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UNIVERSIDADE METODISTA DE PIRACICABA FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

MESTRADO EM EDUCAÇÃO FÍSICA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

EFEITO DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE A FUNCIONALIDADE DE LINFÓCITOS E CITOCINAS CIRCULANTES DE RATOS

JONATO PRESTES

PIRACICABA-SP Fevereiro de 2006

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UNIVERSIDADE METODISTA DE PIRACICABA

FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE MESTRADO EM EDUCAÇÃO FÍSICA


JONATO PRESTES

PIRACICABA-SP Fevereiro de 2006

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em Educação Física da Universidade Metodista de Piracicaba, para obtenção do título de Mestre em Educação Física na área de concentração “Performance Humana”, sob orientação da Profa. Dra. Cláudia Regina Cavaglieri.

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BANCA EXAMINADORA:

PROFa. DRa. CLÁUDIA REGINA CAVAGLIERI (ORIENTADORA)

PROF. DR. CARLOS ALBERTO DA SILVA

PROF. DR. SÉRGIO EDUARDO DE ANDRADE PEREZ

PROFa. DRa. ADRIANNE CHRISTINE PALANCH (SUPLENTE)

UNIVERSIDADE METODISTA DE PIRACICABA FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PIRACICABA-SP 2006

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O mundo é grande e cabe

nesta janela sobre o mar.

O mar é grande e cabe

na cama e no colchão de amar.

O amor é grande e cabe

no breve espaço de beijar

(Carlos Drummond de Andrade in “Amar se Aprende Amando”)

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DEDICATÓRIA

A DEUS que me deu luz, indicou o caminho e me acompanhou em todos os

passos da minha vida até hoje, e que com certeza continuará me guiando para

caminhos ainda mais gloriosos e abençoados.

Aos meus Pais, Jauri de Oliveira Prestes e Hedvirges Prestes, por terem me

dado tanto apoio e carinho até hoje. Este é mais um dos sonhos realizados,

que estarei sempre dedicando a vocês. Sonho que se realizou pela existência

destes dois maravilhosos seres humanos.

Neste momento só posso agradecer a Anelena Bueno Frollini, por toda a

compreensão, ajuda, cumplicidade, amor e por ter sempre estado ao meu lado.

Uma pessoa que mudou minha vida.

6

AGRADECIMENTO ESPECIAL

A Professora DRa. Cláudia Regina Cavaglieri, uma pessoa formidável, por ter

acreditado no meu trabalho, na minha pessoa. Obrigado pela oportunidade de

me tornar este Homem que sou hoje, é com muita honra e dedicação que eu

tive o prazer de ter recebido sua orientação e mais do que tudo, sua amizade.

Muito obrigado Cláudia você é inesquecível e possue uma inteligência

inestimável.

Ao grupo de Imunologia do exercício, em especial aos meus amigos Rodrigo

Dias, Clílton Krauss de Oliveira Ferreira e Felipe Donatto que foram pessoas

que sempre me ajudaram e me fizeram crescer muito na pesquisa e na vida.

As pessoas que moraram comigo nestes dois anos e me suportaram, dando

amizade e carinho, grandes homens com muito conhecimento científico,

grandes futuros nomes da Educação Física no Brasil, Christiano Bertoldo

Urtado, Gerson do Santos Leite, Vinicius Guzzoni, Henrique Del Bem.

Ao Professor Denis Foschini pelas oportunidades oferecidas e pela amizade.

7

AGRADECIMENTOS

A Patrícia Carla Paulino pelos dias em que nos auxiliou brilhantemente no

laboratório de Fisiologia, sempre demonstrando paciência, carinho e amizade.

A Melissa Victo, Márcia Guerreschi, Sandra Brambila pelo apoio nos

experimentos realizados para a concretização deste trabalho.

As Professoras DRa. Rozangela Verlengia e DRa. Adrianne Christine Palanch

pelos conselhos, amizade e ajuda nos tempos difíceis.

A Professora DRa. Slivia Crepaldi Alves pelo o incentivo e oportunidades

abertas neste período, uma grande mestre.

A todos os professores da Pós-graduação pelo conhecimento transmitido e

pela amizade e ao programa de Mestrado em Educação Física da Unimep

como um todo.

A todos os colegas da Pós-graduação, pela convivência agradável.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

pelo apoio financeiro na forma de bolsa de estudos, por meio do programa

CAPES/PROSUP, ao PIBIC/CNPQ pelas bolsas cedidas aos alunos de

iniciação científica que participaram deste trabalho e ao FAP/UNIMEP pela

apoio financeiro ao projeto.

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1 2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 4 2.1 Sistema Imunológico ......................................................................................... 4 2.2 Efeitos do Exercício sobre o Sistema Imunitário ............................................... 8 3. OBJETIVOS DA PESQUISA ................................................................................ 24 3.1 Objetivo Geral ................................................................................................ 24 3.2 Objetivos Específicos ..................................................................................... 24 4. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 25 4.1 Animais ............................................................................................................ 25 4.2 Grupos Experimentais ..................................................................................... 25 4.3 Grupo Controle ................................................................................................ 25 4.4 Grupos Submetidos a uma (1) sessão de Exercício Físico ............................. 26 4.5 Grupo Exercitado cinco (5) sessões ................................................................ 26 4.6 Exercício Físico ............................................................................................... 27 4.7 Descrição Metodológica dos Parâmetros Analisados ..................................... 27 4.7.1 Leucometria ............................................................................................ 27 4.7.2 Leucograma Diferencial - % Linfócitos Circulantes ................................ 28 4.7.3 Obtenção dos Linfócitos dos Linfonodos Mesentéricos.......................... 28 4.7.4 Protocolo IL-2 ......................................................................................... 30 4.7.5 Protocolo IL-6 ......................................................................................... 32 4.7.6 Protocolo TNF-α ..................................................................................... 34 4.7.7 Potencial Transmembrânico de Mitocôndria .......................................... 36 4.7.8 Viabilidade de Linfócitos Circulantes ...................................................... 37 4.7.9 Fragmentação de DNA ........................................................................... 37 4.8 Análise Estatística ........................................................................................... 38 5. RESULTADOS ...................................................................................................... 39 5.1 Leucometria ..................................................................................................... 39 5.2 Leucograma Diferencial - Número total de Linfócitos Circulantes .................. 41 5.3 Linfócitos do Linfonodo Mesentérico ............................................................... 43 5.4 Viabilidade de Linfócitos .................................................................................. 45 5.5 Potencial Transmembrânico Mitocondrial de Linfócitos Circulantes ............... 46 5.6 Fragmentação de DNA .................................................................................... 47 5.7 Concentração Sérica de IL-2 ........................................................................... 48 5.8 Concentração Sérica de IL-6 .......................................................................... 50 5.9 Concentração Sérica de TNF-α ....................................................................... 52 5.10 Representação esquemática geral dos resultados.........................................54 6. DISCUSSÃO...........................................................................................................55 7. CONCLUSÕES.......................................................................................................70 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................72 9. ANEXO: Publicações referentes ao mestrado....................................................88

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LISTA DE ABREVIATURAS

ACTH

Hormônio adrenocorticotrópico

AMPc Adenosina monofosfato cíclico

Bax Gene específico de apoptose

Bcl-2 Proteína anti-apoptótica

Bcl-xL Gene específico de apoptose

Bcl-xs Gene específico de apoptose

Células NK Células destruidoras naturais

Células Th Linfócitos T auxiliares

CD Grupo de diferenciação

CK Creatina cinase

CRF Fator de liberação de corticotropina

CRP Proteína-C reativa

DNA Ácido desoxirribonucléico

EDTA Etilenodiaminotetracetato

ELISA Ensaio imunoenzimático em fase sólida

EPM Erro padrão da média

Fas Receptor de morte celular

HSP72 Proteínas de choque térmico

ICAM-1 Molécula de adesão intercelular-1

IgA Imunoglobulina A

IgG Imunoglobulina G

IL-1 Interleucina-1

10

IL-1β Interleucina-1 beta

IL-1ra Interleucina1 receptor antagonista

IL-2 Interleucina-2

IL-4 Interleucina-4

IL-5 Interleucina-5

IL-6 Interleucina-6

IL-8 Interleucina-8

IL-10 Interleucina-10

Integrinas-β2 Integrinas-beta 2

Interferon-γ Interferon-gama

ITRS Infecção do trato respiratório superior

ITRSs Infecções do trato respiratório superior

LTCs Linfócitos T citolíticos

NO Óxido Nítrico

PBS Solução fosfato - salina

PHA Fitoemaglutinina

rpm Rotações por minuto

SOCS Supressores da sinalização de citocinas

STATs Proteínas sinalizadoras de transcrição

gênica

sTNF-R Receptor solúvel de TNF-α

TNF-α Fator de Necrose Tumoral-alfa

TGF- β Fator de Crescimento de

Transformação-beta

11

VCAM-1 Molécula vascular de adesão

intercelular-1

VIP Peptídeo intestinal vasoativo

VO2max Consumo máximo de oxigênio

VO2pico Pico de consumo máximo de oxigênio

durante o exercício físico

12

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Ilustração do modelo da curva em “J” da relação entre carga de

exercício e surgimento de infecções..................................................................15

Figura 2. Ilustração da proposta da curva em “S” que apresenta a relação entre

carga de exercício e surgimento de infecções...................................................16

Figura 3. Ilustração do procedimento de diluição dos calibradores para IL-2...31

Figura 4. Ilustração do procedimento de diluição dos calibradores para IL-6...33

Figura 5. Ilustração do procedimento de diluição dos calibradores para TNF-α

...........................................................................................................................35

Figura 6. Leucometria para o grupo controle e grupos 5, 15 minutos, exaustão e

exercitado 5 sessões em intensidade leve e

moderada...........................................................................................................40

Figura 7. Leucograma diferencial – Número total de linfócitos circulantes para o

grupo controle e grupos 5, 15 minutos, exaustão e exercitado 5 sessões em

intensidade leve e moderada.............................................................................42

Figura 8. Número total de linfócitos provenientes do linfonodo mesentérico para

o grupo controle e grupos 5, 15 minutos, exaustão e exercitado 5 sessões em


Figura 9. Viabilidade de linfócitos circulantes para o grupo controle e grupos 5,

15 minutos, exaustão e exercitado 5 sessões em intensidade leve e

moderada...........................................................................................................45

13

Figura 10. Potencial transmembrânico mitocondrial de linfócitos circulantes

para o grupo controle e grupos 5, 15 minutos, exaustão e exercitado 5 sessões

em intensidade leve e moderada.......................................................................46

Figura 11. Fragmentação de linfócitos circulantes para o grupo controle e

grupos 5, 15 minutos, exaustão e exercitado 5 sessões em intensidade leve e

moderada...........................................................................................................47

Figura 12. Concentração sérica de IL-2 para o grupo controle e grupos 5, 15

minutos, exaustão e exercitado 5 sessões em intensidade leve e

moderada...........................................................................................................49

Figura 13. Concentração sérica de IL-6 para o grupo controle e grupos 5, 15


moderada...........................................................................................................51

Figura 14. Concentração sérica de TNF-α para o grupo controle e grupos 5, 15


moderada...........................................................................................................53

14

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Leucometria para o grupo controle e grupos 5, 15 minutos, exaustão

e exercitado 5 sessões em intensidade leve e

moderada...........................................................................................................39

Tabela 2. Leucograma diferencial – Número total de linfócitos circulantes para o

grupo controle e grupos 5, 15 minutos, exaustão e exercitado 5 sessões em


Tabela 3. Número total de linfócitos provenientes do linfonodo mesentérico

para o grupo controle e grupos 5, 15 minutos, exaustão e exercitado 5 sessões

em intensidade leve e moderada.......................................................................43

Tabela 4. Concentração sérica de IL-2 para o grupo controle e grupos 5, 15


moderada...........................................................................................................48

Tabela 5. Concentração sérica de IL-6 para o grupo controle e grupos 5, 15


moderada...........................................................................................................50

Tabela 6. Concentração sérica de TNF-α para o grupo controle e grupos 5, 15


moderada...........................................................................................................52

Tabela 7. Representação esquemática geral dos resultados............................54

15

RESUMO

O objetivo deste estudo foi verificar os efeitos do exercício físico (natação)

sobre leucócitos totais, contagem e função de linfócitos e citocinas circulantes.

Foram utilizados ratos da linhagem Wistar, + 2 meses, peso + 200g, divididos

em 4 grupos (n=6 ou n=3 por grupo), sendo: 1) grupo controle sedentário, 2)

grupos exercitados em intensidade leve durante 5, 15 minutos e exaustão (5L

15L, e EXL), 3) grupos exercitados em intensidade moderada (sobrecarga de

5% do peso corporal acoplado na região dorsal) na mesma duração (5M, 15M

e EXM) e 4) grupos exercitados durante 5 sessões de volume progressivo na

mesma semana (5, 15, 30, 45 e 60 minutos por dia) em ambas intensidades,

(5SL e 5SM). As análises realizadas foram: leucometria, leucograma

diferencial, contagem de linfócitos dos linfonodos mesentéricos, concentração

de citocinas circulantes (IL-2, IL-6 e TNF-α); potencial transmembrânico

mitocondrial, viabilidade e fragmentação de DNA de linfócitos determinadas por

citometria de fluxo. Aplicou-se o teste estatístico ANOVA, seguido de Post Hoc

Tukey com p*≤0.05, para comparação entre todos os grupos. Observamos

aumento no número de leucócitos totais e linfócitos circulantes, para todos os

grupos exercitados em relação ao controle. Houve aumento no número de

linfócitos mesentéricos nos grupos 5L, 5M e 15M; redução nos grupos EXL,

5SL e 5SM quando comparados com o controle. Na fragmentação de DNA de

linfócitos, foi detectada redução nos grupos 15L, 5M e 15M em relação ao

controle; redução na viabilidade de linfócitos apenas no grupo 15M. Foram

observadas reduções nas concentrações de TNF-α em todos os grupos

exercitados em intensidade moderada e no 5SL; aumento na IL-6 no EXL.

Concluímos que, o exercício realizado durante 5-15 minutos, até a exaustão ou

após 5 sessões de volume progressivo, pode modular os leucócitos circulantes,

promovendo leucocitose; alterar contagem e função de linfócitos, induzindo a

linfocitose e reduzindo a fragmentação de DNA; o exercício prolongado (10

horas em média) eleva a IL-6 e exercícios com sobrecarga promovem queda

na TNF-α circulante. O exercício de curta duração mesmo nas intensidades

leve e moderada, não é inócuo com relação à resposta imune.

Palavras-chave: exercício físico, função imune, linfócitos, citocinas

16

ABSTRACT

The purpose of this issue was to verify the effects of physical exercise

(swimming) on leukocytes count, lymphocytes count and function and

circulating levels of cytokines. Wistar rats were used (2 months old), with an

average weight of 200g, divided into four groups (n=6 or n=3 each group): 1) a

sedentary control group, 2) groups exercised at low intensity for 5, 15 minutes

and exhaustion (5L 15L, and EXL), 3) groups exercised at moderate intensity

(additional load of 5% of their body weight adapted on their backs) with the

same duration (5M, 15M and EXM) and 4) groups exercised for 5 progressive

volume sessions (5, 15, 30, 45 and 60 minutes each day) in the same week at

low and moderate intensities, (5SL and 5SM). The analyses performed were:

leukometry, leukogram differential, lymphocytes from lymph nodes count, seric

cytokines (IL-2, IL-6 and TNF-α) determined by ELISA method, mitochondrial

transmembrane potential, viability and DNA fragmentation of circulating

lymphocytes were measured by flow cytometry. The statistical analyses was

done applying the ANOVA test, followed by Tukey’s post hoc test (p*≤0.05), for

comparison between all the groups. A significant increase in total leukocytes

and in blood lymphocytes was observed for all exercised groups, as compared

to control. There was an increase in the number of lymphocytes from lymph

nodes in 5L, 5M and 15M; decrease in EXL, 5SL and 5SM groups related to

control. In lymphocytes DNA fragmentation, it was observed decrease in 15L,

5M and 15M as compared to control; decrease in lymphocytes viability, only in

15M group. It was observed decrease in TNF-α levels in all moderate intensity

exercised groups and 5SL; increase in IL-6 for the EXL group. We concluded

that, the exercise performed during 5-15 minutes, to exhaustion or after 5

sessions of progressive volume, can modulate circulating leukocytes, inducing

leukocytosis, modulate lymphocytes count and function, promoting

lymphocytosis and decrease in DNA fragmentation; prolonged exercise (10

hours in average) increase IL-6; exercise with additional loads decrease TNF- α

plasma levels. The exercise at short duration, even in low and moderate

intensities groups, was efficient to elicit an immune response.

KEY WORDS: Physical excercise, immune function, lymphocytes, cytokines

17

1. INTRODUÇÃO

A intensidade, duração e a freqüência do exercício exercem papel chave

na determinação das respostas imunológicas, podendo aumentar ou reduzir tal

função (MATTHEWS et al., 2002; MEYER et al., 2001; NIEMAN, 1994b;

ROWBOTTOM e GREEN, 2000). A prática de atividade física regular realizada

em intensidade moderada pode levar a redução na ocorrência de infecções,

especialmente do trato respiratório superior (ITRSs) (MATTHEWS et al., 2002).

Por outro lado, treinamentos de alto volume e intensidade, realizados por

atletas têm sido relacionados com aumentos da susceptibilidade a ITRSs

(NIEMAN e PEDERSEN, 1999; NIEMAN, 1998). O período de “janela aberta”

no qual atletas estão mais susceptíveis a infecções ocorre depois de sessões

exaustivas de exercício (PEDERSEN e ULLUM, 1994). Treinamentos intensos

podem ainda, reduzir a função de linfócitos ou acelerar o processo de apoptose

nestas células (PHANEUF e LEEUWENBURGH, 2001; QUADRILATERO e

HOFFMAN-GOETZ, 2005). Contudo, o exercício pode, paradoxalmente, tanto

promover melhora como debilitar a resposta imune; sendo esta dependente do

tipo de exercício e do nível de aptidão física de cada indivíduo (McCARTHY e

DALE, 1988; NEHLSEN-CANNARELLA et al., 1991; MINETTO et al., 2005).

Assim, para uma preparação física voltada a se chegar ao “desempenho

ótimo”, tanto do ponto de vista físico, nutricional ou psicológico, é necessário

ter conhecimento dos riscos que a atividade física pode trazer às funções

orgânicas, minimizando-os e enaltecendo apenas os benefícios, tanto em

atletas como para a população em geral.

O exercício físico regular é geralmente considerado como fator modulador

do estado de saúde, incluindo redução na pressão arterial, redução de peso

corporal, melhoria na tolerância à glicose e possivelmente contribui para uma

redução nas ITRSs (MACKINNON, 1997). Entre atletas e treinadores, existe

um senso comum que esforços intensos reduzem a resistência imunológica

constituindo um fator predispositor para as ITRSs, sendo que, evidências

epidemiológicas confirmam este fato (MACKINNON, 1997; NIEMAN e

PEDERSEN, 1999; NIEMAN, 1998).

18

O risco de ITRS parece estar especialmente elevado durante a primeira

ou segunda semana após eventos como maratona e após 1-9h de exercícios

de endurance prolongados (NIEMAN et al., 1990). Nessas situções, os

mecanismos de defesa contra agentes invasores estão reduzidos,

caracterizando o período como “janela aberta”, ou seja, aumento na

susceptibilidade a doenças e infecções, principalmente oportunistas (NIEMAN

et al., 1990).

Os mecanismos envolvidos neste processo não foram ainda

completamente elucidados. Estes efeitos podem ocorrer devido à ação de

hormônios do estresse, interações neuro-endócrinas, liberação de citocinas, de

fatores hematológicos, nutricionais ou diminuição dos níveis circulantes de

glutamina (SHEPARD, 1998).

Exercícios físicos intensos e de curta duração podem elevar o número

total de leucócitos no sangue numa relação direta à sua intensidade, sendo

que, este aumento ocorre principalmente na série granulocítica e em especial

nos poliformonucleares (BENONI et al., 1995; HOST et al., 1995; SAXTON et

al., 2003). O número de monócitos e de linfócitos também aumenta, mas em

menor escala (HOST et al., 1995; MOOREN et al., 2004; NIEMAN, 1994b)

sendo que, as células “Destruidoras Naturais” (NK) são as que demonstram

maiores alterações em relação à subpopulação dos linfócitos (MILES et al.,

2002; SHEPHARD e SHEK, 1995; TIMMONS et al., 2006).

Um dos mecanismos propostos para explicar esta linfocitose passageira,

poderia ser a liberação de adrenalina provocada pelo exercício (AZENABOR e

HOFFMAN-GOETZ, 2000). Após cinco minutos do término do exercício, a

contagem de linfócitos começa a diminuir provavelmente pelos efeitos

posteriores do cortisol liberado durante o mesmo (PEDERSEN et al., 1997),

sendo que, em geral de quatro a seis horas depois de encerrado o exercício

físico e, provavelmente após 24 horas de repouso, a contagem dos linfócitos se

normaliza (HOST et al., 1995; MEYER et al., 2004).

Aumento no tráfico de linfócitos é tipicamente controlado pelas

concentrações de catecolaminas, especialmente em atividades de curta

duração (BENSCHOP et al., 1996; KAPPEL et al., 1991; LANDMANN, 1992).

Reduções tardias observadas no número de linfócitos circulantes sofrem

influências do cortisol, particularmente em exercícios de duração mais

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prolongada. Diversas substâncias podem modular o número e a função de

linfócitos, incluindo os hormônios do estresse e seus respectivos ciclos

circadianos, prostaglandinas, β-endorfinas e citocinas (JOZSA et al., 2005;

KAPPEL et al., 1991; PEDERSEN et al., 1997).

O exercício físico afeta a produção sistêmica de citocinas,

principalmente o Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-α) (MOLDOVEANU et

al., 2000; RIVIER et al., 1994), além das interleucinas-1 beta (IL-1β)

(MOLDOVEANU et al., 2000), IL-6 (JANKORD e JEMIOLO, 2004;

MOLDOVEANU et al., 2000; OSTROWSKI et al, 2000), interferons e outras

citocinas (NEMET et al., 2004; RIVIER et al., 1994). A IL-6 é uma citocina pró-

inflamatória chave na fase aguda da resposta inflamatória (OSTROWSKI et al.,

2000). A Concentração plasmática de interleucina-2 (IL-2) reduziu 50%

imediatamente após uma corrida de 5Km, retornando aos valores basais em

torno de 2 horas depois do exercício, e aumentando em cerca de 50% 24 horas

depois da prova (ESPERSEN et al., 1990). A demanda imposta pelo exercício

e a resultante redução na atividade de células NK durante a recuperação estão

relacionadas a uma redução na expressão dos receptores de membrana de IL-

2 em células NK (McFARLIN et al., 2004). Em adultos, foram demonstrados

aumentos significativos na concentração de TNF-α circulante em resposta ao

exercício extenuante (OSTROWSKI et al., 1999), porém, outro estudo não

registrou nenhuma mudança na concentração da mesma citocina (SUZUKI et

al., 2000).

A morte celular programada ou apoptose é um importante mecanismo

para regulação da resposta imune e pode ser induzida pelo exercício físico

(GRANVILLE et al., 1998; OPFERMAN e KORSMEYER, 2003). A corrida de

alta intensidade em esteira foi associada com a expressão de proteínas pró-

apoptóticas (caspase-3 e citocromo citosólica-c) e a redução na expressão da

proteína anti-apoptótica Bcl-2 em linfócitos intestinais c, quando comparado a

um grupo controle não exercitado (QUADRILATERO e HOFFMAN-GOETZ,

2005).

Considerando as alterações imunes apresentadas, o objetivo geral deste

trabalho foi analisar o efeito do exercício físico (natação) em diferentes

intensidades e volumes sobre o sistema imune, mais especificamente sobre

20

número e funcionalidade de linfócitos, bem como a concentração de citocinas

circulantes em ratos.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 - Sistema Imunológico

O sistema imunológico é extremamente complexo, pois envolve vários

órgãos, tecidos, tipos de células e moléculas. As células do sistema imune

sintetizam e reorganizam uma variedade de moléculas, incluindo anticorpos,

proteínas de complemento, fatores de crescimento, citocinas e receptores para

as próprias moléculas. A eficiência das respostas imunológicas depende da

interação entre estas células e as moléculas (KELLEY, 2001).

A proteção do organismo é monitorada por dois tipos de imunidade: a

inata e a adquirida, que agem de maneira cooperativa. A inata (natural) possui

o mesmo mecanismo de defesa contra a maioria dos agentes infecciosos, por

isto é considerada um sistema de baixa especificidade. Epitélios, proteínas

sangüíneas, fagócitos, como os neutrófilos e macrófagos, participam deste

mecanismo de defesa. A imunidade adquirida ou específica, responde de

maneira particular aos vários tipos de antígenos, sendo, portanto especializada.

Este sistema é eficiente principalmente por sua memória, que lhe confere

respostas mais vigorosas aos mesmos agentes. Os linfócitos e os anticorpos

por eles produzidos são responsáveis pela ativação deste mecanismo de

defesa (ABBAS et al., 2003).

Estas respostas imunes são altamente dependentes da habilidade dos

leucócitos em migrarem do sangue para os tecidos periféricos, em locais de

inflamação. A migração, rolamento, ativação e forte adesão dos leucócitos

compreendem o clássico paradigma do recrutamento inflamatório celular

(CAVAGLIERI et al., 2000; PATEL et al., 2000).

Famílias específicas de moléculas de adesão mediam cada passo desta

cascata. A migração e o rolamento são as primeiras reações deste processo, e

são predominantemente mediadas por moléculas de adesão, chamadas

selectinas. Três tipos de selectinas foram identificadas selectina-P, E e L. A

selectina-P (CD62P) é primariamente utilizada para armazenar grânulos nas

plaquetas sangüíneas e células endoteliais, sendo rapidamente translocada

21

(dentro de minutos) para a superfície da membrana celular, através da ativação

celular (ADAMS e SHAW, 1994). A selectina-E (CD62E) também é produzida

nas células endoteliais e é gradualmente expressa (dentro de horas) na

superfície da membrana celular, seguida de estimulação por citocinas. A

selectina-L (CD62L) é constantemente expressa em todos os leucócitos, sendo

importante componente no processo inicial de diapedese da adesão celular

endotelial leucocitária, estando associada com o trânsito e inflamação dos

leucócitos (ADAMS e SHAW, 1994).

Fatores indutores, principalmente quimiotáticos derivados do endotélio,

como a interleucina-8 (IL-8) presente na parede dos vasos, podem ativar

moléculas de adesão leucocitárias, como as integrinas. Estas moléculas são

encontradas em vários tipos de leucócitos e mediam a adesão endotelial das

mesmas (BUNTING et al., 2002). As integrinas-β2 (complexo CD11/CD18) ou

integrinas de leucócitos elevam-se rapidamente depois de ativadas,

promovendo forte junção do leucócito ao endotélio vascular e subseqüente

migração transendotelial (NIELSEN e LYBERG, 2004).

NIESEN e LYBERG (2004) propuseram que a molécula de adesão

intercelular-1 (ICAM-1) e a molécula vascular de adesão celular-1 (VCAM-1),

conhecidos ligantes para as integrinas e exercem papel essencial na adesão

de leucócitos ao endotélio vascular.

A inflamação é um processo de defesa que envolve células sangüíneas e

proteínas de um tecido em resposta a uma injúria, infecção, trauma ou reação

imunológica (KELLEY, 2001). O recrutamento de leucócitos circulantes, para o

início da resposta inflamatória, ocorre devido à influência de citocinas

(KATSUHIKO et al., 2003).

As citocinas são hormônios protéicos mediadores e reguladores de

respostas imunes e inflamatórias, produzidas pelas próprias células de defesa,

durante as fases de ativação da imunidade inata e específica. Citocinas pró-

inflamatórias favorecem a produção de reações inflamatórias, sendo estas as

interleucinas: IL-1, IL-6, IL-8, Fator de Necrose Tumoral-α (TNFα) e aquelas

produzidas por células Th1 (IL-2 e interferon-γ) (KELLY, 2001; PLAYFAIR e

LYDYARD, 1999). As citocinas com ação antiinflamatória favorecem a

produção de imunoglobulina E, e ativação e/ou produção de eosinófilos, neste

grupo temos o receptor antagonista de IL-1 (IL-1ra), o Fator de Crescimento de

22

Transformação-β (TGF-β) e as citocinas produzidas por células Th2 (IL-4, IL-5

e IL-10). Um desequilíbrio entre as citocinas pró e anti-inflamatórias pode

induzir respostas inflamatórias ou de hipersensibilidade (alergias) (KELLY,

2001; PLAYFAIR e LYDYARD, 1999).

Referente à inflamação, foi demonstrado que exposições a agentes

externos (bactérias, traumas e exercício) aumentam as proteínas de choque

térmico extracelulares (eHSP72), que agem como “sinalizadores de perigo”

para o sistema imune, potencializando a resposta do óxido nítrico (NO) contra

bactérias e facilitando a recuperação da inflamação bacteriana (FLESHNER e

CAMPISI, 2003).

As células envolvidas com a inflamação aguda são as polimorfonucleares,

já na inflamação crônica observa-se um aumento de células mononucleares,

como, macrófagos, linfócitos T e plasmócitos. Os primeiros mediadores da

resposta inflamatória são a histamina e a serotonina, provenientes

principalmente, de basófilos, que são responsáveis pela vasodilatação e

aumento da permeabilidade vascular. Os mediadores secundários podem ser,

o ácido araquidônico, as enzimas de neutrófilos, as linfocitocinas (citocinas da

imunidade específica) e as monocitocinas da imunidade inata (ABBAS et al.,

2003).

A capacidade do sistema imunológico de não reagir contra seus próprios

antígenos é conhecida como tolerância. O organismo deve ser auto tolerante,

reconhecendo e respondendo apenas aos antígenos estranhos ao corpo. A

resposta do sistema imunológico à estimulação antigênica é conhecida como

auto-imunidade, que pode desencadear as doenças auto-imunes (ABBAS et

al., 2003).

Linfócitos, macrófagos e neutrófilos desempenham um papel central na

resposta imunitária e inflamatória. Linfócitos são células circulantes, têm sua

origem nos tecidos linfóides primários (timo e medula óssea), podendo migrar

para os órgãos linfóides secundários (baço, linfonodos e placas de Peyer).

Estas células encontram-se em estado quiescente até serem estimuladas a

proliferar, por exemplo, durante uma infecção por vírus ou bactérias (STITES et

al., 2000).

Os linfócitos podem ser divididos em duas classes, linfócitos T e linfócitos

B. Estas células se originam na medula óssea, porém as células T

23

amadurecem no timo, enquanto que os linfócitos B amadurecem no mesmo

local de origem. Após o período de maturação, estas células, junto com células

acessórias do sistema imune, se dirigem para tecidos linfóides periféricos

espalhados por todo o organismo. Além de diferentes locais de

amadurecimento, estas células também diferem em suas funções. Os linfócitos

B são responsáveis pela imunidade humoral, mediada por anticorpos por eles

produzidos, que atingem antígenos extracelulares e suas toxinas. Os linfócitos

T conferem a imunidade celular (microorganismos intracelulares), não

produzem anticorpos, mas secretam citocinas e apresentam capacidade de

lisar células que apresentam antígenos estranhos (ABBAS et al., 2003; STITES

et al., 2000).

As células T expressam diferentes proteínas de membrana, as quais são

responsáveis por sua caracterização. Estas células são classificadas a partir de

procedimentos experimentais, onde em cultura, observa-se a formação de

grupos celulares que apresentam a mesma origem e, portanto, as mesmas

características morfofuncionais. Desta forma, as células T são denominadas

pela sigla CD (Grupo de diferenciação), termo que corresponde aos

agrupamentos observados em cultura. Esta sigla é acrescida de um número

que corresponde ao tipo de proteína. Assim, os linfócitos T são divididos em

duas classes, que expressam em suas membranas diferentes proteínas. As

células T auxiliares apresentam a proteína CD4 expressa, estas células

estimulam o crescimento e a diferenciação de células B e ainda ativam

macrófagos através das citocinas secretadas. A outra classe de linfócitos é

conhecida como linfócitos T citotóxicos (LTCs), estes participam da lise de

células infectadas por vírus e células tumorais, e também ativam macrófagos

pela liberação de citocinas. Os LTCs expressam em suas membranas a

proteína CD8. A maioria dos tecidos possui a proporção de CD4 e CD8 de 2:1

(ABBAS et al., 2003; STITES et al., 2000).

Na década de 80, o grupo do Prof. Eric Newsholme determinou que

macrófagos e linfócitos utilizam glutamina em altas taxas como substrato

energético (CURI et al.,1986) e, posteriormente PITHON-CURI et al. (1997)

verificaram que os neutrófilos também utilizam glutamina. A partir destes

estudos, postulou-se que fatores nutricionais poderiam modular a

funcionalidade destas células imunes.

24

2.2 - Efeitos do Exercício Físico sobre o Sistema Imunológico

Estudos realizados in vivo demonstram que a resposta imunitária é

totalmente autônoma. Porém, existe uma nítida interação funcional deste

sistema com o sistema neuroendócrino, que modula a resposta imunitária

frente ao estresse fisiológico, psicológico ou patológico (FLESHNER, 2000;

JONSDOTTIR, 2000). Foi verificado que à prática regular de exercício físico

está associada à redução de alguns tipos de câncer, principalmente o de cólon

e o de mama (DE CARO et al., 2006; GALVÃO e NEWTON, 2005; HARDMAN,

2001; HAYDON et al., 2006; McTIERNAN et al., 1998). Um dos possíveis

mecanismos para esta relação é o fato de que, o exercício físico altera a

concentração e a sensibilidade de alguns hormônios, como por exemplo: a

insulina e o estradiol (YU et al., 2002). Outro possível mecanismo seria a

modulação na funcionalidade do sistema imunitário. HOFFMAN-GOETZ (1999)

observou que o estradiol induziu a diminuição da proliferação de linfócitos T e B

em camundongos fêmeas, sendo que este efeito foi mascarado quando os

animais foram submetidos também ao exercício físico. No entanto, HAYES et

al. (2003) indicaram que apesar das pesquisas demonstrarem que um

programa adequado de exercícios pode induzir efeitos imunomodulatórios

positivos em indivíduos saudáveis, até o momento, não está totalmente

esclarecido o papel do exercício na recuperação da resposta imune, depois de

tratamento quimioterápico contra o câncer.

O exercício físico é caracterizado pelo nosso organismo como estímulo

estressante, e este produz uma descarga simpática e de corticosteróides por

meio do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal. Os estímulos estressantes atuam por

intermédio de neurônios aferentes ou diretamente sobre o hipotálamo,

promovendo a secreção do Fator de Liberação de Corticotropina (CRF) e

conseqüentemente a liberação de corticotropina (ACTH) pela hipófise.

SHEPARD et al. (2000) observaram que a expressão das moléculas de adesão

de vários subtipos de leucócitos, incluindo as seletinas, integrinas e membros

das imunoglobulinas, foi alterada pelo exercício agudo e crônico,

provavelmente devido à ação da adrenalina liberada no exercício.

25

A liberação de catecolaminas predomina principalmente, nos primeiros

minutos de exercício, conseqüentemente contribuindo para a elevação dos

linfócitos circulantes (ARLT e HEWISON, 2004; RONSEN et al., 2004). As

concentrações plasmáticas de adrenalina e noradrenalina aumentam quase

que linearmente com a duração do exercício dinâmico e exponencialmente com

a intensidade (SUGIURA et al., 2002). A expressão de receptores beta

adrenérgicos (β-adrenérgicos) nas células T, B, NK, macrófagos e neutrófilos

fornecem base molecular para que estas sejam células-alvo para sinalização

das catecolaminas (NAGAO et al., 2000). Existe uma relação entre número de

receptores adrenérgicos nas subpopulações de linfócitos e sua resposta ao

exercício (WEISE et al, 2004). Os receptores β-adrenérgicos presentes nos

linfócitos estão ligados intracelularmente ao sistema adelinato ciclase, para

geração de adenosina monofosfato cíclico (AMPc), como segundo mensageiro,

atuando no processo de ativação e diferenciação desta célula imune (WIGAL et

al., 2003).

O número de receptores β-adrenérgicos nas células NK aumenta durante

o exercício, sendo que, quando administrado β-bloqueadores adrenérgicos,

este efeito é inibido (PEDERSEN e TOFT, 2000). A adrenalina também

contribui para o recrutamento de células NK, a partir das paredes endoteliais

para a circulação geral, linfonodos, baço e intestino (PEDERSEN e

STEENSBERG, 2002). Dentre os subtipos de linfócitos, as células NK possuem

o maior número de receptores β-adrenérgicos, os linfócitos B e citotóxicos

número intermediário e os linfócitos T auxiliares, o menor número.

(PEDERSEN e STEENSBERG, 2002).

Os corticosteróides podem suprimir várias reações inflamatórias e

imunitárias. Em camundongos, ratos e coelhos, os glicocorticóides provocam

extensa destruição linfóide. Por outro lado, os linfócitos de cobaias, macacos e

seres humanos mostram-se altamente resistentes a lise induzida por esteróides

(JONSDOTTIR, 2000). Os efeitos antiinflamatórios e imunossupressores dos

corticosteróides podem ser decorrentes de suas ações sobre o trânsito celular

e funcionalidade dos leucócitos (STITES et al., 2000). De fato, a infusão de

corticosteróides intravenosa em humanos, causa redução no número de

linfócitos, monócitos e aumento no número de neutrófilos que alcançam seus

valores máximos 4 horas após a administração (PEDERSEN e HOFFMAN-

26

GOETZ, 2000). Em doses suprafisiológicas, os corticosteróides induzem a

morte celular de linfócitos T e B imaturos (SAPOLSKY et al., 2000).

A incubação de timócitos e esplenócitos com corticosteróides, na

presença de concentrações próximas aquelas observadas em exercícios

máximos, induz a apoptose destas células (HOFFMAN-GOETZ e

ZAJCHOWSKI, 1999). A apoptose induzida pelo exercício pode contribuir para

o quadro de linfopenia e redução da resposta imune depois do exercício

intenso (RONSEN et al., 2001a; 2004). A concentração de cortisol aumenta em

resposta ao exercício intenso e principalmente no de longa duração

(BUTCHER et al., 2005; DAVIS et al., 2000; DIMITRIOU et al., 2002; WEISE et

al., 2004). Esta elevação pode promover a entrada de neutrófilos provenientes

da medula óssea para a circulação, enquanto inibe a entrada de linfócitos,

facilitando seu regresso para outros tecidos periféricos (BUTCHER et al.,

2005). Desta forma, o cortisol que poderá permanecer elevado até 1,5 hora

após os exercícios de endurance, promove redução no número de linfócitos

circulantes (KANALEY et al., 2001).

Adicionalmente, o cortisol reduz os receptores de IL-1 e IL-2 nas células

T. A conseqüência imediata destas ações é a redução da atividade e

capacidade proliferativa das células NK e B (RONSEN et al., 2001a; 2004). A

longo prazo, elevações crônicas de cortisol podem aumentar a razão

catabólica, modificando as reservas de aminoácidos disponíveis para o

crescimento e proliferação de linfócitos (ARLT e HEWISON, 2004; RONSEN et

al., 2004).

Estudos observaram que, exercícios físicos intensos e de curta duração

elevaram o número total de leucócitos no sangue numa relação diretamente

proporcional à intensidade do exercício, sendo que, este aumento ocorre

principalmente na série granulocítica e em especial nos poliformonucleares

(BENONI et al., 1995; HOST et al., 1995). O número de monócitos e de

linfócitos também aumenta, mas em menor escala (HOST et al., 1995;

MOOREN et al., 2004; NIEMAN, 1994b). Dentre a subpopulação de linfócitos,

as células “Destruidoras Naturais” (NK) são as que mais aumentam (TIMMONS

et al., 2006). Um dos mecanismos propostos para explicar esta linfocitose

passageira, pode ser em decorrência dos efeitos da adrenalina induzida pelo

exercício (ORTEGA et al., 2003). O número de linfócitos começa a diminuir

27

cinco minutos após o término do exercício, provavelmente devido ao efeito

persistente do cortisol liberado durante o mesmo, diferentemente da adrenalina

que decresce logo após o fim do exercício físico (HOST et al., 1995). Em geral,

quatro a seis horas depois de encerrado o exercício físico e, com certeza após

24 horas de repouso, o número de linfócitos circulantes retorna aos valores

basais (MEYER et al., 2004). Com relação à função dos demais linfócitos, foi

observado também que o cortisol pode reduzir a capacidade mitogênica, nas

primeiras horas após o término do exercício físico (HOST et al., 1995; MALM,

2004).

Foi verificado um aumento médio de 3.5 vezes no número de monócitos

CD14+ CD16+, mesmo num curtíssimo período de exercício (1 minuto). Em

condições de repouso, a maioria (>75%) dos monócitos CD14+ CD16+ ficam

aderidos à parede endotelial dos vasos sangüíneos, e não no sangue

periférico. A rápida mobilização destas células a partir das paredes endoteliais,

em condições de estresse, deve servir para fornecer uma grande população

ativa de células para defesa em locais de lesão e infecção (STEPPICH et al.,

2000).

Em outro estudo, com maior volume de exercício, 10 homens fisicamente

ativos de idade entre 18-25 anos realizaram duas sessões de endurance de 20

minutos cada (5 min a 50% do VO2max e 15 min a 70% VO2max) no mesmo

dia, separadas por quatro horas de descanso, observou-se aumento no número

total de leucócitos circulantes, neutrófilos e contagem de linfócitos, com pouco

efeito sobre a atividade da célula NK. As alterações no sistema imune frente a

duas sessões de endurance foram mais pronunciadas, quando comparadas a

uma única sessão (MACFARLIN et al., 2003).

Recentemente, NIEMAN et al. (2005) analisaram o efeito da caminhada

de 30 minutos sobre a resposta imune. Esta atividade é executada em grande

escala pela população, com objetivos de melhorar a aptidão física e saúde.

Neste estudo, foram avaliadas 17 mulheres com idades entre 25 e 55 anos,

saudáveis que realizavam caminhadas a pelo menos 3 meses anteriores ao

experimento, com uma freqüência de 2-7 dias por semana. Verificou-se que

esta atividade realizada na intensidade de 60%-65% do VO2max foi associada

com modestas e temporárias alterações na contagem de leucócitos

(especialmente neutrófilos e células NK), proliferação de linfócitos induzida pela

28

fitoemaglutinina (PHA), e concentração plasmática de IL-6. Nenhuma mudança

na concentração plasmática de cortisol, produção de IgA salivar, ou

concentração plasmática de IL-1ra foi observada (NIEMAN et al., 2005).

Os efeitos citados acima contrastam com a maioria das alterações

registradas após exercício intenso e prolongado, como uma maratona

(NIEMAN et al., 2001). Estes dados foram observados em praticantes regulares

de exercício físico, sendo assim, devemos ter cautela ao extrapolar estes

efeitos e aplicá-los a indivíduos sedentários.

Em animais experimentais, DAVIS et al. (2004) verificaram que 1 hora de

exercício moderado, durante 6 dias, melhorou a competência da resposta de

macrófagos ao vírus da herpes tipo 1. Adicionalmente, observaram redução na

susceptibilidade à ITRSs. No entanto, mais estudos devem ser realizados para

estabelecer uma relação entre mudanças imunes agudas e melhora da

resistência imunológica.

Nesta linha de pensamento, outro estudo com ratos, demonstrou que a

corrida de alta intensidade em esteira está associada com aumento na

expressão de proteínas pró-apoptóticas (caspase-3 e citocromo citosólica-c) e

redução na expressão da proteína anti-apoptótica Bcl-2 em linfócitos intestinais

c, quando comparados ao grupo controle não exercitado. Adicionalmente,

devido ao fato de a Bcl-2 e a citocromo c serem proteínas específicas de

mitocôndria, foi sugerido que a apoptose de linfócitos intestinais durante o

exercício, pode ser desencadeada por um mecanismo oxidativo-dependente

através de uma via mitocondrial (apoptótica intrínseca) (QUADRILATERO e

HOFFMAN-GOETZ, 2005).

No caso do treinamento de força, característico de ações excêntricas, a

proteólise muscular pode estar aumentada. Neste sentido, WILLOUGHBY et al.

(2003) concluíram que uma única sessão deste tipo de exercício em indivíduos

destreinados, é efetiva no aumento da atividade da protease caspase-3

apoptótica e de suas vias proteolíticas relacionadas, associadas com lesão

muscular e força muscular reduzida. Isso indica que o exercício excêntrico

pode induzir apoptose no músculo esquelético através do aumento da atividade

da caspase-3.

Muitos dos eventos fisiológicos atribuídos a apoptose celular podem

ocorrer após exercícios prolongados e/ou intensos (GRANVILLE et al., 1998;

29

OPFERMAN e KORSMEYER, 2003). Mudanças nas características

bioquímicas e moleculares da apoptose como: níveis aumentados de caspase

3 (PATEL e HOFFMAN-GOETZ, 2002), aumento do receptor Fas (receptor de

morte celular) (MOOREN et al., 2002), liberação de Ca2+ (AZENABOR e

HOFFMAN-GOETZ, 2000), externalização de fosfatidilserina (HOFFMAN-

GOETZ e QUADRILATERO, 2003), despolarização da membrana mitocondrial

(HSU et al., 2002), expressão dos genes específicos de apoptose como Bax,

Bcl-xs, e Bcl-xL, condensação de cromatina (KUMAZAKI et al., 2002), e

fragmentação de DNA (LIN et al., 1999) foram observadas em leucócitos de

humanos e ratos depois de exercício extenuante. A apoptose e necrose foi

observada em linfócitos depois de exercício intenso agudo aeróbio

(HOFFMAN-GOETZ e DUERRSTEIN, 2004).

Contudo, admite-se que exercícios muito intensos são capazes de

danificar uma quantidade de tecido muscular suficiente para desencadear uma

resposta inflamatória aguda, que segundo ORTEGA et al. (2003) envolve

reações complexas moduladas pelo sistema imunitário através da liberação de

citocinas.

As citocinas são glicoproteínas, produzidas por diferentes tipos de células

do sistema imunitário que tem como função principal mediar a comunicação

entre as células do sistema imunitário e as de outros tecidos (MOLDOVEANU

et al., 2001). As citocinas inflamatórias são moduladas por vários estímulos,

incluindo o exercício físico, trauma e infecção. Este tipo de atividade afeta a

produção sistêmica de citocinas, principalmente o Fator de Necrose Tumoral

alfa (TNF-α) (MOLDOVEANU et al., 2000; RIVIER et al., 1994), além das

interleucinas-1 beta (IL-1β) (MOLDOVEANU et al., 2000), IL-6 (JANKORD e

JEMIOLO, 2004; MOLDOVEANU et al., 2000; OSTROWSKI et al, 2000),

interferons e outras citocinas (GARCIA et al., 1999; NEMET et al., 2004;

RIVIER et al., 1994).

Vários mecanismos foram propostos na tentativa de explicar a

suscetibilidade de atletas de endurance à infecções respiratórias (NIEMAN,

1994b). Foi observada uma relação direta entre o aumento da concentração

plasmática de IL-6, exercícios extenuantes e aumento de sepsis e infecções

respiratórias (OSTROWSKI et al., 2000; TOTH et al., 2006; XING et al., 1998;

YENDE et al., 2006). A IL-6 é uma citocina pró-inflamatória chave na fase

30

aguda da resposta inflamatória. É produzida por diferentes tipos de células, as

quais são originalmente estimuladas pelos monócitos. Foi verificada uma

ligação entre sua concentração plasmática e a intensidade da corrida

(OSTROWSKI et al., 2000), o que poderíamos hipoteticamente relacionar com

o aumento proporcional de lesão muscular.

A redução na concentração plasmática de glutamina pode também estar

associada como um possível fator causal da supressão imunológica (CURI,

2000; KEAST et al., 1995; NEWSHOLME et al., 1987; 1988; 1989; 1997;

PARRY-BILLINGS et al., 1990; ROWBOTTOM et al., 1996). No caso de

ciclistas, a relação glutamina/glutamato provou ser um importante indicativo de

treinamento excessivo, que se caracteriza por um período de queda na

capacidade de performance e a recuperação pode levar de alguns dias a várias

semanas. Apesar de não terem sido detectadas mudanças estatisticamente

significativas nas células do sistema imune e nas concentrações basais de

citocinas circulantes (IL-6 e TNF-α), os autores não descartaram que este

mecanismo pode estar envolvido no processo de supertreinamento (HALSON

et al., 2003). Ainda, RIETJENS et al. (2005) também registraram que em

ciclistas bem treinados, as mudanças na distribuição dos leucócitos não foram

consistentes, nem sensíveis o bastante para detectar a síndrome do excesso

de treinamento em seus estados iniciais.

Em condições normais, as concentrações plasmáticas de glutamina são

mantidas por um balanço entre a produção e utilização de glutamina por vários

órgãos. Dentre estes, o cérebro, os pulmões, fígado, músculo esquelético e

possivelmente o tecido adiposo liberam glutamina. No entanto, células do

sistema imune, fígado, rins e trato gastrintestinal são utilizadores primários da

mesma. Para determinar se uma célula produz ou consume glutamina analisa-

se a direção de uma única reação reversível, na qual a glutamina é sintetizada

da amônia e glutamato pela glutamina sintetase, e a glutaminase catalisa a

reação reversa para formar amônia e glutamato através da glutamina

(CASTELL, 2003; NEWSHOLME e CALDER, 1997).

Usualmente, sessões de treinamento e competição no ciclismo de rua

demoram várias horas. Está bem estabelecido que o exercício prolongado

pode induzir imunossupressão temporária chamada de “janela aberta”

(NIEMAN, 1999; PEDERSEN e ULLUM, 1994). NIEMAN (1994a) propôs a

31

curva em “J”, que descreve a relação entre intensidade do exercício e

possibilidade de infecção. De acordo com esta hipótese, o exercício moderado

protegerá o indivíduo de infecções, enquanto que, o exercício intenso

aumentará o número de episódios infecciosos num determinado período

(Figura 1).

Porém, nos atletas avaliados para formulação desta curva em “J”, não foi

distinguido a diferença entre carga “alta” e de “elite” para o exercício. Sendo

que, quando atletas de elite são inclusos no modelo, a relação entre carga de

exercício e risco de infecções sugerida deveria ter a forma de “S”, onde as

intensidades consideradas de “elite”, teriam menor possibilidade de induzir a

infecções em relação as intensidades “altas” (Figura 2) (MALM, 2006).

Para melhor visualização e entendimento destas duas propostas,

apresentamos abaixo os dois modelos de relação da carga de exercício e

possibilidade de infecções.

Figura 1. Modelo da curva em “J” da relação entre carga de exercício e

surgimento de infecções (NIEMAN, 1994a).

Sedentário Moderado Alto

Média

Abaixo da Média

Acima da Média

Risco de ITRSs

32

Figura 2. Proposta da curva em “S” que apresenta a relação entre carga de

exercício e surgimento de infecções (MALM, 2006).

Recentemente, SCHARHAG et al. (2005) examinaram as respostas

imunológicas depois do exercício prolongado, em ciclistas bem treinados, sob

condições realísticas de treinamento, numa intensidade de 70% do limiar de

lactato, que correspondeu a 59% do VO2max. Foram observados aumentos de

3-4 vezes na proteína reativa-c e aumento em 10 vezes nas concentrações de

IL-6, indicando uma resposta de fase aguda moderada. Também foi observada

leucocitose típica (aumento em 2 vezes no número de leucócitos circulantes),

principalmente nos neutrófilos (3 vezes em relação aos valores basais),

resultante da IL-6 e cortisol mediados pelo recrutamento a partir da medula

óssea, apesar dos linfócitos não terem sido elevados ao final do exercício, foi

notado observado aumento significativo nas células NK. Este aumento pode

ser atribuído à redução das moléculas de adesão, mediadas pelas

catecolaminas (NAGAO et al., 2000).

Neste mesmo estudo de SCHARHAG et al. (2005), não foram

encontradas diferenças na atividade da célula NK comparando antes e depois

do exercício. A atividade da célula NK pode não ser afetada, mesmo pelo

exercício prolongado, parece que a imunocompetência desta célula,

Alta Elite Moderada Baixa

Carga do exercício

Risco de ITRSs

33

aumentada ou atenuada é mais uma questão de redistribuição numérica. A

capacidade fagocitária de neutrófilos e monócitos não foi afetada pelo

exercício, tendo sido observada apenas pequena redução na capacidade

oxidativa de neutrófilos. Sendo assim, o ciclismo prolongado em intensidade

moderada parece não afetar substancialmente a função de células na primeira

linha de defesa, parecendo ser seguro do ponto de vista imunológico.

Foi sugerido que indivíduos com alta aptidão cardiorrespiratória tem

respostas celulares imunes atenuadas frente ao exercício agudo (20 minutos

de corrida em esteira a 65-70% do VO2pico estimado. Devido ao fato de

indivíduos fisicamente ativos terem apresentado uma menor resposta imune

relacionado a sua aptidão cardiovascular, estes exibiriam respostas imunes

ainda menores a mesma quantidade absoluta de exercício realizada por

indivíduos menos aptos (HONG et al., 2005). Um papel protetor do exercício

contra a imunossupressão induzida pelo estresse foi encontrada em estudos

com animais (FLESHNER et al., 2002; MORASKA e FLESHNER, 2001). O

exercício regular inibiu as reduções no número de células T CD4+ normalmente

observadas depois de exercício exaustivo em ratos (FU et al., 2003).

No entanto, a imunoproteção contra vários estressores em indivíduos

fisicamente ativos permanecem inconclusivos, a demarginação atenuada de

linfócitos em resposta ao stress físico e fisiológico claramente demonstra que a

aptidão física altera a resposta imune em humanos (HONG et al., 2004).

Com a intenção de analisar as associações entre longos períodos de

treinamento, com diferentes intensidades e durações por mais de 10 anos, os

parâmetros imunes celulares e humorais basais em atletas mulheres de meia

idade foram avaliados e comparados com um grupo controle. Neutrófilos,

eosinófilos, basófilos, linfócitos, monócitos e subpopulações de linfócitos, como

total de células T, B, células T CD4+, células T CD8+, e células NK do grupo

com treinamento de alta intensidade e longa duração (atletas de competição) e

do grupo de treinamento moderado (atletas recreacionais) não foram

estatisticamente diferentes do que o grupo controle não exercitado.

Desta maneira, neste estudo não foram obtidos dados para dar suporte a

imunossupressão induzida pelo treinamento de alta intensidade e longa

duração, a não ser pela correlação negativa com células T auxiliares CD4+ e

razão CD4/CD8, sendo considerado um marcador indireto de supressão da

34

imunidade celular. No entanto, foi demonstrada uma correlação positiva entre o

VO2max do grupo exercício moderado com IgG (imunoglobulina G), sendo esta

intensidade considerada benéfica para sistema imune humoral (BUYUKYAZI,

et al., 2004).

Através da análise do impacto de seis semanas de treinamento intenso de

natação em ratos a atividade proliferativa das células T e B foram reduzidas,

sendo que estes são indicativos para imunidade celular e humoral. Concluindo

que o treinamento pesado de longa duração resulta em maior suscetibilidade a

doenças e infecção, podendo ser, em parte, responsável pela síndrome do

sobretreinamento (PEIJIE et al., 2003).

No aspecto das concentrações de imunoglobulina-A salivar (IgA), esta

mostrou correlação inversa com o número de infecções do trato respiratório

superior, o que indica que a mensuração de IgA durante um período de

treinamento ou exercícios, pode predizer imunossupressão (GLEESON e PINE,

2000). PUTLUR et al. (2004), registraram concentrações reduzidas de IgA

salivar em jogadoras de futebol universitárias, no curso de 9 semanas de uma

temporada competitiva quando comparadas ao grupo controle, sendo que, a

freqüência de lesões e doenças também foi superior neste grupo.

Citocinas e Exercício Físico

Interleucina-2 (IL-2)

A IL-2 exerce efeitos regulatórios na maioria das células corporais,

especialmente células imunes, sendo primariamente produzidas pelos linfócitos

T e linfócitos NK. Esta citocina exerce um importante papel nas respostas

celulares humorais e inflamatórias (JANEWAY e TRAVERS, 1996). O exercício

demonstrou suprimir a função dos linfócitos T e NK, possivelmente assim,

comprometendo a produção de citocinas a partir destas células (STARKIE et

al., 2001c). As ações da IL-2 incluem a estimulação da proliferação e

diferenciação de células B e T, elevação da citotoxidade de linfócitos tanto

pelas células NK como pelas células citotóxicas, ativação de

35

monócitos/macrófagos, e a liberação de outras citocinas como TNF-α e IFNΎ

(STEENSBERG et al., 2001b).

A concentração plasmática de IL-2 pode exibir padrão complexo de

mudança em resposta ao exercício. Por exemplo, em corredores treinados, a

concentração plasmática de IL-2, mensurada por radioimunoensaio, reduziu

50% imediatamente depois uma prova de 5 Km, retornando aos valores basais

em torno de 2 horas depois do exercício, e então aumentou cerca de 50% 24

horas depois da prova (ESPERSEN et al., 1990). A demanda imposta pelo

exercício e a resultante redução na atividade de células NK durante a

recuperação estão relacionadas a uma redução na expressão dos receptores

de membrana de IL-2 em células NK (McFARLIN et al., 2004). Desta maneira,

o exercício de endurance de alta intensidade demonstrou causar uma

significativa redução no número de células T (IBFELT et al., 2002).

Foi sugerido que a redução transitória na concentração de IL-2

imediatamente depois do exercício pode refletir um concomitante aumento no

número de linfócitos ativados que expressam o receptor de IL-2, sendo que,

mais células com mais receptores removeriam rapidamente a IL-2 da

circulação. Este conceito é sustentado por duas observações: 1) alta elevação

no número de células NK CD16+ imediatamente depois do exercício, estas

células exibem maior densidade de receptores de IL-2 entre todos os linfócitos

(SHEK et al., 1995); e 2) rápido aumento na presença do receptor de IL-2 na

urina 1 hora depois de corrida de distância (SPRENGER et al., 1992).

Em contraste, a IL-2, mensurada por ELISA, não foi detectável no

plasma 24 horas depois de 20 Km de corrida, ou até 2 dias depois de 2 horas

de ciclismo a 70-75% do VO2max em ciclistas treinados (MACKINNON, 1999),

nem 5 dias depois contrações excêntricas máximas dos extensores do cotovelo

(NOSAKA e CLARKSON, 1996).

A produção de IL-2 foi reduzida em células do baço quando comparados

ratos exercitados (corrida extenuante aguda em esteira em velocidades

gradualmente maiores até fadiga voluntária) com grupo controle 2 dias depois

do exercício. As células do baço dos animais controle, em cultura, produziram

significativamente mais IL-2 do que as células dos animais exercitados. Em

períodos posteriores da cultura celular, não houve mais nenhuma diferença na

produção de IL-2. Estas alterações na cinética da IL-2 e outras citocinas (IL-6,

36

IL-12 e TNF-α) podem estar associadas ao aparecimento de infecções

oportunistas devido a imunossupressão transitória observada, no entanto, mais

estudos são necessários para esclarecer e confirmar os mecanismos

fisiológicos destes fatos (KOHUT et al., 2001).

Interleucina-6 (IL-6)

A interleucina-6 (IL-6) é uma molécula de sinalização intercelular

tradicionalmente associada com o controle e coordenação de respostas

imunes, esta é primeiramente secretada pelos macrófagos e linfócitos em

resposta a lesão ou infecção (PEDERSEN e TOFT, 2000). Com relação ao

músculo esquelético, a elevação de citocinas proinflamatórias como a IL-6 está

inserida no contexto de impactos deletérios, geralmente associada como

conseqüência de lesão no tecido muscular induzida por atividades de alta

intensidade ou ações excêntricas (KELLER, et al., 2001). No entanto, a

produção da IL-6 durante o exercício pode estar presente mesmo na ausência

de lesão muscular induzida pelo exercício (STARKIE et al., 2001b).

Quando os conteúdos de glicogênio estiverem comprometidos, pode

ocorrer crise energética no músculo em contração, afetando tanto o

metabolismo dos carboidratos como o lipídico, se o período de recuperação

entre as sessões de exercício for pequeno e a intensidade do trabalho elevada

(STICH et al., 2000). Por exemplo, existem observações de que esta citocina

direta ou indiretamente media efeitos catabólicos sobre o músculo esquelético

(GRIMBLE, 2003).

HADDAD et al., (2005) realizaram a infusão de IL-6 no músculo

esquelético in vivo em ratas. A dose foi determinada a partir de uma recente

observação que analisou a concentração de IL-6 encontrada depois de

exercício extenuante em humanos, que foi de 22 ng/l (STEENSBERG et al.,

2001a). Neste caso, devido à ausência dos efeitos sistêmicos (infusão direta no

músculo) foi detectada significativa atrofia muscular em ratas saudáveis. As

mudanças moleculares e celulares observadas nos músculos com infusão de

IL-6 sugerem que, mecanismos de retro alimentação negativa, via supressores

da sinalização de citocinas (SOCS) foram ativados, alterando o balanço da

fosforilação de proteínas sinalizadoras da via de transdução para ativação de

37

transcrição gênica (STATs), em favor de um perfil mais catabólico (HADDAD et

al., 2005).

Similarmente o seu papel no sistema imune, a liberação de IL-6 induzida

pelo exercício assumidamente regula componentes da fase de resposta aguda,

incluindo fase aguda de síntese proteica pelo fígado e liberação de

glicocorticóides via estimulação do eixo hipotalâmico-hipofisário-adrenal

(PEDERSEN et al, 2001b). Em outro contexto, a IL-6 parece estar relacionada

ao crescimento deficiente em crianças sob vários estados de doença

(BENEDETTI, et al., 1997) e ao processo de sarcopenia (redução do número

de sarcômeros em série) em idosos (BARBIERI et al., 2003).

Concentrações elevadas de IL-6 foram registradas imediatamente após

uma maratona e também em resposta ao exercício físico (PEDERSEN e

HOFFMAN-GOETZ, 2000; STEENSBERG et al., 2002). Em relação a

exercícios de características concêntricas e excêntricas, a IL-6 é produzida em

maiores quantidades do que qualquer outra citocina (PEDERSEN et al.,

2001a).

Em conseqüência de duas sessões prolongadas de ciclismo realizadas

por 9 atletas de endurance bem treinados, pode-se observar que uma segunda

sessão de alta intensidade no mesmo dia foi associada com aumentos mais

pronunciados na IL-6 e IL-1ra comparado com uma única sessão de exercício

similar. No entanto, uma tendência de atenuação na resposta aumentada

destas citocinas foi observada quando o período de intervalo entre as duas

sessões de exercício foi entendido de 3 para 6h e uma refeição adicional foi

fornecida (RONSEN et al., 2002). Os autores argumentaram que estas

respostas aumentadas frente ao exercício podem estar ligadas à depleção de

glicogênio muscular e aumentada mobilização de substrato por outros tecidos.

SUZUKI et al. (2003), demonstraram que uma maratona de 42.195-Km

induziu a liberação sistêmica de IL-6 e IL-8, sendo que estas citocinas mediam

o recrutamento e à ativação de neutrófilos e monócitos. No caso de garotas de

14-16 anos de idade, a pratica de uma sessão de pólo aquático resultou em

significativos aumentos nas concentrações circulantes de IL-6, mas o efeito

destas mudanças em resposta ao exercício sobre o processo de crescimento e

desenvolvimento em adolescentes ainda precisa ser mais bem estudado

(NEMET et al., 2003).

38

Foi sugerido que as elevações na IL-6 em resposta ao exercício podem

exercer um papel antiinflamatório, principalmente pela inibição na produção de

TNF-α, uma citocina tipicamente proinflamatória (PEDERSEN et al., 2003a).

Este mecanismo ocorre à medida que a de IL-6 estimula a produção de IL-1ra,

que se liga e bloqueia o receptor da IL-1β, exercendo assim, potentes efeitos

antiinflamatórios (HORN et al., 2000). Com o exercício, o pico de IL-1ra foi

encontrado 1-2h depois do pico de IL-6, sendo assumido que as concentrações

de IL-1ra refletem a produção de IL-6 (OSTROWSKI et al., 1999).

Adicionalmente, a IL-6 mostrou ter participação no controle de vias metabólicas

durante o exercício (PEDERSEN et al., 2003b).

Apesar de inconclusivo, existem evidências que a IL-6 pode afetar o

metabolismo lipídico, sendo que, a infusão de IL-6 em ratos aumentou as

concentrações de ácidos graxos e triacilgliceróis de uma forma dose

dependente. A hipertrialcilglicerídemia foi causada pela secreção renal

aumentada da mesma e liberação não reduzida (NONOGAKI et al., 1995).

Contudo, ratos deficientes em IL-6 desenvolveram obesidade antecipadamente

e quando foram tratados com IL-6 durante 18 dias, houve uma redução

significativa no peso corporal destes animais (WALLENIUS et al., 2002).

Neste aspecto, a eficácia da IL-6 foi testada como fator lipolítico em

mulheres ativas saudáveis. Os resultados encontrados foram que a infusão de

IL-6 aumentou a lipólise na ausência de hipertrialcilglicerídemia, mudanças nas

catecolaminas, glucagon, ou insulina, sem causar efeitos colaterais. Assim,

esta citocina é uma importante moduladora do metabolismo lipídico em

humanos, devido ao aumento na oxidação de gorduras e reesterificação de

ácidos graxos (GERRIT et al., 2003).

Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-αααα)

O Fator de Necrose Tumoral (TNF-α) está inserido no grupo de citocinas

proinflamatórias atuando de maneira significativa na coordenação das

respostas inflamatórias do organismo. Tendo em vista que o exercício físico

pode romper a homeostasia celular, não é surpreendente que este possa

elevar as concentrações plasmáticas de várias citocinas. O TNF-α induz

39

efetivamente respostas inflamatórias locais e auxilia no controle de infecções.

No entanto, a produção sistêmica de TNF-α pode levar a sepsi, choque, e

morte (GOEBEL et al., 2000).

Sessões de exercício que induzem lesão de células musculares e altas

sobrecargas metabólicas causam uma liberação seqüencial de TNF-α e outras

citocinas tipicamente proinflamatórias (IL-1β e IL-6), o TNF-α por sua vez

estimula a produção de IL-6, que induz a fase de resposta aguda e a produção

de IL-1ra. (HENSON et al., 2000). As citocinas inflamatórias auxiliam na rápida

regulação da migração de neutrófilos e, posteriormente monócitos para áreas

de células musculares lesadas a outros tecidos metabolicamente ativos para

iniciar reparo (NIEMAN et al., 2001).

O exercício de endurance associado com microlesão muscular induz a

maiores respostas inflamatórias destas citocinas do que ciclismo, tênis,

patinação, que são concêntricos ou intermitentes em intensidade (NIEMAN et

al., 2000). Em adultos, foram demonstrados aumentos significativos no TNF-α

circulante em resposta ao exercício extenuante (OSTROWSKI et al., 1999),

porém, outro estudo não registrou nenhuma mudança na mesma citocina

(SUZUKI et al., 2000). No entanto, RHIND et al. (2001), mostraram que a

exposição prolongada ao frio (mesmo com a manutenção da temperatura

corporal normal) reduz a expressão intracelular de TNF-α e induz a redução

das concentrações séricas desta citocina depois do exercício.

Além disso, a grande quantidade de pesquisas examinando os efeitos

imunológicos das elevações no TNF-α, recentes estudos tem centrado sobre os

feitos metabólicos desta citocina. Esta mostrou ser expressa no músculo

esquelético humano (SAGHIZADEH et al., 1996; STARKIE et al., 2001a),

estando associado também com a resistência à insulina e a diabetes tipo 2

(KERN et al., 2001). Possivelmente, o músculo esquelético pode estar

associado aos aumentos do TNF-α (STEENSBERG et al., 2002). Apesar de

altas concentrações do RNAm de TNF-α terem sido demonstradas no tecido

muscular em pacientes com resistência a insulina, está menos claro se existe

uma relação causal entre insulina e TNF-α (KROGH-MADSEN et al., 2004).

40

3 - Objetivos da pesquisa

3.1 - Objetivo Geral

Investigar o efeito de exercícios físicos nas intensidades leve e moderada,

sobre o número e funcionalidade de linfócitos e, concentração de citocinas

circulantes em ratos, usando como modelo de exercício a natação.

3.2 - Objetivos Específicos

Avaliar os efeitos do exercício físico leve e moderado sobre:

1) Número total de leucócitos circulantes;

2) Leucograma diferencial (percentual de monócitos, neutrófilos e linfócitos

circulantes);

3) O número de linfócitos teciduais originários dos linfonodos mesentéricos;

4) O número de linfócitos circulantes;

5) A concentração sérica de Interleucina-2 (IL-2), Interleucina-6 (IL-6) e Fator

de Necrose Tumoral-α (TNF-α);

6) Funcionalidade de linfócitos circulantes (viabilidade, potencial

transmembrânico mitocondrial e fragmentação de DNA).

41

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 - Animais

Procedência e manutenção

Ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var, albinus, Rodentia,

Mamalia), com 2 meses de idade, que foram obtidos do biotério Central da

Universidade Metodista de Piracicaba. Todo o experimento foi conduzido de

acordo com a política para pesquisas com animais experimentais do American

College of Sports Medicine.

Os animais receberam água e alimentação ad libitum e foram mantidos

em ambiente com temperatura constante de 23°C ± 2°C e ciclo claro/escuro de

12/12 horas, com luz acesa a partir das 6 horas, e mantidos em gaiolas

coletivas (5 animais por gaiola). Antes de iniciar o período experimental, os

animais permaneceram por 48 horas em adaptação às condições do biotério de

pesquisa.

4.2 - Grupos experimentais

Os animais foram divididos em 3 grupos: a) grupo controle – animal

sedentário; b) grupo com atividade física aguda - animal submetido à natação

durante 5, 15 minutos ou até a exaustão; c) grupo exercitado por 5 sessões.

4.3 - Grupo Controle

Composto por animais sedentários, não tendo nenhuma participação nos

protocolos de exercício físico (n-6), sendo identificados com o código (C).

42

4.4 - Grupos Submetidos a uma (1) sessão de Exercício Físico

Composto por animais sedentários, que realizaram uma única sessão de

exercício físico, com duração de 5, 15 minutos ou exaustão (n-6), tanto na

intensidade leve como na intensidade moderada.

Os animais que se exercitaram na intensidade leve foram

respectivamente identificados com os códigos (5L), (15L) e (EXL), e os animais

que se exercitaram na intensidade moderada foram identificados

respectivamente como (5M), (15M) e (EXM).

4.5 - Grupo Exercitado durante cinco (5) sessões

Composto por animais sedentários, que foram submetidos a 5 sessões

de natação, tanto na intensidade leve, como na intensidade moderada. Os

animais realizaram 5 sessões (1 por dia / durante 5 dias), sendo que as

sessões seguiram uma ordem crescente no aumento do volume (5, 15, 30, 45

e 60 minutos).

Os animais que realizaram 5 sessões de exercício em intensidade leve

foram identificados com o código (5SL) sendo que, os animais que realizaram a

5 sessões em intensidade moderada foram identificados com o código (5SM).

Com exceção da dosagem sérica de citocinas circulantes onde utilizamos n=3

animais, em todas as outras dosagens descritas foi utilizado n=6 animais para

cada grupo experimental.

43

4.6 - Exercício Físico

Para realização do exercício na intensidade moderada, cargas adicionais

com 5% do peso corporal dos animais foram acopladas em suas regiões

dorsais, o que corresponde a uma intensidade abaixo do limiar anaeróbio

(GOBATTO et al., 2001; VOLTARELLI et al., 2002), sendo que, no exercício de

intensidade leve não se fez uso de cargas adicionais.

Todos os protocolos foram realizados no período da tarde, entre 14 e 17

horas. Os animais dos grupos experimentais foram submetidos separadamente

ao exercício físico e sacrificados de 3 a 4 minutos após o final das sessões de

exercício estipuladas, para análise das variáveis sanguíneas e teciduais. O

sangue foi previamente armazenado em tubo de vidro com EDTA (100 µl para

3,5 ml de sangue), e mantido em gelo para análise da leucometria e

leucograma diferencial. Todas as coletas sangüíneas e teciduais foram

realizadas no mesmo período do dia (entre 14 e 17 horas), incluindo o grupo

controle, submetendo todos os animais à mesma influência do ritmo circadiano

hormonal, minimizando desta maneira, possíveis alterações fisiológicas

decorrentes de coletas realizadas em momentos diferentes do dia, que

poderiam alterar nossos resultados.

4.7 - Descrição Metodológica dos Parâmetros Analisados

4.7.1 - Leucometria

O protocolo para a determinação da leucometria foi realizado através

das seguintes etapas: Os animais foram sacrificados após o exercício físico de

natação ou sem exercício (grupo controle); O sangue foi colhido em tubo de

vidro que continha EDTA - anticoagulante para hematologia (100 µl para 3,5 ml

de sangue); Uma alíquota de 10 µL do sangue foi retirada, colocada em um

tubo de plástico e acrescentado 190 µL do corante TURKEY (Sigma, St. Louis,

MO, USA); Com pipeta o tubo foi homogeneizado; Foi preenchida a câmara de

Neubauer, e feita à contagem total dos leucócitos no microscópio (Cálculo:

número encontrado na soma dos 4 quadrantes ÷ 4 (número de quadrantes) x

44

20 (diluição) = número x 104); Observação: Os resultados foram expressos x

106. Esta metodologia foi realizada acompanhando as especificações propostas

por DORNFEST et al. (1986) e GADEBERG et al. (1979).

4.7.2 - Leucograma Diferencial - % de Linfócitos Circulantes

Os animais foram sacrificados após o exercício físico de natação ou sem

exercício (grupo controle); O sangue foi colhido em tubo de vidro que continha

EDTA - anticoagulante para hematologia (100 µl para 3,5 ml de sangue); O

tubo foi homogeneizado e preparado para fazer o esfregaço; Foi pego uma

lâmina bem limpa e seca (preparada 24h antes), colocado 7,5 µl de sangue

sobre a lâmina e com a lâmina extensora a gota de sangue foi pressionada

com ângulo de 45º em relação à extremidade da lâmina, no qual foi feito o

esfregaço; A arrasto foi procedido em direção à outra ponta da lâmina com

velocidade constante; Foi seca a temperatura ambiente (2 a 3 minutos) sendo

precedida a coloração (Coloração: Foi colocado sobre a lâmina de esfregaço

3ml MAY GRUNWALD e GIEMSA (corantes) (Sigma, St. Louis, MO, USA);

Após 4 minutos, foi colocado 5 ml de água destilada em cima da lâmina e 2

minutos foram esperados; A lâmina foi lavada com água corrente, deixando-a

inclinada para secar em temperatura ambiente); Após a secagem a leitura foi

procedida, em objetiva de imersão com óleo de imersão; A leitura do

leucograma diferencial foi feita no aparelho LEUCOTRON TP; O resultado

expressa o número diferencial dos tipos de leucócitos (neutrófilos, basófilos,

monócitos, eosinófilos e linfócitos); Foi enfatizado o percentual de linfócitos

circulantes seguindo as descrições de DORNFEST et al. (1986) e GADEBERG

et al. (1979).

4.7.3 - Obtenção dos linfócitos dos linfonodos mesentéricos

O protocolo para a determinação do número total dos linfócitos dos

linfonodos mesentéricos foi realizado através das seguintes etapas: Os animais

foram sacrificados após o exercício físico de natação ou sem exercício (grupo

controle); Após a colocação do animal na placa de sacrifício, realizou-se um

corte sagital, na região da parede abdominal, e posteriormente a musculatura

45

do abdômen foi aberta; Foram localizados e retirados os linfonodos

mesentéricos, sendo em seguida separado o tecido ganglionar linfóide do

tecido gorduroso; Para a obtenção dos linfócitos mesentéricos foi utilizado um

sistema de dois cilindros de aço inox de diferentes diâmetros de modo que um

se encaixe no outro, contendo cada cilindro um sistema de malhas na sua

extremidade. Os linfócitos foram colocados entre os dois cilindros, e através de

movimentos normais circulares os mesmos foram comprimidos (maceração),

obtendo-se linfócitos íntegros e isolados. Acrescentou-se 10 ml de PBS gelado

com o auxílio de uma seringa; Com o auxilio de um papel de filtro, o líquido foi

filtrado no tubo de ensaio 1; O líquido já no tubo de ensaio 1 de plástico foi

Centrifugado por 1 minuto a 2000 rpm ou até o Pelet ser formado; O

sobrenadante foi descartado e ressuspendido o Pelet no agitador em 10 ml de

PBS gelado (diluição 10 X) tubo 1; Foi pego 100 µL da amostra do tubo 1,

colocado em outro tubo e acrescentado 900 µL de PBS gelado, tubo 2 (diluição

10X); 100 µL da amostra do tubo 2 foi pego e colocado em um tubo de plástico;

Neste tubo de plástico foi acrescido 100 µL de Triplan Blue (Sigma, St. Louis,

MO, USA) e o conteúdo foi homogeneizado com pipeta; Foi preenchida a

câmara de Neubauer e feita a contagem do número total de linfócitos dos

linfonodos mesentéricos no microscópio (Cálculo: número encontrado na soma

dos 4 quadrantes ÷ 4 (número de quadrantes) x 200 (diluição) = número x 104);

Observação: Os resultados foram expressos x 106. A Obtenção dos linfócitos

dos linfonodos mesentéricos foi realizada seguindo a metodologia descrita por

SERRANO et al. (1993).

Determinação sérica de IL-2, IL-6 e TNF-αααα

As dosagens de IL-2, IL-6 e TNF-α foram realizadas a partir da coleta do

soro do sangue dos animais e determinadas pelo método ELISA (Ensaio

imunoenzimático em fase sólida), seguindo as especificações correspondentes

ao Kit (R&D Systems, Minneapolis, MN) para cada uma das citocinas em ratos

de acordo com as descrições de CAVAGLIERI et al. (2003). Todas as amostras

para determinação das concentrações das citocinas circulantes foram

realizadas em duplicata, para garantir a precisão dos resultados obtidos.

46

4.7.4 - Protocolo para dosagem de IL-2

Preparação do reagente

Colocar todos os reagentes em temperatura ambiente antes do uso.

Kit controle de IL-2 de rato – reconstituir o kit controle com 1mL de água

destilada.

Conjugado de IL-2 de rato – para preparar o conjugado suficiente para uma

placa, acrescentar 0.5mL do conjugado concentrado a 11mL do diluente do

conjugado. Usar um recipiente estéril, e proteja da luz.

Tampão de lavagem – adicionar 625mL de água destilada + o frasco de 25mL

do tampão de lavagem.

Solução substrato – o reagente A e B de cor devem ser misturados juntos em

volumes iguais para uso dentro de 15 minutos (deste volume será usado 100µL

por orifício). Proteger da luz.

Padrão de IL-2 de rato – reconstituir a solução padrão de IL-2 com 2mL do

calibrador diluente RD5-4. Não substituir outros diluentes. Essa reconstituição

produz uma solução estoque de 2.000pg por mL. Misturar a solução por no

mínimo 5 minutos com agitação leve, antes de fazer as diluições. Pipetar 200µL

do calibrador diluente RD5-4 dentro de cada tubo utilizado. Usar a solução

estoque para produzir uma diluição de 2x em série (como na figura abaixo).

Misturar em cada tubo antes da próxima transferência. A solução padrão e IL-2

do rato não diluída servem como um maior padrão (2.000pg por mL). O

calibrador diluente RD5-4 serve como padrão zero (0pg por mL).

47

Figura 3. Ilustração do procedimento de diluição dos calibradores para IL-2.

Procedimento do ensaio

Todos os reagentes e amostras foram colocados em temperatura

ambiente antes de usar. É recomendado que todas as amostras padrões e

controles sejam analisados em duplicata.

1. Preparar reagentes, diluições da curva padrão, controle e amostras como

direcionado na sessão anterior.

2. Utilizar somente as colunas necessárias.

3. Acrescentar 50µL do diluente de ensaio RD1-21 em cada pequeno orifício.

4. Acrescentar 50µL do padrão, controle ou amostra por orifício. Misturar

girando a placa gentilmente por 1 minuto. Cobrir com um adesivo fornecido.

Encubar por 2 horas em temperatura ambiente.

5. Aspirar cada orifício e lavar, repetindo o processo 4x para um total de 5

lavagens. Lavar preenchendo cada orifício com 400µL do tampão de

lavagem, usando uma pipeta multicanal e um becker grande. Completar a

remoção do líquido em cada passo é essencial para boa performance.

Depois da última lavagem, remover qualquer tampão de lavagem

remanescente por aspiração. Inverter a placa e bater contra papéis toalha

limpos.

48

6. Acrescentar 100µL do conjugado de IL-2 de rato em cada orifício. Cobrir

com uma nova fita adesiva. Encubar por 2 horas em temperatura ambiente.

7. Repetir a aspiração/lavagem como no passo 5.

8. Acrescentar 100µL da solução substrato em cada orifício. Encubar por 30

minutos em temperatura ambiente. Proteger da luz.

9. Acrescentar 100µL da solução de parada em cada orifício. Mover a placa

gentilmente para garantir mixagem.

Preparação da amostra

75µL da amostra + 75µL do calibrador diluente RD5-4 e misturar bem.

4.7.5 – Protocolo para dosagem de IL-6



Kit controle de IL-6 de rato – reconstituir o kit controle com 1mL de água

destilada.

Tampão de lavagem – adicionar 25mL do tampão de lavagem para 625mL de

água destilada.




Padrão de IL-6 de rato – reconstituir a solução padrão de IL-6 com 1mL do

calibrador diluente RD5-16. Não substituir outros diluentes. Essa reconstituição

produz uma solução estoque de 4.000pg por mL. Misturar a solução por no

mínimo 5 minutos com agitação leve, antes de fazer as diluições. Utilizar tubos

de polipropileno - Pipetar 200µL do calibrador diluente RD5-16 dentro de cada

tubo utilizado. Usar a solução estoque para produzir uma diluição de 2x em

série (como na figura abaixo). Misturar em cada tubo antes da próxima

transferência. A solução padrão e IL-6 do rato não diluída serve como um maior

49

padrão (4.000pg por mL). O calibrador diluente RD5-16 serve como padrão

zero (0pg por mL).

Figura 4. Ilustração do procedimento de diluição dos calibradores para IL-6.













lavagens. Lavar preenchendo cada orifício com 400µL do tampão de lavagem,

50

usando uma pipeta multicanal e um becker grande. Completar a remoção do

líquido em cada passo é essencial para boa performance. Depois da última

lavagem, remova qualquer tampão de lavagem remanescente por aspiração.

Inverter a placa e bater contra papéis toalha limpos.

6. Acrescentar 100µL do conjugado de IL-6 de rato em cada orifício. Cobrir com

uma nova fita adesiva. Encubar por 2 horas em temperatura ambiente.







Utilizar tubos de polipropileno. 75µL da amostra + 75µL do calibrador

diluente RD5-16 e misturar bem.

4.7.6 - Protocolo para dosagem de TNF-αααα



Kit controle de TNF-α de rato – reconstituir o kit controle com 1mL de água

destilada.

Tampão de lavagem – adicionar 625mL de água destilada + o frasco de 25mL

do tampão de lavagem.




Padrão de TNF-α de rato – reconstituir a solução padrão de TNF-α com 2mL

do calibrador diluente RD5-17. Não substituir outros diluentes. Essa

reconstituição produz uma solução estoque de 800pg por mL. Misturar a

solução por no mínimo 5 minutos com agitação leve, antes de fazer as

51

diluições. Utilizar tubos de polipropileno -Pipetar 200µL do calibrador diluente

RD5-17 dentro de cada tubo. Utilizado a solução estoque para produzir uma

diluição em série (como na figura abaixo). Misturar em cada tubo antes da

próxima transferência. A solução padrão e TNF-α do rato não diluída servem

como um maior padrão (800pg por mL). O calibrador diluente RD5-17 serve

como padrão zero (0pg por mL).

Figura 5. Ilustração do procedimento de diluição dos calibradores para TNF-α.












52


lavagens. Lavar preenchendo cada orifício com 400µL do tampão de lavagem,

usando uma pipeta multicanal e um becker grande. Completar a remoção do

líquido em cada passo é essencial para boa performance. Depois da última

lavagem, remover qualquer tampão de lavagem remanescente por aspiração.

Inverter a placa e bater contra papéis toalha limpos.

6. Acrescentar 100µL do conjugado de TNF-α de rato em cada orifício. Cobrir

com uma nova fita adesiva. Encubar por 2 horas em temperatura ambiente.







75µL da amostra + 75µL do calibrador diluente RD5-17 e misturar bem.

4.7.7 - Potencial transmembrânico da mitocôndria

As células foram centrifugadas a 1000g durante 15 minutos a 4°C, e o

Pelet foi ressuspendido em 1000 µL de PBS. A rodamina 123 é um corante

catiônico permeável à membrana, excitável por laser argônio que emite

fluorescência sendo rapidamente seqüestrado pela mitocôndria sem a indução

de efeitos citotóxicos (PITHON-CURI et al., 2003). A rodamina 123 (Molecular

Probes, Eugene, OR, USA). (5 µM) foi acrescentada e as células foram então

incubadas durante 15 minutos a 37°C no escuro. As células foram lavadas

duas vezes em PBS e incubadas durante 30 minutos a 30°C no escuro. A

fluorescência de 10000 eventos foi determinada por citometria de fluxo usando

o canal FL1 (fluorescência verde_530/30 nm). Esta técnica foi aplicada somente

nos grupos exercitados de curta duração (controle, 5 minutos leve e moderado

e 15 minutos leve e moderado nos linfócitos circulantes). Os valores foram

53

expressos em percentual de linfócitos circulantes com alteração do potencial

transmembrânico mitocondrial.

4.7.8 - Viabilidade de Linfócitos circulantes

Os linfócitos foram centrifugados a 1000g durante 15 minutos a 4°C, e o

Pelet obtido foi ressuspendido em 500 µL de solução salina tampão (PBS).

Posteriormente, foi acrescentado 50 µL de solução com iodeto de propídeo

(ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA, USA) (50 mg/mL in PBS), e as células

foram analisadas com citometro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, San

Jose, CA, USA). O iodeto de propídeo é um componente fluorescente

altamente solúvel em água que é excluído das células viáveis. Nas células que

perderam a integridade da membrana, este se liga ao DNA intercalando-se

entre as bases, com pequena ou nenhuma preferência de seqüência. A

fluorescência foi mensurada utilizando o canal FL2 (fluorescência laranja-

vermelho 585/42 nm). 10000 eventos foram analisados por experimento. As

células com a fluorescência de iodeto de propídeo foram avaliadas pelo

software CellQuest (Becton Dickinson). Esta técnica foi aplicada somente nos

grupos exercitados de curta duração (controle, 5 minutos leve e moderado e 15

minutos leve e moderado nos linfócitos circulantes) (CURY-BOAVENTURA et

al., 2005). Os valores foram expressos em percentual de linfócitos viáveis.

4.7.9 - Fragmentação de DNA

A fragmentação de DNA foi analisada por citometria de fluxo depois que

as células foram misturadas ao iodeto de propídeo (ICN Biomedicals, Costa

Mesa, CA, USA), de acordo com o método descrito por NICOLETTI et al.

(1991). As células foram ressuspendidas numa solução que continha

detergentes permeabilizantes, que incorporaram a coloração no DNA. Em

seguida, as células foram centrifugadas a 1000g durante 15 minutos a 4°C. O

Pelet foi gentilmente ressuspendido em 300 µL de solução hipotônica que

continha 50 µg/mL de iodeto de propídeo, 0.1% citrato de sódio (Merck,

Darmstadt, Germany), e 0.1% Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO, USA). As

células foram então incubadas durante 2 h a 4°C. A fluorescência foi

54

mensurada e analisada por citometria de fluxo como descrito acima. Esta

técnica foi aplicada somente nos grupos exercitados de curta duração

(controle, 5 minutos leve e moderado e 15 minutos leve e moderado nos

linfócitos circulantes). Os valores foram expressos em percentual de linfócitos

circulantes com fragmentação de DNA.

4.8 - Análise Estatística

Todos os dados foram expressos como média ± Erro Padrão da Média

(EPM). A análise estatística foi realizada inicialmente pelo teste de normalidade

Kolmorogorov-Smirnov e pelo teste de homocedasticidade (critério de Bartlett).

Para as variáveis analisadas, que apresentaram distribuição normal e

homocedasticidade, foi utilizado a Anova e teste F sendo que, quando a

diferença apresentada era significante, aplicou-se o teste de Tukey HSD para

as comparações múltiplas. Em todos os cálculos foi fixado um nível crítico de

5% (p<0,05).

O software utilizado em todos os testes estatísticos foi o Statistica® 6.1.

55

5. Resultados

5.1 - Tabela 1. Leucometria

Todos os grupos exercitados apresentaram leucocitose quando

comparados ao controle (p* ≤ 0,05), na intensidade leve, 5L aumentou

110,44%, 15L 130,1%, EXL 84,5% e no grupo 5SL aumento de 295%.Na

intensidade moderada, 5M aumentou 207%, 15M 181,8%, EXL 90,53% e 5SM

64,32%. Na comparação entre os grupos, foi detectado maior número de

leucócitos circulantes (45,9%) no grupo 5M quando comparado ao 5L;

leucocitose 22,5% maior no 15M em relação ao 15L e menor leucocitose

(140,32%) no grupo 5SM em relação ao grupo 5SL (Tabela 1, Figura 6).

Leucometria x 106 Média + EPM

C 4,12 0,14

5L 8,67 0,87*

15L 9,48 0,75*

EXL 7,6 0,33*

5SL 16,27 0,46*

5M 12,65 0,74*#

15M 11,61 0,5*#

EXM 7,85 0,35*

5SM 6,77 0,23*#

Valores = média + Erro padrão da média. C= Grupo controle, 5L= Exercício

leve 5 minutos, 15L= Exercício leve 15 minutos, EXL= Exercício até a exaustão

em intensidade leve, 5SL= Grupo exercitado 5 sessões em intensidade leve

5M= Exercício moderado 5 minutos, 15M= Exercício moderado 15 minutos,

EXM= Exercício até a exaustão em intensidade moderada, 5SM= Grupo

exercitado 5 sessões em intensidade moderada, (n=6 para todos os grupos

experimentais). *Diferença significativa quando comparado ao grupo controle. #Diferença significativa entre grupos de mesma duração, porém com

intensidades diferentes (5L com 5M, 15L com 15M, EXL com EXM e 5SL com

5SM) (p < 0,05).

56

C 5L 15L EXL 5SL 5M 15M EXM 5SM0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

#

##

**

**

*

*

**

Leu

com

etri

a -

Nº

de

Leu

cóci

tos

x 10

6

Grupos Experimentais

Figura 6 – Leucometria. Valores = média + Erro padrão da média. C= Grupo

controle, 5L= Exercício leve 5 minutos, 15L= Exercício leve 15 minutos, EXL=

Exercício até a exaustão em intensidade leve, 5SL= Grupo exercitado 5

sessões em intensidade leve 5M= Exercício moderado 5 minutos, 15M=

Exercício moderado 15 minutos, EXM= Exercício até a exaustão em

intensidade moderada, 5SM= Grupo exercitado 5 sessões em intensidade

moderada, (n=6 para todos os grupos experimentais). *Diferença significativa

quando comparado ao grupo controle. #Diferença significativa entre grupos de

mesma duração, porém com intensidades diferentes (5L com 5M, 15L com

15M, EXL com EXM e 5SL com 5SM) (p < 0,05).

57

5.2 - Tabela 2. Número total de Linfócitos Circulantes.

Foi observada linfocitose estatisticamente significante em todos os grupos

exercitados em relação ao controle, (p* ≤ 0,05). Sendo que, o grupo 5L exibiu

aumento de 97%, 15L aumentou 165%, EXL 87,55% e o grupo 5SL aumentou

3 vezes mais em comparação ao controle, apresentando a maior elevação nos

linfócitos circulantes (Tabela 2, Gráfico 7). Na intensidade moderada, o grupo

5M aumentou 2,5 vezes, 15M aumentou 190,57%, EXM 94,34% e 5SM

100,4%, todos em relação ao controle (Tabela 2, Gráfico 7). Na comparação

entre os grupos, foi observado maior número de linfócitos circulantes no grupo

5M (78%) quando comparado ao grupo 5L; 5SL apresentou linfocitose 116,38%

maior do que o grupo 5SM (Tabela 2, Gráfico 7).

N0. Linfócitos Circulantes x 106 Média + EPM

C 2,65 0,0008

5L 5,24 0,0166*

15L 7,03 0,008*

EXL 4,97 0,007*

5SL 11,49 0,0207*

5M 9,33 0,0072*#

15M 7,7 0,0061*

EXM 5,15 0,0061*

5SM 5,31 0,0061*#









5SM) (p < 0,05).

58


2

4

6

8

10

12

#

#

**

*

*

*

*

*

*

N0 . T

ota

l de

Lin

fóci

tos

Cir

cula

nte

s x

106


Figura 7 - Leucograma Diferencial. Valores = média + Erro padrão da média.

C= Grupo controle, 5L= Exercício leve 5 minutos, 15L= Exercício leve 15

minutos, EXL= Exercício até a exaustão em intensidade leve, 5SL= Grupo

exercitado 5 sessões em intensidade leve 5M= Exercício moderado 5 minutos,

15M= Exercício moderado 15 minutos, EXM= Exercício até a exaustão em






59

5.3 - Tabela 3. Número total de Linfócitos do linfonodo mesentérico.

Foram observados aumentos estatisticamente significantes nos grupos 5L

(31,8%), 5M (28,13%) e 15M (45,43%) no número total de linfócitos

mesentéricos quando comparados ao controle (p* ≤ 0,05). Houve diminuição de

18,26% no grupo EXL, 24,84% no 5SL e 53,93% no 5SM em relação ao

controle (Tabela 3, Figura 8). Na comparação entre grupos, o grupo 15M

demonstrou maior número total de linfócitos mesentéricos (44,74%) em

comparação ao 15L; similarmente, o grupo EXM apresentou maior número de

linfócitos teciduais (31,7%) quando comparado ao EXL; no caso dos grupos

exercitados durante 5 sessões, observamos valor 63,14% menor nos linfócitos

teciduais no grupo 5SM em relação ao 5SL (Tabela 3, Figura 8).

Linfócitos Mesentéricos x 106 Média + EPM

C 157 5,28

5L 206,92 13,32*

15L 157,75 9,57

EXL 128,33 4,56*

5SL 118 7,30*

5M 201,17 2,71*

15M 228,33 6,09*#

EXM 169 5,43#

5SM 72,33 3,84*#









5SM) (p < 0,05).

60


50

100

150

200

250

#

#

#

*

*

*

**

*

Nº

Tota

l de

Lin

fóci

tos

Mes

enté

rico

s x

106


Figura 8 – Número total de Linfócitos do linfonodo mesentérico. Valores =

média + Erro padrão da média. C= Grupo controle, 5L= Exercício leve 5

minutos, 15L= Exercício leve 15 minutos, EXL= Exercício até a exaustão em

intensidade leve, 5SL= Grupo exercitado 5 sessões em intensidade leve 5M=

Exercício moderado 5 minutos, 15M= Exercício moderado 15 minutos, EXM=

Exercício até a exaustão em intensidade moderada, 5SM= Grupo exercitado 5

sessões em intensidade moderada, (n=6 para todos os grupos experimentais).

*Diferença significativa quando comparado ao grupo controle. #Diferença

significativa entre grupos de mesma duração, porém com intensidades

diferentes (5L com 5M, 15L com 15M, EXL com EXM e 5SL com 5SM) (p <

0,05).

61

5.4 - Viabilidade de linfócitos circulantes

Quando realizamos a comparação dos grupos exercitados nas

intensidades leve e moderada com o grupo controle, observamos diminuição

significativa de 10% na viabilidade de linfócitos circulantes apenas no grupo

15M (p* ≤ 0,05). Na comparação entre grupos, não constatamos alterações

estatisticamente significantes (Figura 9).

C 5L 15L 5M 15M0

20

40

60

80

100

*

% li

nfó

cito

s vi

ávei

s


Figura 9 - Viabilidade de linfócitos circulantes. Valores = média + Erro

padrão da média. C= Grupo controle, 5L= Exercício leve 5 minutos, 15L=

Exercício leve 15 minutos, 5M= Exercício moderado 5 minutos, 15M= Exercício

moderado 15 minutos, (n=6 para todos os grupos experimentais). *Diferença

significativa quando comparado ao grupo controle (p < 0,05).

62

5.5 - Potencial Transmembrânico da Mitocôndria de Linfócitos Circulantes

Quando se comparou os grupos exercitados de curta duração nas

intensidades leve e moderada com o grupo controle, não observamos alteração

significativa no potencial transmembrânico mitocondrial de linfócitos. Na

comparação entre grupos, também não constatamos alterações

estatisticamente significantes (Figura 10).

C 5L 15L 5M 15M0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

% L

inf.

c/ a

lter

ação

Po

ten

cial

Tra

nsm

emb

rân

ico


Figura 10 – Alteração no Potencial Transmembrânico Mitocondrial de

Linfócitos Circulantes. Valores = média + Erro padrão da média. C= Grupo

controle, 5L= Exercício leve 5 minutos, 15L= Exercício leve 15 minutos, 5M=

Exercício moderado 5 minutos, 15M= Exercício moderado 15 minutos, (n=6

para todos os grupos experimentais). *Diferença significativa quando

comparado ao grupo controle (p < 0,05).

63

5.6 - Fragmentação de DNA de linfócitos circulantes

Pudemos observar redução estatisticamente significante de 35,84% no

grupo 15L quando comparado com o controle, similarmente, os grupos 5M e

15M também apresentaram queda na fragmentação de DNA de linfócitos

circulantes em relação ao grupo controle (50% e 57%, respectivamente, p* ≤

0,05). Quando realizamos a comparação entre os grupos exercitados,

observamos diminuição significativa de 32,8% na fragmentação do DNA de

linfócitos no grupo 15M em relação ao 15L (Figura 11).

C 5L 15L 5M 15M0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

#**

*

% d

e lin

fóci

tos

com

fra

gm

enta

ção

do

DN

A


Figura 11 - Fragmentação de DNA de linfócitos circulantes. Valores =

média + Erro padrão da média. C= Grupo controle, 5L= Exercício leve 5

minutos, 15L= Exercício leve 15 minutos, 5M= Exercício moderado 5 minutos,

15M= Exercício moderado 15 minutos, (n=6 para todos os grupos

experimentais). *Diferença significativa quando comparado ao grupo controle (p

< 0,05).

64

5.7 - Tabela 4. Concentração sérica de IL-2.

Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas em

nenhum dos grupos exercitados quando comparados com o grupo controle,

tanto nas intensidades leve como moderada. Na comparação entre os grupos

exercitados, também não foram observadas alterações estatisticamente

significativas na concentração sérica de IL-2 (p < 0,05) (Tabela 4 e Figura 12).

IL-2 (pg/ml) Média + EPM

C 56,2 7,01

5L 53,14 2,54

15L 48,97 2,68

EXL 52,31 3,36

5SL 54,53 5,3

5M 48,4 2,88

15M 49,46 1,63

EXM 59,8 4,4

5SM 52,58 4,09









5SM) (p < 0,05).

.

65


10

20

30

40

50

60

70IL

-2 (

pg

/ml)


Figura 12 - Concentração sérica de IL-2. Valores = média + Erro padrão da

média. C= Grupo controle, 5L= Exercício leve 5 minutos, 15L= Exercício leve

15 minutos, EXL= Exercício até a exaustão em intensidade leve, 5SL= Grupo








66

5.8 - Tabela 5. Concentração sérica de IL-6.

Quando comparado ao controle, encontrou-se aumento estatisticamente

significativo de 26,6% na concentração circulante de IL-6 no grupo exaustão

leve (EXL), sendo que, os outros grupos exercitados não apresentaram

alterações significativas em relação ao controle (p < 0,05). Na comparação

entre grupos, observou-se redução de 26% na IL-6 do grupo EXM quando

comparado ao grupo EXL (Tabela 5 e Figura 13).

IL-6 (pg/ml) Média + EPM

C 267,88 9,86

5L 262,54 17,67

15L 279,88 13,01

EXL 364,88 7,76*

5SL 269,88 3,05

5M 283,21 28,62

15M 294,54 12,66

EXM 259,98 23,18#

5SM 270,54 11,79









5SM) (p < 0,05).

67


50

100

150

200

250

300

350

400

#

*IL

-6 (

pg

/ml)


Figura 13 - Concentração sérica de IL-6. Valores = média + Erro padrão da










68

5.9 - Tabela 6. Concentração sérica de TNF-α.

Foram detectadas reduções significativas na concentração circulante de

TNF-α nos grupos exercitados 5SL (24,72%), 5M (23,44%), 15M (23,07%),

EXM (26,19%, maior redução) e 5SM (23,81%) quando comparados ao

controle. Na comparação entre os grupos exercitados, observamos redução

estatisticamente significativa de 20% no grupo 15M em relação ao grupo 15L,

na TNF-α circulante (p < 0,05) (Tabela 6 e Figura 14).

TNF-α (pg/ml) Média + EPM

C 5,46 0,2

5L 4,84 0,27

15L 5,25 0,2

EXL 4,62 0,24

5SL 4,11 0,06*

5M 4,18 0,16*

15M 4,2 0,08*#

EXM 4,03 0,03*

5SM 4,16 0,19*









5SM) (p < 0,05).

69


1

2

3

4

5

6

# *****

TN

F-a

lph

a (p

g/m

l)


Figura 14 - Concentração sérica de TNF-α. Valores = média + Erro padrão da










70

Tabela 7. Representação esquemática geral dos resultados.

PARÂMETROS GRUPOS EXPERIMENTAIS

5L 15L EXL 5SL 5M 15M EXM 5SM

Leucócitos

Totais ↑ ↑ ↑ ↑ ↑↑ ↑↑ ↑ ↑↓

Linfócitos

Circulantes ↑ ↑ ↑ ↑ ↑↑ ↑ ↑ ↑↓

Linfócitos

Teciduais ↑ NS ↓ ↓ ↑ ↑↑ ↑ ↓↓

Viabilidade

de linfócitos NS NS ─ ─ NS ↓ ─ ─

Potencial

transmembrânico

Mitocondrial

NS NS ─ ─ NS NS ─ ─

Fragmentação de

DNA de linfócitos NS ↓ ─ ─ ↓ ↓↓ ─ ─

Interleucina-2 NS NS NS NS NS NS NS NS

Interleucina-6 NS NS ↑ NS NS NS ↓ NS

Fator de Necrose

Tumoral-α NS NS NS ↓ ↓ ↓↓ ↓ ↓

↑ = Aumento em relação ao controle

↓ = Redução em relação ao controle

↑ = Aumento em relação ao grupo exercitado no mesmo volume, porém com

intensidade diferente

↓ = Redução em relação ao grupo exercitado no mesmo volume, porém com

intensidade diferente

NS = Nenhuma alteração estatisticamente significativa

─ = Parâmetro não analisado neste grupo

71

6. Discussão

A leucocitose ocorre em resposta ao estresse físico agudo, assim como

em exercícios físicos intensos e de curta duração, sendo um fenômeno bem

documentado na literatura (GOEBEL e MILLS, 2000). Os efeitos deste tipo de

exercício físico sobre o aumento no número de leucócitos circulantes são

mediados, pelo menos em parte, pela ativação do sistema nervoso simpático

(MILLS et al., 1999) e aumento agudo dos níveis plasmáticos de catecolaminas

durante o exercício (DISHMAN, 1997; MAZZEO, 1991). A leucocitose pode

aumentar linearmente de acordo com a elevação da intensidade do exercício,

que poderá também promover maior resposta das catecolaminas (BAIN et al.,

2000; PEDERSEN e HOFFMAN-GOETZ, 2000).

Em estudo realizado por HONG et al. (2005), foram utilizados indivíduos

saudáveis divididos em 2 grupos, grupo fisicamente ativo e grupo não ativo

fisicamente, que realizaram 20 minutos de exercício físico em esteira a uma

intensidade de 65-70% VO2max. Foi observada leucocitose similar ao aumento

das concentrações de catecolaminas, que não diferiu entre os dois grupos. Os

valores retornaram próximo aos valores de repouso após 10-15 minutos do

final do teste de esteira.

Sabe-se que o treinamento é capaz de alterar a freqüência cardíaca de

repouso e durante o exercício, ou seja, a promoção da bradicardia

(SIGVARDSSON et al., 1977). Além de promover uma regulação negativa nos

receptores β-adrenérgicos dos linfócitos em situação de repouso (OHMAN et

al., 1987). Assim, o destreinamento ou a baixa aptidão física direciona o

organismo a uma maior concentração plasmática de noradrenalina

(SOTHMANN et al., 1991). As catecolaminas liberadas durante o exercício

físico provocam efeitos característicos como aumento da freqüência cardíaca e

da força de contração do miocárdio proporcionando maior circulação sanguínea

pelo corpo. Dessa forma mais células são liberadas para a corrente sanguínea,

aumentando a quantidade de células circulantes, caracterizando a leucocitose.

Esta leucocitose induzida pelo exercício físico também foi encontrada em

nosso trabalho, através dos aumentos significantes detectados no número de

leucócitos totais circulantes em todos os grupos exercitados quando

comparados ao grupo controle não exercitado, sendo que, na intensidade leve,

72

o grupo 5L aumentou 110,44%, 15L (130,1%), EXL (84,5%) e 5SL (295%)

(Tabela 1 e Figura 4). Já os grupos exercitados em intensidade moderada

apresentaram maiores aumentos com relação à leucocitose, 5M (207%), 15M

(181,8%), EXM (90,53%), com exceção do grupo exercitado 5 sessões em

intensidade moderada (5SM, que apresentou aumento de 64,32%) (Tabela 1 e

Figura 6). Corroborando com os trabalhos comentados acima, no presente

estudo a intensidade do exercício promoveu maior leucocitose nos grupos

exercitados durante 5 e 15 minutos com sobrecarga adicional (45,9%, 5M>5L e

22,5% 15M>15L, respectivamente) quando comparados aos grupos

exercitados em intensidade leve na mesma duração (Tabela 1 e Figura 6).

A leucocitose menos pronunciada no grupo exercitado 5 sessões em

intensidade moderada (140,32% menor) quando comparado ao grupo

exercitado 5 sessões em intensidade leve pode estar relacionada a carga

adicional utilizada neste grupo. Em virtude da maior intensidade, os animais

podem não ter tido tempo suficiente para adaptação, uma vez que os

resultados encontrados nesse grupo são muito semelhantes aos grupos

exercitados até a exaustão (Tabela 1 e Figura 6). De fato, a intensidade

moderada pode ter imposto maior estresse ao grupo 5SM, induzindo a menor

contagem de leucócitos totais observada no mesmo. No entanto, acreditamos

ser necessária a realização de mais estudos que elucidem os mecanismos

moduladores da contagem total de leucócitos frente à realização de 5 sessões

de exercício com volumes crescentes numa mesma semana, em diferentes

intensidades.

Considerando estes aspectos relacionados ao aumento no número de

leucócitos circulantes, os linfócitos liberados da medula para a circulação geral,

durante o exercício, contribuíram para um aumento do número de células

marginadas nos vasos (HOGG, 1987). Disponibilizando maior número de

células para a circulação em decorrência do exercício. Os leitos

microvasculares pulmonar e esplênico são importantes reservatórios de

leucócitos marginados (HOGG, 1987). Neste sentido, VAN EEDEN et al. (1997)

e LAWRENCE et al. (1996) comentaram que os polimorfonucleares imaturos

liberados da medula óssea têm se mostrado preferencialmente marginados nos

capilares pulmonares.

73

O aumento no percentual de linfócitos circulantes (linfocitose) frente ao

exercício é passageiro, e, provavelmente se deve a liberação dos hormônios do

estresse, principalmente a adrenalina (SAXTON et al., 2003), aumentando a

liberação de células de seus compartimentos para a circulação sanguínea.

O exercício físico regular em intensidade submáxima pode não alterar as

subpopulações de linfócitos (PEDERSEN e HOFFMAN-GOETZ, 2000). Ainda,

em estudo realizado por HONG et al. (2005), onde foram realizados 20 minutos

de exercício físico de esteira a uma intensidade de 65-70% VO2max foram

observados aumentos no percentual de linfócitos circulantes. Em outro estudo,

McFARLIN et al. (2003) utilizaram 10 homens fisicamente ativos de idade entre

18-25 anos, que realizaram duas sessões de endurance de curta duração (20

minutos cada, 5 min a 50% do VO2max e 15 min a 70% VO2max) no mesmo

dia. Foram observados aumentos na contagem de linfócitos, mas mínimo efeito

sobre a atividade da célula NK.

Recentemente, NIEMAN et al. (2005) analisaram o efeito da caminhada

de 30 minutos na resposta imune. Neste estudo foram avaliadas 17 mulheres

com idades entre 25 e 55 anos, que já realizavam caminhadas pelo menos a

três meses, com uma freqüência de 2-7 dias por semana. Sumariamente,

verificou-se que a caminhada numa intensidade de 60%-65% do VO2max, foi

associada com aumentos padrões, porém temporários na contagem de células,

sendo que os linfócitos circulantes contribuíram com 40% na elevação total.

Os resultados dos estudos comentados acima são similares aos

observados no presente estudo. Pois verificamos aumento no percentual de

linfócitos circulantes em todos os grupos exercitados: 5 minutos leve (5L, 97%

de aumento), 15 minutos leve (15L, 165% de aumento), exercitado até a

exaustão leve (EXL, 87,55% de aumento) e exercitado 5 sessões em

intensidade leve (5SL, 333,6% de aumento). No exercício moderado,

observamos também aumento em todos os grupos: 5 minutos (5M, 252% de

aumento), 15 minutos (15M, 190,57% de aumento), exaustão (EXM, 94,34% de

aumento) e exercitado 5 sessões (5SM, 100% de aumento) quando

comparados ao controle (Tabela 2 e Figura 7).

No entanto, quando foi realizada a comparação entre as intensidades,

observamos maior número de linfócitos estatisticamente significativo, apenas

no grupo 5M (78% maior) quando comparado a 5L (Tabela 2 e Figura 7).

74

Adicionalmente, foi detectado menor número de linfócitos circulantes no grupo

5SM (116,38% menor) em relação ao grupo 5SL (Tabela 2 e Figura 7).

Similarmente a contagem total de leucócitos, a maior intensidade imposta aos

animais do grupo 5SM exerceu influência na contagem de linfócitos circulantes,

reduzindo o número deste subtipo celular. O período de exercício realizado (1

semana) parece não ter sido suficiente para adaptação a sobrecarga adicional.

LAPERRIERE et al. (1991; 1994) mostraram que 10 semanas de

treinamento em aerobiose promoveu um aumento do número de células CD4+,

CD8+ e linfócitos B, coletados no estado de repouso em homens sedentários

saudáveis. A intensidade utilizada foi de 70-80% da freqüência cardíaca

máxima predita para a respectiva idade / volume de 45 minutos, 3 vezes por

semana, utilizando-se como modelo de exercício o ciclismo. Porém,

PEDERSEN et al. (2000) observaram que em 7 semanas de treinamento,

somente o número de células NK estava aumentado sob condições de

repouso. Em estudo realizado por NIEMAN et al. (2000) que utilizaram 40

mulheres jovens (20 corredoras de elite e 19 mulheres não atletas), a atividade

das células NK estava significantemente aumentada nas corredoras de elite em

comparação com o grupo controle não atleta.

NIELSEN et al. (1997) demonstraram que aproximadamente 2/3 do total

de linfócitos liberados para a circulação geral, durante o exercício, são

provenientes do baço, órgão este que provavelmente teria contribuído para a

linfocitose nos grupos exercitados. Estando de acordo com GABRIEL e

KINDERMANN (1998), que propuseram os órgãos linfóides secundários como

responsáveis pelo aumento de células circulantes. Se o exercício for realizado

por longos períodos ou em alta intensidade, a concentração total de linfócitos

nos órgão linfóides secundários pode diminuir, levando ao quadro de linfopenia,

o que se deve à falta de células maduras que podem ser recrutadas, e à

redistribuição dos linfócitos para a circulação geral (PEDERSEN e HOFFMAN-

GOETZ, 2000; PEDERSEN e NIEMAM, 1998; RONSEN et al., 2001b).

Neste sentido, estes resultados estão de acordo com as da nossa

pesquisa, pois para curta duração foram observados aumentos nos linfócitos

provenientes dos linfonodos mesentéricos em relação ao controle, o grupo 5L

(aumentou 31,8%), 5M (aumentou 28,13%) e 15M (aumentou 45,43%),

possivelmente pelos mesmos mecanismos fisiológicos propostos para a

75

linfocitose circulante (Tabela 3 e Figura 8). No caso de exercício com maior

volume, foram observadas reduções significativas na contagem de linfócitos

mesentéricos para os grupos exaustão leve (EXL, redução de 18,26%),

exercitado 5 sessões em intensidade leve (5SL, redução de 24,84%) e

exercitado 5 sessões em intensidade moderada (5SM, redução de 54%),

quando comparados ao controle sedentário (Tabela 3 e Figura 8).

Estes linfócitos que possivelmente saíram do compartimento linfóide

(linfonodo mesentérico), podem ter contribuído para linfocitose circulante

observada nestes mesmos grupos. Novamente, em dois grupos exercitados a

intensidade promoveu maiores aumentos no número de células (neste caso

dos linfócitos teciduais), já que, observamos linfocitose tecidual mais

pronunciada no grupo 15M (44,74% maior) em relação ao 15L e também no

grupo EXM (31,7% maior) quando comparado ao grupo EXL. Finalmente, nos

grupos que realizaram 5 sessões encontramos menor número de linfócitos

teciduais (63,14%) no grupo 5SM em relação ao 5SL (Tabela 3 e Figura 8).

Este padrão foi evidenciado neste mesmo grupo, para as variáveis leucometria

e linfócitos circulantes, provavelmente, em decorrência do pequeno período

disponível para a adaptação a intensidade moderada (1 semana) e pelo maior

estresse imposto ao grupo 5SM.

Vale destacar que provavelmente nossos animais podem ter sido

submetidos a um estresse maior, em virtude do ciclo de luz ao qual foram

expostos e o horário a qual foram submetidos ao exercício. Sabe-se que no

ciclo de luz normal, os ratos, animais noturnos, apresentam um pico de

corticosteróides próximo da inversão da luz (final da tarde) (KALSBEEK et al.,

2003). Neste sentido, estes foram exercitados no período normalmente de

repouso (durante o dia, período da tarde, entre 14:00 e 17:00 horas).

Entretanto, esta condição foi amenizada, uma vez que, todos os grupos foram

submetidos à mesma condição de ciclo de luz no biotério, horário do exercício

e sacrifício (inclusive o grupo controle, porém não exercitado).

A apoptose e necrose foram observadas em linfócitos depois de exercício

aeróbio intenso e agudo (HOFFMAN-GOETZ e DUERRSTEIN, 2004).

Mudanças no potencial transmembrânico mitocondrial, força de direcionamento

para formação do ATP, constitui um passo obrigatório na indução da morte

apoptótica (KROEMER et al., 1998). A despolarização mitocondrial precede

76

sinais nucleares de apoptose à ativação de endonucleases endógenas e

caspases, que resultam em fragmentação de DNA irreversível da célula

(KROEMER et al., 1998).

Depois de exercícios extenuantes, a despolarização da membrana

mitocondrial pode ocorrer em neutrófilos de ratos (LAGRANHA et al., 2004),

monócitos e linfócitos de humanos, e linfócitos intestinais de camundongos

(QUADRILATERO e HOFFMAN-GOETZ, 2004). Durante a disfunção

mitocondrial, a citocromo-c é liberada no citosol ativando caspases e

eventualmente promovendo apoptose (GREEN e REED, 1998). Resultados

similares também foram observados por CONCORDET e FEERRY (1993), que

verificaram apoptose em timócitos de ratos que realizaram duas corridas em

esteira até a exaustão, evidenciada pela fragmentação de DNA. Nesta linha de

pensamento, em ratos, foi demonstrado que a corrida de alta intensidade em

esteira foi associada com a expressão de proteínas pró-apoptóticas (caspase-3

e citocromo citosólica-c) e a redução na expressão da proteína anti-apoptótica

Bcl-2 em linfócitos intestinais c, quando comparados ao grupo controle não

exercitado (QUADRILATERO e HOFFMAN-GOETZ, 2005).

MOOREN et al. (2002) relataram que o exercício exaustivo (corrida em

esteira e 80% do VO2max) induz a apoptose em linfócitos periféricos enquanto

que o exercício moderado (corrida em esteira e 60% do VO2max) não induz em

indivíduos saudáveis. HOFFMAN-GOETZ et al., (1999) não observaram

apoptose de timócitos em camundongos submetidos à corrida submáxima em

esteira durante 90 minutos.

Como mencionado acima, o exercício moderado não induziu a apoptose

de linfócitos circulantes, o que também não foi observado no presente estudo,

nas intensidades leve e moderada. De fato, nosso trabalho verificou que o

exercício de 15 minutos em intensidade leve promoveu redução de 35,84% na

porcentagem de linfócitos com fragmentação de DNA. Nos grupos 5 e 15

minutos em intensidade moderada observamos reduções de 50% e 57%,

respectivamente, em relação ao controle (Figura 11). Apesar de obtermos

redução de 10% na viabilidade no grupo 15 minutos moderado (Figura 9), uma

porcentagem menor de linfócitos estaria entrando em apoptose devido à

fragmentação de DNA (Figura 11). Portanto, a redução na viabilidade dos

linfócitos ocorreu por outro mecanismo, não investigado neste estudo. Ainda na

77

intensidade moderada, o grupo 15M apresentou um percentual menor de

linfócitos com fragmentação de DNA (32,8%) na comparação com o grupo

exercitado durante 15 minutos em intensidade leve (15L) (Figura 11). São raros

os trabalhos que avaliam a apoptose de linfócitos em exercícios de curta

duração, neste caso observamos diminuição na apoptose de linfócitos

circulantes pela fragmentação de DNA. Sendo assim, estes resultados devem

ser analisados cuidadosamente e os mecanismos envolvidos devem ser

totalmente esclarecidos, antes de serem relacionados possíveis benefícios do

exercício em seres humanos.

No caso do potencial transmembrânico, não encontramos diferenças

estatisticamente significantes em nenhum dos grupos exercitados (Figura 10).

Estes resultados são diferentes dos apresentados por LAGRANHA et al (2004)

e por QUADRILATERO e HOFFMAN-GOETZ, 2004, que utilizaram duração

mais prolongada e tipo de exercício diferente do nosso estudo. Desta forma,

são necessários mais trabalhos que avaliem os efeitos do exercício de curta

duração sobre a o potencial transmembrânico mitocondrial.

Outro fator imunológico importante que pode ser modulado pelo

exercício/treinamento físico é a concentração das citocinas circulantes. Estas

glicoproteínas atuam como uma rede de ligação para auxiliar na regulação da

sinalização das respostas imunes inatas e específicas. Existem diversas

explicações possíveis para a variabilidade dos resultados na responsividade

das citocinas pró e antiinflamatórias em relação ao exercício (PEDERSEN et

al., 1998a). Primeiro, a aptidão física, o tipo de atividade física, a intensidade e

duração do exercício, podem afetar o perfil das citocinas. Têm sido relatado

aumento na concentração de citocinas, depois do exercício envolvendo

componente excêntrico, e também no exercício concêntrico. (PEDERSEN,

2000). A especificidade e a sensibilidade dos kits utilizados em estudos com

exercício físico podem justificar as variações nos resultados (PEDERSEN,

2000).

Sabe-se que os inibidores de citocinas e as citocinas antiinflamatórias

restringem a magnitude e duração da resposta inflamatória ao exercício. A

presença de múltiplas citocinas (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-2 receptores e

interferon-γ) na urina depois do exercício demonstra que a expressão das

78

citocinas em resposta ao exercício é plenamente possível (SPRENGER et al,

1992).

Neste sentido MCFARLIN et al. (2003), realizaram um estudo com treze

homens de dezoito a vinte e seis anos, os quais se exercitaram em uma única

sessão por uma hora na bicicleta ergométrica com 75% a 80% do VO2max. As

amostras de sangue para mensurar as concentrações de citocinas circulantes

foram coletadas antes, imediatamente após e, duas horas e quatro horas após

o término do exercício. Os resultados demonstraram que não houve alteração

estatisticamente significativa na IL-2 quando não utilizada a ingestão de

carboidratos. Os estudos citados acima corroboram com nossos resultados,

pois quando foram comparados todos os grupos exercitados com o grupo

controle e entre os grupos, não observamos nenhuma alteração na

concentração sérica de IL-2 (Tabela 4 e Figura 12).

NIEMAN et al. (2001) demonstraram que este padrão de mudança nas

concentrações plasmáticas de citocinas não foi diferente entre homens e

mulheres ou entre indivíduos jovens e idosos que competiram uma maratona.

Sendo que, as concentrações de IL-2 permaneceram próximos aos valores pré-

prova ou em concentrações indetectaveis. Esses resultados são praticamente

idênticos aqueles de SUZUKI et al. (2000), que também mensuraram esta

citocina num grupo de 16 homens corredores de maratona antes e depois de

uma prova.

CASTELL et al. (1997) registraram que as concentrações plasmáticas de

IL-2 foram aumentadas 16 horas depois de uma corrida de maratona. BAUM et

al. (1997) apesar de terem observado que 30 minutos depois do exercício

exaustivo, a produção de interferon-γ induzida com fitoemaglutinina foi

suprimida, resultados inconsistentes foram encontrados para IL-2. Após

exercício concêntrico, realizado em bicicleta ergométrica durante 1 hora a 75%

do VO2max, não se detectou a produção in vitro de IL-2 (HAAHR et al., 1991).

A concentração plasmática de IL-2 pode exibir respostas complexas

depois do exercício. Por exemplo, ESPERSEN et al. (1990) encontraram

redução de 50% na concentração plasmática de IL-2 imediatamente depois de

uma corrida de 5Km, em corredores de elite. No entanto, os valores retornaram

as concentrações basais depois de duas horas após o exercício, e aumentando

50% 24h depois da corrida.

79

TOFT et al. (2002) registraram que depois de 60 minutos de exercício

em bicicleta ergométrica realizando a seguinte seqüência: 0-6 minutos a 50%,

6-12 minutos a 75%, 12-20 minutos a 100%, 20-25 minutos a 130%, 25-40

minutos a 100%, e 40-60 minutos a 75% do VO2max, a IL-6 aumentou

progressivamente depois desta seqüência, consistentemente com a hipótese

que este aumento está relacionado com lesão muscular.

Estudos prévios demonstraram que o exercício concêntrico, como

pedalar, resulta em aumentos menos pronunciados na IL-6 comparado com o

exercício excêntrico, como a corrida (NIEMAN et al., 1990; STARKIE et al.,

2001a). Contudo, durante a corrida intensa, como a maratona, aumentos de

100 vezes na concentração de IL-6 tem sido consistentemente demonstrados

(OSTROWSKI et al., 1999; OSTROWSKI et al., 1998a; STARKIE et al., 2001b;

TOFT et al., 2000). Num destes estudos, os autores especularam que o

aumento na IL-6 no plasma pode ter sido causado pela lesão muscular porque

estes registraram concentrações marcadamente elevadas de creatina kinase

(CK), depois do exercício comparado com o repouso (STARKIE et al., 2001a).

No entanto, estes pesquisadores também hipotetizaram que as elevações na

IL-6 plasmática durante uma maratona pode ser causada pela endotoxemia,

secundariamente a redução no fluxo sangüíneo visceral, suficiente para induzir

isquemia (BAGBY et al., 1996; CAMUS et al., 1997). Os maiores valores na

concentração de IL-6 registrados para corredores podem ser devido ao maior

estresse mecânico muscular imposto por esta atividade (SUZUKI et al., 2003).

As concentrações plasmáticas de IL-6 aumentadas depois do exercício

foram então associadas com lesão muscular (BRUUNSGAARD et al., 1997).

No entanto, estudos posteriores estabeleceram que a IL-6 pode aumentar

mesmo na ausência de lesão no tecido muscular (CROISIER et al., 1999;

KELLER et al., 2001; OSTROWSKI et al., 1998b; OSTROWSKI et al., 1998a;

STEENSBERG et al., 2001c; STEENSBERG et al., 2000). A IL-6 plasmática

durante o exercício aumenta com a intensidade e duração da atividade

(OSTROWSKI et al., 1998a).

Em estudo realizado com 12 atletas competidores homens (9 ciclistas, 3

triatletas; idade média 26 anos, altura média 179 cm e peso corporal de 71Kg)

que realizaram uma sessão de ciclismo de carga constante com duração de 4

horas na intensidade de 70% do limiar anaeróbio individual, numa pista de

80

400m, foi observado aumento na IL-6 de 10 vezes em relação aos valores

basais (SCHARHAG et al., 2005). O aumento na concentração plasmática de

IL-6 foi comparável ao aumento depois de 2-2.5 horas de teste em

cicloergômetro a 75% do VO2max (HISCOCK et al., 2003; NIEMAN et al.,

1998). Sendo menos pronunciado do que depois do ciclismo competitivo

(250Km de corrida de bicicleta, duração de 6.5 horas) (GANNON, et al., 1997),

e, foi maior em relação a um único teste ciclo ergométrico máximo ou repetitivo

anaeróbio (MEYER et al., 2001).

Especificamente em atletas de alto nível, neste caso, 9 homens (4

triatletas e 5 patinadores de velocidade; 21 a 27 anos de idade, 74,7Kg em

média) que realizaram sessões de exercício em cicloergômetro a 75% do

consumo máximo de oxigênio que duraram 75 minutos, foram detectados

aumentos significativos na concentração de IL-6 (RONSEN et al., 2002). De

maneira esperada, neste estudo, quando os indivíduos realizaram mais do que

uma sessão no mesmo dia, as concentrações de IL-6 foram significativamente

superiores em relação a uma única sessão (RONSEN et al., 2002).

Nesta linha de trabalhos, NEMET et al. (2003) também observaram

aumentos substanciais nas concentrações plasmáticas de IL-6 em 10

indivíduos do sexo feminino saudáveis, de 14-16 anos de idade que realizaram

uma única e típica sessão de 1 hora e 30 minutos de pólo aquático, sendo que

as amostras sangüíneas foram coletadas antes e logo após o exercício.

Caracterizando esta sessão com uma profunda resposta proinflamatória e

catabólica. A IL-6 sabidamente aumenta com o exercício em adultos, e mais

recentemente, isto foi demonstrado também em crianças submetidas à corrida

em esteira a 75% do VO2max durante 60 minutos (NEMET et al., 2002).

Apesar da interleucina-6 ser tradicionalmente considerada como um

mediador catabólico, estudos recentes sugerem que esta também possui

efeitos positivos sobre o crescimento em determinadas situações, incluindo o

exercício físico. Outros membros da família das citocinas IL-6 (fator de inibição

leucêmico) regulam o crescimento muscular (REARDON et al., 2001). A IL-6

sabidamente estimula a angiogênese mediada por fatores de crescimento

vasculares (fator de crescimento fibroblasto-2) (BLOTNICK et al., 1994) e fator

de crescimento vascular endotelial (FREEMAN et al., 1995).

81

A interleucina-6 é uma substância biologicamente ativa que não é

secretada apenas pelas células do sistema imunológico durante condições

inflamatórias, mas é também liberada do tecido adiposo (FRUBECK et al.,

2001) e pela contração muscular na ausência de inflamação (STEENSBERG et

al., 2000).

Na perspectiva metabólica, a IL-6 pode possuir efeitos lipolíticos em

associação com o exercício físico. HALL et al. (2003) propuseram que esta

citocina é um potente modulador do metabolismo de gorduras, através do

aumento da oxidação de ácidos graxos e a reesterificação dos mesmos, sem

causar hipertrialcilglicerídemia, em 18 homens ativos que receberam a infusão

de IL-6. WALLENIUS et al. (2002), acrescentaram que ratos deficientes de IL-6

desenvolveram obesidade prematuramente. Em soma, quando os ratos foram

tratados com infusão de IL-6 durante 18 dias, houve redução significativa no

peso corporal destes animais. Neste sentido, nos nossos resultados pudemos

observar aumentos significativos de 26,6% na IL-6 no grupo exaustão leve em

comparação ao controle e redução de 26% no grupo exercitado até a exaustão

em intensidade moderada (duração do tempo de nado inferior a 50 minutos em

média) em relação ao grupo exercitado até exaustão em intensidade leve

(Tabela 5 e Figura 13). Vale destacar, que no grupo exaustão leve os animais

nadaram em média 10 horas, sendo este exercício de característica aeróbia e

de longa duração, priorizando o metabolismo lipídico e a produção desta

citocina (Tabela 5 e Figura 13).

No músculo esquelético, KELLER et al. (2001) analisaram 6 homens,

fisicamente ativos, porém destreinados (idade média 26 anos, peso corporal

médio 78.1Kg e altura média de 1.87m) que realizaram uma sessão de 60

minutos em cicloergômetro a 70% do VO2max. Observaram que o exercício

prolongado ativa a transcrição do gene de IL-6 no músculo esquelético. Esta

resposta foi particularmente aumentada quando o conteúdo de glicogênio

muscular era baixo. A partir destes achados, os mesmos autores

estabeleceram que o tecido muscular é uma fonte de produção de IL-6 durante

o exercício prolongado e que a concentração de glicogênio muscular pode ser

um determinante crítico regulando a resposta desta molécula glicoproteica ao

exercício.

82

Quando realizada a infusão de concentrações relativamente modestas

de IL-6 (como aquelas que podem estar presentes depois do exercício ou em

baixos níveis inflamatórios crônicos) diretamente num músculo alvo in vivo, foi

observada significativa atrofia muscular em idosos (HADDAD et al., 2005).

Finalmente, PEDERSEN et al. (2001a) demonstraram que a interleucina-

6 é produzida localizadamente pelo músculo esquelético e liberada na

circulação em grandes quantidades. Foi hipotetizado esta citocina pode exercer

um papel importante na manutenção da homeostasia da glicose durante o

exercício prolongado, com ações similares a de um hormônio, otimizando a

resposta metabólica durante a atividade muscular.

Nesta linha de pensamento, durante o exercício pode ocorrer uma crise

energética (depleção de glicogênio) ou lesão tecidual que promovem a

sinalização para produção e liberação aumentadas de IL-6 (GLEESON, 2000).

Suas concentrações plasmáticas estimulam então a glicogenólise hepática e

liberação de glicose, ajudando a manter a glicemia sangüínea. A IL-6 também

promove síntese de proteínas de fase aguda e fatores de crescimento

insulínicos, que exercem importante papel na adaptação muscular ao exercício

(GLEESON, 2000). Estes efeitos metabólicos de regulação poderiam estar

provavelmente presentes em nossos resultados, devido às mudanças nesta

citocina terem sido detectadas apenas no grupo exaustão leve (média de 10

horas de natação), evidenciando a necessidade de manutenção da glicemia e

grande utilização de ácidos graxos (Tabela 5 e Figura 13).

Foi sugerido que a adrenalina pode ser um gatilho para resposta da IL-6

durante o exercício (PAPANICOLAOU et al., 1996). Pois, a infusão de

adrenalina induziu aumento de 6 vezes nesta citocina. No entanto, o exercício

promoveu aumentos de 30 vezes nas concentrações circulantes de IL-6

(STEENSBERG et al., 2001c). Adicionalmente, em outro estudo, ambas as

pernas, exercitada e não exercitada foram expostas às mesmas concentrações

hormonais, porém apenas a perna exercitada liberou IL-6 (STEENSBERG et

al., 2000). A noradrenalina foi sugerida como um potencial estímulo para a

elevação de IL-6 induzida pelo exercício (MAZZEO et al., 2001). Numerosos

trabalhos têm demonstrado que a adrenalina e a noradrenalina podem induzir a

produção de IL-6 em repouso (DERIJK et al., 1994; STEENSBERG et al.,

2001c; SONDERGAARD et al., 2000). No entanto, as catecolaminas não

83

exercem papéis fundamentais neste processo (PEDERSEN e STEENSBERG,

2002).

Diferentes células e tecidos produzem IL-6, e as principais fontes

durante infecções são provenientes de monócitos e macrófagos estimulados.

Um estudo demonstrou que estas células não eram as principais fontes de

elevação da IL-6 durante o exercício (STARKIE et al., 2001b). De fato, foi

recentemente demonstrado que o músculo posterior da coxa liberou IL-6 e que

esta liberação pode contribuir para as elevadas concentrações plasmáticas de

desta mesma citocina (STEENSBERG et al., 2000). No músculo esquelético, a

expressão de IL-6 aumenta após o exercício e precede as microrupturas nas

miofibrilas induzidas por este tipo de atividade. O controle da produção de

citocinas como: IL-6, IL-1β e TNF-α podem regular o processo de dor muscular

tardia decorrente de atividades esportivas (TOMIYA et al., 2004). De fato, a IL-

6 induz a proliferação de células satélites, que são células quiescentes

precursoras da formação de novos miotubos e auxiliam na regeneração

muscular (JONSDOTTIR et al., 2000).

Concentrações de glicocorticóides acima das variações fisiológicas,

entre as concentrações circadianas basais e as concentrações induzidas pelo

estresse do exercício, afetam diferentemente a produção de citocinas

específicas. A IL-6 é resistente à supressão dos glicocorticóides, no entanto, a

TNF-α é muito sensitiva aos glicocorticóides, indicando que as variações

fisiológicas nesta classe de hormônios podem exercer importante papel na

regulação da produção de TNF-α e também de outras citocinas como a IL-1β e

IL-6 (DeRIJK et al, 1997).

Interessantemente, a TNF-α pode aumentar a esterificação de ácidos

graxos e a formação de diacilglicerol, que é um importante ativador de algumas

isoformas de proteínas cinases C, podendo interferir com sinalização da

insulina via fosforilação de serina do IRS-1 (receptor de insulina-1) (YU et al.,

2002). Este pode ser um potencial mecanismo pelo qual a TNF-α causa

resistência à insulina (DYCK et al., 2006).

GOEBEL et al. (2000) observaram que o exercício aumentou a produção

in vitro de TNF-α em 32 indivíduos saudáveis (13 mulheres e 19 homens), com

idades entre 21 e 49 anos, que realizaram um exercício físico durante 15 a 18

84

minutos em cicloergômetro, pedalando a 70rpm (rotações por minuto) numa

intensidade de 75% do VO2max estimado.

O exercício extenuante induz aumentos na concentração de citocinas no

sangue. As concentrações de TNF-α apresentam aumento de duas a três

vezes depois de exercícios extenuantes (OSTROWSKI et al., 1999). É

relevante destacar que as citocinas têm meia vida curta, os tempos nos quais

as amostras são coletadas influenciam nos resultados (PEDERSEN et al,

1998b). Outros fatores que também podem alterar os dados obtidos estão

relacionados à duração, intensidade e tipo de exercício físico executado.

O aumento do TNF-α com relação ao metabolismo das células do

sistema imunitário, também pode estar envolvido em aumentar a captação de

glicose nestas células, com o intuito de melhorar sua resposta. Sabe-se que a

glicose e a glutamina são os principais substratos energéticos das células do

sistema imunitário, inclusive os neutrófilos (PITHON-CURI et al., 1997).

Em meninas saudáveis, de 14 a 16 anos, que realizaram uma única

sessão de polo aquático, com duração de 1 hora e 30 minutos, sendo que as

amostras de sangue foram coletadas antes e depois do exercício físico.

Encontraram uma pequena, porém significante redução de 20% sobre TNF-α.

(NEMET et al., 2003). No entanto, outros não registraram nenhuma mudança

(SUZUKI et al., 2000).

RHIND et al. (2001) demonstraram que a exposição prolongada ao frio

(apesar da manutenção da temperatura corporal) provoca redução na

expressão intracelular de TNF-α e leva a uma redução nas concentrações

plasmáticas de TNF-α depois do exercício.

SPRENGER et al. (1992) observaram elevadas concentrações de TNF-α

no estado de repouso, em 22 corredores quando comparados com indivíduos

controle, que não exibiram concentrações circulantes mensuráveis dessa

citocina. A correlação significante foi encontrada entre as concentrações

plasmáticas de TNF-α e IL-1β em indivíduos treinados e controle, sugerindo

que essas citocinas podem ser secretadas pelo mesmo tipo de estresse físico,

como a corrida. Com relação a outras citocinas, as concentrações plasmáticas

de TNF-α podem não mudar durante o exercício. Isso foi observado por

ULLUM et al. (1994) que não encontraram mudanças durante e depois de 6h

85

de ciclismo em indivíduos treinados, corroborando com outros estudos

(DRENTH et al., 1995; SMITH et al., 1992; SPRENGER et al., 1992).

TIMMONS et al. (2004) realizaram um estudo com doze meninos (9,8

anos de idade em média) e dez homens (22,1 anos de idade em média)

saudáveis, os quais pedalaram por 60 minutos a 70% do VO2max. As amostras

de sangue foram coletadas antes, imediatamente e 60 minutos após o

exercício. Concluíram que não houve aumento nas concentrações de TNF-α.

Os resultados destes estudos citados apresentaram estabilidade ou

diminuição nas concentrações plasmáticas de TNF-α, podem ser relacionados

de maneira similar com os dados encontrados em nossa pesquisa, pois foi

observada redução média de 23% nesta citocina nos grupos exercitados com

sobrecarga (Tabela 6 e Figura 14). A intensidade do exercício parece exercer

efeito sobre a concentração sérica de TNF-α, já que foi observada maior

redução de 20% no grupo exercitado durante 15 minutos em intensidade

moderada quando comparado ao grupo exercitado em intensidade leve no

mesmo volume (Tabela 6 e Figura 14).

Interessantemente, a resposta das citocinas ao exercício físico difere

daquela pronunciada nas diferentes infecções (FEBBRAIO e PEDERSEN,

2002; PEDERSEN e HOFFMAN-GOETZ, 2000; PEDERSEN et al., 2001a;

SUZUKI et al., 2002). O fato de que citocinas proinflamatórias, TNF-α e IL1-β,

em geral não aumentam com o exercício indica que a cascata de citocinas

induzida pelo exercício difere substancialmente da cascata de citocinas

induzida pelas infecções (OSTROWSKI et al., 2000). Recentemente,

PETERSEN e PEDERSEN (2005), propuseram que o exercício físico provoca

primariamente a liberação de IL-6, seguido de aumentos na IL-1ra, IL-10

(citocinas antiinflamatórias), proteína-C reativa (CRP) e receptor solúvel de

TNF-α (sTNF-R), inibindo ainda a produção de TNF-α. Em nosso trabalho,

pudemos registrar reduções na TNF-α nos grupos exercitados com sobrecarga

de 5%, além do grupo exercitado 5 sessões em intensidade leve (Tabela 6 e

Figura 14).

Outros estudos serão necessários para esclarecer se o aumento,

manutenção ou ainda redução destas citocinas poderia estar envolvido com a

melhora da resposta das células do sistema imunitário frente ao exercício.

86

7. Conclusões

Concluímos neste estudo que, o exercício físico tanto de curta duração,

como realizado até a exaustão, ou mesmo durante 5 sessões de volume

progressivo nas intensidades leve e moderada, pode modular o número de

leucócitos totais, promovendo aumento na contagem destas células. O

aumento na intensidade do exercício (de leve para moderada) pode induzir a

leucocitose mais pronunciada. Pudemos observar também que, quando uma

maior intensidade é exposta durante 5 sessões, pode-se alterar a resposta

leucocitária total, reduzindo a leucometria, o que nos leva a crer que os animais

ainda não estavam adaptados à esta carga.

No caso da contagem de linfócitos circulantes, o exercício promoveu

linfocitose. No exercício de natação com duração curta (5 a 15 minutos), o

aumento na contagem de linfócitos circulantes é acompanhado pelo aumento

no número de linfócitos teciduais, neste sentido, a duração do exercício pode

alterar a resposta dos linfócitos teciduais. De fato, após o exercício mais

prolongado (60 minutos a 10 horas de duração em média), os linfócitos

provenientes dos linfonodos mesentéricos foram reduzidos, migrando para a

corrente sangüínea e contribuindo na linfocitose induzida por este tipo de

atividade.

Com relação à funcionalidade de linfócitos em exercícios físicos

realizados por breves períodos (5 e 15 minutos, nas intensidades leve e

moderada), estes modularam agudamente o sistema imune promovendo

redução na viabilidade de linfócitos circulantes e redução na fragmentação de

DNA nesta célula. O exercício, mesmo quando realizado em curta duração e

intensidade moderada, não é inócuo frente à resposta imune.

A concentração sérica de TNF-α foi reduzida apenas no exercício

realizado com intensidade moderada e durante 5 sessões de volume

crescente. No entanto, para IL-6, o exercício mais prolongado (10 horas em

média) promoveu maiores modificações, induzindo aumentos expressivos.

A imunologia do exercício necessita prontamente de futuras

investigações devido à redução funcional de células imunes, que podem

ocorrer em indivíduos sedentários que se submetem a sessões agudas de

exercício, em alguns momentos, sem orientação profissional e/ou com

87

treinamentos inadequados, com relação à intensidade e duração que podem

extrapolar suas limitações físicas. Finalmente os efeitos positivos e negativos,

crônicos e agudos do exercício, em diferentes intensidades sobre o sistema

imune precisam ser melhor elucidados. Proporcionar a prática de treinamento

físico com benefícios e promoção da saúde, tanto em atletas como em

indivíduos sedentários, é de primordial importância para os profissionais da

área da fisiologia do exercício.

Para profissão de educadores físicos, fica a mensagem de que, as

alterações provocadas por qualquer tipo de exercício físico, não são apenas

estéticas ou musculares. Estas modificações induzidas no organismo devem

ser visualizadas de acordo com todo sistema biológico que compõem o ser

humano. Desta maneira, a compreensão das respostas imunológicas

resultantes de uma única sessão de exercício ou do treinamento físico

realizado em longo prazo, podem auxiliar na ampliação do conhecimento

científico e na adequação da prescrição individualizada do esforço.

88

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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104

9. ANEXO: PUBLICAÇÕES REFERENTES AO MESTRADO

TRABALHOS RESUMIDOS PUBLICADOS EM ANAIS DE EVENTO

PRESTES, J.; GUERESCHI, M.G.; BRANBILLA, S.B.; DIAS, R.; FERREIRA, C. K.O.; CAVAGLIERI, C.R.; PALANCH, A.C. Alterações da ultra-estrutura de linfócitos dos linfonodos mesentéricos de ratos submetidos a 5 minutos de exercício físico agudo de intensidade leve e moderada In: 13° Simpósio Internacional de Iniciação Científica, 13º SIICUSP. Ribeirão Preto: USP Ribeirão Preto, 4807-4807, 2005.

PRESTES, J.; PALANCH, A.C.; FROLLINI, A.B.; FERREIRA, C.K.O.; DIAS, R.; DONATTO, F.; GUERESCHI, M.G.; URTADO, C.B.; LEITE, G.S.; CAVAGLIERI, C.R. Efeito do exercício físico realizado até exaustão, nas intensidades leve e moderada sobre a concentração sérica de IL-6 In: I Congresso Paulista da Sociedade Brasileira de Fisiologia do Exercício. IV Workshop em Fisiologia do exercício da UFSCAr. SãoCarlos: UFSCAr, t43-t43, 2005.

RAMALLO, B.T.; PRESTES, J.; FOSCHINI, D.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos agudos do método de múltiplas séries sobre as células do sistema imune In: 13° Simpósio Internacional de Iniciação Científica, 13º SIICUSP. Ribeirão Preto: USP Ribeirão Preto, 3110–3110, 2005.

VEIGA, A.; PRESTES, J.; RAMALLO, B.T.; FOSCHINI, D.; FERREIRA, C. K.O.; DONATTO, F.; URTADO, C.B.; CAVAGLIERI, C.R.; et. al. Efeitos agudos do treinamento de força sobre as células do sistema imunológico em praticantes de musculação em academias In: 8º Congresso de Iniciação e Produção Científica & 7º Seminário de extensão Metodista, 8º Congresso de Iniciação e Produção Científica e 7º Seminário de extensão Metodista. São Paulo: UMESP, 2971–2971, 2005.

PRESTES, J.; FERREIRA, C.K.O.; DONATTO, F.; GUERESCHI, M.G.; DIAS, R.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos da adaptação ao exercício em intensidade leve sobre o número de leucócitos circulantes In: XX Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, FESBE. São Paulo: FESBE, 81–81, 2005.

105

PRESTES, J.; FERREIRA, C.K.O.; DONATTO, F.; GUERESCHI, M.G.; DIAS, R.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos da adaptação ao exercício físico em intensidade leve sobre a concentração de linfócitos mesentéricos e circulantes de ratos sedentários In: XX Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, FESBE 2005. São Paulo: FESBE, 81-81, 2005.

DIAS, R.; PRESTES, J.; FERREIRA, C.K.O.; DONATTO, F.; GUERESCHI, M.G.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos da adaptação ao exercício físico em intensidade leve sobre a glicemia, lactemia e hematócrito de ratos sedentários In: XX Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, FESBE 2005. São Paulo: FESBE, 81-81, 2005.

PRESTES, J.; CAVAGLIERI, C.R.; FERREIRA, C.K.O.; DONATTO, F.; GUERESCHI, M.G.; DIAS, R.; BRANBILLA, S.B.; PALANCH, A.C. Efeitos da adaptação ao exercício físico em intensidade leve sobre a glicemia, lacticemia e hematócrito de ratos sedentários In: IV Congresso Iternacional de Educação Física e Motricidade Humana, Motriz. Rio Claro: Divisa, 11:S69-S69, 2005.

PRESTES, J.; FROLLINI, A.B.; FERREIRA, C.K.O.; DONATTO, F.; DIAS, R.; BRANBILLA, S.B.; GUERESCHI, M.G.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos da adaptação ao exercício físico nas intensidades leve e moderada sobre a concentração de linfócitos mesentéricos In: XVIII Simpósio Internacional de Ciências do Esporte. Atividade Física e Esporte no Ciclo da vida. São Caetano do Sul: Celafiscs,13:163-163,2005.

PRESTES, J.; FERREIRA, C.K.O.; DONATTO, F.; GUERESCHI, M.G.; DIAS, R.; BRANBILLA, S.B.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos da adaptação ao exercício físico em intensidade leve na concentração de linfócitos teciduais e circulantes de ratos sedentários In: IV Congresso Internacional de Educação Física e Motricidade Humana, Motriz. Rio Claro: Divisa, 11:S145-S146, 2005.

DIAS, R.; PRESTES, J.; FERREIRA, C.K.; DONATTO, F.; GUERESCHI, M.G.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos da adaptação do exercício físico em intensidade leve sobre a glicemia, lactemia e hematócrito de ratos sedentários In: Congresso Internacional de Pegagogia do Esporte. Educação Física e Esportes: formação e intervenção profissional. Maringá-PR: STHAMPA, 2:120-121, 2005.

106

PRESTES, J.; FROLLINI, A.B.; FERREIRA, C.K.O.; DONATTO, F.; GUERESCHI, M.G.; DIAS, R.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos de duas sessões de exercício físico sobre a concentração de linfócitos mesentéricos de ratos sedentários In: XXVIII Simpósio Internacional de Ciências do Esporte. Atividade Física e Esporte no ciclo da vida. São Caetano do Sul: Celafiscs, 13:164-164, 2005.

DONATTO, F.; PRESTES, J.; FROLLINI, A.B.; FERREIRA, C.K.O.; GUERESCHI, M.G.; DIAS, R.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos de duas sessões de exercício físico sobre a glicemia, lactacidemia de ratos sedentário In: XVIII Simpósio Internacional de Ciências do Esporte. Atividade Física e Esporte no ciclo da vida. São Caetano do Sul: Celafiscs, 13:S164-S164, 2005.

FROLLINI, A.B.; PRESTES, J.; FERREIRA, C.K.O.; DONATTO, F.; GUERESCHI, M.G.; DIAS, R.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos de duas sessões de exercício sobre o número de leucócitos circulantes de ratos In: XXVIII Simpósio Internacional de Ciências do Esporte. Atividade Física e Esporte no ciclo da vida. São Caetano do Sul: Celafiscs, 13:164–164, 2005.

PRESTES, J.; FROLLINI, A.B.; FERREIRA, C.K.O.; DONATTO, F.; GUERESCHI, M.G.; DIAS, R.; FOSCHINI, D.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos de duas sessões de exercício sobre o número de linfócitos In: Semana de Reunião da Biologia. IV SERBIO. Piracicaba: SERBIO, 27–27, 2005.

PRESTES, J.; FERREIRA, C. K.O.; DONATTO, F.; GUERESCHI, M.G.; DIAS, R.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos de um minuto de exercício físico em intensidade leve sobre a concentração de linfócitos mesentéricos e circulantes de ratos sedentários In: Congresso Internacional de Pedagogia do Esporte. Educação Física e Esportes: formação e intervenção profissional. Maringá-PR: STHAMPA, 2:120-120, 2005.

FERREIRA, C. K.O.; PRESTES, J.; DONATTO, F.; GUERESCHI, M.G.; DIAS, R.; BRANBILLA, S.B.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos de um minuto de exercício físico em intensidade leve sobre a glicemia, lactemia e hematócrito em ratos sedentários In: Congresso Internacional de Pedagogia do Esporte. Educação Física e Esportes: formação e intervenção profissonal. Maringá-PR: STHAMPA, 2:132-133, 2005.

107

PRESTES, J.; FERREIRA, C. K.O.; DONATTO, F.; GUERESCHI, M.G.; DIAS, R.; BRANBILLA, S.B.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos de um minuto de exercício físico em intensidade leve sobre o número de leucócitos circulantes de ratos sedentários In: Congresso Internacional de Pedagogia do Esporte. Educação Física e Esporte: Formação e intervenção profissional. Maringá-PR: STHAMPA, 2:132-132, 2005.

PRESTES, J.; VEIGA, A.; RAMALLO, B.T.; URTADO, C.B.; FERREIRA, C.K.O.; FOSCHINI, D.; DONATTO, F.; LEITE, G.S.; CURI, T.P.; CAVAGLIERI, C.R.; et. al. Efeitos de uma partida de basquetebol sobre as células do sistema imunológico de atletas profissionais In: 8º Congresso de Iniciação e Produção Científica & 7º Seminário de extensão Metodista. 8º Congresso de Iniciação e Produção Científica & 7º Seminário de extensão Metodista. São Paulo: UMESP, 2972-2972, 2005.

GUERESCHI, M.G.; PRESTES, J.; FROLLINI, A.B.; FERREIRA, C.K.O.; DONATTO, F.; BRANBILLA, S.B.; DIAS, R.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Exercício físico agudo de intensidade leve e moderada altera a morfofisiologia de linfócitos circulantes de ratos In: XVIII Simpósio Internacional de Ciências do Esporte. Atividade Física e Esporte no ciclo da vida. São Caetano do Sul: Celafiscs, 13: 288-288, 2005.

FROLLINI, A.B.; PRESTES, J.; FERREIRA, C.K.O.; DONATTO, F.; DIAS, R.; CAVAGLIERI, C.R. Influência do exercício físico realizado até exaustão, nas intensidades leve e moderada, sobre a concentração sérica de citocinas In: 13° Simpósio Internacional de Iniciação Científica, 13º SIICUSP. Ribeirão Preto: USP RIBEIRÃO PRETO, 2450-2450, 2005.

FERREIRA, C.K.O.; PRESTES, J.; GUERESCHI, M.G.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Efeito do Exercício agudo com intensidades leve e moderada sobre a concentração plasmática de TNF-alpha In: XIX Reunião Anual Federação de Sociedades de Biologia Experimental. São Paulo: FESBE, 146-146, 2004.

PRESTES, J.; FERREIRA, C.K.O.; GUERESCHI, M.G.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos da Atividade Física aguda sobre as variáveis metabólicas de ratos In: XIX Reunião Anual Federação de Sociedades de Biologia Experimental. São Paulo: FESBE, 146-146, 2004.

108

TRABALHOS COMPLETOS PUBLICADOS EM ANAIS DE EVENTOS

PRESTES, J.; CAVAGLIERI, C.R. Determinação do limiar anaeróbio em ratos submetidos a um teste incremental na natação In: 3º Congresso de Pós Graduação, 3º Mostra Acadêmica Unimep. Piracicaba: Unimep, 2005.

PRESTES, J.; CAVAGLIERI, C.R.; PALANCH, A.C; GUERESCHI, M.G.; FERREIRA, C.K.O. The physical exercise effects on the immune system of rats In: Workshop sobre Atividade Física e Saúde. Piracicaba: UNIMEP, 2004.

ARTIGOS RESUMIDOS PUBLICADOS EM PERIÓDICOS

PRESTES, J.; FROLLINI, A.B.; FERREIRA, C.K.O.; DONATTO, F.; GUERESCHI, M.G.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos de duas sessões de exercício físico sobre a concentração de linfócitos mesentéricos de ratos. Revista brasileira de ciência e movimento. 13:S164-S164, 2005.

PRESTES, J.; FERREIRA, C.K.O.; DONATTO, F.; GUERESCHI, M.G.; DIAS, R.; BRANBILLA, S.B.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos da adaptação ao exercício físico em intensidade leve sobre a glicemia, lacticemia e hematócrito de ratos sedentários. Motriz. 11:S69- S69, 2005.

PRESTES, J.; GUERESCHI, M.G.; FROLLINI, A.B.; FERREIRA, C.K.O.; DONATTO, F.; DIAS, R., BRANBILLA, S.B. CAVAGLIERI, C.R.; PALANCH, A.C. Exercício físico agudo de intensidade leve e moderada altera a morfofisiologia de linfócitos circulantes de ratos. Revista brasileira de ciência e movimento. 13:S288 - S288, 2005.

GUERESCHI, M.G.; PRESTES, J.; FERREIRA, C. K.O.; DONATTO, F.; CAVAGLIERI, C.R.; PALANCH, A.C. Alterações Morfofisiológicas em monócitos e macrófagos de ratos submetidos a exercício agudo de intensidade leve e moderada. Revista brasileira de ciência e movimento. 13:S82 - S82, 2005.

FOSCHINI, D.; PRESTES, J.; et. al. Dano muscular induzido por uma sessão de treinamento de força com múltiplas séries. Revista brasileira de ciência e movimento. 13:S174- S174, 2005.

109

FERREIRA, C.K.O.; PRESTES, J.; PALANCH, A.C.; GUERESCHI, M.G.; DIAS, R.; BRANBILLA, S.B.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos da adaptação ao exercício em intensidade leve no número, viabilidade e funcionalidade de nacrófagos teciduais de ratos sedentários. Motriz. 11:S81 - S81, 2005.

DIAS, R.; PRESTES, J.; FROLLINI, A.B.; FERREIRA, C.K.O.; DONATTO, F.; GUERESCHI, M.G.; BRANBILLA, S.B.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C. R. Efeitos da adaptação ao exercício físico nas intesnidades leve e moderada sobre o percentual de monócitos e neutrófilos. Revista brasileira de ciência e movimento. 13:S166-S166, 2005.

DONATTO, F.; PRESTES, J.; FROLLINI, A.B.; FERREIRA, C.K.O; GUERESCHI, M.G.; DIAS, R.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos de duas sessões de exercício físico sobre a glicemia, lactacidemia de ratos sedentário. Revista brasileira de ciência e movimento. 13:S164-S164, 2005.

FROLLINI, A.B.; PRESTES, J.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R.; FERREIRA, C.K.O.; DONATTO, F..; GUERESCHI, M.G.; DIAS, R.; BRANBILLA, S.B. Efeitos de duas sessões de exercício sobre o número de leucócitos circulantes de ratos. Revista brasileira de ciência e movimento. 13:S164-S164, 2005.

GUERESCHI, M.G.; PRESTES, J.; FROLLINI, A.B.; FERREIRA, C.K.O.; DIAS, R.; BRANBILLA, S.B.; DONATTO, F.; CAVAGLIERI, C.R.; PALANCH, A.C. Alterações Morfológicas em monócitos e macrófagos de ratos submetidos a exercício físico agudo de intensidade leve e moderada. Revista brasileira de ciência e movimento. 10:S82-S82, 2004.

FERREIRA, C.K.O.; PRESTES, J.; DONATTO, F.; GUERESCHI, M.G.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Respostas agudas ao exercício físico de natação nas intensidades leve e moderada sobre o número, viabilidade e funcionalidade de neutrófilos de ratos. Revista brasileira de ciência e movimento. 10:S95-S95, 2004.

ARTIGOS COMPLETOS PUBLICADOS EM PERIÓDICOS

PRESTES, J.; CAVAGLIERI, C.R.; FERREIRA, C.K.O.; DONATTO, F.; et al. Efeitos do fator de crescimento insulínico-I (IGF-I) sobre o músculo esquelético e suas relações com o exercício físico. Revista Brasileira de Ciência e Movimento. No prelo, 1, 2006.

110

PRESTES, J.; BUCCI, M.; CAVAGLIERI, C.R.; et. al. Metabolismo Lipídico: Suplementação e Performance Humana. Saúde em Revista. No prelo, 18, 2006.

PRESTES, J.; DIAS, R.; DONATTO, F.; FERREIRA, C.K.O.; FROLLINI, A.B.; GUERRESCHI, M.; PALANCH, A.; CAVAGLIERI, C.R. Efeito de duas sessões de exercício sobre o número de leucócitos totais e linfócitos circulantes. Revista Mackenzie de Educação Física. Artigo submetido, 2006.

PRESTES, J.; DIAS, R.; DONATTO, F.; FERREIRA, C.K.O.; FROLLINI, A.B.;

GUERRESCHI, M.; PALANCH, A.; VERLENGIA, R.; PITHON-CURI, T.; CURI, R.; CAVAGLIERI, C.R. Lymphocytes function and cytokines levels can be modulated by short duration physical exercise in different intensities? Eur J Sports Sci. Artigo submetido, 2006.

PRÊMIOS E TÍTULOS

MENSÃO HONROSA PARA PAINÉIS da XX Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, FESBE 2005. FERREIRA, C. KO.; PRESTES, J.; DONATTO, F.; GUERESCHI, M.G.; DIAS, R.; PALANCH, A.C.; CAVAGLIERI, C.R. Efeitos da adaptação ao exercício físico em intensidade leve sobre o número, viabilidade e funcionalidade de macrófagos peritoneais de ratos In: FESBE 2005. 81 – 81, 2005.

OUTRAS INFORMAÇÕES RELEVANTES

Participação no projeto de pesquisa intitulado: “Efeitos da suplementação de glutamina sobre a performance de jovens nadadores”. Projeto cadastrado no CNPQ.

Participação no grupo de pesquisa intitulado: “Endocrinologia e Performance Humana”.

jonato prestes - unimep.br · 3 efeito do exercÍcio fÍsico sobre a funcionalidade de linfÓcitos...

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