josÉ carlos quilles junior planejamento molecular ... · protozoários e câncer de pâncreas...
TRANSCRIPT
1
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE QUÍMICA DE SÃO CARLOS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: QUÍMICA ORGÂNICA E BIOLÓGICA
JOSÉ CARLOS QUILLES JUNIOR
Planejamento Molecular, Atividade Tripanossomicida e Anticancerígena de
Inibidores Covalentes Reversíveis de Cisteíno Proteases
TESE DE DOUTORADO
SÃO CARLOS, 20 DE MARÇO DE 2019.
2
JOSÉ CARLOS QUILLES JUNIOR
Planejamento Molecular, Atividade Tripanossomicida e Anticancerígena de
Inibidores Covalentes Reversíveis de Cisteíno Proteases
Tese apresentada ao Instituto de Química de São Carlos da
Universidade de São Paulo como parte dos requisitos para a
obtenção do título de Doutor em Ciências.
Área de concentração: Química Orgânica e Biológica
Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto Montanari
SÃO CARLOS, 20 DE MARÇO DE 2019.
3
Aos meus pais, que mesmo com a simplicidade e
dificuldade em entender a grandeza do título,
nunca mediram esforços para que eu chegasse até
aqui!
4
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a DEUS, por ser meu refúgio nos momentos de incerteza e por
me ensinar a aprender intensamente com cada dificuldade, me dando forças para sempre
seguir em frente.
À minha família, meus pais Roseli e José Carlos e meu irmão Matheus. Só nós sabemos
das dificuldades que vocês já passaram para eu chegar onde estou hoje. Cada conquista da
minha vida é dedicada a vocês, que nunca deixaram de me apoiar durante essa longa
caminhada em busca do meu maior sonho. Obrigado por, acima de tudo, me ensinarem os
valores humanos sobre respeito e dignidade, me incentivando sempre a buscar um futuro
melhor, não importando quantos quilômetros poderiam existir entre nós. Que um dia eu seja
capaz de retribuir tudo o que vocês fizeram e significam pra mim, pois eu sei que mesmo com
a distância, eu sempre tenho pra onde voltar.
Ao Prof. Carlos Alberto Montanari, por me aceitar no grupo NEQUIMED e ter
depositado confiança no meu trabalho. Com certeza, a experiência de trabalhar com um dos
mais renomados pesquisadores em química medicinal no Brasil foi essencial para meu
amadurecimento profissional.
Ao Prof. Andrei Leitão, por todas as lições científicas e pessoais compartilhadas. Cheguei
ao grupo sem nunca ter visto uma célula no microscópio, vindo de uma área completamente
diferente durante o mestrado e esforços nunca foram medidos da sua parte, para que eu
pudesse evoluir sempre. Sou extremamente grato pela confiança depositada em mim, tendo
você como exemplo de pesquisador.
Ao meu casal favorito, meus amigos de laboratório, de festas, de tusca e meus afilhados
de casamento, Murillo e Camila. Crescemos e vivemos muito juntos e esses momentos foram
e serão únicos em nossas vidas! Tenho certeza que seguiremos juntos, onde quer que o
futuro nos leve, pois a distância não é nada perto da amizade que construímos.
Ao meu amigo nerd leitor de quadrinhos de super-heróis preferido, Pedro Jataí (quantas
vezes não zoei esse sobrenome, hein?!). Saiba que aprendi muito com você, a cada conversa
e a cada risada em cada almoço. Preciso dizer que admiro de mais seu jeito de ser e de ver a
vida, e que a cada desabafo que fazia com você, sentia o calor do abraço de um amigo,
mesmo que longe. É nóis que voa Pedroka, e ainda vamos voar longe!
À minha amiga de labuta diária, Daiane Tezuka, por, além me ensinar toda a base sobre
os ensaios biológicos, se tornou uma amiga pra vida. Que possamos seguir a vida
compartilhando nossas dificuldades e alegrias, mesmo que em caminhos diferentes. Conte
sempre comigo Dai!
5
Aos demais membros e ex-membros do NEQUIMED: Fabiana Rosini, Elisa Castañeda,
Lucas Trevelin, Fernanda Ribeiro, Daniela de Vita, Samelyn Martins, Monique Souza, Talita
Avarenga, Lorenzo Cianni e Thiago Kelvin. Agradeço também a Dra. Carla Duque e ao Prof.
Sérgio de Albuquerque da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto pelo
suporte com os estudos de infecção e invasão.
Ao desafio pessoal e profissional de viver um ano no exterior. Com certeza, foram
vividos momentos únicos que contribuíram imensamente para meu desenvolvimento como
pesquisador e pessoa. Durante minha estadia em Nottingham, UK, conheci pessoas
maravilhosas que, com certeza, levarei para sempre: Raphael Morales, Andrea Sabatini,
Juliana Akinaga, Viviane Mignone, Júlia Monteiro e Ana Luíza. Agradeço também à Profª Maria
Augusta Arruda, por todo apoio durante a realização do estágio no exterior, principalmente
com todas as burocracias.
À Profª Tracey Bradshaw, por toda orientação, aprendizado e amizade durante minha
estadia na Faculdade de Farmácia da Universidade de Nottingham. Com certeza, um exemplo
de ser humano, gentileza, profissionalismo e sempre disposta em me ajudar em todos os
momentos, profissionais ou pessoais. Aprendi muito com você, e que um dia possamos ter a
oportunidade de trabalhar juntos novamente. Aos amigos do Lab C62 do Centre for
Biomolecular Sciences: Kaouthar Bouzinad, Alastair Breen, Haneen Abuzaid, Mohammed e
Roukee. Ao meu best British friend Gareth Daniel por ser tão solícito em me ajudar em todos
os momentos e por me apresentar bons restaurantes em Nottingham, pelas caronas e por me
convencer de que comida vegetariana não é tão ruim assim, mesmo eu preferindo carne.
Ao Luan Leite, um ursinho que apareceu na minha vida quando eu menos esperava e
mudou tudo pra melhor. Obrigado por me apoiar, por estar ao meu lado e por ser tão
especial. Compartilhar momentos e a vida com você tem sido incrível, e espero que tenhamos
a oportunidade de seguir o futuro juntos.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio
financeiro durante os 36 meses de execução do projeto no Brasil (2014/07292-0).
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte
financeiro durante os 12 meses de estágio no exterior dentro do projeto Drug Discovery em
parceria com a School of Pharmacy – University of Nottingham.
6
“Um dançarino é louco aos olhos dos que não
conseguem ouvir sua música”
The Alienist – Caleb Carr
7
RESUMO
A atividade de cisteíno proteases (CP) tem sido relacionada a diferentes doenças, como
no caso da leishmaniose, doença de Chagas e alguns tipos de câncer. Devido a similaridade
entre as CP presentes em altos níveis nessas células, foi investigada aqui a importância dessas
enzimas para o estabelecimento e desenvolvimento dessas doenças a partir da atividade
biológica in vitro de novas dipeptidil nitrilas inibidoras reversíveis de CP. De maneira geral, as
substâncias apresentaram atividade inibitória de CP nos distintos ensaios, com máximo de
inibição de 42 % para CP expressas por Leishmania spp. e 76 % em relação a atividade de CP
expressas por células de câncer de pâncreas. A atividade citostática foi observada para todos
os tipos celulares após a inibição da atividade de CP. Quando testados em Leishmania spp. o
crescimento celular foi suprimido em pelo menos 67 %, com máximo de inibição de 95% para
o Neq0551 a 10 µM. Em células de câncer de pâncreas, alterações no ciclo celular e supressão
dos processos de migração e formação de colônias foram os resultados mais evidentes, com
redução da formação de colônias das células MiaPaca-2 em 50 % pelo Neq0554 a 10 µM. Já
em relação aos protozoários da cepa Y de Trypanosoma cruzi, os inibidores testados
apresentaram interessante seletividade contra os parasitos em relação à célula hospedeira
LLC-MK2, além de promoverem a supressão de 80% do processo de invasão celular in vitro
quando a célula hospedeira foi previamente tratada com 10 µM do inibidor Neq0662 por 2 h
antes do processo de infecção. Por fim, a encapsulação do Neq0554 em apoferritina
promoveu um incremento na atividade antineoplásica para células de câncer de pâncreas
(IC50 = 79 µM), com aumento da seletividade em relação às células de fibroblasto. De maneira
geral, os resultados corroboram a hipótese da inibição de CP nos sistemas celulares é
eficiente para promover efeitos citostáticos. Além disso, a atividade de CP nas células de
protozoários e câncer de pâncreas apresentou perfil semelhante de ação, nos quais os
inibidores não promoveram a morte em nível significativo das células, mas ressaltaram os
efeitos citostáticos em relação ao crescimento celular.
Palavras chaves: CP, leishmaniose, doença de Chagas, câncer de pâncreas, química
medicinal.
8
ABSTRACT
Cysteine proteases (CP) activity has been related to different pathologies, such as
leishmaniasis, Chagas disease and some types of cancer. Due to the homology between
cysteine proteases expressed by these cellular systems, it was investigated here the
importance of these enzymes for the development and establishment of these diseases based
on the in vitro biological activity of novel reversible cysteine protease inhibitors. In general,
inhibitors had a significant inhibitory activity of cysteine proteases in all assays, with a
maximum inhibition of 42 % for Neq0554 concerning the CP activity expressed by Leishmania
spp. and 76 % to CP activity expressed by pancreatic cancer cells. Different profiles of
biological activity were observed between the cellular systems, but all substances had
significant CP activity suppression, in cytostatic levels after the inhibition of CPA. When the
inhibitors were tested against Leishmania spp., the cell growth was suppressed by at least 67
%, with maximum inhibition of 95% for Neq0551 at 10 μM. Similarly in pancreatic cancer cells,
changes in the cell cycle profile were the most evident results, as well as the suppression of
migration and colony formation ability, with 50 % retention of the colony development of
MiaPaCa-2 cells by Neq0554 at 10 μM. In contrast, to protozoa from Trypanosoma cruzi Y
strain, the inhibitors tested showed an interesting selectivity against the parasites concerning
the host cell LLC-MK2, also promoting the in vitro cell invasion suppression in about 80%
when the host cell was pre-treated with Neq0662 10 μM for 2 h. Finally, the encapsulation of
Neq0554 promoted an increase in its anticancer activity against pancreatic cancer cells, with
IC50 of 79 μM alongside > 200 μM to fibroblast cells, besides increasing its selectivity. In
general, the results corroborate the hypothesis that the inhibition of cysteine proteases in the
cellular systems is efficient to promote cytostatic effects, being an interesting tool to be used
as control and development suppression of some pathologies. Also, CP activity in protozoa
cells and pancreatic cancer showed a similar profile of action, in which cysteine protease
inhibitors did not promote death at a significant level for the cells, but emphasized cytostatic
effects about cell growth.
Key words: cysteine proteases, leishmaniosis, Chagas disease, pancreatic cancer,
medicinal chemistry.
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Interação do sítio catalítico das proteases com o substrato durante a hidrólise da
ligação peptídica. ........................................................................................................................... 23
Figura 2. Mecanismo catalítico de CP na hidrólise de ligações peptídicas. ................................ 24
Figura 3. Representação esquemática do sítio ativo e de interação das CP com o substrato. . 25
Figura 4. Mecaniso geral de ativação de proteases. Proteases geralmente são expressas como
um zimogênio inativo e são ativadas por diversos mecanismos, incluindo modificações pós-
translacionais (MPT), ligação de um cofator, mudanças de pH e remoção do prédomínio. .... 26
Figura 5. Mecanismo geral de inibição covalente de cisteíno proteases por dipeptidil
nitrilas.........................................................................................................................................28
Figura 6. Arcabouço químico das dipeptidil nitrilas estudadas como inibidores covalentes
reversíveis de cisteíno proteases. ................................................................................................. 29
Figura 7. Status de endemicidade mundial da leishmaniose visceral. ........................................ 31
Figura 8. Ciclo de vida dos protozoários do gênero Leishmania spp. ......................................... 33
Figura 9. Atividade leishmanicida dos inibidores reversíveis de CP. A viabilidade celular foi
verificada pelo método colorimétrico MTT após 72 h de incubação com os inibidores a 100
µM. ................................................................................................................................................. 40
Figura 10. Cronograma de incubação e execução dos experimentos (A). Durante 96 h o
crescimento da forma promastigota dos protozoários L. amazonensis e L. infantum foi
investigado na presença dos inibidores a 10 µM (B). Após 96 h, os parasitos L. infantum
(barras azuis escuras) e L. amazonensis (barras azuis claras) foram centrifugados e incubados
em meio de cultura sem os inibidores por 48 h (C). Os experimentos foram realizados em
triplicada e a análise estatística pelo teste de Dunnett foi realizada comparando as amostras
com o controle negativo de cada espécie considerando valores de P < 0.05. .......................... 43
Figura 11. Análise do perfil ciclo celular por citometria de fluxo (A) e histograma (B) de
promastigotas de L. infantum incubadas por 72 h com 10 µM dos diferentes inibidores. Como
controle positivo foi utilizado o inibidor irreversível de CP E-64. Resultados obtidos a partir de
experimento em triplicata, com desvio padrão menor do que 8% para todas as análises. ...... 45
Figura 12. Padronização da relação entre o número de protozoários e a unidade de
fluorescência relativa (UFR) da forma promastigota dos protozoários L. infantum e L.
10
amazonensis incubados com o substrato fluorogênico Z-FR-MCA a 10 e 20 µM por 3 h (A). Em
seguida, a viabilidade celular e atividade proteolítica da forma promastigota do protozoário L.
amazonensis foi avaliada após incubação por 24 h com diferentes concentrações do inibidor
covalente irreversível E-64 (B). Para confirmar a seletividade do substrato referente à
atividade de CP, a inibição da atividade proteolítica de promastigotas de L. amazonensis foi
realizada utilizando inibidores seletivos para cada classe enzimática: (MMTS) cisteíno, (PMSF)
serino e (EDTA) metalo proteases na concentração de 250 µM. Como controle foi utilizado o
coquetel de inibição de protease comercial (C). O teste de Tukey de comparação de médias
foi realizado com valores de p < 0,05. .......................................................................................... 47
Figura 13. Atividade proteolítica do extrato enzimático obtido a partir da lise celular de
promastigotas de L. amazonensis e L. infantum incubados com os inibidores de CP. Análise
estatística foi realizada comparando a média de cada tratamento com o controle para cada
espécie de Leishmania, considerando p < 0,05. MMTS foi utilizado como controle positivo de
inibição da atividade proteolítica total. ........................................................................................ 51
Figura 14. Ciclo de vida do protozoário Trypanosoma cruzi. ...................................................... 55
Figura 15. Mecanismo de ação proposto para os fármacos Benzonidazol e Nifurtimox para o
tratamento da doença de Chagas................................................................................................. 56
Figura 16. Viabilidade celular da célula hospedeira LLC-MK2 e da forma tripomastigota de T.
cruzi cepla Y incubada por 24 h com os inibidores a 10 µM (A). O teste t não pareado foi
realizado para verificar a diferença significativa entre a seletividade para hospedar e as células
parasitos com valores de P <0,05. Também foram realizadas comparações múltiplas pelo
teste de Dunnet entre a atividade biológica de dos inibidores de CP e o fármaco de referência
benzonidazol contra tripomastigotas da cepa Y de Trypanosoma cruzi, com base em valores
de P <0,05
(B)...............................................................................................................................................66
Figura 17: Supressão da infecção in vitro pela cepa tripomastigota de T. cruzi em células
LLCMK-2 é promovida pelos inibidores da cruzipaína sob tratamento diferenciado: célula
hospedeira previamente tratada com os inibidores por 2 h (barras azuis); tripomastigota pré-
tratado por 2 h com os inibidores (barras verdes) e infecção parasitária na presença de IPC
(barras púrpuras) (A). Estrutura química dos inibidores de cruzipaína mais potentes para o
ensaio de invasão (B). .................................................................................................................... 71
Figura 18. Processo geral de formação de metástase por células cancerosas. ......................... 74
11
Figura 19. Os inibidores de CP não apresentam atividade citotóxica para a linhagem
metastática de câncer de pâncreas MiaPaCa-2 e em fibroblastos Balb/C 3T3 clone A-31. ...... 82
Figura 20. Atividade relativa do extrato celular a partir da conversão do substrato seletivo
para CP (Z-FR-MCA) utilizando inibidores específicos para cada classe enzimática: (PMSF)
serino, (MMTS) cisteíno e (EDTA) metalo proteases na concentração de 250 µM (A).
Estruturas químicas dos inibidores padrões utilizados no ensaio de padronização (B) e do
substrato Z-FR-MCA (C). ................................................................................................................ 83
Figura 21. Número de colônias (A), área total (B) e diâmetro (C) das colônias formadas pelas
células MiaPaCa-2 após 72 h de incubação com os inibidores. As imagens dos dois melhores
inibidores são mostradas na figura (D). O ensaio de migração celular foi realizado a partir da
contagem do número de células capazes de migrarem fisicamente pelo inserto, comparado
com o controle sem tratamento (E). Análise estatística foi baseada no teste de comparações
múltiplas com o controle, considerando p < 0,05. ...................................................................... 87
Figura 22. Análise do ciclo celular por citometria de fluxo das células de câncer de pâncreas
MiaPaCa-2 incubadas com inibidores a 10 µM por 24 h. Os resultados foram obtidos a partir
de experimento em duplicata e análise de significância foi realizada com p < 0,05 em relação
ao controle. .................................................................................................................................... 89
Figura 23. Análise do crescimento celular dos esferoides de células MiaPaCa-2 incubadas com
Neq0551 e Neq0554 a 100 µM. A imagem dos esferoides ao final do experimento é
apresentada para cada condição experimental. O ensaio foi realizado em quadruplicado com
desvio padrão apresentado. Experimento realizado pelo Mestre Murillo Dorilleo Leite
Bernardi. ......................................................................................................................................... 90
Figura 24. Análise da terapia combinada dos ICP a 10 µM e gencitabina a 200 nM em
diferentes condições. (A) Tratamento para células de câncer de pâncreas da linhagem
MiaPaCa-2 com os inibidores de CP combinados com gencitabina por 24, 48 e 72 h. (B)
Células pré-tratadas com os inibidores 24 h antes do tratamento com gencitabina por 48 h.
(C) Índice de combinação das razões entre os inibidores e gencitabina por 72 h. Análise de
significância foi realizada, considerando p > 0,05. ...................................................................... 93
Figura 25. Diferentes nanopartículas utilizadas como carreador de fármacos e seus
respectivos tamanhos. .................................................................................................................. 98
Figura 26. Estrutura da ferritina humana. .................................................................................... 99
12
Figura 27. Encapsulação das substâncias em AFt por difusão (A). Eletroforese não
desnaturante da AFt e das nanoformulações (B). Análise da integridade da estrutura da
molécula de AFt por DLS (C). Liberação in vitro das substâncias encapsuladas em ambiente
ácido (pH 5.5) e fisiológico (pH 7.4) a 37°C (D). ......................................................................... 106
Figura 28. Análise da expressão do receptor de transferrina (TfR1) pelas linhagens MRC-5,
MiaPaCa-2 e HCT-116 (A). Como controle da concentração proteica, a expressão da proteína
GAPDH foi analisada em condições normais de cultivo celular. Concentração resposta do
Neq0554 livre (curvas vermelhas) e da nanoformulação Neq0554-AFt (curvas azuis) testados
nas linhagens de câncer de pâncreas MiaPaCa-2 (B), HCT-116 (C) e fibroblasto humano MRC-5
(D). ................................................................................................................................................ 109
Figura 29. Histograma do perfil do ciclo celular analisado por citometria de fluxo das células
de HCT-116 incubadas com o Neq0554 e Neq0554-AFt por 48 h a 10 e 100 µM (A) e
representação gráfica dos resultados para as linhagens HCT-116 e MiaPaCa-2 (B). .............. 110
Figura 30. Número de colônias das linhagens HCT-116 e MiaPaCa-2 (A) obtidas após 24 h de
incubação com o Neq0554 livre e encapsulado a 100 µM (B). ................................................. 112
Figura 31. Inibição da atividade de catepsina L em linhagens de HCT-116 (A) MiaPaCa-2 (B)
incubadas por 12 h com diferentes concentrações de Neq0554 (linhas azuis) e a
nanoformulação Neq0554-AFf (linhas verdes). Inibição da atividade de catepsina L na
concentração de 50 µM para o Neq0554 livre e encapsulado incubados por 12 h com HCT-116
(C) e MiaPaCa-2 (D). As imagens foram obtidas por microscopia confocal, analisando a
intensidade da conversão por célula do substrato fluorescente Magic-Red, marcada com
DAPI. Como controle, foram utilizadas as células sem tratamento, somente com meio de
cultura (linhas vermelhas). O uso da apoferritina sem inibidores não interferiu na atividade
enzimática e foi aplicado como controle do carreador (dados não apresentados). ............... 114
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Espécies do gênero Leishmania spp. responsáveis por diferentes formas clínicas de
Leishmaniose. ................................................................................................................................ 32
Tabela 2. Estrutura química dos inibidores estudados e radicais substituintes em cada posição.
Inibição do crescimento (IC) e da atividade proteolítica (IAP) do extrato enzimático obtido a
partir da lise de promastigotas de L. amazonensis e L. infantum incubados com diferentes
compostos a 100 µM. .................................................................................................................... 49
Tabela 3. Inibição relativa (%) da atividade proteolítica (IAP) baseado na hidrólise do substrato
fluorescente seletivo para CP Z-FR-MCA utilizando a morfologia amastigota (intacta), e lisados
celulares de epimastigota e tripomastigota de Trypanosoma cruzi. .......................................... 63
Tabela 4. Índice citotóxico contra a célula hospedeira isolada (EC50 para LLC-MK2) e as cepas
intracelulares Tulahuen e Y de T. cruzi (IC50). O índice de seletividade (IS) é mostrado como a
relação EC50 / IC50. ......................................................................................................................... 68
Tabela 5. Inibição da atividade proteolítica (ICP) do extrato enzimático obtido a partir da lise
celular e estrutura química dos inibidores. Os resultados foram obtidos a partir de
experimentos com N = 4 e DP > 10%. .......................................................................................... 85
Tabela 6. Parâmetros de encapsulação dos inibidores de CP no interior das moléculas de
apoferritina, rendimento de encapsulação (RE) e caracterização do potencial zeta (E0) dos
sistemas encapsulados. Os ensaios foram realizados em triplicata, com erro < 0,5 para os
ensaios de potencial zeta, considerando E0 = -8,60 para apoferritina sem inibidor. .............. 104
Tabela 7. Atividade biológica antes e após encapsulação em AFt dos inibidores de CP em
relação ao crescimento celular das linhagens de câncer de pâncreas MiaPaCa-2 e colo retal
HCT-116. Fibroblasto humano MRC-5 foram utilizados como controle de citotoxicidade e
seletividade. Os valores de IC50 (µM) foram obtidos a partir da incubação das substâncias por
72 h e determinado pelo ensaio colorimétrico MTT. ................................................................ 108
14
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AFt – apoferritina
AP – aspartato proteases
CP – cisteíno protease
CPA – cisteíno protease do tipo A
CPB – cisteíno protease do tipo B
CPC – cisteíno protease do tipo C
CTSB – catepsina B
CTSL – catepsina L
DMSO – dimetil sulfóxido
EC50 – atividade citotóxica
EDL – espalhamento dinâmico de luz
FBS – Soro fetal bovino
IAP – inibição da atividade proteolítica
IC50 – inibição do crescimento em 50%
INCA – Instituto Nacional do Câncer
IS – índice de seletividade
L. – Leishmania
MP – metalo protease
MTT – brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-ipheniltetrazólio)
Neq – abreviação do código NEQUIMED para as substâncias estudadas
PBS – Tampão fosfato salino
PMS – metossulfato de fenazina
SP – serino protease
T. cruzi – Trypanosoma cruzi
TP – treonino proteases
Z-FR-MCA – carbobenzoxicarbonil-Phe-Arg-7-amido-4-metilcoumarina
15
ÍNDICE
CAPÍTULO 1 - Introdução e Revisão Bibliográfica .................................................... 19
1.1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 20
1.2. OBJETIVO GERAL ............................................................................................................. 21
1.3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA GERAL ...................................................................................... 21
1.3.1. A Química Medicinal e o descobrimento de fármacos .............................................. 21
1.3.2. Cisteíno Proteases (CP) ................................................................................................ 22
1.3.3. Cisteíno proteases como alvo terapêutico ................................................................. 25
1.3.4. Inibidores de cisteíno proteases .................................................................................. 27
CAPÍTULO 2 - Inibição da atividade de CP e efeitos biológicos em
protozoários do gênero Leishmania. ............................................................................ 30
2.1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................................. 31
2.1.1. Leishmaniose no contexto global ................................................................................ 31
2.1.2. Ciclo de vida e tratamento .......................................................................................... 32
2.1.3. CP do tipo B – CPB ....................................................................................................... 34
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................. 35
2.3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 36
2.3.1. Protozoários ................................................................................................................. 36
2.3.2. Atividade leishmanicida ............................................................................................... 36
2.3.2.1. Método colorimétrico – MTT ................................................................................... 36
2.3.2.2. Densidade celular por citometria de fluxo ............................................................... 37
2.3.3. Ciclo celular .................................................................................................................. 37
2.3.4. Atividade proteolítica de Leishmania spp. ................................................................. 37
2.3.4.1. Atividade proteolítica em promastigotas ................................................................ 37
2.3.4.2. Atividade proteolítica em lisados celulares ............................................................. 38
2.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................. 39
2.4.1. Efeito citotóxico contra a forma promastigota .......................................................... 39
2.4.2. Efeito citostático : inibição do crescimento parasitário e ciclo celular ..................... 40
2.4.3. Avaliação da inibição da atividade proteolítica nas células parasitárias ................. 45
2.5.CONCLUSÕES PARCIAIS .................................................................................................... 51
CAPÍTULO 3 - Importância da atividade de cisteíno proteases durante a
infecção in vitro de protozoários Trypanosoma cruzi. ............................................ 53
16
3.1.REVISÃO BIBLIOGRAFICA .................................................................................................. 54
3.1.1.A Doença de Chagas e alternativas terapêuticas........................................................ 54
3.1.2. Cruzipaína como alvo terapêutico. ............................................................................. 56
3.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................... 57
3.3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 58
3.3.1. Trypanosoma cruzi ...................................................................................................... 58
3.3.2. Células LLC-MK2 ........................................................................................................... 58
3.3.3. Atividade tripanossomicida ......................................................................................... 58
3.3.3.1. Método colorimétrico – MTT ................................................................................... 58
3.3.3.2. Densidade celular por citometria de fluxo ............................................................... 59
3.3.4. Atividade proteolítica .................................................................................................. 59
3.3.4.1. Atividade em amastigota extracelular .................................................................... 59
3.3.5. Avaliação da atividade tripanossomicida em amastigota intracelular ..................... 60
3.3.5.1. Cepa Tulahuen .......................................................................................................... 60
3.3.5.2. Cepa Y ........................................................................................................................ 60
3.3.6. Ensaios de invasão e índice de internalização ............................................................ 61
3.4.RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................................. 61
3.4.1. Avaliação da inibição da atividade proteolítica ......................................................... 61
3.4.2. Avaliação da seletividade dos inibidores .................................................................... 64
3.4.3. Inibição do crescimento de amastigotas intracelulares ............................................ 66
3.4.4. Avaliação da supressão da invasão in vitro dos protozoários pelos inibidores ........ 69
3.5. CONCLUSÕES PARCIAIS ................................................................................................... 72
CAPÍTULO 4 Atividade Antineoplásica de inibidores de cisteíno proteaseas na
linhagem celular de câncer de pâncreas MiaPaCa-2. ............................................. 73
4.1. REVISÃO BIBLIOGRAFICA ................................................................................................. 74
4.1.1. Câncer e Metástase ..................................................................................................... 74
4.1.2. Câncer de Pâncreas e Catepsina L .............................................................................. 75
4.1.3. Terapia combinada como alternativa terapêutica .................................................... 76
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................. 77
4.3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 78
4.3.1. Cultura Celular ............................................................................................................. 78
4.3.2. Viabilidade Celular ....................................................................................................... 78
17
4.3.3. Inibição da atividade de cisteíno protease ................................................................. 78
4.3.4. Crescimento celular ..................................................................................................... 79
4.3.5. Análise do ciclo celular ................................................................................................ 79
4.3.6. Ensaios citostáticos: migração celular e formação de colônias ................................ 79
4.3.7. Ensaios de terapia combinada com gencitabina ....................................................... 80
4.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................. 81
4.4.1. Atividade anticangerígena de inibidores de CP .......................................................... 81
4.4.2. Inibição da atividade intracelular de CP expressas por MiaPaCa-2 .......................... 82
4.4.3. Estudo citostático: ensaio clonogênico e migração celular ....................................... 85
4.4.4. Análise do ciclo celular ................................................................................................ 88
4.4.5. Avaliação em modelo 3D de cultura celular ............................................................... 89
4.4.6. Terapia combinada com gencitabina ......................................................................... 91
4.5. CONCLUSÕES PARCIAIS ................................................................................................... 94
CAPÍTULO 5 - Encapsulação de substâncias bioativas com potencial
anticancerígeno em apoferritina para o tratamento de câncer. .......................... 95
5.1. REVISÃO BIBLIOGRAFICA ................................................................................................. 96
5.1.1. Importância da catepsina L para o câncer colo retal de pâncreas ........................... 96
5.1.2. Sistema de entrega de fármacos (SEF) ....................................................................... 97
5.1.3. Apoferritina como carreador molecular ..................................................................... 98
5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................ 100
5.3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................ 100
5.3.1. Encapsulação das substâncias .................................................................................. 100
5.3.2. Caracterização das nanoformulações (inibidores encapsulados) ........................... 101
5.3.3. Determinação da taxa de liberação in vitro das substâncias encapsuladas .......... 101
5.3.4. Avaliação da atividade biológica das substâncias encapsuladas ............................ 102
5.3.5. Análise da expressão do TfR-1 por Western blot (WB) ............................................ 102
5.3.6. Quantificação da atividade in vitro de catepsina L .................................................. 102
5.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................... 103
5.4.1. Encapsulação e caracterização das nanoformulações. ........................................... 103
5.4.2. Avaliação da atividade antineoplásica das substâncias encapsuladas .................. 106
5.4.3. Análise da supressão do crescimento celular ........................................................... 109
5.4.4. Inibição in vitro da catepsina L em células cancerosas ............................................ 112
18
5.5. CONCLUSÕES PARCIAIS ................................................................................................. 115
CAPÍTULO 6 - Conclusão Geral .................................................................................... 117
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................ 118
ANEXO I ................................................................................................................................... 135
ANEXO II .................................................................................................................................. 144
19
CAPÍTULO 1
Introdução e
Revisão Bibliográfica
20
1.1. INTRODUÇÃO
A necessidade de descoberta e desenvolvimento de novas substâncias bioativas com
potencial para conter a progressão e resistência de doenças aos tratamentos existentes
justifica a busca por novas alternativas terapêuticas. Atualmente, a Doença de Chagas e a
Leishmaniose são duas principais parasitoses presentes no Brasil, infectando cerca de um
milhão de pessoas anualmente. Apesar de muito tempo relatadas, poucos são os tratamentos
existentes e nenhum deles apresenta eficácia para todas as fases das doenças. Estudos vêm
sendo desenvolvidos com o foco no controle e cura das parasitoses, sendo que CP são alvos
promissores para o desenvolvimento de novos candidatos a fármacos devido às suas funções
essenciais durante processo de infecção e o ciclo de vida dos protozoários. Deste modo,
dipeptidil nitrilas inibidoras covalentes reversíveis de CP têm sido estudadas no grupo de
pesquisa NEQUIMED.
Essas enzimas são análogas àquelas expressas por diversos organismos, dentre elas as
cisteíno catepsinas humanas, que têm sido reportadas como importantes em alguns tipos de
câncer, como no câncer de pâncreas. Esse tipo de neoplasia apresenta grande potencial
metastático, além de difícil diagnóstico no início do desenvolvimento tumoral, evidenciando o
alto índice de mortalidade entre os pacientes. Além dessas características patológicas,
limitações em relação às terapias existentes também tornam necessária a busca por
tratamentos mais eficazes e seletivos.
Entretanto, uma das maiores barreiras durante o processo de descoberta de um
fármaco é a baixa seletividade, o que pode resultar em severos efeitos colaterais. Sistemas
baseados no processo de encapsulação e entrega de fármacos têm sido amplamente
explorados para contornar esse problema, aumentando a eficiência e seletividade de
substâncias bioativas no tratamento de diversas doenças, como o câncer. Baseado nessas
informações, a busca por novas substâncias com potencial biológico e nanoformulações que
podem aumentar a potência ou seletividade de inibidores de CP foram explorados nesse
trabalho.
21
1.2. OBJETIVO GERAL
O trabalho foi baseado na hipótese de que a inibição de cisteíno proteases presentes
em diferentes tipos celulares pode ser caracterizada como alternativa para o tratamento de
doenças parasitárias e neoplasia. Novas dipeptidil nitrilas, planejadas e sintetizadas pelo
grupo NEQUIMED, foram aplicadas como inibidores covalentes reversíveis de cisteíno
proteases com o intuito de avaliar a atividade biológica frente aos distintos tipos celulares,
bem como a avaliação da supressão da atividade das cisteíno proteases expressas por essas
células.
1.3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA GERAL
1.3.1. A Química Medicinal e o descobrimento de fármacos
As modificações químicas de pequenas moléculas e sua avaliação em sistemas
biológicos deram início ao nascimento da química medicinal no século 19. Além disso,
estudos de receptores biológicos e especificidade de enzimas também fazem parte do marco
da multidisciplinariedade que a deu origem [1]. Como ideia principal, a química medicinal
abrange a concepção da criação e modificação de substâncias que podem apresentar efeito
biológico no tratamento, prevenção ou cura de doenças [2]. Desde então, a pesquisa e
desenvolvimento de novos fármacos contam com o importante papel da química medicinal
nesse processo, que utiliza técnicas e conhecimento de diferentes áreas tendo como raízes a
química e a biologia [1].
O desenvolvimento e descoberta de um novo fármaco se iniciam a partir da
necessidade de substâncias bioativas adequadas para tratar ou conter determinada doença,
seja nova ou já existente, mas ainda com tratamentos ineficazes [3]. Nesse sentido, a química
medicinal agrega diversas áreas do conhecimento para a descoberta e desenvolvimento de
novas substâncias. Além disto, a incorporação de novas tecnologias para a otimização de
propriedades físico-químicas problemáticas em novas substâncias bioativas levou a
introdução de novos tipos de formulações (especialmente advindas da nanotecnologia) de
carreamento de fármacos.
22
O processo de identificação e validação de um alvo molecular é uma etapa que precede
a descoberta e desenvolvimento de um fármaco [4]. Um alvo é tido como uma
macromolécula que possui um sítio de interação com a substância bioativa, no qual essa
interação promove efeitos terapêuticos para a doença [5]. Assim, a estrutura e propriedades
da macromolécula alvo devem ser conhecidas a fim de obter um reconhecimento específico
entre a substância e o alvo molecular [5, 6].
Algumas classes de macromoléculas são identificadas por meio da formação de
interações com substâncias químicas, dentre elas proteínas, polissacarídeos, ácidos nucleicos
e lipídeos, dentre os quais as proteínas são os principais alvos na busca por substâncias com
potencial biológico [8]. Porém, devido ao papel de muitas proteínas na regulação de
sinalizações celulares, além da identificação de semelhança entre proteínas de diferentes
tecidos e organismos, torna-se ainda mais importante a seletividade da substância candidata
a fármaco em relação ao seu alvo macromolecular.
1.3.2. Cisteíno Proteases (CP)
Proteínas estão entre os polímeros biológicos mais estáveis estruturalmente, podendo
resistir a altas temperaturas ou severas condições de pH, porém, estas podem ser degradadas
por proteases específicas. A descoberta da tripsina por Corvisart em 1856 foi um dos marcos
no estudo de proteólise e, desde então, proteases têm sido estudadas e relacionadas a
diversos processos biológicos [9]. Devido à sua evolução, as proteases têm se adaptado a
diferentes condições nos diversos organismos que estão presentes, como variações de pH,
ambiente redutor entre outros [10]. A atividade proteolítica pode ser regulada de diversas
maneiras, como a compartimentalização na célula ou expressão seletiva em determinados
tecidos, controle do pH ou ativação por reguladores, dependendo do tipo de protease e da
via celular que a mesma participa [11].
Peptidase é a classificação dada pela União Internacional de Bioquímica e Biologia
Molecular (IUBMB) para todas as enzimas proteolíticas [12] que têm como função básica a
hidrólise de ligações peptídicas entre aminoácidos em peptídeos ou proteínas [13]. Os
principais critérios de classificação bioquímica das peptidases são baseados no tipo de reação
catalisada, na composição do sítio catalítico e na relação estrutural evolutiva [14]. A grande
família de proteases é classificada de acordo com o sítio de clivagem da ligação peptídica na
estrutura do substrato. Quando a clivagem ocorre no interior da estrutura peptídica, a
23
protease é denominada endopeptidase, enquanto que se a quebra da ligação peptídica
ocorre nas extremidades, denomina-se exopeptidases [15].
Em relação ao mecanismo catalítico, as proteases são divididas como aspartato
proteases (AP), serino proteases (SP), treonino proteases (TP), metalo proteases (MP) e CP
(CP) [16]. Do ponto de vista catalítico, as proteases formam ligação covalente com o substrato
durante a hidrólise da ligação peptídica em alguns casos (Figura 1). MP e AP não participam
covalentemente da catálise, mas promovem a hidrólise da ligação peptídica a partir do
mecanismo ácido-base. Em contraste, as SP, TP e CP participam ativamente da reação
catalítica, no qual os resíduos dos amino ácidos que são responsáveis por efetuar o ataque
nucleofílico dão origem a sua classificação [9]. Todas as proteases, assim como as enzimas de
maneira geral, promovem a redução da energia necessária para alcançar o estado de
transição, aumentando a velocidade da reação. Esse estado de transição leva a um
intermediário tetraédrico, que é um precursor da clivagem da ligação peptídica em todas as
proteases.
Figura 1. Interação do sítio catalítico das proteases com o substrato durante a hidrólise
da ligação peptídica.
FONTE: adaptado de DRAG & SALVESEN, 2010 [9].
O mecanismo de catálise geral de CP se inicia a partir da formação do par iônio entre os
resíduos de histidina e a cisteíno, formando a díade catalítica como os grupos tiolato e
imidazol (Figura 2). O tiolato atua como nucleófilo, efetuando o ataque nucleofílico ao
carbono deficiente em elétrons presente no substrato, formando o primeiro intermediário
tetraédrico. Essa espécie é caracterizada pela ligação covalente com o resíduo de cisteíno
24
presente no sítio ativo da enzima, responsável por estabilizar o estado de transição. A partir
do rearranjo de elétrons e posterior quebra de ligação, a porção amino da cadeia peptídica é
liberada e um segundo intermediário acil é formado. Na próxima etapa, a água atua como
nucleófilo, atacando o carbono da ligação tiol, liberando a porção ácida do peptídeo e
regenerando a enzima [17].
Figura 2. Mecanismo catalítico de CP na hidrólise de ligações peptídicas.
FONTE: adaptado de FRICKER, et al., 2010 [17].
Além do sítio de interação responsável pela atividade catalítica das CP, outros
importantes pontos de estudos na pesquisa de inibidores dessas enzimas estão relacionados
com sua estrutura (Figura 3). A interação entre o substrato e a estrutura enzimática ocorre
por bolsões de aminoácidos, chamados de subsítios. Os subsítios voltados para a parte N-
terminal do substrato são nomeados S1-Sn, bem como os respectivos sítios de interação
presentes no peptídeo (P1-Pn). Para a parte C-terminal do substrato, as regiões de interação
da enzima são chamadas S1’-Sn’, e o mesmo segue para os grupos de interações presentes no
substrato (P1’-Pn’) [18]. Dessa maneira, enquanto o sítio catalítico é responsável por
promover a atividade enzimática, os subsítios têm importante papel durante o
reconhecimento e seletividade do substrato.
Enzima Livre Intermediário Tetraédrico
Acil-enzima
25
Figura 3. Representação esquemática do sítio ativo e de interação das CP com o
substrato.
FONTE: adaptado de TURK, 2006 [10].
1.3.3. Cisteíno proteases como alvo terapêutico
A atividade proteolítica é uma característica essencial durante muitos processos
celulares, como desenvolvimento e diferenciação celular e resposta imune. Entretanto, a
irreversibilidade da reação exige que a atividade proteolítica seja rigorosamente controlada
[18]. Grande parte das proteases é expressa como zimogênio, uma estrutura inativa devido à
presença de um pró-domínio responsável pela inativação proteica. Já as proteases que não
são expressas com pró-domínios inibitórios requerem cofatores ou modificações traducionais
para sua atividade. A remoção do pró-domínio pode ocorrer pela ação de outra protease ou
autocatálise. Uma vez ativa, a enzima pode ser limitada por fatores endógenos ou sofrer a
degradação proteica pelo proteasoma (Figura 4) [19]. Além dos processos de regulação, a
atividade proteolítica também é dependente de vários fatores, como o tipo celular em que é
expressa e o compartilhamento na célula [10].
26
Figura 4. Exemplo de mecanismo de ativação de proteases. Proteases geralmente são
expressas como um zimogênio inativo e são ativadas por diversos mecanismos, incluindo
modificações pós-translacionais (MPT), ligação de um cofator, mudanças de pH e remoção do
prédomínio.
FONTE: adaptado de SANMAN & BOGYO, 2014 [19].
Além disso, as proteases também participam de importantes vias para o
desenvolvimento celular, no qual o equilíbrio entre suas funções deve ser considerado
durante a pesquisa por moléculas bioativas com capacidade inibitória de proteases. Devido a
sua importância e regulação controlada, inibidores com atividade biológica devem ser
cuidadosamente planejados.
Proteases têm sido validadas como alvos terapêuticos para diferentes doenças [17]. A
peptdisase NS3/NS2B é uma SP responsável por clivar proteínas do sistema hospedeiro
contribuindo para a maior virulência da dengue [20]. Durante a replicação e invasão viral, essa
protease é responsável pela degradação proteica citoplasmática na célula hospedeira,
incluindo a ação de enzimas como a helicase, atuando alteração da ativação do sistema
imunológico [21]. De maneira similar, o complexo NS3/NS2B também apresenta importante
papel no desenvolvimento da hepatite C, sendo considerado um alvo relevante para o
desenvolvimento de fármacos para o tratamento da doença [22]. Ainda sobre proteases
como alvo terapêutico em doenças virais, a HIV-1 protease tem sido essencial para maturação
viral [23]. Outra SP, a NARC-1 é considerada como alvo validado para a degradação e redução
dos níveis plasmáticos de colesterol no tratamento da aterosclerose [15, 16].
Com 25% de identidade com cisteíno catepsinas, as AP BACE1 e BACE2 são outro
exemplo de importantes proteínas no desenvolvimento da diabetes mellitus, sendo validadas
Inibidor de protease
Zimogênio inativo
Remoção do pré-dominio Degradação
Inibição
Protease ativa
Fatores externos
MPT
27
como alvos para seu tratamento desde 2011 [24]. Além do distúrbio metabólico, a BACE1
também tem sido correlacionada com a acumulação de amiloides em células neurais, uma
característica da doença de Alzheimer e devido a isso, inibidores de BACE1 tem sido
desenvolvidos como alternativa terapêutica para a neuropatologia [25], porém ainda sem
nenhum sucesso clínico evidenciado.
CP também têm sido relatadas como importantes enzimas durante processos críticos
como invasão e evasão do sistema imune em diversas parasitoses [26]. Doença de Chagas e
Leishmaniose são duas importantes parasitoses que apresentam algumas características em
comum, como a importância de uma cisteíno protease fundamental para os processos de
infecção e sobrevivência do parasito no hospedeiro vertebrado [27–30]. Além disso, cisteíno
catepsinas são CP lisossomais com funções essenciais no desenvolvimento de tumores e
super expressas em alguns casos, como no câncer de pâncreas [31–33]. Além de CP, outras
proteases também são consideradas alvos para o tratamento de infecções, o que justifica o
fato de quase 40% dos fármacos disponíveis atualmente serem inibidores proteolíticos [23].
1.3.4. Inibidores de cisteíno proteases
Pequenas moléculas baseadas no mecanismo da atividade enzimática têm sido
estudadas recentemente como uma forma de modular a atividade enzimática em diferentes
tipos celulares [34]. Inibidores covalentes são compostos químicos com características de se
ligarem a um alvo macromolecular por meio de uma ligação covalente e suprimir sua função
biológica. Esse conceito na descoberta de fármacos adota uma concepção distinta em relação
ao mecanismo de ação de outros tipos de inibidores, que somente utilizam interações
intermoleculares fracas [35]. Inibidores enzimáticos covalentes irreversíveis reagem com a
enzima alvo, inativando-a permanentemente, sendo necessário que a célula expresse o alvo
novamente para reverter a ação do fármaco. Devido à ligação covalente estável, que é
irreversível, efeitos colaterais severos podem ser observados pela promiscuidade do inibidor
frente a outras moléculas presentes no meio. Esse fenômeno é conhecido como efeito “off-
target”. Outro ponto importante a ser considerado é a maior dificuldade na análise de
metabólitos destes inibidores covalentes irreversíveis, uma vez que pode haver ligação com
as enzimas ou até pequenas moléculas [36].
De forma oposta aos inibidores irreversíveis, os inibidores reversíveis que formam
interações moleculares com a macromolécula estão em equilíbrio com esta proteína alvo.
28
Entretanto, este tipo de inibidor nem sempre é atrativo para ser desenvolvido em enzimas
onde o sítio de interação está muito exposto e que depende de um grande número de
interações para que o reconhecimento molecular seja considerável, como é o caso das
cisteíno proteases.
Uma alternativa factível engloba o estudo de inibidores covalente reversíveis, onde a
ligação covalente é realizada entre o átomo reativo do aminoácido situado no sítio catalítico e
um grupo reativo da substância bioativa (comumente denominado “warhead”).
Diferentemente dos covalentes irreversíveis, esta ligação química é lábil e pode ser rompida,
com o retorno do sistema ao estado inicial. Desta forma, espera-se que este tipo de inibidor
tenha uma maior afinidade ao alvo macromolecular (quando comparado com inibidores que
somente realizam interações intermoleculares), mas com menor probabilidade de efeitos
adversos (em comparação com os inibidores covalentes irreversíveis).
Em um sistema celular, várias moléculas interagem entre si de maneira eficiente e
seletiva, processo essencial para todos os aspectos biológicos. Nos estudos de descoberta de
fármacos também ocorre dessa maneira, buscando inibidores seletivos para proteínas
essenciais ao desenvolvimento de diferentes doenças [37]. O processo de inibição de uma
proteína alvo por um inibidor covalente reversível baseia-se em duas principais etapas: (i) por
meio de interações reversíveis, o inibidor se associa com a proteína alvo, de maneira que
essas interações levam ao posicionamento adequado do grupo reativo da molécula; (ii) o
grupo reativo eletrofílico é facilmente atraído por uma região nucleofílica presente na
enzima, que no caso de cisteíno proteases é o tiolato, onde ocorrerá a formação da ligação
covalente e, consequentemente, do complexo enzima–inibidor com a supressão da atividade
catalítica [35] (Figura 5). Atualmente, há fármacos aprovados com mecanismo de ação
baseados na modificação reversível e irreversível de proteínas, para o tratamento de
hipertensão, HIV e alguns tipos de câncer [9].
Figura 5. Mecanismo geral de inibição covalente de cisteíno proteases por dipeptidil nitrilas.
FONTE: adaptado de TURK, et al., 2012 [38].
-
29
Neste trabalho, os inibidores estudados foram dipeptidil nitrilas baseados no esqueleto
químico apresentado na Figura 6, com distintos grupos substituindo as posições envolvidas na
interação com o sítio ativo da enzima (ANEXO 1). As substâncias foram planejadas e
sintetizadas por outros membros do grupo NEQUIMED, com algumas rotas sintéticas já
publicadas [38, 39]. O planejamento foi realizado a partir do conhecimento da estrutura do
alvo (denominado “Target-based drug design”) com a introdução de substituintes no
arcabouço apresentado na Figura 5 para aumentar a afinidade com os distintos subsítios da
cisteíno protease de interesse. Além disso, os compostos apresentaram elevada inibição da
atividade das cisteíno proteases aqui estudadas (na ordem de nanomolar), de acordo com os
dados da tese de doutorado do Dr. Jean Francisco Rosa Ribeiro (2018). Nos próximos
capítulos serão apresentados o planejamento dos experimentos bem como o resultado
obtido a partir da avaliação da atividade biológica das substâncias estudadas frente a
diferentes sistemas celulares.
Figura 6. Arcabouço químico das dipeptidil nitrilas estudadas como inibidores covalentes reversíveis de cisteíno proteases.
Fonte: Autoria própria.
30
CAPÍTULO 2
Inibição da atividade de CP e efeitos biológicos em
protozoários do gênero Leishmania.
As atividades descritas nesse capítulo foram submetidas para publicação na revista “Experimental Parasitology”
como: J. C. Quilles Junior, F. L. Ribeiro, C. A. Laughton, C. A. Montanari, A. Leitão.
Dipeptidyl nitrile derivatives have cytostatic effects against Leishmania spp. promastigotes.
31
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1.1. Leishmaniose no contexto global
Leishmaniose é uma doença parasitária causada por cerca de vinte espécies do
protozoário do gênero Leishmania (L.) com incidência em mais de 90 países e a terceira
doença infecciosa com maior índice de morte entre as doenças parasitárias no mundo [41]. A
leishmaniose é caracterizada como uma doença endêmica em áreas de alta pobreza, segundo
a Organização Mundial da Saúde, com influência de fatores ambientais, sociais e
climatológicos. Em dados mais recentes (Figura 7), a OMS relatou que cerca de 75% dos casos
de leishmaniose cutânea mundial se concentram em 10 países, dos quais 3 deles estão
presentes na América do Sul (Brasil, Colômbia e Peru), enquanto que 90% dos casos
registrados da forma visceral são relatados no Brasil, Etiópia, Índia, Bangladesh, Sudão e
Sudão do Sul [OMS, 2017].
Figura 7. Status de endemicidade mundial da leishmaniose visceral.
Fonte: Organização Mundial da Saúde (OMS), 2018.
A forma natural de transmissão da doença se dá a partir da picada da fêmea de um
inseto vetor do gênero Phlebotomus, que libera os protozoários durante a sucção sanguínea
do hospedeiro vertebrado [42]. A parasitose apresenta três formas clínicas de manifestações
em seu organismo hospedeiro, podendo ser visceral, cutânea e mucocutânea [43]. Diferentes
32
espécies de Leishmania são responsáveis por promoverem as distintas formas clínicas da
doença (Tabela 1) e essas espécies são endêmicas em diferentes regiões. A forma cutânea de
manifestação da parasitose é a mais comum entre as formas clínicas e se caracteriza pela
formação de lesões dérmicas no local da picada do inseto vetor. O período de incubação pode
variar entre alguns dias a meses, com aumento da lesão gradualmente, permanecendo
avermelhada e sensível. A leishmaniose mucocutênea promove grave deformação nas
cavidades naso-orais e faríngeas com intenso desconforto no local da lesão. Além da lesão
inicial, outras lesões podem ocorrer anos após a infecção, comprometendo as regiões da boca
e nariz, prolongando sofrimento ao longo da vida. Por fim, a forma visceral da doença é
caracterizada como a mais grave e, se não diagnosticada e tratada em tempo hábil, pode ser
fatal para o hospedeiro. A infecção promove uma série de sintomas caracterizados por febre
prolongada, aumento do volume de alguns órgãos, como baço e fígado, perda de peso,
diminuição dos componentes sanguíneos e consequente anemia. A forma clínica clássica leva
à morte do indivíduo, devido ao enfraquecimento do sistema imunológico do paciente
causado pela severa infecção do parasito [44].
Tabela 1. Espécies do gênero Leishmania spp. responsáveis por diferentes formas
clínicas de Leishmaniose.
Forma clínica Espécies do gênero Leishmania spp.
Leishmaniose cutânea
L. major, L. tropica e L. aethiopica, L. mexicana, L.
amazonensis, L. braziliensis, L. panamanesis e L.
guyanensis
Leishmaniose mucocutênea L. braziliensis e ocasionalmente por L. panamensis ou
L. guyanensis.
Leishmaniose visceral L. donovani e L. infantum, L. infantum
FONTE: VAN ASSCHE et al., 2011 [45]
2.1.2. Ciclo de vida e tratamento
Os protozoários do gênero Leishmania spp. são adaptados a diferentes ambientes no
hospedeiro vertebrado e no inseto vetor, com distintos estados morfológicos (Figura 8). A
partir da picada do inseto vetor contaminado, a forma flagelada infectante do protozoário
33
entra em contato com a corrente sanguínea do hospedeiro vertebrado, promovendo
predominantemente a infecção de macrófagos [46]. Após invasão, dentro dos vacúolos
parasitóforos os protozoários se diferenciam para amastigota, forma aflagelada e não móvel,
iniciando o processo de replicação celular. Com o processo de replicação celular contínuo, a
célula hospedeira sofre a lise devido à alta densidade parasitária no seu interior, liberando os
parasitos que invadem outras células do sistema imune. Ao final, os protozoários invadem
preferencialmente os tecidos que contêm grande quantidade de macrófagos, como baço,
fígado e medula óssea [44].
Figura 8. Ciclo de vida dos protozoários do gênero Leishmania spp.
FONTE: adaptado de KAYE, et al., 2011[45].
O tratamento da parasitose é dependente tanto do sistema hospedeiro quanto do
protozoário, com alguns tratamentos sendo eficientes somente para determinadas espécies
de leishmania e de algumas regiões geográficas. Além da baixa efetividade de cura, alguns
problemas como toxicidade e efeitos colaterais, alto custo e longa duração do tratamento são
as principais limitações dos fármacos atuais [47]. Dentre os tratamentos existentes, os
antimoniais pentavalentes geralmente são os fármacos de primeira escolha para o
34
tratamento da parasitose, atuando como pró-fármacos. Ao serem metabolizados, são
reduzidos para a forma mais tóxica do antimônio, no qual hipóteses sugerem que seu
mecanismo de ação pode ocorrer a partir da interação com diferentes biomoléculas [48].
Entretanto, problemas de citotoxicidade e aumento da resistência dos protozoários têm sido
um dos limitantes do uso desses fármacos [49]. A miltefosina e anfotericina B, ambas
desenvolvidas para diferentes fins terapêuticos (anticancerígena e antifúngica,
respectivamente) também são alternativas para o tratamento da doença. O mecanismo de
ação da anfotericina B ocorre pela interação seletiva com o ergosterol, lipídeo constituinte da
membrana celular do protozoário [50]. Essa interação leva à formação de poros e alteração
da permeabilidade celular, promovendo a perda de íons intracelulares e, consequentemente,
levando à morte celular [11, 12]. Esses dois fármacos apresentaram total eliminação dos
protozoários da forma visceral da doença, porém não são tratamentos ideais [41]. Além de
efeitos colaterais, esses fármacos também apresentam diferentes níveis de eficácia
dependendo da espécie do protozoário, e são administrados de forma parental, o que leva a
muitos pacientes abandonarem o tratamento, facilitando o surgimento de cepas mais
resistentes aos tratamentos atuais [51]. Assim, não há um tratamento eficaz contra a
parasitose, tornando-se necessário o desenvolvimento de tratamentos seguros, eficientes,
acessíveis e de curta duração [52].
2.1.3. CP do tipo B – CPB
Em busca de novos e eficientes alvos terapêuticos para o desenvolvimento de fármacos
para o tratamento da Leishmaniose, as proteases têm ganhando destaque devido a suas
diversas funções em ambas as morfologias e etapas do ciclo de vida do parasito [53]. Essas
proteínas com função catalítica são conhecidas por promoverem a hidrólise de ligações
peptídicas de diferentes moléculas de peptídeos, dependendo da estrutura enzimática [14].
Dentre as proteases identificadas nas espécies de Leishmania spp. destacam-se as CP, metalo
proteases e serino proteases, sendo essenciais para o desenvolvimento do parasito [54]. As
principais funções destas proteínas para o parasito são o desenvolvimento do ciclo celular,
invasão celular, degradação de proteínas e evasão do sistema imune [55].
As CP (CPA, CPB e CPC) presentes nos protozoários do gênero Leishmania spp. têm sido
investigadas e relatadas como essenciais para diferentes funções celulares, com destaque
35
para a CPB [27]. A cisteíno protease do tipo B (CPB) apresenta várias isoformas codificadas
por genes similares em diferentes espécies de Leishmania spp. A atividade da CPB é essencial
para promover diversas modificações imunológicas em hospedeiros vertebrados infectados
por diferentes espécies do parasito [53]. Após a infecção, a formação do vacúolo parasitóforo
é uma característica do sistema imune hospedeiro, no qual essas espécies exógenas são
degradadas por essas organelas. A atividade de CPB é relacionada à modificação da formação
do vacúolo in vitro em células de mamíferos infectadas por protozoários de L. mexicana [54].
Da mesma forma, a supressão da expressão de CPB está diretamente relacionada com a
virulência e sucesso da proliferação parasitária intracelular, evidenciando a importância dessa
enzima durante o processo de infecção e evasão do sistema imune da L. mexicana [24, 49].
A CPB pode apresentar distintas funções dependendo da espécie de Leishmania spp.
Em protozoários de L. amazonensis, sua atividade foi caracterizada essencial para a
degradação de moléculas específicas dos vacúolos parasitóforos, diminuindo o índice de
morte parasitária intracelular [57]. Além do papel no sistema imunológico, a proliferação
celular de promastigotas também pode ser suprimida pela deleção do gene que codifica a
CPB em L. mexicana [56]. Baseado nessa diversidade de funções biológicas, a CPB é
considerada um alvo promissor para novos fármacos no controle da parasitose.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar o potencial leishmanicida de 28 novos inibidores covalentes reversíveis de
cisteíno proteases;
Quantificar a atividade de CPB expressa pela forma promastigota dos protozoários L.
amazonensis e L. infantum;
Quantificar a inibição da atividade de CPB in vitro por inibidores de CP;
Avaliar os efeitos citostáticos dos inibidores de CP em promastigotas.
36
2.3. MATERIAIS E MÉTODOS
2.3.1. Protozoários
Todos os protozoários estudados no trabalho foram gentilmente cedidos pelo Prof.
Sérgio de Albuquerque da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP-
USP). A forma promastigota das espécies de Leishmania amazonensis (L. amazonensis) e
Leishmania infantum (L. infantum) óxido resiste foi cultivada em frascos de cultura T25
(Corning) a 25°C em meio 199 suplementado com 0,22% de bicarbonato de sódio (NaHCO3).
Os parasitos foram coletados para ensaios durante sua fase log de crescimento, em média no
terceiro ou quarto dia de cultura.
2.3.2. Atividade leishmanicida
A partir de uma solução estoque dos compostos a 50 mM em DMSO, diferentes
concentrações foram sempre mantendo a diluição final de 0,5% (v/v) de DMSO. Para os
parasitos (forma promastigota) foi preparada uma solução da substância diluída em meio de
cultura em uma concentração dez vezes maior do que a desejada. Assim, 10 µL dessa solução
concentrada foi dez vezes diluída diretamente no poço, contendo 90 µL de parasitos à
concentração de 1·107 cel·mL-1 e incubada por 72 h. A viabilidade foi determinada a partir do
método colorimétrico com MTT ou por citometria de fluxo, como descrito a seguir.
2.3.2.1. Método colorimétrico – MTT
A viabilidade celular da forma promastigota dos protozoários foi avaliada utilizando o
ensaio colorimétrico com MTT na presença de PMS. Para o ensaio, 10 µL de uma solução de 5
mg de MTT diluído em 1 mL de tampão fosfato salino (PBS) juntamente com 0,22 mg
metossulfato de fenazina (PMS) foi incubada com os protozoários por 4 h. Após esse período,
70 µL de uma solução 10% (m/v) SDS e 0,01% (v/v) HCl foram adicionados às amostras
juntamente com 30 µL de DMSO por 90 minutos para solubilização dos cristais de formazan
formados pela reação. A viabilidade foi determinada a partir da absorbância medida pelo
espectrofotômetro a λ = 570 nm. Como controle negativo, foi utilizado meio de cultura com
DMSO na mesma condição das substâncias testadas e a anfotericina a 100 nM foi utilizada
37
como controle positivo de morte celular. Como branco, foi utilizado todo o sistema (meio
com substâncias) seguido da adição do reagente MTT na ausência dos parasitos.
2.3.2.2. Densidade celular por citometria de fluxo
A citometria de fluxo foi utilizada para determinação da densidade celular para o
acompanhamento do crescimento in vitro da forma promastigota dos protozoários na
presença de diferentes inibidores de CP. As células parasitárias foram diluídas em PBS (cinco
ou dez vezes) e a concentração celular foi realizada a partir da distribuição das populações
celulares em relação ao tamanho de partícula, separando células inteiras de fragmentos
celulares usando o módulo InCyte no programa guavaSoft2.7 no citômetro de fluxo guava
8HT (MerckMillipore®).
2.3.3. Ciclo celular
O ensaio de ciclo celular foi realizado utilizando o kit da marca MerckMillipore® Guava –
Cell Cycle Reagent no citômetro de fluxo. As células de promastigota das espécies de
Leishmania spp. foram distribuídas na concentração de 107 cel·mL-1 em placas de 96 poços e
incubadas com diferentes compostos por 24 h a 25 °C. Após a incubação, as células foram
centrifugadas a 280 G e lavadas duas vezes com PBS contendo 20% FBS; ao pellet foi
adicionado etanol 70% e incubado overnight a 4 °C. No dia seguinte, as células foram
novamente centrifugadas, lavadas uma vez com PBS contendo 20% PBS, com adição de 200
µL do reagente Cell Cycle e incubação por 30 minutos na ausência de luz. A partir da
coloração do conteúdo genético, as células foram classificadas por populações características
de diferentes fases do ciclo celular.
2.3.4. Atividade proteolítica de Leishmania spp.
2.3.4.1. Atividade proteolítica em promastigotas
A atividade total de peptidase intracelular foi realizada utilizando 10 µM do substrato
fluorogênico Z-FR-MCA (Sigma-Aldrich®). Inicialmente, diferentes concentrações dos
protozoários e substratos foram avaliadas para padronização e viabilização do ensaio. Para os
ensaios com os inibidores, após o período de tratamento com as substâncias, os parasitos em
uma concentração inicial de 107 células·mL-1 foram transferidos para uma placa escura de 96
38
poços e incubados por 3 h com o substrato. Após a incubação, foi realizada a medida de
fluorescência no fluorímetro Biotek Synergy HT (λexc= 360/40 nm e λemis= 460/40 nm)
baseada na conversão do substrato. Poços contendo somente parasito em meio com DMS
nas mesmas condições das substâncias foi considerado como controle positivo de atividade
proteolítica, enquanto meio de cultura com a substância sem os parasitos foi utilizado como
branco da conversão do substrato. Diferentes inibidores seletivos para cada classe de
peptidases foram utilizados, como inibidores de CP (CP) – MMTS, serino proteases (SP) –
PMSF e metalo proteases (MP) – EDTA. Um coquetel de inibição de proteases Sigma-Aldrich®
também foi utilizado na concentração de 250 µM nas mesmas condições do ensaio.
2.3.4.2. Atividade proteolítica em lisados celulares
A atividade proteolítica total nas células das espécies de Leishmania spp. foi avaliada a
fim de determinar, de maneira mais direta, o processo de inibição do alvo macromolecular
pelos compostos. Os ensaios foram baseados na literatura com algumas modificações [58]. As
células foram cultivadas como descrito anteriormente, ajustadas na concentração desejada e
ressuspensas em tampão fosfato de sódio 1 M gelado e lisadas usando ultrassom em banho
de gelo durante 5 minutos, com pulsos 10% de amplitude a cada 30 segundos. Após a lise, a
mistura foi centrifugada por 5 min a 220 G para separar o extrato proteico de restos celulares
provenientes da lise celular. O sobrenadante foi coletado e concentrado 15 vezes por
centrifugação a 4 °C e 3400 G utilizando filtro de 10 kDa da MerckMillipore. Em seguida, a
concentração proteica total foi determinada pelo método de Bradford [59], no qual o extrato
enzimático foi diluído para a concentração desejada em tampão de ensaio acetado de sódio 1
M pH 5,5 e a atividade enzimática foi aferida a partir da cinética por 5 minutos utilizando o
substrato fluorescente Z-FR-MCA seletivo para CP. Para isso, 142 µL da amostra do
sobrenadante foi adicionado em placa preta de 96 poços juntamente com 8 µL dos inibidores
a diferentes concentrações e incubados por 10 minutos. Após incubação, 50 µL do substrato
diluído no mesmo tampão de ensaio foram adicionados atingindo a concentração final de 30
µM. A partir da inclinação da reta, os valores de Vmax foram coletados pela medida de
fluorescência no fluorímetro Biotek Synergy HT (λexc= 360/40 nm e λemis= 460/40 nm) e o
percentual de inibição foi calculado relativamente comparando as velocidades máximas das
amostras tratadas com inibidores com as amostras sem tratamento. Como controle positivo
39
de atividade, foi utilizado somente o extrato enzimático incubado pelo mesmo tempo na
ausência de inibidores e o mesmo sistema, considerando somente o tampão sem o extrato foi
utilizado como branco. Como controle positivo de inibição enzimática, foi utilizado o coquetel
de inibidores de peptidases foi utilizado (SigmaFast – código S8820, Sigma-Aldrich®). O
mesmo procedimento foi adotado para os demais tipos celulares estudados no trabalho.
2.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.4.1. Efeito citotóxico contra a forma promastigota
A forma promastigota das espécies de Leishmania spp. está presente em ambos os
hospedeiros e é fundamental para o processo de infecção celular. Assim, é interessante a
avaliação leishmanicida de candidatos a fármacos que possam vir a inibir o processo de
invasão celular ou até mesmo, levar à morte parasitária da forma infectiva do protozoário.
Atualmente, a única forma de quimioterapia disponível para tratamento da doença apresenta
efeitos tóxicos severos, além de alto preço e longo período de tratamento, o que justifica a
busca por novos agentes com potencial leishmanicida [60].
Ao todo, 28 substâncias planejadas em nosso grupo de pesquisa com características
de inibidores covalentes reversíveis de CP planejadas a partir de modificações em posições
específicas da estrutura do protótipo foram inicialmente avaliados quanto ao seu potencial
leishmanicida (Anexo I). Os inibidores foram ensaiados contra a forma promastigota das
espécies de L. amazonensis e L. infantum e baseado na viabilidade celular, mas nenhum dos
compostos foi efetivo em promover a morte parasitária in vitro, mesmo a 100 µM (Figura 9),
uma vez que o valor de corte para a viabilidade é de 50%. Ensaios bioquímicos preliminares
realizados por outros membros do grupo têm mostrado que todas as substâncias são
potentes inibidores de CPB, na ordem de nanomolar (dados pertencentes à tese de
doutorado do aluno Jean Francisco Rosa Ribeiro). Porém, devido à complexidade da célula em
relação à enzima recombinante isolada, torna-se bem complexo analisar os fatores que
podem levar um potente inibidor enzimático a ter baixa potência (ou até ser inativo) no
ensaio celular. Diversas possibilidades podem ser levantadas, como baixa permeabilidade das
substâncias pela membrana celular e possível metabolização dos inibidores antes da
interação com a enzima alvo. Outra possível hipótese seria que a interação efetiva entre
40
inibidor e enzima pudesse ocorrer, porém a inibição do alvo poderia não ser efetiva ou
suficiente para promover a morte celular. Dessa maneira, outros ensaios foram realizados,
pensando em possíveis efeitos citostáticos, descritos na próxima sessão.
Figura 9. Atividade leishmanicida dos inibidores reversíveis de CP. A viabilidade
celular foi verificada pelo método colorimétrico MTT após 72 h de incubação com os
inibidores a 100 µM.
In ib id o r e s (1 0 0 u M / 7 2 h )
Via
bil
ida
de
ce
lula
r (%
)
Ne q 4 0 0
Ne q 0 4 1 3
Ne q 0 4 1 5
Ne q 0 5 0 0
Ne q 0 5 3 3
Ne q 0 5 3 6
Ne q 0 5 4 4
Ne q 0 5 4 8
Ne q 0 5 7 6
Ne q 0 5 7 7
Ne q 0 4 0 9
Ne q 0 4 1 4
Ne q 0 5 1 3
Ne q 0 5 4 6
Ne q 0 5 4 9
Ne q 0 5 5 0
Ne q 0 5 5 1
Ne q 0 5 5 2
Ne q 0 5 5 4
Ne q 0 5 6 5
Ne q 0 5 6 9
Ne q 0 5 7 0
Ne q 0 5 7 1
Ne q 0 5 7 2
Ne q 5 7 3
Ne q 0 5 7 5
Ne q 0 5 7 8
Ne q 5 8 7
An fo
ter i
c ina -B
10 0 n M
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
L . a m a z o n e n s is L . c h a g a s i
FONTE: Autoria própria.
2.4.2. Efeito citostático : inibição do crescimento parasitário e ciclo celular
A atividade proteolítica é um processo bioquímico crucial para o desenvolvimento
dos sistemas eucariotos, apresentando funções no processo de regulação. Moléculas com
atividade biológica para tratamento da doença, tanto para promover a morte celular ou inibir
o crescimento e/ou a infecção do hospedeiro pelo parasito pode ser uma alternativa
terapêutica eficaz. Alguns dos inibidores de CP que não apresentaram atividade citotóxica em
relação à morte celular dos protozoários foram ensaiados para avaliação de efeitos
citostáticos (Figura 10A). Os parasitos na forma promastigota de ambas as espécies foram
incubados com os inibidors, seguido da determinação da concentração celular realizada por
citometria de fluxo após diferentes tempos de incubação, por no máximo de 96h, como
apresentado na Figura 10B. Todos os compostos apresentam atividade inibitória do
crescimento dos protozoários dentro do período estudado, em especial Neq0551 e Neq0569.
De maneira geral, os protozoários responsáveis pela forma cutânea da doença (L.
amazonensis) foram mais sensíveis a ação dos inibidores em relação à forma visceral (L.
41
infantum). A relação estrutura química-atividade biológica (SAR) será discutida
posteriormente.
A inibição do crescimento dos protozoários do gênero Leishmania spp. é um notável
estudo apresentado por alguns autores na literatura [51-54]. Tais experimentos in vitro
permitem a pré-avaliação de substâncias quanto ao potencial inibitório de um dos principais
fatores da doença, que é o alto índice de replicação dos protozoários. Utilizando inibidores da
enzima nucleosídeo hidrolase, responsável pela hidrólise de polímeros de nucleotídeos tendo
como produtos ácidos nucleicos isolados, Freitas e colaboradores [62] demonstraram a ação
inibitória do crescimento celular de promastigotas in vitro das duas espécies de Leishmania
spp. estudadas nesse trabalho. Devido ao elevado metabolismo desses protozoários, é
essencial uma fonte rápida e farta de ácidos nucleicos para a replicação do material genético,
no qual a inibição da fonte desses nucleotídeos comprometeu todo o ciclo desse protozoário.
Entretanto, até o momento não foram encontrados relatos que descrevam o efeito
citostático em relação ao crescimento celular exercidos por inibidores de CP nesses sistemas.
Porém, a função essencial para o desenvolvimento celular e infecção parasitária foi relatada
por Saraiva e colegas [56] usando promastigotas de Leishmania mexicana que não expressam
a sua principal cisteíno protease. O parasito deficiente em CPB foi capaz de infectar poucas
células hospedeiras in vitro, além do comprometimento da replicação da forma amastigota
intracelularmente. Dessa maneira, os resultados apresentam indícios de que os compostos
estão atuando efetivamente na inibição da proteína alvo em questão, afetando
consideravelmente a proliferação celular de ambas as espécies estudadas.
Após 96h de incubação com os compostos, os parasitos foram centrifugados e
adicionados em meio de cultura sem os inibidores, a fim de avaliar a capacidade dos
protozoários de recuperarem seu metabolismo e retomarem seu crescimento normal após a
ação dos inibidores de CP. A partir desse estudo também é possível verificar a reversibilidade
da ação das substâncias testadas nos protozoários. Os resultados são apresentados como
porcentagem de crescimento em relação à concentração inicial, após 48h (Figura 10C). Os
inibidores testados apresentaram resultados distintos para as duas espécies de Leishmania
spp. em estudo, sendo a L. amazonensis a forma com o crescimento mais suscetível após
incubação com as substâncias. Notável é o efeito dos inibidores Neq0551 e Neq0569, os mais
efetivos para as duas espécies, com crescimento máximo de aproximadamente 50% em
relação à concentração inicial após 48 h da retirada das substâncias, enquanto os parasitos
42
controles quintuplicaram sua concentração inicial dentro do mesmo período. Os resultados
indicam a ação dos inibidores de CP, no qual a provável inibição dessas enzimas apresenta-se
como um drástico efeito no parasito, limitando seu crescimento após a ação dessas
substâncias. Vale ressaltar que há uma seletividade entre as substâncias testadas para as duas
espécies de Leishmania spp., que ainda deverá ser estudada mais profundamente para
compreender este fenômeno, especialmente pelo fato do ensaio citostático ter levado a uma
resposta oposta ao estudo de replicação após a retirada das substâncias.
43
Figura 10. Cronograma de incubação e execução dos experimentos (A). Durante 96 h
o crescimento da forma promastigota dos protozoários L. amazonensis e L. infantum foi
investigado na presença dos inibidores a 10 µM (B). Após 96 h, os parasitos L. infantum
(barras azuis escuras) e L. amazonensis (barras azuis claras) foram centrifugados e incubados
em meio de cultura sem os inibidores por 48 h (C). Os experimentos foram realizados em
triplicada e a análise estatística pelo teste de Dunnett foi realizada comparando as amostras
com o controle negativo de cada espécie considerando valores de P < 0.05.
FONTE: Autoria própria.
A análise do ciclo celular por citometria de fluxo baseia-se na quantificação do
material genético marcado por um marcador químico fluorescente. Em uma célula
eucariótica, a quantidade de DNA está correlacionada com intensidade de fluorescência
emitida pelo marcador interagindo com o núcleo, enquanto que a perda ou espalhamento da
Compostos (10 uM)
Co
nce
ntr
açã
o (
cel/
mL)
0 48 960
2.0105
4.0105
6.0105
Neq0544
Neq0413
Neq0551
Neq0554
Neq0568
Neq0569
Neq0573
Controle
L. amazonensis
C o m p o s t o s (1 0 u M )
Via
bil
ida
de
ce
lula
r (
%)
0 4 8 7 2 9 6
0
2 .01 0 5
4 .01 0 5
6 .01 0 5
N e q 0 5 4 4
N e q 0 4 1 3
N e q 0 5 5 1
N e q 0 5 5 4
N e q 0 5 6 8
N e q 0 5 6 9
N e q 0 5 7 3
C o n t r o le
L . c h a g a s i
Inibidores
Cre
scim
en
to C
elu
lar
(%)
Neq04
13
Neq05
44
Neq05
51
Neq05
54
Neq05
68
Neq05
69
Neq05
73
Contro
l0
100
200
300
400
500
600
******
***
** **
******
***
**
*
*
*
**
0 h 96 h 144 h
Início Fim da incubação Fim
Incubação com os inibidores Avaliação do crescimento na ausência
dos inibidores
(A)
(B) (C)
44
fluorescência ocorre em células apoptóticas devido à fragmentação do DNA [64]. A retenção
ou não de alguma fase do ciclo celular nos dá a ideia da importância do alvo e a ação da
substância para uma determinada fase do ciclo. Devido ao fato da forma promastigota de L.
amazonensis ser mais sensível ao tratamento com os compostos, foi inicialmente realizado a
incubação nas mesmas condições dos ensaios citostáticos, com a análise do ciclo celular
realizada por citometria de fluxo após 72 h. Nenhuma alteração significativa foi observada no
perfil do ciclo celular destes protozoários, em relação ao controle, o que demonstra que as
substâncias atuam de maneira ciclo inespecífica (dados não apresentados). Entretanto, para
as promastigotas de L. infantum foi observado um perfil diferente na presença dos inibidores
(Figura 11). A substância Neq0544 foi a que mais se destacou na alteração do perfil do ciclo
celular, atuando principalmente na retenção do ciclo provavelmente ao final da fase S,
quando ocorre o processo de síntese de DNA. Estes resultados não apresentam correlação
com os dados de atividade citostática para a maior parte das substâncias, exceto talvez pela
Neq0544 e o conhecido inibidor de CP E64, usado como controle.
45
Figura 11. Análise do perfil ciclo celular por citometria de fluxo (A) e histograma (B)
de promastigotas de L. infantum incubadas por 72 h com 10 µM dos diferentes inibidores.
Como controle positivo foi utilizado o inibidor irreversível de CP E-64. Fases do ciclo celular
representadas em azul (G1), azul claro (S) e branco (G2/M). Resultados obtidos a partir de
experimento em triplicata, com desvio padrão menor do que 8% para todas as análises.
In ib id o r e s ( 1 0 M | 7 2 h )
Cic
lo C
elu
lar (
%)
Neq0544
Neq0551
Neq0554
Neq0568
Neq0569
Neq0573
MM
TS
E-6
4
Contr
ole
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
* **
* *
(A )
FONTE: Autoria própria.
2.3.3. Avaliação da inibição da atividade proteolítica nas células parasitárias
Proteases extracelulares são importantes no desenvolvimento de várias doenças e
classificadas de acordo com seu mecanismo de ação [65]. CP do tipo B (CPB) são vitais para
diversos processos em protozoários do gênero Leishmania spp., como no processo de
autofagia e diferenciação celular [27]. Devido à ausência de atividade citotóxica dos
compostos testados contra os protozoários e a fim de avaliar a capacidade dos inibidores de
Neq0554 (B)
46
CP de induzirem a inibição do alvo, foi realizado o ensaio para quantificação da atividade de
peptidase total nas células de promastigotas de L. amazonensis utilizando o substrato Z-FR-
MCA, seletivo para CP [32]. Inicialmente, foi realizada a padronização da concentração de
substrato e tempo de incubação com as células (dados não apresentados) bem como uma
curva de calibração, para determinação das melhores condições de ensaio, como
apresentado para L. infantum e L. amazonensis na Figura 12A. É possível observar que uma
correlação linear entre a concentração de protozoário e a atividade proteolítica para L.
infantum utilizando 10 µM do substrato Z-FR-MCA, porém o mesmo não foi obtido para L.
amazonensis. Isso provavelmente se deve a maior taxa de metabolização ou ativação de CP
para essa espécie, uma vez que a linearidade foi atingida com o aumento na concentração do
substrato para 20 µM. Após a padronização, a atividade de CP foi comparada com o ensaio
colorimétrico de viabilidade celular, na presença do inibidor irreversível de CP E-64 (Figura
12B). Mesmo em altas concentrações do inibidor, a atividade proteolítica foi inibida em torno
de 30%, o que não foi suficiente para promover alteração na viabilidade celular. Diferentes
resultados foram observados por Caroselli e colaboradores [58], no qual a diminuição na
viabilidade celular correlacionada à atividade proteolítica de promastigotas de L. amazonensis
na presença de E-64. Entretanto, os resultados obtidos levantam a hipótese de que a inibição
de CP em Leishmania spp. pode não ser uma alternativa efetiva para a progressão da morte
celular, mas pode atuar de outras maneiras, como apresentado anteriormente, afetando a
proliferação celular.
As promastigotas de L. amazonensis foram lisadas por irradiação de ultrassom e,
utilizando inibidores específicos para cada classe de protease, foi realizado um ensaio de
quantificação da atividade proteolítica obtida do extrato enzimático bruto proveniente da lise
celular em diferentes condições. Nesse ensaio, inibidores de CP (CP) – MMTS, serino
proteases (SP) – PMSF e metalo proteases (MP) – EDTA foram utilizados. A partir dos
resultados, obtivemos um estudo indireto do perfil de cada uma dessas proteases pelo
substrato em estudo, como apresentado na Figura 12C. É notável a predominância da
detecção de atividade de CP em relação às demais proteases utilizando um substrato seletivo
e não específico para essa classe de enzima. Assim, podemos inferir que utilizando o método
de detecção de atividade proteolítica com o substrato em questão temos resultados com alta
seletividade para CP, como a CPB em estudo.
47
Figura 12. Padronização da relação entre o número de protozoários e a unidade de
fluorescência relativa (UFR) da forma promastigota dos protozoários L. infantum e L.
amazonensis incubados com o substrato fluorogênico Z-FR-MCA a 10 e 20 µM por 3 h (A). Em
seguida, a viabilidade celular e atividade proteolítica da forma promastigota do protozoário L.
amazonensis foi avaliada após incubação por 24 h com diferentes concentrações do inibidor
covalente irreversível E-64 (B). Para confirmar a seletividade do substrato referente à
atividade de CP, a inibição da atividade proteolítica de promastigotas de L. amazonensis foi
realizada utilizando inibidores seletivos para cada classe enzimática: (MMTS) cisteíno, (PMSF)
serino e (EDTA) metalo proteases na concentração de 250 µM. Como controle foi utilizado o
coquetel de inibição de protease comercial (C). O teste de Tukey de comparação de médias
foi realizado com valores de p < 0,05.
FONTE: Autoria própria.
c e l m L- 1
x 1 05
UF
R (
%)
0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 1 5 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
y = 0 ,5 9 5 · x + 8 ,8 6 1
R ² = 0 ,9 9 1
S y ·x = 3 ,6 1
L . c h a g a s i
Z -F R -M C A 1 0 M
E -6 4 ( M )
Un
ida
de
s R
ela
tiv
as
(%
)
0 , 5 1 1 0 2 5 5 0 1 0 0
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
A t iv id a d e P r o t e o l í t ic a V ia b i l id a d e C e lu la r
In ib id o r e s ( 2 5 0 M )
Ativ
ida
de
Re
lativ
a(%
)
C o n t r o l e E D T A P M S F M M T S C o q u e t e l
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5**
*
(A)
(B) (C)
0 25 50 75 100 125 150
0
25
50
75
100
celmL-1 x 105
L. amazonensisZ-FR-MCA 10M
0 25 50 75 100 125 150
0
25
50
75
100
celmL-1 x 105
L. amazonensisZ-FR-MCA 20M
y=0,653x + 5,090
R2 = 0,994
Syx = 2,98
48
Em seguida, a capacidade dos inibidores em afetar o crescimento celular foi estudada
quanto à inibição da atividade de CP dentro da célula dos protozoários. Esses inibidores já
foram relatados pelo nosso grupo como inibidores de CP em ensaios bioquímicos e com
potencial tripanossomicida em ensaios celulares [40]. A ideia então foi avaliar o potencial
desses inibidores diretamente nas células vivas do alvo celular, considerando um sistema mais
complexo do que o reproduzido no ensaio bioquímico, além de todos os possíveis obstáculos
encontrados no ambiente celular, como permeabilização, solubilização e metabolização. Os
resultados da inibição do crescimento após 48 h em meio sem os inibidores são oriundos da
Figura 10C e reapresentados na Tabela 2 em termos numéricos. As substâncias foram
eficazes para inibir o crescimento celular, fornecendo efeito tardio (ou residual), uma vez que
a atividade foi observada, mesmo após 48 h de remoção do composto. No geral, as
promastigotas intactas de L. amazonensis foram mais sensíveis ao conjunto de compostos do
que L. infantum (Tabela 2). É conhecido de que o parasito responsável pela forma visceral da
doença (L. infantum) é mais resistente a diferentes tipos de tratamento. Este é o mesmo
perfil observado em relação aos ensaios citostáticos realizados, nos quais L. infantum foi mais
resistente a todos os inibidores que L. amazonensis, como comprovado pela análise
estatística (Figura 10C).
Entretanto, avaliando a inibição da atividade proteolítica, protozoários de L.
amazonensis, que apresentaram elevada taxa de conversão do substrato durante a
padronização do ensaio (Figura 12A), não tiveram inibição significativa da sua atividade
proteolítica (Tabela 2). Por outro lado, todos os inibidores promoveram a diminuição da
atividade proteolítica dentro das células dos protozoários de L. infantum em torno de 30%. De
certa forma, esse resultado levanta a hipótese de que a resposta tardia ou residual da ação
dos inibidores é dependente do processo celular específico para cada espécie de leishmania,
mas ainda não se sabe como ele poderia estar relacionado ao metabolismo e sobrevivência
do parasito.
49
Tabela 2. Estrutura química dos inibidores estudados e radicais substituintes em cada
posição. Inibição da proliferação celular (IPC) e da atividade proteolítica (IAP) do extrato
enzimático obtido a partir da lise de promastigotas de L. amazonensis e L. infantum incubados
com diferentes compostos a 100 µM.
Inibidor Substituintes L. amazonensis L. infantum
R1 R2 R3 IPC (%)¹ IPA (%)² IC (%)¹ IPA (%)²
Neq0413 CH2
CH3 81,1
--- NA
---
Neq0544 CH2
OC(CH3)3 90,2 NA 67,7 35,1 (± 12,8)
Neq0551 CH2
Ph 94,8 NA 95,8 27,2 (± 6,5)
Neq0554 CH2
84,1 NA 63,8 18,8 (± 7,3)
Neq0568 CH2 CH2CH(CH3)2
82,5 NA 72,3 28,1 (± 6,4)
Neq0569
CH2CH(CH3)2
99,3 NA 87,9 24,9 (± 10,6)
Neq0573
CH2C(CH3)3 Ph 90,8 NA NA NA
¹ Protozoários foram tratados com os inibidores a 10 µM por 96 h e então foram incubados
em meio fresco sem inibidores por 48 h, como previamente discutido na seção 5.3.2. A
porcentagem de crescimento foi realizada considerando a concentração parasitária para cada
condição como 100%. O desvio padrão e a análise estatística são apresentados na Figura 10C.
² Inibição relativa da atividade de CP dentro das células parasitárias intactas após o fim do
experimento.
50
Até o momento, não é possível descartar a hipótese de que o papel das CP para L.
amazonensis possa ser muito mais importante do que para L. infantum, devido ao alto índice
de metabolização do substrato. Com base nessa ideia, a atividade de CP foi quantificada a
partir do extrato proteico obtido da lise celular de promastigotas, para avaliar a capacidade
de inibição da enzima alvo expressa pelos protozoários, além de checar a inibição proteolítica
sem a interferência da membrana celular para cada uma das espécies estudadas, o que
poderia afetar a concentração intracelular das substâncias devido a possíveis limitações na
permeabilidade pela membrana (Figura 13). No geral, significativa inibição da atividade de CP
foi observada para ambas as espécies baseado na análise estatística, porém, todas as
substâncias apresentaram maior taxa de inibição da atividade de CP para L. infantum em
comparação com L. amazonensis. A partir disso, uma alternativa poderia ser mais exploradas
para ter uma análise aprofundada deste fenômeno, L. amazonensis pode expressar níveis
mais elevados de CP ativas do que L. infantum. A hipótese em questão é que, embora a
inibição da atividade proteolítica de L. amazonensis seja menor do que L. infantum para todos
os inibidores testados, a atividade citostática observada para essas moléculas é maior para L.
amazonensis (Tabela 2). Esse resultado não pode ser explicado baseado no modo de ação
hipotético dos inibidores relacionado à inibição das CP CPA, CPB e CPC. A maior parte dos
trabalhos publicados sobre a atividade de CPB é focada no entendimento da virulência do
parasito baseado na interação patógeno-hospedeiro [53] ou na citotoxicidade usando
diferentes inibidores da protease [40, 59], sem análises adicionais sobre a ação de inibidores
na morfologia promastigota. Alguns exemplos abrangem o estudo do inibidor covalente
irreversível ZLIII43A e derivados contra L. major [67] e K777 em promastigotas de L. major e L.
tropica [68]. Estes compostos apresentaram atividade citostática até 72 h em concentrações
na ordem de micromolar (5-100 µM), levando à morte celular parasitária na concentração
mais elevada. Entretanto, baseado nos dados da literatura, não é possível assegurar que as
maiores concentrações dos inibidores estudados foram responsáveis pela total inibição da
atividade da cisteíno protease nos parasitos, promovendo a morte celular. Porém, os estudos
realizados aqui mostram que, apesar da inativação da atividade proteolítica por CP, a maior
parte das promastigotas de ambas as espécies de Leishmania ainda permaneceram vivas.
Esses resultados sugerem que a inibição de CP por inibidores covalentes reversíveis podem
atuar de maneira citostática, suprimindo a proliferação celular sem efeitos tóxicos
significativos.
51
Figura 13. Atividade proteolítica do extrato enzimático obtido a partir da lise celular
de promastigotas de L. amazonensis e L. infantum incubados com os inibidores de CP. Análise
estatística foi realizada comparando a média de cada tratamento com o controle para cada
espécie de Leishmania, considerando p < 0,05. MMTS foi utilizado como controle positivo de
inibição da atividade proteolítica total.
Inibidores (100 M / 72h)
Ati
vid
ade
pro
teo
lític
a (
%)
Neq0544
Neq0551
Neq0554
Neq0568
Neq0569
Neq0573
MM
TS
Controle
0
25
50
75
100
*
* * **
*
*
**
**
*
L. amazonensis
L. infantum
FONTE: Autoria própria.
2.5. CONCLUSÕES PARCIAIS
Os inibidores de CP estudados aqui foram responsáveis por promover efeitos
citostáticos em duas espécies de Leishmania spp., sem efeito tóxico significativo. Até onde
sabemos, este é o primeiro relato que mostra este perfil de inibidores covalentes reversíveis
de CP nestes parasitos. Apesar da elevada taxa de conversão do substrato Z-FR-MCA seletivo
para CP por promastigotas de L. amazonensis, ainda não é possível indicar se esse resultado é
devido aos diferentes níveis de expressão de CP ou mesmo à presença dessas proteases com
maior eficiência catalítica. Indiretamente, resultado semelhante foi obtido em relação à
porcentagem de atividade proteolítica nas células dos protozoários, no qual os inibidores
foram inativos contra L. amazonensis, porém com atividade de algumas substâncias em L.
infantum. Além disso, a inibição do crescimento de promastigotas não está relacionada à
inibição da atividade proteolítica, o que sugere que essas moléculas possam estar atuando
52
por meio de um mecanismo de ação diferente. Este resultado mostra um perfil biológico
diferente do esperado e abre uma nova perspectiva para o endereçamento do(s) alvo(s)
macromolecular(es) para estas substâncias.
53
CAPÍTULO 3
Importância da atividade de cisteíno proteases durante a infecção in vitro de protozoários
Trypanosoma cruzi.
54
3.1. REVISÃO BIBLIOGRAFICA
3.1.1. A Doença de Chagas e alternativas terapêuticas.
Classificada como doença tropical negligenciada, a doença de Chagas foi primeiramente
descrita em 1909 pelo médico e sanistarista brasileiro Carlos Chagas. Causada pela infecção
do protozoário Trypanosoma cruzi e transmitida pelos insetos da família Triatomíneo, a
parasitose é endêmica principalmente em regiões subdesenvolvidas, como África e América
Latina com surgimento de aproximadamente 8 milhões de novos casos anualmente [69]. O
protozoário causador da doença apresenta complexo ciclo de vida, adaptando-se às
diferentes condições entre o hospedeiro vertebrado e o inseto vetor [70]. O ciclo de vida se
inicia a partir da picada seguida da liberação dos protozoários nas fezes do inseto vetor
infectado, que entra em contato com a corrente sanguínea do hospedeiro vertebrado e
invade suas células. No interior celular, o parasito se diferencia para sua forma replicativa,
(amastigota) e após sucessivos ciclos de replicação no citoplasma da célula hospedeira, os
protozoários se diferenciam novamente para a forma tripomastigota [71]. A partir da
concentração parasitária no interior celular, a célula hospedeira se rompe, liberando a forma
infectante para a corrente sanguínea e promovendo a infecção de novas células e/ou ser
ingerida por um inseto vetor não contaminado [72]. Após ingestão pelo inseto não
contaminado, a forma tripomastigota se diferencia para a epimastigota para iniciar sua
replicação no sistema digestivo do inseto, que se diferenciam novamente para
tripomastigota, se concentram no reto do inseto e são liberados nas fezes do inseto [73]
(Figura 14).
55
Figura 14. Ciclo de vida do protozoário Trypanosoma cruzi.
FONTE: adaptado de ALVAREZ, et al., 2012 [71].
Para o tratamento atual da doença de Chagas, somente o fármaco benzonidazol é
recomendado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) [75]. Nifurtimox foi banido do Brazil
há mais de 20 anos devido aos efeitos colaterais. Entretanto, a principal desvantagem é
ineficiência no tratamento para pacientes portadores da doença na fase crônica e a
resistência adquirida pelos protozoários [76]. Além disso, o tratamento com ambos os
fármacos requer longos períodos de administração, o que aumenta a probabilidade de efeitos
colaterais [77]. O mecanismo de ação dos fármacos ainda não é bem conhecido, mas
evidências sugerem que ocorra através da formação de radicais livres [78], como apresentado
na Figura 15. A partir da ação de nitrorredutases específicas, o grupo nitro (NO2) dessas
substâncias é reduzido ao grupo amino (NH2). O benzonidazol atua pela formação de radicais
livres e formação de metabólitos eletrofílicos quando o grupo nitro é reduzido, ao contrário
do Nifurtimox, que leva a geração espécies reativas de oxigênio [74]. Dessa maneira, é
suposto que esses fármacos atuem a partir de complexos mecanismos de interação com
proteínas, lipídeos e DNA. Os metabólitos eletrofílicos podem atuar também em outros
sistemas, como na célula hospedeira, o que leva aos efeitos colaterais indesejáveis [78].
Tripomastigota
Corrente Sanguínea Amastigota
Tripomastigota Epimastigota
56
Figura 15. Mecanismo de ação proposto para os fármacos Benzonidazol e Nifurtimox
para o tratamento da doença de Chagas.
FONTE: adaptado de DIAS, et al., 2009 [78].
3.1.2. Cruzipaína como alvo terapêutico.
Devido à dificuldade no tratamento da doença de Chagas, há uma necessidade
importante de novos fármacos eficientes e seguros como alterativa terapêutica. Atualmente,
alguns autores têm relatado diferentes enzimas como alvo válido para tratamento da doença
de Chagas, como a cisteíno protease cruzipaína [79–81] e a proteína de transporte de
elétrons citocromo b [82]. Além disso, há muitas vias metabólicas e macromoléculas
específicas desse organismo, uma vez que a seletividade é um importante ponto a ser
considerado, pois os protozoários também são eucariotos, assim como seu hospedeiro
vertebrado. Entretanto, devido à dificuldade na especificidade de novos compostos por alvos
do protozoário, possíveis efeitos de antagonistas devem ser cuidadosamente observados [76].
Diversas proteases desempenham funções essenciais para a patogenicidade da doença
de Chagas e têm se tornado interessantes alvos para estudos na descoberta de novos
candidatos a fármacos. A partir do sequenciamento genômico de Trypanosoma cruzi, foram
identificadas diversas CP, além várias outras proteases [70]. Dentre as CP, a cruzipaína é
expressa por diversos genes presentes no protozoário e tem apresentado altos níveis de
antígenos em pacientes portadores da fase crônica da doença [83]. Considerada como alvo
validado para tratamento da doença [84], a cruzipaína é a principal cisteíno protease do
protozoário, que desempenha papel fundamental na nutrição parasitária, além da sua
importância no processo de invasão da célula hospedeira, evasão do sistema imune e
diferenciação celular [76]. A enzima é encontrada em todas as fases do ciclo de vida do
57
protozoário, apresentando diferentes funções e localizações em cada uma das suas
morfologias [85]. Em epimastigota, a cruzipaína concentra-se principalmente nos
reservossomos, organela protista semelhante ao lisossomo. Ela é preferencialmente
secretada em tripomastigota, responsável pela infecção da célula hospedeira e é
predominantemente encontrada na membrana celular em amastigotas [71]. Devido a função
essencial da cruzipaína para a viabilidade e virulência do protozoário, inibidores desta enzima
têm sido considerados promissores para o desenvolvimento de novas terapias para a doença
[86], com alguns relados de possíveis candidatos para o tratamento da doença de Chagas.
Protozoários de T. cruzi deficientes para a cruzipaína ainda foram capazes de promover a
infecção in vitro, porém não sobreviveram a defesa da célula hospedeira [80]. Considerando a
inibição por substâncias químicas, o processo de invasão e crescimento intracelular do
protozoário T. cruzi foram inibidos, comprovando a importante função dessa proteína para a
estabilização e progressão da doença [87]. Inibidores covalentes reversíveis também têm sido
relatados como potentes substâncias na inibição da atividade de cruzipaína, bem como
relevantes efeitos biológicos em diferentes morfologias do protozoário [86]. Além das
características citadas, a cruzipaína também apresenta alta similaridade com algumas
catepsinas de humanos, como a catepsina L. Essa semelhança ocorre principalmente devido à
massa molecular, condições de reação e seletividade no sítio ativo [71], além da topologia.
Dessa maneira, buscamos também entender os efeitos biológicos obtidos a partir da inibição
da CP em células de mamífero nos próximos capítulos.
3.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar o potencial tripanossomicida dos inibidores de cisteíno proteases;
Determinar a inibição da atividade de CP expressas pelos protozoários da cepa Y de
Trypanosoma cruzi;
Avaliar o efeito biológico dos inibidores durante o processo in vitro de invasão celular.
58
3.2. MATERIAIS E MÉTODOS
3.3.1. Trypanosoma cruzi
A forma epimastigota dos protozoários da cepa Y de T. cruzi foi cultivada por no máximo
sete dias à 25 °C em tubo de centrífuga de 50 mL com meio LIT pH 7,2 ± 0,2 suplementado
com: 10 % FBS inativado, 0,5 % penicilina/estreptomicina, 0,2 % glicose 0,01 % imina bovina,
0,4 % cloreto de sódio (NaCl), 0,04 % cloreto de potássio (KCl), 0,8 % de difosfato de sódio
(Na2HPO4), 0,5 % de triptose, 0,5 % de infuso de fígado, 0,1 % de imina. Após cada período de
cultura foi realizado uma nova passagem para manutenção dos parasitos.
3.3.2. Células LLC-MK2
A células epiteliais de rim de macaco LLC-MK2 foram mantidas em frascos de cultura
T75 a 37 oC em 5% CO2 em meio comercial RPMI-1640 (Cultilab) pH 7,2 ± 0,2 modificado com
0,22 % de bicarbonato de sódio (Na2CO3), 0,2 % glutamina. A manutenção celular foi realizada
a cada 72 h.
3.3.3. Atividade tripanossomicida
A partir de uma solução estoque a 50 mM em DMSO dos compostos testados frente aos
protozoários de T. cruzi, diferentes concentrações foram preparadas na concentração final
limite do solvente de 0,5%. Para as células parasitárias (forma tripomastigota) foi preparada
uma solução da substância diluída em meio de cultura em uma concentração dez vezes maior
do que a desejada. Assim, 10 µL dessa solução concentrada foi dez vezes diluída diretamente
no poço, contendo 90 µL de parasitos à concentração de 1·107 cel·mL-1 e incubada por 24 h. A
viabilidade foi determinada a partir do método colorimétrico com MTT ou por citometria de
fluxo, como descrito a seguir.
3.3.3.1. Método colorimétrico – MTT
A viabilidade celular da forma promastigota dos protozoários foi avaliada utilizando o
ensaio colorimétrico com MTT na presença de PMS. Para o ensaio, 10 µL de uma solução de 5
mg de MTT diluído em 1 mL de PBS juntamente com 0,22 mg PMS foi incubada com os
protozoários por 4 h. Após esse período, 70 µL de uma solução 10% SDS e 0,01% HCl foram
adicionados às amostras juntamente com 30 µL de DMSO por 90 minutos para solubilização
59
dos cristais de formazan formados pela reação. A viabilidade foi determinada a partir da
absorbância medida pelo espectrofotômetro a λ = 570 nm.
3.3.3.2. Densidade celular por citometria de fluxo
A citometria de fluxo foi utilizada para determinação da densidade celular para o
acompanhamento do crescimento in vitro da forma promastigota dos protozoários na
presença de diferentes inibidores de CP. As células parasitárias foram diluídas em PBS (cinco
ou dez vezes) e a concentração celular foi realizada a partir da distribuição das populações
celulares em relação ao tamanho de partícula, separando células inteiras de fragmentos
celulares usando o módulo InCyte no programa guavaSoft2.7 no citômetro de fluxo.
3.3.4. Atividade proteolítica
3.3.4.1. Atividade proteolítica no lisado celular
Após 5 dias a infecção em frascos infectados, a forma tripomastigota foi liberada para o
meio extracelular devido à alta densidade parasitária citoplasmática. Esses protozoários na
forma infectante foram então ajustados para a concentração de a 1·10-6 cel·mL-1,
centrifugados a 500 G, e ressuspensos em 10 mL de tampão fosfato de sódio frio (10 mM, pH
8,0). Os parasitos foram lisados e a atividade proteolítica foi determinada como previamente
descrito em 3.2.4.2.
3.3.4.2. Atividade em amastigota extracelular
Após dez dias da infecção celular no frasco de cultura, a alta densidade do parasito
intracelular promove a lise da célula hospedeira e é possível encontrar formas amastigotas
extracelulares. A atividade proteolítica no interior da amastigota extracelular intacta foi
analisada utilizando o substrato fluorogênico seletivo Z-FR-MCA. Após a incubação do
parasito por diferentes períodos com inibidores, todas as amostras foram transferidas para
uma placa preta de 96 poços e 10 µM da solução de substrato foram adicionados a cada
poço, seguido de 15 min de incubação. As imagens foram obtidas usando microscopia
fluorescente pelo sistema de imagem EVOS FL da Thermo Fisher Scientific. A análise foi
qualitativa e comparada com a análise quantitativa realizada com o extrato extracelular.
60
3.3.5. Avaliação da atividade tripanossomicida em amastigota intracelular
3.3.5.1. Cepa Tulahuen
Os ensaios com a cepa Tulahuen foram realizados no laboratório de parasitologia do
Prof. Sérgio de Albuquerque da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto com o
auxílio da Dra. Carla Lopez. Para o ensaio, foi utilizado o protozoário geneticamente
modificado para expressão de β-galactosidase, no qual as células hospedeiras da linhagem
LLC-MK2 foram plaqueadas em placas de 96 poços na concentração de 5·104 células·mL-1. A
forma infectante tripomastigotas da cepa Tulahuen LacZ foi adicionada na concentração de
5·105 parasitos·mL-1 e incubada por 48 h a 37 °C e atmosfera de 5 % de CO2. Após o período
de incubação, as tripomastigotas presentes no sobrenadante foram retiradas com sucessivas
lavagens com PBS, permanecendo apenas as formas amastigotas intracelulares. Os inibidores
a serem testados foram adicionados às células em diferentes concentrações seguido por
incubação de 72 h. Ao final deste período o substrato CPRG (chlorophenol red β-D-
galactopyranoside, 400 μM em 0,3 % Triton X-100, pH 7,4) foi adicionado e incubado por 4 h
a 37°C. Após incubação, as placas foram analisadas em espectrofotômetroemà 570 nm,
utilizando como controle positivo o Benzonidazol nas mesmas concentrações das substâncias
e como controle negativo o DMSO, solvente utilizado para solubilização das mesmas.
3.3.5.2. Cepa Y
Os ensaios foram realizados em placas de 96 poços, com incubação das células
imortalizadas de camundongo Mus musculus da linhagem C2C12 na concentração de 5·104
células·mL-1. As formas tripomastigotas da cepa Y foram adicionadas na concentração de
2,5·105 parasitos·mL-1 e incubadas overnight a 37 °C com 5 % de CO2. Após esse período, as
formas tripomastigotas presentes no sobrenadante foram retiradas com sucessivas lavagens
com PBS, permanecendo apenas as formas amastigotas intracelulares. As substâncias a serem
testadas foram adicionadas em diferentes concentrações e incubadas por 72 h. Ao final deste
período, as placas foram sucessivamente lavadas com PBS, fixadas com 4 % de formaldeído,
coradas com DAPI e analisadas no HTS (High Content Screening). Foram utilizados como
controle positivo o Benzonidazol nas mesmas concentrações das substâncias e como controle
negativo o DMSO, solvente utilizado para solubilização das mesmas.
61
3.3.6. Ensaios de invasão e índice de internalização
A fim de determinar o potencial inibitório de invasão parasitária in vitro a partir dos
inibidores de CP, a infecção parasitária foi avaliada usando três condições: (i) a forma
tripomastigotas e os compostos (1 e 10 µM) foram incubados com as células hospedeiras por
18 h; (ii) tripomastigotas foram previamente incubadas com os compostos nas mesmas
concentrações durante 2 h, centrifugadas a 465 G para substituir o meio e remover os
compostos, seguido da infecção celular; (iii) as células aderentes de mamífero utilizadas como
hospedeiras (LLC-MK2) foram previamente incubadas com os compostos utilizando as
mesmas condições durante 2 h, lavadas duas vezes com PBS e depois a infecção foi realizada
com tripomastigotas. Para todos os experimentos, foi utilizada uma proporção de células
hospedeiras 1: 5 parasitos, bem como a incubação do sistema a 37 °C, 5 % de CO2 com 90 %
de umidade. No final da infecção, as células hospedeiras foram lavadas três vezes com PBS,
fixadas com formaldeído a 5 % e coradas com DAPI. Imagens foram obtidas com microscopia
de epifluorescência e o índice de invasão foi determinado considerando a condição não
tratada como 100 %.
3.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.4.1. Avaliação da inibição da atividade proteolítica
Todos os compostos foram caracterizados como inibidores potentes da cisteíno
protease [39], [40]. Em particular, são potentes inibidores da cruzaína, uma forma
recombinante de cruzipaína [39]. Aqui, uma comparação entre a inibição da atividade da
cisteíno protease em lisados e parasitos intactos foi investigada para caracterizar a
seletividade e potência de nossos compostos usando diferentes condições e fontes proteicas.
A expressão da cruzipaína é conhecida por ocorrer em todos os estágios do ciclo de vida do
parasito e sua atividade é essencial para vários processos celulares [88]. Em geral, a maioria
dos compostos foi capaz de inibir a atividade proteolítica na faixa de 40-50% nos lisados
celulares para ambos ou pelo menos uma das morfologias do parasito (Tabela 3). A diferença
entre a atividade inibitória de proteases de lisados epimastigotas e tripomastigotas pode ser
devida ao complexo de isoformas de cruzipaína e outras CP expressas e seus níveis nesses
respectivos estágios do ciclo de vida [71]. No entanto, a seletividade entre as proteases de
diferentes morfologias dos protozoários foi diferente entre os inibidores, com maior
62
preferência para as proteases do extrato enzimático obtido a partir da lise celular de
tripomastigotas. Sabe-se também que há um nível mais elevado de cruzipaína extracelular nas
formas tripomastigotas [71]. Pode ser a razão da maior preferência ou inibição facilitada da
atividade proteolítica nesse extrato intracelular, uma vez que a cruzipaína é encontrada
preferencialmente no ambiente extracelular nessa morfologia.
Uma ação proteolítica inibitória dependente do tempo foi observada para derivados de
dipeptidil nitrila em formas amastigotas extracelulares analisadas por microscopia de
fluorescência, sem efeito tóxico para os parasitos (Tabela 3). Todos os inibidores foram
eficientes em promover a diminuição da fluorescência referente à conversão do substrato
seletivo Z-FR-MCA em 6 h, principalmente Neq0662 e Neq0663, enquanto E-64 foi menos
eficaz nas mesmas condições. No entanto, após um período prolongado de incubação, os
inibidores reversíveis tiveram sua potência diminuída, apresentando maior fluorescência.
Devido à atividade dependente do tempo, as imagens fluorescentes também foram
interessantes para confirmar o mecanismo de ação proposto para os inibidores de CP, mesmo
que de maneira indireta. Como inibidores reversíveis covalentes competitivos, essas
substâncias podem se ligar ao alvo enzimático presente no parasito, bloqueando sua
interação com o substrato e promovendo a diminuição da fluorescência. Após um longo
período de incubação, a interação entre a enzima e o inibidor é perdida e a enzima se torna
livre novamente para ligar e clivar a molécula do substrato, promovendo um incremento na
fluorescência. Comparando com os inibidores irreversíveis, E-64 e MMTS, promoveu-se o
efeito oposto, no qual a inibição da atividade proteolítica total foi alcançada após 18 h de
incubação. A irreversibilidade de E-64 e MMTS já é bem descrita [89] e esta evidência reforça
o perfil de reversibilidade das dipeptidil nitrilas descritas neste ensaio. Em relação ao perfil
toxicológico, os inibidores reversíveis compõem uma abordagem interessante, devido à
menor probabilidade de apresentarem efeitos colaterais promovidos por efeitos prolongados
fora do alvo, por exemplo, ao atingir e inativar enzimas não-alvo (off target effect) [9].
63
Tabela 3. Inibição relativa (%) da atividade proteolítica (IAP) baseado na hidrólise do
substrato fluorescente seletivo para CP Z-FR-MCA utilizando a morfologia amastigota
(intacta), e lisados celulares de epimastigota e tripomastigota de Trypanosoma cruzi.
Substância IAP – amastigota ¹ IAP – lisado ² (%)
6h 18h Ep. Trip.
Neq0396
15,8 41,9
Neq0583
49,1 16,1
Neq0594
16,8 22,0
Neq0662
* 42,7
Neq0663
* 42,7
Neq0666
ND ND
64
E64
99,2 99,9
MMTS
88,2 53,5
Controle
0,0 0,0
¹ Amastigotas extracelulares foram coletadas da cultura infectada in vitro após a lise
e liberação natural das células e incubada com os inibidores a 10 µM. Após esse período, os
protozoários foram incubados com uma solução do substrato fluorescente seletivo para CP e
as imagens de microscopia de fluorescência foram obtidas. Experimentos obtidos com o
auxílio da doutoranda Daiane Y. Tezuka. ²Os parasitos foram lisados e a atividade proteolítica
foi quantificada, como descrito em 3.2.4.2.
ND: não detectado / * não testado.
3.4.2. Avaliação da seletividade dos inibidores
A afinidade de um inibidor ao seu alvo é considerada constante em termos práticos de
farmacologia com sua interação bioquímica estimada [82]. Além disso, a seletividade é um
ponto importante na descoberta e otimização de um novo fármaco, buscando substâncias
mais seletivas e com menos efeitos colaterais [90]. Consideramos aqui uma triagem baseada
na viabilidade celular contra as células alvo e hospedeira para estabelecer uma ideia sobre a
seletividade de nossos inibidores a 10 µM. Na mesma condição, todos os inibidores
mostraram seletividade significativa para a morfologia tripomastigota, exceto o composto
Neq663 com um perfil tóxico semelhante a os tipos celulares (Figura 16A). Com o objetivo de
alcançar uma faixa de segurança na administração de medicamentos, a atividade biológica e a
possível reatividade cruzada de novos fármacos devem ser compreendidas [9]. No entanto,
mesmo para aqueles inibidores de cruzaína altamente potentes, é bastante difícil
65
correlacionar a inibição da cisteíno protease à morte celular [39]. Em um sistema biológico,
muitas barreiras devem ser superadas após a administração do fármaco para atingir o alvo
macromolecular, e vários trabalhos têm mostrado a importância destes [89, 90]. Os inibidores
também apresentaram atividade tripanossomicida em baixa concentração, na qual o
Neq0583 foi estatisticamente mais potente que o benzonidazol (Figura 16B). Além disso,
Neq0594 e Neq0662 foram tão citotóxicos quanto o fármaco de referência benzonidazol
contra o parasito. Mesmo com um mecanismo de ação diferente do benzonidazol, os
inibidores de CP foram capazes de promover a morte celular da forma infecciosa do parasito.
Assim, os próximos ensaios foram baseados em hipóteses sobre o seu efeito durante a
invasão e proliferação celular no perfil biológico complementar para o composto.
66
Figura 16. Viabilidade celular da célula hospedeira LLC-MK2 e tripomastigota de T. cruzi
cepa Y incubada por 24 h com os inibidores a 10 µM (A). O teste t não pareado foi realizado
para verificar a diferença significativa entre a seletividade para hospedar e as células parasitos
com valores de P <0,05. Também foram realizadas comparações múltiplas pelo teste de
Dunnet entre a atividade biológica de dos inibidores de CP e o fármaco de referência
benzonidazol contra tripomastigotas da cepa Y de Trypanosoma cruzi, com base em valores
de P <0,05 (B).
FONTE: Autoria própria.
3.4.3. Inibição do crescimento de amastigotas intracelulares
Diferentes cepas são responsáveis por características bioquímicas e moleculares das
linhagens de Trypanosoma cruzi [92]. Devido a essa diversidade genética, a atividade biológica
deve ser verificada em diferentes cepas do protozoário [93]. Aqui, ensaios de concentração-
resposta foram realizados avaliando os inibidores de CP mais potentes nos ensaios anteriores
A)
Diferença entre as médias
-60 -40 -20 0 20 40
Benzonidazol - Neq0396
Benzonidazol - Neq0583
Benzonidazol - Neq0594
Benzonidazol - Neq0662
Benzonidazol - Neq0663
Benzonidazol - Neq0666
Benzonidazol - E-64
Inibidores (10 M | 24h)
Via
bil
ida
de
ce
lula
r (%
)
Neq
0396
Neq
0583
Neq
0594
Neq
0662
Neq
0663
Neq
0666
Benzo
nida
zol
E-64
0
25
50
75
100
125 LLC-MK2
Tripomastigota
* **
*
** ***
B)
67
(Neq0662, Neq0663 e Neq0666) utilizando células de LLC-MK2 infectadas com diferentes
cepas de T. cruzi (Tulahuen e Y) e o índice de seletividade foi calculado para cada um deles.
Em geral, a cepa de Tulahuen é mais sensível aos compostos conforme o esperado (Tabela 4).
Analisando o índice de seletividade (IS) entre cada cepa de T. cruzi comparada com a célula
hospedeira, a melhor substância foi a Neq0662, mostrando IS maior que 200 e 25 vezes para
as amastigotas de Tulahuen e Y, respectivamente. Este parâmetro reflete na janela de
segurança para tratar a doença sem efeito tóxico para as células hospedeiras, com base na
concentração citotóxica para as células hospedeiras (IC50) e a concentração efetiva contra as
células alvo (EC50). Nenhuma análise mecanística foi feita aqui, mas as análises comparativas
de IS descritas na Tabela 4 podem representar uma dependência das diferentes taxas de
crescimento desses parasitos dentro das células hospedeiras [94], bem como os possíveis
mecanismos de sobrevivência intracelular desenvolvidos e a relevância de atividade
cruzipaína para cada cepa. No entanto, o Neq0662 apresentou IS duas vezes maior para a
cepa mais resistente do T. cruzi do que o fármaco antichagásico disponível no Brasil, o
benzonidazol. É importante ressaltar que a discussão farmacológica sobre o mecanismo de
ação do benzonidazol e do Neq0662 é limitada, uma vez que seus mecanismos de ação são
bastante distintos. A ação do benzonidazol é em parte dependente da formação de radicais
livres induzida pelo estresse oxidativo intracelular [78] com efetividade durante a infecção
aguda, mas ação limitada na fase crônica [95]. Este fato reforça a restrita eficácia da atual
opção de tratamento da Doença de Chagas e a importância de novos fármacos para o
tratamento desta parasitose. Em contraste, os inibidores da cruzaína atuam por inibição do
alvo covalentemente, promovendo a limitação de alguns processos celulares essenciais para a
sobrevivência e estabelecimento de infecção parasitária [84, 95, 96]. Assim, o mecanismo de
ação de nossos inibidores pode ser uma alternativa para atuar no alvo dentro da célula do
parasito, bem como promover o decaimento do número de parasitos intracelulares para
ambas as cepas de protozoários. Além disso, investigamos a eficácia de nossos inibidores de
cruzaína a nível bioquímico em suprimir a infecção in vitro, como discutida no próximo tópico.
68
Tabela 4. Índice citotóxico contra a célula hospedeira isolada (EC50 para LLC-MK2) e as
cepas intracelulares Tulahuen e Y de T. cruzi (IC50). O índice de seletividade (IS) é mostrado
como a relação EC50 / IC50.
Inibidor
LLC-MK2 Cepa Tulahuen Cepa Y
EC50 (µM) IC50 (µM) IS IC50 (µM) IS
Neq0662 146,7 (± 7,55) 0,72 (± 0,03) 203 5,86 (± 0.16) 25,0
Neq0663 107,3 (± 6,12) 7,68 (± 0,69) 13,9 106,7 (± 0.54) 1,00
Neq0666 69,45 (± 4,78) 43,42 (± 3,96) 1,59 6,73 (± 0.28) 10,3
Benzonidazol 61,6 (± 6.12) 3,23 (± ) 4,29 19,1 5,37 (± 0.38) 11,5
Algumas características estruturais foram determinantes para a atividade biológica
apresentada na Tabela 4. Uma atividade completamente diferente foi observada para os
diastereômeros Neq0662 e Neq0663 (Figura 17). A inversão da estereoquímica para o grupo
CF3 que fica no início do sítio P3 foi crucial para a atividade, alterando a potência em cerca de
18 vezes em relação às amastigotas da cepa Y. Essa diferença é provavelmente devida a
características estruturais, uma vez que a estereoquímica do substituinte CF3 parece ser um
fator essencial para o reconhecimento e a estabilização do inibidor no sítio da enzima. Essas
diferentes posições de grupo são essenciais para o planejamento de inibidores covalentes de
CP, uma vez que essas posições no sítio ativo da enzima são responsáveis pela sua
seletividade [10]. É observado também que para Neq0662 e Neq0663 a alteração da
esteroquímica do grupo trifluorocarbonil em P2 de R (Neq0662) para S (Neq0663) promoveu
uma redução na potência para ambas as cepas: Tulahuen (10x) e Y (18x). Para o Neq0666,
uma mudança radical dos grupos químicos substituindo todas as posições (P1, P2 e P3) levou
a uma mudança completa na potência e na seletividade, com maior preferência para a cepa Y.
69
3.4.4. Avaliação da supressão da invasão in vitro dos protozoários pelos inibidores
A cruzipaína tem sido evidenciada como uma enzima crucial para invasão da célula
hospedeira por parasitos de T. cruzi, mesmo no hospedeiro invertebrado [85, 97]. Para
investigar melhor o efeito biológico de nossos inibidores durante a infecção in vitro de células
de mamíferos por protozoários de T. cruzi, diferentes esquemas de tratamento com os
melhores inibidores de CP foram realizados para caracterizar sua atividade durante este
processo. Parasitos deficientes em cruzipaína não apresentam invasão ou desenvolvimento
intracelular, além de não modificarem a resposta imune da célula hospedeira em ensaios in
vitro, comprovando a importância dessa enzima para o desenvolvimento do ciclo de vida do
parasito [80]. Aqui, observamos uma supressão da invasão parasitária durante o modelo de
infecção in vitro de cerca de 60% para as substâncias Neq0662 e Neq0666, enquanto 80% foi
atingido para Neq0663 quando as células hospedeiras foram tratadas com 10 µM do inibidor
(Figura 17). Em geral, a inibição da invasão foi dependente da concentração do inibidor para
todos os tratamentos, com melhor supressão da invasão quando utilizada a maior
concentração da substância. Os resultados mostram claramente a atividade de Neq0662,
Neq0663 e Neq0666, responsáveis por mais de 50% da inibição da invasão tripomastigota,
mesmo quando usadas para tratar as células hospedeiras anteriormente. Com base nisso,
propomos que os inibidores possam se acumular rapidamente dentro da célula hospedeira,
promovendo a inibição da invasão. Essa característica físico-química tem sido reportada aos
sais de bistiazólio aplicados contra Plasmodium falciparum, nos quais também foram capazes
de se acumular dentro da célula hospedeira, promovendo sua atividade antimalárica [99].
Uma vez incubada com os inibidores de cisteíno protease, a infecção parasitária da célula
hospedeira também foi significativamente suprimida, o que reforça a hipótese do papel
crucial das CP durante a invasão da célula hospedeira e a sobrevivência do parasito. De
acordo com a literatura, a inibição da cisteíno protease cruzipaína afeta o desenvolvimento
do parasito intracelular em macrófagos, com redução da taxa de parasitemia semelhante ao
benzonidazol em camundongos infectados [100]. Além disso, estudos in vivo também
mostram a diminuição do dano cardíaco pela ação de um inibidor irreversível da cisteíno
protease [97]. No geral, nossos inibidores não foram citotóxicos para as células hospedeiras,
no qual evidencia o efeito antiparasitário seletivo em direção ao T. cruzi (Figura 16A). A
seletividade de um fármaco tem sido um dos pontos mais difíceis quando as CP são utilizadas
como alvo terapêutico, devido à alta similaridade dessa classe de proteínas, mesmo de
70
diferentes tipos celulares [36]. Nossos compostos atendem a este requisito importante de
acordo com estudos realizados com diferentes classes de proteases (Figura 12). Entretanto,
estudos futuros podem ser realizados para determinar o perfil de atividade in vivo destas
sustâncias, uma vez que se mostraram candidatas promissoras para o desenvolvimento de
novos fármacos.
71
Figura 17: Supressão da infecção in vitro pela cepa tripomastigota de T. cruzi em células
LLCMK-2 é promovida pelos inibidores da cruzipaína sob tratamento diferenciado: célula
hospedeira previamente tratada com os inibidores por 2 h (barras azuis); tripomastigota pré-
tratado por 2 h com os inibidores (barras verdes) e infecção parasitária na presença de IPC
(barras púrpuras) (A). Estrutura química dos inibidores de cruzipaína mais potentes para o
ensaio de invasão (B).
FONTE: Autoria própria.
A) Neq0662
Neq0663
Neq0666
B)
72
CONCLUSÕES PARCIAIS
A atividade de CP no interior das amastigotas foi consideravelmente inibida de maneira
reversível pelas nossas substâncias, com maior potência contra o extrato enzimático obtido a
partir da lise de tripomastigotas. Além disso, essa preferência pelas CP do parasito levou à
supressão da invasão parasitária por nossos inibidores em todos os tratamentos, mostrando a
importância dessa classe de enzimas para a infecção e estabelecimento da doença. Por fim, o
Neq0662 foi mais eficiente na diminuição do número de parasitos intracelulares com maior IS
do que o fármaco comercial benzonidazol. Mais do que uma alternativa para controlar a taxa
de proliferação de protozoários dentro das células hospedeiras, os inibidores da cruzaína
também se mostraram promissores para aplicação no controle da infecção parasitária em
estudos in vitro, com promissor resultado em relação à parada do ciclo de vida do parasito.
De maneira geral, a atividade de CP foi considerada relevante em todas as morfologias do
parasito, além de sua importância durante o processo de infeção celular, comprovando sua
funcionalidade como alvo terapêutico no desenvolvimento de fármacos para o tratamento da
doença de Chagas.
73
CAPÍTULO 4
Atividade Antineoplásica de inibidores de cisteíno proteaseas na linhagem celular de câncer de pâncreas
MiaPaCa-2.
As atividades descritas nesse capítulo estão publicadas em:
J. C. Quilles Junior, M. D. Bernardi, P. H. J. Batista, S. C. M. Silva, C. M. R. Rocha, C. A. Montanari, A. Leitão.
Biological Activity and Physicochemical Properties of Dipeptidyl Nitrile Derivatives against Pancreatic Ductal
Adenocarcinoma Cells (2018). Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry.
DOI: 10.2174/1871520618666181029141649
74
4.1. REVISÃO BIBLIOGRAFICA
4.1.1. Câncer e Metástase
O acúmulo de alterações genéticas ocasionadas por fatores intra ou extracelulares é
fundamental para a anormalidade celular induzindo o crescimento e divisão celular de
maneira descontrolada. Sem responder adequadamente aos sinais de controle do
comportamento normal celular, tais características evidenciam o perfil de células cancerosas,
implicando na perda generalizada de suas funções e a acumulação dessas células levando a
formação do tumor primário no tecido originário [101].
Após sucessivas etapas de divisão celular com o acúmulo de aberrações genéticas, as
alterações nas características da célula podem promover a capacidade invasiva, originando o
processo de metástase [101]. A formação do tumor em outro tecido diferente do originário é
apresentada na Figura 18. Complexos eventos celulares são requeridos para o processo
metastático, tais como: (a) invasão através da degradação da matriz extracelular; (b) alcance
dos vasos sanguíneos; (c) permanência e transporte na corrente sanguínea; (d) instalação em
tecidos distantes do originário; (e) sobrevivência nesse novo ambiente e (f) reinício da
proliferação e sobrevivência celular no local metastático, processo conhecido como cascata
de invasão-metástase [102].
Figura 18. Processo geral de formação de metástase por células cancerosas.
FONTE: adaptado de VALASTYAN, et al., 2011 [102].
75
4.1.2. Câncer de Pâncreas e Catepsina L
O pâncreas é uma glândula localizada na parte abdominal e apresenta função endócrina
e exócrina compondo o sistema digestivo. A combinação das funções dos compartimentos
exócrino e endócrino é essencial para metabolismo sistêmico de nutrientes, auxiliando o
processo de digestão e a subsequente regulação da homeostase da glicose sanguínea. A
maior parte do pâncreas é formada por células com função exócrina, constituindo até 90% do
tecido, enquanto o compartimento endócrino compreende cerca de 1-2% do pâncreas [98,
99].
O câncer de pâncreas é extremamente agressivo, com característica invasiva e
migratória que contribui para a progressão do processo metastático [31]. Dentre os cinco
tipos de cânceres mais fatais, o câncer de pâncreas apresenta baixa expectativa de
sobrevivência após sua descoberta, em torno de 5-6% [105]. No Brasil, 4% de todas as mortes
causadas por câncer são decorrentes ao câncer de pâncreas, segundo o Instituto Nacional do
Câncer (INCA). Com difícil diagnóstico e poucas alterativas terapêuticas, a única chance de
cura é a ressecção cirúrgica, porém, 75% dos pacientes cirúrgicos ainda apresentam a doença
na forma metastática [106]. Após a cirurgia, radioterapia e quimioterapia são as opções para
a progressão do tratamento. A gencitabina é um dos quimioterápicos mais utilizados,
apresentando maior percentual no aumento da sobrevida dos pacientes cirúrgicos [107].
Entretanto, o sucesso da quimioterapia com gencitabina tem apresentado limitações devido à
rápida resistência adquirida pelo tumor, o que leva a propor novos estudos para
desenvolvimento de terapias [105], também baseadas em diferentes alvos.
As cisteíno catepsinas estão presentes em células de mamíferos e com importantes
funções para o desenvolvimento e progressão do tumor, como o processo de angiogênese,
apoptose e metástase [108], [109]. O termo catepsina refere-se às aspartato, serino e cisteíno
proteases (B, C, H, F, K, L, O, S, V) intracelulares que atuam na degradação proteica nos
lisossomos e no processamento de proteínas em outras organelas [109]. Entretanto,
evidências de que são importantes no processo de degradação da matriz proteica e na
mobilidade celular também comprovam sua capacidade de serem ativas em ambiente
extracelular [110], o que sugere que seu substrato e função variam de acordo com sua
localização [16].
A expressão de CP tem sido observada em diferentes tipos de tumores, como ovário,
mama, próstata, pulmão, pâncreas e gástrico, além de seu nível de expressão estar
76
relacionado ao grau de estágio da doença [111]. Dentre as CP conhecidas, as catepsinas B e L
(CTSB e CTSL) são consideradas biomarcadores em células cancerosas, com diferentes níveis
de expressão, no qual se apresentam em maiores quantidades nos tumores metastáticos [36].
Além disso, elas não só se apresentam essenciais para os processos de invasão e migração
celular, mas também desempenham importante papel na auto proteólise e ativação dos
fatores de crescimento e citosinas [33].
A relevância da CTSL no processo metastático tem indicado que tal comportamento
celular é auxiliado pela atividade de desta enzima, levando ao processo de invasão e migração
celular [112]. Devido a isso, a inibição de CTSL em células cancerosas com característica
invasiva é considerada como uma alternativa terapêutica o tratamento e controle de
tumores. Uma das etapas essenciais durante a cascata metastática é a degradação da matriz
extracelular [102], processo bem característico de células com potencial migratório. A partir
da ação de um inibidor competitivo de CTSL, o KD-1, a degradação de colágeno por essa
cisteíno protease foi inibida, bem como a atividade da enzima em células de câncer
metastático de mama [113]. Outra característica de células tumorais é o crescimento
descontrolado dessas células e a sua aglomeração no tecido originário, formando o tumor
primário. Estudos genéticos evidenciaram a participação essencial de CTSL durante o
desenvolvimento da doença e, mesmo com a inatividade da inibição enzimática para o início
da progressão do tumor, efeito antitumoral foi observado nas etapas posteriores de evolução
da doença [114]. O ciclo celular é também um processo essencial para a proliferação celular
e sua regulação pode ser afetada pela atividade de CTSL, devido à participação da forma
truncada da enzina na degradação de importantes fatores nucleares de transcrição [115].
Esses exemplos evidenciam a importância da CTSL para processos celulares voltados para a
progressão e estabelecimento do câncer, e em geral, torna a CTSL um alvo promissor na
busca por novas alternativas terapêuticas.
4.1.3. Terapia combinada como alternativa terapêutica
O uso de combinações de fármacos com mecanismos de ação diferentes com o intuito
de atingir diferentes populações celulares é conhecido como terapia combinada e visa obter
respostas mais eficazes do que as observadas pela monoterapia. O sinergismo do efeito
terapêutico com a redução da dose e toxicidade, estão dentre os efeitos almejados pela
terapia combinada, além de retardar o processo de resistência a fármacos adquiridos pelas
77
células [116]. Dessa maneira, as adaptações das células cancerosas podem ser suprimidas
pela administração de fármacos quimioterápicos com diferentes mecanismos de ação,
reduzindo o surgimento de novas células tumorais. Os fármacos anticancerígenos baseados
em mecanismos similares podem atuar de forma sinérgica, promovendo maior seletividade
ao alvo e melhor eficiência terapêutica [117]. Esse método alternativo de terapia tem sido
utilizado em algumas doenças, como câncer, hipertensão e AIDS. Baseado nisso, indústrias
farmacêuticas têm dedicado atenção na descoberta de novas entidades moleculares,
reformulando substâncias existentes em combinação com novos produtos [118].
Além da aplicação da terapia combinada como agente antineoplásico, seu uso no
tratamento de parasitoses como a doença de Chagas também tem sido evidenciado [63].
Inibidores de CP têm se mostrado ativos, mesmo em protozoários resistentes aos fármacos
nifurtimox e benzonidazol. Além disso, sua aplicação em combinação com benzonidazol
alcançou efeito aditivo de morte parasitária [83]. Nesse trabalho, buscamos aplicar a
combinação de nossos inibidores com o fármaco de referência utilizado no tratamento do
câncer de pâncreas para avaliar os benefícios terapêuticos da combinação dessas substâncias.
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar o efeito de novos inibidores de cisteíno proteases em células de câncer
metastático de pâncreas (MiaPaCa-2);
Determinar o potencial citostático dos melhores inibidores em modelos 2D e 3D de
MiaPaCa-2 por ensaios de migração, formação de colônias e análise do ciclo celular;
Avaliar a combinação dos melhores inibidores de CP com o fármaco de referência no
tratamento do câncer de pâncreas (gencitabina);
Quantificar a inibição da atividade proteolítica de CP expressas pela linhagem
MiaPaCa-2 obtidas a partir da lise celular.
78
4.3. MATERIAIS E MÉTODOS
4.3.1. Cultura Celular
As células de fibroblastos imortalizadas 3T3 clone A-31 oriundas de camundongos
foram cultivadas em meio DMEM com vermelho fenol (pH 7,2 ± 0,2) suplementado com: 0,15
% bicarbonato de sódio (NaHCO3), 0,35 % glicose (C6H12O6), 10 % FBS inativado e 0,5 %
penicilina/estreptomicina (v/v). As células foram mantidas em garrafas de cultura T75 a 37 °C
em 5 % CO2 durante 3 dias ou até atingirem a confluência de 70 %. Para as células de câncer
de pâncreas MiaPaca-2 o mesmo procedimento foi realizado, com a adição de 2,5 % de soro
de cavalo.
4.3.2. Viabilidade Celular
A viabilidade celular foi avaliada utilizando o ensaio colorimétrico com MTT diluído em 1
mL de meio de cultura na concentração final de 5 mg·mL-1. Após incubação com os inibidores,
o meio de cultura foi trocado por 100 µL de meio contendo MTT e incubados por 3 h. Após
esse período, o meio de cultura foi aspirado e 100 µL de DMSO foram adicionados às células
para solubilização dos cristais de formazan com leitura da absorbância a λ = 570 nm após 30
minutos.
4.3.3. Inibição da atividade de cisteíno protease
A atividade proteolítica total no lisado celular foi avaliada como descrito no item 2.2.4.2
com algumas adaptações para as células de mamífero. As células foram cultivadas como
descrito anteriormente, ajustadas na concentração de 106 cel·mL-1 e ressuspendidas em
tampão fosfato gelado 1 M pH 8,0 e lisadas e concentradas, com descrito anteriormente no
item indicado. A concentração proteica total foi determinada pelo método de Bradford,
seguido da incubação por 15 minutos com os inibidores estudados e os inibidores padrões de
serino (fluoreto de fenilmetanosulfonil – PMSF), cisteíno (metanietiossulfonato de metila –
MMTS) e metalo proteases (ácido etilenodiamino tetra-acético – EDTA) para análise da
atividade enzimática. Um coquetel comercial de inibição de proteases (Sigma-Aldrich®)
também foi utilizado para estudar a seletividade dos inibidores. A partir da cinética
enzimática utilizando o substrato fluorescente Z-FR-MCA seletivo para CP, a inibição
79
enzimática foi aferida e calculada relativamente comparando as velocidades máximas das
amostras tratadas com inibidores com as amostras sem tratamento (controle).
4.3.4. Crescimento celular
A proliferação de células MiaPaca-2 no modelo 2D foi determinada por citometria de
fluxo. A concentração inicial de células (104 cel·mL-1) foi semeada em placas de 96 poços
juntamente com inibidores de 10 µM. A cada 24 h, as células foram quantificadas com o
programa ViaCount Assay. Células sem tratamento compuseram o controle negativo para
determinar a taxa de propagação celular. Para cultura 3D, as células MiaPaca-2 foram
cultivadas como descrito anteriormente até alta confluência (80%). Em seguida, as células
foram tripsinizadas e ressuspensas em meio completo em concentrações celulares
apropriadas (500 células por poço) para formar esferoides tumorais multicelulares (ETMC)
pela ação da gravidade usando o Placa Perfecta 3D drop®. Após três dias, os esferoides foram
transferidos para uma placa de 96 poços revestida com ágar, na qual foram mantidos em
cultura durante o período do ensaio. Para este ensaio, Neq0554 e Neq0551 foram escolhidos
devido ao seu resultado citostático em culturas 2D. Os esferoides foram cultivados durante 9
dias com troca do meio de cultura cada 3 dias por meio fresco ou compostos a 10 e 100. As
imagens também foram tiradas a cada 3 dias, com medidas do diâmetro esferóide e do
volume determinado a assumir uma forma esférica no ImageJ software.
4.3.5. Análise do ciclo celular
As células MiaPaca-2 foram tratadas com 10 µM de cada inibidor e incubadas durante
24 h. Após o período de incubação, as células foram ressuspendidas com solução de
tripsina/EDTA 10 %, centrifugadas a 500 G e incubadas overnight com etanol 70 % a 4 °C.
Após incubação, o etanol foi removido por centrifugação e 100 µL do reagente de ciclo celular
Guava (Merck-Millipore®) foram adicionados ao pellet celular em banho de gelo e incubados
por 30 minutos antes da leitura. A análise foi realizada utilizando o módulo de ciclo celular do
Citômetro de Fluxo EasyCyte 8HT da Guava (Merck Millipore®).
4.3.6. Ensaios citostáticos: migração celular e formação de colônias
O potencial migratório das células MiaPaCa-2 foi determinado utilizando insertos para
placas de 24 poços (BD Biosciences®). As células foram diluídas para a concentração de 2·105
80
cel·mL-1 em meio DMEM isento de soro e semeadas na parte superior do inserto, com
imersão do mesmo em meio DMEM contendo 10 % de soro. Este sistema foi incubado a 37
°C, 5 % de CO2 durante 24 h. As células foram então fixadas com metanol durante 5 minutos e
coradas com solução de Giemsa® a 10 %. O controle negativo incluiu poços sem soro,
utilizado como agente quimiotático. Experimentos foram realizados em duplicata, com
imagens obtidas usando microscopia ótica para contar o número de células que migraram
para o lado inferior da membrana onde o soro estava disponível.
A análise da proliferação celular por formação de colônias foi realizada utilizando uma
placa de 6 poços com 3·102 cel·poço-1 no volume final de 1 mL. Após a adesão celular (18 h),
os inibidores foram incubados a 10 µM por 72 h de incubação a 37 °C e 5 % de CO2. Após
incubação, o meio foi substituído por 4 mL de meio sem inibidores e incubado por mais 7 dias
nas mesmas condições. Ao final, as células foram fixadas com metanol por 5 minutos e
coradas com solução de Giemsa® a 10 %. Os experimentos foram realizados em duplicata e
analisados por microscopia óptica. Imagens dos poços foram processadas usando o software
ImageJ para obter o conjunto de parâmetros: diâmetro, área total e número de colônias.
4.3.7. Ensaios de terapia combinada com gencitabina
As células MiaPaCa-2 foram semeadas em placas de 96 poços. Após adesão, meio de
cultura contendo inibidores a 10 µM, DMSO a 0,5 % (v/v) (controle negativo) ou gencitabina
(controle positivo) foram adicionados. Os ensaios de terapia combinada foram realizados em
duas formas distintas: (i) as células foram incubadas com inibidores a 10 µM durante 24 h
com posterior troca por meio contendo gencitabina a 200 nM (correspondendo ao valor de
IC50) seguida por 48 h de incubação; (ii) as células foram expostas à solução de meio contendo
10 µM de inibidores e 200 nM de gencitabina durante 72 h. A viabilidade celular foi
determinada pelo método MTT. Os experimentos foram realizados em triplicata e os
resultados foram comparados com o tratamento de referência (gencitabina) para determinar
a eficiência dos diferentes métodos de combinação das substâncias .
81
4.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.4.1. Atividade antineoplásica de inibidores de CP
A inibição de CP em células cancerosas pode levar a resultados significantes do ponto
de vista farmacológico, como futuros candidatos a fármacos para tratamento de carcinomas,
uma vez que essas enzimas são consideradas essenciais em diversos processos de regulação
celular em diferentes células tumorais [31]. Os inibidores de CP foram avaliados quanto ao
seu potencial anticancerígeno para a linhagem metastática de câncer de pâncreas MiaPaCa-2
e células de fibroblasto foram utilizadas como controle de células não tumorais para avaliação
citotóxica e seletividade. Após 72 h de incubação, o potencial anticancerígeno observado para
os inibidores não foi relevante do ponto de vista de morte celular (Figura 19). Porém, de
acordo com os resultados obtidos, poucas foram as substâncias que se aproximaram de um
efeito tóxico para morte de 50% da população tumoral, mesmo na alta concentração
ensaiada de 100 µM para os inibidores. Há uma relação entre a expressão e atividade de CP e
o desenvolvimento do câncer de pâncreas, no qual a remoção dos seus genes levou à
diminuição no potencial inflamatório do tumor, o que indica a relação direta de CP com a via
de morte celular programada [119]. Utilizando células geneticamente mutadas, Gocheva e
colaboradores [108] conseguiriam mapear as principais funções de algumas CP com alto
índice de expressão em modelos in vivo de câncer de pâncreas. Dentre os resultados, os
autores mostraram a importância das catepsinas L e B na proliferação e desenvolvimento do
tumor, com retardamento na proliferação celular das populações modificadas. A CTSL
também tem sido relacionada ao processo de invasão e migração de células tumorais, com
altos índices de expressão em diversos tipos de câncer, como cérebro, mama, próstata e
pâncreas [120]. Devido a isso, possíveis efeitos citostáticos dos nossos inibidores foram
avaliados para identificar os danos gerados por essas substâncias durante o ciclo celular e
proliferação nas células cancerosas em questão nesse trabalho.
82
Figura 19. Os inibidores de CP não apresentam atividade citotóxica para a linhagem
metastática de câncer de pâncreas MiaPaCa-2 e em fibroblastos Balb/C 3T3 clone A-31.
In ib id o r e s ( 1 0 0 M / 7 2 h )
Via
bil
ida
de
ce
lula
r (%
)
Ne q 0 4 0 0
Ne q 0 4 0 9
Ne q 0 4 1 0
Ne q 0 4 1 3
Ne q 0 4 1 4
Ne q 0 4 1 5
Ne q 0 4 1 9
Ne q 0 5 3 5
Ne q 0 5 0 0
Ne q 0 5 3 3
Ne q 0 5 3 6
Ne q 0 5 3 7
Ne q 0 5 4 4
Ne q 0 5 4 6
Ne q 0 5 4 8
Ne q 0 5 4 9
Ne q 0 5 5 0
Ne q 0 5 5 1
Ne q 0 5 5 2
Ne q 0 5 5 4
Ne q 0 5 6 8
Ne q 0 5 6 9
Ne q 0 5 7 0
Ne q 0 5 7 1
Ne q 0 5 7 2
Ne q 0 5 7 3
Ne q 0 5 7 4
Ne q 0 5 7 5
Ne q 0 5 7 6
Ne q 0 5 7 7
Ne q 0 5 7 8
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
3 T 3 - A 3 1 M IA -P a C a 2
FONTE: Autoria própria.
4.4.2. Inibição da atividade intracelular de CP expressas por MiaPaCa-2
As CP são super expressas em diversos tipos de tumores, principalmente em células com
potencial metastático. A inibição dessas enzimas tem sido investigada frente ao processo de
evolução do tumor envolvendo a invasão e migração celular (49,50). Células com potencial
metastático ativam sua cascata de invasão-metástase a partir de proteases, entre elas as
metalo proteases, também responsáveis pela degradação da matriz extracelular (11). Aqui,
utilizando inibidores covalentes específicos de cisteíno (MMTS), serino (PMSF) e metalo
proteases (EDTA) foi realizado o processo de análise da atividade proteolítica obtida a partir
da lise das células de câncer de pâncreas, utilizando o substrato seletivo para CP, Z-FR-MCA
(Figura 20). É observada a seletividade do substrato em relação às CP, nas quais se
apresentam totalmente inativas quando utilizado o inibidor MMTS, diferentemente de
quando inibidores de serino e metalo proteases foram utilizados, o que confirma a
seletividade frente a CP. Como observação adicional, o extrato obtido a partir da lise das
células de MiaPaCa-2 apresentou atividade significativa de metalo proteases, uma
característica de células com potencial metastático que ativam sua cascata de invasão-
metástase a partir de proteases, entre elas as metalo proteases, responsáveis pela
degradação da matriz extracelular [16].
83
Figura 20. Atividade relativa do extrato celular a partir da conversão do substrato
seletivo para CP (Z-FR-MCA) utilizando inibidores específicos para cada classe enzimática:
(PMSF) serino, (MMTS) cisteíno e (EDTA) metalo proteases na concentração de 250 µM (A).
Estruturas químicas dos inibidores padrões utilizados no ensaio de padronização (B) e do
substrato Z-FR-MCA (C).
FONTE: Autoria própria.
Após a determinação da inibição da atividade das proteases utilizando os inibidores padrões e
confirmação da seletividade do substrato, os inibidores de CP foram testados. Baseado em
estudos bioquímicos de outros membros do grupo, somente alguns dos melhores inibidores
de CP foram selecionados, uma vez que nenhuma substância apresentou atividade
antineoplásica relevante. Na concentração testada, todos os compostos foram ativos na
inibição da conversão do substrato fluorogênico, com inibição acima de 60%, com destaque
para as substâncias Neq0551 e Neq0573 (Tabela 5). A inserção do anel ciclopropila na posição
P1 e a alteração do grupo fenol por um substituinte alifático volumoso não influenciaram a
potência de inibição da cisteíno protease. A substituição do anel ciclopropila próximo ao
grupo “wearhead” nitrila já é descrita como uma alternativa estérica para evitar o ataque
nucleofílico promíscuo na porção nitrila, além da melhoria associada à meia-vida da
substância (reduzindo a toxicidade e aumentando a seletividade) [121]. A propriedade
farmacológica foi confirmada comparando o Neq0568 e Neq0569, onde a presença do anel
ciclopropila em P1 foi suficiente para melhr a inibição da conversão do substrato seletivo para
(A)
Inibidores (250 M)
Ati
vid
ade
Rel
ativ
a(%
)
Controle PMSF EDTA MMTS Coquetel
0
25
50
75
100
(B)
PMSF EDTA MMTS
(C)
Z-FR-MCA
84
CP. Curiosamente, a substituição em para- no anel fenólico melhorou a potência do Neq0551
em relação à posição meta- da cloro fenila em Neq0413.
Analisando o perfil inibitório das substâncias, podemos inferir que os compostos são
ativos e possuem interação e atividade inibitória para as CP expressas intracelularmente pelas
células MiaPaCa-2. A inibição de CP leva a concepção de experimentos fenotípicos para
entender a resposta celular alcançada para o mecanismo de ação proposto por inibição
reversível. De maneira indireta, é obtida uma ideia da possível ação biológica das substâncias
na célula, baseado no potencial de inibição da atividade proteolítica. As substâncias levam à
inibição da catepsina L purificada no ensaio bioquímico (dados apresentados na tese de
doutorado de Jean Francisco Rosa Ribeiro), além da inibição da atividade de CP expressas
intracelularmente pelas células. Isso mostra a capacidade inibitória das substâncias testadas,
porém não é suficiente para promover efeitos tóxicos suficientes e levar à morte celular.
Sendo assim, ensaios complementares foram realizados para caracterizar o potencial
citostático das substâncias.
85
Tabela 5. Inibição da atividade proteolítica (ICP) do extrato enzimático obtido a partir da
lise celular e estrutura química dos inibidores. Os resultados foram obtidos a partir de
experimentos com N = 4 e DP > 10%.
Inibidor
Estrutura
R1 R2 R3 IAP (%)
Neq0413 CH2
CH3 66,9
Neq0551 CH2
Ph 90,12
Neq0554 CH2
76,8
Neq0568
CH2 CH2CH(CH3)2
65,5
Neq0569
CH2CH(CH3)2
70,9
Neq0573
CH2C(CH3)3 Ph 88,5
4.4.3. Estudo citostático: ensaio clonogênico e migração celular
Estudos de atividade citostática são essenciais para o controle da progressão de
determinada doença, principalmente doenças com elevado índice de mortalidade e
agressividade, como o câncer de pâncreas. A capacidade de uma única célula de se multiplicar
em uma colônia é essencial para a sobrevivência celular e depende da formação do clone
celular e do processo de replicação [122]. Esse processo é fundamental no desenvolvimento
do câncer, já que uma etapa crucial para o estabelecimento do processo metastático é a
86
replicação celular no tecido diferente do originário [102]. Aqui, o ensaio de replicação celular
baseado na formação de colônias foi realizado a partir da incubação com os inibidores de CP
com as células por 72 h e posterior contagem do número de colônias formadas, quantificando
o diâmetro, a área total e o número de colônias (Figura 21 A, B e C, respectivamente).
Inibidores de quinases foram capazes de diminuir a formação de colônias de células colo
retais, com um papel essencial durante o ciclo celular [123]. Resultados semelhantes foram
obtidos avaliando o potencial clonogênico das células MiaPaCa-2 na presença dos nossos
inibidores, reduzindo a replicação e a formação de colônias em mais de 50%. Os inibidores
Neq0554 e Neq0573 foram capazes de suprimir a formação de colônias sem efeitos tóxicos
nas condições testadas, baseados em estudos de viabilidade celular utilizando as mesmas
condições (dados não mostrados). Assim, podemos afirmar que qualquer alteração do
número ou diâmetro das colônias pode ser avaliada como atividade citostática que não foi
promovida pela morte celular ou outros efeitos citotóxicos. Entretanto, o número de colônias,
quando analisado isoladamente, não é uma indicação válida de atividade citostática. Porém, a
avaliação conjunta desse parâmetro com a área total das colônias, que é baseada na taxa de
proliferação celular, pode evidenciar o efeito citostático da substância. Baseado nisso, todos
os inibidores foram úteis para promover a diminuição da área total das colônias, exceto o
Neq0551. Esse resultado é corroborado pela análise do diâmetro das colônias, que é
proporcional ao número de células que as constituem.
Outra avaliação baseada na ação citostática dos inibidores foi realizada, baseada na
migração celular, curso essencial para processos patológicos com diferentes complexidades
[105]. Para a progressão do câncer, a invasão e a migração celular são cruciais para a
instalação do tumor em uma localização secundária, promovido por vários passos capazes de
promoverem a o processo metastático [124]. Modelos baseados em “Transwell” são usados
para simular as barreiras físicas presentes no microambiente tumoral e a capacidade da célula
de superá-las [125]. Os inibidores estudados foram eficazes em suprimir a migração celular
após 24 h de incubação (Figura 21-E). Em geral, enzimas proteolíticas são responsáveis pelo
controle de determinados processos celulares naturais e essenciais durante a vida celular,
como replicação, invasão, migração e morte celular. Algumas catepsinas, como L, B e X,
desempenham importante papel durante o processo de migração de diferentes sistemas
celulares [16]. A inibição da CP é uma alternativa terapêutica para controlar o tamanho do
tumor por meio da atividade citostática e inibir a migração. Ambos os efeitos são essenciais
87
para manter o tumor localizado, o que poderia ser benéfico para a quimioterapia primária,
com aplicação local e, consequentemente, menos efeitos colaterais. A catepsina L
extracelular é conhecida por ser responsável pela diminuição da interação célula-célula e
inicialização da metástase, e esse processo pode ser diminuído quando sua inibição é
eficiente [112]. A inibição de CP utilizando substâncias comercialmente disponíveis foi capaz
de diminuir a invasão e migração celular [32]. Aqui, todos os inibidores estudados
apresentaram atividade inibitória de CP, além de retardar a progressão tumoral, com
promissora atividade antineoplásica. Além disso, 90% das mortes por câncer humano é
causado pelo tipo metastático [126] e aqui foi possível validar a importância do papel de CP
durante a proliferação de migração celular a partir da atividade dos inibidores de CP,
indicando tal processo como uma abordagem relevante no controle da progressão do câncer
de pâncreas.
Figura 21. Número de colônias (A), área total (B) e diâmetro (C) das colônias formadas
pelas células MiaPaCa-2 após 72 h de incubação com os inibidores. As imagens dos dois
melhores inibidores são mostradas na figura (D). O ensaio de migração celular foi realizado a
partir da contagem do número de células capazes de migrarem fisicamente pelo inserto,
comparado com o controle sem tratamento (E). Análise estatística foi baseada no teste de
comparações múltiplas com o controle, considerando p < 0,05.
FONTE: Autoria própria.
Inibidores (10 M)
Nú
me
ro d
e C
olô
nia
s
Controle
Neq0551
Neq05
54
Neq0568
Neq0569
Neq0573
Neq0587
E-64
0
20
40
60
80
100
*
(A)
*
Inibidores (10 M)
Áre
a t
ota
l (m
m²)
Controle
Neq0551
Neq0554
Neq0568
Neq05
69
Neq0573
Neq0587
E-64
0
50000
100000
150000
200000
250000(B)
*
*
*
*
* *
Inibidores (10 M)
Diâ
me
tro
(m
m)
Controle
Neq0551
Neq0554
Neq0568
Neq0569
Neq0573
Neq0587
E-64
0
500
1000
1500
2000(C)
*
*
* *
(D) Neq055
4
Control
e
Neq057
3
Inibidores (10 M | 24h)
Nú
me
ro d
e c
élu
las
Neq0413
Neq0551
Neq0554
Neq0568
Neq0569
Neq0573
Controle
0
250
500
750
1000(E)
****
*** ***
****
*******
88
4.4.4. Análise do ciclo celular
Uma das principais características das células tumorais é o crescimento celular
descontrolado, desencadeado devido à perda do controle apropriado do ciclo celular [127]. A
regulação do ciclo celular pode ser fortemente afetada pela inibição de catepsina L [34, 79,
92], retardando o crescimento e desenvolvimento celular. Dessa maneira, a interferência de
alguma das fases do ciclo de maneira específica pode afetar a proliferação celular. O estudo
do ciclo das células da linhagem MiaPaCa-2 foi realizado com análise da significância dos
resultados para comprovação estatística da ação das substâncias na concentração não tóxica
de 10 µM por 24 h (Figura 22). De maneira geral, todos os compostos promoveram a
alteração significativa na fase S1, com destaque para Neq0413, Neq0551 e Neq0554. A
diminuição em uma das fases do ciclo ocorre, geralmente, devido à retenção do ciclo celular
na fase seguinte. Dentre os compostos citados, é possível observar a retenção na fase S e
G2/M, em que ocorrem a síntese de DNA e divisão celular, respectivamente. Além da
catepsina extracelular L, uma isoforma nuclear truncada tem sido associada à degradação dos
fatores de transcrição, promovendo a replicação do DNA e a cascata metastática nas células
tumorais [111]. A retenção na fase S pode ser uma indicação da inibição da catepsina L
nuclear, alterando a progressão do ciclo celular. No entanto, outras proteases de cisteíno
desempenham papeis importantes na proliferação celular em distintos compartimentos
celulares. A cisteíno catepsina B foi encontrada no citoplasma das células replicantes,
reforçando sua importância para a progressão do ciclo celular [128]. As substâncias E64 e
E64d utilizadas como controle apresentaram pouca interferência no ciclo celular, mesmo já
sendo conhecidas na literatura como inibidores de CP. Esses resultados comprovam a ação
citostática na diminuição do crescimento celular na presença das substâncias, como
demonstrado no item 4.4.3. Isso sugere que inibidores de CP podem promover relevantes
efeitos citostáticos em células de câncer pancreático, mostrando que os inibidores são ativos
contra o alvo macromolecular proposto.
89
Figura 22. Análise do ciclo celular por citometria de fluxo das células de câncer de
pâncreas MiaPaCa-2 incubadas com inibidores a 10 µM por 24 h. Os resultados foram obtidos
a partir de experimento em duplicata e análise de significância foi realizada com p < 0,05 em
relação ao controle.
S u b s t â n c ia s ( 1 0 M | 2 4 h )
Cic
lo C
elu
lar
(%)
Ne q 0 4 1 3
Ne q 0 5 5 1
Ne q 0 5 5 4
Ne q 0 5 6 8
Ne q 0 5 6 9
Ne q 0 5 7 3
Ne q 0 5 8 7
E -64
E 6 4 d C-
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
G 1
S
G 2 / M
* * * * * * * * * * * *
* * * *
* * * *
* * * *
* *
*
* * * * * * * *
* * * ** * * *
* * *
* * * * * * * ** *
*
* ** ** * * * * * * *
FONTE: Autoria própria.
4.4.5. Avaliação em modelo 3D de cultura celular
Agregados sólidos de células tumorais têm sido utilizados em modelos in vitro para
fornecer estudos mecanísticos de vários aspectos celulares, como crescimento e proliferação
celular, migração e remodelação de matriz [125]. Aqui, escolhemos Neq0551 e Neq0554
como melhores inibidores para avaliar seu efeito no crescimento de esferoides utilizando
células MiaPaCa-2 durante 9 dias. O microambiente 3D prevê resultados distintos da cultura
em monocamada, apresentado resultados mais aplicáveis aos modelos pré-clínicos em
relação à atividade antineoplásica e sensibilidade à ação da substância [111]. Os inibidores
testados seguiram uma tendência semelhante no crescimento de volume até o sexto dia, com
crescimento mais lento a partir do sétimo dia para os esferoides tratados com Neq0554 a 100
µM (Figura 23). No tratamento dos esferoides a concentração mais baixa dos inibidores não
afetou a supressão do seu crescimento (dados não mostrados). A técnica de microscopia tem
sido um dos métodos diretos mais usados para medir a viabilidade celular em sistemas 3D,
considerando o tamanho do agregado celular [129]. Após 9 dias de crescimento, o grupo
controle (esferoides não tratados) e o grupo tratado com Neq0554 a 100 µM apresentaram
um volume médio de 2,6 e 1,6 mm3, respectivamente. Isso ilustra uma ação tempo
90
dependente das substâncias em relação à supressão do crescimento celular para MiaPaCa-2.
Dessa maneira, ao final do experimento, inibição de mais de 1,5 vezes foi observada,
provavelmente, devido à inibição de cisteíno protease. A catepsina B tem sido relatada como
eficiente para promover a supressão da capacidade de invasão em células de glioma in vitro
[130], e quando sua expressão é inibida, o comportamento invasivo de modelos 3D com
células de glioblastoma também diminui [131]. Além da importância das cisteíno proteases no
desenvolvimento do tumor, os processos de invasão e migração celular são dependentes de
metalo proteases ancoradas na membrana [132]. Todos estes resultados exemplificam a
importância destas proteínas durante muitos processos celulares em modelos 3D, apoiando
que a inibição de CP leva à supressão do crescimento celular.
Figura 23. Análise do crescimento celular dos esferoides de células MiaPaCa-2
incubadas com Neq0551 e Neq0554 a 100 µM. A imagem dos esferoides ao final do
experimento é apresentada para cada condição experimental. O ensaio foi realizado em
quadruplicado com desvio padrão apresentado. Experimento realizado pelo Mestre Murillo
Dorilleo Leite Bernardi.
FONTE: Autoria própria.
Tempo de incubação (dias)
Vo
lum
e (
mm
3)
0 3 6 9
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5Neq0551Controle Neq0554
91
4.4.6. Terapia combinada com gencitabina
A combinação de fármacos é um processo que pode promover o aumento da
potência das substâncias e, consequentemente, diminuir possíveis efeitos tóxicos. Em relação
ao câncer de pâncreas, devido ao seu diagnóstico tardio, tratamentos mais eficazes têm sido
alcançados a partir da quimioterapia combinada [133]. Outra relevante informação é a
inibição de catepsinas em células cancerosas, em especial a isoforma L, que tem sido eficiente
para aumentar a ação terapêutica de vários quimioterápicos, reduzindo as concentrações
efetivas em que os efeitos adversos são inevitáveis [120]. Aqui, diferentes estudos foram
realizados para determinação do efeito agonista na terapia combinada dos inibidores de CP
com o fármaco de referência gencitabina. Para isso, todos os ensaios foram realizados
utilizando os inibidores na concentração não tóxica e citostática (10 µM), como já
determinado nas seções anteriores, combinados com o valor de IC50 para gencitabina (200
nm). Primeiramente, os inibidores de CP foram incubados em conjunto com a gencitabina e a
resposta biológica foi monitorada a cada 24 h (Figura 24-A). É notável a potencialização da
ação do fármaco após o período de 72 h para todas as sustâncias, em especial para o
Neq0554. Adicionalmente, uma relação tempo dependente para a terapia combinada foi
observada para ambos os inibidores, apresentando efeito agonista somente após 72 h de
incubação com a gencitabina.
Em uma segunda avaliação, as células foram previamente tratadas com os inibidores
na concentração citostática por 24 h e, posteriormente, foi realizada a substituição por meio
de cultura contendo ICP e gencitabina nas concentrações mencionadas, incubados por mais
48 h. O inibidor Neq0554 também foi o mais efetivo na potencialização da atividade biológica
de gencitabina quando aplicado previamente por 24 h antes do tratamento com o fármaco
por 48 h (Figura 24-B). Como apresentado anteriormente, o pré-tratamento com inibidores
de CP durante 24 h mostrou-se efetivo na inibição da migração e crescimento celular, o que
evidencia que esse seria o tempo para a ação das substâncias em promoverem efeitos
citostáticos suficientes para potencializar o fármaco gencitabina. A inibição de CP em células
cancerosas tem se demonstrado importante não só para efeitos causados pelo mecanismo de
ação, mas também por diminuir a possibilidade de resistência celular quando combinada com
substâncias já conhecidas [111]. Dessa forma, a partir da análise do índice de combinação
entre as substâncias, podemos observar que a atividade biológica da gencitabina combinada
com algumas das nossas substâncias foi mantida em relação à monoterapia com o fármaco a
92
200 nM (Figura 24-C). Combinando os inibidores com gencitabina na proporção 2:3,
respectivamente, o fármaco apresentou mesma potência do que seu uso separadamente,
sem alterações significativas na atividade. Porém, esses resultados mostram a efetividade da
terapia combinada baseada no uso dos inibidores de CP com o fármaco referência, no qual os
ICP e gencitabina foram aplicados a 4 µM e 120 nM, respectivamente. Esse resultado
evidencia o efeito positivo na diminuição da resistência ao fármaco, já que a combinação
proporcionou a mesma atividade, utilizando 60 % da quantidade necessária para promover o
mesmo efeito, quando comparado com a substância de referência testada separadamente.
De maneira geral, quando aplicadas separadamente, todas as substâncias foram inativas em
relação à citotoxicidade, apresentando somente efeitos citostáticos. Porém seu uso em
combinação com a gencitabina mostra efeito agonista, principalmente para o Neq0554,
mesmo em proporções menores do que as utilizadas nos ensaios citostáticos. Esse resultado
já era esperado, uma vez que esse inibidor apresentou a melhor atividade citostática no
ensaio clonogênico e na supressão do crescimento celular (previamente apresentados). Esses
dados reforçam o perfil antineoplásico do Neq0554, além de evidenciarem que os objetivos
propostos pela combinação de substâncias como alternativa terapêutica foram alcançados.
93
Figura 24. Análise da terapia combinada dos ICP a 10 µM e gencitabina a 200 nM em
diferentes condições. (A) Tratamento para células de câncer de pâncreas da linhagem
MiaPaCa-2 com os inibidores de CP combinados com gencitabina por 24, 48 e 72 h. (B)
Células pré-tratadas com os inibidores 24 h antes do tratamento com gencitabina por 48 h.
(C) Índice de combinação das razões entre os inibidores e gencitabina por 72 h. Análise de
significância foi realizada, considerando p > 0,05.
FONTE: Autoria própria.
Inibidores (24h)
Via
bili
dad
e ce
lula
r (%
)
Neq0551
Neq0554
Neq0568
Neq0569
Neq0587
Neq0573E64
E64d
Gencitabin
a
0
25
50
75
100
24h 48h 72h
**
(A)
* * **
*
Inibidores 10 M (24h) + Gencitabina (48h)
Via
bili
dad
e ce
lula
r (%
)
Gencitabin
a
Neq0551
Neq0554
Neq0568
Neq0569
Neq0573
Neq0587E64
E64d
0
20
40
60
80
****** *** *** ****
(B)
Proporção inibidores 10 M : Gencibatina 200 nM
Via
bili
dad
e ce
lula
r (%
)
05:00
04:01
03:02
02:03
01:04
00:05
0
25
50
75
100
125 Neq0554 Neq0568 Neq0573 Neq0587
*
(C)
94
4.5. CONCLUSÕES PARCIAIS
Os inibidores de CP estudados aqui foram efetivos na promoção de efeito citostáticos
quando aplicados na linhagem de câncer de pâncreas MiaPaCa-2. Sem efeitos tóxicos, as
substâncias foram eficazes em suprimir a formação clonogênica e a migração celular,
processos essenciais para o desenvolvimento metastático. Além disso, os inibidores
promoveram a inibição da atividade de CP expressas pelas células, com inibição de 76% para
o Neq0554, melhor substância da série. A inibição de CP também se mostrou eficiente no
retardo do ciclo celular com retenção das células na fase S, uma vez que a atividade de
catepsinas nucleares é essencial para a degradação de alguns fatores de transcrição efetivos
no crescimento celular. Por fim, a combinação dos inibidores com o fármaco de referência foi
relevante na potencialização da atividade do fármaco gencitabina, além de minimizar o
processo de resistência adquirida ao fármaco pelas células após tratamentos em longo prazo.
Dessa maneira, a inibição das catepsinas foi essencial para diversos processos celulares na
linhagem MiaPaCa-2 e sua inibição covalente reversível tem apresentado resultados
promissores no tratamento e controle da progressão tumoral.
95
CAPÍTULO 5
Encapsulação de substâncias bioativas com potencial anticancerígeno em apoferritina para o tratamento de
câncer.
As atividades descritas nesse capítulo foram realizadas durante o período no exterior na Escola de Farmácia da
Universidade de Nottingham, Inglaterra, sob a supervisão da Prof. Dr. Tracey Bradshaw.
96
5.1. REVISÃO BIBLIOGRAFICA
5.1.1. Importância da catepsina L para o câncer colo retal de pâncreas
As proteases desempenham um papel importante em um grande número de processos
essenciais para a sobrevivência e desenvolvimento celular [9], agindo durante a proliferação
celular, migração, adesão, senescência, autofagia, apoptose e evasão do sistema imune [134].
A catepsina L, uma cisteíno protease lisossomal [15], tem sido associada como um indicador
para o câncer de pâncreas [31], sendo superexpressa por células desse tipo de carcinoma
[135]. Devido à natureza agressiva da progressão do tumor pancreático, mais de 80% dos
pacientes com câncer de pâncreas apresentam doença metastática [136]. A ressecção
cirúrgica continua sendo a intervenção terapêutica mais eficaz, porém com baixa eficácia na
sobrevivência dos pacientes [137]. Segundo a American Cancer Society, para todos os estágios
do câncer de pâncreas combinados, a taxa de sobrevida em cinco anos é de 7%. O câncer colo
retal é também uma doença agressiva e resistente aos processos quimioterápicos [138]. Com
alta incidência metastática (> 50% dos pacientes) e mau prognóstico, as terapias para câncer
colo retal têm sucesso limitado [139]. A sobrevivência em cinco anos após diagnóstico
precoce é de aproximadamente 60%, mas os diagnósticos para esse tipo de câncer em
estágio IV acompanham uma taxa de vida de 5 anos para menos de 8% nos casos
diagnosticados. A desregulação celular da expressão de catepsina L é uma das características
comuns desses tipos de carcinomas, além de seus níveis extracelulares elevados [16, 140].
Alguns estudos bem sucedidos foram alcançados pela inibição da catepsina L nesses sistemas
celulares, validando sua importância na tumorigênese e como alvo terapêutico. Durante os
estágios iniciais do desenvolvimento do câncer de pâncreas em um modelo de camundongo,
foi identificado elevada atividade de catepsina L com redução do tamanho do tumor após a
deleção do gene responsável pela sua expressão [114]. A inibição da catepsina L por
inibidores covalentes promove a supressão da proliferação de células cancerosas pancreáticas
[135]. Além disso, a proliferação de células do câncer de colo retal também foi reduzida pelos
inibidores da catepsina L, após a perturbação do ciclo celular [140]. No entanto, a catepsina L
possui funções importantes nas células normais. Sua total inibição, como todos os agentes
quimioterápicos, tem o potencial de causar efeitos adversos, limitando a eficácia terapêutica.
97
5.1.2. Sistema de entrega de fármacos (SEF)
As quimioterapias existentes para o tratamento de diferentes tipos de câncer têm
apresentado limitações, como a distribuição do fármaco de maneira inespecífica entre os
diferentes tecidos, a baixa biodisponibilidade ocasionada pela rápida absorção sanguínea e
longos períodos de tratamento. Além disso, propriedades físico-químicas como solubilidade e
estabilidade também reduzem a eficácia dessas substâncias [141]. Dessa maneira, diferentes
moléculas têm sido investigadas como transportadores de substâncias bioativas com a
finalidade de diminuir os efeitos colaterais e aumentar a potência e eficácia do tratamento.
Almejando alcançar a aplicação de sistemas de liberação de fármacos de maneira seletiva a
fim de diminuir efeitos colaterais e aumentar a potência das substâncias bioativas, vários são
os enfoques desenvolvidos nas últimas décadas. Para se enquadrar no perfil ideal, um bom
sistema de liberação de fármacos deve ser qualificado com propriedades adequadas, do
ponto de vista:
Farmacêutico (considerando a capacidade de armazenar diferentes tipos de
substâncias bioativas eficazmente, além de apresentar perfis de libração de fármacos
adaptados ao tratamento de diversas doenças);
Segurança terapêutica (biocompatibilidade e propriedades físico-químicas como
absorção, degradação e eliminação);
Seletividade (identificação e interação específica à célula alvo, aumentando a
possibilidade de diminuição dos efeitos colaterais) [142].
Durante um sistema de entrega de fármaco, a substância bioativa é transportada
diretamente para o local de ação, diminuindo interações indesejáveis com outras células ou
moléculas, aumentando sua acumulação e, consequentemente, diminuindo as doses
necessárias para o tratamento. Diferentes nanopartículas têm sido utilizadas como
carreadores de substâncias bioativas durante o processo de entrega de fármacos (Figura 25).
Com diferentes tamanhos, a escolha da nanopartículas também pode variar de acordo com a
finalidade terapêutica, tipo de tratamento e moléculas a serem encapsuladas em seu interior
[143]. As nanopartículas têm chamado atenção como carreadores de fármacos por
apresentarem relevantes propriedades do ponto de vista biotecnológico e farmacológico,
como a redução da toxicidade do fármaco, prevenção da degradação ou sequestro da
substância, aumento do tempo de disponibilidade e circulação e bom direcionamento para a
célula alvo [144].
98
Figura 25. Diferentes nanopartículas utilizadas como carreador de fármacos e seus
respectivos tamanhos.
FONTE: Adaptado de Wilczewska, et al., 2012 [143].
De maneira geral, do ponto de vista farmacocinético, as principais propriedades de
carreadores de fármacos incluem o tamanho da partícula, no qual carreadores menores
facilitam a uniformidade no processo de dosagem do fármaco; sua carga superficial,
geometria e sua suscetibilidade a modificações estruturais, fator decisivo para o sucesso da
entrega de fármacos, possibilitando sua funcionalização com grupos específicos de maneira
uniforme e precisa [144]. Estruturas polipeptídicas caracterizadas pela capacidade de
modificação estrutural de acordo com as condições ambientais, como pH, têm sido
amplamente estudadas para aplicação no processo de entrega de fármacos [145].
5.1.3. Apoferritina como carreador molecular
Conhecida como uma das primeiras proteínas identificadas, a ferritina é a proteína
responsável pelo armazenamento de ferro em todos os organismos, com exceção de
leveduras e diatomáceas centrais [146]. A forma isenta de ferro, a apoferritina (AFt), é uma
estrutura proteica endógena biocompatível e biodegradável identificada como um carreador
ideal de entrega de fármacos. Cada estrutura de AFt é composta por 24 subunidades
polipeptídicas montadas em uma estrutura proteica esférica de tamanho uniforme (Figura 26)
que são facilmente moduladas a partir de variações entre condições ácidas e alcalinas,
permitindo a liberação controlada de substâncias [147]. Possuindo canais de 0,3 - 0,4 nm com
diâmetro interno de 8 nm [148], uma das principais propriedades estruturais é sua grande
cavidade interior, projetada para armazenar até 4000 átomos de ferro que transitam por
meio de seis canais hidrofílicos responsáveis pelo transporte de prótons. Em procariotos e
99
eucariotos, a estrutura da ferritina é altamente conservada, mesmo com baixa identidade na
sequência dos aminoácidos, cerca de 15% [149].
Figura 26. Estrutura da ferritina humana.
FONTE: PDB: 2FHA
Diferentes substâncias bioativas têm sido aplicadas no sistema de entrega de fármacos
baseado na sua encapsulação no interior da proteína apoferritina. Como exemplos, a
citotoxicidade de complexos de rutênio foi significativamente diminuída após encapsulação
no interior de moléculas de apoferritina, além do aumento das suas propriedades
antineoplásicas quando testados in vitro contra células de câncer de mama MCF-7 [145].
Além da capacidade de encapsulação, moléculas de apoferritina podem sofrer modificações
estruturais, como a inserção de anticorpos na sua superfície, o que promoveu o aumento da
potência do fármaco doxorrubicina no tratamento in vitro de câncer de próstata [150]. As
propriedades da apoferritina, além do interesse farmacológico, também chamam a atenção
de outras áreas com diferentes aplicações. A encapsulação de moléculas no interior da
estrutura da apoferritina tem sido aproveitada com sucesso na área biotecnológica, com a
encapsulação de enzimas para aplicação em diversos processos industriais [151]. Na indústria
alimentícia, antioxidantes possuem limitações devido à instabilidade de algumas propriedades
físico-químicas. Entretanto, a encapsulação de proantocianidinas promoveu a retenção de
mais de 50% da sua atividade antioxidante, quando comparada com a partícula livre [152].
100
A AFt é internalizada nas células por endocitose mediada pelo receptor de transferrina
1 (TfR1) que é altamente expresso nas membranas celulares em muitos tipos de câncer [153].
Dessa maneira, a AFt aplicada como um carreador de entrega de substâncias bioativas pode
promover o aumento da liberação do fármaco no tecido canceroso, através da maior
permeabilidade e retenção associada ao microambiente tumoral [154], aumentando as
concentrações do fármaco intracelular dentro de um tumor e melhndo a eficácia terapêutica
com diminuição dos efeitos colaterais [155]. Uma vez no citoplasma, AFt (ou ferritina) é
direcionada para os lisossomos, onde, devido às condições ácidas, a proteína é desmontada,
liberando seu conteúdo interno [149]. Como já conhecida, a catepsina L é preferencialmente
encontrada nos lisossomos [26], e, portanto, é interessante o processo de encapsulação de
inibidores da CP no interior de moléculas de AFt, no qual a expectativa é a inibição mais
eficiente do alvo molecular.
5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Encapsular alguns dos melhores inibidores de CP no interior de moléculas de AFt;
Caracterizar as nanopartículas após encapsulação;
Determinar o potencial antineoplásico das substâncias encapsuladas contra células de
câncer de pâncreas (MiaPaCa-2) e câncer colo retal (HCT-116);
Avaliar a atividade biológica e alterações na proliferação e ciclo celular;
Quantificar a inibição in vitro de catepsina L em células de câncer de pâncreas e colo
retal por microscopia confocal.
5.3. MATERIAIS E MÉTODOS
5.3.1. Encapsulação das substâncias
A apoferritina comercial obtida a partir do baço de cavalo foi diluída em tampão de
acetato de sódio 100 mM, pH 5,5 na concentração final de 6·10-9 M e mantida a 4 °C sob
agitação (150 rpm). A cada 45 minutos, os inibidores dissolvidos em DMSO na concentração
final de 50 mM foram adicionados à solução de AFt para atingirem a razão final de 1:500
(AFt:inibidores). Após sucessivos ciclos, as moléculas de inibidores não encapsuladas foram
101
removidas da solução por centrifugação (2400 G por 4 minutos) utilizando membranas
Amicon 30 kDa a 4 °C. A concentração do inibidor encapsulado em AFt após a etapa de
purificação foi determinada por UV-Vis a 248 nm utilizando um espectrofotômetro Thermo
Fisher Scientific NanoDrop 2000. Para a quantificação, a lei de Lambert-Beer foi usada
baseada na equação da reta obtida a partir da curva de calibração previamente construída
com diferentes concentrações dos inibidores diluídos no mesmo solvente utilizado durante a
encapsulação. A concentração total de proteína foi determinada usando o ensaio de Bradford
[59]. O rendimento de encapsulação foi baseado na quantidade de substância disponibilizada
durante o processo de encapsulação e a quantidade no interior da AFt após o processo de
purificação. O carregamento proteico foi determinado a partir da razão entre o número de
mols de inibidores encapsulados pelo número de mols de AFt após a encapsulação e
purificação. Todas as substâncias encapsuladas foram aliquotadas e armazenadas a 4 °C em
tampão acetato de sódio 100 mM pH 5,5.
5.3.2. Caracterização das nanoformulações (inibidores encapsulados)
A estabilidade do sistema encapsulado foi examinada durante 6 semanas por
espectroscopia UV-Vis a partir do armazenamento das nanoformulações a 4 e 37 °C. As
propriedades físicas da AFt foram caracterizadas por espalhamento dinâmico de luz (EDL) e
análise de potencial zeta. Estes resultados seguiram as mesmas condições de ensaios, usando
1 mL de 0,2 mg·mL-1 de agente encapsulado em AFt. Eletroforese não desnaturante foi
conduzida para confirmar a estrutura da proteína AFt após o encapsulamento: 15 µL de
solução de AFt (~ 0,2 mg·mL-1) e 5 µL de marcador de peso molecular foram separados em gel
de poliacrilamida 15% a 4 °C usando tampões catódicos e anódicos. As proteínas foram
coradas após a imersão de géis em Coomassie azul brilhante e o gel foi fotografado com
câmera digital.
5.3.3. Determinação da taxa de liberação in vitro das substâncias encapsuladas
A liberação in vitro dos inibidores encapsulados no interior das moléculas de
apoferritina foi analisada sob condições de pH ácido (acetato de sódio 100 mM pH 5,5) e
neutro (tampão Hepes 100 mM pH 7,4) a partir da diálise por 24 h a 37 °C usando uma
membrana de diálise de 8 kDa de corte. Em diferentes períodos, a liberação do fármaco foi
102
determinada por UV-Vis, considerando a concentração inicial da substância encapsulada
como 100%.
5.3.4. Avaliação da atividade biológica das substâncias encapsuladas
A atividade biológica das substâncias foi realizada a partir dos ensaios celulares já
citados nos capítulos anteriores, como MTT (4.3.2) para determinação do potencial
antitumoral, ensaio clonogênico (4.3.6) para avaliação da supressão do crescimento celular e
ciclo celular (4.3.5) por citometria de fluxo. Como controle, foi utilizada a linhagem de
fibroblasto humano MRC-5.
5.3.5. Análise da expressão do TfR-1 por Western blot (WB)
A análise da expressão do receptor de transferrina pelas células estudadas foi feita pela
técnica de Western blot. As células foram cultivadas em frascos de 75 cm² a 37 °C sob
atmosfera de 5% de CO2 até 70% de confluência (cerca de 72 h). Posteriormente, as células
foram separadas por tripsina e lisadas em tampão de lise (100 mL NP40, NaCl 1 M, Tris HCl 1
M a pH 8,0) suplementado com um coquetel comercial de inibição de proteases (Roche,
Sigma-Aldrich®). As proteínas celulares (50 μg) foram separadas por SDS-PAGE e
eletrotransferidas para membranas de PVDF bloqueadas em solução tampão salino Tris (TBS)
contendo 5% de leite à temperatura ambiente. Todos os anticorpos primários (GAPDH e TfR-
1) foram incubados overnight a 4 °C. Em seguida, as membranas foram lavadas com TBS a
temperatura ambiente e incubadas com um anticorpo secundário por 1 h. A detecção foi
realizada com o reagente Super Signal Chemiluminescent, de acordo com o protocolo do
fabricante (Tanon, China). Imagens foram obtidas por 12 minutos em scanner da C-DiGit®
com a membrana em contato com a solução de substrato.
5.3.6. Quantificação da atividade in vitro de catepsina L
Inicialmente, 104 células foram semeadas em placas pretas de 96 poços com fundo
transparente e submetidas ao tratamento de 100 µM de compostos não encapsulados e
encapsulados por um período máximo de 24 h. Para determinação da atividade de catepsina
L, as células foram lavadas com PBS após o período de tratamento e incubadas durante 1 h
com substrato de Magi Red (Sigma-Aldrich) diluído 300 vezes e o fluoróforo Hoechst foi
utilizado para identificação do núcleo celular. As imagens obtidas a partir da análise temporal
103
foram realizadas com um microscópio confocal Ultra Nikon equipado com uma objetiva de
40x com excitação a 510-560 nm, e a luz emitida foi quantificada através de um filtro de
passagem ruim a 570-620 nm. Células não tratadas e células tratadas com Aft foram usadas
como controle negativo para cada condição.
5.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.4.1. Encapsulação e caracterização das nanoformulações.
Os inibidores covalentes reversíveis de CP foram encapsulados em AFt por difusão
passiva através dos seis canais hidrofóbicos em solução pH 5,5 (Figura 27A). Todos os
compostos foram previamente dissolvidos em DMSO e, a cada 45 minutos, diluídos
separadamente em tampão acetato de sódio pH 5,5 com AFt a uma proporção final de 1:500
(AFt:substância). O sucesso do processo de encapsulação de qualquer substância depende
fortemente das propriedades físico-químicas e estruturais do fármaco [148]. As propriedades
hidrofóbicas dos inibidores facilitaram a difusão pelos canais da AFt, permitindo o
carregamento maior do que 10 % para todos os compostos. O número médio de moléculas
encapsuladas de Neq0554 e Neq0551 foi 105 e 117, respectivamente, representando
eficiências de encapsulação maior do que 50 % para ambos os inibidores. Para o Neq0568, o
rendimento de encapsulação foi de 71 % com número médio de moléculas encapsuladas de
226 (
Tabela 6). Diferenças nos grupos químicos e estereoquímica das moléculas dos
inibidores podem acarretar em diferentes rendimentos de encapsulação, uma vez que o
aprisionamento das moléculas no interior da estrutura da AFt depende diretamente da
difusão da substância pelos canais presentes na estrutura proteica. Dessa maneira, a
presença do átomo de flúor na substância Neq0554 parece ser um fator limitante na difusão
da molécula pelos canais hidrofóbicos da AFt. Assim, maior número de moléculas foi
observado para o Neq0568, que não apresenta o átomo de flúor na sua estrutura, com quase
o dobro do número de moléculas em relação do Neq0551, que também não apresenta flúor
na sua estrutura. Dessa maneira, as propriedades estruturais das substâncias a serem
encapsuladas influenciam fortemente no processo de encapsulação, que parece ser
favorecido pelo uso de substâncias com grupos químicos menos volumosos e com
104
propriedades hidrofóbicas mais evidentes. Dessa maneira, isso provavelmente justifica o alto
número de moléculas de Neq0659 encapsuladas no interior da estrutura de AFt, devido sua
forte característica apolar e poucos grupos carregados, o que facilita sua difusão por meio dos
canais hidrofóbicos presentes na AFt.
Tabela 6. Parâmetros de encapsulação dos inibidores de CP no interior das moléculas de
apoferritina, rendimento de encapsulação (RE) e caracterização do potencial zeta (E0) dos
sistemas encapsulados. Os ensaios foram realizados em triplicata, com erro < 0,5 para os
ensaios de potencial zeta, considerando E0 = -8,60 para apoferritina sem inibidor.
Inibidor Fórmula
Molecular
Peso
molecular
(g·mol-1)
nº
moléculas
Neq/AFt
RE (%) Carregamento
(%)
E0
(mV)
Neq0551 C18H17N3O3 323,35 117 ± 3 55,2 ± 4,6 14,5 ± 4,4 -8,47
Neq0554 C17H16F3N5O2 379,34 105 ± 2 50,9 ± 10,9 10,1 ± 1,2 -8,61
Neq0568 C17H27N5O2 333,44 226 ± 12 71,2 ± 9.9 14,3 ± 6,8 -8,94
Neq0659 C29H30F3N3O 493,57 253 ± 10 85,0 ± 4,8 14,3 ± 8,6 -8,35
Após a encapsulação, a integridade estrutural da AFt foi caracterizada por eletroforese
não desnaturante em gel de poliacrilamida e espalhamento dinâmico de luz (DLS) como
apresentado nas Figura 27B e C, respectivamente. As análises de DLS demonstraram que a
distribuição de tamanho médio das estruturas de AFt após o encapsulamento dos inibidores
não diferiram significativamente, com valores médios de 17,8 nm (± 4,1) para AFt e 14,8 nm(±
3,4) para as nanoformulações, confirmando que a distribuição média do tamanho da AFt é
mantida antes e após a encapsulação [156]. Além disso, a carga total da proteína
determinada pela análise do potencial zeta antes e após o encapsulamento deixou evidente
que não houve consideráveis alterações na carga superficial da AFt após o aprisionamento
das substâncias no interior da proteína (Tabela 6). A carga eletrostática de um nanocarreador
pode alterar as propriedades farmacológicas do sistema, influenciando na distribuição e a
absorção celular [157]. Dessa maneira, é de extrema importância, no caso da AFt que já é um
105
carreador biocompatível, de que suas propriedades eletrostáticas sejam mantidas. Em adição,
a partir da eletroforese não desnaturante, é evidente que a encapsulação via difusão permitiu
a retenção da integridade estrutural da AFt, sem nenhuma alteração na migração da proteína
determinada para AFt pré e pós-encapsulação (~ 720.000 Da - Figura 27B). Isto contrasta
fortemente com o encapsulamento de inibidores por indução de pH que envolve o
desmembramento das subunidades de AFt a pH ácido e sua remontagem a pH fisiológico
(resultados não mostrados).
De acordo os experimentos de liberação in vitro das substâncias encapsuladas, o
possível relaxamento e alargamento dos poros e eventual desmontagem sob condições ácidas
(pH 5,5) pode ter sido um fator determinante para a liberação das substâncias (Figura 27D).
Nessas condições, foi observada uma liberação mais rápida e extensa de todos os compostos.
Um sistema de liberação de fármacos ideal é considerado por atingir a concentração
plasmática necessária para a manutenção de uma liberação de fármaco ideal no tecido alvo
[158]. Dessa maneira, podemos verificar a maior estabilidade no carreamento das substâncias
em condições fisiológicas do que em condições ácidas. Por exemplo, uma comparação após
12 h evidencia esse fato, já que 75% do Neq0554 foi liberado do interior da AFt em
comparação a ~32% da mesma substância em fisiológico (pH 7,4), condição na qual a
manutenção da estrutura da AFt é favorecida. Além disso, a liberação inicial de "explosão" foi
mais evidente com mais de 50 % de compostos liberados nas primeiras 6 h em pH 5,5. Dessa
maneira, o sistema de entrega de substâncias baseado na encapsulação em apoferritina se
mostrou eficiente em condições ácidas, semelhante ao interior dos lisossomos onde se
encontra o alvo molecular as substâncias testadas.
106
Figura 27. Encapsulação das substâncias em AFt por difusão (A). Eletroforese não
desnaturante da AFt e das nanoformulações (B). Análise da integridade da estrutura da
molécula de AFt por DLS (C). Liberação in vitro das substâncias encapsuladas em ambiente
ácido (pH 5.5) e fisiológico (pH 7.4) a 37°C (D).
FONTE: Autoria própria.
5.4.2. Avaliação da atividade antineoplásica das substâncias encapsuladas
Os inibidores de CP testados apresentaram modesta atividade inibidora do crescimento
contra células cancerosas HCT-116 e MiaPaCa-2, com valores de IC50 para Neq0554 e
Neq0568 < 400 µM, por exemplo. A seletividade dos compostos livres para as células
cancerosas em relação aos fibroblastos MRC-5 não foi relevante em termos dos índices de
Neq0554 AFt
pH 5.5
4°C
Neq0554-AFt
(A)
MW
AFt
55
1-A
Ft
55
4-A
Ft
56
8-A
Ft
65
9-A
Ft
20 kDa
66 kDa 146 kDa
1048 kDa
720 kDa
480 kDa
(B) (C)
(D) pH 5.5
Tempo (h)
Lib
era
ção
in v
itro
(%
)
0 6 12 18 24
0
25
50
75
100
pH 7.4
Tempo (h)
Lib
era
ção
in v
itro
(%
)
0 6 12 18 24
0
25
50
75
100Neq0551-AFt
Neq0554-AFt
Neq0568-AFt
Neq0659-AFt
107
seletividade, no qual os melhores índices encontrados foram para Neq0554 e Neq0568, cerca
de 1,75 e ~2 para IC50 MRC-5 / GI50 MiaPaCa-2 e HCT-116, respectivamente. Como alternativa
para contornar os problemas de baixa potência e seletividade de uma substância, o processo
de encapsulação de moléculas bioativas é empregado devido sua capacidade em aumentar o
potencial e atividade das condições terapêuticas, diminuindo efeitos tóxicos [142]. Após o
aprisionamento no interior da AFt, maior atividade inibitória do crescimento celular (IC50) foi
observada para todos os compostos encapsulados, em comparação com os compostos livres
(Tabela 7). Como exemplo, após 72h de incubação com os inibidores encapsulados, a inibição
do crescimento celular de ambas as linhagens cancerosas foi mais evidente, alcançando um
aumento na potência de 2,5 vezes para o Neq0554-AFt com o valor de IC50 < 80 µM e a
redução de 3 vezes em relação ao Neq0568-AFt. O aumento da potência de sustâncias com
potencial anticancerígeno após encapsulação em apoferritina tem sido amplamente relatado
na literatura [140, 142, 148], o que evidencia a eficiência do processo de entrega de fármacos
baseado na encapsulação em apoferritina. Assim, nossos resultados corroboram que o
processo de encapsulação dos inibidores de CP auxilia na atividade das substâncias, bem
como corroboram a ideia de que a estrutura de apoferritina permite a liberação controlada
da substância na célula alvo. Uma vez encapsulado, a seletividade dos inibidores tornou-se
mais evidente para as células cancerosas, com valores de IC50 > 200 µM consistentemente
encontrados após o tratamento de fibroblastos MRC-5 com os inibidores encapsulados em
AFt, com exceção do Neq0659, que teve sua atividade suprimida para todas as linhagens
celulares. Uma hipótese que poderia corroborar esse comportamento seria o ancoramento
do inibidor na superfície da proteína, devido ao seu caráter hidrofóbico. A presença de
moléculas do inibidor na superfície proteica pode modular a seletividade da nanoformulação,
dificultando o reconhecimento do receptor pela proteína AFt. Entretanto, maiores
investigações devem ser realizadas para confirmação dessa hipótese, bem como a
encapsulação dos análogos do Neq0659 que apresentam propriedades físico-químicas e
estruturais semelhantes.
108
Tabela 7. Atividade biológica antes e após encapsulação em AFt dos inibidores de CP em
relação ao crescimento celular das linhagens de câncer de pâncreas MiaPaCa-2 e colo retal
HCT-116. Fibroblasto humano MRC-5 foram utilizados como controle de citotoxicidade e
seletividade. Os valores de IC50 (µM) foram obtidos a partir da incubação das substâncias por
72 h e determinado pelo ensaio colorimétrico MTT.
Substâncias Média dos valores de IC50 ± SD (µM)
HCT-116 MiaPaCa-2 MRC-5
Neq0551 > 500 ± 5,1 > 500 ± 8,6 > 500 ± 6.7
Neq0551-AFt > 200 ± 4,2 162,2 ± 5,7 > 200 ± 9.4
Neq0554 358,6 ± 7,7 230,7 ± 9,1 404.0 ± 9.7
Neq0554-AFt 131,0 ± 5,2 79,5 ± 10,7 > 200 ± 6.1
Neq0568 231,1 ± 7,8 393,0 ± 8,1 > 500 ± 5.6
Neq0568-AFt 168,1 ± 6,5 125,1 ± 9,8 > 200 ± 5.6
Neq0659 63,5 ± 9,0 41,4 ± 8,3 31,2 ± 8,4
Neq0659-AFt 167,7 ± 8,1 119,8 ± 8,8 > 200 ± 9,2
Entretanto, o perfil de potência dos demais inibidores após a encapsulação foi
positivamente observado, com destaque para o Neq0554. O transporte da AFt extracelular
para o ambiente intracelular se dá por meio de endocitose mediada por receptores de
transferrina (TfR1) presentes na membrana celular de alguns tipos de câncer [144]. A
expressão do receptor foi detectada somente para células cancerosas, com maior evidência
para a linhagem de câncer de pâncreas MiaPaCa-2 (Figura 28A). Dessa maneira, é possível
correlacionar a maior potência das substâncias após a encapsulação em AFt à expressão do
TfR1 pelas células HCT-116 e MiaPaCa-2. Essa hipótese é corroborada pelos gráficos de
concentração resposta do inibidor mais potente na supressão do crescimento celular após a
encapsulação, o Neq0554 (Figura 28B-D). As curvas claramente mostram o perfil mas tóxico
da substância após encapsulação no interior das moléculas de AFt para as células cancerosas,
em comparação com as células de fibroblastos, que não apresentam níveis consideráveis de
receptor expresso. Dessa maneira, o processo de encapsulação das substâncias em AFt é
eficiente não só para aumentar a potência da substância, mas principalmente para aumentar
a faixa de segurança de aplicação dos compostos, diminuindo os efeitos tóxicos.
109
Figura 28. Análise da expressão do receptor de transferrina (TfR1) pelas linhagens MRC-
5, MiaPaCa-2 e HCT-116 (A). Como controle da concentração proteica, a expressão da
proteína GAPDH foi analisada em condições normais de cultivo celular. Concentração
resposta do Neq0554 livre (curvas vermelhas) e da nanoformulação Neq0554-AFt (curvas
azuis) testados nas linhagens de câncer de pâncreas MiaPaCa-2 (B), HCT-116 (C) e fibroblasto
humano MRC-5 (D).
FONTE: Autoria própria.
5.4.3. Análise da supressão do crescimento celular
Para compreender melhor a natureza da inibição do crescimento de células de câncer
causada pela encapsulação das substâncias, a análise do ciclo celular por citometria de fluxo
foi empregada avaliando a ação da melhor nanoformulação, Neq0554-AFt e seu análogo livre,
nas mesmas condições de tempo e concentração. Após 48 h de tratamento, as células
MiaPaCa-2 e HCT-116 foram suavemente permeabilizadas e o DNA celular foi corado com
iodeto de propídio (PI). Alterações significativas foram encontradas somente para a linhagem
MR
C-5
Mia
PaC
a-2
HC
T -
11
6
TfR1
37 kDa
100 kDa
(A)
Concentração (log)
Via
bili
dad
e C
elu
lar
-6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0 -3.5 -3.0
0
25
50
75
100(B)
Concentração (log)
Via
bil
ida
de
ce
lula
r (%
)
-6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0 -3.5 -3.0
0
25
50
75
100(C)
GAPDH
Concentração (log)
Via
bil
ida
de
ce
lula
r (%
)
-6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0 -3.5 -3.0
0
25
50
75
100(D)
(B)
(C) (D)
110
HCT-116, com o aparecimento de população celular na fase sub G1 (Figura 29). Alterações
mais evidentes foram observadas para ambas as concentrações testadas utilizando o
Neq0544 encapsulado em AFt. Esse é mais um indicativo da entrega mais seletiva e eficiente
da substância, quando encapsulada no interior da proteína e avaliadas contra células com
potencial em expressão do receptor de transferrina. A retenção ou aparecimento da fase sub
G1 após o tratamento com substâncias bioativas é o indicativo de morte celular, caracterizada
por apoptose [160]. Dessa maneira, podemos inferir indiretamente o mecanismo de morte
celular causada pelo Neq0554 encapsulado no interior das moléculas de AFt. O processo de
morte celular por apoptose se inicia com o encolhimento celular [161] e é considerado como
o processo ideal de morte, sem etapas inflamatórias, como no caso da necrose [162]. Assim,
nossos inibidores apresentam potencial apoptótico, principalmente após a encapsulação em
AFt, com interessante perfil anticancerígeno para as linhagens MiaPaCa-2 e HCT-116.
Figura 29. Histograma do perfil do ciclo celular analisado por citometria de fluxo das
células de HCT-116 incubadas com o Neq0554 e Neq0554-AFt por 24 h a 10 e 100 µM (A) e
representação gráfica dos resultados para as linhagens HCT-116 e MiaPaCa-2 (B).
FONTE: Autoria própria.
Livre Encapsulado Livre Encapsulado Controle (A)
(B)
10 µM 100 µM
111
O ensaio clonogênico também foi realizado para examinar se as células poderiam
sobreviver à breve exposição ao Neq0554 e Neq0554-AFt e reter sua capacidade proliferativa.
Para isso, as células foram previamente incubadas com o inibidor na concentração de 100 µM
por 24 h e após esse período, o meio de cultura foi trocado por meio sem nenhuma
substância e incubado por mais 7 dias a 37 °C. Após esse período, pode ser claramente
observado que a sobrevivência clonogênica de células HCT-116 foi suavemente inibida, cerca
de 22 e 28 % para o Neq0554 e Neq0554-AFt, respectivamente (Figura 30A). No entanto, a
capacidade de formação de colônia para as células MiaPaCa-2 foi dramaticamente suprimida
pelo Neq0554 encapsulado e livre, com inibição cerca de 60 %. Entretanto, para HCT-116,
pode-se observar que o Neq0554- AFt inibiu a formação de colônias em maior extensão do
que o inibidor não encapsulado, possivelmente uma consequência da captação celular
aumentada após o processo de encapsulação. No entanto, a formação de colônias das células
MiaPaCa-2 foi evidentemente suprimida durante a ação da substância, porém com uma
resposta citostática menor após a remoção da substância para as células HCT-116, que foram
capazes de retomar sua proliferação, como apresentado nas imagens (Figura 30B). Assim,
uma exposição mais longa ou contínua para essa linhagem seria necessária para tentar
suprimir a total formação clonogênica, diferentemente da aplicação em células MiaPaCa-2, no
qual apresentou maior grau de supressão do crescimento celular.
112
Figura 30. Número de colônias das linhagens HCT-116 e MiaPaCa-2 (A) obtidas após 24
h de incubação com o Neq0554 livre e encapsulado a 100 µM (B).
FONTE: Autoria própria.
5.4.4. Inibição in vitro da catepsina L em células cancerosas
A inibição da atividade de catepsina L foi analisada em ensaios in vitro utilizando as
linhagens celulares MiaPaCa-2 e HCT-116. Inicialmente, diferentes concentrações do inibidor
Neq0554 encapsulado e livre foram testadas com as células por 6, 12 e 24 h. Baixa inibição foi
observada no tempo de 6 h, no qual 12 e 24 h apresentaram resultados semelhantes (dados
não apresentados). Dessa maneira, discutimos aqui a incubação das células cancerosas com
Neq0554 e Neq0554-AFt por 12 h. Para as células de HCT-116, o Neq0554 livre não
apresentou potencial de inibição da atividade de catepsina L, já que a atividade após a
incubação com o inibidor foi maior do que o controle (Figura 31A). Resultado oposto foi
observado para a linhagem celular MiaPaCa-2, sendo que em ambas as condições o inibidor
Neq0554 foi capaz de promover a inibição enzimática em todas as concentrações testadas,
com destaque para a substância encapsulada em AFt (Figura 31B). Inibidores de proteases
têm apresentado atividade in vitro e in vivo, promovendo efeitos benéficos para o tratamento
de tumores [110]. Da mesma maneira, nossos inibidores apresentam interessante atividade
antineoplásica, principalmente após o processo de encapsulação em AFt. A atividade de
cisteíno catepsinas é maior em células cancerosas e está associada a fatores invasivos de
(B) (A) MiaPaCa-2 HCT-116
Controle
Neq0554
Neq0554-AFt
113
carcinomas [135]. Assim, mais do que a morte das células cancerosas, a inibição de catepsina
L pode ser uma alternativa para supressão e controle do desenvolvimento do tumor. Esse
processo pode ser intensificado com a encapsulação dos inibidores em AFt, que direciona as
substâncias diretamente ao lisossomos, compartimento celular onde há a predominação
dessas enzimas [38]. Tal sistema de entrega de fármacos mostrou agir de maneira eficiente e
rápida, com significante inibição após 12 h de incubação. Entretanto, a inibição da atividade
de catepsina L não apresentou perfil dose dependente, com pouca variação em
concentrações acima de 50 µM. Essa variação pode ser devido ao limite máximo de inibição,
que depende do equilíbrio entre a ligação e a dissociação do inibidor da enzima, já que
trabalhamos com inibidores reversíveis. Entretanto, os resultados são promissores para o
controle do câncer, como já citado, uma vez que a inibição eficiente de catepsina L intensifica
a supressão do crescimento celular para as linhagens de câncer aqui estudadas.
114
Figura 31. Inibição da atividade de catepsina L em linhagens de HCT-116 (A) MiaPaCa-2
(B) incubadas por 12 h com diferentes concentrações de Neq0554 (linhas azuis) e a
nanoformulação Neq0554-AFf (linhas verdes). Inibição da atividade de catepsina L na
concentração de 50 µM para o Neq0554 livre e encapsulado incubados por 12 h com HCT-116
(C) e MiaPaCa-2 (D). As imagens foram obtidas por microscopia confocal, analisando a
intensidade da conversão por célula do substrato fluorescente Magic-Red, marcada com
DAPI. Como controle, foram utilizadas as células sem tratamento, somente com meio de
cultura (linhas vermelhas). O uso da apoferritina sem inibidores não interferiu na atividade
enzimática e foi aplicado como controle do carreador (dados não apresentados).
Controle
Neq0554
Neq0554-AFt
DAPI MAGIC-RED MERGE (C)
115
FONTE: Autoria própria.
5.5. CONCLUSÕES PARCIAIS
A atividade de catepsina L é evidentemente maior em algumas linhagens de células
tumorais, como no caso das células de câncer de pâncreas MiaPaCa-2 e de colo retal HCT-
116. A elevada expressão dessa enzima reforça sua importância em muitos processos
celulares essenciais para o desenvolvimento tumoral, como migração e invasão. Após
identificar efeitos citostáticos a partir da inibição de catepsina L em MiaPaCa-2, os melhores
inibidores foram submetidos à encapsulação por difusão no interior de moléculas de
apoferritina. Essa proteína, responsável por transporte de íons de ferro apresentou aumento
na potência após a encapsulação dos inibidores, com destaque para o Neq0554, capaz de
promover alterações no ciclo celular das células de HCT-116 bem como supressão do número
de colônias para as células de MiaPaCa-2. Isso ocorre devido a elevada expressão do receptor
TfR1, responsável pelo transporte da apoferritina para o interior celular. Maior efeito
Controle
Neq0554
Neq0554-AFt
DAPI MAGIC-RED MERGE (D)
116
biológico foi observado contra ambas as linhagens de células tumorais, com significante
diminuição do potencial citotóxico em relação às células de fibroblasto MRC-5. Além disso, a
inibição da catepsina L in vitro foi mais evidente após a encapsulação das substâncias em APf,
uma vez que o sistema de entrega de substâncias baseado essa proteína promove a liberação
do inibidor preferencialmente nos lisossomos, onde se encontra a maior parte da enzima alvo
catepsina L. Assim, mais do que o aumento na potência dos inibidores, a encapsulação das
substâncias em AFt é extremamente eficiente em relação à supressão da atividade
enzimática, podendo atuar como inibidor do crescimento e desenvolvimento das células
cancerosas.
117
CAPÍTULO 6
Conclusão Geral
A elevada expressão de CP caracteriza sua importância durante o estabelecimento e
desenvolvimento de algumas doenças, como a leishmaniose e doença de Chagas. Além disso,
alguns tipos de células tumorais apresentam elevada expressão da cisteíno catepsina L, que
apresenta considerável similaridade com a CPB e a cruzipaína, enzimas em altos níveis nos
protozoários do gênero T. cruzi e Leishmania spp, respectivamente. Assim, as três doenças
apresentam alvos válidos em comum, no qual interessantes resultados podem ser observados
após a inibição dessas enzimas em cada um dos tipos celulares. De maneira geral, efeitos
citostáticos, como supressão do crescimento e perturbação do ciclo celular foram observados
em relação à inibição de CP, sugerindo sua função citostática em ambas as células estudadas.
Em relação às células tumorais, após a encapsulação dos inibidores no interior das moléculas
de AFt, maior atividade antineoplásica é observada devido ao seletivo sistema de entrega de
fármacos relacionado ao transporte da AFt para o interior celular, processo possível somente
para linhagens celulares que apresentam a expressão do receptor TRf1, como no caso das
células de câncer de pâncreas e colo retal. Assim, inibidores de CP podem promover
supressão e controle do desenvolvimento da doença e serem combinados com outros
fármacos para efetivamente promoverem a morte das células alvo, atuando de maneira
eficaz no tratamento dessas doenças.
118
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 KHAN, M. O. F.; DEIMLING, M. J.; PHILIP, A. Medicinal chemistry and the pharmacy curriculum. American Journal of Pharmaceutical Education, v. 75, n. 8, p. 1-10, 2011. 2 NADENDLA, R. R. Principles of organic medicinal chemistry. Nova Deli: New Age International Ltd, 2005. 331 p. 3 HUGHES, J. P.; REES, S. S.; KALINDJIAN, S. B.; PHILPOTT, K. L. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology, v. 162, n. 6, p. 1239-1249, 2011. 4 BULL, S. C.; DIOG, A. J. Properties of protein drug target classes. PLoS One, v. 10, n. 3, p. 1-44, 2015. 5 CHEN, X. P.; DU, G. H. Target validation: a door to drug discovery. Drug Discoveries & Therapeutics, v. 1, n. 1, p. 23-29, 2007. 6 AMARAL, A. T.; MONTANARI, C. A. Química medicinal: 25 anos de planejamento racional de fármacos. Química Nova, v. 25, p. 39-44, 2002. 7 MONTANARI, C. A. A química medicinal na próxima década. Química Nova, v. 23, n. 1, p. 108-112, 2000. 8 XU, H.; XU, H. Y.; MINGZHI, L.; WANG, W.; LI, Z.; HUANG, J.; CHEN, Y.; CHEN, X. Learning the drug target-likeness of a protein. Proteomics, v. 7, n. 23, p. 4255-4263, 2007. 9 DRAG, M.; SALVESEN, G. S. Emerging principles in protease-based drug discovery. Nature Reviews: Drug Discovery, v. 9, n. 9, p. 690-701, 2010. 10 TURK, B. Targeting proteases: successes, failures and future prospects. Nature Reviews: Drug Discovery, v. 5, n. 9, p. 785-799, 2006. 11 COSTA, T. F. R.; LIMA, A. P. C. A. Natural cysteine protease inhibitors in protozoa: fifteen years of the chagasin family. Biochimie, v. 122, p. 197-207, 2016.
119
12 RAWLINGS, N. D.; BARRETT, A. J. MEROPS : the peptidase database. Nucleic Acids Research, v. 27, p. 323-331, 1999. 13 RANI, K.; RANA, R.; DATT, S. Review on latest lverview of proteases. Internation Journal of Current Research in Life Sciences, v. 2, n. 1, p. 12-18, 2012. 14 BARRETT, A. J. Classification of peptidases. Methods in Enzymology, v. 244, p. 1-15, 1994. 15 OTTO, H. H.; SCHIRMEISTER, T. Cysteine proteases and their inhibitors. Chemical Reviews, v. 97, n. 1, p. 133-172, 1997. 16 MOHAMED, M. M.; SLOANE, B. F. Cysteine cathepsins: multifunctional enzymes in cancer. Nature: Cancer Reviews, v. 6, n. 10, p. 764-775, 2006. 17 FRICKER, S. P. Cysteine proteases as targets for metal-based drugs. Metallomics, v. 2, p. 366-377, 2010. 18 RAWLING, N. D.; BARRETT, A. J. Handbook of proteolytic enzymes. San Diego: Elsevier,2013. p. 1743-1773. 19 SANMAN, L. E.; BOGYO, M. Activity-based profiling of proteases. Annual Reivew of Biochemistry., v. 83, n. 1, p. 249-273, 2014. 20 TIAN, Y.S.; ZHOU, Y.; TAKAGI, T.; KAMEOKA, M. KAWASHITA; N. Dengue virus and Its inhibitors: a brief review. Chemical and Pharmaceutical Bulletiin, v. 66, n. 3, p. 191-206, 2018. 21 PHOO, W. W.; LI, Y.; ZHANG, Z.; LEE, M. Y.; LOH, Y. R.; TAN, Y. B.; NG, E. Y.; LESCAR, J.; KANG, C.; LUO, D. Structure of the NS2B-NS3 protease from Zika virus after self-cleavage. Nature Communications, v. 7, p. 1-8, 2016. 22 LUO, D.; VASADEVAN, S.; LESCAR, J. The flavivirus NS2B – NS3 protease – helicase as a target for antiviral drug development. Antiviral Research, v. 118, p. 148-158, 2015. 23 LV, Z.; CHU, Y.; WANG, Y. HIV protease inhibitors: a review of molecular selectivity and toxicity. HIV AIDS (Auckl), v. 7, p. 95-104, 2015.
120
24 TOBERGTE, D. R.; CURTIS, S. BACE2 as a new diabetes target: a patent review (2010 – 2012). Journal of Chemical Information and Modeling, v. 53, n. 9, p. 1689-1699, 2013. 25 KAPHINGST, K. A.; PERSKY, S.; LACHANCE, C. B-Secretase: its biology as a therapeutic target in diseases. Trend Phamacology Sciences, v. 34, n. 4, p. 215-225, 2013. 26 ANGULO, W. M. A. Inhibitors of human cathepsin L and cruzain as therapeutic agents. 2008. 323 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Baylor University, Texas, EUA, 2008. 27 WILLIAMS, R. A.; TETLEY, L.; MOTTRAM, J. C.; COOMBS, G. H. Cysteine peptidases CPA and CPB are vital for autophagy and differentiation in Leishmania mexicana. Molecular Microbiology, v. 61, n. 3, p. 655-674, 2006. 28 BRANDT, A. M. L.; BATISTA, P. R.SOUZA-SILVA, F.; ALVES, C. R.; CAFFARENA, E. R. Exploring the unbinding of Leishmania (L.) amazonensis CPB derived-epitopes from H2 MHC class I proteins. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics, v. 84, n. 4, p. 473-487, 2016. 29 CHOY, J. W.; BRYANT, C.; CALVET, C. M.; DOYLE, P. S.; GUNATILLEKE, S. S.; LEUNG, S. S. F.; ANG, K. K. H.; CHEN, S.; GUT, J.; OSES-PRIETO, J. A.; JOHNSTON, J. B.; ARKIN, M. R.; BURLINGAME, A. L.; TAUNTON, J.; JACOBSON, M. P.; MCKERROW, J. M.; PODUST, L. M.; RENSLO, A. R. Chemical-biological characterization of a cruzain inhibitor reveals a second target and a mammalian off-target. Beilstein Journal of Organic Chemistry, v. 9, p. 15-25, 2013. 30 MARTINEZ-MAYORGA, K.; BYLER, K. G.; RAMIREZ-HERNANDEZ, A. I.; TERRAZAS-ALVARES, D. E. Cruzain inhibitors: efforts made, current leads and a structural outlook of new hits. Drug Discovery Today, v. 20, n. 7, p. 890-898, 2015. 31 SINGH, N.; DAS, P.; GUPTA, S.; SACHDEV, V.; SRIVASATAVA, S.; GUPTA, S. D.; PANDEY, R. M.; SAHNI, P.; CHAUDAN, S. S.; SARAYA, A. Plasma cathepsin L: a prognostic marker for pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology, v. 20, n. 46, p. 17532-17540, 2014. 32 COLELLA, R.; JACKSON, T.; GOODWYN, E. Matrigel invasion by the prostate cancer cell lines, PC3 and DU145, and cathepsin L+B activity. Biotechnic & Histochemistry, v. 79, n. 3, p. 121-127, 2015. 33 PALERMO, C.; JOYCE, J. A. Cysteine cathepsin proteases as pharmacological targets in cancer. Trends in Pharmacological Sciences, v. 29, n. 1, p. 22-28, 2008.
121
34 KATO, D.; BOATRIGHT, K. M.; BERGER, A. B.; NAZIF, T.; BLUM, G.; RYAN, C.; CHEHADE, K. A. H.; SALVESEN, G. S.; BOGYO, M. Activity-based probes that target diverse cysteine protease families. Nature Chemical Biology, v. 1, n. 1, p. 33-38, 2005. 35 BAILLIE, T. A. Targeted covalent inhibitors for drug design. Angewandte Chemie International Edition, v. 55, n. 2, p. 2-17, 2016. 36 SIKLOS, M.; BENAISSA, M.; THATCHER, G. R. J. Cysteine proteases as therapeutic targets: does selectivity matter? A systematic review of calpain and cathepsin inhibitors. Acta Pharmaceutical Sinica B, v. 5, n. 6, p. 506-519, 2015. 37 BANDYOPADHYAYA, A.; GAO, J. Targeting biomolecules with reversible covalent chemistry. Current Opnion in Chemistry Biology, v. 34, p. 110-116, 2016. 38 TURK, V.; STOKA, V.; VASILJEVA, O.; RENKO, M.; SUN, T.; TURK, B.; TURK, D. Cysteine cathepsins: from structure, function and regulation to new frontiers. Biochemica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics, v. 1824, n. 1, p. 68-88, 2012. 39 AVELAR, L. A. A.; CAMILO, C. D.; ALBUQUERQUE, S.; FERNANDES, W. B.; GONÇALVEZ, C.; KENNY, P. W.; LEITÃO, A.; MCKERROW, J. H.; MONTANARI, C. A.; OROZCO, E. V. M.; RIBEIRO, J. F. R.; ROCHA, J. R.; ROSINI, F.; SAIDEL, M. E. Molecular design, synthesis and trypanocidal activity of dipeptidyl nitriles as cruzain inhibitors. PLOS Neglected Tropical Diseases, v. 9, n. 7, p. 1-24, 2015. 40 BURTOLOSO, A. C. B.; ALBUQUERQUE, S.; FURBER, M.; GOMES, J. C.; GONÇALEZ, C.; KENNY, P. W. LEITÃO, A.; MONTANARI, C. A.; QUILLES, J. C. J.; RIBEIRO, J. F. R.; ROCHA, J. R. Anti-trypanosomal activity of non-peptidic nitrile-based cysteine protease inhibitors, PLOS Neglected Tropical Diseases, v. 11, n. 2, p1-16, 2017. 41 WILLIE, S.; PATTERSON, S.; STOJANOVSKI, L.; SIMEONS, F. R. C.; NORVAL, S.; KIME, R.; READ, K. D.; FIARLAMB, A. H.The anti-trypanosome drug fexinidazole shows potential for treating visceral leishmaniasis. Science Translational Medicine, v. 4, n. 119, p. 1-7, 2012. 42 DAVID, C. V.; CRAFT, N. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Dermatology Therapy, v. 22, n. 6, p. 491-502, 2009.
122
43 CONTIJO, V. S.; ESPURI, P. F.; ALVEZ, R. B.; CAMARGOS, L. F.; SANTOS, F. V.; JUDICE, W. A. S.; MARQUES, M. J.; FREITAS, R. P. Leishmanicidal, antiproteolytic, and mutagenic evaluation of alkyltriazoles and alkylphosphocholines. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 101, p. 24-33, 2015. 44 KUMAR, A. Leishmania and leishmaniasis. Nova Delhi: Springer, 2013. 90 p. 45 VAN ASSCHE, T.; DESCHACHT, M.; LUZ, R. A. I.; MAES, L.; COS, P. Leishmania-macrophage interactions: insights into the redox biology. Free Radical Biology & Medicine, v. 51, n. 2, p. 337-351, 2011. 46 SACKES, D.; NOBEN-TRAUTH, N. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice. Nature Reviews Immunology, v. 2, n. 11, p. 845-858, 2002. 47 MACHADO-SILVA, A.; GUIMARÃES; P. P. G.; TAVARES, C. A. P.; SINISTERRA, R. D. New perspectives for leishmaniasis chemotherapy over current anti-leishmanial drugs: a patent landscape. Expert Opinion on Therapeutic Patents, v. 25, n. 3, p. 247-60, 2015. 48 BARBORA, A. M.; COSTA, S. S.; ROCHA, J. R.; MONTANARI, C. A.; GIORGIO, S. Evaluation of the leishmanicidal and cytotoxic effects of inhibitors for microorganism metabolic pathway enzymes. Biomedicine & Pharmacotherapy, v. 74, p. 95-100, 2015. 49 MCGWIRE, B. S.; SATOSKAR, A. R. Satoskar. Leishmaniasis: clinical syndromes and treatment. QJM: an International Journal of Medicine, v. 107, n. 1, p. 7-14, 2014. 50 FILIPPIN, F. B.; SOUZA, L. C. Eficiência terapêutica das formulações lipídicas de anfotericina B. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 42, n. 2, p. 167-194, 2006. 51 SOARES-BEZERRA, R. J.; LEON, L.; GENESTRA, M. Recentes avanços da quimioterapia das leishmanioses : moléculas intracelulares como alvo de fármacos. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 40, n. 2, 139-149, 2004. 52 MEARS, E. R.; MODABBER, F.; DON, R.; JOHNSON, G. E. A review: the xurrent in vivo models for the discovery and utility of new anti-leishmanial drugs targeting cutaneous leishmaniasis. PLOS Negleted Tropical Diseases, v. 9, n. 9, p. 1-23, 2015.
123
53 ALMEIRA, M. S.; PEREIRA, B. A.; GUIMARÃES, M. R.; ALVES, C. Proteinases as virulence factors in Leishmania spp. infection in mammals. Parasites & Vectors, v. 5, n. 1, p. 160-180, 2012. 54 CASGRAIN, P.A.; MARTEL, C.; MCMASTER, W. R.; MOTTRAM, J. C.; OLIVER, M.; DESCOTEAUX, A. Cysteine Peptidase B regulates Leishmania mexicana virulence through the modulation of GP63 expression. PLOS Pathogens, v. 12, n. 5, p. 1-17, 2016. 55 SAJID, M.; MCKERROW, J. H. Cysteine proteases of parasitic organisms. Molecular and Biochemistry Parasitology, v. 120, n. 1, p. 1-21, 2002. 56 SARAIVA, N. G.; ESCORCIA, B.; OSORIO, Y.; VALDERRAMA, L.; BROOKS, D.; ARTEAGA, L.; COOMBS, G.; MOTTRAM, J.; TRAVI, B. L. Pathogenicity and protective immunogenicity of cysteine proteinase-deficient mutants of Leishmania mexicana in non-murine models. Vaccine, v. 24, n. 19, p. 4247-4259, 2006. 57 LEAO, S. D. S.; LANG, T.; PRINA, E.; HELLIO, R.; ANTOINE, J. Intracellular Leishmania amazonensis amastigotes internalize and degrade MHC class II molecules of their host cells.Journal of Cell Science, v. 3231, p. 3219-3231, 1995. 58 CAROSELLI, E. E.; ASSIS, D. M.; BARBIÉRI, C. L.; JÚDICE, W. A. S.; JULIANO, M. A.; GAZARIN, M. L.; JULIANO, L. Leishmania (L.) amazonensis peptidase activities inside the living cells and in their lysates. Molecular & Biochemical Parasitology, v. 184, n. 2, p. 82-89, 2012. 59 BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, v. 72, n. 1-2, p. 248-254, 1976. 60 BRUNO, F.; CASTELLI, G.; MIGLIAZZO, A.; PIAZZA, M.; GALANTE, A.; VERDE, V. L.; CALDERONE, S.; NOCATOLO, G.; VITALE, F. Cytotoxic screening and in vitro evaluation of pentadecane against Leishmania infantum promastigotes and amastigotes. Journal of Parasitology, v. 101, n. 6, p. 701-705, 2015. 61 TRINCONI, C. T.; REIMÃO, J. Q.; COLEHO, A. C.; ULIANA, S. R. B. Efficacy of tamoxifen and miltefosine combined therapy for cutaneous leishmaniasis in the murine model of infection with Leishmania amazonensis. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 17, n. 1, p. 1314-1322, 2016.
124
62 FREITAS, E. O.; NICO, D.; GUAN, R.; MEYER-FERNANDES, J. R.; CLINCH, K.; EVANS, G. B.; TYLER, P. C.; SCHRAMM, V. R.; PALATNIK-DE-SOUSA, C. B. Immucillins impair Leishmania (L.) infantum chagasi and Leishmania (L.) amazonensis multiplication in vitro. PLoS One, v. 10, n. 4, p. 1-18, 2015. 63 GARCÍA-GARCÍA, V. ; OLDFIELD, E.; BENAIM, G. Inhibition of Leishmania mexicana growth by the tuberculosis drug SQ109. Antimicrobial Agents and Chemotheraphy, v. 60, n. 70, p.6386-6389, 2016. 64 HO, J.; FISHWILD, D. M. Screening cytoactive compounds to determine cell cycle arrest using the guava PCA-96 system: a microplate-based benchtop cell analysis system. Guava Technology, v. 1, p. 1-9, 2004. 65 COSTA, J. D. ; MELO, A. C. N.; VERMELHO, A. B.; MEIRELLES, M. D. N.; PORROZZI, R. In vitro evidence for metallopeptidase participation in hepatocyte damage induced by Leishmania chagasi-infected macrophages. Acta Trop, v. 106, n. 3, p. 175-183, 2008. 66 AZEVEDO, A. F.; DUTRA, J. L. L.; SANTOS, M. L. B.; SANTOS, D. A.; ALVES, P. B.; MOURA, T. R.; ALMEIRA, R. P.; FERNANDES, M. F.; SCHER, R. FERNANDES, R. P. M. Fatty acid profiles in Leishmania spp. isolates with natural resistance to nitric oxide and trivalent antimony. Parasitology Research, v. 113, n. 1, p. 19-27, 2014. 67 P. SELZER, P. M.; PINGEL, S.; HSIEH, I.; UGELE, B.; CHAN, V. J.; ENGEL, J. C.; BOGYO, M.; RUSSEL, D. G.; SAKANARI, J. A.; MCKERROW, J. H. Cysteine protease inhibitors as chemotherapy: lessons from a parasite target. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 96, n. 20, p. 11015-11022, 1999. 68 MAHMOUDZADEH, H.; MCKERROW, J. H. Leishmania tropica: cysteine proteases are essential for growth and pathogenicity. Experimental Parasitology, v. 106, n. 3-4, p. 158-163, 2004. 69 VEIGA-SANTOS, P.; REIGNAULT, L. C.; HUBER, K.; BRACHER, F., SOUZA, W; CARVALHO, T. M. U. Inhibition of NAD+-dependent histone deacetylases (sirtuins) causes growth arrest and activates both apoptosis and autophagy in the pathogenic protozoan Trypanosoma cruzi. Parasitology, v. 141, n. 6, p. 814-25, 2014. 70 DUSCHAK, V. G.; COUTO, A. S. Cruzipain, the major cysteine protease of Trypanosoma cruzi: a sulfated glycoprotein antigen as relevant candidate for vaccine development and drug target. a review. Current Medicinal Chemistry, v. 16, n. 24, p. 3174-3202, 2009.
125
71 ALVAREZ, V. E.; NIEMIROWICZ, G. T.; CAZZULO, J. J. The peptidases of Trypanosoma cruzi: digestive enzymes, virulence factors, and mediators of autophagy and programmed cell death. Biochimica & Biophysica Acta - Proteins and Proteomics, v. 1824, n. 1, p. 195–206, 2012. 72 ALVES, M. J. A.; KAWAHARA, R.; VINER, R.; COLLI, W.; MATTOS, E. C.; THAYSEN-ANDERSEN, M.; LARSEN, M. R.; PALMISANO, G. Comprehensive glycoprofiling of the epimastigote and trypomastigote stages of Trypanosoma cruzi. Journal of Proteomics, v. 151, p. 182-192, 2016. 73 BERN, C. Antitrypanosomal therapy for chronic Chagas disease.The New England Journal of Medicine: Research & Review , v. 364, n. 26, p. 2527-2534, 2011. 74 RAJÃO, M. A.; FURTADO, C.; ALVES, C. L.; SILVA, D. G. P.; MOURA, M. B.; REIS, B. L. S.; LIMA, M. K.; ZUMA, A. A.; ROCHA, J. P. V.; GARCIA, J. B. F.; MENDES, I. C.; PENA, S. D. J.; MACEDO, A. M.; FRANCO, G. R.; PINTO, N. C. S.; MEDEIROS, M. H. G.; CRUZ, A. K.; MOTTA, M. C. M.; TEIXEIRA, S. M. R.; MACHADO, C. R. Unveiling benznidazole’s mechanism of action through overexpression of DNA repair proteins in Trypanosoma cruzi. Environmental and Molecular Mutagenesis, v. 55, p. 309-321, 2014. 75 SANTOS, P. V.; LI, K.; LAMEIRA, L.; CARVALHO, T. M. U.; HUANG, G.; GALIZZI, M.; SHANG, N.; LI, Q.; PACANOWSKA, D. G.; RODRIGUEZ, V. H.; BENAIM, G.; GUO, R. T.; URBINA, J. A.; DOCAMPO, R.; SOUZA, W.; OLDFIELD, E. SQ109, a new drug lead for chagas disease. Antimicrob. Agents Chemother., v. 59, n. 4, p. 1950-1961, 2015. 76 BERMUDEZ, J.; DAVIES, C.; SIMONAZZI, A.; REAL, J. P.; PALMA, S. Current drug therapy and pharmaceutical challenges for Chagas disease. Acta Trop, v. 156, p. 1-16, 2016. 77 CHATELAIN, E.; KONAR, N. Translational challenges of animal models in Chagas disease drug development : a review. Drug Desing, Development and Therapy, v. 9, p. 4807-4823, 2015. 78 DIAS, L. C.; DESSOY, M. A.; SILVA, J. J. N.; THIEMANN, O. H.; OLIVA, G.; ANDRICOPULO, A. D. Quimioterapia da doença de Chagas: estado da arte e perspectivas no desenvolvimento de novos fármacos. Química Nova, v. 32, n. 9, p. 2444-2457, 2009. 79 BELLERA, C. L.; BALCAZAR, D. E.; VANRELL, M. C.; CASASSA, A. F.; PALESTRO, P. H.; GAVERNET, L.; LABRIOLA, C. A.; GALVEZ, J.; BLANCH, L. E. B.; ROMANO, P. S.; CARRILHO, C.; TALEVI, A. Identification of trypanocidal activity of clofazimine, benidipine and saquinavir. European Journal fo Medicinal Chemistry, v. 93, p. 338-348, 2015.
126
80 DOYLE, P. S.; ZHOU, Y. M., HSIEH, I.; GREENBAUM, D. C.; MCKERROW, J. H. ENGEL, J. C. The Trypanosoma cruzi protease cruzain mediates immune evasion. Plos Pathogenisis, v. 7, n. 9, p.1-11. 2011. 81 BOU, D. D.; TEMPONE, A. G.; PINTO, E. G.; LAGO, J. H. G., SARTORELLI, P. Antiparasitic activity and effect of casearins isolated from Casearia sylvestris on Leishmania and Trypanosoma cruzi plasma membrane. Phytomedicine, v. 21, n. 5, p. 676-681, 2014. 82 KHARE, S.; ROACH, S. L.; BARNES, S. W.; HOEPFNER, D.; WALKER, J. R.; CHATTERJEE, A. K.; NEITZ, R. J.; ARKIN, N. R.; MCNAMARA, C. W.; BALLARD, J.; LAI, Y.; FU, Y.; MOLTENI, V.; YEH, V.; MCKERROW, J. H.; GLYNNE, R. J.; SUPEK, F. Utilizing chemical genomics to identify cytochrome b as a novel drug target for Chagas disease. PLoS Pathogenesis, v. 11, n. 7, p. 1-22, 2015. 83 BRANQUINHA, M. H. Cruzipain: an update on its potential as chemotherapy target against the human pathogen Trypanosoma cruzi. Current Medicinal Chemistry, v. 22, n. 18, p. 2225-2235, 2015. 84 WIGGERS, H. J.; ROCHA, J. R.; FERNANDES, W. B.; COSTA, R. S.; CARNEIRO, Z. A.; CHELESKI, J.; SILVA, A. B. F.; JULIANO, L.; CEZARI, M. H. S.; SILVA, J. S.; MCKERROW, J. H.; MONTANAIR, C. A. Non-peptidic cruzain inhibitors with trypanocidal activity discovered by virtual screening and in vitro assay. Plos Neglected Tropical Diseases, v. 7, n. 8, p. 1-11, 2013. 85 GARRIDO, V. V.; DULGERIAN, L. R.; STEMPIN, C. C.; CERBAN, F. M. The Increase in mannose receptor recycling favors arginase induction and Trypanosoma cruzi survival in macrophages. International Journal of Biological Sciences, v. 7, n. 9, p. 1257-1272, 2011.
86 NDAO, M.; BEAULIEU, C.; BLACK, W. C.; ISABEL, E.; CAMARGO, F. V.; CHOWDHURY, M. N.; MASSE, F.; MELLON, C.; METHOT, N.; GRIFFITH, D. A. N. Reversible cysteine protease inhibitors show promise for a Chagas. Antimicrobial Agents and Chemotheraphy, vol. 58, pp. 1167–1178, 2014. 87 FERRAO, P. M.; LEVY, C. M. D.; JORGE, T. C. A.; DEGRAVE, W. M.; GONÇALVES, A. S.; GARZONI, L. R.; LIMA, A. P.; FEIGE, J. J.; BAILLY, S.; LIMA, L. M.; WAGHABI, M. C. Cruzipain activates latent TGF-β from host cells during T. cruzi invasion. PLoS One, v. 10, n. 5, p. 1-15, 2015.
127
88 MOTTRAM, J. C.; BROOKS, D. R.; COOMBS, G. H. Roles of cysteine proteinases of trypanosomes and Leishmania in host-parasite interactions. Current Opnion in Microbiology, v. 1, n. 4, p. 455-460, 1998. 89 POWERS, J. C.; ASGIAN, J. L.; EKICI, Ö. D.; JAMES, K. E. Irreversible inhibitors of serine, cysteine, and threonine proteases. Chemical Reviews, v. 102, n. 12, p. 4639-4750, 2002. 90 HUGGINS, D. J.; SHERMAN, W.; TIDOR, B. Rational approaches to improve selectivity in drug design. Journal of Medicinal Chemistry, v. 55, p. 1424-1444, 2012. 91 BARAN, I.; IFTIME, A.; POPESCU, A. Diffusion-convection effects on drug distribution at the cell membrane level in a patch-clamp setup. BioSystems, v. 102, n. 2-3, p. 134-147, 2010. 92 MILLES, M. A.; PÓVOA, M. M.; PRATA, A.; CEDILLOS, R. A.; SOUZA, A. A.; MACEDO, V. Do radically dissimilar Trypanosoma cruzi strains (zymodemes) cause Venezuelan and Brazilian forms of Chaga’s disease. Lancet, v. 20, p. 1338-1340, 1981. 93 COSENTINO, R. O.; AGUERO, F. A simple strain typing assay for Trypanosoma cruzi: discrimination of major evolutionary lineages from a single amplification product. PLoS Negliteced Tropical Diseases, v. 6, n. 7, p. 1-11, 2012. 94 GAZZINELLI, R. T.; TALVANI, A.; CAMARGO, M. M.; SANTIAGO, H. C.; OLIVEIRA, M. A. P.; VIEIRA, L. Q.; MARTINS, G. A.; ALIBERT, J. C. S.; SILVA, J. S. Induction of cell-mediated immunity during early stages of infection with intracellular protozoa. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 31, n. 1, p. 89-104, 1998. 95 RASSI, A.; RASSI, A.; MARIN, J. A. Chagas disease. Nature, v. 465, n. 7301, p. 1388-1402, 2010. 96 ENGEL, J. C.; DOYLE, P. S.; HSIEH, I.; MCKERROW, J. H. Cysteine protease inhibitors cure an experimental Trypanosoma cruzi infection. Journal of Experimental Medicine, v. 188, n. 4, p. 725-734, 1998. 97 BARR, S. C.; WARNER, K. L.; KORNREIC, B. G.; PISCITELLI, J.; WOLFE, A.; BENET, L.; MCKERROW, J. H. A cysteine protease inhibitor protects dogs from cardiac damage during infection by Trypanosoma cruzi a cysteine protease inhibitor protects dogs from cardiac damage during infection by Trypanosoma cruzi. Antimicrobial Agents & Chemotherapy, v. 49, n. 12, p. 5160-5162, 2005.
128
98 UEHERA, L. A.; MOREIRA, O. C.; OLIVEIRA, A. C.; AZAMBUJA, P.; LIMA, A. P. C. A.; BRITTO, C.; SANTOS, A. L. S.; BRANQUINHA, M. H.; LEVY, C. M. D. Cruzipain promotes Trypanosoma cruzi adhesion to Rhodnius prolixus midgut. PLoS Neglected Tropical Diseases, v. 6, n. 12, p. 1-11, 2012. 99 WEIN, S.; BA, C. T. V.; MAYNADIER, M.; BORDAT, Y.; PEREZ, J.; PEYRROTTES, S.; FRAISSE, L.; VIAL, H. J. New insight into the mechanism of accumulation and intraerythrocytic compartmentation of albitiazolium, a new type of antimalarial. Antimicrobial Agents & Chemotheraphy, v. 58, n. 9, p. 5519-5527, 2014. 100 OLIVEIRA, G. B.; CARDOSO, M. V. O.; ESPINDOLA, J. W. P.; FERREIRA, L. F. G. R.; SIMONE, C. A.; FERREIRA, R. S.; COELHO, P. L.; MEIRA, C. S.; MOREIRA, D. R. M.; SOARES, M. B. P.; LEITE, A. C. L. Structural design, synthesis and pharmacological evaluation of 4-thiazolidinones against Trypanosoma cruzi. Bioorganic & Medicinal Chemistry, v. 23, n. 23, p. 7478-7486, 2015. 101 YOKOTA, J. Tumor progression and metastasis. Carcinogenesis, v. 21, n. 3, p. 497-503, 2000. 102 VALASTYAN, S.; WEINBERG, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell, v. 147, n. 2, p. 275-292, 2011. 103 LARSEN, H. L.; BOTTON, A. G. The molecular and morphogenetic basis of pancreas organogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology, v. 66, p. 51-68, 2017. 104 GILLILAND, T. M.; FERRIOL, N. V.; SHAH, R. M.; CAO, H. S. T.; MASSARWEH N. N.; SILBERFEIN, E. J.; CHOI, E. A.; HSU, C.; MCELHANY, A. L.; BARAKAT, O.; FISHER, W.; BUREN, G. V. Nutritional and metabolic derangements in pancreatic cancer and pancreatic resection. Nutrients, v. 9, n. 3, p. 1-15, 2017. 105 FAHRIOBLU, U.; DODURGA, Y.; ELMAR, L.; SEÇME, M. Ferulic acid decreases cell viability and colony formation while inhibiting migration of MIA PaCa-2 human pancreatic cancer cells in vitro. Gene, v. 576, n. 1, p. 476-482, 2016. 106 HERMAN, J. M.; REGIENE, W. F. Adjuvant pancreatic cancer therapy: no one should go it alone or be Left behind. Internation Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics, v. 77, n. 3, p. 645-647, 2010.
129
107 POSTLEWAIT, L. M.; ETHUN, C. G.; KOOBY, D. A.; SARMIENTO, J. M.; CHEN, Z.; STALEY, C. A.; BRUTCHER, E.; ADSAY, V.; EL-RAYES, B.; MAITHEL, S. K. Combination gemcitabine/cisplatin therapy and ERCC1 expression for resected pancreatic adenocarcinoma: results of a Phase II prospective trial. Journal of Surgical Oncology,v. 114, n. 3, p. 336-341, 2016. 108 GOCHEVA, V.; ZENG, W.; KE, D.; KLIMSTRA, D.; REINHECKEL, T.; PETER, C.; HANAHAM, D.; JOYCE, J. A. Distinct roles for cysteine cathepsin genes in multistage tumorigenesis. Genes and Development, v. 20, n. 5, p. 543-556, 2006. 109 JOYCE, J. A.; HANAHAN, D. Multiple roles for cysteine cathepsins in cancer. Cell Cycle, v. 3, n. 12, p. 1516-1519, 2004. 110 VERDOES, M.; BENDER, K. O.; SEGAL, E.; LINDER, W. A.; SYED, S.; WITHANA, N. P.; SANMAN, L. E.; BOGYO, M. Improved quenched fluorescent probe for imaging of cysteine cathepsin activity. Journal of American, Chemical Society, v. 135, p. 14726-14730, 2013. 111 SUDHAN, D. R.; SIEMANN, D. W. Cathepsin L targeting in cancer treatment. Pharmacology & Therapeutics, v. 155, p. 105-116, 2015. 112 LANKELMA, J. M.; VOOREND, D. M.; BARWARI, T.; KOETSVELD, J.; SPEK, A. H. V.; PORTO, A. P. N. A.; ROOIJEN, G. V.; NOORDEN, C. J. F. V. Cathepsin L , target in cancer treatment? Life Sciences, v. 86, n. 2010, p. 225-233, 2010. 113 DANA, D.; DE, S.; RATHOD, P.; DAVALOS, A. R.; NOVOA, D. A.; PAROLY, S.; TORRES, V. M.; AFZAL, N.; LANKALAPALLI, R. S.; ROTENBERG, S. A.; CHANG, E. J.; SUBRAMANIAM, G.; KUMAR, S. Development of a highly potent, selective, and cell-active inhibitor of cysteine cathepsin L-A hybrid design approach. Chemical Communication, v. 50, n. 74, p. 10875–10878, 2014. 114 BRINDLE, N. R.; JOYCE, J. A.; ROSTKER, F.; LAWLOR, E. R.; BROWN, L. S.; EVAN, G.; HANAHAN, D.; SHCHORS, K. Deficiency for the cysteine protease cathepsin l impairs Myc-induced tumorigenesis in a mouse model of pancreatic neuroendocrine cancer. PLoS One, v. 10, n. 4, p. 1-17, 2015. 115 BRIX, K.; DUNKHORTS, A.; MAYER, K.; JORDANS, S. Cysteine cathepsins: cellular roadmap to different functions. Biochimie, v. 90, n. 2, p. 194-207, 2008. 116 CHOU, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the chou- talalay method. Cancer Research, v. 70, n. 2, p. 440-446, 2010.
130
117 IRAM, S.; ZAHERA, M.; KHAN, S.; KHAN, I.; SYED, A.; ANSARY, A. A.; AMEEN, F.; SHAIR, O. H. M.; KHAN, M. S. Gold nanoconjugates reinforce the potency of conjugated cisplatin and doxorubicin. Colloids, and Surfaces B: Biointerfaces, v. 160, p. 254-264, 2017. 118 FOUCQUIER, J.; GUEDJ, M. Analysis of drug combinations: current methodological landscape. Pharmacology Research & Perspectives, v. 3, n. 3, p. 1-11, 2015. 119 LYO, V.; CATTARUZZA, F.; KIM, T. N.; WALKER, A. W.; WALKER, A. W.; PAULICK, M. P.; COX, D.; CLOYD, J.; BUXBAUM, J.; OSTROFF, J.; BOGYO, M.; GRADY, E. F.; BUNNETT, N. W.; KIRKWOOD, K. S. Active cathepsins B, L, and S in murine and human pancreatitis. American Journal of Physiological Liver Physiology, v. 303, n. 8, p. 894-903, 2012. 120 SUDHAN, D. R.; SIEMANN, D. W. Cathepsin L inhibition by the small molecule KGP94 suppresses tumor microenvironment enhanced metastasis associated cell functions of prostate and breast cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis, v. 30, n. 2013, p. 891-902, 2013. 121 GAGNON, A.; AMAD, A. M.; BONNEAU, P. R.; COULOMBE, R.; DEROY, P. L.; DOYON, L.; DOYON, L.; DUAN, J.; GARNEAU, M.; GUSE, I.; JAKALIAN, A.; JOLICOEUR, E.; LANDRE, S.; MALENFANT, E.; SIMONEAU, B.; YOAKIM, C. Thiotetrazole alkynylacetanilides as potent and bioavailable non-nucleoside inhibitors of the HIV-1 wild type and K103N/Y181C double mutant reverse transcriptases. Biorganic & Medicinal Chemistry Letters, v. 17, n. 16, p. 4437-4441, 2007. 122 FRANKEN, N. A. P.; RODERMOND, H. M.; STAP, J.; HAVEMAN, J. VAN-BREE, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols, v. 1, n. 5, p. 2315-2319, 2006. 123 SONG, L.; CHANG, J.; LI, Z. A serine protease extracted from Trichosanthes kirilowii induces apoptosis via the PI3K/AKT-mediated mitochondrial pathway in human colorectal adenocarcinoma cells. Food Functions, v. 7, n. 2, p. 843-854, 2016. 124 MARTIN, A. C. B. M.; CARDOSO, A. C. F.; SELISTRE-DE-ARAUJO, H. S.; COMINETTI, M. R. Recombinant disintegrin domain of human ADAM9 inhibits migration and invasion of DU145 prostate tumor cells. Cell Adhesion & Migration, v. 9, n. 4, p. 293-299, 2015. 125 KATT, M. E.; PLACONE, A. L.; WONG, A. D.; XU, Z. S.; SEARSON, P. C. In Vitro tumor models: advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, v. 4, n. 12, p. 1-12, 2016.
131
126 MEHLEN, P.; PUISIEUX, A. Metastasis: a question of life or death. Nature Reviews Cancer, v. 6, n. 6, p. 449-58, 2006. 127 TAMURA, K. Development of cell-cycle checkpoint therapy for solid tumors. Japonse Journal of Clinical Oncology, v. 45, n. 12, p. 1097-1102, 2015. 128 GOULET, B.; NEPVEU, A. Complete and limited proteolysis in cell cycle progression. Cell Cycle, v. 3, n. 8, p. 986-989, 2004. 129 SHELPER, T. B.; LOVITT, C. J.; AVERY, V. M. Assessing drug efficacy in a miniaturized pancreatic cancer in vitro 3D cell culture model. Assay and Drug Development Technologies, v. 14, n. 7, p. 367-380, 2016. 130 DEMCHIK, L. L.; SAMENI, M.; NELSON, K.; MIKKELSEN, T.; SLOANE, B. F. Cathepsin B and glioma invasion. International Journal of Developmental Neuroscience, v. 17, n. 5, p. 483-494, 1999. 131 LAKKA, S. S.; GONDI, C. S.; YANAMANDRA, N.; OLIVERO, W. C.; DINH, D. H.; GUJRATI, M.; RAO, J. S. Inhibition of cathepsin B and MMP-9 gene expression in glioblastoma cell line via RNA interference reduces tumor cell invasion, tumor growth and angiogenesis. Oncogene, v. 23, n. 27, p. 4681-4689, 2004. 132 SABEH, F.; SHIMIZU-HIROTA, R.; WEISS, S. J. Protease-dependent versus-independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited. Journal of Cell Biology, v. 185, n. 1, p. 11-19, 2009. 133 AWASTHI, N.; ZHANG, C.; SCHWARZ, A. M.; HINZ, S.; WANG, C.; WILLIAMS, N. S.; SCHWARZ, M. A.; SCHWARZ, R. E. Comparative benefits of nab-paclitaxel over gemcitabine or polysorbate-based docetaxel in experimental pancreatic cancer. Carcinogenesis, v. 34, n. 10, p. 2361-2369, 2013. 134 OTIN-LOPEZ, C.; MATRISIAN, L. M. Emerging roles of proteases in tumour suppression. Nature Review Cancer, v. 7, n. 10, p. 800-808, 2007. 135 JOYCE, J. A.; BARUCH, A.; CHEHADE, K.; MORSE, N. M.; GIRAUDO, E.; TSAI, F. Y.; GREENBAUM, D. C.; HAGER, J. H.; BOGYO, M.; HANAHAN, D. Cathepsin cysteine proteases are effectors of invasive growth and angiogenesis during multistage tumorigenesis. Cancer Cell, v. 5, p. 443-453, 2004.
132
136 REYNOLDS, R. B.; FOLLODER, J. Clinical management of pancreatic cancer. Journal of the Advanced Practitioner in Oncology, v. 5, n. 5, p. 356-64, 2014. 137 SEICEAN, A.; PETRUSEL, L.; SEICEAN, R. New targeted therapies in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology,v. 21, n. 20, p. 6127-6145, 2015. 138 O'CONNELL, M. J. Phase Ill trial of 5-fluorouracil and leucovorin in the treatment of advanced colorectal cancer. Cancer, v. 63, p. 1026-1030, 1989. 139 GRAMONT, B. A.; FIGER, A.; SEYMOUR, A.; HOMERIN, M.; HMISSI, M.; CASSIDY, A.; BONI, J.; CORTES-FUNES, C.; CERVANTES, H.; FREYER, A.; PAPAMICHEAL, G, LEBAIL, D.; LOUVET, N.; HEDLER, C.; BRAUD, D.; WILSON, F.; MORVAN, F. Leucovorin and fluorouracil with or without oxaliplatin as first-line treatment in advanced colorectal cancer. Journal of Clinical Oncology, v. 18, n. 16, p. 2938-2947, 2000. 140 TAMHANE, T; LLLUKKUMBURA, R.; LU, S.; MAELANDSMO, G. M..; HAUGEN, M. H.; BRIX, K. Nuclear cathepsin L activity is required for cell cycle progression of colorectal carcinoma cells. Biochimie, v. 122, p. 208-218, 2015. 141 QIN, S. Y.; ZHANG, A. Q.; CHENG, S. X..; RONG, L.; ZHANG, X. Z. Zhang. Drug self-delivery systems for cancer therapy. Biomaterials, v. 112, p. 234-247, 2017. 142 TOSI, G.; BELLETTI, D.; PEDERZOLI, F.; RUOZI, B. Apoferritin nanocage as drug reservoir: is it a reliable drug delivery system? Expert Opinion in Drug Delivery, v. 13, n. 10, p. 1341-1343, 2016. 143 WILCZEWSKA, A. Z.; NIEMIROWICZ, K.; MARKIEWICZ, K. H.; CAR, H.Nanoparticles as drug delivery systems. Pharmacology Reports, v. 64, n. 5, p. 1020-1037, 2012. 144 MOLINO, N. M.; WANG, S. W. Caged protein nanoparticles for drug delivery. Current Opinion in Biotechnology, v. 28, n.1, p. 75- 82, 2014. 145 LI, X.; ZHANG, Y.; CHEN, H.; SUN, J.; FENG, F. Protein nanocages for delivery and release of luminescent ruthenium(II) polypyridyl complexes. ACS Applied, Materials & Interfaces, v. 8, n. 35, p. 22756-22761, 2016.
133
146 LI, L.; ZHANG, L.; KNEZ, M. Comparison of two endogenous delivery agents in cancer therapy: exosomes and ferritin. Pharmacology Research, v. 110, p. 1-9, 2016. 147 CRICHTON, R. R.; CHARLOTEAUX-WAUTERS, M. Iron transport and storage proteins. European Journal of Biotechnology, v. 164, p. 485-506, 1987. 148 KURUPPU, A. I.; ZHANG, L.; COLLINS, H..; TURYANSKA, L.; THOMAS, N. R.; BRADSHAW, T. D. An apoferritin-based drug delivery system for the tyrosine kinase inhibitor gefitinib. Advances Healthcare Materials, v. 4, n. 18, p. 2816-2821, 2015. 149 AROSIO, P.; INGRASSIA, R.; CAVADINI, P. Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects, v. 1790, n. 7, p. 589-599, 2009. 150 DOSTALOVA, S.; CERNA, T.; HYNEK, D.; KOUDELKOVA, Z.; VACULOVIC, T.; KOPEL, P.; HRABETA, J.; HEGER, Z.; VACULOVICOVA, M.; ECKSCHLAGER, E.; STIBOROVA, M.; ADAM, V. Site-directed conjugation of antibodies to apoferritin nanocarrier for targeted drug delivery to prostate cancer cells. Applied Materials & Interfaces, v. 8, n. 23, p. 14430-14441, 2016. 151 TETTER, S.; HILVERT, D. Enzyme encapsulation by a ferritin cage. Angewandte Chemie International Edition, v. 56, n. 47, p. 14933-14936, 2017. 152 ZHOU, Z.; SUN, G.; LIU, Y.; GAO, Y.; XU, J.; MENG, D.; STRAPPE, P.; BLANCHARD, C.; YANG, R. A novel approach to prepare protein-proanthocyanidins nano-complexes by the reversible assembly of ferritin cage. Food Science Technology Research, v. 23, n. 2, p. 329-337, 2017. 153 TORTI, S. V.; TORTI, F. M. Iron and cancer: more ore to be mined. Nature Review Cancer, v. 13, n. 5, p. 342-355, 2013. 154 MAEDA, H.; WU, J.; SAWA, T.; MATSUMURA, Y.; HORI, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release, v. 65, n. 1-2, p. 271-284, 2000. 155 DANIELS, T. R.; BERNABEU, E.; RODRIGUEZ, J. A.; PATEL, S.; KOZMAN, M.; CHIAPPETTA, D. A.; HOLLER, E.; LJUBIMOVA, J. Y.; HELGUERA, G.; PENICHET, M. L. Transferrin receptors and th targeted delivery of therapeutic agents against cancer. Biochemica et Biophysica Acta, v. 1820, n. 3, p. 291-317, 2012.
134
156 XING, R.; WANG, X.; ZHANG, C.; ZHANG, Y.; WANG, Q.; YANG, Z.; GUO, Z. Characterization and cellular uptake of platinum anticancer drugs encapsulated in apoferritin. Journal of Inorganic Biochemistry, v. 103, n. 7, p. 1039-1044, 2009. 157 SUNDERLAND, C. J.; STEIERT, M.; TALMADGE, J. E.; DERFUS, A. M.; BARRY, S. E. Targeted nanopartiles for decting and treating cancer. Drug Development Research, v. 67, n. 3, p. 70-93, 2006. 158 TIWARI, R. Controlled release drug formulation in pharmaceuticals: a study on their application and properties. World Journal of Phamaceutircal Research, v. 5, n. 2, p. 1704-1720, 2016. 159 TURYANSKA, L.; BRADSHAW, T. D.; SHARPE, J.; LI, M.; MANN, S.; THOMAS, N. R.; PATANE, A. The biocompatibility of apoferritin-encapsulated PbS quantum dots. Small Communications, v. 5, n. 15, p. 1738-1741, 2009. 160 DARZYNKIEWICZ, Z.; BRUNO, S.; BINO, G. D.; GORCZYCA, W.; HOTZ, M. A.; LASSOTA, P.; TRAGANOS, F. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry, v. 13, p. 795-808, 1992. 161 ALFANAS, V. N.; KOROL, B. A.; MANTSYGIN, Y. A.; NELIPOVICH, P. A.; PECHATNIKOV, V. A.; UMANSKY, S. R. Flow cytometry and biochemical analysis of DNA degradation characteristic of two types of cell death. FEBS Letters, v. 194, n. 2, p. 351-354, 1986. 162 KROEMER, G.; GALLUZZI, L.; VANDENABEELE, P.; ABRAMS, J.; ALNEMRI, E. S.; BAEHRECKE, E. H.; BLAGOSKLONNY, M. V.; EL-DEIRY, W. S.; GOLSTEIN, P.; GREEN, D. R.; HENGARTNER, M.; KNIGHT, R. A.; KUMAR, S.; LIPTON, S. A.; MALORNI, W.; NUNEZ, G.; PETER, M. E.; TSCHOPP, J.; YUAN, J.; PIACENTINI, M.; ZHIVOTOVSKY, B.; MELINO, G. Classification of cell death: recommendations of the nomenclature committee on cell death 2009. Cell Death Differenciation, v. 16, n. 1, p. 3-11, 2009.
135
ANEXO I
Estruturas químicas dos inibidores covalentes reversíveis de cisteíno proteases estudadas no
trabalho.
Neq0396
Neq0400
Neq0409
Neq0413
136
Neq0414
Neq0415
Neq0419
Neq0500
Neq0513
137
Neq0533
Neq0536
Neq0537
Neq0544
138
Neq0546
Neq0548
Neq0549
Neq0550
Neq0551
139
Neq0552
Neq0554
Neq0565
Nseq0568
140
Neq0569
Neq0570
Neq0571
Neq0572
Neq0573
Neq0574
141
Neq0575
Neq0576
Neq0577
Neq0578
Neq0583
142
Neq0587
Neq0594
Neq0662
Neq0663
143
Neq0666
144
ANEXO II
145