adicional na cadeia lateral que se liga a R1.

Além destes compostos, muitos outros metabólitos relacionados com a

síntese de lovastaina e mevastatina têm sido isolados e caracterizados. Monacolin X

e M tem uma composição diferente na cadeia lateral ligada a R1. Monacolin J e L,

moléculas intermediárias na síntese da lovastatina necessitam da cadeia lateral

ligada a R1 substituídos por um grupo hidroxil ou um hidrogênio, respectivamente.

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 ______________________________________________________________________  Introdução

65  

 

Figura 7 - Estrutura das estatinas. A. Estrutura base (Anel naftaleno e a β-hidróxi lactona). B. Estruturas que diferenciam as estatinas no C8 (R1) e C6 (R2)

Fonte: modificado de Manzoni e Rollini, 2003   

A estrutura das estatinas sintéticas atorvasatatin (Lipitor®, Parke-Davis),

fluvastatin (Lescol®, Novartis) e cerivasatatin (Baycol® e Lipobay®, Bayer) são

diferentes entre si e entre as estatinas naturais. Unicamente se assemelham na

fração homóloga do HMG-CoA, responsável pela inibição na via do mevalonato, e

comum em todas as estatinas. A fluvastatina, derivado da mevalolactona, foi a

primeira estatina sintética disponível no mercado (Levy et al., 1993), enquanto a

atorvastatina e a cerivastatina, derivados de piridina, são compostos de novas

gerações de estatinas (Bakker-Arkema et al., 1996).

1.2.9 Produção das estatinas

Desde 1970 as investigações na produção e isolamento de estatinas têm

indicado a possibilidade de obter-se uma ampla variedade de moléculas como

produtos finais, metabólitos intermediários ou produtos de processos de

R2

R1H

CH3

O

OH OA. B.

R1 R2

CH3

H

OH

Lovastatina

Mevastatina

Pravastatina

Simvastatina

Monacolina J

Monacolina L

Monacolina X

Monacolina M

O

O

CH3 H

O

O

CH3 H

O

O

CH3 H

O

O

CH3 H

O

O

CH3 H

O

O

CH3 CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

OH

H

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 ______________________________________________________________________  Introdução

66  

biotransformações. Algumas destas estatinas já foram produzidas mediante

processos fermentativos em grande escala (Barrios-Gonzalez e Miranda, 2010;

Manzoni e Rollini, 2002).

As estatinas naturais são produzidas principalmente por cepas de A. terreus

(Alberts et al., 1980; Greenspan e Yudkovitz, 1985) e por diferentes espécies do

gênero Monascus (Endo, 1979; Endo et al., 1985; Kimura et al., 1990; Komagata et

al., 1989; Shiao e Don, 1987), mas também existem relatos na literatura da produção

desta classe de compostos por outros gêneros de fungos filamentosos como

Penicillium (Endo et al., 1976; Hosobuchi et al., 1993), Doratomyces, Eupenicillum,

Gymnoascus, Hypomyces, Peacilomyces, Phoma, Trichoderma (Endo et al., 1986),

e Pleurotus (Gunde-Cimerman et al., 1993).

A lovastatina foi a primeira estatina a ser aprovada pela FDA em 1987, e

disponibilizada no mercado como agente anticolesterolêmico (Tobert, 1987);

entretanto a mevastatina (ML-236B) foi a primeira estatina a ser descoberta, isolada

em 1976 a partir de uma cepa de Penicillum citrinum pelo pesquisador Endo et al.

1976. Ao mesmo tempo, nos laboratórios Beecham foi isolada a mesma estatina a

partir de uma cepa de Penicillum brevicompactum (Brown et al., 1978).

Nos anos seguintes a lovastatina (conhecida como mevinolin) foi obtida a

partir de uma cepa de A. terreus isolada do solo no laboratório CIBE em Madrid,

Espanha (Alberts et al., 1980) e por outra cepa de M. ruber (conhecida como

monacolin K) por Endo em 1979. Em um programa de busca de cepas de fungos

produtores de estatinas foram testadas 124 cepas do gênero Monascus, sendo que

17 delas apresentaram produção de lovastatina, e dentre elas encontravam- se

espécies do tipo M. ruber, M. purpureus, M. pilosus, M. vitreus e M.pubigerus

(Negishi et al., 1986)

Outros estudos voltados à síntese e caracterização de compostos

relacionados à lovastatina, indicaram que algumas monacolinas são obtidas

principalmente por cepas de Monascus sp.. Monacolina J e L foram isoladas e

caracterizadas em culturas de M. ruber (Endo et al., 1985). Outras investigações

concentram-se no desenvolvimento de novas estatinas com melhores atividades

biológicas obtidas de modificações de estatinas já caracterizadas como a lovastatina

e a mevastatina. Foram testadas diferentes biotransformações a partir destas

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 ______________________________________________________________________  Introdução

67  

estatinas adicionadas diretamente no meio de cultura, resultando na obtenção da

pravastatina, uma estatina com particular interesse, já que apresentou melhores

resultados na inibição da síntese de colesterol in vitro em relação ao seu precursor,

a mevastatina (Endo, 1979; Watanabe et al., 1988). A pravastatina é obtida a partir

de um processo fermentativo de dois estágios, o primeiro consiste na produção da

mevastatina para depois ser biotransformada. A biotransformação consiste na β-

hidroxilação do C6 da mevastatina, pode ser realizada por diferentes espécies de

fungos e de Actinomycetos. Entre os micro-organismos destacados para a

biotransformação está o Mucor hiemalis, que obteve uma taxa de conversão entre o

30-90%, mas apresentou sensibilidade à mevastaina em concentrações de 0.05%

na forma lactona. Só foi atingida uma produção em maior escala quando Matsuoka

et al. (1989), obtiveram a pravastatina utilizando uma cepa de Streptomyces

carbophilus mediante um sistema enzimático que continha a citocromo P-450.

Outra série de estatinas foi obtida a partir de modificações químicas da cadeia

lateral da lovastatina situada no C8, de onde se obteve a simvastatina a partir de

processos semi-sintéticos, molecula que tem aplicações práticas na redução dos

níveis de colesterol no plasma sanguineo (Manzoni e Rollini, 2002).

O processo industrial para a produção da lovastatina foi implementado em

1980 a partir da cepa de A. terreus (Mevacor®, Merck). O desenvolvimento do

processo abarcou a análise de diferentes parâmetros fermentativos tais como a

homogeneidade do cultivo, efeitos de vários tipos de fontes de carbono, pH, aeração

e desenho dos mecanismos de agitação. O re-isolamento da cepa produtora junto

com o controle do pH e suplemento da fonte de carbono, em particular o glicerol,

produziu um aumento considerável em relação à produtividade inicial da lovastatina.

O aumento da escala de produção até 19000 litros revelou que a

transferência de oxigênio relacionada com a alta viscosidade do meio de cultivo é

uns dos fatores mais importantes na produtividade da lovastatina. Esta limitação foi

superada mediante a utilização de um impulsor mecânico mais eficiente com

aumento da força hidrodinâmica e redução da energia requerida com um 66% na

turbina Rushton (Gbewonyo et al., 1992).

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 ______________________________________________________________________  Introdução

68  

1.3 OBJETIVOS

Prospecção dirigida à identificação de genes da via biossintética dos

policetídeos em fungos endofíticos e de rizosfera isolados de cana-de-açúcar.

Para cumprir tal objetivo, foram planejadas as seguintes atividades:

1. Identificação dos isolados pela análise da região ITS1-5.8S- ITS2 do

rDNA 16S e por técnicas morfológicas macro e microscópicas.

2. Caracterização da atividade biológica contra bactérias, leveduras e

fungos filamentosos

3. Identificação dos genes PKS por meio da técnica do PCR.

4. Produção e purificação dos policetídeos.

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4 Conclusões e perspectivas

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 ______________________________________________________ Conclusões e perspectivas

170  

O presente trabalho representa a primeira caracterização de genes PKS de

fungos derivados da cana-de-açúcar. Os resultados revelaram uma grande

diversidade de fungos endofíticos capazes de produzir policetídeos, que podem

eventualmente, ter funções distintas sobre a manutenção em ambientes tropicais.

Este trabalho abre novas perspectivas para o desenvolvimento de outros estudos

relativos ao potencial desses fungos na biossíntese de pigmentos, toxinas e/ou

compostos policetídicos ainda não descritos. Neste contexto, os fungos derivados da

cana-de-açúcar podem representar uma fonte promissora de recursos genéticos

microbianos a serem explorados pela biotecnologia farmacêutica, os setores

agrícolas e ambientais.

Os resultados mais relevantes do presente trabalho estão apresentados a

seguir:

O isolado CBMAI 1023 identificado como A. flavus, demonstrou capacidade

de produção de uma ampla variedade de metabolitos secundários, não só pelos

compostos detectados nas análises químicas, mas, também, nos seus níveis de

expressão gênica. Como perspectiva futura sugere-se a construção de novos

iniciadores, a avaliação de diversos meios e condições de cultura e, inclusive, a

expressão heteróloga de genes silenciados. Em relação ao composto 1, purificado

do caldo de fermentação, serão realizadas etapas de purificação para elucidar sua

estrutura e avaliar sua potencial atividade biológica.

O isolado CBMAI 1030 foi identificado como Sacharicola sp., corroborando

com resultados já descritos na literatura que mostra ser um micro-organismo isolado

somente de cana-de-açúcar . Este fato sugere que esta linhagem pode apresentar

características genéticas únicas, onde os genes PKS participariam em funções

fundamentais. Os genes PKS identificados neste trabalho não apresentaram

similaridade com genes já caracterizados, levando ás suposições de que estes

genes sintetizem novos tipos de PK. Como continuidade deste trabalho propõe- se

realizar análises mais detalhadas destes genes visando uma melhor caracterização.

O isolado CBMAI 1018 identificado como Trichoderma sp. apresentou as

atividades biológicas mais amplas, inibindo o crescimento de bactérias, leveduras e

fungos filamentosos, quando expostos aos extratos produzidos por este. Muitos

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 ______________________________________________________ Conclusões e perspectivas

171  

trabalhos têm reportado o isolamento de uma grande variedade de metabolitos

secundários de espécies de Trichoderma, entre eles alguns policetídeos. Contudo,

nenhum trabalho tem reportado a caracterização de genes PKS responsáveis pela

síntese destes compostos, tornando os genes PKS identificados neste trabalho

fortes candidatos para uma futura caracterização.

O isolado CBMAI 1029 pode representar uma nova espécie, considerando a

alta similaridade com fungos que ainda não foram identificados e a baixa

similaridade com fungos conhecidos, quando comparada sua seqüência com

aquelas depositadas nos bancos de dados. Além disso, a detecção de um suposto

novo gene PKS (seqüência de 33Nid) a partir deste fungo reforça esta hipótese. No

entanto, devem ser realizadas outras análises taxonômicas para confirmar seu

estado de nova espécie.

Os isolados 1028 e 1029 foram identificados como Epicoccum sp. nos quais

foram identificados genes PKS responsáveis pela síntese de melaninas. Este

resultado se destaca por ser o primeiro a descrever este fato. Sugere-se uma

caracterização mais aprofundada deste gene visando o interesse para a produção

de corantes de origem microbiana.

Os isolados identificados como P. jantinellum apresentaram características

morfológicas heterogêneas entre eles, corroborando com a literatura. Demonstrando

ser ainda uma espécie pouco caracterizada. No entanto, a identificação de genes

PKS pertencentes ao mesmo grupo (Figura 24), em especial aqueles distribuídos

dentro do clado III R-PKS, abre a possibilidade de incluir um novo sub-clado na

classificação dos PKS fúngicos, responsáveis por um tipo particular de PK especifico

do gênero Penicillium.

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Referências

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