josé victor dos santos silva fungicida óxido cuproso induz...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ – UESC PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO
VEGETAL – PPGPV
José Victor dos Santos Silva
Fungicida óxido cuproso induz mudanças fisiológicas,
bioquímicas e moleculares em folhas de plantas jovens de cacau
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL Fevereiro 2019
José Victor dos Santos Silva
Fungicida óxido cuproso induz mudanças fisiológicas,
bioquímicas e moleculares em folhas de plantas jovens de cacau
ILHÉUS – BAHIA - BRASIL Fevereiro 2019
Dissertação apresentada à
Universidade Estadual de Santa
Cruz, como parte das exigências
para obtenção do título de
Mestre em Produção Vegetal.
Linha de Pesquisa: Cultivos em
Ambiente Tropical Úmido
Orientador: Alex-Alan Furtado
de Almeida
José Victor dos Santos Silva
Fungicida óxido cuproso induz mudanças fisiológicas,
bioquímicas e moleculares em folhas de plantas jovens de cacau
APROVADO: ___________________________ ______________________________ Prof. Dr. Alex-Alan Furtado de Almeida Dra. Martielly Santana dos Santos UESC UESC (Orientador)
__________________________ Dra. Milena do Amaral Santos UESC
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL Fevereiro 2019
Dissertação apresentada à
Universidade Estadual de Santa
Cruz, como parte das exigências
para obtenção do título de
Mestre em Produção Vegetal.
Linha de Pesquisa: Cultivos em
Ambiente Tropical Úmido
Orientador: Alex-Alan Furtado
de Almeida
i
Dedico
A Deus, pai e criador
À minha família, o meu porto seguro
ii
Agradecimentos
Agradeço a Deus, por todas as bençãos concedidas em minha vida, sem
ti eu não nada seria.
Às minhas melhores amigas, mãe (Telma), irmã (Iasmin) e vó (Maria),
por sempre me apoiar em cada passo da minha jornada na Terra e sempre me
achar o melhor de todos, mesmo não sendo. Isso só me impulsionou e me fez
tentar, não ser o melhor, mas sempre a fazer o melhor de mim. Obrigado pelo
amor incondicional!
Ao Prof. Dr. Alex-Alan, pelo exemplo de profissionalismo, por sempre
ter paciência comigo, pelo gigantesco conhecimento compartilhado, pela
amizade e orientação que venho recebendo desde a graduação, sou
imensamente grato.
À Universidade Estadual de Santa Cruz- UESC e ao Programa de Pós
Graduação em Produção Vegetal- PPGPV pela oportunidade e crescimento
acadêmico.
À Coordenadoria do Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pela concessão da bolsa de estudos.
À Carol, secretária do PPGPV, por sempre estar disponível facilitando
os trâmites burocráticos, por sempre me manter alerta aos prazos e por me
tranquilizar quando pensei que tudo ia desabar.
Aos técnicos da UESC: Lucas, Lane e Horlei, a ajuda que recebi de
vocês foi essencial para a realização desse trabalho.
iii
Ao pessoal do almoxarifado: Dona Telma, Luís e Dona Jô pelo
cafézinho milagroso e pelos momentos de descontração.
À minha amiga e parceira de mesa, Natália Martins, por sempre estar
ali para me explicar os procedimentos que eu não tinha domínio, pela
companhia no almoço, incontáveis momentos de risadas e por todas as delícias
da culinária mineira, obrigado pela amizade.
À Gisandra, minha parceira de trabalho, obrigado por estar sempre
disponível pra me auxiliar em tudo, por sempre me manter calmo quando eu
pensava que as coisas não iriam se realizar e por colocar música para as
plantinhas do experimento. Você é show!
À Adeilma e Patrícia, meus anjos em forma de amigas, por todos os
conselhos, puxões de orelha, e por sempre estarem disponíveis para me
escutar, amo vocês.
Aos integrantes do LFV, D’Ávila, Thayse Tosto, Carlos Henrique, João
Paulo, Bruna, Mayana e Isabela por todas as conversas e experiências
compartilhadas, vocês são ótimos.
À Valéria, por toda paciência em me escutar quando eu a procurava,
obrigado pelo companheirismo.
À Tainã, Francine, Nayara, Natasha, Maria Luíza, Thaynara e Ariana,
por terem entrado na minha vida e por todos os lindos momentos que
compartilhamos, foram inesquecíveis.
A todas as pessoas não citadas que contribuíram positivamente para a
realização desse trabalho.
Muito obrigado.
iv
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS…….....……………………………………………………….ii
RESUMO……………………………..………………………………………………v
ABSTRACT…………………………..……………………………………...……….vii
Lista de figuras……………………………………………………………..............ix
Lista de tabelas ..………………………………………………………......…........x
Introdução geral..................................................…………………………….....11
Material e Métodos...........................................................................................14
Resultados........................................................................................................18
Discussão.........................................................................................................29
Conclusões.......................................................................................................33
Referências.......................................................................................................34
v
SILVA, José Victor dos Santos. Universidade Estadual de Santa Cruz – UESC,
Ilhéus, fevereiro de 2019. Fungicida óxido cuproso induz mudanças
fisiológicas, bioquímicas e moleculares em folhas de plantas jovens de
cacau. Orientador: Dr. Alex-Alan Furtado de Almeida. Co-orientadores: Dra.
Vânia Lima Souza, Dr. Pedro Antônio Oliveira Mangabeira
RESUMO
Theobroma cacao é uma espécie lenhosa tropical de alta importância
econômica, devido ao valor comercial de suas amêndoas (sementes
fermentadas) que são utilizadas na produção de manteiga, lícor e chocolate, na
fabricação de cosméticos, medicamentos, etc., além da polpa das sementes
usada na produção de sucos e sorvetes. O uso contínuo e excessivo de fungicida
cúprico em plantações de cacau, na forma de óxido cuproso, para controle
químico de Moniliophthora perniciosa e de Phytophthora sp temaumentado a
concentração de Cu no solo o que pode ser evidenciado nos aspectos
morfofisiológicos. O cobre (Cu) está envolvido em diversos processos
metabólicos nas plantas, mas em alta concentração promove vários
desequilíbrios fisiológicos, bioquímicos, moleculares e ultraestruturais nas
células vegetais. O presente estudo teve como objetivo principal avaliar a
toxicidade de Cu, aplicado via foliar como fungicida na forma de óxido cuproso,
em plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a concentrações
crescentes de Cu (1,5, 3, 4,5 e 6 g L-1), juntamente com o controle (sem aplicação
de Cu), por meio de alterações fisiológicas, bioquímicas e moleculares.
Observou-se que os tratamentos com 4,5 e 6,0 g Cu L-1 afetaram severamente
as trocas gasosas foliares com decréscimo na condutância estomática (gs) e
redução da fixação de CO2. Houve alterações na expressão dos genes psbA e
psbO, envolvidos na biossíntese das proteínas intrínseca (PsbA) e extrínseca
(PsbO) do fotossistema 2 (PS2) da fase fotoquímica da fotossíntese. Além disso,
observaram-se, também, aumento na atividade das enzimas dismutase do
superóxido (SOD), peroxidase do ascorbato (APX), peroxidase do guaiacol
(GPX) e catalase (CAT), envolvidas no metabolismo antioxidativo, no teor de
prolina, na expressão dos genes Mt2b, sod cyt, sod chl e per-1, nas
concentrações de macro e micronutrientes minerais e na peroxidação lipídica de
vi
membranas celulares dos tecidos foliares. O aumento da atividade de SOD,
APX, GPX e CAT e do teor de prolina coincidiram com a maior expressão do
gene sod cyt e M2tb, envolvidos com a biossíntese de SOD citoplasmática e de
matalotioneína, respectivamente, demonstrando sincronicidade da eliminação
de espécies reativas de oxigênio (ERO) e da compartimentalização de Cu em
nível de vacúolos. Tais respostas evidenciaram um padrão de resposta do tipo
dose-tempo dependente, indicando que houve um sinergismo nas vias de
detoxificação celular na eliminação do excesso de ERO. Concluiu-se, portanto,
que a aplicação das diferentes concentrações de Cu via foliar, usando como
fonte o fungicida óxido cuproso, induziu um desequilíbrio do metabolismo celular
em folhas de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51, principalmente nas
concentrações de 4,5 e 6 g Cu L-1.
Palavras-chave: Theobroma cacao, estresse oxidativo, cobre, expressão gênica
vii
SILVA, José Victor dos Santos. Universidade Estadual de Santa Cruz – UESC,
Ilhéus, February, 2019. Cuprous oxide fungicide induces physiological,
biochemical and molecular changes in leaves of young cacao plants.
Advisor: Dr. Alex-Alan Furtado de Almeida. Co-advisors: Dra. Vânia Lima Souza,
Dr. Pedro Antônio Oliveira Mangabeira.
ABSTRACT
Theobroma cacao is a tropical woody species of high economic importance, due
to the commercial value of its beans (fermented seeds) that are used in the
production of butter, milk and chocolate, in the manufacture of cosmetics,
medicines, etc., besides the seed pulp used in the production of juices and ice
cream. The continuous and excessive use of cupric fungicide in cocoa
plantations, in the form of cuprous oxide, for the chemical control of
Moniliophthora perniciosa and Phytophthora sp., increased the concentration of
Cu in the soil, which can be evidenced in the morphophysiological aspects.
Copper (Cu) is involved in various metabolic processes in plants, but in high
concentration it promotes several physiological, biochemical, molecular and
ultrastructural imbalances in plant cells. The main objective of this study was to
evaluate Cu toxicity, applied in the leaves of young plants of the cacao genotype
CCN 51 as fungicide in the form of cuprous oxide in increasing concentrations
(1.5, 3, 4.5 and 6 g Cu L-1), together with the control (without Cu application),
through physiological, biochemical and molecular changes. It was observed that
treatments with 4.5 and 6 g Cu L-1 severely affected leaf gas exchange with
decreases in stomatal conductance (gs) and reduction of CO2 fixation. There
were alterations in the expression of the psbA and psbO genes involved in the
intrinsic (PsbA) and extrinsic (PsbO) proteins of photosystem 2 (PS2)
biosynthesis of the photochemical phase of photosynthesis. In addition, there
was an increase in the activity of the enzymes superoxide dismutase (SOD),
ascorbate peroxidase (APX), guaiacol peroxidase (GPX) and catalase (CAT)
involved in antioxidative metabolism, proline content, expression of the Mt2b, sod
cyt, sod chl and per-1 genes, concentrations of macro and micronutrients
minerals and lipid peroxidation of cell membranes of leaf tissues. The increase in
viii
SOD, APX, GPX and CAT activity and the proline content coincided with the
higher expression of the sod cyt and M2tb gene, involved in cytoplasmic SOD
biosynthesis and metallothionein, respectively, demonstrating the synchronicity
of elimination of reactive oxygen species (ROS) and compartmentalization of Cu
at the vacuoles level. These responses evidenced a dose-time dependent
response pattern, indicating that there was a synergism in the pathways of
cellular detoxification in the elimination of excess ROS. It was concluded,
therefore, that the application of different concentrations of Cu in the leaves, using
as a source the cuprous oxide fungicide, induced an imbalance of the cellular
metabolism in leaves of young plants of the cacao genotype CCN 51, mainly in
the concentrations of 4.5 and 6 g Cu L-1.
Keywords: Theobroma cacao, oxidative stress, copper, gene expression
ix
Lista de figuras:
Figura 1 - (A) Fotossíntese liquída por unidade de área, (B) condutância
estomática ao vapor d’água, (C) transpiração instantânea em folhas de plantas
jovens do genótipo de cacau CCN51, submetidas a diferentes concentrações de
Cu [■ 0, ■ 1,5, ■ 3, ■ 4,5 e ■ 6 (g L-1) – fonte (fungicida óxido cuproso)] via foliar,
aos 1, 7, 14, 21 e 30 dias após a aplicação dos tratamentos, (D) relação entre
fotossíntese e a concentração de Cu in situ no tecido foliar. Valores médios de
10 repetições (±SE). Letras maiúsculas indicam comparação entre o tempo em
dias e letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de
Tukey (p<0,05).
Figura 2 – (A) transpiração instantânea em folhas de plantas jovens do genótipo
de cacau CCN51, submetidas a diferentes concentrações de Cu [■ 0, ■ 1,5, ■ 3,
■ 4,5 e ■ 6 (g L-1) – fonte (fungicida óxido cuproso)] via foliar, aos 1, 7, 14, 21 e
30 dias após a aplicação dos tratamentos, (B) relação entre fotossíntese e a
concentração de Cu in situ no tecido foliar. Valores médios de 10 repetições
(±SE). Letras maiúsculas indicam comparação entre o tempo em dias e letras
minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Tukey
(p<0,05).
Figura 3 - Atividade das enzimas do metabolismo antioxidativo.nos diferentes
intervalos de tempo (■ 0h, ■ 3h, ■ 6h, ■ 12h, ■ 24h, ■ 48h, ■ 96h após a aplicação
dos tratamentos). (A) SOD-Dismutase do superóxido, (B) CAT- Catalase, (C)
APX- Peroxidase do ascorbato, (D) GPX- Peroxidase do guaiacol, em folhas de
plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes
concentrações de Cu [■ 0, ■ 1,5, ■ 3, ■ 4,5 e ■ 6 (g L-1) – fonte (fungicida óxido
cuproso)] via foliar. Valores médios de 5 repetições (±SE). Letras maiúsculas
indicam comparação entre os tratamentos de Cu e letras minúsculas indicam
comparação entre os intervalos de tempo pelo teste de Tukey (p<0,05).
Figura 4 - Concentração de prolina em tecido foliar de plantas jovens do genótipo
de cacau CCN 51 submetidas a concentrações crescentes de Cu [ 0, 1,5, 3, 4,5
e 6 (g L-1) – fonte (fungicida óxido cuproso)] via foliar. Valores médios de cinco
repetições biológicas (±SE). Letras maiúsculas indicam comparações de médias
entre os tratamentos pelo teste de Tukey (p<0,05).
x
Figura 5- Expressão relativa dos genes codificadores da biossíntese das
proteínas psbA (A) e psbO de PS2 (B), dismutase do superóxido citoplasmática-
sod cyt (C), dismutase do superóxido cloroplastídica- sod chl (D), peroxidases
classe III- per-1 (E) e metalotioneínas- Mt2b (F) em folhas de plantas jovens do
genótipo de cacau CCN 51, submetidas a diferentes concentrações de Cu [■ 0,
■ 1,5, ■ 3, ■ 4,5 e ■ 6 (g L-1) – fonte (fungicida óxido cuproso)] via foliar em dois
intervalos de tempo (■ 24 h e ■ 96 h). Valores médios de três repetições
biológicas (± SE). Letras maiúsculas indicam comparações médias entre os
tratamentos de Cu, pelo teste de Tukey (p<0,05). A significância estatística entre
os intervalos avaliados foi determinada pela ANOVA, seguida do teste t (* p
<0,05).
Figura 6 - Concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
em folhas de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51, submetidas a
diferentes concentrações de Cu [ 0, 1,5, 3, 4,5 e 6 (g L-1) – fonte (fungicida
óxido cuproso)] via foliar. Valores médios de cinco repetições biológicas (±SE).
Letras maiúsculas indicam comparações de médias entre os tratamentos pelo
teste de Tukey (p<0,05).
Figura 7 - Acúmulo de Cu em folhas de plantas jovens do genótipo de cacau
CCN 51, submetidas a diferentes concentrações de Cu [ 0, 1,5, 3, 4,5 e 6 (g L-
1) – fonte (fungicida óxido cuproso)] via foliar. Valores médios de quatro
repetições biológicas (±SE). Letras maiúsculas indicam comparações de médias
entre os tratamentos pelo teste de Tukey (p<0,05).
Lista de tabelas:
Tabela 1. Pares de primers genes específicos utilizados na análise qRT-PCR.
Tabela 2. Concentração de macro e micronutrientes minerais em folhas de
plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51, submetidas a diferentes
concentrações de Cu [0, 1,5, 3, 4,5 e 6 (g Cu L-1) – fonte (fungicida óxido
cuproso)] via foliar. Valores médios de quatro repetições biológicas (± SE). Letras
maiúsculas indicam comparações de médias entre os tratamentos pelo teste de
Tukey (p<0,05
11
INTRODUÇÃO GERAL
O cacau (Theobroma cacao) é uma espécie perene de porte arbóreo,
preferencialmente alógama com origem na região do Alto Amazonas, terras
baixas do México e América central (ALMEIDA; VALLE, 2009; 2007). A espécie
pertence a família Malvaceae, assim como todo o gênero Theobroma, que
compreende cerca de 22 espécies, dentre as quais o destaque é o T. cacao
(MONTEIRO; AHNERT, 2011).
Nas plantações de cacau se utiliza comumente fungicida cúprico, na
forma de óxido cuproso, como controle químico para proteção de flores e frutos
contra o ataque de fungos, como Moniliophthora perniciosa e Phytophthora sp,
que, uma vez sem controle, pode comprometer grande parte da produção de
frutos. Apesar de a externalidades negativas do controle químico, a fim de
defender métodos alternativos de controle (TONDJE et al., 2006; DEBERDT et
al., 2008), a pulverização de fungicidas é a alternativa mais barata e acessível e,
por hora, contribui positivamente para o controle eficiente das doenças (AKROFI
et al., 2003; BATEMAN et al., 2005; GOCKOWSKI et al., 2005). Segundo
Cabala-Rosand et al. (1982), pulverizações com fungicidas cúpricos é o principal
determinante do alto teor de cobre (Cu) nos solos cultivados com cacau.
Pesquisas realizadas na região comprovam o aumento dos teores de Cu no solo,
quando comparado com áreas isentas de aplicação de fungicidas por um período
de cinco ou dezesseis anos (VELOSO; SANTANA, 2000).
O cobre (Cu) é um elemento calcófilo e siderófilo. Ocorre nas formas
cuprosa (Cu+2) e cúprica (Cu+3), ocorrendo também na forma metálica em alguns
minerais. Por apresentar forte caráter covalente das ligações do metal com
outros elementos, é encontrado principalmente como sulfetos em rochas ígneas.
Embora seja encontrado, naturalmente, em arenito e em minerais, pode também
ser encontrado no solo por ações antropogênicas (van RAIJ, 1991; ABREU et
al., 2002; LOPES et al., 2006). A sua retenção no solo pode ser explicada por
mecanismos de adsorção nas superfícies das partículas minerais, por meio da
complexação com substâncias húmicas em partículas orgânicas e reações de
precipitação (KHAN; SCULLION, 2000).
Durante o processo de adsorção, Cu acumulado na interface, entre a
superfície sólida e a solução adjacente, pode se tornar disponível no solo na
forma de íons livres. Estes íons complexados por ligações iônicas ou covalentes
12
são retidos e absorvidos pelas plantas. Isto acontece quando Cu forma
complexos (CuOH+) de alta energia de ligação, em superfícies que contêm
grupos hidroxilas como óxidos e hidróxidos de Al, Fe e Mn (GUILHERME et al.,
1995; ALLOWAY; AYRES, 1997). Por outro lado, Cu pode ser complexado,
também, em formas orgânicas insolúveis na matéria orgânica, pela sua
capacidade de formar quelatos. Dessa forma, Cu permanece indisponível ou
não, atenuando sua capacidade de produzir efeitos de toxidez para as plantas
ou de contaminar as águas superficiais e subterrâneas (SIMÃO; SIQUEIRA,
2001; COSTA et al., 2004;).
Nas plantas, Cu está envolvido em diversos processos fisiológicos
(NAGAJYOTI et al., 2010). As proteínas e enzimas contendo Cu, conhecidas
como cuproenzimas, possuem um papel crucial no metabolismo celular.
Apresenta um papel fundamental como constituinte de enzimas eucarióticas
onipresentes como: (i) citocromo c oxidase mitocondrial, que catalisa a redução
do oxigênio molecular em água, um passo fundamental na síntese de ATP
durante a respiração, (ii) superóxido dismutase do tipo Cu/Zn (SOD-Cu/Zn),
enzima antioxidante responsável por catalisar a decomposição dos radicais
superóxido no citosol e nos cloroplastos de células vegetais e (iii) lacases de
parede celular, oxidases que contribuem para a modificação da parede celular,
por meio da polimerização de monolignóis em lignina no apoplasto. Por outro
lado, Cu participa também como cofator de molibdênio, formando sítios ativos
das enzimas dependentes de Mo. Ademais está envolvido na assimilação de N
e ácido abscísico (ABA), no catabolismo de purinas e na desintoxicação por
sulfito (KUPER et al., 2004; PRINTZ et al., 2016).
O excesso de Cu o torna extremamente tóxico para as plantas (KUPPER;
ANDRESEN, 2016). Alguns distúrbios fisiológicos e bioquímicos são
frequentemente associados ao aumento dos teores de Cu nas plantas
(MATEOS-NARANJO et al., 2013; SOUZA et al.,2014; TIECHER et al., 2016). A
alta concentração de Cu na planta pode inibir o seu crescimento, por
interferência em processos celulares importantes, como a estrutura da
cromatina, síntese de proteínas e atividade de enzimas envolvidas nos
processos de fotossíntese e respiração (YRUELA, 2009). Por outro lado,
elevadas concentrações de metais tóxicos pode induzir estresse oxidativo, em
função da formação excessiva de espécies reativas de oxigênio (ERO) (SHAHID
et al., 2017).
13
Como exemplo de ERO pode ser citado os radicais superóxido (O2-•),
peróxido de hidrogênio (H2O2), radicais hidroxílicos (OH•) e oxigênio singleto
(1O2), que se formam naturalmente, em pequenas concentrações, nos
cloroplastos, mitocôndrios e peroxissomos, como subprodutos do metabolismo
aeróbio. Estas espécies reativas são eliminadas constantemente pelo sistema
antioxidativo enzimático e não enzimático para a manutenção da homeostase
celular (MITTLER, 2017). A partir do momento que o acúmulo de ERO não é
totalmente eliminado pelos sistemas antioxidantes, desencadeia-se, em seguida,
o estresse oxidativo em nível celular. As enzimas antioxidativas dismutase do
superóxido (SOD, CE 1.15.1.1), peroxidase do ascorbato (APX, EC 1.11.1.11),
peroxidase do guaicol (GPX, EC 1.11.1.7) e catalase (CAT, EC 1.11.1.6)
participam do processo de eliminação e desintoxicação de ERO’s, cujas
atividades são monitoradas para avaliação de plantas em condição de estresse
(MITTLER, 2017).
A ativação da síntese e acúmulo de aminoácidos livres como a prolina,
tem sido relatada como um agente antioxidante não enzimático, frente ao
estresse por metais tóxicos (CHRISTHUUTHAYAM et al., 2018). A prolina possui
múltiplas funções, tais como regulador da pressão osmótica, redutor de radicais
livres, estabilizador de enzimas, de membranas e de estruturas protéicas. Além
disso, a prolina mantém o pH citosólico, ajudando a equilibrar o estado de
reações redox da célula (ASLAN et al., 2017).
Outro importante mecanismo de desintoxicação e tolerância desenvolvido
pelas plantas, frente ao estresse induzido por Cu e outros metais tóxicos, é a
quelação por peptídeos como as metalotioneínas e fitoquelatinas (HASAN et al.,
2017; SRIVASTAVA et al., 2017). A biossíntese de metalotioneínas é estimulada
em função da concentração de metal livre nas células (HASAN et al., 2017; TAIZ
et al., 2017). As metalotioneínas, faz parte de uma família de proteínas de baixo
peso molecular, ricas em cisteína, que apresentam uma forte correlação entre
sua expressão e a concentração de metais no ambiente, devido à alta afinidade
por íons metálicos. As metalotioneínas são produtos da tradução de mRNA e
são expressas em resposta a diferentes tipos de estresses abióticos (HASAN et
al., 2017; SHAHID et al.,2017, NAVARRETE et al., 2019). Já as fitoquelatinas
(PCs) são pequenos polipeptídeos ricos em cisteína com estrutura: (γ-Glu-Cys)
n-Gly e comprimentos de cadeia entre 2 e 11 unidades, responsáveis pela
quelação de metais via grupos sulfidrila (COBBETT; GOLDSBROUGH, 2002).
14
As PCs são sintetizadas pela enzima fitoquelatina sintase (PCS) usando
glutationa reduzida (GSH) como substrato. Sua ativação ocorre na presença de
íons metálicos ou por meio de ligação aos complexos GSH (OSAKI et al., 2009).
Tanto as metalotioneínas quanto as fitoquelatinas atuam no sequestro do Cu,
inativando o mesmo no citoplasma e transportando o metal complexado para os
vacúolos, onde serão compartimentalizados (LANGE et al., 2017, NAVARRETE
et al., 2019). Dessa forma, protegem as plantas proporcionando resistência ao
efeito deletério dos metais pesados, restringindo sua acumulação na parte aérea
das mesmas (YADAV, 2010).
Este estudo teve como objetivos principais: (i), avaliar os efeitos da
aplicação de Cu via foliar sobre as trocas gasosas (ii) determinar o teor de macro
e micronutrientes minerais em folhas; (iii) determinar a atividade de enzimas
relacionadas ao metabolismo antioxidativo; (iv) avaliar os produtos resultantes
da peroxidação lipídica em nível foliar; (v) determinar a concentração de prolina,
osmólito não enzimático relacionado ao metabolismo antioxidativo e (vi) analisar
os padrões de expressão de genes envolvidos na biossíntese de enzimas
antioxidativas (Sod cyt, Sod chl e per-1), das proteínas do fotossistema 2 (PsbA
e PsbO) e da metalotioneína (Mt2b).
Material e Métodos
Material vegetal e condições de cultivo
O experimento foi conduzido em condições de casa de vegetação no
Campus da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, Bahia, Brasil
(14º 47’ S, 39º 10’ W). Sementes do genótipo de cacau CCN 51 foram
germinadas em tubetes de polietileno de 288 cm3, contendo substrato orgânico
(casca de Pinnus + fibra de coco na proporção de 1:1), enriquecido com macro
e micronutrientes minerais, de acordo com as exigências da cultura. Logo depois,
aos 60 dias após a emergência, as plântulas foram transplantadas para vasos
plásticos com capacidade de 5 kg contendo solo previamente corrigido (pH 5.6)
e adubado, de acordo com a sua análise fisico-química. Posteriormente, aos 90
dias após o transplantio, foi realizada uma única aplicação via foliar, tanto na
face adaxial como na abaxial, com pulverizador manual, usando 50 mL de
solução por planta de concentrações crescentes de Cu (1,5; 3; 4,5 e 6 g Cu L-¹),
15
juntamente com o controle (sem adição de Cu), sob a forma Cu2O, e avaliado
por período de 30 dias.
Medições de trocas gasosas foliares
A taxa fotossintética líquida (A) e a taxa de transpiração instantânea (E)
foram medidas na 2ª ou 3ª folha completamente expandida a partir da
extremidade do eixo caulinar, nos intervalos de tempo de 1, 7, 14, 21 e 30 dias
após aplicação dos tratamentos (AAT), em 10 plantas por tratamento + controle,
perfazendo um total de 50 plantas. As medições foram realizadas
semanalmente, entre 8 e 11 h, com um sistema aberto de analisador de gases
por infravermelho, modelo LI-6400 (Li-Cor Biosciences Inc., Lincoln, NE, USA),
equipado com uma câmara Li-6400-40 e fonte de luz artificial 6400-02B RedBlue.
A fonte de luz artificial foi ajustada para prover uma radiação fotossinteticamente
ativa de 800 μmol m−2 s−1, o fluxo de CO2 foi ajustado para manter uma
concentração de 380 µmol mol-1 no interior da câmara e a temperatura da
câmara foliar foi mantida constante em 28 °C. A condutância estomática ao vapor
de água (gs) foi calculada pelo referido equipamento a partir dos valores de A e
E (VON CAEMMERER; FARQUHAR, 1981).
Atividade das enzimas GPX, APX, SOD e CAT
Os ensaios da atividade das enzimas do metabolismo antioxidativo foram
realizados em tecidos foliares, na 2ª ou 3ª folha a partir do ápice caulinar,
coletadas de 25 plantas (cinco de cada tratamento + controle) e lavadas com
água deionizada (2x), HCl a 3% (2x), EDTA a 3% (2x) e água destilada (2x) para
eliminação de Cu não absorvido pela folha. As coletas foram realizadas em
diferentes intervalos de tempo correspondentes a 0, 3, 6, 12, 24, 48 e 96 h AAT.
Imediatamente após a coleta, as folhas foram imersas em nitrogênio líquido,
armazenadas em ultrafreezer – 80 °C e, posteriormente, liofilizadas e
armazenadas em freezer – 20 °C. As atividades de SOD, GPX, APX e CAT foram
determinadas de acordo com Carlberg e Mannervik (1985), Giannopolitis e Ries
(1977), Havir e Mchale (1987), Nakano e Asada (1981), respectivamente.
16
Determinação de prolina livre.
Foi coletada a 2ª ou 3ª folha madura, a partir do ápice caulinar, de cinco
plantas por tratamento + controle, perfazendo um total de 25 plantas, aos 30 dias
AAT. Imediatamente após, as folhas foram destacadas das plantas e lavadas
com água deionizada (2x), HCl a 3% (2x), EDTA a 3% (2x) e água destilada (2x)
e colocadas em sacos de papel e levadas à estufa de secagem com ventilação
forçada de ar a 70 °C até massa constante. Posteriormente, a biomassa seca foi
moída em moinho de facas tipo Willey, modelo MA-340, usando peneiras de 20
mesh de abertura de malha. Em seguida, a prolina livre das folhas foi extraída
da biomassa seca triturada e o seu teor determinado pelo método do ácido
sulfosalicílico, de acordo com os procedimentos descritos por Bates et al. (1973)
com pequenas modificações (KHEDR et al., 2003).
Peroxidação lipidica
A peroxidação lipídica de membranas celulares foi obtida por meio da
determinação das substâncias reativas ao ácido tiobarbiturico (TBARS),
principalmente malondialdeido (MDA), de acordo com metodologia descrita por
Cakmak e Horst (1991) com algumas modificações (SOUZA et al., 2014).
Utilizou-se amostras foliares coletadas e liofilizadas aos 30 dias AAT. A leitura
foi realizada em espectrofotometro de microplacas (SpectraMax Paradigm Multi-
Mode Microplate Reader, Molecular Devices, EUA), em comprimento de onda de
532 e 600 nm. A concentração de MDA foi calculada utilizando o coeficiente de
absorbância para o MDA de 155 Mm cm-1.
Expressão gênica
A partir da análise dos resultados da atividade das enzimas do
metabolismo antioxidativo, realizada nos diferentes tratamentos + controle, nos
intervalos de tempo correspondentes a 0, 3, 6, 12, 24, 48 e 96 h AAT, foram
selecionados os intervalos de 24 e 96 h AAT, que apresentaram maiores
contrastes entre tratamentos e controle, para analises de real time (qRT-PCR).
Para extração do RNA total, usou-se parte das amostras foliares
coletadas e liofilizadas para a determinação da atividade das enzimas do
metabolismo antioxidativo. A extração do RNA foi realizada utilizando o kit
17
RNAqueous (Ambion®) de acordo com as intruções do fabricante. A
concentração e pureza do RNA foram determinadas espectrofotometricamente
a 260 e 280 nm. O cDNA foi sintetizado usando o kit High Capacity RNA-to-cDNA
(Applied Biosystems, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. O
cDNA foi amplificado por qRT-PCR, utilizando vários pares de primers
relacionados à biossíntese de proteínas envolvidas no metabolismo
antioxidativo, no PS2 da fase fotoquímica da fotossíntese, na quelação e
sequestro de metais, no estresse térmico e na via glicolítica (Tabela 1).
Nutrientes minerais
Para a determinação dos teores de macro (N, P, K, Ca, Mg e S) e
micronutrientes (Cu, Fe, Zn, Mn e B) minerais foram utilizadas partes da
biomassa seca foliar triturada e usada para a determinação do teor de prolina,
cujas folhas foram coletadas nos diferentes tratamentos + controle aos 30 dias
AAT. Sequencialmente, o material vegetal seco e moído foi submetido à digestão
nitroperclorica (3:1 v:v). Após a digestão, os teores de macro e micronutrientes
minerais foram determinados por meio de Espectrometria de Emissão Óptica por
Plasma Indutivamente Acoplado (ICP-OES) modelo “Varian 710-ES” (Agilent
Technologies, Santa Clara, CA).
Análise estatística
O delineamento experimental adotado no estudo foi o inteiramente
casualizado, com cinco tratamentos, referentes às concentrações crescentes de
Cu + controle, com 20 repetições e uma planta por unidade experimental.
Entretanto, houve variações do número de repetições, de acordo com o
parâmetro avaliado. Foram utilizadas dez repetições para medições de trocas
gasosas foliares, cinco repetições para atividade enzimática e expressão gênica,
cinco repetições para prolina, nutrientes minerais e peroxidação lipidica. Fez-se
análise de variância (ANOVA) e comparação de medias, entre tratamentos e
controle, usando o teste de Tukey (p<0.05).
18
Resultados
Trocas gasosas foliares
O aumento da concentração de Cu na superfície foliar e o tempo de
exposição aos tratamentos aplicados impactaram negativamente A, gs e E (Fig.
1 e 2) com decréscimo verificado após o primeiro dia após aplicação dos
tratamentos.
Após os sete dias AAT houve diferença significativa nos valores de A, gs
e E em relação ao controle. Na concentração de 6 g Cu L-1, as diminuições nos
valores de A, gs e E foram na ordem de 58%, 30% e 56%, respectivamente. Por
outro lado, aos 21 dias AAT o decréscimo observado nos valores de A, gs e E
foi de 57%, 70% e 56% e de 43%, 53% e 55% para as concentrações de 4,5 e 6
g Cu L-1, respectivamente. Entretanto, aos 30 dias AAT, os valores de A
diminuíram 54%, 58% e 77% para os tratamentos de 3,0, 4,5 e 6,0 g Cu L-1,
respectivamente. No entanto, não houve variações significativas para os valores
de gs nestas mesmas concentrações de Cu. Mas, em geral, verificou-se uma
diminuição de gs na ordem de 45%, quando comparado ao controle (Fig. 1B).
Foi observado redução exponencial de A à medida que a concentração de Cu
no tecido aumentou (Fig.1D).
19
Figura 1 - (A) Fotossíntese liquída por unidade de área, (B) condutância estomática ao
vapor d’água em folhas de plantas jovens do genótipo de cacau CCN51, submetidas a
diferentes concentrações de Cu [■ 0, ■ 1,5, ■ 3, ■ 4,5 e ■ 6 (g L-1) – fonte (fungicida
óxido cuproso)] via foliar, aos 1, 7, 14, 21 e 30 dias após a aplicação dos tratamentos.
Valores médios de 10 repetições (±SE). Letras maiúsculas indicam comparação entre o
tempo em dias e letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste
de Tukey (p<0,05).
20
Figura 2 - (A) transpiração instantânea em folhas de plantas jovens do genótipo de
cacau CCN51, submetidas a diferentes concentrações de Cu [■ 0, ■ 1,5, ■ 3, ■ 4,5 e ■
6 (g L-1) – fonte (fungicida óxido cuproso)] via foliar, aos 1, 7, 14, 21 e 30 dias após a
aplicação dos tratamentos, (B) relação entre fotossíntese e a concentração de Cu in situ
(mg kg-1 DW) no tecido foliar. Valores médios de 10 repetições (±SE). Letras maiúsculas
indicam comparação entre o tempo em dias e letras minúsculas indicam comparação
entre os tratamentos pelo teste de Tukey (p<0,05).
D
(mg kg-1 DW)
21
Metabolismo antioxidativo
Em geral, houve um aumento significativo (p<0.05) na atividade das
enzimas envolvidas no metabolismo antioxidativo com o incremento das
concentrações de Cu aplicado via foliar e com o tempo de exposição às
diferentes concentrações do metal. Houve um aumento na atividade de SOD,
nas concentrações de 4,5 e 6 g Cu L-1, as 6 e 96 h AAT, de 40 e 528% e de
290% e 570%, respectivamente, quando comparado ao controle (Fig. 3A). A
maior atividade de CAT (Fig. 3B) foi evidenciada na concentração de 4,5 g Cu L-
1 as 3 h AAT. Esse tratamento promoveu um aumento na atividade de CAT na
ordem de 458% as 3 h AAT e de 241% às 96 h AAT, quando comparado ao
controle. Por outro lado, não houve variação na atividade de APX nas doses
correspondentes a 1,5; 3 e 6 g Cu L-1 (Fig. 3C) em relação ao controle.
Entretanto, verificou-se um aumento na atividade de APX de 607, 501 e 506%
nas concentrações de 1,5; 3 e 6 g Cu L-1 as 96 h AAT, respectivamente, quando
comparado ao controle. Para GPX (Fig. 3D), a maior atividade se verificou na
concentração de 6 g Cu L-1 as 24 e 96 h AAT, cujos incrementos foram de 700 e
710%, respectivamente, quando comparado ao controle.
22
Figura 3 - Atividade das enzimas do metabolismo antioxidativo.nos diferentes intervalos
de tempo (■ 0h, ■ 3h, ■ 6h, ■ 12h, ■ 24h, ■ 48h, ■ 96h após a aplicação dos
tratamentos). (A) SOD-Dismutase do superóxido, (B) CAT- Catalase, (C) APX-
Peroxidase do ascorbato, (D) GPX- Peroxidase do guaiacol, em folhas de plantas jovens
do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Cu [■ 0, ■ 1,5,
A
B
C
D
23 ■ 3, ■ 4,5 e ■ 6 (g L-1) – fonte (fungicida óxido cuproso)] via foliar. Valores médios de
5 repetições (±SE). Letras maiúsculas indicam comparação entre os tratamentos de Cu
e letras minúsculas indicam comparação entre os intervalos de tempo pelo teste de
Tukey (p<0,05).
Prolina
Houve um aumento significativo (p<0,05) crescente do teor de prolina nas
folhas com o incremento das concentrações de Cu aplicadas via foliar. O maior
teor de prolina foi observado na concentração de 6 g Cu L-1, cujo aumento foi de
400%, quando comparado ao controle (Fig. 4).
Figura 4 - Concentração de prolina em tecido foliar de plantas jovens do genótipo de
cacau CCN 51 submetidas a concentrações crescentes de Cu [ 0, 1,5, 3, 4,5 e 6 (g Cu
L-1) – fonte (fungicida óxido cuproso)] via foliar. Valores médios de cinco repetições
biológicas (±SE). Letras maiúsculas indicam comparações de médias entre os
tratamentos pelo teste de Tukey (p<0,05).
Expressão gênica
Observou-se diferença significativa (p<0,05) na expressão relativa dos
genes psbA, psbO, Mt2b, sod cyt, sod chl e per-1 em função das concentrações
de Cu aplicadas via foliar e do tempo de exposição ao metal (Fig 5). No período
de 24 h AAT, as maiores expressões relativas dos genes sod cyt, psbA, per-1 e
Mt2b (Fig. 5C, A, E e F) ocorreram na concentração de 6 g Cu L-1, com aumentos
E
A
D
C
B
24
de 130x, 150x, 140x e 85x, respectivamente, quando comparado ao controle.
Por outro lado, na concentração de 4,5 g Cu L-1, houve um acréscimo na ordem
de 120x a expressão relativa do gene psbO (Fig 5B). A expressão relativa mais
elevada do gene sod chl (Fig. 5D) foi observada na concentração de 3 g Cu L-1,
com um incremento de 136x, quando comparado ao controle. Além disso, nas
concentrações de 4,5 e 6 g Cu L-1 também houve aumento da expressão relativa
dos genes sod cyt e sod chl (Fig 5C e D), com acréscimo na ordem de 130 e
220x e 135 e 130x, respectivamente. Em contrapartida, nas concentrações de
4,5 e 3 g Cu L-1, verificou-se repressão da expressão relativa dos genes psbA e
psbO, respectivamente (Fig. 5A e B). No período de 96 h AAT, as maiores
expressões relativas dos genes sod cyt, psbA e Mt2b (Fig 5A, D e F) foram
observadas na concentração de 6 g Cu L-1, com aumentos de 220x, 135x e 130x,
respectivamente, quando comparado ao controle. Entretanto, para o gene per-1
(Fig. 5E), a maior expressão relativa, no intervalo de 96h AAT, foi observada na
concentração de 3 g Cu L-1, com aumento correspondente a 70x. Por outro lado,
a expressão dos genes sod chl e psbO (Fig 5D e B) ocorreu na concentração de
1,5 g Cu L-1, com um acréscimo na ordem de 80x, quando comparado ao
controle.
25
Tabela 1. Pares de primers genes específicos utilizados na análise qRT-PCR.
a http://esttik.cirad.fr/index.html b http://cocoagendb.cirad.fr/ c http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Gene Acesso Função Primer
Cu-Zn
sodcyt CL94Contig1a
Biossíntese de Cu-
Zn SOD citosólica
F—5′-GATGATGGCTGTGTGAGTTTCTCT-3′
R—5′-CAACAACAGCTCTTCCAATAATTGA-3′
Cu–Zn
sodchl CL872Contig1a
Biossíntese de Cu-
Zn SOD
cloroplastídica
F—5′-AATGGATGCATGTCAACAGGAGC−3′
R—5′-ATGTTTCCCAGGTCACCCGC-3′
psbA NC_014676.2c
Biossíntese da
proteína PsbA ou
proteína D1
F—5′-GGTTTGCACTTTTACCCGA−3′
R—5′-CTCATAAGGACCGCCATT-3′
psbO CL326Contig1a
Biossíntese da
proteína PsbO ou
protéina OEE1
F—5′-GCAAACGCTGAAGGAGTT-3′
R—5′-GGCTTGAAGGCAAATGAGTC-3′
per-1 CK144296.1a
Biossíntese de
peroxidase da
classe III
F—5′-CAGGTGTCGTGGGATCAAGA-3′
R—5′-TGGAAAAACTACGCCAAATATGC-3′
Mt2b CL9Contig1a Biossíntese de
metalotioneínas
F—5′-GCAACCCTTGCACTTGTAAATG-3′
R—5′-CAAGCCATGGCAACTTTATTCTAA-3′
hsp70 NC_030850c
Endógeno
F- 5’-GAAGTTTGAGCTCACGGGAATT-3’
R- 5’-TCGCATCAATGTCGAACACA-3’
GAPDH NC_030853c Endógeno
F-5’-GGGAGGTGCAAAGAAAGTTATCA-3’
R-5’-TTCCTTTTCATTGACACCAACAA-3’
26
Figura 5 - Expressão relativa dos genes codificadores da biossíntese das proteínas
psbA (A) e psbO de PS2 (B), dismutase do superóxido citoplasmática- sod cyt (C),
dismutase do superóxido cloroplastídica- sod chl (D), peroxidases classe III- per-1 (E) e
metalotioneínas- Mt2b (F) em folhas de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51,
submetidas a diferentes concentrações de Cu [■ 0, ■ 1,5, ■ 3, ■ 4,5 e ■ 6 (g L-1) – fonte
(fungicida óxido cuproso)] via foliar em dois intervalos de tempo (■ 24 h e ■ 96 h).
Valores médios de três repetições biológicas (± SE). Letras maiúsculas indicam
comparações médias entre os tratamentos de Cu, pelo teste de Tukey (p<0,05). A
significância estatística entre os intervalos avaliados foi determinada pela ANOVA,
seguida do teste t (* p <0,05).
A B
C D
E F
27
Peroxidação lipídica
À semelhança do teor de prolina, houve, também, um aumento
significativo (p<0,05) crescente no teor de TBARS nas folhas com o incremento
das concentrações de Cu aplicadas via foliar. O maior teor de TBARS, na
concentração de 6 g Cu L-1, correspondeu a um aumento de 300% em relação
controle (Fig. 6).
Figura 6 - Concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) em
folhas de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51, submetidas a diferentes
concentrações de Cu [ 0, 1,5, 3, 4,5 e 6 (g L-1) – fonte (fungicida óxido cuproso)] via
foliar. Valores médios de cinco repetições biológicas (±SE). Letras maiúsculas indicam
comparações de médias entre os tratamentos pelo teste de Tukey (p<0,05).
Nutrientes minerais
A aplicação de diferentes concentrações de Cu via foliar alterou
significativamente (p<0,05) a concentração de macro e micronutrientes minerais
nas folhas. Dentre os macronutrientes analisados (Tabela 2), houve um aumento
na ordem de 112 e 118% na concentração de Ca e Mg para as concentrações
de 4,5 e 6 g Cu L-1, respectivamente, em relação ao controle. Em contrapartida,
o aumento da concentração de Cu via foliar induziu a uma redução na ordem de
18 e 3% na concentração de K e S, respectivamente. No entanto, o aumento das
concentrações de Cu via foliar não alterou as concentrações de N e P nas folhas.
E
A
B
C
D
28
Por outro lado, para os micronutrientes minerais, observou-se um aumento na
ordem de 861, 980 e 109% e de 107 e 92,5 e 105% na concentração de Fe, Mn
e B nas concentrações 4,5 e 6 g Cu L-1, respectivamente, em comparação ao
controle (Tabela 2). Entretanto, para a concentração de Cu, foi observado um
incremento significativo (p<0,05) com as concentrações crescentes de Cu
aplicadas via foliar, cujos aumentos foram na ordem de 181, 300, 363 e 969%,
nas concentrações de 1,5; 3; 4,5 e 6 g Cu L-1, respectivamente, em relação ao
controle (Fig. 7).
Tabela 2. Concentração de macro e micronutrientes minerais em folhas de plantas
jovens do genótipo de cacau CCN 51, submetidas a diferentes concentrações de Cu [0,
1,5, 3, 4,5 e 6 (g L-1) – fonte (fungicida óxido cuproso)] via foliar. Valores médios de
quatro repetições biológicas (± SE). Letras maiúsculas indicam comparações de médias
entre os tratamentos pelo teste de Tukey (p<0,05).
Parameter
Cu (g L-1)
0 1.5 3.0 4.5 6.0
Macronutrient (g kg-1 DW)
N 30,06±0,80 A 29,18± 0,65 A 30,99±0,63A 30,45 ± 0,34 A 28,25±0,56 A
P 1,11 ± 0,00 A 1,14 ± 0,02 A 1,10 ± 0,01 A 1,13 ± 0,01 A 1,14 ± 0,02 A
K 15,25±0,11A 14,34±0,32AB 13,63 ±0,19 B 13,75 ±0,19 B 13,57±0,17 B
Ca 9,39 ± 0,14 B 9,68 ±0,18 AB 10,45 ±0,31 A 10,09 ± 0,08 A 10,59±0,19 A
Mg 3,60 ± 0,07 B 3,95± 0,05 AB 4,48 ± 0,12 A 4,25 ± 0,08 A 4,50 ± 0,03 A
S 2,05 ± 0,07 A 1,94 ±0,03 B 1,98 ±0,08 B 2,03 ±0,07 A 1,94 ±0,05 B
Micronutrient (mg kg-1 DW)
Fe 13,57±1,18 E 14,24± 1,22 D 98,70 ± 0,89 C 112,66 ± 1,11 B 130,05±0,12A
Zn 41,64±1,32 A 30,08±0,90 D 30,73 ± 0,82 D 32,83 ± 0,65 C 36,61± 0,54 B
Mn 392,93±2,22E 441,53±1,21A 399,45 ± 0,98 D 428,46 ± 3,12 B 422,31±2,78C
B 40,16±0,98B 36,66±1,19 D 35,38 ± 2,00 E 37,23 ± 0,88 C 42,31± 0,64 A
29
Figura 7 - Acúmulo de Cu em folhas de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51,
submetidas a diferentes concentrações de Cu [ 0, 1,5, 3, 4,5 e 6 (g L-1) – fonte (fungicida
óxido cuproso)] via foliar. Valores médios de quatro repetições biológicas (±SE). Letras
maiúsculas indicam comparações de médias entre os tratamentos pelo teste de Tukey
(p<0,05).
Discussão
A toxicidade de Cu promovida pela aplicação do fungicida óxido cuproso
via foliar alterou significativamente as características fisiológicas, bioquímicas e
moleculares das folhas das plantas jovens do genótipo de cacau CCN 15. As
trocas gasosas foliares (A, gs e E) foram severamente afetadas pela aplicação
de Cu via foliar, principalmente nas concentrações 4,5 e 6 g Cu L-1 (Fig 1).
Observou-se que os danos ocasionados pelas concentrações de Cu não foram
de origem difusional e sim de origem bioquímica, visto que não houve alterações
significativas nos valores de gs nas concentrações de 4,5 e 6 g Cu L-1 (Fig. 1). O
que esteve associado a maior concentração de Cu in situ nos tecidos foliares
(Fig. 1 D), o que indica efeito de dose tempo dependente. As alterações nas
trocas gasosas foliares podem ser explicadas, em parte, pelo decréscimo da
expressão de genes psbA e psbO, responsáveis pela biossíntese das proteínas
PsbA e PsbO de PS2 da cadeia transportadora de elétrons na fase fotoquímica
da fotossíntese (Fig. 4A e B).
30
Alterações nas características fotossintéticas podem determinar a
tolerância das plantas à determinada condição de estresse (MEDINA et al., 2009;
DAYMOND et al., 2011). O cobre atua como um elemento estrutural fundamental
de mitocôndrios, cloroplastos e proteínas, como a plastocianina, que está
envolvida na transferência de elétrons entre o PS2 e PS1 na fase fotoquímica da
fotossíntese (ADREES et al., 2015), e pelas alterações na atividade das enzimas
do metabolismo antioxidativo e no teor de TBARS (SHAHID et al., 2017). Por
outro lado, o excesso de Cu em plantas causa a competição com outros íons
metálicos (Zn, Fe e Ni), além da substituição de elementos estruturais em
enzimas, como a ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase (RuBisCO)
(KUPPER; ANDRESEN, 2016).
Severas alterações nas trocas gasosas foliares em resposta ao aumento
da concentração de Cu foi encontrado em T. cacao, com fornecimento de Cu (8
mg L-1) em solução nutritiva (SOUZA et al., 2014), Hymenaea courbaril
(MARQUES et al., 2018), Kandelia obovata (SORRENTINO et al.,2018),
Aegiceras corniculatum e Bruguiera gymnorrhiza (LIU et al., 2009) e Silene
paradoxa (BAZIHINA et al., 2015).
A toxicidade por metais causa foto-oxidação e dissipação de elétrons,
resultando no excesso de formação de espécies reativas de oxigênio (ERO)
(GURURANI et al., 2015). Para manter o equilíbrio redox do metabolismo, as
plantas requerem de um complexo e eficiente sistema enzimático e não
enzimático de destoxificação do excesso de ERO. Neste caso, o sistema
enzimático envolve, principalmente, a atividade de SOD, CAT, GPX e APX
(DRAZKIEWICZ et al., 2003, ROUT ; SAHOO, 2013). Em plantas sob condição
de estresse abiótico ou abiótico as enzimas do sistema antioxidativo são
responsáveis por converter o O2- em H2O2 (CHOUDURY et al., 2016), que é
posteriormente removido pela peroxidases (SONG et al., 2014). A exposição
das plantas do genótipo de cacau CCN 51 às diferentes concentrações de Cu
aplicado via foliar, gerou alterações não somente nos processos fisiológicos,
mas também na atividade das enzimas do metabolismo antioxidativo (SOD,
CAT, GPX e APX), induzido pelo aumento da concentração de ERO. Foi
possível observar um padrão crescente no aumento da atividade destas
enzimas, principalmente nas concentrações correspondentes a 4,5 e 6 g Cu L-1.
31
A SOD é uma das enzimas mais importantes no sistema de defesa
antioxidante das plantas, que tem como função o controle a geração de ERO,
catalisando a dismutação de dois ânions superóxidos em peróxido de hidrogênio
(H2O2) e oxigênio molecular no citosol, nos mitocôndrios e nos cloroplastos
(ZHOU et al., 2017). O aumento da atividade de SOD em nível foliar, em resposta
ao aumento da concentração de Cu, foi relatado também em Elsholtzia
haichowensis (ZHANG et al., 2010), Brassica compestris (LI et al., 2009), Oryza
sativa (MOSTOFA et al., 2015), Brassica juncea (SINGH et al., 2010) e Vitis
vinifera (ZHOU et al., 2018). Para T. cacao, o aumento da atividade das enzimas
antioxidativas, em função do aumento da concentração de Cu aplicado via foliar,
demonstra o sinergismo do sistema antioxidativo, visto que SOD, CAT, APX e
GPX são essenciais na catálise e eliminação dos produtos gerados por ERO (LI
et al., 2018).
Em adição as enzimas do metabolismo antioxidativo, as plantas se
utilizam do sistema antioxidativo não enzimático, responsável pelo acúmulo de
aminoácidos que desempenham um papel importante na mitigação do estresse
osmótico causado por metais pesados (YAN; TAM, 2013). Evidenciou-se nesse
estudo, que o acúmulo de prolina nas folhas foi diretamente proporcional às
concentrações de Cu aplicadas via foliar (Fig. 3). O acúmulo de prolina pode
influenciar a tolerância ao estresse regulando o equilíbrio redox e controlando a
expressão de genes reguladores do crescimento e desenvolvimento das plantas
(SZABADOS; SAVOURCB, 2010). Além disso, a prolina ajuda a manter o
equilíbrio hídrico das células e tecidos, protegendo, dessa forma, a integridade
estrutural de membranas e mitigando a toxicidade por metais pesados (ZHAO et
al., 2016). Desta forma, a prolina é um aminoácido multifuncional nas células,
pelo fato de prevenir a desnaturação das proteínas, auxiliar na homeostase
celular e na extinção de ERO (SINGH et al.,2015). Logo, foi possível observar
que o acúmulo de prolina nas folhas de cacau coincidiu com o aumento da
atividade das enzimas SOD, CAT, APX e GPX.
A aplicação de diferentes concentrações de Cu via foliar promoveu um
aumento significativo no teor de TBARS, resultante da peroxidação lipídica de
membranas celulares (Fig. 5), induzida pelo acréscimo na produção de ERO. O
aumento de TBARS foi diretamente proporcional ao incremento da concentração
de Cu, cujo maior valor coincidiu com a maior atividade das enzimas
32
antioxidativas, com maior teor de prolina livre em nível foliar e com a maior
redução das trocas gasosas foliares. O aumento do teor de MDA, uma das
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, nos tecidos vegetais está associado
à degradação de membranas e de biomoléculas (PIOTTO et al., 2014;
CHOUDURY et al., 2016). Plântulas do genótipo de cacau CCN 51, cultivadas
em concentrações crescentes de Cu em solução nutritiva, apresentaram, 24 h
AAT, na concentração de 8 mg Cu L-1, danos nas membranas tilacoidais dos
cloroplastos das células do mesofilo foliar e redução das trocas gasosas foliares
(SOUZA et al., 2014). Segundo estes autores, houve também, 96h AAT,
aumento da porcentagem de extravasamento de eletrólitos pelas membranas
celulares com o aumento crescente da concentração de Cu (0,005 a 32 mg Cu
L-1) em solução nutritiva.
Outro mecanismo importante desenvolvido pelas plantas, para a
desintoxicação e tolerância a metais tóxicos, é a quelação de metais por ligantes
com alta afinidade, como as metalotioneínas (SRIVASTAVA et al., 2017). O
aumento da expressão relativa do gene Mt2b (Fig 4F), responsável pela
biossíntese de metalotioneínas, observado nas concentrações 4,5 e 6 g Cu L-1,
contribuiu, provavelmente, para a redução da concentração de Cu no citosol, por
meio de seu sequestro, inativação e compartimentalização nos vacúolos
(HASAN et al., 2017). As metalotioneínas são induzidas na presença de metais
tóxicos e estão envolvidas no controle de elementos essenciais e não essenciais
presentes em excesso nas plantas (SOUZA et al., 2014). Estudos realizados com
plântulas de cacau submetidas à toxicidade de Cu em solução nutritiva, indicam
que a indução da expressão de Mt2b pode ser uma estratégia de tolerância para
acumular maior conteúdo de Cu, visando manter o processo metabólico nas
folhas (SOUZA et al., 2014). Maior expressão de Mt2b em plantas de cacau,
submetidas ao estresse por metais tóxicos, tem sido relatado por diversos
autores (SOUZA et al.,2014; CASTRO et al., 2015; ARAÚJO et al., 2017).
No presente trabalho, o aumento da expressão relativa do gene de sod
cyt, responsável pela biossíntese da enzima SOD citoplasmática, nas folhas de
cacau, coincidiu com o aumento da atividade de SOD nas concentrações de 4,5
e 6 g Cu L-1 aplicadas via foliar. A indução pós-transcricional de genes de Cu-Zn-
sod cyt em plantas é crítica para a tolerância ao estresse oxidativo (SUNKAR et
al., 2006). Aumento da expressão do gene sod cyt em folhas de cacau do
33
mesmo genótipo foi, também, observado por Souza et al. (2014), ao avaliarem
a toxidez de Cu em solução nutritiva. O aumento da atividade de SOD e de outras
enzimas do metabolismo antioxidativo atua como indicadores de transcrição na
indução de genes de biossíntese dessas enzimas (SUNKAR et al., 2006).
A toxicidade induzida pela aplicação de diferentes concentrações de Cu
via foliar, induziu a redução da concentração de macro e micronutrientes
minerais (K, S e Zn) nas folhas do genótipo de cacau CCN 51. De acordo com
Souza et al. (2014), o excesso de Cu aplicado em solução nutritiva também
interfere nas concentrações de Mn, Zn, Fe, Mg, K e Ca nos diferentes órgãos
das plântulas do genótipo de cacau CCN 51. No presente trabalho, o aumento
da concentração de Cu no tecido foliar (Fig. 6) contribuiu para as alterações
observadas nos parâmetros avaliados, principalmente nas concentrações de 4,5
e 6 g Cu L-1.
34
Conclusões
A aplicação das diferentes concentrações de Cu via foliar, usando como
fonte o fungicida óxido cuproso, induziu um desequilíbrio do metabolismo celular
em folhas de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51, principalmente nas
concentrações de 4,5 e 6 g Cu L-1.
A toxicidade, provocada pelo excesso de Cu aplicado via foliar, promoveu
modificações nas trocas gasosas foliares, no metabolismo antioxidativo
enzimático e não enzimático e na expressão de genes relacionados ao estresse
oxidativo, à fotossíntese e ao mecanismo de detoxificação celular.
Há um padrão de resposta do tipo dose-tempo dependente, indicando que
houve um sinergismo nas vias de detoxificação celular na eliminação do excesso
de espécies reativas de oxigênio.
35
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